JP2022507687A

JP2022507687A - 敗血症の治療に使用するための初期アポトーシス細胞

Info

Publication number: JP2022507687A
Application number: JP2021527091A
Authority: JP
Inventors: ノヴィック、シャイ; メヴォラッチ、ドロール
Original assignee: エンリヴェックスセラピューティクスリミテッド
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2019-11-17
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-11-17
Also published as: KR20210093318A; AU2019383076A1; WO2020105034A1; CN113226341A; EP3883584A4; CA3116296A1; EP3883584A1; IL282634A; JP7334249B2

Abstract

本明細書に開示される組成物、およびその使用方法は、必要とする対象において敗血症を治療または予防するためのものを含み、敗血症に罹患している対象の生存を延長する方法と、敗血症による臓器機能障害または臓器不全を低減する方法とを含む。必要とする対象において敗血症を治療または予防する方法は、初期アポトーシス細胞または初期アポトーシス細胞上清を含む組成物を投与することを含む。組成物およびその使用方法は、敗血症に伴う負の炎症誘発性効果を低減し得る。さらに、抗炎症性サイトカイン放出を低減し得る。ある特定の事例では、組成物は、追加の薬剤を含み得る。【選択図】図４６Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
本発明は、２０１９年１１月４日に出願された米国特許出願第１６／６７２，５４７号の利益を主張し、２０１９年１０月７日に出願された米国特許出願第１６／５９４，４６３号の利益を主張し、２０１８年１１月１９日に出願された米国特許出願第１６／１９４，４１７号の利益を主張する。これらの出願のすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率を阻害または低減するための組成物およびその方法である。さらに、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害するための組成物およびその方法である。さらに、本明細書に開示される組成物は、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、または発生率の低減に使用され得る。組成物は、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存を増加させるために使用され得る。使用される組成物は、単独で、または他の化学療法と組み合わせて投与され得る。本明細書に開示される方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を単独で、またはＣＡＲＴ細胞療法と組み合わせて含む組成物の投与を含むものを含む。本明細書に開示される方法には、敗血症を治療するための方法が含まれる。

がんの標準的な治療法は外科手術、化学療法、および放射線療法であるが、標的免疫療法などの改善された方法が現在開発され、試験されている。有望な技術の１つは、養子細胞移植（ＡＣＴ）を使用し、この技術では、免疫細胞を改変して、それらの腫瘍を認識して攻撃する。ＡＣＴの一例は、患者自身の細胞傷害性Ｔ細胞またはドナーのものが、腫瘍細胞の表面に発現する腫瘍特異的抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲＴ細胞）を発現するように操作される場合である。次いでこれらのＣＡＲＴ細胞は、腫瘍特異的抗原を発現する細胞に対してのみ細胞傷害性を示す。臨床試験では、ＣＡＲＴ細胞療法が、とりわけ進行性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）およびリンパ腫の制御に大きな可能性を有することを示す。

しかしながら、ＣＡＲＴ細胞療法およびその他の免疫療法を受けた一部の患者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と呼ばれる危険な、かつ時には生命を脅かす副作用を経験し、輸液された活性化Ｔ細胞が全身性炎症反応を引き起こし、血流へサイトカインが急速かつ大量に放出されることにより、危険な低血圧、高熱、震えをもたらす。

ＣＲＳの重症例では、患者はサイトカインストーム（別名サイトカインカスケードまたは高サイトカイン血症）を経験し、このストームでは、サイトカインと、サイトカインのレベルが非常に高い白血球との間に正のフィードバックループがある。これは、心機能障害、成人呼吸窮迫症候群、神経毒性、腎および／または肝不全、肺水腫、ならびに播種性血管内凝固を含む、生命を脅かす可能性のある合併症につながり得る。

例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体に結合するモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２を投与された最近の第Ｉ相試験の６人の患者は、サイトカインストームおよび多臓器不全の重症例を示した。これは、ＴＧＮ１４１２の用量が動物で安全であることが判明した用量の５００分の１であったにもかかわらず起こった（Ｓｔ．ＣｌａｉｒＥＷ：Ｔｈｅｃａｌｍａｆｔｅｒｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｏｒｍ：ＬｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｔｈｅＴＧＮ１４１２ｔｒｉａｌ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１１８：１３４４－１３４７，２００８）。

現在まで、ＣＡＲＴ細胞療法を投与された患者のサイトカイン放出症候群を制御するために、コルチコステロイド、抗ＩＬ６療法などの生物学的療法、および抗炎症剤が評価されている。しかしながら、ステロイドはＣＡＲＴ細胞の活性および／または増殖に影響を及ぼし、患者を敗血症および日和見感染の危険にさらす可能性がある。サイトカインストームには非常に多くのサイトカインが含まれているが、患者に抗炎症剤を注入する能力は限られているため、抗炎症剤はサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの制御に効果的ではない可能性がある。ＣＡＲＴ細胞療法の可能性を実現するためには、サイトカイン放出症候群、特にサイトカインストームを制御するための新しい戦略が必要である。

サイトカインストームは、他の感染性および非感染性の刺激の後にも問題となる。サイトカインストームでは、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－６、ｇ－インターフェロン（ｇ－ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）などの多数の炎症誘発性サイトカインが放出され、低血圧、出血、および最終的には多臓器不全をもたらす。１９１８年のＨ１Ｎ１型インフルエンザの大流行および最近の鳥インフルエンザＨ５Ｎ１感染における、おそらく健康な免疫系を有する若者の比較的高い死亡率は、サイトカインストームに起因している。この症候群はまた、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、エプスタインバーウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症、敗血症、グラム陰性敗血症、マラリア、およびエボラ感染を含む多数の他の感染症の進行または末期の症例でも発生することが知られている。

サイトカインストームは、急性膵炎、重度の火傷もしくは外傷、または急性呼吸窮迫症候群などの非感染性の症例からも生じる可能性がある。したがって、サイトカイン放出症候群、特にサイトカインストームを制御するための新しい戦略が必要である。

がんは、１つ以上の細胞集団の制御されない増殖が、正常な生物学的機能を妨害する異常な状態である。増殖性の変化は通常、分化度の低い、より発達的に原始的な状態への復帰を含む、細胞特性の他の変化を伴う。がんのインビトロ相関は細胞形質転換と呼ばれている。形質転換細胞は一般に、以下の特性：球状形態、胎児性抗原の発現、成長因子非依存性、接触阻害の欠如、足場非依存性、および高密度への成長のいくつかまたはすべてを示す。

肺がんおよび皮膚がんなどの悪性疾患の致死性の主な原因は、転移の広がりから生じる。多くの場合、がんは診断時までに転移性であることが多いため、転移性疾患の発症を予防することはできず、この段階より前にがんが診断された場合でも、最終的に転移を引き起こす可能性のある原発巣組織の完全な外科的除去または破壊はできない場合がある。転移巣のサイズが小さく、かつ／またはそれらの存在を確実に予測するための信頼できるマーカーが原発巣にないため、転移性疾患を早期に診断することは不可能な場合がある。そのような病変は、それらに接近困難であり、播種性であり、かつ／または局所化が不十分であるため、切除法を介して治療することが困難または不可能な場合がある。特定の転移性悪性腫瘍の治療に現在選択されている化学療法／放射線療法は、効果がないか最適ではないことが多く、特に有害なおよび／または潜在的に致命的な副作用に関連する重大な欠点を有する。

抗原提示細胞（ＡＰＣ）ワクチン接種を含むものなどの免疫療法のがん治療法は、接近困難であり、播種性であり、顕微鏡的であり、再発性であり、かつ／または局所化が不十分ながん病変の治療に最適に効果的である可能性がある。有望な免疫療法の手段の１つは、樹状細胞（ＤＣ）などの専門的なＡＰＣを使用して、全身の抗がん免疫を誘発することを含む。

樹状細胞は、哺乳類の免疫系の抗原産生および提示細胞であり、抗原物質を処理し、それを細胞表面で免疫系のＴ細胞に提示し、それによってＴ細胞を新しい抗原およびリコール抗原の両方に感作させることができる。ＤＣは最も強力な抗原産生細胞であり、自然免疫系および獲得免疫系の間のメッセンジャーとして機能する。ＤＣ細胞は、腫瘍を攻撃しかつ溶解するエフェクター細胞の生成を通じて、特定の抗腫瘍免疫を刺激するために使用され得る。

敗血症は、組織の損傷、臓器不全、および死につながり得る感染に対する身体の圧倒的かつ生命を脅かす反応である。言い換えれば、それは感染に対する身体の過活動性かつ有毒性反応である。

免疫系は通常、感染を予防するために任意の病原菌（細菌、ウイルス、真菌、寄生虫）と戦うように機能する。感染が発生した場合、免疫系はそれと戦おうとするが、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、駆虫剤などの薬剤の助けが必要な場合がある。しかしながら、研究者が理解していない理由のために、免疫系は時々「侵入者」との戦いをやめ、自分自身を活性化し始める。これが敗血症の始まりである。

敗血症を発症するリスクが高い人は、一般的に感染症に罹患するリスクが高い人である。これら人々には、若年層、高齢層、慢性疾患のある人、および免疫系の低下または障害のある人が含まれる可能性がある。患者は、敗血症に関連する一連の兆候および症状を発症する場合、敗血症と診断される。敗血症は、感染自体に基づいて診断されることはない。人が敗血症の２つ以上の症状を有する場合、特に感染の兆候がある場合、または誰かがより高いリスク群の１つに属する場合、医師は敗血症を疑う可能性がある。

世界保健機関（ＷＨＯ）によって世界的な健康の優先事項として特定されている敗血症には、適切な抗生物質、輸液、必要に応じて昇圧剤、およびおそらくコルチコステロイド以外に、確証された薬物学的治療が存在しない（Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ，Ｂ．，Ｆｉｎｆｅｒ，Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｉ，Ｄ．，Ａｒａｂｉ，Ｙ．，Ｂｅｌｌｏｍｏ，Ｒ．，Ｂｉｌｌｏｔ，Ｌ．，Ｃｏｒｒｅａ，Ｍ．，Ｇｌａｓｓ，Ｐ．，Ｈａｒｗａｒｄ，Ｍ．，ｅｔａｌ．（２０１８）．ＡｄｊｕｎｃｔｉｖｅＧｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄＴｈｅｒａｐｙｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳｅｐｔｉｃＳｈｏｃｋ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７８，７９７－８０８）。入院患者における報告された死亡率は、３０％～４５％の範囲である（Ｆｉｎｆｅｒ，Ｓ．，Ｂｅｌｌｏｍｏ，Ｒ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｊ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｃ．，Ｄｏｂｂ，Ｇ．，ａｎｄＭｙｂｕｒｇｈ，Ｊ．（２００４）．Ａｄｕｌｔ－ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｓｅｖｅｒｅｓｅｐｓｉｓｉｎＡｕｓｔｒａｌｉａｎａｎｄＮｅｗＺｅａｌａｎｄｉｎｔｅｎｓｉｖｅｃａｒｅｕｎｉｔｓ．ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ．３０，５８９－５９６、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｃ．，Ｓｃｈｅｒａｇ，Ａ．，Ａｄｈｉｋａｒｉ，Ｎ．Ｋ．Ｊ．，Ｈａｒｔｏｇ，Ｃ．Ｓ．，Ｔｓａｇａｎｏｓ，Ｔ．，Ｓｃｈｌａｔｔｍａｎｎ，Ｐ．，Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｋ．，ａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＦｏｒｕｍｏｆＡｃｕｔｅＣａｒｅＴｒｉａｌｉｓｔｓ（２０１６）．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＧｌｏｂａｌＩｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄＭｏｒｔａｌｉｔｙｏｆＨｏｓｐｉｔａｌ－ｔｒｅａｔｅｄＳｅｐｓｉｓ．ＣｕｒｒｅｎｔＥｓｔｉｍａｔｅｓａｎｄＬｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１９３，２５９－２７２、Ｌｉｕ，Ｖ．，Ｅｓｃｏｂａｒ，Ｇ．Ｊ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｕｌｅ，Ｊ．，Ｗｈｉｐｐｙ，Ａ．，Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄＩｗａｓｈｙｎａ，Ｔ．Ｊ．（２０１４）．ＨｏｓｐｉｔａｌＤｅａｔｈｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈＳｅｐｓｉｓＦｒｏｍ２ＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＣｏｈｏｒｔｓ．ＪＡＭＡ３１２，９０、Ｍａｃｈａｄｏ，Ｆ．Ｒ．，Ｃａｖａｌｃａｎｔｉ，Ａ．Ｂ．，Ｂｏｚｚａ，Ｆ．Ａ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｅ．Ｍ．，ＡｎｇｏｔｔｉＣａｒｒａｒａ，Ｆ．Ｓ．，Ｓｏｕｓａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｉｘｅｔａ，Ｎ．，Ｓａｌｏｍａｏ，Ｒ．，Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．，ＰｏｎｔｅｓＡｚｅｖｅｄｏ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１７）．ＴｈｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｓｅｐｓｉｓｉｎＢｒａｚｉｌｉａｎｉｎｔｅｎｓｉｖｅｃａｒｅｕｎｉｔｓ（ｔｈｅＳｅｐｓｉｓＰＲＥｖａｌｅｎｃｅＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔＤａｔａｂａｓｅ，ＳＰＲＥＡＤ）：ａｎｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙ．ＬａｎｃｅｔＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７，１１８０－１１８９、Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｋ．，Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｒ．，Ｋｉｓｓｏｏｎ，Ｎ．，Ｍａｃｈａｄｏ，Ｆ．Ｒ．，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄＦｉｎｆｅｒ，Ｓ．（２０１７）．ＲｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇＳｅｐｓｉｓａｓａＧｌｏｂａｌＨｅａｌｔｈＰｒｉｏｒｉｔｙ－ＡＷＨＯＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７７，４１４－４１７、Ｒｈｅｅ，Ｃ．，Ｄａｎｔｅｓ，Ｒ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｉｗａｓｈｙｎａ，Ｔ．Ｊ．，Ｋａｄｒｉ，Ｓ．Ｓ．，Ａｎｇｕｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｄａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｆｉｏｒｅ，Ａ．Ｅ．，ｅｔａｌ．（２０１７）．ＩｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄＴｒｅｎｄｓｏｆＳｅｐｓｉｓｉｎＵＳＨｏｓｐｉｔａｌｓＵｓｉｎｇＣｌｉｎｉｃａｌｖｓＣｌａｉｍｓＤａｔａ，２００９－２０１４．ＪＡＭＡ３１８，１２４１）。

敗血症は、一般に、補体タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体、ＲＩＧ様受容体、マンノース結合レクチン、およびスカベンジャー受容体を含む、自然免疫系の構成要素による病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）のいずれかの同時認識によって開始される（ＨＯＴＳｈｋｉｓｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｍｏｌｄａｗｅｒ，Ｌ．Ｌ．，Ｏｐａｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｋ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｉ．Ｒ．，ａｎｄＶｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．－Ｌ．（２０１６）．Ｓｅｐｓｉｓａｎｄｓｅｐｔｉｃｓｈｏｃｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｉｓ．Ｐｒｉｍ．２，１６０４５）。認識は、冗長で補完的な活性を伴う複雑な細胞内シグナル伝達システムを誘導し、これらの複数のシグナル伝達経路の活性化は、最終的に、炎症、獲得免疫、および細胞代謝に関与するいくつかの一般的なクラスの遺伝子の発現につながる（Ｔａｎｇ，Ｄ．，Ｋａｎｇ，Ｒ．，Ｃｏｙｎｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｚｅｈ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄＬｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．（２０１２）．ＰＡＭＰｓａｎｄＤＡＭＰｓ：ｓｉｇｎａｌ０ｓｔｈａｔｓｐｕｒａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４９，１５８－１７５）。

敗血症は、サイトカイン／ケモカインの上昇（「サイトカインストーム」としても知られる）によって現れる調節不全の免疫応答を誘発し、これは疾患の重症度および予後不良とよく相関する（Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ｈ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｙ．，Ａｌｉ，Ｍ．Ｍ．，ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｆ．，Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ，Ｐ．Ｓ．，ａｎｄＮａｇａｒｋａｔｔｉ，Ｍ．（２０１５）．Ｒｏｌｅｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｓａｄｏｕｂｌｅ－ｅｄｇｅｄｓｗｏｒｄｉｎｓｅｐｓｉｓ．ＩｎＶｉｖｏ２７，６６９－６８４、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｏｇｕｒａ，Ｈ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｈ．，Ｋａｎｇ，Ｓ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｔ．，ａｎｄＳｈｉｍａｚｕ，Ｔ．（２０１８）．Ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆａｃｙｔｏｋｉｎｅｎｅｔｗｏｒｋｉｎｔｈｅａｃｕｔｅｐｈａｓｅｏｆｓｅｐｓｉｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．８，１－４）。この誇張された免疫応答は、腎臓、肝臓、肺、および心臓を含む、重要臓器の生理学的恒常性に悪影響を与え、多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）とも呼ばれる多臓器不全に発展する場合が多い（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｏｏｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｎ．Ｖ，Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｐｒｕｎｇ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄＳｉｂｂａｌｄ，Ｗ．Ｊ．（１９９５）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｒｇａｎｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｃｏｒｅ：ａｒｅｌｉａｂｌｅｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｃｌｉｎｉｃａｌｏｕｔｃｏｍｅ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．２３，１６３８－１６５２５、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．－Ｌ．（２００６）．ＯｒｇａｎＤｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳｅｖｅｒｅＳｅｐｓｉｓ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．（Ｌａｒｃｈｍｔ）．７，ｓ－６９－ｓ－７２）。

敗血症の兆候に加えて、患者が呼吸困難（肺）、尿量の低下または欠如（腎臓）、異常な肝機能検査（肝臓）、および精神状態の変化（脳）などの臓器機能障害の兆候を経験すると、敗血症は重症敗血症に進行する。重症敗血症のほぼすべての患者は、集中治療室（ＩＣＵ）での治療を必要とする。敗血症性ショックは最も重症なレベルであり、患者の血圧が危険なレベルに低下した場合に診断される。

敗血症の現在の治療としては、抗生物質の投与、および必要に応じて、感染源を排除または少なくとも制御するための外科的または介入性放射線学的アプローチ、適切な血管内容量を回復および維持するための静脈内輸液（０．９％の塩化ナトリウム溶液などの晶質液、または５％のアルブミン溶液などのコロイド溶液）の投与、心臓の収縮の強さを変えるために、必要に応じて、バソプレシンもしくはノルアドレナリンなどの滴定可能な血管収縮薬および／または変力薬の注入、ならびに必要に応じて、機械的人工呼吸、様々な形態の腎代替療法、およびまれに、静脈または静脈動脈の体外式膜型人工肺が挙げられる。

敗血症による高い死亡率および罹患率、ならびに関連する経済的負担のために、新しい薬理学的療法の必要性は明らかである。残念ながら、機械的人工呼吸を受けていた敗血症性ショックの患者における糖質コルチコイドの役割を調べた最近の研究では、ヒドロコルチゾンの持続注入の投与は、プラセボと比較して９０日後の死亡率の低下をもたらさなかったことが見出された。

敗血症患者の中で起こる生物学的活動の並行した経過のために、敗血症の治療法を見つけるための過去の試みは失敗したようである。医療チームが最高水準の治療、主に抗生物質を投与しているが、同時にサイトカイン放出症候群は増加していく。サイトカイン放出症候群は、複数の過剰な免疫活性の生物学的経路を誘発する数十種類のサイトカインが関与しているため、従来の小分子またはバイオ医薬で治療するのは困難である。このような過剰な免疫活性は、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓などの患者の健康な臓器に対する免疫キラー細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）の攻撃をもたらす可能性がある。この攻撃の結果は、臓器損傷、多臓器不全、および死亡につながる可能性がある。サイトカイン放出症候群を予防できれば、医療チームは敗血症の主要な原因（すなわち、抗生物質耐性菌）を根絶するための十分な時間を有し、患者の生存の可能性および生存統計を大幅に高める可能性がある。

アポトーシス細胞は、生理学的細胞死の１つの経路を示し、最も一般的にはアポトーシスを介して発生し、これは、認識、免疫応答、および除去プロセスを含む一連の分子恒常性維持機構を誘発する。さらに、アポトーシス細胞は、樹状細胞およびマクロファージに対する免疫寛容を直接的および間接的に誘導することができる免疫調節性細胞である。アポトーシス細胞は、樹状細胞およびマクロファージを調節し、それらを寛容原性にし、炎症誘発性サイトカインの分泌および共刺激分子の発現などの炎症誘発性活性を阻害することが示されている。

人体では３×１０^８個もの細胞が１時間ごとにアポトーシスを起こす。アポトーシス細胞によって発現される主要な「ｅａｔｍｅ」シグナルの１つは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）膜の曝露である。アポトーシス細胞自体が、貪食プロセスの「非炎症性」性質の主な原因であり、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ－１）またはアデノシン一リン酸、かつ場合によってはマクロファージおよびＤＣと相互作用する他の免疫調節「ｃａｌｍ－ｄｏｗｎ」シグナルを分泌することによるものもある。アポトーシス細胞はまた、「ｆｉｎｄｍｅ」および「ｔｏｌｅｒａｔｅｍｅ」シグナルを産生して、これらのシグナルのいくつかに特異的な受容体を発現するマクロファージおよびＤＣを引き付けて免疫調節する。

免疫系とのアポトーシス細胞相互作用の恒常性維持促進性は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＮＦ－κＢ、インフラマソーム、脂質活性化核内受容体、Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒｔｋ受容体に関連するマクロファージおよびＤＣにおける既知のアポトーシス細胞シグナル伝達事象に図示される。さらに、シグナル伝達物質の誘導、転写の活性化１、およびサイトカインシグナル伝達の抑制は、免疫系サイレンシングおよびＤＣ耐性をもたらす（Ｔｒａｈｔｅｍｂｅｒｇ，Ｕ．，ａｎｄＭｅｖｏｒａｃｈ，Ｄ．（２０１７）．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｆｏｒｉｍｍｕｎｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８）。

最近要約されたように（ＴｒａｈｔｅｍｂｅｒｇａｎｄＭｅｖｏｒａｃｈ，２０１７、同上）、アポトーシス細胞は、動物モデルとインビトロモデルの両方で、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰに由来する抗炎症性サイトカインと炎症誘発性サイトカインの両方のダウンレギュレーションとともに、異常な免疫応答に有益な効果をもたらす可能性がある。

対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、または発生率の低減のための組成物および方法に対する満たされていない必要性が依然として存在する。本明細書の以下に記載されるアポトーシス細胞調製物、組成物、およびそれらの使用は、対象におけるがんまたは腫瘍を治療、予防、成長を阻害、または発生率を低減するために使用され得る初期アポトーシス細胞の集団を提供することによって、この必要性に対処する。さらに、本明細書に記載の使用方法は、がんまたは腫瘍の寛解の増加を含む、がんおよび腫瘍に罹患している対象の生存を増加させる必要性に対処する。

さらに、敗血症患者の臓器不全および死亡の予防を含む、敗血症を治療する組成物および方法に対する満たされていない必要性が依然として存在する。

本明細書に記載の使用方法は、敗血症に罹患している対象の生存を増加させる必要性に対処し、臓器不全の予防を含む、敗血症を治療するための予想外の解決策を提供する。

一態様では、本明細書に開示されるのは、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、もしくは緩和、またはそれらの任意の組み合わせの方法であり、この方法は、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

関連する態様では、敗血症は、軽度または重症敗血症を含む。いくつかの実施形態では、敗血症の原因は、肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染症、または尿路感染症（ＵＴＩ）を含む。

別の関連する態様では、この方法は、該対象の生存の増加をもたらす。別の関連する態様では、この方法によって治療される対象における、臓器不全もしくは臓器機能障害、または臓器損傷、またはそれらの組み合わせの発生率は低減される。さらなる関連する態様では、臓器不全は、急性多臓器不全を含む。

関連する態様では、初期アポトーシス細胞集団は、
（ａ）単核に富む細胞集団、または（ｂ）２４時間超安定しているアポトーシス集団、または（ｃ）単核アポトーシス細胞集団であって、非静止非アポトーシス細胞の減少、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、もしくはそれらの任意の組み合わせを備えた、単核アポトーシス細胞集団、それの任意の組み合わせを含む。関連する態様では、初期アポトーシス細胞集団は、初期アポトーシス細胞のプールされた集団を含む。

関連する態様では、必要する対象はヒト対象である。

関連する態様では、投与は、該初期アポトーシス細胞集団の単回注入を含む。さらなる関連する態様では、投与は、該アポトーシス細胞集団の複数回注入を含む。追加の関連する態様では、投与は、静脈内投与を含む。

関連する態様では、方法は、追加の療法を投与することをさらに含む。さらなる関連する態様では、追加の療法は、該初期アポトーシス細胞の投与の前、同時、または後に投与される。

関連する態様では、方法は、第一選択療法を含む。別の関連する態様では、方法は、アジュバント療法を含む。

特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。この特許または特許出願公開とカラー図面のコピーは、要求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、官庁から提供される。

本明細書に開示される本主題は、本明細書の結論部分で特に指摘され、明確に特許請求される。しかしながら、本明細書に開示される組成物および方法は、組織および操作方法の両方に関して、その目的、特徴、および利点と併せて、以下の詳細な説明を参照することにより、添付の図面とともに読まれる場合に最も良く理解され得る。

標準的なＣＡＲＴ細胞療法を使用してアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を産生する患者における安全かつ効果的なＣＡＲＴ細胞がん療法の方法の実施形態を示す概略図。患者自身の細胞（自家）を使用してアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を産生する患者における安全かつ効果的なＣＡＲＴ細胞がん療法の方法の実施形態を示す概略図。ドナー細胞を使用してアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を産生する患者における安全かつ効果的なＣＡＲＴ細胞がん療法の方法の実施形態を示す概略図。抗凝固剤がプロセスに含まれる、初期アポトーシス細胞集団の製造プロセスの一実施形態中のステップを示すフローチャート。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、Ａｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、がんの存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ－１０レベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でＡｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、マクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ－６レベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、Ａｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＭＩＰ－１αレベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、Ａｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ－８レベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、Ａｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－αレベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４で、Ａｐｏｃｅｌｌを２４時間で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＭＩＰ－１βレベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４で、Ａｐｏｃｅｌｌを２４時間で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＭＣＰ－１レベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８および１：１６で、Ａｐｏｃｅｌｌを２つの時間帯（６時間および２４時間）で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ－９レベルの低減を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。マクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４で、Ａｐｏｃｅｌｌを２４時間で投与した後の、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導性ＩＬ－２Ｒレベルの増加を示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。アポトーシス細胞は、がん環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ無菌モデルにおいて誘導されるサイトカインストームのインビトロモデルでサイトカインストームを予防する。アポトーシス細胞が細胞からのＩＬ－２放出をダウンレギュレートしないことを示す。アポトーシス細胞は、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、アポトーシス細胞（ｎ＝３）の用量を増やしながら２４時間にわたってマクロファージ／単球とともにインキュベートされた。空のバー（アウトラインのみ）－ウェルあたり２．５×１０^６のアポトーシス細胞、黒－ウェルあたり５×１０^６のアポトーシス細胞、灰色－ウェルあたり１０×１０^６のアポトーシス細胞。形質導入されたＴ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗ＣＤ１２４分析のフローサイトメトリー結果を示すＴ細胞の形質導入の検証。Ｔ４^＋ＣＡＲＴ－細胞は、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ卵巣腺がん細胞の増殖を低減させた。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞の単層を非形質導入Ｔ細胞またはＴ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかで培養した細胞毒性アッセイの結果を、棒グラフで提示する。アポトーシス細胞はＴ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を抑制しない。結果は細胞毒性アッセイに基づいており、ビヒクル（ハルトマン溶液）、またはアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）、またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）、またはアポトーシス細胞および単球／マクロファージの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）の存在下で、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞の単層を非形質導入Ｔ細胞またはＴ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかで培養した。細胞毒性の間に高レベルで分泌されるＩｌ－６は、アポトーシス細胞によってダウンレギュレートされる。ここに示される結果は、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃおよびヒト単球／マクロファージの共培養が、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）、またはＡｐｏｃｅｌｌの上清（ＡｐｏＳｕｐ）、またはアポトーシス細胞および単球／マクロファージの共培養（ＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）に曝露された効果を示す。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中のＬＰＳ曝露後の、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはアポトーシス細胞および単球の共培養の効果。リポ多糖（ＬＰＳ）を細胞毒性アッセイに加えた場合、ＩＬ－６の非常に高い分泌が記録された。結果は、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）、またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）、またはアポトーシス細胞および単球／マクロファージの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）への曝露が、ＩＬ－６をダウンレギュレートし、ＩＬ－６が許容レベルに低減したことを示す。ＣＡＲＴ細胞臨床療法を模倣したＣＡＲＴ細胞治療中のＬＰＳ曝露後の、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはアポトーシス細胞および単球の共培養の効果。リポ多糖（ＬＰＳ）を細胞毒性アッセイに加えた場合、ＩＬ－６の非常に高い分泌が記録された。結果は、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）、またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）、またはアポトーシス細胞および単球／マクロファージの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）への曝露が、ＩＬ－６をダウンレギュレートし、ＩＬ－６が許容レベルに低減したことを示す。淘汰時のマウスの体重および腫瘍サイズ実験期間中の体重変化を示す。青－４．５×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞を投与されていない対照。赤－０．５×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞。緑－１．０×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞。紫－４．５×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞。４．５×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞を受けているマウスの注射後３９日目の代表的なＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍を示す。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の成長。対照（ＰＢＳ）と０．５×１０^６、１×１０^６、および４．５×１０^６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞の接種との間の違いを示す生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって撮像されたＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍を担持するマウスを提示する。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍負荷。インビボでのＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の生物発光（ＢＬＩ）の定量化（図１２を参照）。製造元の指示に従って、６００フォトンカウントのカットオフが実装された。０．５×１０６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃを接種したマウス。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍負荷。インビボでのＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の生物発光（ＢＬＩ）の定量化（図１２を参照）。製造元の指示に従って、６００フォトンカウントのカットオフが実装された。１×１０６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃを接種したマウス。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍負荷。インビボでのＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の生物発光（ＢＬＩ）の定量化（図１２を参照）。製造元の指示に従って、６００フォトンカウントのカットオフが実装された。４．５×１０６ＳＫＯＶ３－ｌｕｃを接種したマウス。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍負荷。インビボでのＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の生物発光（ＢＬＩ）の定量化（図１２を参照）。製造元の指示に従って、６００フォトンカウントのカットオフが実装された。平均ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍の成長。ＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞の細胞毒性キャリブレーション。Ｒａｊｉ細胞を様々な細胞密度で播種し、遠心分離の直前に細胞溶解を行った。結果は、Ｒａｊｉ細胞数（ｘ軸）対４９２ｎｍでの吸光度（ｙ軸）を示す。すべての細胞数は、溶解していない対応物と比較して有意な読み取り値を示した。初期アポトーシス細胞の添加は、ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性に影響を与えない。Ｅ／Ｔ比は、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞とＨｅＬａ細胞の比を示す。生存率はＣＤ１９＋腫瘍細胞のものである。塗りつぶした円ＣＤ１９＋Ｈｅｌａ、空の三角形ＣＤ１９＋Ｈｅｌａ＋ナイーブＴ細胞、塗りつぶした三角形ＣＤ１９＋Ｈｅｌａ＋ＣＡＲＴ－ＣＤ１９、空の円ＣＤ１９＋Ｈｅｌａ＋ＣＡＲＴ－ＣＤ１９＋ＡｐｏＣｅｌｌ。アポトーシス細胞の存在下および非存在下でのＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞におけるサイトカイン分析（ＧＭ－ＣＳＦ）。棒グラフは、単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートされたＲａｊｉ細胞の培養上清に見られるサイトカインＧＭ－ＣＳＦ（ｐｇ／ｍｌ）の濃度測定値を示し、その後に、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ）、ならびに１：８のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：８）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、１：３２のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：３２）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、ならびに１：６４のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：６４）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を添加した。アポトーシス細胞の存在下および非存在下でのＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞におけるサイトカイン分析（ＴＮＦ－アルファ）。棒グラフは、単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートされたＲａｊｉ細胞の培養上清に見られるサイトカインＴＮＦアルファ（ＴＮＦ－ａ）（ｐｇ／ｍｌ）の濃度測定値を示し、その後に、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ）、ならびに１：８のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：８）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、１：３２のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：３２）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、ならびに１：６４のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：６４）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を添加した。実験スキーム。ＣＡＲＴ細胞療法に対するアポトーシス細胞の影響を分析するための実験スキームを示す。ＳＣＩＤマウスに１日目にＲａｊｉがん細胞を注射した後、６日目にＣＡＲＴ－ＣＤ１９細胞（ＣＡＲＴ細胞療法）およびアポトーシス細胞を投与した。実験スキーム。ＣＡＲＴ細胞療法がＡｐｏＣｅｌｌの同時投与によって悪影響を受けなかったことを示す。生存曲線：ＳＣＩＤマウスに、初期アポトーシス細胞の添加の有無にかかわらず、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を注射した。インビボモデルの固形腫瘍において、腫瘍からの炎症誘発性サイトカインの放出の増加。ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＣＩＤマウスの腹膜に存在する固形腫瘍から放出されるＩＬ－６のわずかな増加を示し、ＩＬ－６放出は、ＨｅＬａＣＡＲ－ＣＤ－１９ＣＡＲＴ細胞の存在下で有意に増加する。インビボモデルの固形腫瘍において、腫瘍からの炎症誘発性サイトカインの放出の増加。ＢＡＬＢ／ｃおよびＳＣＩＤマウスの腹膜に存在する固形腫瘍から放出されるＩＰ－１０のわずかな増加を示し、ＩＰ－１０放出は、ＨｅＬａＣＡＲ－ＣＤ－１９ＣＡＲＴ細胞の存在下で有意に増加した。インビボモデルの固形腫瘍において、腫瘍からの炎症誘発性サイトカインの放出の増加。驚くべきことに、ＴＮＦ－α放出でさえ、ＨｅＬａＣＡＲ－ＣＤ－１９ＣＡＲＴ細胞の存在下で増加することを示す。ＡｐｏＣｅｌｌの存在下または非存在下で、ＨｅＬａＣＤ１９（白血病）のＩＰモデルにおけるＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を試験する。ＨｅＬａ－ＣＤ１９－青、ＨｅＬａＣＤ１９＋Ｍｏｃｋ－緑、ＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ－紫、およびＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－オレンジ。０．５×１０^６－ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞を用いたものである。ＡｐｏＣｅｌｌの存在下または非存在下で、ＨｅＬａＣＤ１９（白血病）のＩＰモデルにおけるＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を試験する。ＨｅＬａ－ＣＤ１９－青、ＨｅＬａＣＤ１９＋Ｍｏｃｋ－緑、ＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ－紫、およびＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－オレンジ。２．２×１０^６－ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞を用いたものである。インビボびまん性腫瘍ＳＣＩＤマウスモデルの生存曲線。曲線は、初期アポトーシス細胞（ＡＰＯ、太い破線－－－－）の投与が、アポトーシス細胞を投与されていないマウス（ＡＰＯなし；点線・・・・）と比較して生存を延ばしたことを示し、対照ＳＣＩＤマウスは１００％の生存を示した（実線＿＿＿＿＿＿）。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させた。コホート：白血病なし（対照－縞模様）、白血病＋初期アポトーシス細胞（斑点）、白血病のみ（灰色の実線）。合計ｎ＝５１（ｐ＜０．００１）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命まで生存するマウスの割合を増加させたアポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させた。コホート：白血病なし（対照－縞模様）、白血病＋初期アポトーシス細胞（斑点）、白血病のみ（灰色の実線）。合計ｎ＝５１（ｐ＜０．００１）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大１２％生存するマウスの割合を増加させた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させた。コホート：白血病なし（対照－縞模様）、白血病＋初期アポトーシス細胞（斑点）、白血病のみ（灰色の実線）。合計ｎ＝５１（ｐ＜０．００１）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大３０％生存するマウスの割合を増加させた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させた。コホート：白血病なし（対照－縞模様）、白血病＋初期アポトーシス細胞（斑点）、白血病のみ（灰色の実線）。合計ｎ＝５１（ｐ＜０．００１）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大１００％生存し、完全寛解を達成するマウスの割合を増加させた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療効果を高めた。コホート：白血病のみ（灰色の実線）、白血病＋初期アポトーシス細胞（縞模様）、白血病＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ（チェック模様）、白血病＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞（斑点）。合計ｎ＝２８（ｐ＜０．００２）。Ｒａｊｉ細胞による白血病誘発後のマウスの予想寿命までのパーセント（％）生存率を示す。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療効果を高めた。コホート：白血病のみ（灰色の実線）、白血病＋初期アポトーシス細胞（縞模様）、白血病＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ（チェック模様）、白血病＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞（斑点）。合計ｎ＝２８（ｐ＜０．００２）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大２４％長く生存するマウスの割合を増加させた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療効果を高めた。コホート：白血病のみ（灰色の実線）、白血病＋初期アポトーシス細胞（縞模様）、白血病＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ（チェック模様）、白血病＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞（斑点）。合計ｎ＝２８（ｐ＜０．００２）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大５９％長く生存するマウスの割合を増加させ、白血病マウスの寿命に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂ効果を高めた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療効果を高めた。コホート：白血病のみ（灰色の実線）、白血病＋初期アポトーシス細胞（縞模様）、白血病＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ（チェック模様）、白血病＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞（斑点）。合計ｎ＝２８（ｐ＜０．００２）。アポトーシス細胞注入は、白血病誘発後の予想寿命の最大７６％長く生存するマウスの割合を増加させ、白血病マウスの寿命に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂ効果を高めた。アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の治療効果を高めた。コホート：白血病のみ（灰色の実線）、白血病＋初期アポトーシス細胞（縞模様）、白血病＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ（チェック模様）、白血病＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞（斑点）。合計ｎ＝２８（ｐ＜０．００２）。アポトーシス細胞注入は、完全寛解を達成するマウスの割合を増加させた。ＡｐｏＣｅｌｌを受けたＲａｊｉ白血病／リンパ腫を有するＳＣＩＤ－Ｂｇマウスのカプラン・マイヤー生存率プロット。（ＲＰＭＩ群、ｎ＝１５、Ｒａｊｉ群、ｎ＝２３、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群、ｎ＝２４）ＲＰＭＩ（対照）－黒、Ｒａｊｉのみ－オレンジ、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－青。カプラン・マイヤー生存率プロット。７週齢の雌ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（ＥＮＶＩＧＯ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）にマウスあたり０．１×１０^６個のＲａｊｉ細胞（ｎ＝１０／群、３群）を静脈内注射した研究のデータを示す。マウスは、３０×１０^６ＡｐｏＣｅｌｌの３回の静脈内投与（５、８、１１日目）を受けた。（ＲＰＭＩ－薄い青、Ｒａｊｉ－オレンジ、およびＲａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－濃い青）カプラン・マイヤー生存率プロット。７週齢の雌ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（ＥＮＶＩＧＯ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）にマウスあたり０．１×１０^６個のＲａｊｉ細胞（ｎ＝１０／群、３群）を静脈内注射した研究のデータを示す。マウスは、３０×１０^６ＡｐｏＣｅｌｌの３回の静脈内投与（５、８、１１日目）を受けた。（ＲＰＭＩ－黒、Ｒａｊｉ－オレンジ、およびＲａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－濃い青）カプラン・マイヤー生存率プロット。８～９週齢の雌ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（ＥＮＶＩＧＯ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）にマウスあたり０．１×１０^６個のＲａｊｉ細胞（ｎ＝１０／群、２群）を静脈内注射した研究のデータを示す。マウスは、３０×１０^６ＡｐｏＣｅｌｌの３回の静脈内投与（５、８、１２日目）を受けた。（Ｒａｊｉ－オレンジ、およびＲａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－濃い青）ＲｔＸおよびＡｐｏＣｅｌｌを受けたＲａｊｉ白血病／リンパ腫を有するＳＣＩＤ－Ｂｇマウスのカプラン・マイヤー生存率プロット。（Ｒａｊｉのみ－オレンジ、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－青、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ２ｍｇ－緑、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ２ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－黄色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ５ｍｇ－紫、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ５ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－灰色）。ｒｔｘおよびＡｐｏＣｅｌｌを受けたＲａｊｉ白血病／リンパ腫を有するＳＣＩＤ－Ｂｇマウスのカプラン・マイヤー生存率プロット。（Ｒａｊｉのみ－オレンジ、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－青、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ２ｍｇ－緑、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ２ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ－黄色）。プールされたＡｐｏＣｅｌｌ調製の効果。図２８は、複数の個々のドナー（青）からの単一のアポトーシス細胞調製物の注射による生存率に対する明らかな効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフを提示する。提示されたグラフは、単回照射された複数の個々のドナーからプールされたアポトーシス細胞調製物で処理されたＧｖＨＤマウスモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線である。プールされたＡｐｏＣｅｌｌ調製の効果。図２９は、複数の個々のドナー（青）からの単一のアポトーシス細胞調製物の注射による２つの比較群の体重減少のパーセンテージに対する明らかな効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフを提示する。単一ドナー対プールされたＡｐｏＣｅｌｌ調製物の比較。図３０は、誘発性ＧｖＨＤのマウスモデルを使用した生存率％について、単回用量の単一ドナーおよび複数ドナーのアポトーシス細胞調製物＋／－照射の投与の比較を示すグラフを示す。効力試験。図３１Ａ～３１Ｂは、ＨＬＡ－ＤＲの発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。新鮮な最終産物Ａ（ｔ０）のＨＬＡＤＲ平均蛍光。効力試験。図３１Ａ～３１Ｂは、ＨＬＡ－ＤＲの発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。２～８℃で２４時間後の新鮮な最終産物ＡのＨＬＡＤＲ平均蛍光。効力試験。図３２Ａ～３２Ｂは、ＣＤ８６の発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。新鮮な最終産物Ａ（ｔ０）のＣＤ８６平均蛍光。効力試験。図３２Ａ～３２Ｂは、ＣＤ８６の発現によって測定された、アポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟の阻害を示す効力試験の結果を提示する。２～８℃で２４時間後の新鮮な最終産物ＡのＣＤ８６平均蛍光。敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用の前臨床分析の結果。抗生物質およびＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ（本明細書に記載の初期アポトーシス細胞）を受けたマウスの生存率の増加を示す。敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用の前臨床分析の結果。異なるコホートの臨床スコアを示し、臨床スコアは、ＣＬＰ誘発性敗血症モデル対象におけるマウスの生存と相関する。敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用の前臨床分析の結果。Ａｌｌｏｃｅｔｒａが、敗血症誘発後の制御されないサイトカインシグナル伝達事象、すなわちサイトカインストームを予防し、ＣＬＰ誘発性敗血症モデル対象における生存率の増加をもたらすことを示す。敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用の前臨床分析の結果。Ａｌｌｏｃｅｔｒａで処理されたＣＬＰ誘発性敗血症モデル対象の用量依存的な生存率の増加を示す。敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用の前臨床分析の結果。Ａｌｌｏｃｅｔｒａで処理されたＣＬＰ誘発性敗血症モデル対象の用量依存的な生存率の増加を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。ＣＬＰの２４時間後、ナイーブマウス（ｎ＝２１）は病気の兆候を示さなかったが、ＣＬＰマウスの大部分（ｎ＝４０）は重症の臨床兆候を示した（ＭＳＳ臨床スコアの中央値１３、中央値の９５％ＣＩ９～１４）、＊＊両側マンホイットニー検定によってＰ＜０．０００１。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。肺と胴体の重量比は、敗血症の重症度とともに有意に増加する。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。ナイーブマウス（上部パネル）およびＣＬＰマウス（下部パネル）の代表的な２Ｄ心エコー図であり、タイムラプスビュー（Ｍモード）および上面ビュー（Ｂモード）を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。心拍数を含む左心室構造および機能の様々なパラメータの計算のために、左心室内部距離、心拍数、および後部の壁厚を測定した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。左心室容積を含む左心室構造および機能の様々なパラメータの計算のために、左心室内部距離、心拍数、および後部の壁厚を測定した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する呼吸器および心血管機能障害の兆候を示す。心拍出量を含む左心室構造および機能の様々なパラメータの計算のために、左心室内部距離、心拍数、および後部の壁厚を測定した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する腎機能障害の兆候を示す。腎機能障害は、血中尿素の濃度の増加によって示される。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する腎機能障害の兆候を示す。腎機能障害は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）の濃度の増加によって示される。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスは、敗血症の重症度と相関する腎機能障害の兆候を示す。腎機能障害は、血清カリウムの濃度の増加によって示される。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、総ビリルビン血清濃度においてわずかなかつ有意ではない（ｐ＞０．９３）増加を有した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは敗血症の重症度とともに有意に減少した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、総ビリルビン血清濃度においてわずかなかつ有意ではない（ｐ＞０．９３）増加を有したが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルは敗血症の重症度とともに有意に減少した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、アルカリホスファターゼレベルは敗血症の重症度とともに有意に減少した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、アルブミンレベルは敗血症の重症度とともに有意に減少した。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。ＣＬＰの２４時間後、重症敗血症（ＭＳＳ臨床スコア＞１３）を有するマウスでは、グロブリン血清濃度は有意に変化しなかった。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。肝機能障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。敗血症マウス、特に軽度の敗血症マウス（ＭＳＳ臨床スコア１～４）のグルコースレベルは、ナイーブマウスよりも低かった。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症ならびに異常な補体活性化。ＣＬＰの２４時間後、敗血症マウスはナイーブマウスよりも血小板数が有意に少なかった。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、無関係の凡例の下に示され、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症ならびに異常な補体活性化。ＣＬＰマウス、主に軽度の敗血症（ＭＳＳ臨床スコア１～４）のマウスにおけるＷＢＣの減少。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、無関係の凡例の下に示され、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症ならびに異常な補体活性化。ＣＬＰマウス、主に軽度の敗血症（ＭＳＳ臨床スコア１～４）のマウスにおけるリンパ球数の減少。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、無関係の凡例の下に示され、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症ならびに異常な補体活性化。Ｃ５ａ血清濃度は、臨床スコアに関係なく、敗血症マウスにおいてより高い。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、無関係の凡例の下に示され、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症ならびに異常な補体活性化。Ｃ３ａ血清濃度は、臨床スコアに相関して敗血症マウスにおいてより低い。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表し、群サイズ（Ｎ）は、無関係の凡例の下に示され、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との有意差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の有意差を示す。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。ＣＬＰの２４時間後、敗血症の重症度とともに血中ｐＨが有意に減少した。図３８Ａ、３８Ｃ、３８Ｅ、および３８Ｆのデータは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。ナイーブおよびＣＬＰマウスからのＰＢＭＣのＯＣＲ測定は、主に重症敗血症マウス（ＭＳＳ臨床スコア＞１０）で異常なミトコンドリア呼吸を示し、主に図３８Ｃの結合効率の減少によって表される。データは、平均±標準偏差として表され、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示される。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。ナイーブおよびＣＬＰマウスからのＰＢＭＣのＯＣＲ測定は、主に重症敗血症マウス（ＭＳＳ臨床スコア＞１０）で異常なミトコンドリア呼吸を示し（図３８Ｂ）、主に結合効率の減少によって表される。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。ナイーブおよびＣＬＰマウスからのＰＢＭＣの細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）測定は、一般的な解糖機能の軽度の変化のみを示し、中等度の敗血症マウスではわずかに増加した（ＭＳＳ臨床スコア７～８．５）。データは、平均±標準偏差として表され、群サイズ（Ｎ）は、それぞれの凡例の下に示される。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。このアッセイにおけるＰＢＭＣの解糖予備能は、重症敗血症マウスで有意に減少した（ＭＳＳ臨床スコア＞１４）。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスは有害な代謝変化を呈する。血中乳酸濃度はＣＬＰマウスでわずかに低かった。データは、四分位数間範囲（ＩＱＲ）内の中央値として示され、平均値は「＋」記号でマークされ、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表され、ダン検定を使用して調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による^＊Ｐ≦０．０１、^＊＊Ｐ≦０．００１、^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。バーの上のＰ値は、対照群との差を示し、括弧の上のＰ値は、他の２つの群間の差を示す。ＣＬＰマウスに対するＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの有益な効果。別途示されない限り、ＣＬＰの４時間後、マウスにエルタペネムおよびハルトマン溶液（ビヒクル）または２０×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのいずれかを静脈内注射した。ＭＳＳ臨床スコアが＞１５の場合、マウスの健康状態をモニターし、安楽死させた。エルタペネム＋ビヒクルまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのいずれかで処理されたＣＬＰマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。各群のマウスの数（Ｎ）は、それぞれの凡例の横に示される。ＣＬＰマウスに対するＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの有益な効果。別途示されない限り、ＣＬＰの４時間後、マウスにエルタペネムおよびハルトマン溶液（ビヒクル）または２０×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのいずれかを静脈内注射した。ＭＳＳ臨床スコアが＞１５の場合、マウスの健康状態をモニターし、安楽死させた。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理マウスの生存期間中央値の増加、エラーバーは９５％ＣＩを表し、ダン検定を使用することによって調整された多重比較を使用するＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析による＊Ｐ≦０．０１。各群のマウスの数（Ｎ）は、それぞれの凡例の横に示される。ＣＬＰマウスに対するＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの有益な効果。別途示されない限り、ＣＬＰの４時間後、マウスにエルタペネムおよびハルトマン溶液（ビヒクル）または２０×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのいずれかを静脈内注射した。ＭＳＳ臨床スコアが＞１５の場合、マウスの健康状態をモニターし、安楽死させた。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理マウスの平均ＭＳＳ臨床スコアの減少。エラーバーは標準エラーを表し、＊＊＊非線形曲線フィットの通常の一元配置分散分析による^＊＊＊Ｐ≦０．０００１。各群のマウスの数（Ｎ）は、それぞれの凡例の横に示される。ＣＬＰマウスに対するＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの有益な効果。別途示されない限り、ＣＬＰの４時間後、マウスにエルタペネムおよびハルトマン溶液（ビヒクル）または２０×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのいずれかを静脈内注射した。ＭＳＳ臨床スコアが＞１５の場合、マウスの健康状態をモニターし、安楽死させた。エルタペネム＋様々な用量のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで処理されたＣＬＰマウスのカプラン・マイヤー生存曲線。各群のマウスの数（Ｎ）は、それぞれの凡例の横に示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＬ－６を含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＴＮＦ－αを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＬ－１βを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＬ－１０を含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＭＩＰ－１ａを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＭＩＰ－１ｂを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＲＡＮＴＥＳを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＥＮＡ－７８を含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＬ－１７ａを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＰ－１０含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＶＥＧＦ－αを含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ処理は、ＣＬＰ後のサイトカイン／ケモカイン放出を弱毒化する。血液試料は、エルタペネムまたはエルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせ（ＯＴＳ－ＡＬＣ）のいずれかで処理した後、ＣＬＰの前およびＣＬＰの２４時間後、４８時間後、および７２時間後にＣ５７ＢＬ／６マウスから採取した。未処理のＣＬＰマウスは２４時間以上生存しなかったため、データは示されない。サイトカイン／ケモカインレベルは、ＩＬ－１２ｐ７０を含むＬｕｍｉｎｅｘによって測定された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの治療後に炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの両方が低減することを示す。データは平均±標準偏差として提示される。患者の特徴－２０１６年～２０１８年の間に、ＩｓｒａｅｌのＪｅｒｕｓａｌｅｍにあるＨａｄａｓｓａｈＥｉｎＫｅｒｅｍ病院の医療集中ユニットに入院したすべての既存適合対照が調査された。既存対照を、年齢（±３歳）、性別マッチング、入院時の逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア（±２）、および敗血症の原因に基づいて患者に適合させた。入院の最初の２４時間に取得されたＡＰＡＣＨＥＩＩスコア（一般的な状態および慢性疾患に応じて死亡率を予測するスコア）に基づく６人の患者の治療群の生存確率は５２．９５％であった。しかしながら、治療群で死亡した患者はいなかった。入院時の患者（治療済みおよび対照）のＳＯＦＡスコアを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－治療済み）。患者の特徴－２０１６年～２０１８年の間に、ＩｓｒａｅｌのＪｅｒｕｓａｌｅｍにあるＨａｄａｓｓａｈＥｉｎＫｅｒｅｍ病院の医療集中ユニットに入院したすべての既存適合対照が調査された。既存対照を、年齢（±３歳）、性別マッチング、入院時の逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア（±２）、および敗血症の原因に基づいて患者に適合させた。入院の最初の２４時間に取得されたＡＰＡＣＨＥＩＩスコア（一般的な状態および慢性疾患に応じて死亡率を予測するスコア）に基づく６人の患者の治療群の生存確率は５２．９５％であった。しかしながら、治療群で死亡した患者はいなかった。入院時の患者の年齢分布を示す。（黒－適合対照、縞模様－治療済み）。Ｙ軸は、患者のパーセントである。Ｘ軸は年齢である。患者の特徴－２０１６年～２０１８年の間に、ＩｓｒａｅｌのＪｅｒｕｓａｌｅｍにあるＨａｄａｓｓａｈＥｉｎＫｅｒｅｍ病院の医療集中ユニットに入院したすべての既存適合対照が調査された。既存対照を、年齢（±３歳）、性別マッチング、入院時の逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコア（±２）、および敗血症の原因に基づいて患者に適合させた。入院の最初の２４時間に取得されたＡＰＡＣＨＥＩＩスコア（一般的な状態および慢性疾患に応じて死亡率を予測するスコア）に基づく６人の患者の治療群の生存確率は５２．９５％であった。しかしながら、治療群で死亡した患者はいなかった。肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）または尿路感染症（ＵＴＩ）による患者のパーセントおよび敗血症の原因（治療済みおよび対照）を示す。Ｙ軸は、患者のパーセントである。比較中間データ：治療済みおよび未治療の適合対照の患者集団。図４２は、６人の治療済み患者および３７人の適合対照患者の比較中間データを表形式で示す。比較中間データ：入院時のＳＯＦＡおよび敗血症関連死亡率。図４３は、適合対照群の場合、死亡率は主に入院時の低いＳＯＦＡスコアと関連していたことを示す。比較中間データ：敗血症からの回復。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが敗血症の治療に非常に効果的であることを示す。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療されたすべての患者の１００％が、適合対照のわずか４８％と比較して、肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、および尿路感染症（ＵＴＩ）を含める敗血症の原因とは無関係に、２８日以内に敗血症から回復したことを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：敗血症からの回復。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが敗血症の治療に非常に効果的であることを示す。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療された敗血症患者（敗血症の原因：肺炎および血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ））の１００％が、適合対照のわずか４５％と比較して、２８日以内に敗血症から回復したことを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：敗血症からの回復：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、入院後迅速な敗血症の治療に非常に効果的である。図４５は、入院からの日数に基づいて敗血症から完全に回復した患者の％を示し、治療済み患者の１００％（濃い灰色の線）は、適合対照の４０％未満（薄い灰色の線）と比較して８日目までに回復した。比較トップラインデータ：敗血症からの回復：死亡率データは、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが敗血症関連の死亡率の予防に非常に効果的であることを示す。２９％（適合対照）および２３％（文献）の死亡率と比較して、肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、および尿路感染症（ＵＴＩ）を含める敗血症の原因とは無関係に、Ａｌｌｏｃｅｔｒａで治療された患者の死亡はなかったことを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－文献）。比較トップラインデータ：敗血症からの回復：死亡率データは、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが敗血症関連の死亡率の予防に非常に効果的であることを示す。３４％（適合対照）および２８％（文献）の死亡率と比較して、敗血症の原因が肺炎および血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含める場合に、Ａｌｌｏｃｅｔｒａで治療された患者の死亡はなかったことを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－文献）。比較中間データ：ＩＣＵ入院期間中、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳにより患者の臨床状態が改善し、ＩＣＵからの解放を早めることを示す。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療された患者の１００％と比較して、６日後にすべての適合対照の４３％のみがＩＣＵから解放されたことを示す。（治療済み－黒い破線、適合対照－点線）比較中間データ：ＩＣＵ入院期間中、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳにより患者の臨床状態が改善し、ＩＣＵからの解放を早めることを示す。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療された患者の１００％と比較して、６日後に適合対照（ＵＴＩ対照を除く）の３５％のみがＩＣＵから解放されたことを示す。（治療済み－黒い破線、適合対照－灰色の実線、データ収集は１００％で開始）比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが臓器機能障害と不全を予防することを示す臓器機能障害および不全。肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、および尿路感染症（ＵＴＩ）を含める敗血症の原因とは無関係に、すべての対象の平均ベースラインＳＯＦＡおよび最大ＳＯＦＡを示す（治療済みおよび適合対照）。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが臓器機能障害と不全を予防することを示す臓器機能障害および不全。ＵＴＩ患者を除く対象（治療済みおよび適合対照）の平均ベースラインＳＯＦＡおよび最大ＳＯＦＡを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが臓器機能障害と不全を予防することを示す臓器機能障害および不全。肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、および尿路感染症（ＵＴＩ）を含める敗血症の原因とは無関係に、すべての対象の中央値ベースラインＳＯＦＡおよび最大ＳＯＦＡを示す（治療済みおよび適合対照）。ベースラインＳＯＦＡでは治療済み患者および過去の対照との間に差はないが、最大ＳＯＦＡの間には劇的な違いがあり、治療済み患者は敗血症の経過で進行しなかったことを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが臓器機能障害と不全を予防することを示す臓器機能障害および不全。ＵＴＩ患者を除く対象（治療済みおよび適合対照）の平均値ベースラインＳＯＦＡおよび最大ＳＯＦＡを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療済み）比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳによる治療がＳＯＦＡスコアの増加を予防したことを示す臓器機能障害および不全。肺炎、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、および尿路感染症（ＵＴＩ）を含む敗血症の原因とは無関係に、入院時からＳＯＦＡスコアが増加したすべての患者のパーセントを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療済み）。比較中間データ：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳによる治療がＳＯＦＡスコアの増加を予防したことを示す臓器機能障害および不全。入院時からＳＯＦＡスコアが増加した患者のパーセントを示し、敗血症の原因には、肺炎および血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が含まれる。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療済み）。比較中間データ：ＳＯＦＡの４ポイント以上の増加を予防することが死亡率を予防するために重要であり、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳによる治療がＳＯＦＡの４ポイント以上の増加を予防することを示す臓器機能障害および不全。ＳＯＦＡが４以上増加した患者の死亡率の割合を示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療済み）。比較中間データ：ＳＯＦＡの４ポイント以上の増加を予防することが死亡率を予防するために重要であり、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳによる治療がＳＯＦＡの４ポイント以上の増加を予防することを示す臓器機能障害および不全。ＳＯＦＡが４以上増加した患者のパーセントを示す。（黒－適合対照、薄い灰色－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療済み）。

以下の発明を実施するための形態では、本明細書に開示される方法の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が記載される。しかしながら、これらの方法はこれらの具体的な詳細を伴わずに実践され得ることが、当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本明細書に開示される方法を不明瞭にしないように、周知の方法、手順、および構成要素は詳細に説明されていない。

免疫細胞の遺伝子改変は、がんに対する免疫細胞療法の戦略として周知である。これらの免疫細胞療法は、自家または同種異系の免疫細胞を操作し、必要とする対象に投与することに基づく。免疫細胞ベースの療法としては、ナチュラルキラー細胞療法、樹状細胞療法、ならびにナイーブＴ細胞、Ｔヘルパー細胞としても知られるエフェクターＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を利用することを含むＴ細胞免疫療法が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、樹状細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞およびアポトーシス細胞からの上清を含む組成物である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ細胞）である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法中にキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）の増殖速度を維持または増加させる方法であり、この方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を該対象に投与するステップを含み、該増殖率は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、かつ該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して、対象において維持または増加する。

関連する実施形態では、方法は、該ＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を低減または阻害しない。関連する実施形態では、方法は、該ＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を改善する。別の関連する実施形態では、該対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率は、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して阻害または低減される。

いくつかの実施形態では、ＣＲＳは自発的に発生する。別の実施形態では、ＣＲＳはＬＰＳに応答して発生する。別の実施形態では、ＣＲＳはＩＦＮ－γに応答して発生する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）がん療法の有効性を増加させる方法であり、この方法は、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤を投与するステップを含み、該ＣＡＲＴ細胞の該有効性は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、かつ該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、対象において増加する。関連する実施形態では、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生レベルは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、かつ該薬剤を含む組成物を投与されていない対象における該炎症誘発性サイトカインのレベルと比較して低減する。別の関連する実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－６を含む。

関連する実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清が投与される場合、該方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して、対象におけるＩＬ－２のレベルを増加させる。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清が投与される場合、該方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して、対象におけるＩＬ－２のレベルを維持する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清が投与される場合、該方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して、対象におけるＩＬ－２のレベルを維持または増加する。別の関連する実施形態では、該対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して阻害または低減される。

関連する実施形態では、ＣＡＲＴ細胞および該追加の薬剤またはそれらの任意の組み合わせは、単一の組成物に含まれる。別の関連する実施形態では、該ＣＡＲＴ細胞および該追加の薬剤またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも２つの組成物に含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）および追加の薬剤を投与するステップを含む、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であって、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、またはＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み、該方法は、ＣＡＲＴ細胞を投与され、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、該対象においてがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

関連する実施形態では、該方法は、ＣＡＲＴ細胞を投与され、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、該対象における該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率の低減、改善または緩和する効力を増加させた。

別の関連する実施形態では、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生レベルは、該ＣＡＲＴ細胞を投与され、かつ該薬剤を含む組成物を投与されていない対象における該炎症誘発性サイトカインのレベルと比較して低減する。別の関連する実施形態では、該炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－６を含む。別の関連する実施形態では、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含み、該方法は、該ＣＡＲＴ細胞を投与され、かつ該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清を投与されていない対象と比較して、対象におけるＩＬ－２のレベルを増加させる。別の関連する実施形態では、該ＣＡＲＴ細胞および該追加の薬剤またはそれらの任意の組み合わせは、単一の組成物に含まれる。さらに別の関連する実施形態では、該ＣＡＲＴ細胞および該追加の薬剤またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも２つの組成物に含まれる。

関連する実施形態では、該追加の薬剤の投与は、該ＣＡＲＴ細胞の投与の前、同時、または後に行われる。別の関連する実施形態では、該アポトーシス細胞は、初期アポトーシス状態のアポトーシス細胞を含む。別の関連する実施形態では、該アポトーシス細胞は、該対象に対して自家であるか、またはプールされた第三者のドナー細胞である。

関連する実施形態では、該アポトーシス細胞上清は、（ａ）アポトーシス細胞を提供し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を培養し、（ｃ）細胞から上清を分離するステップを含む方法によって得られる。別の関連する実施形態では、該アポトーシス細胞上清は、アポトーシス細胞－白血球上清であり、該方法は、（ｄ）白血球を提供し、（ｅ）任意に、アポトーシス細胞および白血球を洗浄し、（ｆ）アポトーシス細胞および白血球を共培養するステップをさらに含み、ステップ（ｄ）～（ｆ）はステップ（ｂ）の代わりである。別の関連する実施形態では、提供される白血球は、貪食細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞からなる群から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、アポトーシス上清は、アポトーシス細胞をマクロファージとともに培養することによって産生された上清を含み、マクロファージはアポトーシス細胞を摂取し、この共培養から産生された上清が使用される。いくつかの実施形態では、アポトーシス上清は、アポトーシス細胞を培養することによって産生された上清を含み、上清は、アポトーシス細胞によって分泌された材料から産生される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、初期アポトーシス細胞を含む組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、追加の薬剤と組み合わせた初期アポトーシス細胞を含む組成物である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、リツキシマブまたはその機能的断片を含む。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞の組成物は、初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団を含み、該単核アポトーシス細胞集団は、非静止非アポトーシス生存細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備える。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変されたＴ細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変されたＴ細胞およびアポトーシス細胞の上清を含む組成物である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変されたＴ細胞受容体細胞（ＴＣＲ）およびアポトーシス細胞を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞からの上清を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変されたＴ細胞受容体細胞（ＴＣＲ）およびアポトーシス細胞の上清を含む組成物である。

特定の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、単一の組成物内に含まれる。他の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、別々の組成物内に含まれる。

本開示は、いくつかの実施形態では、初期アポトーシス状態の単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、プールされた個々の単核細胞集団を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、生きた非アポトーシス生存細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備える。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞が照射されている。別の実施形態では、本開示は、いくつかの実施形態では、献血から得られた白血球分画（ＷＢＣ）を使用する、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供する。多くの場合、このＷＢＣ分画は血液バンクで廃棄されるか、研究での使用を目的としている。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞集団は不活化される。別の実施形態では、不活化は照射を含む。別の実施形態では、不活化は、Ｔ細胞受容体の不活化を含む。別の実施形態では、不活化は、Ｔ細胞受容体の編集を含む。別の実施形態では、不活化は、該調製物中の免疫応答を抑制するかまたは排除することを含む。別の実施形態では、不活化は、調製物に含まれる複数の個々の集団間の交差反応性を抑制するかまたは排除することを含む。他の実施形態では、不活化は、調製物に含まれる複数の個々の集団間のＴ細胞受容体活性を低減または排除することを含む。別の実施形態では、不活化細胞調製物は、生きた非アポトーシス細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

別の実施形態では、不活化細胞集団は、非放射線細胞調製物と比較して、減少した数の非静止非アポトーシス細胞を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の５０パーセント（％）を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の４０％を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の３０％を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の２０％を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の１００％を含む。いくつかの実施形態では、不活化細胞集団は、生きた非アポトーシス細胞の０％を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、不活化初期アポトーシス細胞集団を調製する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、非静止非アポトーシス生存細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備えた単核アポトーシス細胞の集団を産生する方法であり、該方法は、以下のステップ、
末梢血の単核に富む細胞集団を得ることと、
抗凝固剤を含む凍結培地中で該単核に富む細胞集団を凍結することと、
該単核に富む細胞集団を解凍することと、
約１０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度のメチルプレドニゾロンおよび抗凝固剤を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地中で、該単核に富む細胞集団をインキュベートすることと、
該アポトーシス細胞集団を投与培地に再懸濁することと、
該単核に富む集団を不活性化することとを含み、該不活化は誘発後に発生し、
該方法は、非静止非アポトーシス細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備える単核アポトーシス細胞の集団を産生する。

別の実施形態では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。さらに別の実施形態では、照射された調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、減少した数の非静止非アポトーシス細胞を有する。

別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は、Ｔ細胞受容体の不活化を受けている。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は、Ｔ細胞受容体の編集を受けている。

いくつかの実施形態では、プールされた血液は、レシピエントに対して、ＨＬＡ一致またはＨＬＡ不一致の供給源からの第三者の血液を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、例えば、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤に限定されない遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物である。

いくつかの実施形態では、本開示は、初期アポトーシス状態のプールされた個々の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む医薬組成物の製造方法を提供し、該組成物は、生きた非アポトーシス細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制を有する調製物、または任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを備える。別の実施形態では、方法は、初期アポトーシス状態のプールされた個々の単核細胞集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む医薬組成物を提供し、該組成物は、非静止非アポトーシス細胞の減少した割合を備える。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、発生率の低減、またはそれらの任意の組み合わせの方法であり、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与するステップを含み、該方法は、該対象においてがんまたは腫瘍を治療、予防、成長を阻害、発生率を低減するか、またはそれらの任意の組み合わせを行う。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、疾患進行の遅延、腫瘍量の低減、もしくは発生率の低減、またはそれらの任意の組み合わせを含み、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、追加の免疫療法、化学療法剤、もしくは免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを、該対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節剤は、該初期アポトーシス細胞の投与の前、同時、または後に投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存を増加させる方法であり、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与するステップを含み、該方法は、該対象の生存を増加させる。いくつかの実施形態では、この方法は、追加の免疫療法、化学療法剤、もしくは免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを、該対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節剤は、該初期アポトーシス細胞の投与の前、同時、または後に投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象において、がんまたは腫瘍のサイズを縮小させるか、または成長速度を低減させる方法であって、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与するステップを含み、該方法は、サイズを縮小させるか、または成長速度を低減させる。いくつかの実施形態では、この方法は、追加の免疫療法、化学療法剤、もしくは免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを、該対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節剤は、該初期アポトーシス細胞の投与の前、同時、または後に投与される。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性に影響を与えず、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、腫瘍量を低減、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約５％超でがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、腫瘍量を低減、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約１０％超でがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、腫瘍量を低減、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約１５％超でがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、腫瘍量を低減、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約２０％超でがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、腫瘍量を低減、または緩和する。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を増加させる。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を、少なくとも５、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５、または少なくとも５０％増加させる。

別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約５％超で該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約１０％超で該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約１５％超で該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、約２０％超で該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性に影響を与えず、該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞の有効性を低減せず、該がんまたは該腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象においてサイトカイン産生を減少または予防し、それによって、対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率を阻害または低減する。別の実施形態では、本明細書に開示される、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、アポトーシス細胞を含む組成物をがん療法を受けている対象に投与するステップを含む。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン産生の減少または阻害のための方法は、アポトーシス細胞を含む組成物をがん療法を受けている対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性に影響を与えない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を低減しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約５％超低減しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１０％超低減しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１５％超低減しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約２０％超低減しない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームを経験するか、またはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームに対して脆弱である対象におけるサイトカイン産生の減少または阻害の方法であり、本明細書に開示されるようなアポトーシス細胞上清または該アポトーシス細胞上清を含む組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、アポトーシス細胞－貪食細胞上清を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害するための本明細書に開示される方法は、アポトーシス細胞上清を含む組成物をがん療法を受けている対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性に影響を与えない。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を低減しない。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、対象における少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生を減少または阻害する。

別の実施形態では、本開示は、免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカインストーム、または不妊性を治療、予防、改善、阻害、または発生率を低減するために、それらを必要とする患者において、本明細書に記載されるような初期アポトーシス状態の単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物の使用方法を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、プールされた単核アポトーシス細胞調製物であり、特定の実施形態ではそのような細胞調製物の使用は、例えばＨＬＡタイピングによるドナーおよびレシピエントのマッチングを必要としない。

遺伝子改変された免疫細胞

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物が本明細書に開示される。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、樹状細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞、アポトーシス細胞、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞、アポトーシス細胞上清、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物である。

一実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性である。別の実施形態では、遺伝子改変のための細胞傷害性細胞は、対象（自家）またはドナー（同種異系）の骨髄から得ることができる。他の場合では、細胞は、幹細胞から得られる。例えば、細胞傷害性細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性Ｔ細胞などのヒト多能性幹細胞に由来することができる。人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の場合、そのような多能性Ｔ細胞は、遺伝子改変細胞傷害性細胞が提供される対象の体細胞を使用して得ることができる。一実施形態では、免疫細胞は、静脈穿刺、アフェレーシス法、白血球動員とそれに続くアフェレーシスまたは静脈穿刺、または骨髄穿刺によって細胞を採取することによって、対象またはドナーから得ることができる。

一実施形態では、インビボでの免疫細胞、例えばＴ細胞は、特定の因子の存在によって生成および増大される。別の実施形態では、インビボでのＴ細胞の生成および維持は、サイトカインによって影響を受ける。別の実施形態では、インビボでのＴヘルパー細胞の生成および維持に影響を与えるサイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、およびＴＧＦβを含む。別の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、インビボでのサイトカイン誘導によってナイーブＴ細胞から生成される。さらに別の実施形態では、ＴＧＦ－βおよび／またはＩＬ－２は、ナイーブＴ細胞を分化させてＴｒｅｇ細胞にする役割を果たす。

別の実施形態では、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでＣＡＲＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでＣＡＲＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでＴＣＲＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでＴＣＲＴ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＩＬ－３３、およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでＴ－ｒｅｇ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでＴ－ｒｅｇ細胞の増殖速度を維持もしくは増加させるか、またはその両方をもたらす。

一実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質またはＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現または形態の変化を有するＴ細胞は、長期間維持されるか、もしくは増殖速度が増加するか、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、該発現の変化は、発現ＳＴＡＴ５Ｂポリペプチドを増加させる。別の実施形態では、該発現の変化は、ＢＡＣＨ２ポリペプチドの発現を増加させる。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、１年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、２年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、３年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、４年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、５年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、１０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、２０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。

別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、１年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、２年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、３年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、４年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、５年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、１０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴ細胞は、２０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、１年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、２年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、３年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、４年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、５年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、１０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、２０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。

別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、１年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、２年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、３年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、４年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、５年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、１０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴ細胞は、２０年を超えてインビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＣＡＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＣＡＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＣＡＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＣＡＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴＣＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴＣＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴＣＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴＣＲＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖速度が増加する。

別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の発現の変化を有するＴｒｅｇ細胞は、インビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現の変化を有するＴｒｅｇ細胞は、インビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質の形態の変化を有するＴｒｅｇ細胞は、インビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。別の実施形態では、ＢＡＣＨ２コード化タンパク質の形態の変化を有するＴｒｅｇ細胞は、インビボでそれらの増殖速度を維持または増加させる。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞の増殖速度を維持または増加させるための方法が本明細書に開示され、方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与するステップを含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞の有効性を増加させるための方法が本明細書に開示され、方法は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための方法は、遺伝子改変された免疫細胞および追加の薬剤を投与し、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外腫瘍結合部分、最も一般的にはモノクローナル抗体からの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合した、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインで構成される一種の抗原標的受容体である。ＣＡＲは、ＭＨＣ媒介提示とは関係なく、細胞表面抗原を直接認識し、すべての患者の任意の所与の抗原に特異的な単一の受容体構築物の使用を可能にする。初期のＣＡＲは、抗原認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ活性化鎖に融合させた。これらの第１世代のＣＡＲは、インビトロでＴ細胞エフェクター機能を誘導したが、インビボでの抗腫瘍効果が乏しいため、大きく制限されていた。後続のＣＡＲの反復には、ＣＤ２８、または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む、ＣＤ３ζと並行して二次共刺激シグナルが含まれた。さらに、第３世代の受容体には、ＣＤ３ζに加えて、最も一般的にはＣＤ２８および４－１ＢＢからの２つの共刺激シグナルが含まれる。第２および第３世代のＣＡＲは、抗腫瘍効果を劇的に改善し、場合によっては進行がん患者の完全寛解を誘導する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、その受容体がその抗原に結合すると活性化される、抗原受容体を含む免疫応答性細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、第１世代のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、第２世代のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、第３世代のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、第４世代のＣＡＲＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の各世代は、以前の世代のＣＡＲＴ細胞よりも強力である。

いくつかの実施形態では、第１世代のＣＡＲは、１つのシグナル伝達ドメイン、典型的には、ＣＤ３ＴＣＲζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインを有する。

別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞は、第２世代のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞は、三連キメラ受容体（ＴＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞は、共刺激に依存しない方法でナイーブＴ細胞を活性化する１つ以上のシグナル伝達部分を含む。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの１つ以上のメンバーをさらにコードし、いくつかの実施形態では、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはそれらの組み合わせである。

第３世代のＣＡＲＴ細胞は、２つの共刺激ドメインのシグナル伝達の可能性を利用しようとし、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインの後に、４－１ＢＢまたはＯＸ－４０シグナル伝達ドメインが続く。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、共刺激シグナル伝達ドメインをさらにコードし、これは一実施形態ではＣＤ２８である。別の実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩｌａ－ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態では、テロメア長および複製能力は、養子移入されたＴ細胞株の移植効率および抗腫瘍効果と相関する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８刺激は、Ｔ細胞においてテロメア長を維持する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞効力は、増殖性サイトカイン（すなわち、ＩＬ－１２）または共刺激リガンド（すなわち、４－１ＢＢＬ）をコードする遺伝子を含む、追加の遺伝子の導入によってさらに増強され得、ひいては「アーマード（ａｒｍｏｒｅｄ）」第４世代のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を産生する。いくつかの実施形態では、「アーマードＣＡＲＴ細胞」は、抑制性腫瘍微小環境から保護されているＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、「アーマード」ＣＡＲ技術は、全身性副作用を最小限に抑えることを目的として、腫瘍微小環境内の免疫応答を増幅するために、可溶性シグナル伝達タンパク質の局所分泌を組み込んでいる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達タンパク質シグナルは、Ｔ細胞の活性化および動員を刺激することができるＩＬ－１２である。いくつかの実施形態では、「アーマード」ＣＡＲ技術は、微小環境および強力な免疫抑制機序が強力な抗腫瘍応答の確立をより困難にする可能性がある固形腫瘍の適応症において特に有用である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、アポトーシスの予防、腫瘍微小環境のリモデリング、恒常性増殖の誘導、および方向付けられたＴ細胞ホーミングを促進するケモカイン受容体に関与する分子をコードするように遺伝子改変される。

別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞療法は、サイトカイン導入遺伝子の発現、小分子阻害剤との併用療法、またはモノクローナル抗体を使用して増強される。別の実施形態では、腫瘍細胞をより特異的に標的化するためのデュアルＣＡＲおよびケモカイン受容体の使用を含む、ＣＡＲＴ細胞療法を改善することを目的とする他の戦略は、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞およびＣＡＲＴ細胞療法の一部とみなされるべきである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法のＣＡＲＴ細胞は、がん細胞対正常細胞に対するＣＡＲＴ細胞の特異性を高めるために、阻害または増幅シグナルのいずれかをもたらすことができる第２の結合ドメインを含む。例えば、ＣＡＲＴ細胞は、１つの標的タンパク質の存在下でトリガーとなるが、第２のタンパク質が存在する場合は阻害されるように操作され得る。あるいは、最大の活性化に２つの標的タンパク質が必要となるように操作することもできる。これらのアプローチは、正常組織と比較して、腫瘍に対するＣＡＲの特異性を高めることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＣＡＲＴ細胞は、抗体ベースの外部受容体構造と、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフから構成されるシグナル伝達モジュールをコードするサイトゾルドメインとをコードする。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、免疫抑制活性を有するポリペプチドに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をさらにコードする。別の実施形態では、免疫抑制活性を有するポリペプチドは、ＣＤ４７、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、またはそれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、免疫賦活活性を有するポリペプチドに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をさらにコードする。別の実施形態では、免疫賦活活性を有するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢまたはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をさらにコードし、いくつかの実施形態では、抗原の免疫賦活活性を高める。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性である。別の実施形態では、遺伝子改変のための細胞傷害性細胞は、対象またはドナーの骨髄から得ることができる。他の場合では、細胞は、幹細胞から得られる。例えば、細胞傷害性細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性Ｔ細胞などのヒト多能性幹細胞に由来することができる。人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の場合、そのような多能性Ｔ細胞は、遺伝子改変細胞傷害性細胞が提供される対象の体細胞を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、静脈穿刺、アフェレーシス法、白血球動員とそれに続くアフェレーシスもしくは静脈穿刺、または骨髄穿刺によって細胞を採取することによって、対象またはドナーから得ることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象から免疫細胞を得ることと、免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させることと、を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象から免疫細胞を得ることと、免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させることと、アポトーシス細胞集団と組み合わせることとを含み、対象におけるサイトカイン産生を低減させるが、アポトーシス細胞集団で投与されていないＣＡＲを発現する免疫細胞と比較して実質的に影響を受けない細胞毒性をもたらす（図１Ａ～１Ｂおよび２）。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象から免疫細胞を得ることと、免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させることと、アポトーシス細胞上清または上清を含む組成物と組み合わせることとを含み、対象におけるサイトカイン産生を低減させるが、アポトーシス細胞上清で投与されていないＣＡＲを発現する免疫細胞と比較して実質的に影響を受けない細胞毒性をもたらす。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞からの上清の投与は、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の有効性を低減させない。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、免疫細胞であり、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞が対象に対して自家であるＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、対象に対して異種である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は同種異系である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ユニバーサル同種異系のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、自家、同種異系であり得るか、または操作された前駆細胞または幹細胞のインビトロに由来する。

別の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞は、両方とも同じ供給源に由来する。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞は、両方とも対象に由来する（図１）。代替的実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞は、異なる供給源に由来する。さらに別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は自家であり、本明細書に記載のアポトーシス細胞は同種異系である（図２）。同様に、当業者は、アポトーシス細胞上清が、ＣＡＲＴ細胞と同じ供給源に由来する細胞から作製され得るか、一実施形態では自家細胞であり得るか、またはアポトーシス細胞上清が、ＣＡＲＴ細胞の供給源とは異なる供給源に由来する細胞から作製され得ることを理解するであろう。

当業者は、「異種」という用語が、異なる生物に由来する組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、異なるＴ細胞タイプまたはレシピエントからの異なる種から最初にクローン化されたか、または由来し、かつ細胞または細胞から得られた試料に通常存在しないタンパク質である。

したがって、本明細書に開示される一実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、それによって細胞がそれらの細胞傷害性機能を保持する、細胞傷害性免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）に関する。別の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞に対して外因性である。別の実施形態では、ＣＡＲは組換え的に発現される。別の実施形態では、ＣＡＲは、ベクターから発現される。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、エフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。

遺伝子改変された免疫細胞、例えばＴ細胞の供給源は、文献に広く記載されており、例えば、Ｔｈｅｍｅｌｌｉｅｔａｌ．（２０１５）ＮｅｗＣｅｌｌＳｏｕｒｃｅｓｆｏｒＴＣｅｌｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＡｄｏｐｔｉｖｅＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１６：３５７－３６６、Ｈａｎｅｔａｌ．（２０１３）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ６：４７－５３、Ｗｉｌｋｉｅｅｔａｌ．（２０１０）ＪＢｉｏＣｈｅｍ２８５（３３）：２５５３８－２５５４４、およびｖａｎｄｅｒＳｔｅｇｅｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１９１：４５８９－４５９８を参照されたい。ＣＡＲＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のカスタム構築および製造サービスを提供し、組換えアデノウイルスワクチンによってコードされる防御免役を誘導することができる、作成済みのＣＡＲ構築物ストックも提供する、ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ（ＮＹＵＳＡ）などの商業的供給元から注文可能である。カスタムメイドのＣＡＲＴ細胞はまた、特別に設計されたＣＡＲＴ細胞を提供できるＰｒｏｍａｂＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡＵＳＡ）から得ることができる。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞

一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＣＡＲＴ細胞に加えて、またはその代わりに、デザイナーＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞を利用する。ＴＣＲは、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を媒介するマルチサブユニット膜貫通複合体である。ＴＣＲは、２つの異なるポリペプチド鎖で構成されている。ＴＣＲは、例えば腫瘍細胞やがん細胞などの標的細胞上の抗原エピトープを認識することにより、Ｔ細胞に抗原特異性を付与する。腫瘍またはがん細胞に存在する抗原と接触した後、Ｔ細胞は増殖して表現型と機能を獲得し、がんまたは腫瘍細胞を排除できるようにする。

一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞療法は、目的のタンパク質のエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をＴ細胞に導入することを含む。別の実施形態では、目的のタンパク質は、腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、遺伝子操作されたＴＣＲは、Ｔ細胞活性化ドメインとともに腫瘍細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される腫瘍抗原エピトープを認識する。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、それらの細胞内または膜局在化に関係なく、抗原を認識する。別の実施形態では、ＴＣＲは、腫瘍関連抗原を細胞内に発現する腫瘍細胞を認識する。一実施形態では、ＴＣＲは内部抗原を認識する。別の実施形態では、ＴＣＲは、血管新生因子を認識する。別の実施形態では、血管新生因子は、新しい血管の形成に関与する分子である。様々な遺伝子改変されたＴ細胞受容体およびそれらの産生方法が当該技術分野で知られている。

一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞療法は、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、改善、発生率を低減、または緩和するために使用される。一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞療法は、血液腫瘍（リンパ腫および白血病）および固形腫瘍（難治性黒色腫、肉腫）を伴うものを含む、進行性転移性疾患を治療、予防、阻害、改善、発生率を低減、または緩和するために使用される。一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用されるＴＣＲＴ細胞療法は、Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．，（ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．２０１３Ａｐｒ；３（４）：３８８－３９８）の表１に列挙されている悪性腫瘍を治療する。

別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＨＰＶ－１６Ｅ６エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＨＰＶ－１６Ｅ６である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＨＰＶ－１６Ｅ７エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＨＰＶ－１６Ｅ７である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＭＡＧＥＡ３／Ａ６である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＭＡＧＥＡ３エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＭＡＧＥＡ３である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＳＳＸ２エピトープに結合するように遺伝子改変されており、ＴＣＲで操作されたＴ細胞は、抗ＳＳＸ２である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は、本明細書に開示される標的抗原に結合するように遺伝子改変されている。当該技術分野で周知のツールを使用して、当業者であれば、Ｔ細胞受容体は、がんまたは腫瘍細胞に存在する標的抗原に結合するように遺伝子改変させることができ、ＴＣＲで操作されたＴ細胞が抗腫瘍または抗がん細胞を含むことを理解するであろう。

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象から免疫細胞を得ることと、免疫細胞を遺伝子改変して組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることと、を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象から免疫細胞を得ることと、免疫細胞を遺伝子改変して組換えＴＣＲを発現させることと、追加の薬剤と組み合わせることと、を含み、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞集団、アポトーシス細胞上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、エフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、ＴＣＲＴ細胞を生成するために利用されるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。

ＴＣＲＴ細胞は、文献に広く記載されており、例えば、ＳｈａｒｐｅａｎｄＭｏｕｎｔ（２０１５）同上、ＥｓｓａｎｄＭ，ＬｏｓｋｏｇＡＳＩ（２０１３）ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴｃｅｌｌｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒ（Ｒｅｖｉｅｗ）．ＪＩｎｔｅｒｎＭｅｄ２７３：１６６－１８１、およびＫｅｒｓｈａｗｅｔａｌ．（２０１４）ＣｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３：１－７を参照されたい。

標的化抗原

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原に向けられた抗体または抗体断片を介して抗原のエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

一実施形態では、ＴＣＲは、遺伝子改変されたＴ細胞受容体を介して抗原のエピトープに結合する。

別の実施形態では、本明細書に開示される組成物のＣＡＲＴ細胞は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。別の実施形態では、該腫瘍関連抗原は、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）または多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、アルギニンリッチで、初期腫瘍で変異されたもの（Ａｒｍｅｔ）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、マトリックスメタロペプチダーゼ（ＭＭＰ６）、Ｂメラノーマ抗原－１（ＢＡＧＥ－１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶの異常転写物（ＧｎＴＶ）、Ｑ５Ｈ９４３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｐｍｅｌ、カリクレイン－４、マンマグロビン－１、ＭＡＲＴ－１、ＧＰＲ１４３－ＯＡ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ１、チロシナーゼ、ＦＧＰ－５、ＮＥＵプロトオンコジーン、Ａｆｔ、ＭＭＰ－２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、テロメラーゼ関連タンパク質－２、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ウロプラキンＩＩ、またはプロテイナーゼ３である。

別の実施形態では、白血病のようにＢ細胞を破壊したい場合、ＣＡＲは、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合して、Ｂ細胞を標的とする。ＣＤ１９はＢ細胞系統に特異的な表面受容体であり、プロＢ細胞から初期の形質細胞まで幅広い発現を示すため、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法の魅力的な標的となる。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、またはＧＤ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＡＧＥファミリータンパク質に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、メソテリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ｃ－ｅｒｂＢ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異およびＢＣＲ－ＡＢＬ転座などの腫瘍特異的である変異抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＨＤのＥＢＶ、子宮頸がんのＨＰＶ、およびメルケルがんのポリオーマウイルスなどの腫瘍特異的ウイルス抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＩＸに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３８に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４４ｖ６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４４ｖ７／８に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１２３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１７１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＰ－２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＰ－４０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＥｐｈＡ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｅｒｂ－Ｂ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｅｒｂ－Ｂ２、３、４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｅｒｂ－Ｂ３／４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＦＢＰに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、胎児のアセチルコリン受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｇ_Ｄ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｇ_Ｄ３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＨＥＲ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＨＭＷ－ＭＡＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＬ－１１Ｒアルファに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＩＬ－１３Ｒアルファ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＫＤＲに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、カッパ軽鎖に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ルイスＹに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｌ１細胞接着分子に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＡＧＥ－Ａ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、メソテリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＭＶ感染細胞に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＵＣ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＭＵＣ１６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１（アミノ酸１５７～１６５）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＣＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＲＯＲ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＡＧ－７２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＶＥＧＦ－Ｒ２または他のＶＥＧＦ受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７－Ｈ６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡ９に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、α_ｖβ_６インテグリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、８Ｈ９に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＣＡＭに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、胎児のアセチルコリン受容体に結合する。

別の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、ＣＤ１９抗原を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＡＬＬ、濾胞性リンパ腫、ＣＬＬ、およびリンパ腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ２２抗原を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、アルファ葉酸受容体または葉酸受容体アルファを標的とし、卵巣がんまたは上皮がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡＩＸまたはＧ２５０／ＣＡＩＸを標的とし、腎細胞がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ２０を標的とし、リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、および無痛性Ｂ細胞リンパ腫を有する対象に治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ２３を標的とし、ＣＬＬを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ２４を標的とし、膵臓腺がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３０を標的とし、リンパ腫またはホジキンリンパ腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３３を標的とし、ＡＭＬを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３８を標的とし、非ホジキンリンパ腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ４４ｖ６を標的とし、いくつかの悪性腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ４４ｖ７／８を標的とし、子宮頸がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１２３を標的とし、骨髄性悪性腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＥＡを標的とし、結腸直腸がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とし、神経膠芽腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＥＧＰ－２を標的とし、複数の悪性腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＥＧＰ－４０を標的とし、結腸直腸がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＥｐｈＡ２を標的とし、神経膠芽腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｅｒｂ－Ｂ２またはＥｒｂＢ３／４を標的とし、乳がんなど、前立腺がん、結腸がん、様々な腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｅｒｂ－Ｂ２、３、４を標的とし、乳がんなどを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＦＢＰを標的とし、卵巣がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、胎児のアセチルコリン受容体を標的とし、横紋筋肉腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｇ_Ｄ２を標的とし、神経芽細胞腫、黒色腫、またはユーイング肉腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｇ_Ｄ３を標的とし、黒色腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＨＥＲ２を標的とし、髄芽腫、膵臓腺がん、神経膠芽腫、骨肉腫、または卵巣がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＨＭＷ－ＭＡＡを標的とし、黒色腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－１１Ｒアルファを標的とし、骨肉腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－１３Ｒアルファ１を標的とし、神経膠腫、神経膠芽腫、または髄芽腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－１３受容体アルファ２を標的とし、いくつかの悪性腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＫＤＲを標的とし、腫瘍新生血管系を標的とすることにより、腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、カッパ軽鎖を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍（Ｂ－ＮＨＬ、ＣＬＬ）を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ルイスＹを標的とし、様々ながん腫または上皮由来腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、Ｌ１細胞接着分子を標的とし、神経芽細胞腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１またはＨＬＡ－Ａ１ＭＡＧＥＡ１を標的とし、黒色腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、メソテリンを標的とし、中皮腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＭＶ感染細胞を標的とし、ＣＭＶを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＭＵＣ１を標的とし、乳がんおよび卵巣がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＭＵＣ１６を標的とし、卵巣がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とし、骨髄腫、卵巣、およびその他の腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７－１６５）またはＨＬＡ－Ａ２ＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とし、多発性骨髄腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、がん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）を標的とし、様々な腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＰＳＣＡを標的とし、前立腺がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＰＳＭＡを標的とし、前立腺がん／腫瘍血管系を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＲＯＲ１を標的とし、Ｂ－ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＴＡＧ－７２を標的とし、腺がんまたは胃腸がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＶＥＧＦ－Ｒ２または他のＶＥＧＦ受容体を標的とし、腫瘍新生血管系を標的とすることによって腫瘍を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＡ９を標的とし、腎細胞がんを有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１７１を標的とし、腎神経芽細胞腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＮＣＡＭを標的とし、神経芽細胞腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、胎児のアセチルコリン受容体を標的とし、横紋筋肉腫を有する対象に対して治療効果を有する。別の実施形態では、ＣＡＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎｅｔａｌ．（ＣａｎｃｅｒＤｉｓｃｏｖ．２０１３Ａｐｒ；３（４）：３８８－３９８）の表１に列挙されている標的抗原の１つに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、炭水化物または糖脂質構造に結合する。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、血管新生因子に結合し、それによって腫瘍血管系を標的とする。いくつかの実施形態では、血管新生因子は、ＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、血管新生因子は、エンドグリンである。別の実施形態では、本明細書に開示される血管新生因子は、アンジオゲニン、アンジオポエチン－１、Ｄｅｌ－１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－アルファ）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－ベータ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－アルファ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管新生因子は、血管新生タンパク質である。いくつかの実施形態では、増殖因子は、血管新生タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するための血管新生タンパク質は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ－１）；アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、ＢＢホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ；トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、エンドグリン、およびＴＧＦ－β受容体；単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）；インテグリンαＶβ３、αＶβ５、およびα５β１；ＶＥ－カドヘリンおよびＣＤ３１；エフリン；プラスミノーゲン活性化因子；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）およびＣＯＸ－２；ＡＣ１３３；またはＩｄ１／Ｉｄ３である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するための血管新生タンパク質は、アンジオポエチンであり、いくつかの実施形態では、これは、アンジオポエチン１、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、またはアンジオポエチン６である。いくつかの実施形態では、エンドグリンはまた、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、またはＯＲＷ１としても知られている。いくつかの実施形態では、エンドグリンは、ＴＧＦベータ共受容体である。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、感染病原体に関連する抗原に結合する。いくつかの実施形態では、感染病原体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。いくつかの実施形態では、該Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ関連抗原は、抗原８５Ｂ、リポタンパク質ＩｐｑＨ、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ推定、特徴付けられていないタンパク質Ｒｖ０４７６／ＭＴＯ４９４１前駆体、または特徴付けられていないタンパク質Ｒｖ１３３４／ＭＴ１３７６前駆体である。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、抗体に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、「抗体結合Ｔ細胞受容体」（ＡＣＴＲ）である。この実施形態によれば、ＣＡＲＴ細胞は、ユニバーサルＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、抗体受容体を有するＣＡＲＴ細胞は、抗体が投与される前、後、または同時に投与され、次いで抗体に結合し、Ｔ細胞を腫瘍またはがんに近接させる。別の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞抗原に対して向けられる。別の実施形態では、抗体は、ＣＤ２０に対して向けられる。別の実施形態では、抗体は、リツキシマブである。

別の実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：ＥＲＢＢ２に対して向けられるヒト化ＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、ベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）：ＶＥＧＦに対して向けられるヒト化ＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、セツキシマブ（アービタックス、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）：ＥＧＦＲに対して向けられるキメラヒトマウスＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、パニツムマブ（ベクティビックス、Ａｍｇｅｎ）：ＥＧＦＲに対して向けられるヒトＩｇＧ２である。別の実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ４に対して向けられるイピリムマブ（ヤーボイ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）：ＩｇＧ１である。

別の実施形態では、抗体は、アレムツズマブ（キャンパス、Ｇｅｎｚｙｍｅ）：ＣＤ５２に対して向けられるヒト化ＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、オファツムマブ（アーゼラ、Ｇｅｎｍａｂ）：ＣＤ２０に対して向けられるヒトＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ、Ｗｙｅｔｈ）：ＣＤ３３に対して向けられるヒト化ＩｇＧ４である。別の実施形態では、抗体は、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ）：ＣＤ３０に対して向けられるキメラＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（ゼバリン、ＩＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）：ＣＤ２０に対して向けられるマウスＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体は、１３１Ｉ標識トシツモマブ（ベキサール、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）：ＣＤ２０に対して向けられるマウスＩｇＧ２である。

別の実施形態では、抗体は、血管内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２）に対して向けられる、ラムシルマブである。別の実施形態では、抗体は、ラムシルマブ（サムライザ注射剤、ＥｌｉＬｉｌｌｙａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ、ＡｍｇｅｎＩｎｃ．）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭｅｒｃｋＳｈａｒｐ＆ＤｏｈｍｅＣｏｒｐ．）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、以前はＧＡ１０１として知られている）、ペルツズマブ注射剤（ＰＥＲＪＥＴＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、またはデノスマブ（Ｘｇｅｖａ、ＡｍｇｅｎＩｎｃ．）である。別の実施形態では、抗体は、バシリキシマブ（シムレクト、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。別の実施形態では、抗体は、ダクリズマブ（ゼナパックス、Ｒｏｃｈｅ）である。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞が結合している抗体は、本明細書に記載されている、および／または当該技術分野で知られている、腫瘍またはがん抗原またはその断片に向けられる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞が結合する抗体は、腫瘍関連抗原に向けられる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞が結合する抗体は、血管新生因子である腫瘍関連抗原またはその断片に向けられる。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞が結合している抗体は、本明細書に記載されている、および／または当該技術分野で知られている、腫瘍またはがん抗原またはその断片に向けられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の組成物、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞または初期アポトーシス細胞を含む組成物、またはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて使用することができる。

サイトカインストームおよびサイトカイン放出症候群

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＴＣＲＴ細胞、または操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲＴ細胞）を含むＴ細胞などの免疫細胞に、少なくとも追加の薬剤を提供し、対象において発生する可能性のある毒性サイトカイン放出または「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）または「重症サイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）または「サイトカインストーム」を減少させる。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳまたはサイトカインストームは、免疫細胞の投与の結果として発生する。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳまたはサイトカインストームは、免疫細胞とは別の刺激、状態、または症候群の結果である（以下を参照）。別の実施形態では、サイトカインストーム、サイトカインカスケード、または高サイトカイン血症は、より重症の形態のサイトカイン放出症候群である。

一実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞上清または該上清を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、ＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびアルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、テルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびテルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、および免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびＴｒｅｇ細胞を含む。

当業者は、毒性サイトカイン放出または毒性サイトカインレベルの低下が、対象における毒性サイトカインレベルの産生の低下もしくは阻害、または対象におけるサイトカイン放出症候群もしくはサイトカインストームの発生率の阻害または低減を含むことを理解するであろう。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルは、ＣＲＳまたはサイトカインストームの間に低減する。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの産生を減少または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカインストームを治療することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの産生を減少または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカインストームを予防することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの産生を減少または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカインストームを緩和することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインレベルの産生を減少または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカインストームを改善することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインは、炎症誘発性サイトカインを含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－６を含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１βを含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＴＮＦ－αを含み、別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、もしくはＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

一実施形態では、サイトカイン放出症候群は、いくつかの炎症性サイトカインのレベルの上昇、ならびに低血圧、高熱、および震えなどの対象における有害な身体的反応を特徴とする。別の実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、およびＴＮＦ－αを含む。別の実施形態では、ＣＲＳは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、もしくはＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせのレベルの上昇を特徴とする。別の実施形態では、ＣＲＳは、ＩＬ－８、もしくはＩＬ－１３、またはそれらの任意の組み合わせのレベルの上昇を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＴＮＦ－アルファ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－５、フラクタルカイン、またはそれらの組み合わせもしくはそれらのサブセットの増加を特徴とする。さらに別の実施形態では、ＩＬ－６は、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーを含む。

別の実施形態では、ＣＲＳにおいて増加したサイトカイン、またはヒトおよびマウスにおけるサイトカインストームは、以下の表１および２に列挙されているサイトカインの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態では、表１のサイトカインＦｌｔ－３Ｌ、フラクタルカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２およびＩＬ－１３は、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であるとみなされる。別の実施形態では、表１の、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－１、およびＩＬ－１Ｒαは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であると思われる。別の実施形態では、Ｍ－ＣＳＦは未知の重要性を有する。別の実施形態では、表１に列挙されている任意のサイトカイン、またはそれらの組み合わせを、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーとして使用することができる。

一実施形態では、表２のＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、およびＴＮＦ－αは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要である。別の実施形態では、表２のＩＬ－２７、ＭＣＰ－３、ＰＧＥ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－αＲ１、およびＭＩＧは、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であるように思われる。別の実施形態では、ＩＬ－２３およびＩＬ－２５は、未知の重要性を有する。別の実施形態では、表２に列挙されている任意のサイトカイン、またはそれらの組み合わせを、ＣＲＳまたはサイトカインストームのマーカーとして使用することができる。別の実施形態では、マウスサイトカインＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＰ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒ、およびＩＬ－７は、ＣＲＳまたはサイトカインストームにおいて重要であるように思われる。

当業者は、「サイトカイン」という用語が、サイトカイン（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子アルファ）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ）、ならびに活性酸素種および一酸化窒素などの炎症の他の可溶性メディエーターを包含し得ることを理解するであろう。

一実施形態では、特定のサイトカインの放出の増加は、有意であるか、重要であるか、または未知の重要性を有するかにかかわらず、特定のサイトカインがサイトカインストームの一部であることを先験的に意味しない。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの増加は、サイトカインストームまたはＣＲＳの結果ではない。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、特定のサイトカインまたはサイトカインの群の増加したレベルの原因であり得る。

別の実施形態では、サイトカイン放出は、以下の症状：悪寒を伴うまたは伴わない発熱、倦怠感、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛、吐き気、嘔吐、頭痛、皮疹、吐き気、嘔吐、下痢、頻呼吸、低酸素血症、心血管頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量の増加（早期）、潜在的な心拍出量の低下（後期）、Ｄ－ダイマーの上昇、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノゲン血症、高窒素血症、肝トランスアミナーゼ、高ビリルビン血症、頭痛、精神状態変化、混乱、せん妄、喚語困難または明らかな失語症、幻覚、振戦、測定障害、歩行障害、発作のうちのいずれかまたはすべてを特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＩＬ－２放出およびリンパ球増殖を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＣＡＲＴ細胞によって放出されるサイトカインの増加を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、ＣＡＲＴ細胞以外の細胞によって放出されるサイトカインの増加を特徴とする。

別の実施形態では、サイトカインストームは、心機能障害、成人呼吸窮迫症候群、神経毒性、腎および／または肝不全、ならびに播種性血管内凝固を含む、生命を脅かす可能性のある合併症につながる。

当業者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの特徴が、ＣＲＳまたはサイトカインストームのトリガーの数日から数週間後に発生すると推定されることを理解するであろう。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ＣＲＳまたはサイトカインストームのトリガーである。別の実施形態では、ＣＲＳまたはサイトカインストームのトリガーは、ＣＡＲＴ細胞ではない。

一実施形態では、サイトカインストームの指標としてのサイトカインレベルまたは濃度の測定は、サイトカインレベルまたは濃度の倍増、パーセント（％）増加、正味増加または変化率として表すことができる。別の実施形態では、ある特定のレベルまたは濃度を超えるサイトカインの絶対レベルまたは濃度は、サイトカインストームを受けている、または経験しようとしている対象の指標であり得る。別の実施形態では、ある特定のレベルまたは濃度、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けていない対照対象において通常見られるレベルまたは濃度でのサイトカインの絶対レベルまたは濃度は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象においてサイトカインストームを阻害またはその発生率を低減するための方法の指標であり得る。

当業者は、「サイトカインレベル」という用語が、濃度の尺度、倍率変化の尺度、パーセント（％）変化の尺度、または速度変化の尺度を包含し得ることを理解するであろう。さらに、血液、唾液、血清、尿、および血漿中のサイトカインを測定するための方法は、当該技術分野で周知である。

一実施形態では、サイトカインストームがいくつかの炎症性サイトカインの上昇に関連するという認識にもかかわらず、ＩＬ－６レベルは、サイトカインストームの一般的な尺度として、および／またはサイトカインストームの治療の有効性の一般的な尺度として使用され得る。当業者は、他のサイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＢ－１α、ＩＬ－８、ＩＬ－１３、またはＩＮＦ－γがサイトカインストームのマーカーとして使用され得ることを理解するであろう。さらに、サイトカインを測定するためのそのアッセイ法は、当該技術分野で周知である。当事者は、サイトカインストームに影響を与える方法が同様にサイトカイン放出症候群に影響を与え得ることを理解するであろう。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象におけるサイトカイン産生の減少または阻害の方法である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しやすい対象におけるサイトカイン産生の減少または阻害の方法である。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象においてサイトカイン産生を減少または阻害し、表１および／または２に列挙されている任意のサイトカインまたはサイトカインの群の産生が減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－６産生は、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－ベータ１産生は、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－８産生は、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－１３産生は、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＴＮＦ－アルファ産生は、減少または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ－６産生、ＩＬ－１ベータ産生、もしくはＴＮＦ－アルファ産生、またはそれらの任意の組み合わせは、減少または阻害される。

一実施形態では、サイトカイン放出症候群は段階的である。別の実施形態では、グレード１は、症状が生命を脅かすものではなく、対症療法のみを必要とするサイトカイン放出症候群、例えば、発熱、吐き気、疲労、頭痛、筋肉痛、倦怠感について記載する。別の実施形態では、グレード２の症状は、低血圧のための酸素、輸液、または昇圧剤などの中程度の介入を必要とし、それに応答する。別の実施形態では、グレード３の症状は、積極的な介入を必要とし、それに応答する。別の実施形態では、グレード４の症状は生命を脅かす症状であり、人工呼吸器を必要とし、患者は臓器毒性を示す。

別の実施形態では、サイトカインストームは、ＩＬ－６およびインターフェロンガンマ放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、表１および２に列挙されている任意のサイトカインまたはそれらの組み合わせの放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカインストームは、当該技術分野で知られている任意のサイトカインまたはそれらの組み合わせの放出を特徴とする。

一実施形態では、症状の発症は、注入が開始されてから数分から数時間後に始まる。別の実施形態では、症状は、ピークのサイトカインレベルと一致する。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与することを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＡＲＴ細胞療法を助け得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減を助け得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの治療を助け得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの予防を助け得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの改善を助け得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの緩和を助け得る。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象においてサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率を阻害または低減し、かつアポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与される方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの治療を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの予防を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの改善を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの緩和を助け得る。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法を助け得る。一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＴＣＲＴ細胞療法を助け得る。一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、追加の薬剤を投与することを含む。一実施形態では、ＮＫ細胞療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＮＫ細胞療法を助け得る。

別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの治療を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの予防を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの改善を助け得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの緩和を助け得る。

一実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞上清または該上清を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、ＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびアルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、テルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびテルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を減少させるための追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、および免疫調節剤を含む。

別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＣＡＲＴ細胞と、イピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＣＡＲＴ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲＴ細胞と、イピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＴＣＲＴ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、樹状細胞と、イピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、樹状細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＮＫ細胞と、イピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＮＫ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬を含む併用療法を利用する。

別の実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、自己寛容を維持するのを助けるＴ細胞活性化の強力な阻害剤である。別の実施形態では、別の実施形態では抗体である抗ＣＴＬＡ－４遮断薬の投与は、Ｔ細胞活性化の正味効果を生み出す。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞、ＴＣＲＴ細胞、樹状細胞、またはＮＫ細胞の投与に起因する、本明細書に開示される組成物および方法によって治療、予防、阻害、改善、発生率の低減、または軽減され得る他の毒性は、Ｂ細胞形成不全または腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）を含む。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性に影響を与えない。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約５％超低減させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１０％超低減させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１５％超低減させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約２０％超低減させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約５％超増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１０％超増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約１５％超増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を約２０％超増加させる。

細胞毒性を定量化する任意の適切な方法を使用して、ＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞における活性が実質的に変化しないままであるかどうかを決定することができる。例えば、細胞毒性は、実施例に記載される細胞毒性アッセイなどの細胞培養ベースのアッセイを使用して定量化することができる。細胞毒性アッセイでは、死細胞のＤＮＡを優先的に染色する色素を用いることができる。他の場合では、細胞集団内の生細胞と死細胞の相対数を測定する蛍光および発光アッセイが使用され得る。そのようなアッセイでは、プロテアーゼ活性は、細胞生存性および細胞毒性のマーカーとして機能し、標識された細胞透過性ペプチドは、試料中の生存細胞の数に比例する蛍光シグナルを生成する。例えば、細胞毒性アッセイは、フローサイトメトリー分析で７－ＡＡＤを使用する場合がある。様々な細胞毒性アッセイ用のキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｂｃａｍ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの製造元から市販されている。

別の実施形態では、細胞毒性の尺度は、定性的であり得る。別の実施形態では、細胞毒性の尺度は、定量的であり得る。さらなる実施形態では、細胞毒性の尺度は、細胞毒性サイトカインの発現の変化に関連し得る。別の実施形態では、細胞毒性の尺度は、骨髄および肝臓における生存曲線および腫瘍量によって決定され得る。

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、同種異系ドナー細胞の拒絶を克服するのに有用な追加のステップを含む。一実施形態では、方法は、一実施形態では同種異系のＣＡＲＴ細胞であるＣＡＲＴ細胞の投与前の完全または部分的なリンパ球枯渇のステップを含む。別の実施形態では、リンパ球枯渇は、該同種異系Ｔ細胞がそれらが向けられている腫瘍を攻撃することを可能にするのに十分な期間、宿主対移植片反応を遅らせるように調整されるが、骨髄移植による宿主免疫系の救済を必要とするのに不十分な程度である。別の実施形態では、２－アミノ－２－［２－（４－オクチルフェニル）エチル］プロパン－１，３－ジオール（ＦＴＹ７２０）、５－［４－フェニル－５－（トリフルオロメチル）チオフェン－２－イル］－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］１，２，４－オキサジアゾール（ＳＥＷ２８７１）、３－（２－（－ヘキシルフェニルアミノ）－２－オキソエチルアミノ）プロピオン酸（Ｗ１２３）、２－アンモニオ－４－（２－クロロ－４－（３－フェノキシフェニルチオ）フェニル）－２－（ヒドロキシメチル）ブチル水素ホスファート（ＫＲＰ－２０３ホスファート）、または当該技術分野で知られている他の薬剤などのリンパ節からの同種異系Ｔ細胞の脱出を遅らせる薬剤は、本明細書に開示される組成物および方法の一部として使用し、有効性を有し、移植片対宿主病の開始を欠く同種異系ＣＡＲＴ細胞の使用を可能にすることができる。一実施形態では、同種異系Ｔ細胞によるＭＨＣ発現は、同種異系細胞の拒絶を低減するためにサイレンシングされる。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、同種異系細胞の拒絶を予防する。

ＣＡＲＴ細胞療法に関連するサイトカイン放出

一実施形態では、サイトカイン放出は、ＣＡＲＴ細胞療法などの免疫療法の投与の数日後から２週間後に発生する。一実施形態では、低血圧および他の症状は、サイトカイン放出に続く、すなわち、数日から数週間である。したがって、一実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法と同時に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～３日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～１４日後に対象に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２～３時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～１４時間後に対象に投与される。

代替的実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法の前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１日前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～３日前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～１４日前に対象に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２～３時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間前に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～１４時間前に対象に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、サイトカイン放出症候群が発生した時に、治療的に投与され得る。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、サイトカイン放出症候群の開始に至るか、またはその開始を証明するサイトカイン放出が検出された時に、投与され得る。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、増加したサイトカインレベルまたはサイトカイン放出症候群を終結させ、その続発症を回避することができる。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、複数の時点で治療的に投与され得る。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清の投与は、本明細書に記載されている少なくとも２つの時点においてである。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清の投与は、本明細書に記載されている少なくとも３つの時点においてである。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清の投与は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの前であり、サイトカイン放出症候群が発生した時、およびそれらの任意の組み合わせである。

一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法およびアポトーシス細胞療法または上清は、一緒に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、アポトーシス細胞療法または上清の後に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、アポトーシス細胞療法または上清の前に投与される。この態様によれば、一実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲＴ細胞療法の約２～３週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲＴ細胞療法の約６～７週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法または上清は、ＣＡＲＴ細胞療法の約９週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞療法の最大数ヶ月後に投与される。

したがって、一実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法と同時に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～３日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日後に対象に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２～１４日後に対象に投与される。

他の実施形態では、追加の薬剤は、予防として免疫療法と同時に対象に投与される。一実施形態では、追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～３日後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７日後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０日後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４日後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～１４日後に対象に投与される。

別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～３時間後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７時間後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０時間後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４時間後に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～１４時間後に対象に投与される。

代替的実施形態では、追加の薬剤は、予防として免疫療法の前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１日前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～３日前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７日前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０日前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４日前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～１４日前に対象に投与される。

別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～３時間前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７時間前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０時間前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４時間前に対象に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２～１４時間前に対象に投与される。

別の実施形態では、サイトカイン放出症候群が発生すると、追加の薬剤が治療的に投与される。一実施形態では、追加の薬剤は、サイトカイン放出症候群の開始に至るか、またはその開始を証明するサイトカイン放出が検出された時に、投与され得る。一実施形態では、追加の薬剤は、増加したサイトカインレベルまたはサイトカイン放出症候群を終結させ、その続発症を回避することができる。

別の実施形態では、追加の薬剤は、複数の時点で治療的に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤の投与は、本明細書に記載されている少なくとも２つの時点においてである。別の実施形態では、追加の薬剤の投与は、本明細書に記載されている少なくとも３つの時点においてである。別の実施形態では、追加の薬剤の投与は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの前であり、サイトカイン放出症候群が発生した後、およびそれらの任意の組み合わせである。

一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法および追加の薬剤は、一緒に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、追加の薬剤が投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、追加の薬剤の前に投与される。この態様によれば、一実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法の約２～３週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法の約６～７週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法の約９週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞療法の最大数ヶ月後に投与される。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、対象に対して異種である。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、１人以上のドナーに由来する。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、１人以上の骨髄ドナーに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、１つ以上の血液バンク輸血に由来する。一実施形態では、ドナーは、適合ドナーである。一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、ユニバーサル同種異系のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、同系のＣＡＲＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、不適合第三者ドナーからのものである。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、プールされた第三者ドナーＴ細胞からのものである。一実施形態では、ドナーは、骨髄ドナーである。別の実施形態では、ドナーは、血液バンクのドナーである。一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法のＣＡＲＴ細胞は、１つ以上のＭＨＣ非制限腫瘍指向性キメラ受容体を含む。一実施形態では、非自家Ｔ細胞は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１３／０１５６７９４号に記載されるような自己免疫反応を予防または最小化するために当該技術分野で知られているプロトコルに従って操作または投与され得る。

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、対象に対して自家である。一実施形態では、患者自身の細胞が使用される。この実施形態では、患者自身の細胞が使用される場合、ＣＡＲＴ細胞療法は、アポトーシス細胞療法の後に投与される。

一実施形態では、アポトーシス細胞は、対象に対して異種である。一実施形態では、アポトーシス細胞は、１人以上のドナーに由来する。一実施形態では、アポトーシス細胞は、１人以上の骨髄ドナーに由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、１つ以上の血液バンク輸血に由来する。一実施形態では、ドナーは、適合ドナーである。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、不適合第三者ドナーからのものである。一実施形態では、アポトーシス細胞は、ユニバーサル同種異系のアポトーシス細胞である。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、同系のドナーからのものである。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第三者ドナー細胞に由来する。一実施形態では、ドナーは、骨髄ドナーである。別の実施形態では、ドナーは、血液バンクのドナーである。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、対象に対して自家である。この実施形態では、患者自身の細胞が使用される。

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される治療的単核濃縮細胞調製物またはアポトーシス細胞上清は、対象に全身投与される。別の実施形態では、投与は、静脈内経路を介して行われる。あるいは、治療的単核濃縮細胞または上清は、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内および皮下経路を含むがこれらに限定されない、様々な他の経路に従って対象に投与され得る。

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される治療的単核濃縮細胞調製物または追加の薬剤は、対象に全身投与される。別の実施形態では、投与は、静脈内経路を介して行われる。あるいは、治療的単核濃縮細胞または追加の薬剤は、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内および皮下経路を含むがこれらに限定されない、様々な他の経路に従って対象に投与され得る。

一実施形態では、調製物は、例えば、調製物を患者の体の特定の領域に直接注射することによって、全身的ではなく局所的な方法で投与される。別の実施形態では、特定の領域は、腫瘍またはがんを含む。

別の実施形態では、治療的単核濃縮細胞または上清は、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどであるがこれらに限定されない、好適な生理学的緩衝液に懸濁された対象に投与される。さらに、懸濁培地は、細胞の生存能力を維持するのに役立つサプリメントをさらに含み得る。別の実施形態では、追加の薬剤は、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどであるがこれらに限定されない、好適な生理学的緩衝液に懸濁された対象に投与される。

いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、静脈内投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、単回用量で投与される。代替の実施形態によれば、医薬組成物は、複数回用量で投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、２回用量で投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、３回用量で投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、４回用量で投与される。別の実施形態によれば、医薬組成物は、５回以上の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、静脈内注射用に製剤化される。

一実施形態では、改変されたＣＡＲ発現免疫細胞を対象に提供する任意の適切な方法を、本明細書に記載の方法に使用することができる。一実施形態では、対象に細胞を提供するための方法は、造血細胞移植（ＨＣＴ）、がん患者へのドナー由来ＮＫ細胞の注入、またはそれらの組み合わせを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、アポトーシス細胞を含む組成物を該対象に投与するステップを含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清を該対象に投与するステップを含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、少なくとも１つの追加の薬剤を該対象に投与するステップを含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。

特定の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のいずれか、あるいは本明細書に開示されるような追加の薬剤の別のまたは組み合わせを含む、本明細書に開示される組成物を投与することを含む。代替実施形態では、ＣＡＲＴ細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞を含む本明細書に開示される組成物、およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のいずれかを含む組成物、あるいは本明細書に開示されるような追加の薬剤、またはそれらの組み合わせを投与することを含む。

非ＣＡＲＴ細胞適用に関連するサイトカイン放出

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象におけるサイトカイン産生の減少または阻害の方法であり、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物を該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象においてサイトカイン産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生の減少または阻害は、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱であり、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与されていない対象と比較される。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための方法は、炎症誘発性サイトカイン産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための方法は、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための方法は、少なくともサイトカインＩＬ－６の産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための方法は、少なくともサイトカインＩＬ－１ベータの産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための方法は、少なくともサイトカインＴＮＦ－アルファの産生を減少または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を減少または阻害するための本明細書に開示される方法は、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱であり、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与されていない対象と比較して、該対象におけるサイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、またはＴＮＦ－α、または任意の組み合わせの産生の減少または阻害をもたらす。

がんまたは腫瘍はまた、炎症誘発性サイトカインを含むサイトカインの絶対レベルに影響を与える可能性がある。対象における腫瘍負荷のレベルは、サイトカインレベル、特に炎症誘発性サイトカインに影響を与える可能性がある。当業者は、「減少または阻害する」という句またはその文法的変形は、サイトカイン産生の倍数減少または阻害、またはサイトカイン産生の正味の減少または阻害、またはパーセント（％）減少または阻害を含み得るか、あるいはサイトカイン産生の減少または阻害の変化率を包含し得ることを理解するであろう。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象においてサイトカイン産生を減少または阻害する方法であり、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象においてサイトカイン産生を減少または阻害する方法であり、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清、または該上清を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験しているか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象においてサイトカイン産生を減少または阻害する方法であり、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される追加の薬剤などのアポトーシス細胞上清、あるいは該上清を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

一実施形態では、感染症は、対象においてサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを引き起こす。一実施形態では、感染症は、インフルエンザ感染症である。一実施形態では、インフルエンザ感染症は、Ｈ１Ｎ１である。別の実施形態では、インフルエンザ感染症は、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザである。別の実施形態では、感染症は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である。別の実施形態では、対象は、エプスタインバーウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）を有する。別の実施形態では、感染症は、敗血症である。一実施形態では、敗血症は、グラム陰性である。別の実施形態では、感染症は、マラリアである。別の実施形態では、感染症は、エボラウイルス感染症である。別の実施形態では、感染症は、痘瘡ウイルスである。別の実施形態では、感染症は、全身グラム陰性細菌性感染症である。別の実施形態では、感染症は、ヤーリッシュヘルクスハイマー症候群である。

一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）である。別の実施形態では、ＨＬＨは、散発的なＨＬＨである。別の実施形態では、ＨＬＨは、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）である。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＭＡＳである。

一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、慢性関節炎である。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、スティル病としても知られる全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）である。

一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、クリオピリン関連周期症候群（ＣＡＰＳ）である。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、家族性寒冷蕁麻疹（ＦＣＵ）としても知られる家族性寒冷自己炎症性症候群（ＦＣＡＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、マックルウェル症候群（ＭＷＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、慢性乳児神経皮膚関節炎（ＣＩＮＣＡ）症候群を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＰＳは、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、またはＣＩＮＣＡ症候群、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＡＳである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＵである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＭＷＳである。別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＣＩＮＣＡ症候群である。さらに別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、またはＣＩＮＣＡ症候群、あるいはそれらの任意の組み合わせである。

別の実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、ＣＩＡＳＩ遺伝子としても知られる、ＮＬＲＰ３遺伝子における遺伝性または新規の機能獲得変異を含むクリオピリノパシーである。

一実施形態では、対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの原因は、遺伝性の自己炎症性障害である。

一実施形態では、炎症性サイトカインの放出のトリガーは、リポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陽性毒素、真菌毒素、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、またはＲＩＧ－１遺伝子発現の調節である。

別の実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象は、感染症を有さない。一実施形態では、対象は、急性膵炎を有する。別の実施形態では、対象は、実施形態では、重症の火傷または外傷である組織損傷を有する。別の実施形態では、対象は、急性呼吸窮迫症候群を有する。別の実施形態では、対象は、薬物使用に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有する。別の実施形態では、対象は、毒素吸入に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有する。

別の実施形態では、対象は、免疫療法の受領に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを有し、一実施形態では、スーパーアゴニストＣＤ２８特異的モノクローナル抗体（ＣＤ２８ＳＡ）による免疫療法である。一実施形態では、ＣＤ２８ＳＡは、ＴＧＮ１４１２である。別の実施形態では、免疫療法は、ＣＡＲＴ細胞療法である。

別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清またはＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンもしくはそれらの断片またはそれらの類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを使用して、医薬組成物の投与に起因するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを制御し得る。一実施形態では、医薬組成物は、オキサリプラチン、シタラビン、レナリドミド、またはそれらの組み合わせである。

別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清またはＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンもしくはそれらの断片またはそれらの類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを使用して、抗体の投与に起因するサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを制御し得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナルである。別の実施形態では、抗体は、ポリクローナルである。一実施形態では、抗体は、リツキシマブである。別の実施形態では、抗体は、オルソクローンＯＫＴ３（ムロモナブ－ＣＤ３）である。別の実施形態では、抗体は、アレムツズマブ、トシツズマブ、ＣＰ－８７０，８９３、ＬＯ－ＣＤ２ａ／ＢＴＩ－３２２またはＴＧＮ１４１２である。

別の実施形態では、炎症性サイトカイン産生の制御が有益である可能性がある疾患の例としては、がん、アレルギー、任意のタイプの感染、毒素性ショック症候群、敗血症、任意のタイプの自己免疫疾患、関節炎、クローン病、狼瘡、乾癬、または特徴的な特徴が対象に有害な影響を引き起こす毒性サイトカイン放出である他の疾患が挙げられる。

敗血症

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であり、この方法は、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であり、この方法は、アポトーシス上清を含む組成物を該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であり、この方法は、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を抗生物質と組み合わせて該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であり、この方法は、アポトーシス上清を含む組成物を抗生物質と組み合わせて該対象に投与するステップを含み、該投与は、該対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和における初期アポトーシス細胞の使用は、例えば、該対象に抗生物質を投与することも含むがこれに限定されない、併用療法の一部である。

いくつかの実施形態では、敗血症は、重症敗血症を含む。いくつかの実施形態では、敗血症は、軽度敗血症を含む。いくつかの実施形態では、敗血症は、急性敗血症を含む。いくつかの実施形態では、敗血症は、高悪性度敗血症を含む。

いくつかの実施形態では、敗血症の原因は、肺炎を含む。いくつかの実施形態では、敗血症の原因は、血管内メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、敗血症の原因は、尿路感染症（ＵＴＩ）を含む。いくつかの実施形態では、敗血症の原因は、胆道感染症を含む。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、臓器不全を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、臓器機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、臓器不全を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、臓器損傷を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、急性多臓器不全を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、臓器不全の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、臓器機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、臓器不全の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、臓器損傷の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、急性多臓器不全の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。

いくつかの実施形態では、敗血症中の臓器不全は、例えば、肺、心臓、腎臓、肝臓、および血液器官などであるがこれらに限定されない、重要器官の不全を含む。いくつかの実施形態では、敗血症の構成要素としての多臓器不全は、肺、心臓、腎臓、肝臓、および血液の組み合わせの不全を含む。いくつかの実施形態では、敗血症中の血液学的異常は、血小板減少症、リンパ球減少症、好中球減少症、または好中球増加症、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、臓器不全は、逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアを含むがこれに限定されない、当該技術分野で知られている標準を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、敗血症の測定は、グラスゴー昏睡尺度（ＧＣＳ）を含むがこれに限定されない当該技術分野で知られている標準を使用する。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、臓器機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、多臓器機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、重要臓器の機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、臓器機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、多臓器機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、重要臓器機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、初期アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して、重要臓器機能障害の増加が予防される。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することは、敗血症の治療において非常に効果的である。いくつかの実施形態では、敗血症の効果的な治療の尺度は、所与の時間枠内に敗血症から回復する患者のパーセントを含む。いくつかの実施形態では、敗血症の効果的な治療の尺度は、初期アポトーシス細胞を投与されていない患者のパーセントと比較して、集中治療から解放された患者のパーセントを含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞を投与された敗血症に罹患している対象は、敗血症に罹患し、かつ初期アポトーシス細胞を投与されていない対象よりも迅速に回復する。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞を投与された敗血症に罹患している対象は、敗血症に罹患し、かつ初期アポトーシス細胞を投与されていない対象よりも完全に回復する。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患し、かつ初期アポトーシス細胞で治療された患者の死亡率は、初期アポトーシス細胞を投与されていない患者と比較して減少している。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、心血管機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、急性腎障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、肺機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、肝機能障害を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、血液学的異常を予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、心血管機能障害、急性腎障害、肺機能障害、および血液学的異常のうちのいずれかの組み合わせを予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、心血管機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、急性腎障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、肺機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、肝機能障害の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、血液学的異常の予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することは、心血管機能障害、急性腎障害、肺機能障害、および血液学的異常のいずれかの組み合わせの予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、サイトカインストームを予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、ケモカインストームを予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、サイトカインおよびケモカインストームを予防し、阻害し、発生率を低減させることを含む。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、サイトカインストームの予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、ケモカインストームの予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、サイトカインおよびケモカインストームの予防、阻害、発生率の低減がもたらされる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、対象における免疫応答のリバランスを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、炎症誘発性サイトカインの分泌を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発症率を低減、改善、または緩和することは、炎症誘発性サイトカイン／ケモカインおよび抗炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌を低減させることを含む。

いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することにより、対象における免疫応答のリバランスがもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することは、炎症誘発性サイトカインの分泌の低減がもたらされる。いくつかの実施形態では、敗血症に罹患している対象に初期アポトーシス細胞を投与することは、炎症誘発性サイトカイン／ケモカインおよび抗炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌の低減がもたらされる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、敗血症に罹患している対象の死亡率の低下を含む。いくつかの実施形態では、必要とする対象において敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、必要とする対象における生存期間を改善することを含む。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して６０％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して７０％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して８０％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して９０％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して１００％超増加させる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約５０～１００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約８０～１００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約８０％、９０％、または１００％増加させる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約１００～２０００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約２００～３００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して１００％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して２００％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して３００％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して４００％超増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％超増加させる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約１００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％増加させる。

いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約１００～１０００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約１００～５００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約５００～１０００％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約７０～８０％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約５０％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約６０％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約７０％増加させる。いくつかの実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象における生存期間を、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して約８０％増加させる。

別の実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、敗血症を経験し、かつアポトーシス細胞を投与されていない対象と比較される。別の実施形態では、必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和することは、敗血症を経験し、かつアポトーシス上清を投与されていない対象と比較される。

いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、抗生物質、輸液、および昇圧剤による初期標準治療後の静脈内投与を含む。

いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後１２～２４時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後１２～３６時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後２４～３６時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後１２～１８時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後１８～２４時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後１８～３０時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後２４～３０時間の間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後２４～３６時間の間の投与を含む。

いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後約１２時間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または数時間の投与を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を経験している対象へのアポトーシス細胞の投与は、敗血症の診断後２４時間±６時間以内の投与を含む。

いくつかの実施形態では、敗血症を患い、アポトーシス細胞を含む組成物を投与された対象の応答は、用量反応を含む。いくつかの実施形態では、敗血症を患い、アポトーシス細胞上清を含む組成物を投与された対象の応答は、用量反応を含む。

アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）

アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、主に肝臓で産生される循環５２ｋＤａの糖タンパク質である。ＡＡＴは主にセリンプロテアーゼ阻害剤として知られており、遺伝子ＳＥＲＰＩＮＡ１によってコードされる。ＡＡＴは好中球エラスターゼを阻害し、循環ＡＡＴの遺伝性欠損は、肺組織の悪化および肝疾患をもたらす。健康な人の血清ＡＡＴ濃度は、炎症中に２倍に増加する。

ＡＡＴレベルといくつかの炎症性疾患の重症度との間には負の関連がある。例えば、ＡＡＴのレベルまたは活性の低下は、ＨＩＶ感染症、糖尿病、Ｃ型肝炎感染によって誘発される慢性肝疾患、およびいくつかのタイプの血管炎を有する患者で報告されている。

増加する証拠は、ヒト血清由来のアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）が、炎症誘発性サイトカインの産生を低減させ、抗炎症性サイトカインを誘発し、樹状細胞の成熟を妨げることを示す。

実際、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのＡＡＴの添加は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βの放出を阻害するが、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ）およびＩＬ－１０産生を増加させる。

ＡＡＴはインビトロでＩＬ－１β媒介膵島毒性を低減させ、ＡＡＴ単剤療法は膵島同種移植片の生存を延長し、マウスの抗原特異的免疫寛容を促進し、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスの糖尿病の発症を遅らせる。ＡＡＴは、実験モデルでＬＰＳ誘導性急性肺損傷を阻害することが示された。最近、ＡＡＴは、急性心筋虚血再灌流傷害のマウスモデルにおいて、梗塞のサイズおよび心不全の重症度を低減させることが示された。

臨床グレードのヒトＡＡＴ（ｈＡＡＴ）による単剤療法は、循環炎症誘発性サイトカインを低減させ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の重症度を減少させ、実験的同種異系骨髄移植後の動物の生存を延長した（Ｔａｗａｒａｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１２Ｊａｎ１０；１０９（２）：５６４－９）、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＴ治療は、アロ反応性Ｔエフェクター細胞の増殖を低減したが、Ｔ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の回復を促進し、したがって病理学的プロセスを低減するために、ドナーＴエフェクターとＴ制御性細胞の比率を変更した。インビトロでは、ＡＡＴは、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βなどの炎症誘発性サイトカインのインビトロ分泌を抑制し、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の産生を増強し、宿主樹状細胞におけるＮＦ－κＢの移行を障害した。参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｃｏｎｄｅｓ，Ｂｌｏｏｄ．２０１４（Ｏｃｔ３０；１２４（１８）：２８８１－９１）は、ＡＡＴによる治療がＧｖＨＤを改善しただけでなく、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を維持し、おそらく増強したことを示す。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞およびアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、別々の組成物である。別の実施形態では、ＡＡＴは、全長ＡＡＴまたはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡは、全長ＡＡＴの類似体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡＴを含む組成物は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清をさらに含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびアルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法である。別の実施形態では、この方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清をさらに含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを治療する方法は、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを予防する方法は、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを改善する方法は、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを緩和する方法は、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験するか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害する方法であり、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

一実施形態では、ＡＡＴは、サイトカイン放出を制御するために単独で投与される。別の実施形態では、ＡＡＴおよびアポトーシス細胞の両方またはそれらの組成物、あるいはアポトーシス細胞上清またはその組成物が、サイトカイン放出を制御するために投与される。

免疫調節剤

当業者は、免疫調節剤が、細胞外メディエーター、受容体、細胞内シグナル伝達経路のメディエーター、翻訳および転写の調節因子、ならびに免疫細胞を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、本明細書に開示される追加の薬剤は、当該技術分野で知られている免疫調節剤である。別の実施形態では、免疫調節剤の本明細書に開示される方法における使用は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを低減させる。別の実施形態では、免疫調節剤の本明細書に開示される方法における使用は、ＣＲＳまたはサイトカインストームを低減または阻害する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤の本明細書に開示される方法における使用は、腫瘍またはがんの治療、予防、成長の阻害、疾患進行の遅延、腫瘍量の低減、もしくは発生率の低減、またはそれらの任意の組み合わせのためのものである。いくつかの実施形態では、免疫調節剤の使用は、例えば、初期アポトーシス細胞を含むか、またはＣＡＲＴ細胞を含む組成物に限定されないが、本明細書に開示される別の組成物との組み合わせである。

一実施形態では、免疫調節剤は、サイトカインまたはケモカインの放出を遮断、阻害、または低減する化合物を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ＩＬ－２１もしくはＩＬ－２３、またはそれらの組み合わせの放出を遮断、阻害または低減する化合物を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ケモカイン受容体－５（ＣＣＲ５）受容体アンタゴニストクラスの抗レトロウイルス薬、例えばマラビロクを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、抗ＤＮＡＭ－１抗体を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヘパリン硫酸、ＡＴＰ、および尿酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される傷害／病原体関連分子（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、寛容の細胞メディエーター、例えば、制御性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはインバリアントのナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、樹状細胞を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、単球を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、マクロファージを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ルキソリチニブおよびトファシチニブを含む群から選択されるＪＡＫ２またはＪＡＫ３阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤、例えば、フォスタマチニブを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤ボリノスタットアセチル化ＳＴＡＴ３を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ネディレーション阻害剤、例えば、ＭＬＮ４９２４を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ｍｉＲ－１４２アンタゴニストを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、シチジンの化学的類似体、例えばアザシチジンを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、例えばボリノスタットを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンメチル化の阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、抗体を含む。別の実施形態では、抗体は、リツキシマブ（ＲｔＸ）である。

テルリウムベースの化合物

テルリウムは人体に見られる微量元素である。様々なテルリウム化合物は、免疫調節特性を有し、多様な前臨床および臨床研究で有益な効果を有することが示されている。テルリウム含有化合物の特に効果的なファミリーは、例えば、米国特許第４，７５２，６１４号、第４，７６１，４９０号、第４，７６４，４６１号、および第４，９２９，７３９号に開示されている。テルリウム含有化合物のこのファミリーの免疫調節特性は、例えば、米国特許第４，９６２，２０７号、第５，０９３，１３５号、第５，１０２，９０８号、および第５，２１３，８９９号に記載されており、これらはすべて、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。

１つの有望な化合物は、トリクロロ（ジオキシエチレン－Ｏ、Ｏ'）テルル酸アンモニウムであり、本明細書および当該技術分野ではＡＳ１０１とも呼ばれる。ＡＳ１０１は、上述に示されるテルリウム含有化合物のファミリーの代表的な例として、抗ウイルス（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌ．７（３）：１６３－８，１９８８、ＡＩＤＳＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．８（５）：６１３－２３，１９９２）および殺腫瘍活性（Ｎａｔｕｒｅ３３０（６１４４）：１７３－６，１９８７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３（９）：２３４２－５３，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（７）：３５３６－４２，１９９８）を示す。さらに、ＡＳ１０１は、低毒性を特徴とする。

一実施形態では、テルリウム含有免疫調節化合物を含む組成物は、テルリウムベースの化合物が免疫応答の先天性および後天性のアームを刺激する、本明細書に開示される方法で使用され得る。例えば、ＡＳ１０１は、マウス（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８８（１８）：１２７６－８４，１９９６）およびヒト（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎ．ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌ．９（３）：１８２－９０，１９９０；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ７０（４）：４７３－７，１９９０；Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８８（１８）：１２７６－８４，１９９６）におけるインターフェロン（ＩＦＮ）の強力な活性化因子であることが示されている。

別の実施形態では、テルリウムベースの化合物は、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αなどの一連のサイトカインの分泌を誘導する。

別の実施形態では、テルリウムベースの化合物は、免疫調節特性を有することが当該技術分野で知られているテルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、テルリウムベースの化合物は、トリクロロ（ジオキシエチレン－Ｏ、Ｏ'）テルル酸アンモニウムを含む。

一実施形態では、テルリウムベースの化合物は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を阻害する。別の実施形態では、テルリウムベースの化合物は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を低減する。別の実施形態では、テルリウムベースの化合物は、サイトカインストームのサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を阻害または低減する。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびテルリウムベースの化合物を含む組成物である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞およびテルリウムベースの化合物は、別々の組成物である。別の実施形態では、ＡＡＴは、全長ＡＡＴまたはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡは、全長ＡＡＴの類似体またはその機能的断片を含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびテルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法である。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法である。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを治療する方法は、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを予防する方法は、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを改善する方法は、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを緩和する方法は、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験するか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害する方法であり、テルリウムベースの化合物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。

一実施形態では、テルリウムベースの化合物は、サイトカイン放出を制御するために単独で投与される。別の実施形態では、テルリウムベースの化合物およびアポトーシス細胞の両方またはそれらの組成物、あるいはアポトーシス細胞上清またはその組成物が、サイトカイン放出を制御するために投与される。

樹状細胞

一実施形態では、樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳類の免疫系の抗原産生および提示細胞であり、抗原物質を処理し、それを細胞表面で免疫系のＴ細胞に提示し、それによってＴ細胞を新しい抗原およびリコール抗原の両方に感作させることができる。別の実施形態では、ＤＣは最も強力な抗原産生細胞であり、自然免疫系および獲得免疫系の間のメッセンジャーとして機能する。ＤＣ細胞は、一実施形態では、腫瘍を攻撃しかつ溶解するエフェクター細胞の生成を通じて、特定の抗腫瘍免疫を刺激するために使用され得る。

樹状細胞は、皮膚（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊な樹状細胞タイプが存在する）ならびに鼻、肺、胃、および腸の内層などの外部環境と接触している組織に存在する。それらはまた、血中に未成熟な状態で見つけることができる。活性化されると、それらはリンパ節に移動し、そこでＴ細胞およびＢ細胞と相互作用して、獲得免疫応答を開始および形成する。特定の発達段階で、枝分かれした突起、細胞の名前の由来となる樹状突起を発達させる。樹状細胞は、特定の腫瘍抗原を発現するように操作され得る。

Ｔ細胞活性化に必要な３つのシグナルは、（ｉ）自己ＭＨＣ分子における同族抗原の提示、（ｉｉ）膜結合型受容体－リガンド対による共刺激、および（ｉｉｉ）後述の免疫応答の極性化を指示する可溶性因子である。樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞の活性化に必要な３つのシグナルすべてを提供できるため、優れたがんワクチンプラットフォームになる。

したがって、一実施形態では、本明細書に開示されるのは、樹状細胞および追加の薬剤を含む組成物であり、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、樹状細胞および追加の薬剤を含む組成物を投与するステップを含む、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法であって、該薬剤は、該対象に対して、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

遺伝子改変

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞、樹状細胞、および／またはアポトーシス細胞の遺伝子改変は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、組換えウイルス、またはそれらの組み合わせを使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスに由来するベクターは、本明細書に開示される組成物および方法で使用される。別の実施形態では、これらのベクターは、導入遺伝子の永続的な発現の可能性がある、宿主ゲノムに組み込まれ、低い固有の免疫原性を有する。別の実施形態では、宿主ゲノムに組み込まれ、かつ／または低い固有の免疫原性を有する別のベクターを、本明細書に開示される組成物および方法で使用することができる。別の実施形態では、非ウイルスベクター媒介スリーピングビューティートランスポゾンシステムを使用して、ＣＡＲおよび他の遺伝子をＴ細胞に挿入する。別の実施形態では、「自殺遺伝子」は、アポトーシス促進性遺伝子の発現が、全身的に送達される薬物に応答する誘導性プロモーターの制御下にあるＴ細胞に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、一過性であり得る。別の実施形態では、遺伝子改変は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を利用し得る。別の実施形態では、多数の細胞は、ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＴ細胞などの一過的に操作されたＴ細胞に複数回注入され得る。別の実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡを使用するリンパ球のＲＮＡベースのエレクトロポレーションは、タンパク質の一過性発現を約１週間媒介し、ウイルスベクターを組み込むリスクを取り除く。別の実施形態では、ｍＲＮＡで形質導入された樹状細胞またはｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたＴおよびＮＫリンパ球。

遺伝子改変されたＴ細胞は、養子移入後１０年超、悪影響を与えることなく存続できることが示されており、遺伝子改変ヒトＴ細胞は基本的に安全であることを示す。

別の実施形態では、組成物および本明細書に開示される方法における遺伝子改変は、当該技術分野で知られている任意の方法であり得る。

アポトーシス細胞

本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞（「ＡｐｏＣｅｌｌ」）の産生は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８７４０８に記載されており、以下の実施例１に簡単に記載されている。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞は、当該技術分野で知られている任意の方法で産生される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受けている対象の自家である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受けている対象の同種異系である。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、本明細書に開示されるように、または当該技術分野で知られているように、アポトーシス細胞を含む。

当業者は、「自家」という用語が、ドナーおよびレシピエントが同じ人物である組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを包含し得ることを理解するであろう。

当業者は、「同種異系」という用語が、同じ種の別々の個人に由来する組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、同種異系ドナー細胞は、レシピエントとは遺伝的に異なる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製造方法に従って単核濃縮細胞組成物を得ることが、白血球アフェレーシスによって行われる。当業者は、「白血球アフェレーシス」という用語が、白血球がドナーの血液から分離されるアフェレーシス手順を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ドナーの血液は白血球アフェレーシスを受け、したがって、単核濃縮細胞組成物が、本明細書に開示される製造方法に従って得られる。当該技術分野で知られているように、収集された細胞の凝固を防ぐために、白血球アフェレーシス中に少なくとも１つの抗凝固剤の使用が必要であることに留意されたい。

いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシス手順は、本明細書に開示される製造方法に従って、単核濃縮細胞組成物の収集を可能にするように構成される。いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシスによって得られた細胞収集は、少なくとも６５％を含む。他の実施形態では、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の単核細胞。本明細書に開示される通り。いくつかの実施形態では、細胞ドナーからの血漿は、本明細書に開示される製造方法において、単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集される。いくつかの実施形態では、細胞ドナーからの約３００～６００ｍｌの血漿は、本明細書に開示される製造方法に従って、単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製造方法に従って、単核濃縮細胞組成物の取得と並行して収集された血漿は、凍結および／またはインキュベーション培地の一部として使用される。本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞の濃縮された集団を取得する追加の詳細な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８７４０８に見出され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞は、少なくとも８５％の単核細胞を含む。さらなる実施形態では、本本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞は、少なくとも８５％の単核細胞、９０％の単核細胞、あるいは９０％を超える単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞は、少なくとも９０％の単核細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞は、少なくとも９５％の単核細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞の製造方法が、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の単核細胞を含むことに続いて、細胞収集時の単核濃縮細胞調製物は、産生後の最終的な医薬集団である、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％の単核細胞を含むことに留意されたい。

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞の組成物の産生に使用される単核濃縮細胞調製物は、細胞収集時に少なくとも５０％の単核細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、医薬集団を産生するための方法であり、この方法は、ドナーの末梢血から単核に富む細胞調製物を得ることを含み、単核濃縮細胞調製物が少なくとも５０％単核細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるのは、医薬集団を産生するための方法であり、この方法は、少なくとも５０％単核細胞を含む単核濃縮細胞調製物を凍結することを含む。

いくつかの実施形態では、細胞調製物は、少なくとも８５％の単核細胞を含み、調製物中の細胞の少なくとも４０％が初期アポトーシス状態であり、調製物中の細胞の少なくとも８５％が生存細胞である。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞調製物は、１５％以下のＣＤ１５^高発現細胞を含む。

当業者は、「初期アポトーシス状態」という用語が、アポトーシスの後期兆候なしでアポトーシスの初期兆候を示す細胞を包含し得ることを理解するであろう。細胞におけるアポトーシスの初期兆候の例としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の曝露およびミトコンドリアの膜電位の減少が挙げられる。後期事象の例としては、細胞へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の流入、および最終的なＤＮＡ切断が挙げられる。細胞が「初期アポトーシス」状態であることを実証するために、いくつかの実施形態では、Ａｎｎｅｘｉｎ－ＶおよびＰＩ染色によるＰＳ曝露検出が使用され、ＡｎｎｅｘｉｎＶで染色されるがＰＩでは染色されない細胞は「初期アポトーシス細胞」であるとみなされる。別の実施形態では、Ａｎｎｅｘｉｎ－ＶＦＩＴＣおよびＰＩの両方によって染色される細胞は、「後期アポトーシス細胞」であるとみなされる。別の実施形態では、Ａｎｎｅｘｉｎ－ＶまたはＰＩのいずれについても染色されない細胞は、非アポトーシス生存細胞とみなされる。

当業者は、いくつかの実施形態では、「初期アポトーシス細胞」、「アポトーシス細胞」、「Ａｌｌｏｃｅｔｒａ」、「ＡＬＣ」、および「ＡｐｏＣｅｌｌ」という用語、ならびにそれらの文法的変形は、すべて同じ性質および意味を有し、交換可能に使用され得ることを理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の組成物および方法が、いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞を含むことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、初期アポトーシス細胞は、初期アポトーシス細胞を含む組成物のレシピエント（必要とする対象）にＨＬＡ適合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、初期アポトーシス細胞は、初期アポトーシス細胞を含む組成物のレシピエント（必要とする対象）に適合されない。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞（必要とする対象）を含む組成物のレシピエントに適合しない初期アポトーシス細胞は、本明細書に詳細に記載されるように照射される。いくつかの実施形態では、照射された適合しない細胞は、「Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ」または「ＡＬＣ－ＯＴＳ」と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、初期アポトーシス状態の細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも９０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも８０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも７０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも６０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、該細胞の少なくとも５０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗凝固剤をさらに含む。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞は安定である。当業者は、いくつかの実施形態では、安定性は、経時的に初期アポトーシス細胞特性を維持すること、例えば、約２～８℃での保存時に初期アポトーシス細胞特性を維持することを包含することを理解するであろう。いくつかの実施形態では、安定性は、凍結温度、例えば、０℃またはそれ以下の温度での保存時に、初期アポトーシス細胞特性を維持することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法において使用するための初期アポトーシス細胞の製造方法に従って得られた単核に富む細胞集団は、凍結培地中で凍結を受ける。いくつかの実施形態では、凍結は、段階的である。いくつかの実施形態では、収集後、細胞は、凍結するまで室温に維持される。いくつかの実施形態では、細胞調製物は、細胞収集後および凍結前に、洗浄培地中で少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。

本明細書で使用される場合、「細胞の取得」および「細胞収集」という用語は、交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞調製物の細胞は、収集から３～６時間以内に凍結される。いくつかの実施形態では、細胞調製物は、細胞収集の最大６時間以内に凍結される。いくつかの実施形態では、細胞調製物の細胞は、収集の１、２、３、４、５、６、７、８時間以内に凍結される。他の実施形態では、細胞調製物の細胞は、収集の最大８、１２、２４、４８、７２時間で凍結される。他の実施形態では、収集後、細胞は凍結するまで２～８℃に維持される。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生による凍結は、細胞調製物を約－１８℃～－２５℃で凍結し、続いて細胞調製物を約－８０℃で凍結し、最後に解凍するまで液体窒素で細胞調製物を凍結することを含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生による凍結は、細胞調製物を約－１８℃～－２５℃で少なくとも２時間凍結し、細胞調製物を約－８０℃で少なくとも２時間凍結し、最後に解凍するまで液体窒素で細胞調製物を凍結することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、解凍前に少なくとも８、１０または１２時間液体窒素中に保持される。いくつかの実施形態では、細胞調製物の細胞は、解凍およびアポトーシス誘導インキュベーション培地とのインキュベーションまで、液体窒素中に保持される。いくつかの実施形態では、細胞調製物の細胞は、多能性造血幹細胞移植の日まで、液体窒素中に保持される。非限定的な例では、細胞収集および凍結から最終集団の調製までの時間は、１～５０日の間、あるいは６～３０日の間であり得る。代替実施形態では、細胞調製物は、少なくとも数ヶ月などのより長い期間、液体窒素中に保持され得る。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生による凍結は、細胞調製物を約－１８℃～－２５℃で少なくとも０．５、１、２、４時間凍結することを含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生による凍結は、細胞調製物を約－１８℃～－２５℃で約２時間凍結することを含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生における凍結は、細胞調製物を約－８０℃で少なくとも０．５、１、２、４、１２時間凍結することを含む。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０ヶ月間凍結されたままであり得る。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも０．５、１、２、３、４、５年間凍結されたままであり得る。特定の実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも２０ヶ月間凍結されたままであり得る。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間凍結される。特定の実施形態では、単核濃縮細胞組成物の凍結は、少なくとも８時間の期間である。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも約１０時間凍結される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも約１２時間凍結される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約１２時間凍結される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物の総凍結時間（約－１８℃～－２５℃、約－８０℃および液体窒素中）は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間である。

いくつかの実施形態では、凍結は、単核濃縮細胞組成物の細胞において、少なくとも部分的に初期アポトーシス状態を誘導する。いくつかの実施形態では、凍結培地は、Ｌ－グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｓ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地を含む。いくつかの実施形態では、凍結培地中の血漿は、集団の単核濃縮細胞を提供したドナーの自家血漿である。いくつかの実施形態では、凍結培地は、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５％のＨｅｓ、１０％のジメチルスルホキシド、および２０％ｖ／ｖの血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地を含む。

いくつかの実施形態では、凍結培地は、抗凝固剤を含む。特定の実施形態では、凍結培地、インキュベーション培地および洗浄培地を含む、初期アポトーシス細胞集団の産生中に使用される培地の少なくともいくつかは、抗凝固剤を含む。特定の実施形態では、抗凝固剤を含む初期アポトーシス細胞集団の産生中に使用されるすべての培地は、同じ濃度の抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、細胞集団の最終懸濁培地に添加されない。

いくつかの実施形態では、少なくとも凍結培地への抗凝固剤の添加は、細胞調製物の収量を改善する。他の実施形態では、凍結培地への抗凝固剤の添加は、高トリグリセリドレベルの存在下での細胞調製物の収量を改善する。本明細書で使用される場合、細胞調製物の収量の改善は、凍結細胞からの生存細胞の割合、生存細胞からの初期状態アポトーシス細胞の割合、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つの改善に関連する。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも２４時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、２４時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、２４時間超安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも３６時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも３６時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、３６時間超安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、４８時間超安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、少なくとも７２時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、７２時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、７２時間超安定である。

当業者は、「安定」という用語が、ＰＳ陽性（ホスファチジルセリン陽性）のままであり、ＰＩ陽性（ヨウ化プロピジウム陽性）のごくわずかなパーセントであるアポトーシス細胞を包含することを理解するであろう。ＰＩ陽性細胞は膜安定性の指標を提供し、ＰＩ陽性細胞は細胞への流入を可能にし、膜の安定性が低いことを示す。いくつかの実施形態では、安定な初期アポトーシス細胞は、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、初期アポトーシスのままである。別の実施形態では、安定な初期アポトーシス細胞は、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間、初期アポトーシスのままである。別の実施形態では、安定した初期アポトーシス細胞は、２４時間超、３６時間超、４８時間超、または７２時間超、初期アポトーシスのままである。別の実施形態では、安定な初期アポトーシス細胞は、それらの状態を長期間維持する。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞集団は、細胞凝集体がない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞集団は、大きな細胞凝集体がない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞集団は、ドナーからの細胞収集（白血球アフェレーシス）以外のステップで抗凝固剤を添加せずに調製されたアポトーシス細胞集団と比較して、細胞凝集体の数が少ない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞集団またはその組成物は、抗凝固剤を含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、細胞凝集体がなく、該アポトーシス細胞は、高血中トリグリセリドを有する対象から得られた。いくつかの実施形態では、対象の血中トリグリセリドレベルは、１５０ｍｇ／ｄＬを超える。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞集団は、細胞凝集体がなく、該アポトーシス細胞集団は、正常な血中トリグリセリドを有する対象から得られた細胞から調製される。いくつかの実施形態では、対象の血中トリグリセリドレベルは、１５０ｍｇ／ｄＬ以下である。いくつかの実施形態では、細胞凝集体は、アポトーシス細胞産生法の間に細胞喪失を生じる。

当業者は、「凝集体」または「細胞凝集体」という用語は、低剪断力または静止状態下での血球の可逆的凝集を包含し得ることを理解するであろう。細胞凝集体は、アポトーシス細胞の産生のインキュベーションステップ中に視覚的に観察することができる。細胞凝集は、当該技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、光学顕微鏡下で試料を視覚的に画像化することによって、またはフローサイトメトリーを使用することによって測定することができる。

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）式Ａ、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

初期アポトーシス細胞集団およびその組成物を調製する方法のいくつかの実施形態では、抗凝固剤は、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地に添加される。いくつかの実施形態では、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、凍結培地、洗浄培地、アポトーシス誘導インキュベーション培地、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。フォンダパリヌクス、ビバリルジン、およびアルガトロバンなどであるがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている他の抗凝固剤を使用できることに留意されたい。

いくつかの実施形態では、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む５％のＡＣＤ式Ａ溶液を含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、細胞集団の最終懸濁培地に添加されない。本明細書で使用される場合、「最終懸濁培地」および「投与培地」という用語は、すべて同じ性質および意味を有し、交換可能に使用される。

いくつかの実施形態では、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、１％～１５％ｖ／ｖの濃度のＡＣＤ式Ａを含む。いくつかの実施形態では、凍結培地は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結培地およびインキュベーション培地の両方は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、凍結培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、凍結培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）式Ａの溶液である。いくつかの実施形態では、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地に添加される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度でヘパリンを含むＡＣＤ式Ａである。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生において使用されるアポトーシス誘導インキュベーション培地は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生において使用される凍結培地およびアポトーシス誘導インキュベーション培地の両方は、抗凝固剤を含む。理論または機序に拘束されることを望まずに、細胞収集プロトコルに関係なく、異なる細胞組成物において高く安定した細胞収量を維持するために、いくつかの実施形態では、抗凝固剤の添加は、アポトーシス細胞集団の産生中の凍結培地およびアポトーシス誘導インキュベーション培地の両方への抗凝固剤の添加を含む。いくつかの実施形態では、組成物内の高く安定した細胞収量は、アポトーシスの誘導に使用される細胞の初期集団の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞収量を含む。

いくつかの実施形態では、凍結培地およびインキュベーション培地の両方は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地および凍結培地の両方への抗凝固剤の添加は、細胞収集中に添加された抗凝固剤のタイミングおよび／またはタイプに限定されないなど、細胞収集条件に関係なく、集団の異なる調製物間で高く安定した細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地および凍結培地の両方への抗凝固剤の添加は、白血球アフェレーシス中に添加される抗凝固剤のタイミングおよび／またはタイプに関係なく、細胞調製物の高く安定した収量をもたらす。いくつかの実施形態では、高トリグリセリドレベルの存在下での細胞調製物の産生は、異なる調製物間の低くかつ／または不安定な細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から細胞調製物の産生は、細胞調製物の低くかつ／または不安定な細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、「高トリグリセリドレベル」という用語は、同性および同年齢の健康な対象の正常レベルを超えるトリグリセリドレベルを指す。いくつかの実施形態では、「高トリグリセリドレベル」という用語は、約１．７ミリモル／リットルを超えるトリグリセリドレベルを指す。本明細書で使用される場合、高く安定な収量は、対象に投与されたときに治療効率を示す用量の調製を可能にするのに十分に高い集団における細胞収量を指す。いくつかの実施形態では、治療効率は、対象における免疫疾患、自己免疫疾患または、炎症性疾患を治療、予防または改善する能力を指す。いくつかの実施形態では、高く安定した細胞収量は、最初に凍結された細胞のうちの集団中の細胞の少なくとも３０％、おそらく少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞収量である。

いくつかの実施形態では、細胞調製物が高トリグリセリドレベルを有するドナーから得られる場合、ドナーは、スタチンおよび／またはベザフィブラート、輸血の少なくとも８、１０、１２時間前の絶食、輸血の少なくとも２４、４８、７２時間前に血中トリグリセリドレベルを下げるための適切な食事の摂取、およびそれらの任意の組み合わせなどに限定されない、輸血前のトリセグリドを下げる薬剤を服用することからなる群から選択される少なくとも１つの手段をとる。

いくつかの実施形態では、集団における細胞収量は、アポトーシス誘導に供された細胞の初期数のうちの組成物中の細胞数に関連する。本明細書で使用される場合、「初期アポトーシス状態の誘導」および「アポトーシスの誘導」という用語は、交換可能に使用され得る。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、凍結および解凍に続いて、インキュベーション培地中でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、解凍およびインキュベーションの間に少なくとも１つの洗浄ステップが存在する。本明細書で使用される場合、「インキュベーション培地」および「アポトーシス誘導インキュベーション培地」という用語は、交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、Ｌ－グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、メチルプレドニゾロン、および血漿を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地は、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、および１０％ｖ／ｖの血漿を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中の血漿は、細胞調製物の細胞が由来するのと同じドナーに由来する。いくつかの実施形態では、血漿は、インキュベーションの日にインキュベーション培地に添加される。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、３７℃および５％ＣＯ２で実施される。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、メチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地内のメチルプレドニゾロンは、単核濃縮細胞組成物中の細胞が初期アポトーシス状態に入るようにさらに誘導する。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物中の細胞は、メチルプレドニゾロンの存在下での凍結およびインキュベーションの両方によって、初期アポトーシス状態に入るように誘導される。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生は、壊死を実質的に誘導することなく、初期アポトーシス状態の誘導を有利に可能にし、細胞は、調製後約２４時間、該初期アポトーシス状態で安定したままである。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、約１０～１００μｇ／ｍｌの濃度のメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、約４０～６０μｇ／ｍｌ、あるいは約４５～５５μｇ／ｍｌの濃度のメチルプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、５０μｇ／ｍｌの濃度のメチルプレドニゾロンを含む。

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約２～１２時間、おそらく４～８時間、典型的には約５～７時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約６時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも６時間である。好ましい実施形態では、インキュベーションは、６時間である。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地への抗凝固剤の添加は、細胞調製物の収量を改善する。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中の抗凝固剤は、凍結培地内と同じ濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、ヘパリン、ＡＣＤ式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地において使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含有するＡＣＤ式Ａである。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、ヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌ、おそらく０．３～０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、インキュベーション培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地は、ＡＣＤ式Ａを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖ、おそらく４％～７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地中のＡＣＤ式Ａは、約５％ｖ／ｖの濃度である。

いくつかの実施形態では、細胞調製物の収量の改善は、調製物が産生された凍結細胞の数のうち、調製物の初期アポトーシス生存細胞の数の改善を含む。

いくつかの実施形態では、凍結培地への抗凝固剤の添加は、医薬集団の異なる調製物間の高く安定な収量に寄与する。好ましい実施形態では、少なくとも凍結培地およびインキュベーション培地への抗凝固剤の添加は、使用される細胞収集プロトコルに関係なく、医薬組成物の異なる調製物間で高く安定な収量をもたらす。

いくつかの実施形態では、凍結培地は、ヘパリン、ＡＣＤ式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結培地において使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含有するＡＣＤ式Ａである。いくつかの実施形態では、凍結培地は、１０Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む５％ｖ／ｖのＡＣＤ式Ａ溶液を含む。

いくつかの実施形態では、凍結培地は、ヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、凍結培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、凍結培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌ、おそらく０．３～０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、凍結培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。

いくつかの実施形態では、凍結培地は、ＡＣＤ式Ａを含む。いくつかの実施形態では、凍結培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、凍結培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖ、おそらく４％～７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、凍結培地中のＡＣＤ式Ａは、約５％ｖ／ｖの濃度である。

いくつかの実施形態では、インキュベーション培地および／または凍結培地への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルに関係なく、集団内で高く安定な細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、インキュベーション培地および／または凍結培地への抗凝固剤の添加は、正常または高トリグリセリドレベルを有するドナーの血液から得られた場合、本発明の組成物内で高く安定な細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、少なくともインキュベーション培地への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルに関係なく、組成物内で高く安定な細胞収量をもたらす。いくつかの実施形態では、凍結培地およびインキュベーション培地への抗凝固剤の添加は、ドナーの血中のトリグリセリドレベルに関係なく、組成物内で高く安定な細胞収量をもたらす。

いくつかの実施形態では、凍結培地および／またはインキュベーション培地および／または洗浄培地は、少なくとも０．１Ｕ／ｍｌ、おそらく少なくとも０．３Ｕ／ｍｌ、典型的には少なくとも０．５Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、凍結培地および／またはインキュベーション培地および／または洗浄培地は、少なくとも１％ｖ／ｖ、おそらく少なくとも３％ｖ／ｖ、典型的には少なくとも５％ｖ／ｖの濃度のＡＣＤ式Ａを含む。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、細胞収集後、凍結培地に再懸濁され、かつ凍結される前に、少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、凍結および解凍後、少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。いくつかの実施形態では、洗浄ステップは、単核濃縮細胞組成物の遠心分離と、それに続く上清抽出および洗浄培地への再懸濁を含む。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、初期アポトーシス細胞集団の産生の各段階の間に少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、初期アポトーシス細胞集団の産生中の洗浄ステップ中に洗浄培地に添加される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、インキュベーション後、少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、ＰＢＳを使用したインキュベーション後、少なくとも１つの洗浄ステップを受ける。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、投与培地における細胞調製物の再懸濁の前の最終洗浄ステップに添加されない。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、投与培地における細胞調製物の再懸濁の前の最終洗浄ステップで使用されるＰＢＳに添加されない。特定の実施形態では、抗凝固剤は、投与培地に添加されない。

いくつかの実施形態では、インキュベーション中の細胞濃度は、約５×１０^６細胞／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、凍結、解凍、およびインキュベーション後、投与培地に懸濁され、それによって、医薬集団をもたらす。いくつかの実施形態では、投与培地は、好適な生理学的緩衝液を含む。好適な生理学的緩衝液の非限定的な例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）などである。いくつかの実施形態では、投与培地は、ＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、投与培地は、細胞の生存率を維持するのを助長するサプリメントを含む。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、投与前に濾過される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、少なくとも２００μｍのフィルターを使用して、投与前に濾過される。

いくつかの実施形態では、単核に富む細胞集団は、得られる細胞調製物の最終容量が１００～１０００ｍｌ、おそらく２００～８００ｍｌ、典型的には３００～６００ｍｌになるように、投与培地に再懸濁される。

いくつかの実施形態では、細胞収集は、単核濃縮細胞組成物を得ることを指す。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生中に実施される洗浄ステップは、洗浄培地中で実施される。特定の実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の産生のインキュベーションステップまで実施される洗浄ステップは、洗浄培地中で実施される。いくつかの実施形態では、洗浄培地は、Ｌ－グルタミンおよびＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地は、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび１０ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。

いくつかの実施形態では、洗浄培地は、抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地は、ヘパリン、ＡＣＤ式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地中の抗凝固剤の濃度は、凍結培地中と同じ濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄培地中の抗凝固剤の濃度は、インキュベーション培地中と同じ濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄培地において使用される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍｌの濃度のヘパリンを含有するＡＣＤ式Ａである。

いくつかの実施形態では、洗浄培地は、ヘパリンを含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄培地中のヘパリンは、０．１～２．５Ｕ／ｍｌ、おそらく０．３～０．７Ｕ／ｍｌ、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。特定の実施形態では、洗浄培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。

いくつかの実施形態では、洗浄培地は、ＡＣＤ式Ａを含む。いくつかの実施形態では、洗浄培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄培地中のＡＣＤ式Ａは、１％～１５％ｖ／ｖ、おそらく４％～７％ｖ／ｖ、典型的には約５％ｖ／ｖの濃度である。いくつかの実施形態では、洗浄培地中のＡＣＤ式Ａは、約５％ｖ／ｖの濃度である。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、対象への集団の意図された投与の数時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約３３℃～３９℃で解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、約３０～２４０秒、好ましくは４０～１８０秒、最も好ましくは５０～１２０秒間で解凍される。

いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の少なくとも１０時間前、あるいは集団の意図された投与の少なくとも２０、３０、４０、または５０時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の少なくとも１５～２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の少なくとも約２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の少なくとも２０時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の３０時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、集団の意図された投与の少なくとも２４時間前に解凍される。いくつかの実施形態では、単核濃縮細胞組成物は、解凍の前および／または後に、洗浄培地中での洗浄の少なくとも１つのステップを受ける。

いくつかの実施形態では、組成物は、メチルプレドニゾロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、メチルプレドニゾロンの濃度は、３０μｇ／ｍｌを超えない。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、高用量で使用される。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、高濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ヒトアポトーシス多形核好中球（ＰＭＮ）が使用される。いくつかの実施形態では、５０％がアポトーシス細胞である細胞群が使用される。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、メイギムザ染色されたサイトプレップによって検証される。いくつかの実施形態では、細胞の生存率は、トリパンブルー排除によって評価される。いくつかの実施形態では、細胞のアポトーシスおよび壊死状態は、ＦＡＣＳによる検出を伴うＡｎｎｅｘｉｎＶ／ヨウ化プロピジウム染色によって確認される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、壊死細胞を含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、１％未満の壊死細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、２％未満の壊死細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、３％未満の壊死細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、４％未満の壊死細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は、５％未満の壊死細胞を含む。

いくつかの実施形態では、約１４０×１０^６～２１０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約１０～１００×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約２０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約３０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約４０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約５０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、６０×１０^６個のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、約６０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約７０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約８０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約９０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約１～１５×１０^７個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約１０×１０^７個のアポトーシス細胞の用量が投与される。いくつかの実施形態では、約１５×１０^７個のアポトーシス細胞の用量が投与される。

いくつかの実施形態では、１０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^７個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^８個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^９個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１０個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１１個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１２個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^５個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^４個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^３個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^２個のアポトーシス細胞の用量が投与される。

いくつかの実施形態では、高用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、３５×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、２１０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、７０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、１４０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。別の実施形態では、３５～２１０×１０^６個のアポトーシス細胞の用量が投与される。

いくつかの実施形態では、単回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、複数回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、２回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、３回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、４回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、５回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、６回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、７回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、８回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、９回用量のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、１０回用量以上のアポトーシス細胞が投与される。いくつかの実施形態では、複数回用量のアポトーシス細胞が投与される。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、静脈内、皮下、結節内、腫瘍内、髄腔内、胸膜内、腹腔内、および直接胸腺に、を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、該アポトーシス細胞を受ける対象以外の対象から得られた細胞から調製される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、同種異系ドナー細胞の拒絶を克服するのに有用な追加のステップを含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１３／０１５６７９４号に記載の１つ以上のステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、いくつかの実施形態では同種異系アポトーシス細胞であるアポトーシス細胞の投与前の完全または部分的なリンパ球枯渇のステップを含む。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、同種異系アポトーシス細胞がサイトカイン放出を制御することを可能にするのに十分な期間、宿主対移植片反応を遅らせるように調整される。いくつかの実施形態では、方法は、２－アミノ－２－［２－（４－オクチルフェニル）エチル］プロパン－１，３－ジオール（ＦＴＹ７２０）、５－［４－フェニル－５－（トリフルオロメチル）チオフェン－２－イル］－３－［３－（トリフルオロメチル）フェニル］１，２，４－オキサジアゾール（ＳＥＷ２８７１）、３－（２－（－ヘキシルフェニルアミノ）－２－オキソエチルアミノ）プロピオン酸（Ｗ１２３）、２－アンモニオ－４－（２－クロロ－４－（３－フェノキシフェニルチオ）フェニル）－２－（ヒドロキシメチル）ブチル水素ホスファート（ＫＲＰ－２０３ホスファート）、または当該技術分野で知られている他の薬剤などのリンパ節からの同種異系Ｔ細胞の脱出を遅らせる薬剤を投与するステップを含み、本明細書に開示される組成物および方法の一部として使用し、有効性を有し、移植片対宿主病の開始を欠く同種異系アポトーシス細胞の使用を可能にすることができる。別の実施形態では、同種異系アポトーシスＴ細胞によるＭＨＣ発現は、同種異系細胞の拒絶を低減するためにサイレンシングされる。

いくつかの実施形態では、方法は、非静止非アポトーシス生存細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、または任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備えた単核アポトーシス細胞の集団を産生することを含み、該方法は、以下のステップ、末梢血の単核に富む細胞集団を得ることと、抗凝固剤を含む凍結培地中で該単核に富む細胞集団を凍結することと、該単核に富む細胞集団を解凍することと、約１０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度のメチルプレドニゾロンおよび抗凝固剤を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地中で、該単核に富む細胞集団をインキュベートすることと、該アポトーシス細胞集団を投与培地に再懸濁することと、該単核濃縮集団を不活性化することとを含み、該不活化は誘発後に発生し、該方法は、非静止非アポトーシス細胞の減少した割合、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、またはそれらの任意の組み合わせを備える単核アポトーシス細胞の集団を産生する。

いくつかの実施形態では、方法は、アポトーシス細胞の集団を同じ対象（自家Ａｐｏｃｅｌｌ）に投与する前に、対象に由来するアポトーシス細胞の集団を照射するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、アポトーシス細胞の集団をレシピエント（同種異系Ａｐｏｃｅｌｌ）に投与する前に、対象に由来するアポトーシス細胞を照射するステップを含む。

いくつかの実施形態では、細胞は、アポトーシス細胞集団内の残存する生存細胞の増殖および／または活性化を減少させる方法で照射される。いくつかの実施形態では、細胞は、集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントを低減させる方法で照射される。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の５０％未満に低減する。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の４０％未満に低減する。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の３０％未満に低減する。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の２０％未満に低減する。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の１０％未満に低減する。いくつかの実施形態では、不活化初期アポトーシス細胞集団中の生存可能な非アポトーシス細胞のパーセントは、集団の０％に低減する。

別の実施形態では、照射されたアポトーシス細胞は、それらの初期のアポトーシス、免疫調節、安定性の特性をすべて保持している。別の実施形態では、照射ステップは、ＵＶ放射を使用する。別の実施形態では、放射ステップは、ガンマ線放射を使用する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、生きた非アポトーシス細胞の減少したパーセントを含むか、アポトーシス細胞調製物内に存在する任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化を有する調製物を含むか、またはアポトーシス細胞調製物内に存在する任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約１％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約２％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約３％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約４％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約５％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約６％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約７％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約８％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約９％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約１０％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約１５％超増加させない。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比較して、死細胞（ＰＩ＋）の集団を約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％超増加させない。

いくつかの実施形態では、生きた非アポトーシス細胞の低減したまたは存在しない分画を含む細胞集団は、一実施形態では、生きた／生存細胞を有さない単核初期アポトーシス細胞集団を提供し得る。いくつかの実施形態では、生きた非アポトーシス細胞の低減したまたは存在しない分画を含む細胞集団は、一実施形態では、レシピエントにおいてＧＶＨＤを誘発しない単核初期アポトーシス細胞集団を提供し得る。

いくつかの実施形態では、照射されたＡｐｏＣｅｌｌの使用は、アポトーシス集団（生存細胞のごく一部を含む）の使用が引き起こす可能性のある移植片対白血病効果を除去し、ここで実施例（実施例８を参照）に示される効果がアポトーシス細胞集団内に存在する、細胞活性を有する生存可能な増殖細胞集団ではなく、アポトーシス細胞に起因する。

別の実施形態では、方法は、レシピエントに投与する前に、ドナーからＷＢＣに由来するアポトーシス細胞を照射するステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、アポトーシス細胞集団内の残存する生存細胞の増殖および／または活性化を回避する方法で照射される。別の実施形態では、照射されたアポトーシス細胞は、それらの初期のアポトーシス、免疫調節、安定性の特性をすべて保持している。別の実施形態では、照射ステップは、ＵＶ放射を使用する。別の実施形態では、放射ステップは、ガンマ線放射を使用する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、生きた非アポトーシス細胞の減少したパーセントを含むか、アポトーシス細胞調製物内に存在する任意の生きた非アポトーシス細胞の抑制された細胞活性化を有する調製物を含むか、またはアポトーシス細胞調製物内に存在する任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む。いくつかの実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、初期アポトーシス状態の単核細胞を含み、該プールされた単核アポトーシス細胞は、生きた非アポトーシス細胞の減少したパーセント、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制を有する調製物もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを備える。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞が照射されている。別の実施形態では、明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態では、献血から得られた白血球分画（ＷＢＣ）に由来する、プールされた単核アポトーシス細胞調製物である。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞調製物は、照射される。別の実施形態では、該照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。さらに別の実施形態では、照射された調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、低減した数の非アポトーシス細胞を有する。さらに別の実施形態では、照射された調製物は、照射されていないアポトーシス細胞調製物と比較して、低減した増殖細胞数を有する。別の実施形態では、照射された調製物は、照射されていないアポトーシス細胞集団と比較して、潜在的に免疫学的に活性な低減した細胞数を有する。

いくつかの実施形態では、プールされた血液は、ドナーおよびレシピエントの間で適合しない第三者の血液を含む。

当業者は、「プールされた」という用語が、複数のドナーから収集され、調製され、場合によっては後で使用するために保管される血液を包含することを理解するであろう。次いで、この組み合わされた血液のプールを処理して、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を産生することができる。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、単核アポトーシス細胞の容易に利用可能な供給が利用可能であることを確実にする。別の実施形態では、細胞は、アポトーシスが誘導されるインキュベーションステップの直前にプールされる。別の実施形態では、細胞は、再懸濁のステップでのインキュベーションステップの後にプールされる。別の実施形態では、細胞は、照射ステップの直前にプールされる。別の実施形態では、細胞は、照射ステップの後にプールされる。別の実施形態では、細胞は、調製方法の任意のステップでプールされる。

いくつかの実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２～２５単位の血液中に存在する細胞に由来する。別の実施形態では、該プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２～５、２～１０、２～１５、２～２０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、１０～１５、１０～２０、１０～２５、６～１３、または６～２５の単位の血液中に存在する細胞で構成される。別の実施形態では、該プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５単位の血液中に存在する細胞で構成される。必要な血液の単位数は、血液からＷＢＣ回収の効率にも依存する。例えば、低効率のＷＢＣ回復率では追加の単位が必要になり、高効率のＷＢＣ回復率では必要な単位が少なくなる。いくつかの実施形態では、各単位は、血液バックである。別の実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、少なくとも２５単位の血液、少なくとも５０単位の血液、または少なくとも１００単位の血液中に存在する細胞で構成される。

いくつかの実施形態では、血液の単位は、献血からの白血球（ＷＢＣ）分画を含む。別の実施形態では、輸血は、血液センターまたは血液バンクからのものであり得る。別の実施形態では、輸血は、プールされたアポトーシス細胞調製物の調製時に集められた病院のドナーからのものであり得る。別の実施形態では、複数のドナーからのＷＢＣを含む血液の単位は、本明細書に開示される組成物およびその方法の目的のために作成された独立した血液バンクに保存および維持される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物およびその方法の目的で開発された血液バンクは、複数のドナーからのＷＢＣを含む血液のユニットを供給することができ、白血球アフェレーシス単位を含む。

いくつかの実施形態では、プールされたＷＢＣの単位は、ＨＬＡマッチングによって制限されない。したがって、得られたプールされたアポトーシス細胞調製物は、ＨＬＡマッチングによって制限されない細胞集団を含む。したがって、特定の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、同種異系細胞を含む。

ＨＬＡマッチングによって制限されないプールされたＷＢＣに由来するプールされた単核アポトーシス細胞調製物の利点は、ＷＢＣの容易に入手可能な供給源およびＷＢＣを取得するコストの削減である。

いくつかの実施形態では、プールされた血液は、ＨＬＡマッチングとは無関係に、複数のドナーからの血液を含む。別の実施形態では、プールされた血液は、レシピエントとのＨＬＡマッチングが考慮されている複数のドナーからの血液を含む。例えば、１つのＨＬＡ対立遺伝子、２つのＨＬＡ対立遺伝子、３つのＨＬＡ対立遺伝子、４つのＨＬＡ対立遺伝子、５つのＨＬＡ対立遺伝子、６つのＨＬＡ対立遺伝子、または７つのＨＬＡ対立遺伝子が、ドナーおよびレシピエントの間で適合している。別の実施形態では、複数のドナーが部分的に適合し、例えば、一部のドナーは、ＨＬＡ適合しており、１つのＨＬＡ対立遺伝子、２つのＨＬＡ対立遺伝子、３つのＨＬＡ対立遺伝子、４つのＨＬＡ対立遺伝子、５つのＨＬＡ対立遺伝子、６つのＨＬＡ対立遺伝子、または７つのＨＬＡ対立遺伝子が一部のドナーおよびレシピエントの間で適合している。各可能性は、本明細書に開示されるような実施形態を含む。

特定の実施形態では、いくつかの生存可能な非アポトーシス細胞（アポトーシス耐性）は、以下に記載されるアポトーシスの誘導ステップ後も残存し得る（実施例１）。これらの生存可能な非アポトーシス細胞の存在は、いくつかの実施形態では、照射ステップの前に観察される。これらの生存可能な非アポトーシス細胞は、増殖または活性化することができる可能性がある。いくつかの実施形態では、複数のドナーに由来するプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、宿主に対して活性化されるか、互いに活性化されるか、またはその両方であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような照射された細胞調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、細胞活性化を抑制し、増殖を減少させた。別の実施形態では、照射は、ガンマ線照射またはＵＶ照射を含む。別の実施形態では、照射された細胞調製物は、照射されていない細胞調製物と比較して、減少した数の非アポトーシス細胞を有する。別の実施形態では、照射は、約１５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約２０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約２５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約３０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約３５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約４０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約４５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約５０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約５５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約６０グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、約６５グレイ単位（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は、最大２５００Ｇｙを含む。別の実施形態では、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、照射されていないプールされたアポトーシス細胞調製物と同じまたは類似のアポトーシスプロファイル、安定性および効力を維持する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、２４時間超安定である。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されるようなプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大３６時間安定である。さらに別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも３６時間安定である。さらなる実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、３６時間超安定である。別の実施形態では、本明細書に開示されるようなプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、最大４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、４８時間超安定である。

いくつかの実施形態では、照射ステップを含むプールされた細胞調製物を産生する方法は、細胞調製物が照射ステップを含まない場合がある単一のマッチドナーに由来するアポトーシス調製物で観察される初期アポトーシス、免疫調節、および安定性特性を保存する。別の実施形態では、本明細書に開示されるようなプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を誘発しない。

細胞調製物の照射は、当該技術分野では安全であると考えられている。現在、ＷＢＣへの反応を防ぐために、献血するための照射手順が定期的に実施されている。

別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物中のアポトーシス細胞のパーセントは１００％に近く、それによって細胞調製物中の生きた非アポトーシス細胞の分画を減少させる。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも４０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも５０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも６０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも７０％である。さらなる実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも８０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも９０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞のパーセントは、少なくとも９９％である。したがって、生きた非アポトーシス細胞の減少したまたは存在しない分画を含む細胞調製物は、一実施形態では、レシピエントにおいてＧＶＨＤを誘発しないプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し得る。各可能性は、本明細書に開示されるような実施形態を表す。

あるいは、別の実施形態では、生きた非アポトーシスＷＢＣの割合は、例えば、標的化された沈殿によって、生きた細胞集団を特異的に除去することによって減少する。別の実施形態では、ホスファチジルセリンに結合する磁性ビーズを使用して、生きた非アポトーシス細胞の割合を減少することができる。別の実施形態では、生きた非アポトーシス細胞のパーセントは、非アポトーシス細胞の細胞表面上のマーカーに結合するがアポトーシス細胞には結合しない磁気ビーズを使用して減少することができる。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、アポトーシス細胞の細胞表面上のマーカーに結合するが非アポトーシス細胞には結合しない磁気ビーズを使用するさらなる調製のために選択され得る。さらに別の実施形態では、生きた非アポトーシス性ＷＢＣの割合は、超音波の使用によって減少する。

一実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第三者ドナーからのものである。

いくつかの実施形態では、プールされた細胞調製物は、リンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む。別の実施形態では、プールされた細胞調製物は、単核細胞の濃縮された集団を含む。いくつかの実施形態では、プールされた単核は、単核濃縮細胞調製物であり、リンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される細胞型を含む。別の実施形態では、単核濃縮細胞調製物は、顆粒球としても知られる１５％以下、あるいは１０％以下、典型的には５％以下の多形核白血球（すなわち、好中球、好塩基球、および好酸球）を含む。別の実施形態では、プールされた単核細胞調製物は、顆粒球がない。

別の実施形態では、プールされた単核濃縮細胞調製物は、１５％以下、あるいは１０％以下、典型的には５％以下のＣＤ１５^高発現細胞を含む。いくつかの実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、１５％未満のＣＤ１５高発現細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核濃縮細胞調製物は、少なくとも８０％単核細胞、少なくとも８５％単核細胞、あるいは少なくとも９０％単核細胞、または少なくとも９５％単核細胞を含み、各可能性は、本明細書に開示される別個の実施形態である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるプールされた単核濃縮細胞調製物は、少なくとも８５％の単核細胞を含む。

別の実施形態では、単核細胞の最終プールされたパーセントが少なくとも８０％であるプールされた細胞調製物は、本明細書に開示されるように、プールされた単核濃縮細胞調製物と考えられている。したがって、増加した多形核細胞（ＰＭＮ）を有する細胞調製物を、少なくとも８０％の単核細胞の結果として生じる「プール」を有する高単核細胞を有する細胞調製物とプールすることは、本明細書に開示される調製物を含む。いくつかの実施形態によれば、単核細胞は、リンパ球および単球を含む。

当業者は、「単核細胞」という用語が、１つのローブ状の核を有する白血球を包含し得ることを理解するであろう。別の実施形態では、本明細書に開示されるようなプールされたアポトーシス細胞調製物は、５％未満の多形核白血球を含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＣＡＲＴ細胞と同じプールされた第三者ドナーＴ細胞に由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＣＡＲＴ細胞集団に由来する。

驚くべきことに、アポトーシス細胞は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を維持しながら、ＩＬ－６およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を単独または組み合わせて含むがこれらに限定されないサイトカインストームに関連するサイトカインの産生を減少させる（実施例２）。一実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージにおけるサイトカイン発現レベルに影響を与える。別の実施形態では、ポトーシス細胞は、マクロファージにおけるサイトカイン発現レベルを低下させる。一実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージにおけるサイトカイン発現レベルを抑制する。一実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージにおけるサイトカイン発現レベルを阻害する。一実施形態では、アポトーシス細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞投与前に存在するレベルと一致するか、またはほぼ一致するようにＩＦＮ－γレベルを維持する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージにおけるサイトカイン発現レベルに影響を与えるが、ＣＡＲＴ細胞におけるサイトカイン発現レベルには影響を与えない。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＤＣにおけるサイトカイン発現レベルに影響を与えるが、ＣＡＲＴ細胞におけるサイトカイン発現レベルには影響を与えない。したがって、アポトーシス細胞がＣＡＲＴ細胞療法の有効性を維持するのに役立つことは予想外であった。

別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、ＣＲＳの減少をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、重症なＣＲＳの減少をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、ＣＲＳの抑制をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、重症なＣＲＳの抑制をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、ＣＲＳの阻害をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、重症なＣＲＳの阻害をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、ＣＲＳの予防をもたらす。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせにおけるサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、重症なＣＲＳの予防をもたらす。

別の実施形態では、アポトーシス細胞は、Ｔ細胞の死を誘発するが、サイトカイン発現レベルの変化を介しては誘発しない。

別の実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージおよび樹状細胞のプライミングに拮抗して、さもなければサイトカインストームを増幅するサイトカインを分泌する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、炎症反応を抑制し、かつ／またはサイトカインの過剰放出を予防するＴｒｅｇを増加させる。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、１つ以上の炎症誘発性サイトカインを阻害する。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、またはＩＦＮ－ガンマ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の炎症誘発性サイトカインの阻害は、ｐｒ０炎症性サイトカインのダウンレギュレーションを含み、減少した量の１つ以上の炎症誘発性サイトカインが分泌される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、１つ以上の抗炎症性サイトカインの分泌を促進する。いくつかの実施形態では、抗炎症性サイトカインは、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ１０、またはＰＧＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、１つ以上の炎症誘発性サイトカインを阻害し、１つ以上の抗炎症性サイトカインを阻害する。いくつかの実施形態では、１つ以上の炎症誘発性サイトカインおよび１つ以上の抗炎症性サイトカインの阻害は、１つ以上の炎症誘発性サイトカインのダウンレギュレーションとそれに続く１つ以上の抗炎症性サイトカインのダウンレギュレーションを含み、減少した量の１つ以上の炎症誘発性サイトカインおよび１つまたは移動する抗炎症性サイトカインが分泌される。したがって、当業者は、アポトーシス細胞が、抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインの両方のダウンレギュレーションとともに、異常な自然免疫応答に有益な効果をもたらす可能性があることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、この有益な効果は、自然免疫系の構成要素によるＰＡＭＰおよびＤＡＭＰの認識に続く可能性がある。

別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＴＬＲリガンドへの曝露後の樹状細胞の成熟を阻害する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、潜在的に寛容原性の樹状細胞を作製し、いくつかの実施形態では、遊走可能であり、いくつかの実施形態では、遊走は、ＣＣＲ７による。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、一実施形態では、抗原提示細胞の炎症を阻害するＴＡＭ受容体シグナル伝達（Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ）である様々なシグナル伝達事象を誘発する。

いくつかの実施形態では、Ｔｙｒｏ－３、Ａｘｌ、およびＭｅｒは、キナーゼドメインおよび接着分子様細胞外ドメイン内の保存された配列によって特徴付けられる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭファミリーを構成する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＭｅｒＴＫを介したシグナル伝達を活性化する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路を活性化し、いくつかの実施形態では、ＮＦ－κＢを負に制御する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、インフラマソームを負に制御し、一実施形態では、炎症誘発性サイトカイン分泌、ＤＣ成熟、またはそれらの組み合わせの阻害をもたらす。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、Ｎｒ４ａ、Ｔｈｂｓ１、またはそれらの組み合わせなどの抗炎症性遺伝子の発現をアップレギュレートする。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、高レベルのＡＭＰを誘導し、いくつかの実施形態では、Ｐａｎｎｅｘｉｎ１依存的に蓄積される。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、炎症を抑制する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような初期アポトーシス細胞の使用方法は、抗体と組み合わせた、初期アポトーシス細胞またはその組成物の使用を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、腫瘍細胞抗原に対して向けられる。別の実施形態では、抗体は、ＣＤ２０に対して向けられる。別の実施形態では、抗体は、リツキシマブ（Ｒｔｘ）である。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞および抗体は、同じ組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞および抗体は、異なる組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞および抗体の組み合わせ、またはその組成物（複数可）の投与は、同時に行われる。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞および抗体の組み合わせ、またはその組成物（複数可）の投与は、抗体の前のアポトーシス細胞またはその組成物の投与を含む。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞および抗体の組み合わせ、またはその組成物（複数可）の投与は、抗体の投与後のアポトーシス細胞またはその組成物の投与を含む。

別の実施形態では、アポトーシス細胞と組み合わせて投与される抗体は、本明細書に記載されている、および／または当該技術分野で知られている、腫瘍またはがん抗原またはその断片に向けられる。別の実施形態では、抗体は、腫瘍関連抗原に向けられている。別の実施形態では、抗体は、血管新生因子である腫瘍関連抗原またはその断片に向けられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、例えば、初期アポトーシス細胞を含む組成物に限定されないが、本明細書に記載の組成物と組み合わせて使用することができる。

アポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＳｕｐＭｏｎ）

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および治療において使用するための組成物としては、本明細書に開示されるようなアポトーシス細胞上清が挙げられる。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清は、（ａ）アポトーシス細胞を提供し、（ｂ）ステップ（ａ）のアポトーシス細胞を培養し、（ｃ）細胞から上清を分離するステップを含む方法によって得られる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなアポトーシス細胞上清を作製に使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受けている対象と自家である。別の実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞上清を作製する際に使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受けている対象と同種異系である。

アポトーシス細胞上清が得られる「アポトーシス細胞」は、当業者に知られているアポトーシスを誘導する方法に供された、対象の任意の細胞型、または任意の市販の細胞株から選択される細胞であり得る。アポトーシスを誘導する方法は、低酸素、オゾン、熱、放射線、化学物質、浸透圧、ｐＨシフト、Ｘ線照射、ガンマ線照射、ＵＶ照射、血清欠乏、コルチコイド、またはそれらの組み合わせ、または本明細書に記載のもしくは当該技術分野で知られている任意の他の方法であり得る。別の実施形態では、アポトーシスを誘導する方法は、初期アポトーシス状態でアポトーシス細胞を産生する。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞は、白血球である。

一実施形態では、該アポトーシス白血球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。別の実施形態では、該白血球は、プールされた第三者ドナーからのものである。別の実施形態では、該白血球は、同種異系である。

いくつかの実施形態によれば、アポトーシス細胞は、非接着性白血球を選択し、それらをアポトーシス誘導に供し、続いて培養培地での細胞培養ステップによって提供される。アポトーシス細胞－貪食細胞上清を作製するために使用される「白血球」は、樹状細胞、マクロファージ、肥満細胞、好塩基球、造血幹細胞、骨髄細胞、ナチュラルキラー細胞などを含むがこれらに限定されない、免疫系および／または造血系の有核細胞の任意の系統または亜系統に由来し得る。白血球は、用途および目的、所望の白血球系統などに応じて、様々な一般的に実施されている方法のいずれかに従って、様々な好適な解剖学的区画のいずれかから、様々な好適な方法のいずれかで誘導または取得することができる。いくつかの実施形態では、ソース白血球は、初代白血球である。別の実施形態では、ソース白血球は、初代末梢血白血球である。

初代リンパ球および単球は、末梢血に好都合に由来し得る。末梢血白血球としては、７０～９５％のリンパ球、および５～２５％の単球が挙げられる。

血液から特定の型のソース白血球を取得する方法は、日常的に実施される。供給源のリンパ球および／または単球の取得は、例えば、ヘパリンまたはクエン酸などの抗凝固剤の存在下で、血液を採取することによって達成することができる。次いで、採取した血液をフィコールクッション上で遠心分離して、勾配界面でリンパ球と単球が、ペレットに好中球および赤血球が分離される。

白血球は、それらの特定の表面マーカーに従って、標準的な免疫磁気選択または免疫蛍光フローサイトメトリー技術を介して、または遠心溶出法を介して互いに分離することができる。例えば、単球はＣＤ１４＋分画として選択でき、Ｔリンパ球はＣＤ３＋分画として選択でき、Ｂリンパ球はＣＤ１９＋分画として選択でき、マクロファージはＣＤ２０６＋分画として選択できる。

リンパ球および単球は、これらの細胞を、組織培養処理された培養レシピエントにおける静的培養などの基質付着条件に供することによって互いに単離され得、細胞接着性基質にリンパ球ではなく単球の選択的付着をもたらす。

白血球はまた、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られ得、本明細書に記載されるように単離され得る。

当業者は、本明細書に開示されるような所望の量の培養ソース白血球を生成するために初代白血球を適切に培養するために必要な専門知識を有し、そのような培養方法を実施するための十分なガイダンスが当該技術分野の文献で利用可能である。

当業者はさらに、アポトーシス白血球を誘導するための好適な確立された白血球細胞株を確立、購入、または他の方法で取得するために必要な専門知識を有するであろう。好適な白血球細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの市販の業者から入手することができる。アポトーシス性白血球を産生するそれらの能力を著しく妨害する技術を介してソース白血球を取得すべきではないことは、当業者には明らかであろう。

別の実施形態では、アポトーシス細胞は、アポトーシスリンパ球であり得る。初代リンパ球などのリンパ球のアポトーシスは、初代リンパ球を血清欠乏、コルチコステロイド、または照射で治療することによって誘導され得る。別の実施形態では、コルチコステロイドによる治療を介して初代リンパ球のアポトーシスを誘導することは、初代リンパ球をデキサメタゾンで治療することによってもたらされる。別の実施形態では、約１マイクロモルの濃度のデキサメタゾンを使用する。別の実施形態では、照射を介して初代リンパ球のアポトーシスを誘導することは、初代リンパ球をガンマ線照射で治療することによってもたらされる。別の実施形態では、約６６ラジアンの線量を使用する。そのような治療は、貪食細胞との共培養ステップに好適なアポトーシスリンパ球の生成をもたらす。

さらなる実施形態では、アポトーシス細胞は、初代単球などのアポトーシス単球であり得る。アポトーシス単球を生成するために、単球は、血清欠乏の条件下で基質／表面付着のインビトロ条件にさらされる。そのような処理は、貪食細胞との共培養ステップに好適な非炎症性アポトーシス単球の生成をもたらす。

他の実施形態では、アポトーシス細胞は、同種異系アポトーシス細胞、第三者のアポトーシス細胞、およびアポトーシス細胞のプールを含む、本明細書に記載の任意のアポトーシス細胞であり得る。

他の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、アポトーシス細胞を他の細胞と共培養することによって得ることができる。

したがって、いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清は、（ａ）アポトーシス細胞を提供し、（ｂ）他の細胞を提供し、（ｃ）任意にステップ（ａ）および（ｂ）から細胞を洗浄し、（ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）の細胞を共培養し、任意に、（ｅ）細胞から上清を分離するステップを含む方法によって得られるアポトーシス細胞上清である。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞と共培養される他の細胞は、白血球である。

したがって、いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清は、（ａ）アポトーシス細胞を提供し、（ｂ）白血球を提供し、（ｃ）任意にステップ（ａ）および（ｂ）から細胞を洗浄し、（ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）の細胞を共培養し、任意に、（ｅ）細胞から上清を分離するステップを含む方法によって得られるアポトーシス細胞－白血球上清である。

いくつかの実施形態では、白血球は、マクロファージ、単球、または樹状細胞などの貪食細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、白血球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ細胞）であり得る。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および治療で使用するための組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１０６６６６に記載されるアポトーシス細胞－貪食細胞上清を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのアポトーシス細胞－貪食細胞上清は、当該技術分野で知られている任意の方法で産生される。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清は、貪食細胞とアポトーシス細胞との共培養から得られる。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清は、（ａ）貪食細胞を提供し、（ｂ）アポトーシス細胞を提供し、（ｃ）任意にステップ（ａ）および（ｂ）から細胞を洗浄し、（ｄ）ステップ（ａ）および（ｂ）の細胞を共培養し、任意に、（ｅ）細胞から上清を分離するステップを含む方法によって得られる。

「貪食細胞」という用語は、有害な外来粒子、細菌、および死んだ細胞または死にかけている細胞を摂取（貪食）することによって体を保護する細胞を意味する。貪食細胞としては、例えば、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、および肥満細胞と呼ばれる細胞、優先的に樹状細胞および単球／マクロファージが挙げられる。貪食細胞は、樹状細胞（ＣＤ４＋ＨＬＡ－ＤＲ＋系統－ＢＤＣＡ１／ＢＤＣＡ３＋）、マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）であり得るか、または単球由来（ＣＤ１４＋）であり得る。これらの異なる貪食細胞を区別するための技術は、当業者に知られている。

一実施形態では、単球は、プラスチック接着ステップによって得られる。該単球は、マーカーＣＤ１４＋でＢ細胞およびＴ細胞と区別できるが、不必要なＢ細胞はＣＤ１９＋およびＴ細胞ＣＤ３＋を発現する。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）が成熟を誘導した後、得られたマクロファージは、いくつかの実施形態では、マーカーＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋に対して陽性である。

一実施形態では、該貪食細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。

貪食細胞は、貪食細胞を得るための当該技術分野で知られている任意の方法によって提供することができる。いくつかの実施形態では、マクロファージまたは樹状細胞などの貪食細胞は、対象から直接単離され得るか、または成熟ステップによって前駆細胞から誘導され得る。

いくつかの実施形態では、マクロファージは、対象の腹腔から直接単離され、完全ＲＲＰＭＩ培地で培養され得る。マクロファージは、脾臓から単離することもできる。

貪食細胞は、末梢血単球からも得ることができる。該実施例では、培養された時の単球は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を細胞培養培地に添加すると、単球由来のマクロファージに分化するが、これに限定されない。

例えば、貪食細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来し得る。例えば、ＰＢＭＣは、フィコール勾配遠心分離によって個体からのサイタフェレーシスバッグから単離され得、完全ＲＰＭＩ培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）において９０分間細胞接着ステップで播種され得る。非接着性Ｔ細胞は、プラスチック接着ステップによって除去され、接着性Ｔ細胞は、組換えヒトＭ－ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ環境で培養される。培養期間後、単球由来のマクロファージが得られる。

貪食細胞は、細胞接着ステップによって選択することができる。該「細胞接着ステップ」は、貪食細胞または貪食細胞に成熟することができる細胞が、培養細胞を表面、細胞接着表面（例えば、組織培養皿、マトリックス、ナイロンまたはプラスチック製の適切なタイプの嚢またはバック）に接着できる培養状態を介して選択されることを意味する。当事者は、「細胞接着表面」という用語が、親水性および負に帯電したものを包含し得、当該技術分野で知られている様々な方法のいずれかで、別の実施形態では、例えば、コロナ放電、またはガスプラズマを使用してポリスチレン表面を改変することによって、得られ得ることを理解するであろう。これらのプロセスは、表面が親水性になり、負に帯電するように、表面のポリスチレン鎖にグラフトする高エネルギーの酸素イオンを生成する。細胞接着を促進するように設計された培養レシピエントは、様々な市販の業者（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥｖｅｒｇｒｅｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｕｎｃなど）から入手可能である。

Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞は、そのような細胞を得るための当該技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞は、対象から直接単離され得るか、または成熟ステップによって前駆細胞から誘導され得る。別の実施形態では、Ｂ、Ｔ、またはＮＫ細胞は、Ｂ、Ｔまたは、ＮＫ細胞株に由来し得る。当業者は、好適な確立されたＢ細胞、Ｔ細胞、および、ＮＫ細胞株を確立、購入、または他の方法で取得するために必要な専門知識を有するであろう。好適な細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅＴｙｐｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの市販の業者から入手することができる。

一実施形態では、貪食細胞、Ｂ、ＴまたはＮＫ細胞などの該アポトーシス細胞および該白血球は、共培養ステップ（ｄ）の前に個別に培養される。

貪食細胞の細胞成熟は、例えば培地への成熟因子の添加により、細胞培養中に起こる。一実施形態では、該成熟因子はＭ－ＣＳＦであり、例えば、単球由来のマクロファージを得るために使用することができる。

貪食細胞の成熟または選択に使用される培養ステップは、数時間から数日かかる場合がある。別の実施形態では、該未成熟貪食細胞は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８時間、適切な培養培地で培養される。

貪食細胞の培養培地は当業者に知られており、例えば、これらに限定されないが、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ－ｖｉｖｏ、および超培養環境であり得る。

一実施形態では、アポトーシス細胞および貪食細胞の共培養は、生理学的溶液中で行われる。

この「共培養」の前に、細胞を洗浄ステップにかけることができる。いくつかの実施形態では、白血球（例えば、貪食細胞）およびアポトーシス細胞は、共培養ステップの前に洗浄される。別の実施形態では、細胞をＰＢＳで洗浄する。

該共培養の間、白血球（例えば、マクロファージ、単球、もしくは貪食細胞などの貪食細胞類、またはＢ、ＴもしくはＮＫ細胞）およびアポトーシス細胞は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１もしくは１：１の比率で、または１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９もしくは１：１０の比率で（白血球：アポトーシス細胞）混合され得る。一例では、白血球とアポトーシス細胞の比率は、１：５である。

細胞の共培養は、数時間から数日間の場合がある。いくつかの実施形態では、該アポトーシス細胞は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２時間培養される。当業者は、抗炎症化合物の存在、白血球の生存可能な量、およびこれまで排除されていないアポトーシス細胞の量を測定することによって、共培養の最適な時間を評価することができる。貪食細胞によるアポトーシス細胞の排除は、アポトーシス細胞の消失のために光学顕微鏡で観察することができる。

いくつかの実施形態では、白血球（例えば、マクロファージ、単球、もしくは貪食細胞などの貪食細胞類、またはＢ、ＴもしくはＮＫ細胞）を有する培養との共培養などの、アポトーシス細胞の培養は、例えば、対象への注射などの投与と互換性のある培養培地および／生理学的溶液中で行われる。

当業者は、「生理学的溶液」が、培養時間内に白血球の死をもたらさない溶液を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、生理学的溶液は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２時間を超える死をもたらさない。他の実施形態では、４８時間、または３０時間。

いくつかの実施形態では、白血球（例えば、マクロファージ、単球、もしくは貪食細胞などの貪食細胞類、またはＢ、ＴもしくはＮＫ細胞）およびアポトーシス細胞は、生理学的溶液中で少なくとも３０分間インキュベートされる。この培養時間は、食作用の開始ならびにサイトカインおよび他の有益な物質の分泌を可能にする。

一実施形態では、そのような生理学的溶液は、白血球由来マクロファージによるアポトーシス性白血球除去を阻害しない。

培養または共培養ステップの終わりに、上清は、任意に、培養されたアポトーシス細胞または共培養された細胞から分離される。細胞から上清を分離する技術は、当該技術分野で知られている。例えば、細胞および破片を排除するために、上清を収集および／または濾過および／または遠心分離することができる。例えば、該上清は、それを細胞から分離するために、室温で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離され得る。

上清は、使用前に、例えば照射によって「不活化」され得る。したがって、アポトーシス細胞上清を調製するための方法は、任意の追加の照射ステップ（ｆ）を含み得る。該「照射」ステップは、血液製剤を不活化するために日常的に行われているように、微生物を殺すのに十分な速度でＸ線照射（２５～４５Ｇｙ）を使用する消毒方法と考えることができる。

上清の照射は、当該技術分野では安全であると考えられている。現在、ＷＢＣへの反応を防ぐために、献血するための照射手順が定期的に実施されている。

一実施形態では、アポトーシス細胞上清は、本明細書で詳細に説明されるように、対象への投与に適した医薬組成物に処方される。

いくつかの実施形態では、最終産物は、＋４℃で保存される。別の実施形態では、最終産物は、次の４８時間で使用するためのものである。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清、または上清を含む医薬組成物は、例えば－８０℃での保存のために凍結乾燥され得る。

１つの特定の実施形態では、ＷＯ２０１４／１０６６６６の実施例１に記載されているように、アポトーシス細胞－貪食細胞上清は、アポトーシス細胞として胸腺細胞を使用して作製することができる。単離後、胸腺細胞を照射し（例えば、３５Ｘ－Ｇｒａｙ照射で）、完全なＤＭＥＭ培地で例えば６時間培養して、アポトーシスを起こさせる。並行して、マクロファージを腹腔から分離し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏ、ＥＡＡ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＰおよび２－ＭｅｒｃａｐｔｏＥｔｈａｎｏｌ）で培養する。次いで、マクロファージおよびアポトーシス細胞を洗浄し、フェノールを含まないＸ－ｖｉｖｏ培地で１／５のマクロファージ／アポトーシス細胞比でさらに４８時間共培養する。次いで、上清を収集し、遠心分離して破片を除去し、保存のために冷凍または凍結乾燥することができる。マクロファージの濃縮は、ＦＡＣＳによるＦ４／８０の陽性染色を使用して確認できる。アポトーシスは、Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖおよび７ＡＡＤ除外の陽性染色を使用したＦＡＣＳによって確認できる。

一実施形態では、アポトーシス細胞上清は、別々に培養されたマクロファージまたはアポトーシス細胞のいずれかから得られた上清と比較して、ＴＧＦ－βの活性型および潜在型の両方でＴＧＦ－βレベルに富む。一実施形態では、ＩＬ－１０レベルはまた、単独で培養されたマクロファージと比較して増加し、単独で培養されたアポトーシス細胞と比較して劇的に増加する。別の実施形態では、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインは検出できず、ＩＬ－１βおよびＴＮＦは検出できないか、または非常に低レベルである。

一実施形態では、アポトーシス細胞上清は、単独で培養されたマクロファージまたは単独で培養されたアポトーシス細胞からの上清と比較した場合、ＩＬ－１ｒａ、ＴＩＭＰ－１、ＣＸＣＬ１／ＫＣおよびＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ１のレベルが増加し、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－１０に加えて、炎症を制御するための上清の寛容原性の役割に関与している可能性がある。

別の特定の実施形態では、ＷＯ２０１４／１０６６６６の実施例３に記載されているように、ヒトアポトーシス細胞－貪食細胞上清は、アポトーシスＰＢＭＣで培養された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するマクロファージの共培養から作製することができる。したがって、ＰＢＭＣは、例えば、フィコール勾配遠心分離によって、健康なボランティアからのサイタフェレーシスバッグから単離される。次に、ＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩ培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に９０分間播種する。次いで、非接着Ｔ細胞を除去し、例えば３５Ｇｙ用量のＸ線照射を使用してアポトーシスを起こし、アポトーシスの発生を可能にするために、完全ＲＰＭＩ環境で４日間培養する（培養の最初の４８時間後の細胞洗浄を含む）。並行して、接着性Ｔ細胞は、最初の４８時間後の細胞洗浄を含む４日間、５０μｇ／ｍＬの組換えヒトＭ－ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ環境で培養される。４日間の培養期間の終わりに、単球由来のマクロファージおよびアポトーシス細胞を洗浄し、Ｘ－ｖｉｖｏ培地で再び４８時間、１つのマクロファージと５つのアポトーシス細胞の比率で一緒に培養する。次いで、後者の培養物からの上清を収集し、遠心分離して細胞および破片を除去し、保存およびその後の使用のために凍結または凍結乾燥することができる。

一実施形態では、ＷＯ２０１４／１０６６６６に記載されているように、アポトーシス細胞－貪食細胞上清は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から６日で得られる可能性がある。培養物にＭ－ＣＳＦ添加を使用してＰＢＭＣ由来マクロファージを取得するために４日、およびアポトーシス細胞とのＰＢＭＣ由来マクロファージの共培養のためにさらに２日、０日目に単離された非接着性ＰＢＭＣに対応する。

一実施形態では、ＷＯ２０１４／１０６６６６に記載されているように、標準化されたヒトアポトーシス細胞－貪食細胞上清は、ドナーまたはＰＢＭＣのソース（サイタフェレーシスまたはバフィーコート）とは無関係に得ることができる。プラスチック接着ステップは、濃縮された単球の有意な開始集団（プラスチック培養皿に接着した後のＣＤ１４＋細胞の２０～９３％）を得るのに十分である。さらに、そのような接着性Ｔ細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞の存在が非常に少ないことを示す（ＣＤ１９＋Ｂ細胞の１．０％およびＣＤ３＋Ｔ細胞の１２．８％）。Ｍ－ＣＳＦの存在下で接着性Ｔ細胞を４日間培養した後、単球由来マクロファージの割合は、ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋マクロファージの０．１％～７７．７％に大幅に増加する。その時点で、単球由来マクロファージをアポトーシス非接着性ＰＢＭＣ（ＡｎｎｅｘｉｎＶ染色および７ＡＡＤ排除によって示されるように４７．６％のアポトーシス性）と共培養して、４８時間の間にアポトーシス細胞－貪食細胞上清を産生することができる。

一実施形態では、収集されたアポトーシス細胞－貪食細胞上清は、単球由来マクロファージ単独または炎症状態（＋ＬＰＳ）で処理された単球由来マクロファージの培養上清よりも有意に多くの潜在的ＴＧＦを含み、微量または低レベルのＩＬ－１βやＴＮＦなどの炎症性サイトカインを含む。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗凝固剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）式Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の実施形態では、抗凝固剤は、アポトーシス細胞を製造するプロセス中に添加される。別の実施形態では、添加される抗凝固剤は、ＡＣＤおよびヘパリン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。別の実施形態では、ＡＣＤは、１％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、２％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、３％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、４％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、５％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、６％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、７％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、８％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、９％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、１０％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、約１～１０％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、約２～８％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、約３～７％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、約１～５％の濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、約５～１０％の濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．５Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．１Ｕ／ｍｌ～１．０Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．２Ｕ／ｍｌ～０．９Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．３Ｕ／ｍｌ～０．７Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．１Ｕ／ｍｌ～０．５Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌ～１．０Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、約０．０１Ｕ／ｍｌ～１．０Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．１Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．２Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．３Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．４Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．５Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．６Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．７Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．８Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、０．９Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ヘパリンは、１．０Ｕ／ｍｌの最終濃度である。別の実施形態では、ＡＣＤは、５％の濃度であり、ヘパリンは、０．５Ｕ／ｍｌの最終濃度である。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、メチルプレドニゾロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、メチルプレドニゾロンの濃度は、３０μｇ／ｍｌを超えない。

いくつかの実施形態では、組成物は、体重１キログラムあたり約２億個の細胞に相当するサイタフェレーシス（７０ｋｇの対象の場合）によって得られた約１４×１０^９個のＣＤ４５＋細胞の共培養に由来するアポトーシス細胞上清の総用量またはアリコートで使用され得る。一実施形態では、そのような総用量は、体重１キログラムあたり約１億個の細胞に由来する上清の単位用量として投与され、かつ／または週間隔で単位用量として投与され、別の実施形態では、その両方である。この実施形態による好適な総用量には、体重１キログラムあたり約１０００万～約４０億個の細胞に由来する上清の総用量が含まれる。別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約４０００万～約１０億個の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約８０００万～約５億の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約１億６０００万～約２億５０００万の細胞に由来する。この実施形態による好適な単位用量には、体重１キログラムあたり約４００万～約４億個の細胞に由来する上清の単位用量が含まれる。別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約８００万～約２億の細胞に由来する。別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約１６００万～約１億個の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は、体重１キログラムあたり約３２００万～約５０００万の細胞に由来する。

別の実施形態では、約１０×１０^６個のアポトーシス細胞の共培養に由来するアポトーシス細胞上清の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^７個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^８個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^９個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１０個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１１個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^１２個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^５個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^４個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^３個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０^２個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。

いくつかの実施形態では、３５×１０^６個のアポトーシス細胞に由来するアポトーシス細胞上清の用量が投与される。別の実施形態では、２１０×１０^６個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、７０×１０^６個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、１４０×１０^６個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。別の実施形態では、３５～２１０×１０^６個のアポトーシス細胞に由来する用量が投与される。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞上清、または該アポトーシス細胞上清を含む組成物は、本明細書に詳細に論じられるように、静脈内、皮下、結節内、腫瘍内、髄腔内、胸膜内、腹腔内、および直接胸腺に、を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。

驚くべきことに、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、ＩＬ－６などのサイトカインストームに関連するサイトカインの産生を減少させる。別のサイトカインであるＩＬ－２は、ＤＣおよびマクロファージから少量分泌されるが、サイトカイン放出症候群には関与しない。しかしながら、それはＣＡＲＴ細胞の生存と増殖に必要であり、ほとんどがこれらのＴ細胞によって産生される。予期せぬことに、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、ＣＡＲＴ細胞の生存に悪影響を与えるほどＩＬ－２レベルを低下させない。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、マクロファージおよびＤＣにおけるサイトカイン発現レベルに影響を与えるが、Ｔ細胞自体におけるサイトカイン発現レベルには影響を与えない。したがって、アポトーシス細胞の上清が、ＣＡＲＴ細胞療法または樹状細胞療法の増強において有用であること予想外であった。

別の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、Ｔ細胞の死を誘発するが、サイトカイン発現レベルの変化を介してではない。

別の実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、マクロファージおよび樹状細胞のプライミングに拮抗して、さもなければサイトカインストームを増幅するサイトカインを分泌する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、炎症反応を抑制し、かつ／またはサイトカインの過剰放出を予防するＴｒｅｇを増加させる。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清の投与は、１つ以上の炎症誘発性サイトカインを阻害する。いくつかの実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、またはＩＦＮ－ガンマ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、１つ以上の抗炎症性サイトカインの分泌を促進する。いくつかの実施形態では、抗炎症性サイトカインは、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ１０、またはＰＧＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

別の実施形態では、アポトーシス細胞－貪食細胞上清などのアポトーシス細胞上清の投与は、ＴＬＲリガンドへの曝露後の樹状細胞の成熟を阻害する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、潜在的に寛容原性の樹状細胞を作製し、いくつかの実施形態では、遊走可能であり、いくつかの実施形態では、遊走は、ＣＣＲ７による。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、一実施形態では、抗原提示細胞の炎症を阻害するＴＡＭ受容体シグナル伝達（Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ）である様々なシグナル伝達事象を誘発する。いくつかの実施形態では、Ｔｙｒｏ－３、Ａｘｌ、およびＭｅｒは、キナーゼドメインおよび接着分子様細胞外ドメイン内の保存された配列によって特徴付けられる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭファミリーを構成する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、ＭｅｒＴＫを介したシグナル伝達を活性化する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路を活性化し、いくつかの実施形態では、ＮＦ－κＢを負に制御する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、インフラマソームを負に制御し、一実施形態では、炎症誘発性サイトカイン分泌、ＤＣ成熟、またはそれらの組み合わせの阻害をもたらす。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、Ｎｒ４ａ、Ｔｈｂｓ１、またはそれらの組み合わせなどの抗炎症性遺伝子の発現をアップレギュレートする。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、高レベルのＡＭＰを誘導し、いくつかの実施形態では、Ｐａｎｎｅｘｉｎ１依存的に蓄積される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与は、炎症を抑制する。

組成物

本明細書で使用される場合、「組成物」および「医薬組成物」という用語は、いくつかの実施形態では、すべて同じ性質および意味を有し、交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されるような状態または疾患の治療のための医薬組成物である。

別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、遺伝子改変された免疫細胞の増殖速度を維持または増加させるためのものである。さらなる実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞の増殖速度を維持または増加させるための方法は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率を減少または阻害することをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞療法の有効性を増加させるための医薬組成物である。別の実施形態では、免疫細胞療法の有効性を増加させるための方法で使用される組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率を低減または阻害することをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象において腫瘍のがんを治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する方法のための組成物である。別の実施形態では、対象におけるがんまたは腫瘍を治療、予防、発生率を低減、改善、または緩和するための方法で使用される組成物は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率を低減または阻害することをさらに含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、遺伝子改変された免疫細胞またはその遺伝子改変された受容体を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体ＣＡＲＴ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体ＴＣＲＴ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、樹状細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された受容体は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体を含む。

別の実施形態では、医薬組成物は、初期アポトーシス細胞集団を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、アポトーシス上清を含む。

さらに別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤中に本明細書に記載の有効量の遺伝子改変された免疫細胞またはその遺伝子改変された受容体を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量のＣＡＲＴ細胞、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量のＴＣＲＴ細胞、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の細胞傷害性Ｔ細胞、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の遺伝子改変された樹状細胞、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の遺伝子改変されたナチュラルキラー細胞、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の遺伝子改変されたＴ細胞受容体、および医薬的に許容される賦形剤を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量の初期アポトーシス細胞集団、および医薬的に許容される賦形剤を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患の治療のための医薬組成物は、本明細書に記載の有効量のアポトーシス上清、および医薬的に許容される賦形剤を含む。

別の実施形態では、本明細書に記載の状態または疾患は、腫瘍またはがんである。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の目的のタンパク質またはペプチドに結合する、遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体、例えば、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の目的のタンパク質またはペプチドを認識して結合する、遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体、例えばＴＣＲＴ細胞を含む組成物である。別の実施形態では、目的のタンパク質またはペプチドは、腫瘍抗原またはその断片を含む。

別の実施形態では、本明細書に開示され、本明細書に開示される方法で使用される組成物は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、および医薬的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物は、例えば、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、疾患進行の遅延、腫瘍量の低減、または発生率の低減、またはそれらの任意の組み合わせのために、本明細書に開示される方法で使用される。

さらに別の実施形態では、有効量の遺伝子改変された免疫細胞またはその遺伝子改変された受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含むものと同じ組成物であり得る。別の実施形態では、有効量のＣＡＲＴ細胞、またはＴＣＲＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、または遺伝子改変された樹状細胞、または遺伝子改変されたナチュラルキラー細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含むものと同じ組成物であり得る。さらに別の実施形態では、有効量の遺伝子改変されたＴ細胞受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含むものと同じ組成物であり得る。さらに別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞、ＴＣＲＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞を含む群から選択される有効量の遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含むものと同じ組成物ではない。別の実施形態では、組成物は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のいずれか、ならびに医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、組成物は、Ｔ細胞を発現する遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲＴ細胞）およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のいずれか、ならびに医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、有効量の遺伝子改変されたＴ細胞受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含むものと同じ組成物ではない。

別の実施形態では、組成物に含まれるアポトーシス細胞は、初期アポトーシス状態のアポトーシス細胞を含む。別の実施形態では、組成物に含まれるアポトーシス細胞は、プールされた第三者ドナー細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物に含まれるアポトーシス細胞上清は、初期アポトーシス細胞から収集される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物に含まれるアポトーシス細胞上清は、収集されたプールされた第三者ドナー細胞である。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＴＣＲＴ細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＴＣＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＴＣＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、樹状細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、樹状およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、樹状およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞、およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群を有するまたはサイトカインストームを経験している患者におけるサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するための追加の医薬組成物をさらに含む。

一実施形態では、追加の医薬組成物は、一実施形態ではイピリムマブであるＣＴＬＡ－４遮断薬を含む。別の実施形態では、追加の医薬組成物は、本明細書に開示されるようなアルファ－１抗トリプシン、またはその断片、またはその類似体を含む。別の実施形態では、追加の医薬組成物は、本明細書に開示されるテルリウムベースの化合物を含む。別の実施形態では、追加の医薬組成物は、本明細書に開示されるように、免疫調節剤を含む。別の実施形態では、追加の医薬組成物は、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つを含む医薬組成物は、単一の組成物を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞の各々は、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせは、別個の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、例えば、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞である遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞は、一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせは、遺伝子改変された免疫細胞に存在し、例えば、ＣＡＲＴ細胞、組成物、およびアポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清は、別個の組成物に含まれる。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＴＣＲＴ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つを含む医薬組成物は、単一の組成物を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＴＣＲＴ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞の各々は、一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせは、別個の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、例えば、一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞である遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞は、一実施形態では、ＴＣＲＴ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの組み合わせは、遺伝子改変された免疫細胞に存在し、例えば、ＴＣＲＴ細胞、組成物、およびアポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清は、別個の組成物に含まれる。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、樹状細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つを含む医薬組成物は、単一の組成物を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、樹状細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞の各々は、一実施形態では、樹状細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせは、別個の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、例えば、一実施形態では、樹状細胞である遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞は、一実施形態では、樹状細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの組み合わせは、遺伝子改変された免疫細胞に存在し、例えば、樹状細胞、組成物、およびアポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清は、別個の組成物に含まれる。

一実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つを含む医薬組成物は、単一の組成物を含む。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞の各々は、一実施形態では、ＮＫ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせは、別個の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、例えば、一実施形態では、ＮＫ細胞である遺伝子改変された免疫細胞を含む組成物、およびＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、アポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む医薬組成物は、複数の組成物を含み、遺伝子改変された免疫細胞は、一実施形態では、ＮＫ細胞であり、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの組み合わせは、遺伝子改変された免疫細胞に存在し、例えば、ＮＫ細胞、組成物、およびアポトーシス細胞、またはアポトーシス細胞上清は、別個の組成物に含まれる。

いくつかの実施形態では、組成物は、アポトーシス細胞および追加の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アポトーシス細胞および抗体またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、アポトーシス細胞およびＲｔＸ抗体またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞および抗体またはその機能的断片は、別個の組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞および抗体またはその機能的断片は、同じ組成物に含まれ得る。

当業者であれば、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分を有する、本明細書に記載される１つ以上の活性成分の調製物を包含し得ることを理解するであろう。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を促進することである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、または発生率の低減のための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存を増加させるための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、腫瘍またはがんのサイズを縮小するか、または成長速度を低下させるための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象における腫瘍量を低減するために含む医薬品である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象における疾患進行を遅らせるために含む医薬品である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象におけるがんまたは腫瘍の発生率を低減するために含む医薬品である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象におけるがんまたは腫瘍のサイズおよびまたは成長速度を低減するために含む医薬品である。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるような初期アポトーシス細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるような初期アポトーシス細胞集団、および医薬的に許容される賦形剤を含む。

当業者は、「生理学的に許容される担体」、「医薬的に許容される担体」、「生理学的に許容される賦形剤」、および「医薬的に許容される賦形剤」という句は、交換可能に使用され得、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された有効成分の生物学的活性および特性を抑制しない担体、賦形剤、または希釈剤を包含し得ることを理解するであろう。

当業者は、「賦形剤」が、有効成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられる。

薬物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔｅｄｉｔｉｏｎに見出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、組成物は、同時に投与される。代替的実施形態では、組成物は、異なる時間に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、注入または遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、ナチュラルキラー細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、樹状注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体の注入の前に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、注入または遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、ナチュラルキラー細胞注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、樹状注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体の注入の前に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、遺伝子改変された免疫細胞またはその受容体注入の約２４時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、ＣＡＲＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、または樹状細胞または遺伝子改変されたＴ細胞受容体注入の約２４時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、ＣＡＲＴ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、または樹状細胞または遺伝子改変されたＴ細胞受容体注入の約２４時間前に投与される。

いくつかの実施形態では、組成物は、同時に投与される。代替的実施形態では、組成物は、異なる時間に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与の前に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間２０時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間２０時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間前に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日１４日、または１５日前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその機能的断片、または抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の約２週、３週、４週、５週、６週、７週または８週間前に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の注入後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の約２４時間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与の約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間２０時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその断片を含む組成物の投与の約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間２０時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間後に投与される。

別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗体もしくはその断片、または抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日１４日、または１５日後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は、抗体もしくはその機能的断片、または抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の約２週、３週、４週、５週、６週、７週または８週間後に投与される。

いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、ＣＡＲＴ細胞とは別に投与される。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、追加の薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗体である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、治療用組成物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、治療効果を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような組成物は、１回投与される。別の実施形態では、組成物は、２回投与される。別の実施形態では、組成物は、３回投与される。別の実施形態では、組成物は、４回投与される。別の実施形態では、組成物は、少なくとも４回投与される。別の実施形態では、組成物は、５回以上投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなＣＡＲＴ細胞は、１回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、２回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、３回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、４回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、少なくとも４回投与される。別の実施形態では、組成物は、５回以上投与される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、治療用組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、治療効果を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞のみを含む組成物と比較して炎症性サイトカインまたはケモカイン放出の減少を提供するが、ＣＡＲＴ細胞のみを含む組成物と比較して同等の細胞毒性を有する組成物である。

製剤

初期アポトーシス細胞集団を含む本明細書に開示される医薬組成物は、減菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として便利に提供でき、選択されたｐＨに緩衝され得、液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも容易に調製される。さらに、液体組成物は、特に注射による投与がより都合が良い。他方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で処方することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散培地であり得る担体を含むことができる。

無菌注射液は、本明細書に記載の初期アポトーシス細胞集団を組み込むことによって調製することができ、本明細書に開示される方法を実施する際に、必要な量の適切な溶媒と様々な量の他の成分を必要に応じて利用することができる。そのような組成物は、好適な担体、希釈剤、または滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの賦形剤と混合されていてもよい。組成物はまた、凍結乾燥することができる。組成物は、投与経路および所望の調製に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加剤、防腐剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含むことができる。参照により本明細書に組み込まれる、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ」，１７ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５などの標準的なテキストを参照して、過度の実験なしに好適な調製物を調製することができる。

抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤を加えることができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射可能な剤形の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかしながら、本明細書の開示によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、遺伝子改変された免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞と適合性でなければならないであろう。

本明細書に記載の組成物または製剤は等張性であり得、すなわち、それらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有することができる。本明細書に開示されるような組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容される薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、または他の無機もしくは有機溶質などを使用して達成され得る。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液に特に好ましい場合がある。

組成物の粘度は、必要に応じて、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易かつ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、好ましい場合がある。

他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択した薬剤に依存するであろう。重要な点は、選択した粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、投与の正確な経路および特定の剤形の性質、例えば、液体剤形（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態、例えば徐放性形態または液体充填形態に処方されるかどうか）に依存する。

当業者であれば、組成物または製剤の成分が化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本明細書に開示される方法において使用するために、本明細書に記載されるような初期アポトーシス細胞集団の生存率または効力に影響を及ぼさないことを認識するであろう。このことは、化学的および薬学的原則の当業者には問題を提示しないか、または本開示および本明細書に引用された文献から、標準テキストを参照することによって、または簡単な実験（過度の実験を含まない）によって問題を容易に回避することができる。

本明細書に開示される遺伝子改変された免疫応答性細胞の治療的使用に関する１つの考慮事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。投与される細胞の量は、治療される対象によって異なる。いくつかの実施形態では、１０^４～１０^１０、１０^５～１０^９、または１０^６～１０^８個の本明細書に開示される遺伝子改変された免疫応答性細胞は、ヒト対象に投与される。より効果的な細胞は、さらに少ない数で投与され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも約１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、および５×１０^８個の本明細書に開示される遺伝子改変された免疫応答性細胞は、ヒト対象に投与される。有効用量とみなされるものの正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、および状態を含む、各対象に固有の要因に基づくことができる。投薬量は、本開示および当業者の知識から当業者によって容易に確認することができる。

当業者は、組成物中の細胞および任意の添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができ、本明細書に開示される方法で投与される。典型的には、任意の添加剤（活性細胞（複数可）および／または薬剤（複数可）に加えて）は、リン酸緩衝生理食塩水中の０．００１～５０％（重量）の量で存在し、有効成分は、約０．０００１～約５ｗｔ％などのマイクログラムからミリグラム台で存在する。別の実施形態では、約０．０００１～約１重量％である。さらに別の実施形態では、約０．０００１～約０．０５重量％または約０．００１～約２０重量％である。さらなる実施形態では、約０．０１～約１０重量％である。別の実施形態では、約０．０５～約５重量％である。当然ながら、動物またはヒトに投与される任意の組成物、および任意の特定の投与方法については、好適な動物モデル、例えば、マウスなどのげっ歯類における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０、ならびに好適な応答を誘発する組成物（複数可）の投薬量、その中の成分の濃度、および組成物（複数可）を投与するタイミングを決定することなどによって、毒性を決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書に引用された文献から過度の実験を必要としない。さらに、連続投与の時間は、過度の実験なしに確認することができる。

核酸配列、ベクター、細胞

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物および方法で使用するための、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸配列である。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物および方法で使用するための、本明細書に記載される遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離された核酸配列である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載されるような遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含むベクターである。

免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、組組換えＤＮＡ構築物で実質的に均質な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスのいずれか）は、細胞へのＤＮＡ構築物の導入のために使用される。例えば、抗原（例えば、腫瘍抗原、またはバリアント、またはそれらの断片）に結合する受容体をコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローン化することができ、発現は、その内因性プロモーターから、レトロウイルス長い末端反復配列から、または目的の標的細胞タイプに特異的なプロモーターから駆動することができる。非ウイルスベクターも使用できる。

非ウイルスアプローチは、細胞内のタンパク質の発現にも使用することができる。例えば、核酸分子は、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７、Ｏｎｏｅｔａｌ．，ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ１７：２５９，１９９０、Ｂｒｉｇｈａｍｅｔａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９、Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒｅｔａｌ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリジン結合（Ｗｕｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６３：１４６２１，１９８８、Ｗｕｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で核酸を投与することによって、または外科的条件下での微量注射（Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５，１９９０）によって、細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益である可能性がある。対象の患部組織への正常な遺伝子の移植はまた、正常な核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自家または異種の初代細胞またはその子孫）に導入することによって達成することができ、その後、細胞（またはその子孫）は、標的組織に注入されるか、全身的に注射される。組換え受容体はまた、トランスポザーゼまたは標的ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して誘導または取得することができる。一過性発現は、ＲＮＡエレクトロポレーションによって得られ得る。ポリヌクレオチド療法の方法で使用するためのｃＤＮＡ発現は、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、またはメタロチオネインプロモーター）から指示され、任意の適切な哺乳類調節エレメントまたはイントロン（例えば伸長因子ｌａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節され得る。例えば、所望の場合、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に指示することが知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を指示することができる。使用されるエンハンサーとしては、組織特異的または細胞特異的エンハンサーを特徴とするものが含まれ得るが、これらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合、調節は、同族の調節配列によって、または所望する場合、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む異種ソースに由来する調節配列によって媒介され得る。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞である。

使用方法

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される組成物を投与するステップを含む、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための方法である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、アポトーシス細胞を含む組成物を投与するステップを含む、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、疾患進行の遅延、腫瘍量の低減、または発生率の低減、またはそれらの任意の組み合わせの方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、腫瘍またはがんのサイズおよびまたは成長速度を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、腫瘍またはがんに罹患している対象の生存を増加させる。いくつかの実施形態では、アポトーシス細胞またはその組成物の使用は、例えば、ＣＡＲＴ細胞療法に限定されないが、遺伝子改変された免疫細胞療法の有効性を増加させる。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変された免疫細胞および追加の薬剤を含む組成物を投与するステップを含む、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための方法であって、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み、該方法は、該遺伝子改変された免疫細胞を投与され、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、該対象においてがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。別の実施形態では、該遺伝子改変された免疫細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞を含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）および追加の薬剤を含む組成物を投与するステップを含む、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための方法であって、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み、該方法は、該遺伝子改変された免疫細胞を投与され、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、該対象においてがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、遺伝子改変されたＴ細胞受容体細胞（ＴＣＲＴ細胞）および追加の薬剤を含む組成物を投与するステップを含む、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための方法であって、該追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み、該方法は、該遺伝子改変された免疫細胞を投与され、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して、該対象においてがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清またはそれらの組成物の投与は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の該投与の、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための有効性を低下させない。別の実施形態では、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤の投与は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の該投与の、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための有効性を低下させない。

別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清またはそれらの組成物の投与は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の該投与の、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための有効性を増加させる。別の実施形態では、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤の投与は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の該投与の、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和するための有効性を増加させる。

一実施形態では、遺伝子改変させる免疫細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該遺伝子改変された免疫細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与することを含み、有効性は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して増加する。別の実施形態では、該遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞は、樹状細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞受容体細胞（ＴＣＲＴ細胞）である。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該遺伝子改変された免疫細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与することを含み、有効性は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して増加する。

別の実施形態では、本明細書の方法は、免疫がん療法を受け、追加の薬剤を投与されていない対象における該炎症誘発性サイトカインのレベルと比較して、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生レベルを低減させる。別の実施形態では、本明細書の方法は、遺伝子改変された免疫細胞がん療法を受け、追加の薬剤を投与されていない対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率を阻害または低減する。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＩＬ－６を減少させる。

別の実施形態では、本明細書の方法は、免疫がん療法を受け、追加の薬剤を投与されていない対象における該サイトカインのレベルと比較して、少なくとも１つのサイトカインの産生を増加させる。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、アポトーシス細胞であり、他の実施形態では、追加の薬剤は、アポトーシス細胞上清である。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＩＬ－２を増加させる。

当業者は、サイトカインに関して本明細書で使用される「産生」という用語が、サイトカインの発現ならびに細胞からのサイトカインの分泌を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、サイトカインの産生の増加は、細胞からのサイトカインの分泌の増加をもたらす。代替的実施形態では、サイトカインの産生の減少は、細胞からのサイトカインの分泌の減少をもたらす。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を減少させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＩＬ－６の分泌を減少させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を増加させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＩＬ－２の分泌を増加させる。

別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、腫瘍細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、Ｔ細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、免疫細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、マクロファージである。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、Ｂ細胞リンパ球である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、肥満細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、内皮細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、線維芽細胞である。別の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインを分泌する細胞は、間質細胞である。当業者は、サイトカインのレベルが、細胞を取り巻く環境に応じて、サイトカイン分泌細胞において増加または減少し得ることを認識するであろう。

さらに別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を増加させる。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を維持する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を減少させない。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２の分泌を増加させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２Ｒの分泌を増加させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２の分泌レベルを維持する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２Ｒの分泌レベルを維持する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２Ｒの分泌レベルを減少させない。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２の分泌レベルを維持または増加させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２Ｒの分泌レベルを維持または増加させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－２Ｒの分泌レベルを減少させない。

さらにさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－６の分泌を減少させる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－６の分泌を減少させながら、ＩＬ－２の分泌レベルを維持、増加、または減少させない。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される追加の薬剤は、ＩＬ－６の分泌を減少させながら、ＩＬ－２Ｒの分泌レベルを維持、増加、または減少させない。

一実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該対象におけるＩＬ－６のレベルを減少させることを含み、該方法は、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与することを含み、有効性は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該対象におけるＩＬ－２のレベルを増加させることを含み、該方法は、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与することを含み、有効性は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該ＣＡＲＴ細胞の増殖を増加させることを含み、該方法は、ＣＡＲＴ細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞からの上清、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む追加の薬剤を投与することを含み、有効性および該ＣＡＲＴ細胞の増殖は、該追加の薬剤を投与されていない対象と比較して増加する。

一実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を増加させる方法は、該対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害し、該方法は、ＣＡＲＴ細胞およびＣＴＬＡ－４遮断薬を含む組成物、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、がんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法はまた、該対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害し、該方法は、ＣＡＲＴ細胞およびＣＴＬＡ－４遮断薬を含む組成物、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの組成物を投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを治療する方法である。

別の実施形態では、がんまたは腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法は、該対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害し、該方法は、ＣＡＲＴ細胞およびＣＴＬＡ－４遮断薬を含む組成物、アルファ－１抗トリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせ、またはそれらの組成物を投与するステップを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を治療する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を予防する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を阻害する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を低減する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を改善する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍を緩和する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、免疫療法中に遺伝子改変された免疫細胞の増殖速度を維持または増加させる方法であり、方法は、免疫療法中にアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、該遺伝子改変された免疫細胞は、Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、または遺伝子改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、免疫療法中にＣＡＲＴ細胞の増殖速度を維持または増加させる方法であり、方法は、免疫療法中にアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物を投与するステップを含む。

別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞の増殖速度を維持または増加させる方法は、免疫療法の有効性を減少または阻害しない。例えば、別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の増殖速度を維持または増加させる方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法の有効性を減少または阻害しない。別の実施形態では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の増殖速度を維持または増加させる方法は、対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害する。

別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示されるアポトーシス細胞またはアポトーシス上清、およびイピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬との併用療法を利用する。一実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、自己寛容を維持するのを助けるＴ細胞活性化の強力な阻害剤である。一実施形態では、別の実施形態では抗体である抗ＣＴＬＡ－４遮断薬の投与は、Ｔ細胞活性化の正味効果を生み出す。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＣＡＲＴ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ－４遮断薬を含む併用療法を利用する。

場合によっては、本明細書に開示される方法の、および本明細書に開示される方法で使用するためのポリペプチドは、未修飾アミノ酸配列と比較して少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。他の場合では、ポリペプチドは、非保存的アミノ酸置換を含む。そのような場合、そのような修飾を有するポリペプチドは、そのようなアミノ酸置換を欠くポリペプチドと比較して、増加した安定性またはより長い半減期を示す。

いくつかの実施形態では、「治療すること」は、治療的処置を含み、「予防すること」は、予防的または防止的手段を含み、その目的は、上述の標的とする病的状態または障害を予防または軽減することである。したがって、いくつかの実施形態では、治療することは、疾患、障害、または状態に関連する症状に直接影響を与えること、もしくはそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重症度を低減すること、その発症を遅延させること、それを低減すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、「治療すること」、「改善すること」、および「緩和すること」は、とりわけ、進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増強させること、回復を加速させること、代替療法の有効性を増加させること、もしくは代替療法に対する耐性を低下させること、またはそれらの組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、「予防すること」は、とりわけ、症状の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を低減すること、症候性エピソード間の潜伏期を増大させること、またはそれらの組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、「抑制すること」または「阻害すること」は、とりわけ、症状の重症度を低減すること、急性エピソードの重症度を低減すること、症状の数を低減すること、疾患関連症状の発生率を低減すること、症状の潜伏期を削減すること、症状を改善すること、二次症状を低減させること、二次感染を低減させること、患者の生存期間を延長させること、またはこれらの組み合わせを指す。

当業者は、「抗原認識受容体」という用語が、抗原結合に応答して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を包含し得ることを理解するであろう。例示的な抗原認識受容体は、腫瘍抗原結合ドメインが免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている、天然もしくは内因性Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存を増加させ、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与することを含み、方法は、対象の生存を増加させる。

当業者は、「疾患」という用語が、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を包含し得ることを理解するであろう。疾患の例としては、細胞の新生物または病原体感染が挙げられる。

当業者は、「有効量」という用語が、治療効果を有するのに十分な量を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、「有効量」は、新生物の継続的な増殖、成長、または転移（例えば、浸潤、または遊走）を阻止、改善、または阻害するのに十分な量である。

当業者であれば、「新生物」という用語は、細胞または組織の病理学的増殖およびその後の他の組織または器官への転移または浸潤を特徴とする疾患を包含し得ることを理解するであろう。新生物の増殖は、通常、制御されておらず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しない、またはその増殖の停止を引き起こすであろう条件下で起こる。新生物は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、ファロピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群から選択される器官、またはそれらの組織もしくは細胞型を含むがこれらに限定されない、様々な細胞型、組織、または器官に影響を及ぼし得る。新生物には、肉腫、がん腫、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが含まれる。

当業者は、「病原体」という用語が、疾患を引き起こす可能性のあるウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または原生動物を包含し得ることを理解するであろう。

当業者は、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語が、正常または非ＩＳ新生細胞と比較して腫瘍細胞上で独特にまたは差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を包含し得ることを理解するであろう。本明細書に開示される組成物および方法に関して、腫瘍抗原は、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣＩ）を介して免疫応答を活性化または誘導することができるか、または受容体－リガンド結合（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７．１／２）を介して免疫応答を抑制することができる腫瘍によって発現される任意のポリペプチドを含む。

当業者は、「ウイルス抗原」という用語が、免疫応答を誘導することができるウイルスによって発現されるポリペプチドを包含し得ることを理解するであろう。

「含む」、「含んでいる」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む」、「含んでいる」などを意味することができる。同様に、「からなる」および「本質的にからなる」という用語は、米国特許法でそれらに帰する意味を有する。本明細書に開示される組成物および方法は、有効成分または特定のステップを含むか、有効成分または特定のステップからなるか、または本質的に有効成分または特定のステップからなることが想定されている。

当業者は、「治療」という用語が、治療される個体または細胞の疾患経過を変える試みにおける臨床的介入を包含し得、予防のために、または臨床病理学の過程のいずれかで実施できることを理解するであろう。治療の治療効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。疾患または障害の進行を予防することにより、治療は、罹患もしくは診断された対象または障害を有する疑いのある対象における障害による悪化を予防することができるが、障害のリスクがあるか、障害を有する疑いのある対象における障害の発症または障害の症状を予防することもできる。

当業者は、「対象」という用語が、いくつかの実施形態では哺乳類に、いくつかの実施形態ではヒトに脊椎動物を包含し得ることを理解するであろう。対象はまた、いくつかの実施形態では、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ、およびマウス、ラット、スナネズミ、ハムスターなどの実験動物などの家畜化されたものを指す場合がある。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲが目的のペプチドに向けられているＣＡＲＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、目的のペプチドに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは、目的のペプチドを標的とする。別の実施形態では、ＣＡＲは、目的のペプチドを活性化する。別の実施形態では、ＣＡＲは、目的のペプチドのリガンドである。別の実施形態では、目的のペプチドは、ＣＡＲのリガンドである。これらの実施形態の各々は、本明細書に開示される部分とみなされるべきである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞は、Ｔ細胞ではない。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞は、ＮＫ細胞ではない。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞は、ＣＴＬではない。別の実施形態では、本明細書に開示される免疫細胞は、制御性Ｔ細胞ではない。別の実施形態では、免疫細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。別の実施形態では、免疫細胞は、リンパ系細胞が分化され得る多能性幹細胞ではない。

免疫療法への１つのアプローチは、患者自身の免疫細胞を操作して、腫瘍を認識し、かつ攻撃する遺伝子改変された免疫細胞を作成することである。本明細書に記載されるように、免疫細胞が収集され、遺伝子改変されて、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が腫瘍またはがん細胞上の特異的タンパク質抗原を認識できるようにするそれらの細胞表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成する。次いで、遺伝子改変された免疫細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の拡大した集団が、患者に投与される。いくつかの実施形態では、投与された細胞は、患者の体内で増殖し、それらの表面に抗原を宿すがんおよび腫瘍細胞を認識して殺す。別の実施形態では、投与された細胞は、患者の体内で増殖し、腫瘍関連抗原を認識して殺し、がんおよび腫瘍細胞の死につながる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法、ならびにサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験している対象におけるサイトカイン産生の低減または阻害の方法であり、該方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物を投与するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを治療する方法である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを予防する方法である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを緩和する方法である。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを改善する方法である。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清またはそれらの組成物の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を低下させない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）がん療法を受けている対象におけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率の阻害または低減の方法であり、該方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を含む組成物を該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの発生率を阻害または低減することは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞がん療法を受け、かつアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与される対象におけるサイトカインレベルを測定することによって決定される。別の実施形態では、サイトカインの測定されたレベルは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受けていない対象におけるサイトカインレベルと比較される。別の実施形態では、測定されたサイトカインレベルは、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与しない対象におけるサイトカインレベルと比較される。さらに別の実施形態では、測定されたサイトカインレベルは、対照対象と比較される。

別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインのレベルは、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与されていない対象と比較して、対象において低下する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を受け、該アポトーシス細胞または該アポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与されていない対象と比較して、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生レベルを低下または阻害する。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、追加の薬剤の投与をさらに含み得る。あるいは、本明細書に開示される方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清ではなく、追加の薬剤の投与を含み得る。さらに別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲＴ細胞がん療法を増強または改善する化合物または組成物、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。さらに別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞がん療法を増強または改善する追加の薬剤としては、ＣＴＬＡ－４遮断薬、アルファ－１抗トリプシンまたはその機能的断片、またはその類似体、テルリウムベースの化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、追加の薬剤としては、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清が挙げられる。別の実施形態では、本明細書に記載の追加の薬剤の投与は、該ＣＡＲＴ細胞がん療法の前、同時、後である。

いくつかの実施形態では、一実施形態ではトシリズマブであるＩＬ－６受容体アンタゴニストは、本明細書に開示される組成物および方法とともに使用される。

いくつかの実施形態では、養子移入されたＴ細胞は、リンパ球減少症性宿主においてより効率的に生着および拡大する。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、ＣＡＲＴ細胞または他の改変された免疫細胞の移入の前にリンパ球枯渇にさらされる。別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞を受けている対象は、Ｔ細胞支持性サイトカインを与えられる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔｈ１７細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ幹メモリー細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、高い複製能力を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞増殖は、患者において起こる。別の実施形態では、少数の細胞を患者に移すことができる。別の実施形態では、Ｔ細胞増殖は、インビトロで起こる。別の実施形態では、多数の細胞を患者に移すことができ、細胞および／または上清を複数回患者に移すことができ、あるいはそれらの組み合わせを行うことができる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞の利点は、それらが細胞表面分子に特異的であるため、ＭＨＣ制限ＴＣＲ認識の制約を克服し、抗原提示またはヒト白血球抗原発現の障害による腫瘍脱出を回避することである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象における腫瘍負荷を低減する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、腫瘍負荷を低減することは、対象における腫瘍細胞の数を低減することを含む。別の実施形態では、腫瘍負荷を低減することは、対象における腫瘍サイズを低減することを含む。別の実施形態では、腫瘍負荷を低減することは、対象における腫瘍を根絶することを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象におけるがんまたは腫瘍細胞死を誘導する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、対象において腫瘍細胞死を誘導するための本明細書に開示される方法は、少なくとも追加の薬剤とともに操作されたキメラ抗原受容体を含むＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞を投与して、対象において毒性サイトカイン放出または「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）または「重症サイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）または「サイトカインストーム」を減少させることを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、新生物を有する対象の生存を増加または延長する方法であり、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。別の実施形態では、対象の生存を増加または延長する方法は、少なくとも追加の薬剤とともに操作されたキメラ抗原受容体を含むＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞を投与して、対象において毒性サイトカイン放出または「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）または「重症サイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）または「サイトカインストーム」を減少させることを含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、新生物を有する対象の生存を増加または延長する方法であり、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与するステップを含む、対象におけるがんの進行を遅延する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与するステップを含む、対象における白血病またはリンパ腫の進行を遅延する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存を増加、拡大、または延長する方法であり、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、白血病またはリンパ腫に罹患している対象の生存を増加、拡大、または延長する方法であり、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞負荷を低減する方法である。いくつかの実施形態では、腫瘍負荷は、肝臓および骨髄が減少する。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象における新生物を予防する方法であり、該方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは組成物の組み合わせを対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、新生物は、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、それを必要とする対象における血液がんを治療する方法であり、本明細書に記載の組成物のいずれかを該対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、投与は、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期アポトーシス細胞を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、初期アポトーシス細胞から得られた上清を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、本明細書に記載の組成物の組み合わせを投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、同じまたは異なる組成物でＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、本明細書に記載されるような追加の薬剤と組み合わせてＣＡＲＴ細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、同じまたは異なる組成物でアポトーシス細胞および抗体またはその断片を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、併用療法は、相乗効果を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、ＣＡＲＴ細胞のみの使用と比較して、ＣＡＲＴ細胞の有効性を増加させる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、ＣＡＲＴ細胞のみの使用と比較して、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存期間を拡大する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、ＣＡＲＴ細胞のみの使用と比較して、リンパ腫または白血病に罹患している対象の生存期間を拡大する。

いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんの発症または腫瘍の出現を遅延させる。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんの進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、腫瘍の成長を遅延させる。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存期間を拡大する。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、リンパ腫または白血病に罹患している対象の生存期間を拡大する。

いくつかの実施形態では、ＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞の投与を含む使用方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんの発症または腫瘍の出現を遅延させる。いくつかの実施形態では、ＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんの進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、ＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、腫瘍の成長を遅延させる。いくつかの実施形態では、ＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、がんまたは腫瘍に罹患している対象の生存期間を拡大する。いくつかの実施形態では、ＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞を使用する方法は、アポトーシス細胞または抗体のみのいずれかの使用と比較して、リンパ腫または白血病に罹患している対象の生存期間を拡大する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の使用方法は、腫瘍量を低減する。当業者は、「腫瘍量」という用語が、がん細胞の数、腫瘍のサイズ、または体内のがんの量を指し得ることを理解するであろう。「腫瘍量」という用語は、すべて同じ意味および性質を有する「腫瘍負荷」という用語と交換可能に使用することができる。いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞の投与を含む使用方法は、アポトーシス細胞を投与されていない対象と比較して、対象におけるがん細胞の数を低減させ、対象における腫瘍のサイズを低減させ、もしくは対象の体内のがんの量を低減させるか、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞の投与を含む使用方法は、アポトーシス細胞を投与されていない、または抗体を投与されていない、またはそれらの組み合わせである対象と比較して、対象におけるがん細胞の数を低減させ、対象における腫瘍のサイズを低減させ、もしくは対象の体内のがんの量を低減させるか、またはそれらの任意の組み合わせであり、いくつかの実施形態では、ＲｔＸ抗体またはその断片と組み合わせて初期アポトーシス細胞の投与を含む使用方法は、アポトーシス細胞、ＲｔＸ抗体を投与されていないか、またはそれらの組み合わせである対象と比較して、対象におけるがん細胞の数を低減させ、対象における腫瘍のサイズを低減させ、もしくは対象の体内のがんの量を低減させるか、またはそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストームを経験するか、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームに対して脆弱である対象におけるサイトカイン産生を減少または阻害する方法は、サイトカイン産生を減少または阻害する。別の実施形態では、方法は、炎症誘発性サイトカイン産生を減少または阻害する。さらなる実施形態において、方法は、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインを減少または阻害する。対象がＣＡＲＴ細胞がん療法を受けている別の実施形態では、方法は、ＣＡＲＴ細胞療法の有効性を低下させない。

本明細書で提供される方法は、本明細書に開示されるＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞を、既存の状態の軽減または再発の予防であろうと、所望の効果を達成するのに有効な量で投与することを含む。治療の場合、投与量は、所望の効果を生み出すのに有効な量である。有効量は、１回または一連の投与で提供することができる。有効量は、ボーラスまたは連続灌流によって提供することができる。

当業者は、「有効量」（または「治療有効量」）が、治療時に有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量を包含し得ることを認識するであろう。有効量は、１回または複数回の用量で対象に投与することができる。治療の点から、有効量は、疾患の進行を軽減、改善、安定化、逆転または遅延させる、あるいは疾患の病理学的結果を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際には、通常、いくつかの要因が考慮される。これらの要因としては、対象の年齢、性別、体重、治療中の状態、状態の重症度、ならびに投与された抗原結合断片の形態および有効濃度が挙げられる。

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、遺伝子改変された細胞を含む組成物、および単一の組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物、および単一の組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ＴＣＲＴ細胞を含む組成物、および単一の組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、遺伝子改変された細胞を含む組成物、および少なくとも２つの組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ＣＡＲＴ細胞を含む組成物、および少なくとも２つの組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、方法は、ＴＣＲＴ細胞を含む組成物、および少なくとも２つの組成物に含まれる追加の薬剤またはそれらの組み合わせを投与することを含む。

抗原特異的Ｔ細胞、例えばＣＡＲＴ細胞を使用する養子免疫療法の場合、１０^６～１０^１０の範囲の細胞用量（例えば、１０^９）が通常は注入される。遺伝子改変された細胞を宿主に投与し、その後分化すると、特異的抗原に対して特異的に向けられたＴ細胞が誘導される。Ｔ細胞の「誘導」として、欠失またはアネルギーなどによる抗原特異的Ｔ細胞の不活性化が挙げられ得る。不活化は、自己免疫疾患などの耐性を確立または再確立するのに特に有用である。改変された細胞は、静脈内、皮下、結節内、腫瘍内、髄腔内、胸膜内、腹腔内、および直接胸腺に、を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法によって投与することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腹腔内投与されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍内に投与される。

本明細書に開示される遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｎ細胞、ＣＴＬ細胞、またはそれらの前駆細胞）を含む組成物は、新生物、病原体感染、または感染症の治療のために対象に全身的または直接提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞は、目的の器官（例えば、新生物によって影響を受ける器官）に直接注射される。あるいは、遺伝子改変された免疫応答性細胞を含む組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の器官に間接的に提供される。増殖剤および分化剤は、細胞の投与前、投与中、または投与後に提供され、インビトロまたはインビボでのＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させることができる。

本明細書に開示される方法において上記のように、追加の薬剤を含む組成物は、遺伝子改変された免疫細胞の投与の前、同時、または後に提供され得る。一実施形態では、本明細書に開示される方法において、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞は、本明細書に開示されるような追加の薬剤の前に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法において、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞は、本明細書に開示されるような追加の薬剤と同時に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法において、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞は、追加の薬剤の投与後に投与される。

一実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるようなアポトーシス細胞を含む組成物を投与する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるようなアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与する。

改変された細胞は、生理学的に許容される任意のビヒクルで、通常は血管内で投与することができるが、細胞が再生および分化に適切な部位（例えば、胸腺）を見つけることができる骨または他の便利な部位に導入することもできる。通常、少なくとも１×１０^５細胞が投与され、最終的に１×１０^１０以上に達する。本明細書に開示される遺伝子改変された免疫応答性細胞は、精製された細胞集団を含み得る。当業者は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団中の遺伝子改変された免疫応答性細胞の割合を容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された免疫応答性細胞を含む集団における純度の範囲は、約５０～約５５％、約５５～約６０％、および約６５～約７０％である。他の実施形態では、純度は、約７０～約７５％、約７５～約８０％、約８０～約８５％である。さらなる実施形態では、純度は、約８５～約９０％、約９０～約９５％、および約９５～約１００％である。投薬量は、当業者によって容易に調整することができる（例えば、純度の減少は、投薬量の増加を必要とし得る）。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。所望の場合、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬＩＳ、ＩＬ２１、ならびに他のインターロイキン、Ｇ－、Ｍ－、およびＧＭ－ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、インターフェロン、例えば、ガンマ－インターフェロンおよびエリスロポエチンを含むがこれらに限定されない因子も含めることができる。

組成物としては、遺伝子改変された免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物が挙げられる。投与は、自家投与または異種投与であり得る。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞は、１人の対象から得られ、同じ対象、または異なる適合性のある対象に投与され得る。本明細書に開示されている末梢血由来の免疫応答性細胞またはそれらの後代（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ由来）は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む、局所注射を介して投与することができる。本明細書に開示される治療用組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは一般に、単位剤形の注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で処方される。

別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＣＡＲＴ細胞または本明細書に開示される他の免疫細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を生成する方法であり、方法は、Ｔ細胞または免疫細胞に目的の抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列を導入することを含む。代替的実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲＴ細胞または他の免疫細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物とは別である。

一実施形態では、本明細書に開示されるのは、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与するステップを含む悪性腫瘍の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、または緩和の方法である。

当業者は、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲ改変されたＴ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答が、能動的または受動的免疫応答であり得ることを理解するであろう。加えて、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞がＣＡＲの抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。

当業者は、免疫療法が、がん細胞を標的および破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用を包含し得ることを理解するであろう。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体のみが、療法のエフェクターとして機能する場合もあれば、他の細胞を動員して実際に細胞死滅をもたらす場合もある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合し得、単に標的剤として機能し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当該技術分野で知られている任意の血液腫瘍を治療、予防、成長を阻害、発生率を低減するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、例えば、びまん性乳房に限定されない、固形腫瘍が乳房に形成されない、当該技術分野で知られている任意のびまん性がんを治療、予防、成長を阻害、または発生率を低減するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当該技術分野で知られている任意の血液腫瘍の生存期間を拡大するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、例えば、びまん性乳房に限定されない、固形腫瘍が乳房に形成されない、当該技術分野で知られている任意のびまん性がんの生存期間を拡大するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当該技術分野で知られている任意の血液腫瘍に罹患している対象の生存を増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、例えば、びまん性乳房に限定されない、固形腫瘍が乳房に形成されない、当該技術分野で知られている任意のびまん性がんに罹患している対象の生存を増加させるために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当該技術分野で知られている任意の血液腫瘍の成長速度を低下させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、例えば、びまん性乳房に限定されない、固形腫瘍が乳房に形成されない、当該技術分野で知られている任意のびまん性がんの成長速度を低下させるために使用され得る。

いくつかの実施形態では、治療されている腫瘍またはがんは、腫瘍またはがんの転移を含む。いくつかの実施形態では、本明細書での使用方法は、腫瘍またはがんの転移を予防または低減する。いくつかの実施形態では、本明細書での使用方法は、成長を阻害するか、または転移の発生率を低減させる。

いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、小児である。いくつかの実施形態では、対象は、成人である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、上記で詳細に記載されるように、単核に富む細胞集団を含む初期アポトーシス細胞集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、安定な集団細胞を含む初期アポトーシス細胞集団を投与することを含み、該細胞集団は、２４時間超安定である。初期アポトーシス細胞の安定した集団は、上記で詳細に説明されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、細胞凝集体を欠く細胞の集団を含む初期アポトーシス細胞集団を投与することを含む。凝集体を欠く初期のアポトーシス細胞集団およびそれらの製造方法は、上記で詳細に説明されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、自家の初期アポトーシス細胞集団を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、同種異系の初期アポトーシス細胞集団を必要とする対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団またはその組成物の投与方法は、該アポトーシス細胞集団またはその組成物の単回注入を投与することを含む。いくつかの実施形態では、単回注入は、がんまたは腫瘍のリスクがあると事前に決定された対象に予防薬として投与され得る。いくつかの実施形態では、単回注入は、対象の治療的処置の一部として、定期的にがんまたは腫瘍を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、単回注入は、転移性がんの出現を予防、リスクを低減、または遅延させるために、がんまたは腫瘍を有する対象に予防薬として投与され得る。

いくつかの実施形態では、初期アポトーシス細胞集団またはその組成物の投与方法は、該アポトーシス細胞集団またはその組成物の複数回注入を投与することを含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、がんまたは腫瘍のリスクがあると事前に決定された対象に予防薬として投与され得る。いくつかの実施形態では、複数回注入は、対象の治療的処置の一部として、定期的にがんまたは腫瘍を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、複数回注入は、転移性がんの出現を予防、リスクを低減、または遅延させるために、がんまたは腫瘍を有する対象に予防薬として投与され得る。

いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも２回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、２回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、３回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも３回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、３回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、４回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも４回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、４回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、５回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも５回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、５回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、６回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも６回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、６回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、７回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも７回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、７回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、８回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも８回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、８回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、９回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも９回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、９回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、１０回以上の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、少なくとも１０回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、１０回の注入を含む。いくつかの実施形態では、複数回注入は、１１回以上の注入を含む。

いくつかの実施形態では、複数回注入は、少量の初期アポトーシス細胞を含み、投与される細胞の総投与量は、注入の合計である。

いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数日間にわたって投与される。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも１２時間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも２４時間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも１日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも２日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも３日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも４日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも５日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも６日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも７日間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも１週間が存在する。いくつかの実施形態では、複数回注入は、数時間にわたって投与され、注入の間に少なくとも２週間が存在する。

いくつかの実施形態では、複数回注入における細胞の量は、本質的に互いに同等である。いくつかの実施形態では、複数回注入における細胞の量は、互いに異なる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、追加の化学療法剤または免疫調節剤を該対象に投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、追加の化学療法剤または免疫調節剤は、初期アポトーシス細胞と同時に、または本質的に同時に投与される。いくつかの実施形態では、追加の化学療法剤または免疫調節剤は、初期アポトーシス細胞と同じ組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、追加の化学療法剤または免疫調節剤は、初期アポトーシス細胞とは異なる組成物に含まれる。

いくつかの実施形態では、追加の化学療法剤または免疫調節剤は、初期アポトーシス細胞の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、追加の化学療法剤または免疫調節剤は、初期アポトーシス細胞の投与後に投与される。

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アルキル化剤、窒素マスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、非古典的アルキル化剤、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン（ＡＺＱ）、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、代謝拮抗剤、葉酸代謝拮抗薬、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、カペシタビン、デオキシヌクレオシド類似体、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、抗微小管薬剤、ビンカアルカロイド、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、半合成ビンカアルカロイド、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、トポイソメラーゼ阻害剤、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、触媒阻害剤、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、細胞毒性抗生物質、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、アクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラサイクリン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシン、標的療法、モノクローナル抗体、裸のモノクローナル抗体、抱合型モノクローナル抗体、化学標識抗体、二重特異性モノクローナル抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、抗体またはその機能的断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその機能的断片は、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、またはＦｖ断片を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの活性断片である。当業者は、「断片」という用語が少なくとも５、１０、１３、または１５個のアミノ酸を包含し得ることを理解するであろう。他の実施形態では、断片は、少なくとも２０個の連続するアミノ酸である。本明細書に開示される断片は、当業者に知られている方法によって生成することができ、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、生物学的活性に必要とされない新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去または代替的ｍＲＮＡスプライシングによるアミノ酸の除去または代替的タンパク質プロセシング事象）に起因し得る。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で交換可能に使用され、具体的には、抗体の結合活性を保持するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの任意の断片を指す。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の使用を含む。

いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、無傷の分子、ならびに本明細書に記載されるような所望の標的と特異的に相互作用することができる、例えば貪食細胞へ結合できるＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖなどのその機能的断片を指す。いくつかの実施形態では、抗体断片は、以下を含む：

（１）全抗体を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と１本の重鎖の一部とをもたらすことによって生成することができる抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片である、Ｆａｂ；

（２）全抗体をペプシンで処理し、その後還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部とをもたらすことによって得ることができる抗体分子の断片である、Ｆａｂ'（１つの抗体分子あたり２つのＦａｂ'断片が得られる）；

（３）全抗体を酵素ペプシンで処理して、その後還元することなく得ることができる抗体の断片である、（Ｆａｂ'）２（Ｆ（ａｂ'）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ'断片の二量体である）；

（４）２本の鎖として発現される軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝子操作された断片である、Ｆｖ；および

（５）遺伝子融合した一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝子操作された分子である、一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）。

これらの断片の製造方法は、当該技術分野で知られている。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８を参照）

いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉまたは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現によって調製され得る。

抗体断片は、いくつかの実施形態では、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成されて、Ｆ（ａｂ'）２で示される５Ｓ断片を提供することができる。この断片は、チオール還元剤、および任意にジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用してさらに切断され、３．５ＳＦａｂ'一価断片を生成することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ'断片およびＦｃ断片が直接生成される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参考文献によって記載されており、これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９－１２６，１９５９も参照されたい。一価の軽重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、または遺伝的技術などの抗体を切断する他の方法も、断片が、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。

Ｆｖ断片は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９－６２，１９７２に記載されるように、非共有結合的であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されるか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接合されたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接合されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、その後、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞内に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを含む単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷｈｉｔｌｏｗａｎｄＦｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：９７－１０５，１９９１、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６，１９８８、Ｐａｃｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１２７１－７７，１９９３、およびＬａｄｎｅｒｅｔａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号によって記載される。

抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって取得できる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋａｎｄＦｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６－１０，１９９１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、「ヒト化形態」の抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、「ヒト化形態の抗体」という用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）．ｓｕｂ．２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）のキメラ分子である非ヒト（例えば、マウス）抗体を指し、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。ヒト化抗体としては、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および容量を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見られない残基も含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含むであろう［Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６（１９９２）］。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれ、通常、インポート可変ドメインから取得される。ヒト化は、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによるＷｉｎｔｅｒおよびその同僚の方法［Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６（１９８８）］に従って本質的に実行することができる。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、無傷のヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーを含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である［Ｃｏｌｅｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）］。同様に、ヒトは、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。投与すると、ヒトの抗体の産生が観察され、これは、遺伝子再構成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものによく似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、および以下の科学的出版物、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８８１２－１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８４５－５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８２６（１９９６）、ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６５－９３（１９９５）に記載されている。

いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、リツキシマブである。リツキシマブは、市販されており、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の名称で販売され、ＢｉｏｇｅｎａｎｄＧｅｎｅｎｔｅｃｈＵＳＡ，Ｉｎｃ．によって共同で市販されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、第一選択療法を含む。

当業者は、「第一選択療法」という用語が、疾患に対して与えられる最初の治療を包含し得ることを理解するであろう。多くの場合、手術、その後の化学療法および放射線療法など、標準的な一連の治療の一部である。単独で使用する場合、第一選択療法は、最良の治療法として認められている。それは、病気を治さないか、重症な副作用を引き起こす場合は、代わりに他の治療法を追加または使用することができる。導入療法、一次療法、一次治療とも呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、アジュバント療法を含む。

当業者は、「アジュバント療法」という用語が、一次または初期治療に加えて与えられる治療を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、アジュバント療法は、さらなる治療の調製において、一次治療の前に与えられる追加のがん治療を含み得る。いくつかの実施形態では、アジュバント療法は、がんが再発するリスクを低下させるために、一次治療の後に与えられる追加のがん治療を含み得る。アジュバント療法としては、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法、または生物学的療法が挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、微小残存病変を低減させ、寛解を増加させ、寛解期間を増加させ、腫瘍再発速度を低減させ、該腫瘍のサイズを減少させ、該腫瘍または該がんの成長速度を減少させ、該腫瘍または該がんの転移を予防し、または該腫瘍または該がんの転移の速度を低減するか、あるいはそれらの任意の組み合わせである。

当業者は、「微小残存病変」という用語が、患者が疾患の症状または兆候を有さない場合に、治療中または治療後に患者に残る少数のがん細胞を包含し得ることを理解するであろう。

さらに、「寛解」という用語は、がんがまだ体内にある場合でも、がんの兆候および症状の減少または消失を包含し得る。いくつかの実施形態では、寛解は、部分的寛解を含み得、すべてではないが、いくつかのがんの兆候および症状が消失している。いくつかの実施形態では、寛解は完全寛解を含み、がんはまだ体内にある可能性があるが、がんのすべての兆候および症状が消失している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、初期アポトーシス細胞またはその組成物による初期治療が、がんの兆候または症状を減少させるか、またはそれらを消失させる寛解誘導療法を含み得る。

当業者は、「再発」という用語が、一定期間の改善後の疾患の再発または疾患の兆候および症状を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される方法は、無再発生存期間をもたらし、無再発生存期間は、がんの一次治療が終了した後、患者がそのがんの兆候または症状なしに生存する時間の長さを包含する。

当業者は、「転移」という用語が、がん細胞が最初に形成された場所から体の別の部分へのがん細胞の広がりを包含することを理解するであろう。転移では、がん細胞は元の（原発性）腫瘍から離れ、血液またはリンパ系を通って移動し、体の他の臓器または組織に新しい腫瘍を形成する。いくつかの実施形態では、新しい転移性腫瘍は、原発性腫瘍と同じタイプのがんである。例えば、乳がんが肺に転移した場合、肺のがん細胞は乳がん細胞であり、肺がん細胞ではない。

悪性腫瘍

いくつかの実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、がんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する方法において利用され、方法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）を投与するステップを含む。本明細書に開示されるように、これらの方法は、ＣＲＳまたはサイトカインストームの発生率を阻害または減少させるために、追加の薬剤を投与することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象の生存を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、びまん性がんを有する対象の生存を増加または延長する方法であり、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与するステップを含み、方法は、対象の生存を増加させる。

いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、白血病である。別の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病である。

いくつかの実施形態では、がんは、白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、がんまたは腫瘍のサイズを低減させるか、または成長速度を低減させ、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与することを含み、方法は、がんまたは腫瘍のサイズまたは成長速度を低減させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、びまん性がんの成長速度を低減させる方法であり、初期アポトーシス細胞集団を該対象に投与するステップを含み、方法は、がんの成長速度を低減させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、固形がんまたは腫瘍のサイズを低減させるか、または成長速度を低減させる方法であり、初期アポトーシス細胞集団を対象に投与するステップを含み、方法は、固形がんまたは腫瘍のサイズを低減させるか、または成長速度を低減させる。

いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍を含み得る。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な塊を含む。固形腫瘍は、良性（がんではない）、または悪性（がん）であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫、がん腫、およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般的に固形腫瘍を形成しない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肉腫またはがん腫を含む。

いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、血液、骨髄またはリンパ細胞以外の体組織細胞の異常な成長によって形成される新生物（細胞の新たな成長）または病変（解剖学的構造の損傷または生理学的機能の障害）である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肝臓、結腸、乳房、または肺などの異なる組織タイプに由来する可能性があり、最初はその細胞起源の器官で成長する異常な細胞塊からなる。しかしながら、そのようながんは、疾患の進行した段階での転移性腫瘍の成長を通じて他の器官に広がる可能性がある。

いくつかの実施形態では、固形腫瘍の例は、肉腫、がん腫、およびリンパ腫を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肉腫またはがん腫を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、腹腔内腫瘍である。

いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、肺がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頸がん、頭頸部がん、膀胱がん、肝臓がん、および皮膚がんを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がんまたは腫瘍、乳がんまたは腫瘍、卵巣がんまたは腫瘍、前立腺がんまたは腫瘍、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんまたは腫瘍、子宮がんまたは腫瘍、精巣がんまたは腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経鞘腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫を含む。

いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、副腎皮質腫瘍（腺腫およびがん腫）、がん腫、結腸直腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、肝芽細胞腫、肝細胞がん、メラノーマ、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫以外の軟部肉腫、およびウィルムス腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、乳腺腫瘍である。別の実施形態では、固形腫瘍は、前立腺がんである。別の実施形態では、固形腫瘍は、結腸がんである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、脳腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、膵腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、直腸結腸腫瘍である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される初期アポトーシス細胞またはその組成物は、がんまたは腫瘍、例えば肉腫およびがん腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、ナイル管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経鞘腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）に対して治療的および／または予防的有効性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当該技術分野で知られている任意の固形腫瘍を治療、予防、成長を阻害、発生率を低減するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、本明細書にて開示されるような、または当該技術分野で知られている任意の固形腫瘍に罹患している対象の生存を増加させるために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、本明細書にて開示されるような、または当該技術分野で知られている任意の固形腫瘍のサイズを低減させるかまたは成長速度を低減させるために使用され得る。

いくつかの実施形態では、がんは、びまん性がんであり得、がんは広範にわたって転移し、局所化または制限されない。いくつかの実施形態では、びまん性がんは、非固形腫瘍を含み得る。びまん性がんの例としては、白血病が挙げられる。白血病は、骨髄などの造血組織で発生し、多数の異常な血球細胞が生成され、血流に入るがんを含む。

いくつかの実施形態では、びまん性がんは、Ｂ細胞悪性腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、びまん性がんは、白血病を含む。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。

いくつかの実施形態では、びまん性がんまたは腫瘍は、血液腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、血液腫瘍は、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を与えるがんのタイプである。血液腫瘍は、骨髄性細胞株とリンパ性細胞株の２つの主要な血球細胞系統のいずれかに由来する可能性がある。骨髄性細胞株は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、および肥満細胞を産生するが、リンパ系細胞株はＢ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する。リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫）、リンパ性白血病、および骨髄腫はリンパ系に由来するが、急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患は骨髄由来である。

いくつかの実施形態では、非固形（びまん性）がんまたは腫瘍は、造血器悪性腫瘍、血球細胞がん、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、多発性骨髄腫（形質細胞骨髄腫）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄腫性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または形質細胞性白血病を含む。

別の実施形態では、本明細書に開示されるような初期アポトーシス細胞およびその組成物は、例えば、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病に限定されない、びまん性がんに対して、治療的および／または予防的有効性を有する。

本明細書に開示される組成物および方法は、当該技術分野で知られている任意の血液腫瘍を治療、予防、阻害、改善、発生率を低減、または緩和するために使用され得る。

当業者は、全体を含むという用語の使用が、特定の実施形態では、本質的にからなる、またはからなるという用語の使用によって置き換えられ得ることを理解するであろう。当業者は、「含んでいる」という用語は、システムが列挙された要素を含むが、任意である可能性がある他の要素を除外しないことを意味することを意図していることを理解するであろう。例えば、初期アポトーシス細胞を含むが、この細胞集団に限定されない組成物。さらに、「本質的にからなる」という用語は、列挙された要素、例えば本質的または初期アポトーシス細胞からなる組成物を含むが、方法の性能に本質的に有意な影響を与え得る他の要素を除外する方法を包含し得る。したがって、そのような組成物は、がんの治療において本質的な活性を含まない、医薬的に許容される賦形剤を依然として含み得る。さらに、「からなる」とは、他の要素の痕跡以上のものを除外することを含む。したがって、初期アポトーシス細胞からなるそのような組成物は、本明細書に開示されるような他の要素の痕跡以上を含まないであろう。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載される様々な治療的および予防的目的のための本明細書に記載される組成物の使用、あるいは、薬剤または治療用組成物または本明細書に記載されるような様々な治療的および予防的目的のための組成物の調製における本明細書に記載される組成物の使用として表され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、様々な構成要素またはステップを含む。しかしながら、別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、本質的に様々な構成要素またはステップからなり、他の構成要素またはステップが含まれ得る。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、様々な構成要素またはステップからなる。

いくつかの実施形態では、「を含む」という用語は、当該技術分野で知られている可能性のある組成物の有効性に影響を与える組成物の他の構成要素の包含を包含し得る。いくつかの実施形態では、「本質的にからなる」という用語は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）、およびアポトーシス細胞または任意のアポトーシス細胞上清を有する組成物を含む。しかしながら、組成物の有用性に直接関与しない他の構成要素が含まれ得る。いくつかの実施形態では、「構成する」という用語は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲＴ細胞）、および本明細書に開示される任意の形態または実施形態における、本明細書に開示されるアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を有する組成物を包含する。

当業者であれば、「約」という用語が、示された数または数の範囲から０．０００１～５％の偏差を包含し得ることを理解するであろう。さらに、「約」という用語は、示された数または数の範囲から１～１０％の偏差を包含し得る。さらに、「約」という用語は、示された数または数の範囲から最大２５％の偏差を包含し得る。

当業者であれば、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含むことを理解するであろう。例えば、「薬剤」または「少なくとも薬剤」という用語は、それらの混合物を含む複数の薬剤を含み得る。

本出願全体を通して、本明細書に開示される様々な実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能性のあるすべての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのような具体的に開示された部分範囲、同様に、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわりなく適用される。本明細書で数値範囲が示される際は常に、示された範囲内に任意の引用された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字と第２の示された数字と「の間の範囲（複数可）」、および第１の示された数字「から」第２の示された数字「までの範囲（複数可）」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１の示された数字および第２の示された数字ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。

以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、それらは、決して本開示の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１：アポトーシス細胞の産生

目的：初期アポトーシス細胞を産生すること。
方法：初期アポトーシス細胞の集団の製造方法は、国際公開第ＷＯ２０１４／０８７４０８号および米国出願公開第ＵＳ２０１５／０２７５１７５－Ａ１号に十分に記述され、例えば、「ＥａｒｌｙａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」および「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓ」（パラグラフ［０２２３］～［０２８８］）での実施例に先行する方法のセクション、ならびにそれらの全体が本明細書に組み込まれる実施例１１、１２、１３、および１４を参照されたい。

図１に提示されるフローチャートは、初期アポトーシス細胞の集団を産生するプロセス中に使用されるステップの一実施形態の概要を提供し、抗凝固剤は、アポトーシスの解凍および誘導ステップに含まれる。国際公開第ＷＯ２０１４／０８７４０８号の実施例１４および米国出願公開第ＵＳＵＳ－２０１５－０２７５１７５－Ａ１号に詳細に記載されているように、凍結時もしくはインキュベーション時、または凍結時およびインキュベーション時に抗凝固剤を添加した、初期アポトーシス細胞集団を調製した。使用される抗凝固剤は、酸性クエン酸デキストロースであり、ＮＩＨ式Ａ（ＡＣＤ式Ａ）に１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを補充し、総容積の５％のＡＣＤおよび０．５のＵ／ｍｌヘパリンの最終濃度にした。

簡単に説明すると、細胞を収集し、次いで５％の抗凝固剤クエン酸デキスト式Ａおよび１０Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＡＣＤｈｅｐ）を凍結培地に添加して凍結した。解凍し、５％のＡＣＤｈｅｐを含むアポトーシス誘導培地でインキュベーションし、最終産物の調製は、閉鎖系で行われた。

アポトーシスおよび生存率の分析、効力アッセイ、ならびに細胞集団の特性決定は、各実験で行われた。初期アポトーシス細胞産物の産生における一貫性を確立するために、アポトーシス細胞の初期のバッチの最終産物（ＦＰ）は、２～８℃で保存され、ｔ０、ｔ２４ｈ、ｔ４８ｈおよびｔ７２ｈで調べた。各時点で、アポトーシス分析、短効力アッセイ（出願のＣＤ１４＋凍結細胞）、トリパンブルー測定および細胞集団の特性決定を行った。ＦＰの細胞数を試験して、保存およびアポトーシスおよび生存率の分析中の平均細胞損失を評価した。

上記で引用される方法のセクション、および国際公開第ＷＯ２０１４／０８７４０８号の実施例１１、および米国出願公開第ＵＳＵＳ－２０１５－０２７５１７５－Ａ１号は、抗凝固剤の非存在下でのアポトーシス細胞集団の他の実施形態の調製の詳細を提供し、完全に本明細書に組み込まれる。

照射されたアポトーシス細胞の調製方法：同様の方法を使用して、不活化アポトーシス細胞集団を調製し、単核初期アポトーシス細胞集団は、非静止非アポトーシス生存細胞の減少したパーセント、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制を有する細胞の集団、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の増殖の減少を有する細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

簡潔に説明すると、濃縮単核細胞分画は、健康で適格なドナーから白血球アフェレーシス手順を介して収集された。アフェレーシスの完了後、細胞を洗浄し、５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液－式Ａ（ＡＣＤ－Ａ）および０．５Ｕ＼ｍｌのヘパリンを含む凍結培地で再懸濁した。次いで、細胞を徐々に凍結し、長期保存のために液体窒素に移した。

照射されたＡｐｏｃｅｌｌの調製のために、凍結保存された細胞を解凍し、洗浄し、５％のＡＣＤ－Ａ、０．５Ｕ＼ｍｌのヘパリンナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘導培地で再懸濁した。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２中３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を収集し、洗浄し、細胞処理システム（ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＫａｂｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してハルトマン溶液に再懸濁した。製造完了後、Ａｐｏｃｅｌｌは放射線療法ユニットＨａｄａｓｓａｈＥｉｎＫｅｒｅｍでｇカメラを使用して４０００ｃＧｙで照射された。ＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩ（ＭＢＬ、ＭＡ、ＵＳＡ）染色（それぞれ≧４０％および≧１５％）をフローサイトメーターを介して使用して決定されたＡｐｏｃｅｌｌのアポトーシスおよび生存率。ＦＣＳｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析された結果。
この照射されたＡｐｏｃｅｌｌ集団は、初期アポトーシス細胞を含むと考えられており、存在する任意の生存細胞は、細胞活性を抑制し、増殖能力を低下させるか、まったく持たない。場合によっては、Ａｐｏｃｅｌｌ集団には生存可能な非アポトーシス細胞がない。結果：

凍結およびインキュベーション（アポトーシス誘導）で抗凝固剤を含めて産生され、次いで２～８℃で保存されたＦＰの安定性を、以下の表３に示す。

誘導培地に抗凝固剤を含まずに細胞を製造した場合、細胞は２４時間安定であり、その後は不安定であった。表３に示すように、抗凝固剤を使用すると、予想外にアポトーシス細胞集団の安定性が少なくとも７２時間延長された。

表４の結果は、ＦＰの生存率が少なくとも７２時間高いままであることを示す。

表５の結果は、初期アポトーシス細胞の割合がそうであったように、アポトーシス細胞対壊死細胞のパーセントが、細胞の調製後少なくとも７２時間の長期間にわたって維持されたことを示す。

凍結時およびアポトーシスの誘導中の両方に抗凝固剤を含めると、安定した初期アポトーシス細胞の最も一貫した高収量が得られた（初期アポトーシス細胞の平均収量は、６１．３±２．６％％対４８．４±５．０％、１００％収量は凍結時の細胞数に基づく）。この高収量は、２～８℃で２４時間保存した後でも維持された。

次に、凍結または解凍、あるいはその両方での抗凝固剤の含有について比較が行われ、回収率パーセント（％）および安定性が測定された。抗凝固剤は、すべての集団のアポトーシスインキュベーションミックスに含まれていた。表６は、これらの研究の結果を示す。

抗凝固剤の添加の有りなしで調製された初期アポトーシス細胞集団（細胞のバッチ）の追加の集団分析比較は、これらの結果の一貫性を示す。

抗凝固剤の存在下または非存在下での最終産物細胞の割合（収量）。上記の表３に提示される結果と同様に、表６に提示されるデータは、抗凝固剤の存在下で凍結した細胞から製造された初期アポトーシス細胞が、抗凝固剤なしで凍結した細胞と比較して、新鮮な最終産物（ＦＰｔ０）の平均収量に有益な効果をもたらしたことを示す。抗凝固剤を凍結のみ（６１．３±２．６％対４８．４±５．０％）、または凍結および解凍の両方（５６．５±５．２％対４８．４±５．０％）で使用した場合に有益な効果が見られた。解凍時のみ（４４．０±８．５％対４８．４±５．０％）に抗凝固剤を使用した場合、有益な効果はそれほど有意ではなかった。これらは高トリグリセリドではない試料であった。

凝集に対する抗凝固剤の効果。これらの３つの高トリグリセリドではない試料、または２１の追加試料では、細胞凝集は見られなかった（データは示さず）。しかしながら、抗凝固剤なしで製造された他の４１の高トリグリセリドではない試料（データは示さず）では、軽度の凝集体が１０（２４．４％）に、重度の凝集体が５（１２．２％）に見られ、したがって、抗凝固剤は、完全に細胞凝集体を回避する。

安定性に対する抗凝固剤の効果。抗凝固剤の有無にかかわらず、製造された新鮮なＦＰは、製造手順へのＡＣＤｈｅｐの添加がＦＰの安定性を損なうかどうかを決定するために、２～８℃で２４時間保管された。２４時間の保存後に細胞をサンプリングし、細胞数で収量を計算した。表３に示される長期間（最大７２時間）の結果と同様に、表６は、凍結のみ（５９．８±２．１％対４７．５±４．７％）、または結と解凍の両方（５６．４±５．３％対４７．５±４．７％）で抗凝固剤を使用した場合、有益な効果が維持および観察されたことを示す。解凍時にのみ（４２．４±６．１％対４７．５±４．７％）に抗凝固剤を添加した場合、有益な効果はそれほど有意ではなかった。これらはすべて、高トリグリセリドではない試料であった。これらの結果は、すべての処理でＦＰを２４時間保存した後の細胞損失が最小限であり、凍結および解凍の両方で抗凝固剤で処理された細胞に有意な利点があることを示す。抗凝固剤で処理された細胞の平均損失は、凍結中のみは、抗凝固剤なしの１．９±３．３％と比較して２．３±３．２％、解凍時のみは、抗凝固剤なしの１．９±３．３％と比較して３．０±４．７、細胞がＡＣＤｈｅｐで凍結および解凍された場合、抗凝固剤なしの１．９±３．３％と比較して０．２±０．４％であった。要約すると、収量に対する抗凝固剤の有益な効果は、少なくとも２４時間維持された。

ＦＰの代表的な細胞集団の特徴を、以下の表８に示す。

表８の結果は、凍結および解凍時に抗凝固剤の有無にかかわらず製造された最終産物（ＦＰ）の細胞特性を示す。バッチをサンプリングし、単核マーカーを染色し、フローサイトメトリーを介して分析して、各試料の細胞分布を決定し、抗凝固剤の添加が細胞集団に影響を与えたかどうかを調べた。表７に提示されるように、凍結または解凍時に抗凝固剤の有無にかかわらず製造された細胞集団で有意差は検出されなかった。新鮮なＦＰの平均Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋細胞）は、凍結前の６２．９±１．１％と比較して、治療間で６２．３±１．２％であり、平均Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋細胞）は、凍結前の３．１±０．８％と比較して、治療間で８．３±２．５％であり、平均ナチュラルキラー細胞集団（ＣＤ５６＋細胞）は、凍結前の１２．９±０．５％と比較して、治療間で９．５±０．７％であり、平均単球細胞集団（ＣＤ１４＋細胞）は、凍結前の１７．５±０．３％と比較して、治療間で１３．８±０．５％でしあり、平均顆粒球集団（ＣＤ１５＋細胞）は、凍結時の０．３５±０．２％と比較して、新鮮なＦＰでは０．０％であった。

初期アポトーシス集団の効力も調べた。

表９に提示される結果は、（ＬＰＳ）による刺激後の未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の寛容原性状態を強化する各最終産物の能力を決定するために行われた効力アッセイからのものである。寛容原性効果は、初期アポトーシス細胞集団との相互作用およびＬＰＳのアップレギュレーションをもたらす異なる治療後のｉＤＣでの共刺激分子ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６発現のダウンレギュレーションを評価することによって決定された。分析はＤＣｓｉｇｎ＋細胞で行われた。結果は、初期アポトーシス細胞集団との相互作用後、およびＬＰＳの添加後とＬＰＳ誘導成熟後の成熟の遅延パーセントを表す。実験では、抗凝固剤の有無にかかわらず製造された新鮮なＦＰ（ｔ０）の効力を試験した。表９に提示される結果は、抗凝固剤の有無にかかわらず製造されたアポトーシス細胞が、用量依存的様式で両方の共刺激マーカーの耐性効果を高めることを示す。

本明細書で産生された初期アポトーシス細胞は、高トリグリセリドではない試料からのものであった。安定した初期アポトーシス細胞のこの一貫した高収量は、ドナー血漿がトリグリセリドを多く含む場合でも産生された（例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／０８７４０８号の実施例１２および１３ならびに米国出願公開第ＵＳＵＳ－２０１５－０２７５１７５－Ａ１号を参照）。注入のための最終的な初期アポトーシス細胞用量の処方に使用されるＰＢＳ培地に、抗凝固剤が添加されていないことに留意されたい。

要約

この研究の目的は、安定した高収量の初期アポトーシス細胞集団を産生することであった。抗凝固剤を使用する理由は、凝集体が最初に高トリグリセリドの患者に見られたが、後に他の患者のかなりの部分に見られたということであった。ここでの懸念は、抗凝固剤の使用が細胞アポトーシスを予防したという米国特許第ＵＳ６，４８９，３１１号の開示であった。

要するに、細胞の組成、生存率、安定性、およびアポトーシスの性質への影響を最小限に抑えて、抗凝固剤が添加された場合、最終産物（収量）の収集された細胞数の少なくとも１０～２０％の有意な改善があった。この研究では、収量の最大１３％の増加が示され、制御された条件での収量の２６．８％の増加を表すが、実際のＧＭＰ条件では、最大３３％になり、単一の収集でさらに多くの細胞数の増加を生み出すことができる。この効果は、ドナーからの２回目のアフェレーシスの必要性を回避する可能性があるため、非常に重要である。

予想された影響は、軽度の凝集体の溶解であると期待されていたため、この効果は驚くべきものであった。抗凝固剤で細胞を解凍すると、凝集体の量が低減すると仮定されてきた。形成される場合、これらの凝集体は、最終的に大量の細胞損失をもたらす。抗凝固剤なしで収集および凍結された細胞は、洗浄直後の解凍時に凝集体の形成を示した。さらに、抗凝固剤なしで凍結し、抗凝固剤を含む培地で再懸濁した細胞でも、高レベルの凝集体が検出された。凍結し、抗凝固剤を含む培地で再懸濁した細胞では、凝集体は見られなかった。まとめると、凍結およびアポトーシス誘導中の抗凝固剤の添加は非常に重要であり、細胞集団における初期アポトーシスの誘導に悪影響を与えるようには見えなかったと結論付けられた。

初期アポトーシス細胞の回復は、安定性の目的で、例えば２～８℃で２４時間保存した後、さらに試験され、その間、製造条件に関係なく、平均３～４．７％の細胞損失が測定され、良好な結果が得られ、抗凝固剤を含む培地で凍結および解凍した細胞の場合（２４時間のＦＰ保存後に０．２±０．４％の細胞損失）、凍結および解凍中に抗凝固剤の添加が重要であることを示唆しているが、最終的に処方されると、初期アポトーシス細胞集団は安定している。長時間の試験では、少なくとも７２時間までこの安定性を示した。

アポトーシスおよび生存率、およびＦＰ産物の細胞組成物は、凍結および／または解凍段階での抗凝固剤の添加によって有意な影響を受けなかった。多種多様な特性から測定された値は類似しており、ＡＣＤｈｅｐが初期アポトーシス細胞の特性を変化させず、最終産物が≧４０％のアポトーシス細胞の許容基準を満たしたことを示す。

アポトーシス細胞の効力を試験するために使用されたアッセイは、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、貪食作用、抗原提示、サイトカイン産生などの機能を特徴とするＤＣに基づいていた。

ＨＬＡ－ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）膜分子および共刺激分子ＣＤ８６は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の寛容原性効果を検出するためのマーカーとして選択された。フローサイトメトリーを使用して、ｉＤＣでのＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６の発現の変化を、ＬＰＳによる刺激後、および抗凝固剤の有無にかかわらず製造され、ＬＰＳで刺激された初期アポトーシス細胞集団の存在下で測定した。初期アポトーシス細胞集団は、１：２、１：４および１：８のｉＤＣ：初期アポトーシス細胞集団の上昇比率でＤＣに提供された。表６に提示されるように、初期アポトーシス細胞集団は、刺激されたＤＣに対して用量依存的様式で寛容原性効果を増強し、凍結およびアポトーシス誘導の両方で抗凝固剤を用いて製造された初期アポトーシス細胞集団に対してわずかに良い結果をもたらしたことが示された。

まとめると、凍結培地とアポトーシス培地の両方に抗凝固剤を添加することは、細胞の回復を増加させ、凝集体による大量の細胞損失を回避し、かつ多くの場合、ドナーからの２回目のアフェレーシスを回避するために非常に重要であると結論付けられた。すべての細胞が検証済みＦＰの許容基準を満たしていることが示され、抗凝固剤の添加がＦＰを損なうことはないことが示された。

実施例２：インビトロサイトカインストームモデルにおけるサイトカイン放出に対するアポトーシス細胞の効果

目的：マクロファージ活性化症候群のＬＰＳ－無菌モデルで誘発されたサイトカインストームにおけるサイトカインストームマーカー（サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－９）のレベルに対するアポトーシス細胞の効果を試験する。

方法：

細胞株および培養試薬

ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ｅＣＡＣＣ、ＵＫ、アクセス番号８５０１１４２９）、ヒト子宮頸部腺がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ、番号：ＣＣＬ－２）、およびＨｅＬａ－ＣＤ１９（ＰｒｏＭａｂ、ＵＳＡ、カタログ番号ＰＭ－Ｈｅｌａ－ＣＤ１９）は、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ、ＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７－０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号３５０５０－０３８）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号１５１４０－１２２）で補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号３１８７０－０２５）で培養され、以降「完全培地」と呼ばれる。ＨｅＬａ－ＣＤ１９培地には、標準的な培養中に、選択的抗生物質として１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｐ９６２０）をさらに補充した。

すべての細胞はサブコンフルエントな状態に保たれた。Ｒａｊｉ細胞は、０．３ｘ１０^６～２ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度範囲に維持された。容器が９０％のコンフルエンスまで満たされたときに、ＨｅＬａおよびＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞を継代した。

初代単球は、献血バフィーコート（ＳｈｅｂａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）から分離された。最初に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ、カタログ番号１７－１４４０－０３）で単離した。遠心分離（８００ｘｇ、２～８℃、ブレーク０で２０分）後、ＰＢＭＣを含む中間相を新しい試験管に移し、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号ＢＥ１７－６０５Ｅ）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号ＢＥ１７－７３７Ｂ）で補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号ＢＥ１２－９１８Ｆ）（以降「洗浄培地」）で洗浄し、遠心分離（６５０ｘｇ、２～８℃、１０分）した。ペレット化した細胞を、１５ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度まで「洗浄培地」に再懸濁した。細胞は、３５ｍｍプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ、カタログ番号４３０１６５）の中央に０．９ｍｌの液滴として播種された。プレートを加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で１．５時間インキュベートし、単球を付着させた後、予熱したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号ＢＥ１７－５１６Ｆ）で３回洗浄し、他の細胞型を除去した。洗浄後、細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ、ＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７－０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号３５０５０－０３８）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号１５１４０－１２２）で補充された２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号３１８７０－０２５）で培養され、「完全培地」とも呼ばれる。

すべての細胞株は、３７℃で加湿インキュベーター中で培養し、５％ＣＯ_２を含有した。

簡単に説明すると、製造元のガイドラインに従って、標的細胞（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ－ＣＤ１９）を単独で、または単球と組み合わせて培養した。標的細胞がプレートに付着した後（６時間～一晩）、培養物をｙｘ１０^６ＡｐｏＣｅｌｌ細胞に１時間曝露し、その後、これらの細胞をＲＰＭＩの４～５回の洗浄によって洗い流した。Ａｐｏｃｅｌｌ細胞の除去は、光学顕微鏡下で視覚的に確認された。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｌ４３９１）を共培養に導入し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＰＭＩで３～５回の洗浄サイクルでＬＰＳを除去した。生存可能なＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞またはナイーブＴ細胞を、指定されたＥ／Ｔ比（複数可）で添加し、４時間インキュベートした。培地を収集するために、プレートを、２～２５℃で４分間、２５０×ｇで遠心分離し（遠心機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、細胞を沈降させた。各ウェルからの５０μｌの上清培地を新しい平底９６ウェルマイクロプレートウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ、カタログ番号３５９６）に移し、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ９６試薬を各ウェルに添加した。プレートを暗所で室温で３０分間インキュベートし、その後、ウェルあたり５０μｌの停止溶液を添加することにより反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ５０（Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４９２ｎｍで吸光度を読み取り、ＭａｇｅｌｌａｎＦ５０ソフトウェアを使用して捕捉した。データ分析およびグラフ生成は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０を使用して行われた。

サイトカイン放出の分析は、アポトーシス細胞とのインキュベーションまたはアポトーシス細胞からの上清とのインキュベーション後に、Ｌｉｍｉｎｅｘテクノロジーを使用して行われた。

結果：図４Ａから４Ｈは、マクロファージ活性化症候群のインビトロモデルでＬＰＳによって誘導されたサイトカインストームマーカーＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－９のレベルが有意に低下したことを示す。１：８のマクロファージ：アポセル比を達成するようにＡｐｏＣｅｌｌを投与すると、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、および培地に放出されたＩＬ－９（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、４Ｈ）の両方のレベルが有意に低下し、１：１６のマクロファージ：ＡｐｏＣｅｌｌ比を達成するためのＡｐｏＣｅｌｌの投与は、このモデルにおけるサイトカインＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、およびＩＬ－９の放出を実際に阻害またはほぼ阻害した。

アポトーシス細胞の添加により、マクロファージの活性化で誘導される少なくとも２０の炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの阻害をもたらし、この結果のサンプルを図４Ａ～４Ｈに示す。炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン放出の一般的機序は、ＮＦ－κＢ阻害である。

同様の条件下でのサイトカインＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２受容体）レベルの検査は、放出されたＩＬ－２Ｒレベルが炎症性サイトカインで同じように影響を受けなかったことを示したので、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの放出の阻害は、特異的であるように思われる。（図４Ｉ）。アポトーシス細胞の添加は、１：４および１：８の比率で、ＩＬ－２Ｒの放出を増加させた。さらに、図４Ｊは、アポトーシス細胞が２４時間にわたってＩＬ－２の放出に影響を与えなかったことを示す。ＩＬ－２受容体の活性化は、耐性を含む免疫系の重要な機能に不可欠な役割を果たしていると考えられる。

結論：がんおよびＣＡＲ－１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群のサイトカインストームモデルにおける初期アポトーシス細胞の添加は、有意な低減をもたらし、驚くべきことに、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１およびＩＬ－９の予防さえももたらし、一方、サイトカインＩＬ－２Ｒレベルの増加または影響はなかった。したがって、ここでの結果は、炎症誘発性サイトカインが、アポトーシス細胞とのインキュベーションによって低減されたが、ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒは初期アポトーシス細胞のインキュベーションと同じように影響を受けなかったことを示す。したがって、Ｔ細胞関連サイトカインは、ＣＡＲＴ細胞療法＋アポトーシス細胞によって影響を受けないが、自然免疫サイトカイン、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞から放出されるサイトカインは影響を受ける。

実施例３：ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性に悪影響を及ぼさないサイトカインストームに対するアポトーシス細胞の効果

目的：サイトカインストームマーカーサイトカインに対するアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞に由来する上清の効果、および腫瘍細胞に対するＣＡＲＴ細胞の有効性を試験する。

方法：

Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞

マウスにサイトカインストームを誘導すると報告されている固形腫瘍モデル（ｖａｎｄｅｒＳｔｅｇｅｎｅｔａｌ．，２０１３、同上）を利用した。このモデルでは、Ｔ細胞は特定のＥｒｂＢ二量体（Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作され、頭頸部腫瘍および卵巣がんなどの特定の固形腫瘍で高度にアップレギュレートされることがよくある。Ｔ細胞は、ＣＤ３マイクロビーズを使用して末梢血から分離されたＰＢＭＣから単離された。キメラＴ４＋受容体を含むベクターが構築され、単離されたＴ細胞に変換され、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞が得られた。本明細書で行った実験の場合、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞は、ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ（ＮＹＵＳＡ）またはＰｒｏｍａｂＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡＵＳＡ）から購入した。図５は、抗ＣＤ１２４モノクローナル抗体を使用して、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞上の４αβキメラ受容体の表面発現を検証するフローサイトメトリー曲線を示す（Ｗｉｌｋｉｅｅｔａｌ．、同上）。さらに、ＰＣＲ手順を行い、形質導入されたＴ細胞にベクターが存在することを確認した。

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ卵巣腺がん組織培養細胞は、ＣｅｌｌＢｉｏＬａｂｓ（カタログ番号ＡＫＲ－２３２）から購入した。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃはＥｒｂＢ受容体を高度に発現し、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的である（ｖａｎｄｅｒＳｔｅｇｅｎｅｔａｌ．，２０１３、同上）。これらの細胞は、さらに操作されてホタルルシフェラーゼ遺伝子を構成的に発現し、インビトロでの細胞増殖ならびにインビボでの腫瘍の成長および後退の追跡を可能にした。

アポトーシス細胞

アポトーシス細胞は、実施例１に従って調製された。

アポトーシス細胞上清

１２ウェルプレートのウェルあたり８００万個のアポトーシス細胞が播種された。２４時間後、細胞を遠心分離した（２９０ｇ、摂氏４度、１０分）。上清を収集し、使用するまで－８０度でアリコートで凍結した。異なる数の細胞を使用して上清を作製する。一部のアリコートには、濃縮上清が含まれる。

単球の単離

ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍｅ）を使用して、健康で適格なドナーから入手した末梢血＼バフィーコートから単離された。細胞は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）で１５ｘ１０^６細胞＼ｍｌの濃度にし、３５ｍｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の中央に０．９ｍｌの液滴において播種された。次いで、プレートを、５％ＣＯ_２中３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をＰＢＳ（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）で３回洗浄し、光学顕微鏡を使用して接着を測定した。次いで、細胞を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、すべてＧｉｂｃｏ製）とともにインキュベートした。

単球単離の代替方法も使用され、密度勾配遠心分離によってヘパリン化末梢血からヒト単核細胞が単離された。次いで、単離された単核細胞を、磁気ビーズ分離（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってＣＤ１４＋分画として単球を正に選択し、ＣＤ２２＋分画としてＢ細胞を正に選択し、ＣＤ１４－ＣＤ２２－分画としてＴ細胞を負に選択することによって、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞集団に分離した。純度は、単球の場合９５％超であった。

マクロファージの分化のために、接着の終わりに、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＲＰＭＩ１６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐおよび１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）とともにインキュベートした。細胞を、３日目および６日目に培地交換して、７～９日間３７℃および５％でインキュベートした。分化は、光学顕微鏡を介した形態によって決定された。

ａｐｏ＋単球からの上清

ＣＤ１４＋単球を、上記で調製したアポトーシス細胞とともに１：１６の比率で２４時間培養した。単球の数は、１２ウェルプレートのウェルあたり５０万個の細胞であり、アポトーシス細胞の数は、１２ウェルプレートのウェルあたり８００万個の細胞であった。２４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離した（２９０ｇ、摂氏４度、１０分）。上清を収集し、使用するまで－８０度でアリコートで凍結した。同様の手順は、単球：アポトーシス細胞の異なる比率で、ならびに／またはマクロファージおよび樹状細胞などの他の細胞源を使用して行うことができる。

インビトロ培養条件

初期の実験は、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃがん細胞をアポトーシス細胞またはアポトーシス上清と１時間インキュベートした後、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞（＋／－単球－マクロファージ）と４８時間共培養することによって実施した。

インビボ条件でシミュレートするために、１×１０^５ＴＨＰ－１細胞／ｍＬ（ＨＴＣＣＵＳＡ）、または単球またはマクロファージまたは樹状細胞を、７２時間２００ｎＭの（１２３．４ｎｇ／ｍｌ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに分化し、次いでＰＭＡを含まない完全培地でさらに２４時間培養する。次いで、がんまたは腫瘍細胞、例えばＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞は、分化したＴＨＰ－１細胞上に５×１０^５ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種される。がんまたは腫瘍細胞の初期の培養に続いて、４ｘ１０^５～８ｘ１０^５アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）を１～３時間培養液に添加して、免疫寛容環境を誘導する。がん細胞とＡｐｏｃｅｌｌの比率は、各細胞型に対して最適化される。洗浄後、共培養は１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで処理され、その後１ｘ１０^６Ｔ４^＋ＣＡＲＴ細胞（または、エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率グラフによって決定される量）が添加される。腫瘍細胞およびＴ４＋ＣＡＲＴ細胞の比率は、各腫瘍またはがん細胞型のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率グラフを生成するために変更される。

ＳＫＯＶ３がん細胞の細胞毒性をアッセイするために、溶解物を調製し、４８時間のインキュベーション期間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。追加の実験は、他のがん細胞型のがんまたは腫瘍細胞の細胞毒性をアッセイするために、４８時間のインキュベーション期間内の間隔で行われた。あるいは、ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）を使用する。

溶解物の調製

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞溶解物は、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ単層をＰＢＳで洗浄して、任意の残留血清を除去し、７０μｌのＣＣＬＲ溶解緩衝液ｘ１／ウェル（２４ウェルプレート用）を添加することによって調製された。ウェルの底を物理的に削ることによって、剥離がさらに強化された。１５秒間ボルテックスした後、溶解物を１２，０００ｇで２分間、４℃で遠心分離した。上清を収集し、－８０℃で保存した。

インビトロのルシフェラーゼ活性

培養中のＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性を検出するために、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５０１）を使用した。ルミノメーターリーダー（ＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ，ＦａｃｕｌｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＥｉｎＫｅｒｅｍ，ＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＪｅｒｕｓａｌｅｍ）を有するこのキットのキャリブレーションは、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１７０Ａ）によって行われた。６１２ａｇ～６１．２μｇ（１０^－２０～１０^－９モル）を使用して、検出範囲を決定し、製造元のガイドラインに従った。簡単に説明すると、２０μｌ容積中の各ルシフェラーゼ量を、黒色の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに入れた。各量は、３回に分けて行った。１００μｌのＬＡＲ（ルシフェラーゼアッセイシステムキットのルシフェリン基質）を各ウェルに添加し、１０秒間の曝露ですぐに読み取った。

ルシフェラーゼ活性を読み取るために、溶解物を氷上で解凍し、２０μｌの試料を黒色の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に入れた。各試料は、２回に分けて読み取られた。１００μｌのＬＡＲを添加し、２５分間は２．５分ごとに、その後の１０分間は４０秒ごとに、１０秒間の曝露時間で、発光を読み取った。

サイトカイン分析

ＩＬ－２、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１α、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＴＮＦ－αの初期アッセイを行った。ＩＬ－２、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１α、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、および他のサイトカインのサイトカイン放出低減をアッセイするために、上清を収集し、ＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘリーダーおよびＥＬＩＳＡアッセイを使用して、選択したサイトカインを調べた。

結果：

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃの成長

ルシフェラーゼ活性を指標として使用して、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃの成長を追跡し、今後の実験における標的ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞数を決定した。３．８ｘ１０^４～３．８ｘ１０^５ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞／ウェルを２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、ルシフェラーゼ活性を３日間毎日モニターした。１．９ｘ１０^５細胞／ウェル以上の播種された細胞数は、コンフルエンスに達し、播種の２日後にルシフェラーゼ活性で示されている成長飽和を示す（図６）。３．８ｘ１０^４～１．１ｘ１０^５ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞／ウェルは、播種の３日後も線形または対数成長相にあったことに留意されたい（図６、オレンジ、ターコイズ、紫のプロット）。陰性対照（ＬＡＲ基質を含まない３．８ｘ１０^５ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞）は、バックグラウンドレベルの読み取り値のみを表示し、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞からの生物発光読み取り値がルシフェラーゼ活性に起因することを示す。

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞に対するＴ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の検証

Ｔ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を実証するために、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃの単層を１，０００，０００（１００万）個のＴ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞のいずれかに曝露した。２４時間のインキュベーション後、Ｔ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は非形質導入Ｔ細胞対照と比較してＳＫＯＶ３－ｌｕｃ増殖を３０％減少させ（図７）、Ｔ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示した。

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞に対するスタンドアロンＴ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を、アポトーシス細胞への曝露後の活性と比較した。

アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）およびアポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）を試験して、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性に干渉するかどうかを決定した。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞をアポトーシス細胞とともに１時間インキュベートした後、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（５００，０００、５０万）またはＴ４＋非形質導入Ｔ細胞（５００，０００、５０万）を添加した（比率１：２Ｔ４^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞対アポトーシス細胞）。次いで、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／Ｔ４^＋ＣＡＲＴ細胞を４８時間共培養した。対照のＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞を、アポトーシス細胞は使用せず、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞およびハルトマン溶液（アポトーシス細胞のビヒクル）と４８時間共培養した。

結果は、４８時間のインキュベーション後、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性が非形質導入Ｔ細胞とのインキュベーションよりも優れていることを示した。同様のインキュベーションを、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を用いて行った。驚くべきことに、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清への曝露の有無にかかわらず同等であった。（図８）。

ＣＡＲ－Ｔ治療に起因するサイトカインストームの改善、低減または阻害に対するアポトーシス細胞の効果

次に、サイトカインストームを低減させるアポトーシス細胞の効果を調べた。ＩＬ－６は、サイトカインストームで放出される炎症誘発性サイトカインのプロトタイプであり（ＬｅｅＤＷｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ１２４（２）：１８８－１９５）、サイトカインストーム応答のマーカーとしてよく使用される。

培養液は、インビボのＣＡＲＴ細胞療法環境を模倣するように確立された。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞は、ヒト単球－マクロファージおよびＴ４＋ＣＡＲＴ細胞の存在下で培養された。培地で測定されたＩｌ－６の濃度は、約５００～６００ｐｇ／ｍｌであった。ＩＬ－６のこの濃度は、サイトカインストームを表す。

予期せぬことに、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞、ヒト単球－マクロファージ、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養培地で測定されたＩＬ－６レベルは、腫瘍細胞をアポトーシス細胞と１時間インキュベートした（１：２Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞対アポトーシス細胞の比率）後に、劇的に低減していた。同様に、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞、ヒト単球－マクロファージ、Ｔ４＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養培地で測定されたＩＬ－６レベルは、腫瘍細胞をアポトーシス細胞上清と１時間インキュベートした後にも、劇的に低減していた。ＩＬ－６の濃度におけるこの低減は、サイトカインストームの減少を表す（図９）。

予期せぬことに、アポトーシス細胞およびアポトーシス上清は、腫瘍細胞増殖に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を無効にせず、同時に、罹患率につながる主要なサイトカインとして記載されているＩＬ－６などの炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートすると結論付けられた。

より広範囲なサイトカインを用いた分析

実験手順では生成されないが、ヒトサイトカインストーム中に臨床設定で現れる可能性のあるより広範囲およびレベルのサイトカインへの効果をさらに評価するために、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を、上記で概略を述べたＳＫＯＶ３－ｌｕｃ培養条件に添加した。ＬＰＳの添加は、サイトカインストームレベルを指数関数的に増加させると予想される。予想通り、ＬＰＳの添加は、サイトカインストーム効果を増加させ、その結果、ＩＬ－６レベルは約３０，０００ｐｇ／ｍｌに増加した。サイトカインストーム中に高レベルで発現することが知られている他のサイトカインは、例えば、ＴＮＦ－α（２５０～３００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１０（２００～３００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ１－アルファ（４０～５０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１８（４～５ｐｇ／ｍｌ）の高いレベルを示した。図１０に示すように、アポトーシス細胞への曝露は、サイトカインストームの指数関数的状態の間でさえ、ＩＬ－６のレベルを劇的に低下させ、臨床設定で見られる可能性があり、ＣＡＲＴ細胞を使用した実験手順では常に見られるとは限らない、ほぼ正常なレベルになった。この効果は、他の炎症誘発性サイトカイン、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１０、ＩＬ１－アルファ、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１８全体で類似しており、２０～９０％の低減を示した。アポトーシス細胞の代わりにアポトーシス細胞上清を使用した場合にも、同様の結果が見られた。

ＩＬ－２およびＩＬ－２Ｒに対するアポトーシス細胞の効果

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞をＴ４＋ＣＡＲＴ細胞とともにインキュベートした後の培養上清で測定されたＩＬ－２の濃度は、１０８４ｐｇ／ｍｌであった。驚いたことに、ＳＫＯＣ３－ｌｕｃ細胞を最初にアポトーシス細胞とともにインキュベートし、次いでＴ４＋ＣＡＲＴ細胞とインキュベートすると、ＩＬ－２の濃度は、１１９０ｐｇ／ｍｌに増加した。同様に、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞をＴ４＋ＣＡＲＴ細胞とともにインキュベートした後の培養上清で測定されたＩＬ－２Ｒの濃度は、３８１７ｐｇ／ｍｌであった。驚いたことに、ＳＫＯＣ３－ｌｕｃ細胞を最初にアポトーシス細胞とともにインキュベートし、次いでＴ４＋ＣＡＲＴ細胞とインキュベートすると、ＩＬ－２Ｒの濃度は、４５８０ｐｇ／ｍｌに増加した。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ単独では、Ｉｌ－２の濃度は３．２ｐｇ／ｍｌであり、アポトーシス細胞を添加した場合の濃度は、１０．６ｐｇ／ｍｌであった。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ単独では、Ｉｌ－２Ｒの濃度は２６．３ｐｇ／ｍｌであり、アポトーシス細胞を添加した場合の濃度は、２４．７ｐｇ／ｍｌであった。

結論：

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、有意な数の患者にサイトカインストームを引き起こすことが報告されている。これらの結果は、アポトーシス細胞およびアポトーシス細胞上清が、腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性に影響を与えることなく、サイトカインストームサイトカインマーカーを驚くほど減少させたことを示す。さらに、アポトーシス細胞はサイトカインＩＬ－２を増加させると思われ、ＣＡＲＴ細胞増殖を維持または増加させることによって、ＣＡＲＴ細胞療法の期間を増加させる可能性がある。

実施例４：アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞療法を投与されたマウスにおけるサイトカインストームを予防する

目的：Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞の有効性およびサイトカインストームマーカーサイトカインのレベルを決定するために、固形腫瘍モデル（ＳＫＯＶ３卵巣腺がん）でアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のインビボ効果を試験する。

材料および方法

インビトロ試験

上記の結果を作成、培養、および分析する方法を含み、ＥｒｂＢ標的抗原を認識するＴ４＋ＣＡＲＴ細胞（本明細書では「Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞」と呼ばれる）、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、単球、マクロファージ、および様々なアッセイの使用に関連するインビトロの方法はすべて、上記の実施例１に記載されている。同じ方法が、本明細書で使用された。

インビボ試験

マウス

７～８週齢のＳＣＩＤベージュマウスおよびＮＳＧＳマウスは、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入し、Ｓｈａｒｅｔｔ研究所のＳＰＦ動物施設で飼育した。

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞（１×１０^６または２×１０^６）は、ＰＢＳ中のｉ．ｐ．または２００ｍｌのマトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中のｓ．ｃ．のいずれかによって、ＳＣＩＤベージュマウスまたはＮＳＧＳマウスに接種される。腫瘍の移植は、注射後約１４～１８日で生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認され、マウスは、Ｔ細胞投与前の同様の信号強度を持つ群に分類される。

マウスは、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞の投与の２４時間前またはＴ４＋ＣＡＲＴ細胞（１０～３０×１０^６個のＴ４＋ＣＡＲＴ細胞）の投与と同時に、３０×１０^６個のアポトーシス細胞を受ける。腫瘍の成長に続いて生物発光イメージング（ＢＬＩ）が行われ、循環サイトカインレベルはＬｕｍｉｎｅｘによって決定される。

インビボルシフェラーゼアッセイ

ホタルルシフェラーゼ活性により、腫瘍の成長を毎週モニターした。簡単に説明すると、３ｍｇのＤ－ルシフェリン（Ｅ１６０５．Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）／マウス（１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン）をイソフルラン麻酔マウスに腹腔内注射し、注射の１０分後にＩＶＩＳイメージングシステムおよびＬｉｖｅＩｍａｇｅ画像キャプチャソフトウェア（両方ともＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製、ＵＳＡ）を使用して腹側画像を取得した。

画像取得パラメータは、Ｄ－ルシフェリン注射の５分後に「自動」オプションで０．５ｘ１０^６個のＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞／マウスを受けたマウスを画像化することにより、各画像セッションに対して選択された。ビニング４、Ｆ／ｓｔｏｐ１．２、２４倍レンズを使用した２～４分の曝露用に、キャプチャパラメータを設定した。データ分析および定量化は、ＬｉｖｅＩｍａｇｅソフトウェアを使用して行われ、グラフはＭｉｃｒｏｓｏｆｔのＥｘｃｅｌプログラムを使用して生成された。

インビボ細胞毒性

Ｔ細胞のインビボ毒性を評価するために、臓器をマウスから収集し、ホルマリン固定し、組織病理学的分析を行った。

サイトカイン分析

上清および血清は、ＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘリーダーおよび／またはＥＬＩＳＡキット、サイトメトリービーズアレイ（Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造元の説明に従って分析する。例えば、分析は、炎症誘発性サイトカインについてであり得、ある場合にはＩＬ－６であるが、いくつかの実施形態では、表１および２に列挙されるかまたは当該技術分野で知られているサイトカインのいずれかが本明細書で分析され得る。

結果：

インビボでのＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍のキャリブレーション

０．５×１０^６、１×１０^６または４．５×１０^６個のＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤベージュマウスに腹腔内注射し、方法に記載されているように、腫瘍の成長を追跡するために生物発光イメージング（ＢＬＩ）を毎週行った（データは示さず）。

マウスの臨床スコア

マウスは最初の４週間は臨床症状を示さなかった。しかしながら、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ注射の２８日後、高用量（４．５ｘ１０^６、紫色の線）を受けたマウスは徐々に体重が減少し始め（図１１Ａ）、マウスの全体的な外観が悪化し、嗜眠性、異常なペーシング、および活性の一般的な損失において明らかになった。この群は、３９日目に淘汰され、腹部の剖検が行われ、腫瘍の外観およびサイズが明らかになった（図１１Ｂ）。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍は大きく、固形で、血管新生しており、白っぽい輝く様子を示した。１つの大きな腫瘍が、腹腔内の尾側または吻側の注射の側面（左）に優勢であった。この腫瘍は、腔の約２５～７５％を占め、明らかに腸を圧迫して、妨げた。腹腔内の様々な場所でも、より小さな病巣が観察された。腫瘍は腹腔内に含まれており、他の腫瘍は任意のマウスの体の他の部分にも観察されなかった。低用量（０．５ｘ１０^６）または中用量（１×１０^６）のＳＫＯＶ３－ｌｕｃを受けたマウスは、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ注射の４０日後に体重増加が止まり、徐々に体重減少が始まった。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ注射の５０日後に実験を終了した。

ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍動態

ＰＢＳを注射してＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞をコントロールし、これらのマウスは実験を通してルシフェラーゼ活性を示さなかった（図１２、左パネル）。腫瘍の検出および成長は、用量依存的であった。低用量（０．５ｘ１０^６個のＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞）は、注射２５日後（４／５動物）に腫瘍を示し始め、中用量（１×１０^６）注入は、注入１８日後（４／５動物）に腫瘍を示し、一方、高用量（４．５ｘ１０^６）では、注入１１日後の早い時期に３／５の動物に腫瘍が検出され、１８日目までにすべての動物が十分に確立された腫瘍を示した（図１２および図１３Ａ～１３Ｄ）。

ＣＡＲＴ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘導する。

腫瘍のないマウスの３つの群および腫瘍のあるマウスに（腹腔内または腫瘍に直接）、Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞の用量を増やしながら（３ｘ１０^６、１０ｘ１０^６または３０ｘ１０^６）投与する。最高用量では、腫瘍のないマウスおよび腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に抑制された行動、立毛、および可動性の低下を示し、４８時間以内に急激な体重損失とその後の死亡を伴う。少なくともヒトインターフェロンガンマおよびマウスＩＬ－６は、最高用量のＣＡＲＴ細胞を投与されたマウスの血液試料で検出可能である。異なる腫瘍抗原に向けられた高用量のＣＡＲＴ細胞を受ける動物は、体重損失または行動の変化を示さない。

アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲＴ細胞療法によって誘導されるサイトカイン放出症候群の発生率を阻害または低減する

最高用量のＣＡＲＴ細胞を投与されたマウスの１つの群に、安全で効果的な用量であることが以前に実証されている２．１０ｘ１０^８／ｋｇアポトーシス細胞が同時に投与される。ヒトＣＡＲＴ＋アポトーシス細胞を受けたマウスは、マウスＩＬ－６のレベルを有意に低下させ、体重損失を抑え、死亡率を低下させた。

実施例５：インビトロびまん性腫瘍モデルに対する併用免疫療法の効果

目的：がん細胞に対するＣＡＲＴ細胞の有効性およびサイトカインストームマーカーサイトカインのレベルを決定するために、がんが広く拡散し、局在化または限定されていないびまん性腫瘍モデルでアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞に由来する上清の効果を試験する。

方法：

ＣＤ１９＋Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞（「ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞」）

ＣＤ１９特異的ＣＡＲＴ細胞は、ＰｒｏＭａｂ（ロット番号０１２９１６）から購入した。Ｔ細胞は、ＣＡＲに対して３０％陽性であった（製造元のＦＡＣＳデータに従って－Ｆａｂ染色）。簡単に説明すると、細胞をＡｉｍＶ＋５％加熱不活化ＦＢＳに解凍し、遠心分離（３００ｇ、５分間、室温）し、ＡｉｍＶに再懸濁した。実験の６日目に、２０×１０^６個の細胞をマウスごとに静脈内注射した（７０％ＡｎｎｅｘｉｎＰＩ陰性、そのうち３０％ＣＡＲ陽性）。

ＣＤ１９を発現する組換えＨｅＬａ細胞は、細胞表面にもＣＤ１９を発現する対照細胞型として使用される。

ＣＤ１２３＋ＣＡＲＴ細胞

Ｔ４＋ＣＡＲＴ細胞はまた、ＣＤ１２３エピトープを標的とするＣＡＲ（本明細書では「ＣＤ１２３＋ＣＡＲＴ細胞」と呼ばれる）で操作される。

Ｒａｊｉ細胞、ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞、およびＣＤ１２３発現血病細胞

Ｒａｊｉ細胞Ｒａｊｉ細胞は、ＥＣＡＣＣ（カタログ番号８５０１１４２９）から購入され、日常的に完全培地（１０％Ｈ．Ｉ．ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＲＰＭＩ－１６４０）で培養され、３ｘ１０^５～３ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で維持された。実験の１日目に、０．１×１０^６個の細胞をマウスごとに静脈内注射した。

同様に、ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞は実験室で生成され、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の標的として使用される。ＣＤ１２３発現白血病細胞は、ＣＤ１２３＋ＣＡＲＴ細胞の標的として使用される。加えて、原発がん細胞は、ＣＡＲＴ細胞の標的として利用される。

ＣＤ１９発現するＨｅＬａ細胞は、当該技術分野で知られている方法を使用して調製した。細胞を当該技術分野で周知であるように培養する。

ＣＤ１２３は、血液悪性腫瘍の膜バイオマーカーおよび治療標的である。ＣＤ１２３発現白血病細胞、例えば白血病芽球および白血病幹細胞は、当該技術分野で知られているように培養されるであろう。

アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清および単球単離は、実施例１に記載されるように調製される。産生された初期アポトーシス細胞は、少なくとも５０％のＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ陽性および５％未満のＰＩ陽性細胞であった。

マクロファージは、付着によりＣＤ１４陽性細胞から生成された。

樹状細胞は、ＩＬ４およびＧＭＣＳＦの存在下で増殖されたＣＤ１４由来であった。

フローサイトメトリー。以下の抗体：ｈＣＤ１９－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１２－０１９８－４２）、ｍＩｇＧ１－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１２－０１９８－４２）、ｈＣＤ３－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１１－００３７－４２）、ｍＩｇＧ２ａ－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１１－４７２４－８２）を使用した。取得は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤを使用して行われた。

ナイーブＴ細胞。ナイーブＴ細胞は、磁気ビーズ（ＢＤ）を使用してバフィーコートから単離し、９０％ヒトＡＢ血清および１０％ＤＭＳＯで凍結保存した。解凍および注射は、ＣＡＲＴ細胞と同じであった。

インビトロ培養条件

細胞株および培養試薬

すべての細胞はサブコンフルエントな状態に保たれた。Ｒａｊｉ細胞は、０．３ｘ１０６～２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度範囲に維持された。容器が９０％のコンフルエンスまで満たされたときに、ＨｅＬａおよびＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞を継代した。

ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞（ＰｒｏＭａｂ、ＵＳＡ、カタログ番号ＦＭＣ６３）は、ＡＩＭ－Ｖ培地または凍結のいずれかで送達された。インビトロ実験用に凍結保存されたＣＡＲＴ細胞を、実験当日に３５～３８℃の浴で解凍し、直ちに予熱した、５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７－０２９）で補充されたＡＩＭＶ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号１２０５５－０９１）に浸漬した。細胞を遠心分離し（３００×ｇ、室温、５分間）、予熱したＡＩＭＶ培地に再懸濁することによって、ＤＭＳＯを除去した。ＣＤ１９－ＣＡＲ＋細胞集団の濃度と生存率は、抗ＦＬＡＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ、カタログ番号６３７３１０）染色、およびＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩ染色（ＭＥＢＣＹＴＯアポトーシスキット、ＭＢＬ、ＵＳＡ、カタログ番号４７００）によって決定され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ、ＵＳＡ）を使用して読み取られた。

ナイーブＴ細胞の単離では、ＰＢＭＣは、ＨａｄａｓｓａｈＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ（ＥｉｎＫｅｒｅｍＣａｍｐｕｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）で、ＬｅａｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓＵｎｉｔのＳＯＰに従ってＣｏｂｅＳｐｅｃｔｒａ（商標）アフェレーシス装置（ＧａｍｂｒｏＢＣＴ、ＵＳＡ）を使用して、情報に基づいて同意した適格ドナーから収集した白血球アフェレーシス分画から、またはフィコール密度勾配にロードされ、８００ｘｇ、２～８℃、２０分間遠心分離されたバフィーコート（ＳｈｅｂａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ、Ｉｓｒａｅｌ）のいずれかから抽出された。ＭａｇｎｉＳｏｒｔヒトＣＤ３陽性選択キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、カタログ番号８８０２－６８３０－７４）を製造元のガイドラインに従って使用して、陽性分画からＴ細胞を単離した。Ｔ細胞は、追加の２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｔｉｆｉｃ、ＳｏｕｔｈＡｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７－０２９）および５％ＤＭＳＯ（ＣｒｙｏＳｕｒｅ－ＤＭＳＯ、ＷＡＫ－ＣｈｅｍｉｅＭｅｄｉｃａｌＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号ＷＡＫ－ＤＭＳＯ－７０）を含む「完全培地」（上記で定義）で凍結保存し、ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞と並行して実験当日に解凍した。

ＬＤＨ細胞毒性アッセイ

安定した細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、相関的に溶解している細胞によって放出される。したがって、培地中のＬＤＨレベルを使用して細胞毒性活性を定量化することができる。ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｇ１７８０）は、培地中のＬＤＨレベルを定量化するための比色分析である。テトラゾリウム塩基質（ヨードニトロ・テトラゾリウムバイオレット、ＩＮＴ）が過剰に培地に導入され、ＬＤＨが基質を赤いホルマザン産物に変換する。形成される赤色の量は、溶解した細胞の数に正比例する。

簡単に説明すると、製造元のガイドラインに従って、標的細胞（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ－ＣＤ１９）を単独で、または単球と組み合わせて培養した。標的細胞がプレートに付着した後（６時間～一晩）、培養物をｙ×１０^６ＡｐｏＣｅｌｌ細胞に１時間曝露し、その後、これらの細胞をＲＰＭＩの４～５回の洗浄によって洗い流した。Ａｐｏｃｅｌｌ細胞の除去は、光学顕微鏡下で視覚的に確認された。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｌ４３９１）を共培養に導入し、１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＰＭＩで３～５回の洗浄サイクルでＬＰＳを除去した。生存可能なＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞またはナイーブＴ細胞を、指定されたＥ／Ｔ比（複数可）で添加し、４時間インキュベートした。培地を収集するために、プレートを、２～２５℃で４分間、２５０×ｇで遠心分離し（遠心機５８１０Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、細胞を沈降させた。各ウェルからの５０μｌの上清培地を新しい平底９６ウェルマイクロプレートウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ、カタログ番号３５９６）に移し、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ９６試薬を各ウェルに添加した。プレートを暗所で室温で３０分間インキュベートし、その後、ウェルあたり５０μｌの停止溶液を添加することにより反応を停止させた。ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ５０（Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４９２ｎｍで吸光度を読み取り、ＭａｇｅｌｌａｎＦ５０ソフトウェアを使用して捕捉した。データ分析およびグラフ生成は、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０を使用して行われた。

フローサイトメトリー細胞毒性アッセイ

ＨｅＬａ－ＣＤ１９（標的）およびＨｅＬａ（対照）細胞を、５μＭカルボキシフルオレスセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｃ１１５７）で前染色し、混合し、新しいプレートまたは単離された初代単球が装着したプレートのいずれかに播種した。標的細胞がプレートに接着した後（６時間～一晩）、培養液をｙ×１０^６ＡｐｏＣｅｌｌ細胞に１時間曝露した。プレートをＲＰＭＩで３～５回洗浄し、浮遊しているＡｐｏｃｅｌｌ細胞が洗い流されたことを視覚的に確認した。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを共培養に導入し、１時間インキュベートした後、ＲＰＭＩで３～５回の洗浄サイクルでＬＰＳを除去した。生存可能なＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞を、特定のＥ／Ｔ比（複数可）によって示されるような共培養液に添加し、４時間インキュベートした。インキュベーション後、トリプシン－ＥＤＴＡ（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ、カタログ番号０３－０５２－１Ｂ）を添加し、３７℃で４分間インキュベートすることによって、細胞を採取した。酵素活性を停止するために、２～４倍量の「完全培地」を添加した。細胞を収集し、２００×ｇ、５分間、室温で遠心分離し、１００μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号１５１４０－１２２）に再懸濁した。最初に抗ＣＤ１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、カタログ番号１２－０１９８－４２）に対して染色を行い、暗所で３０分間室温でインキュベートした。遠心分離（２９０×ｇ、１分、２～８℃）および３００μｌのＲＰＭＩに再懸濁した後、細胞を抗７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、カタログ番号００－６９９３－５０）に対して染色した。分析は７ＡＤＤ陰性細胞（生細胞）でゲートされ、生標的細胞（ＨｅＬａ－ＣＤ１９）および生対照細胞（ＨｅＬａ）が計算された。生存パーセントは、生標的細胞のパーセントを生対照細胞のパーセントで割ることによって計算された。開始細胞数および自発的標的細胞死の変動を補正するために、生存パーセントを、エフェクター細胞（ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞）なしで培養された対照細胞パーセントに対する標的細胞のパーセントの比率で割った。最後に、細胞毒性の割合は、１００％^２から補正された生存率を差し引くことによって決定された。

最初の実験は、９６ウェルプレート中５×１０^４Ｒａｊｉ細胞／ウェルから始まる、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞対標的Ｒａｊｉがん細胞の最適な比率を決定するために、４８時間のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（＋／－単球－マクロファージ）とともにＲａｊｉがん細胞をインキュベートすることによって行われる。結果に基づいてエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比プレートを作成する。

併用免疫療法実験は、Ｒａｊｉがん細胞をアポトーシス細胞またはアポトーシス上清とともに１時間インキュベートした後、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（＋／－単球－マクロファージ）と４８時間共培養することによって行われる。

インビボ条件でシミュレートするために、１×１０^５ＴＨＰ－１細胞／ｍｌを、７２時間２００ｎＭの（１２３．４ｎｇ／ｍｌ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）とともに分化し、次いでＰＭＡを含まない完全培地でさらに２４時間培養する。次いで、Ｒａｊｉがん細胞は、分化したＴＨＰ－１細胞上に５×１０^５Ｒａｊｉ細胞／ウェルで、２４ウェルプレートに播種される。

Ｒａｊｉがん細胞の初期の培養に続いて、４ｘ１０^５～８ｘ１０^５アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）を１～３時間培養液に添加して、免疫寛容環境を誘導する。がん細胞とＡｐｏｃｅｌｌの比率は、各細胞型に対して最適化される。洗浄後、共培養は、Ｅ／Ｔ比率グラフに基づいて事前に決定された数のＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞で処理される。特定の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を添加する前に、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを培地に添加する。他の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を添加する前に、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を培地に添加する。ＬＰＳまたはＩＦＮ－γの添加は、サイトカインストームレベルを指数関数的に増加させると予想される。

Ｒａｊｉがん細胞の細胞毒性をアッセイするために、溶解物を調製し、４８時間のインキュベーション期間後に、生存率を決定する。追加の実験は、Ｒａｊｉ細胞毒性をアッセイするために、４８時間のインキュベーション期間内の間隔で行われた。あるいは、ＰｒｏｍｅｇａのＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）を使用する。

同様の実験が、ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞およびＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞で実行される。

同様の実験が、ＣＤ１２３発現白血病細胞およびＣＤ１２３＋ＣＡＲＴ細胞で実行される。

サイトカイン分析

最初のサイトカインアッセイでは、培養上清中のＭＩＰ１ａ、ＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＮＦ－γ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ－αのレベルを調べる。

追加のサイトカインアッセイは、サイトカインＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＰ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲもしくはＩＬ－７、またはそれらの任意の組み合わせのレベルを調べる。

培養液は、インビボのＣＡＲＴ細胞療法環境を模倣するように確立された。ＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞は、アポトーシス細胞の有無にかかわらず、ヒト単球－マクロファージ、ＬＰＳおよびＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の存在下で培養された。

Ｒａｊｉ細胞は、単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートされ、その後に、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ）、ならびに１：８のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：８）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、１：３２のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：３２）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）、ならびに１：６４のＣＡＲＴ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲＴ＋ＡｐｏＣｅｌｌ１：６４）のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を添加した。濃度測定は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－α（ＴＮＦ－ａ）の後に行われた。

ＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＩＬ－１３、ならびに他のサイトカインのサイトカイン放出低減をアッセイするために、上清を収集し、ＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘリーダーおよびＥＬＩＳＡアッセイを使用して、選択したサイトカインを調べる。サイトカイン（マウスまたはヒト）は、ＭＡＰＩＸシステムアナライザー（ＭｅｒｅｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（ＭｅｒｅｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘ技術によって評価できる。マウスＩＬ－６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）およびＴＧＦ－β１は、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって評価された。

組織分析

骨髄および肝臓は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用して評価された。屠殺時に、肝臓および骨髄を病理組織学的分析のために収集した。組織を４％ホルマリンで室温で４８時間固定した後、ＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設に提出して処理した。骨は処理前に脱灰された。パラフィン切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＣＤ１９について染色された。

ＩＦＮ－γ効果

ＩＦＮ－γの効果は、ＳＴＡＴ１リン酸化および生物学的産物の両方によって評価される。

結果：

細胞毒性アッセイのための細胞数のキャリブレーション

インビトロモデルで使用されるＲａｊｉ細胞の数を決定するために、細胞毒性アッセイの感度限界を評価した。５ｘ１０^４～２０ｘ１０^４Ｒａｊｉ細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに４回に分けて播種した。溶解は、まだ完全に生存している細胞と比較するために、４組の１セットで行われた。溶解は瞬間的であり、遠心分離の直前に溶解溶液を添加し、部分的な細胞毒性をシミュレートした。実際、すべての細胞量は生存細胞をはるかに超える読み取り値を示し、５ｘ１０^４細胞数が最大の相対読み取り値を生成した（図１４、データの外挿）。したがって、後続の実験では、実験の設計で特に必要とされない限り、この細胞番号をデフォルトとして使用する。

ＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞に対するＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞活性の検証

ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞活性を実証するために、Ｒａｊｉがん細胞の単層を１，０００，０００（１００万）個のＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞のいずれかに曝露した。２４時間のインキュベーション後、ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性を示し、Ｒａｊｉがん細胞増殖を減少させる。

ＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞に対するスタンドアロンＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の活性を、アポトーシス細胞への曝露後の活性と比較した。

アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）およびアポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＭｏｎＳｕｐ）を試験して、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性に干渉するかどうかを決定する。ＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞をアポトーシス細胞とともに１時間インキュベートした後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（５００，０００、５０万）またはＣＤ１９＋非形質導入Ｔ細胞（５００，０００、５０万）を添加した（比率１：２ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞対アポトーシス細胞）。次いで、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を４８時間共培養する。対照のＲａｊｉＢｕｒｋｅｔｔリンパ腫細胞を、アポトーシス細胞は使用せず、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞およびハルトマン溶液（アポトーシス細胞のビヒクル）と４８時間共培養する。

結果は、４８時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性が非形質導入Ｔ細胞とのインキュベーションよりも優れていることを示している。同様のインキュベーションを、アポトーシス細胞上清を用いて行う。驚くべきことに、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清への曝露の有無にかかわらず同等である。

アポトーシス細胞の存在下または非存在下でのＣＡＲＴの同等のＥ／Ｔ比の結果では、インビトロでのＣＤ１９に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞に対するアポトーシス細胞の悪影響は見られなかった。

ＨｅＬａ白血病細胞に対するＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞活性の検証

ＨｅＬａ細胞は、特定のＣＤ１９発現細胞であり、ＣＡＲＣＤ１９^＋Ｔ細胞活性の影響を受けやすい。加えて、非接着性細胞株であるＲａｊｉ細胞とは対照的に、ＨｅＬａ細胞は、接着性である。

ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞活性を実証するために、ＨｅＬａがん細胞の単層を１，０００，０００（１００万）個のＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞のいずれかに曝露した。２４時間のインキュベーション後、ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性（図１５ＣＤ１９^＋＋ＲＰＭＩおよびＣＤ１９^＋＋ＣＡＲＴ－１９細胞）を示し、ＨｅＬａがん細胞増殖を減少させる。

ＣＤ１９^＋ＨｅＬａ細胞に対するスタンドアロンＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の活性を、アポトーシス細胞への曝露後の活性と比較した。

アポトーシス（Ａｐｏｃｅｌｌ）を試験して、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性に干渉するかどうかを決定した。ＨｅＬａ細胞をアポトーシス細胞とともに１時間インキュベートした後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（５００，０００、５０万）またはＣＤ１９＋非形質導入Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞：５００，０００、５０万）を添加した（比率１：２ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞対アポトーシス細胞）。次いで、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を４８時間共培養した。対照のＨｅＬａ細胞を、アポトーシス細胞は使用せず、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞およびＲＰＭＩ（アポトーシス細胞のビヒクル）と４８時間共培養した。ＣＤ１９^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＨｅＬａ細胞比（Ｅ／Ｔ比）は、５～２０の範囲であった（図１５）。

図１５は、４８時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性が非形質導入Ｔ細胞（ナイーブ細胞）と、または緩衝液単独でのインキュベーションよりも優れていることを示している。同様のインキュベーションを、アポトーシス細胞を用いて行った。驚くべきことに、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍活性は、アポトーシス細胞への曝露の有無にかかわらず同等であった。同様の実験は、アポトーシス細胞上清を使用して行われる。図１５は、Ａｐｏｃｅｌｌを添加した場合と添加しない場合のＣＡＲＴ－ＣＤ１９療法と同じインビトロ細胞毒性効果を示す。

アポトーシス細胞の存在下または非存在下で、ＣＤ１９＋ＨｅＬａ細胞に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞に対するアポトーシス細胞の悪影響は、同等のＥ／Ｔ比で観察されなかった。

したがって、ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞の同じインビトロ細胞毒性効果が、初期アポトーシス細胞の添加の有無にかかわらず観察された。

サイトカインＩＬ－８およびＩＬ－１３は、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の添加前後の培地で測定され、サイトカインストームと一致する濃度を示している。アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清の添加は、培地中のＩＬ－８およびＩＬ－１３濃度の低減を示している。

より広範囲なサイトカインを用いた分析

実験手順では生成されないが、ヒトサイトカインストーム中に臨床設定で現れる可能性のあるより広範囲およびレベルのサイトカインへの効果をさらに評価するために、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を、がんおよびＣＡＲ－１９の存在下で、上記で概略を述べたＲａｊｉ細胞培養条件に添加した。ＬＰＳの添加は、サイトカインストームレベルを指数関数的に増加させると予想された。アポトーシス細胞への曝露は、サイトカインのレベルを劇的に低下させる。図１６と図１７に提示される結果は、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加すると、培養培地中のＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αのサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）が大幅に増加する一方で、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－αの両方が、アポトーシス細胞の存在下で大幅に減少することを示す。サイトカイン濃度の減少は、ＣＡＲＴ細胞対アポトーシス細胞のアポトーシス細胞比に関して用量依存的である。

結論：

アポトーシス細胞は、ＣＡＲＴ細胞の臨床手順に関連するサイトカインストームのサイトカインマーカーをダウンレギュレートすることができた。重要なことに、アポトーシス細胞は、ＣＡＲＴ細胞の腫瘍活性に影響を示さなかった。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを減少させ、ＩＦＮ－γレベルおよびＣＡＲ－Ｔ細胞毒性を損なうことなくＩＦＮ－γ効果を阻害する。

実施例６：アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞療法を投与されたびまん性がんインビボモデルにおけるサイトカインストームを予防する

目的：がん細胞に対するＣＡＲＴ細胞の有効性およびサイトカインストームマーカーサイトカインのレベルを決定するために、びまん性腫瘍モデルでアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞に由来する上清のインビボ効果を試験する。

材料および方法

インビトロ試験

インビトロ研究については、実施例５に記載されている方法を参照されたい。

細胞および細胞培養

Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８５０１１４２９）は、製造元のガイドラインに従って培養された。ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞、細胞培養、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、単球単離、およびインビトロ測定は、実施例については上記の通りである。産生された初期アポトーシス細胞は、少なくとも５０％のＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ陽性および５％未満のＰＩ陽性細胞であった。

インビボ試験

マウス

７～８週齢のＳＣＩＤベージュマウスはＥｎｖｉｇｏ（旧称Ｈａｒｌａｎ）から購入した。研究機関ＩＡＣＵＣのガイドラインに従って、マウスをＳＰＦ除去動物施設で飼育した。実験の過程で、マウスを毎日モニターし、週に３回体重を測定した。後肢麻痺を示すマウスを屠殺した。屠殺後、ＦＡＣＳ分析および組織学的処理のために骨髄および肝臓を収集し、サイトカインプロファイリングのために血清を－８０℃で凍結した。インビボ実験

ＳＣＩＤベージュマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃ－ＳＣＩＤ－Ｌｙｓｔ－ｂｇ、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｓｒａｅｌ）は、ＴｈｅＡｕｔｈｏｒｉｔｙｆｏｒＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＡＡＦ）、ＴｈｅＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＪｅｒｕｓａｌｅｍ（ＥｉｎＫｅｒｅｍＣａｍｐｕｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、および続いてＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔａｎｄＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）でＳＰＦ条件で飼育された。研究は動物実験のためのＴｈｅＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、動物の苦痛は可能な限り最小限に抑えられた。

（図１８Ａ）播種性腫瘍モデルでは、７～８週の雌ＳＣＩＤベージュマウスに、マウスあたり２００μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、カタログ番号１５１４０－１２２）に懸濁した１ｘ１０^５個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した（１日目）。６日目に、関連する群のマウスに、マウスあたり２００μｌのハルトマン溶液乳酸リンゲル注射、（ＴｅｖａＭｅｄｉｃａｌ、Ｉｓｒａｅｌ、カタログ番号ＡＷＮ２３２４）中の３０×１０^６個の細胞ＡｐｏＣｅｌｌを静脈内接種した。６日目に、関連する群のマウスに、マウスあたり２００μｌのＡＩＭＶ中の１０×１０^６個の生存可能なＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞またはナイーブＴ細胞を静脈内接種した。対照マウスは、各治療に対して等量のＲＰＭＩを受けた。

マウスの臨床的適応を調べ、週に２回体重を測定し、後肢麻痺の発症時に屠殺した。骨と肝臓の病理学的試料は、ｔｈｅＡｎｉｍａｌＦａｃｉｌｉｔｙＵｎｉｔｏｆＴｈｅＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＪｅｒｕｓａｌｅｍによって調製され、Ｒａｊｉ細胞を検出するために、ヒトＣＤ２０（ＣｅｌｌＭａｒｑｕｅ、ＵＳＡ、クローンＬ２６、カタログ番号１２０Ｍ－８４）に対して、およびヒトＴ細胞を検出するためにヒトＣＤ３（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ、カタログ番号８５０６１）に対して染色された。

特定の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を添加する前に、ＬＰＳを動物対象に投与する。他の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を添加する前に、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を投与する。ＬＰＳまたはＩＦＮ－γの添加は、サイトカインストームレベルを指数関数的に増加させると予想される。

サイトカインアッセイは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＰ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５ＲもしくはＩＬ－７、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されないサイトカインのレベルを調べる。サイトカイン（マウスまたはヒト）は、ＭＡＰＩＸシステムアナライザー（ＭｅｒｅｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（ＭｅｒｅｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘ技術によって評価される。マウスＩＬ－６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）およびＴＧＦ－β１は、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって評価される。

組織分析

骨髄および肝臓は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用して評価される。屠殺時に、肝臓および骨髄を病理組織学的分析のために収集した。組織を４％ホルマリンで室温で４８時間固定した後、ＨｅｂｒｅｗＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物施設に提出して処理した。骨は処理前に脱灰された。パラフィン切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびにＣＤ１９について染色された。

ＩＦＮ－γ効果

結果：

ＣＡＲＴ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘導する

腫瘍のないマウスの３つの群および腫瘍のあるマウスに（腹腔内または腫瘍に直接）、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量を増やしながら（３×１０^６、１０×１０^６または３０×１０^６）投与する。最高用量では、腫瘍のないマウスおよび腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に抑制された行動、立毛、および可動性の低下を示し、４８時間以内に急激な体重損失とその後の死亡を伴う。ヒトインターフェロンガンマ、ならびにマウスＩＬ－６、ＩＬ－８、およびＩＬ－１３は、最高用量のＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与されたマウスの血液試料で検出可能である。異なる腫瘍抗原に向けられた高用量のＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を受ける動物は、体重損失または行動の変化を示さない。

最高用量のＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与されたマウスの１つの群に、安全で効果的な用量であることが以前に実証されている２．１０×１０^８／ｋｇアポトーシス細胞が同時に投与される。ヒトＣＤ１９＋ＣＡＲＴ＋アポトーシス細胞を受けたマウスは、少なくとも１つのマウス炎症誘発性サイトカインのレベルを有意に低下させ、体重損失を抑え、死亡率を低下させた。

ＣＡＲＴ細胞投与と組み合わせたアポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲＴ細胞抗腫瘍活性に影響を与えなかった。

図１８Ｂは、ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を投与されずＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を注射されたＳＣＩＤマウスの予想死亡は、１８～２１日であったことを示す。ＣＤ１９^＋ＣＡＲＴ細胞を投与されたマウスの４０パーセント（４０％）は、少なくとも３０日目まで生存した（図１８一点鎖線および二点鎖線）。生存マウスの割合は、アポトーシス細胞の添加には依存しなかった（図１８）。生き残ったマウスを、３０日目に屠殺した。

結論：インビボでのＣＤ１９に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞のアポトーシス細胞の同等の生存および悪影響はなかった。

ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０１）が報告された。ＩＦＮ－γはダウンレギュレートされなかったが、マクロファージおよび樹状細胞に対するその効果は、リン酸化ＳＴＡＴ１のレベルと、ＩＦＮ－γによって誘導されるＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９の発現との両方で阻害された。

結論：

アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを減少させ、ＩＦＮ－γレベルおよびＣＡＲ－Ｔ細胞毒性を損なうことなくＩＦＮ－γ効果を阻害する。

実施例７：アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲＴ細胞療法を投与された固形腫瘍がんのインビボモデルにおけるサイトカインストームを予防する

目的：がん細胞に対するＣＡＲＴ細胞の有効性およびサイトカインストームマーカーサイトカインのレベルを決定するために、固形腫瘍モデルでアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞に由来する上清のインビボ効果を試験する。

材料および方法

インビトロ試験

細胞および細胞培養

ＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞、ＴＭＣＤ２８を含む第２世代ＣＡＲ－Ｔ－ＣＤ１９細胞を使用し、細胞培養、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、単球単離、およびインビトロ測定は、実施例２および４および６については上記の通りである。産生された初期アポトーシス細胞は、実施例１に詳細に記載されているように、少なくとも５０％のＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ陽性および５％未満のＰＩ陽性細胞であった。

インビボ試験

マウス

固形腹腔内腫瘍を形成するために、ＳＣＩＤベージュマウスまたはＮＳＧＳマウスに、腹膜に付着する可能性があるＣＤ１９発現Ｈｅｌａ細胞を接種した。Ｔ細胞投与前にマウスを群に分類した。

静脈内接種の６日後、５日目のアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）プレコンディショニングの有無にかかわらず、マウスに１０ｘ１０^６個のＣＤ１９＋ＣＡＲＴ細胞を投与した。プレコンディショニングを受けたマウスは、５×１０^６または３０×１０^６個のＡｐｏＣｅｌｌを投与された。腫瘍は毎週調査され、循環サイトカインレベルは毎週モニターされ、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムによって決定された。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用して、２５個のマウスサイトカインおよび３２個のヒトサイトカインを評価した。実験の終了時に、マウスを淘汰し、臓器（骨髄、肝臓、および脾臓）を（ＦＡＣＳおよび免疫組織化学によって）腫瘍の存在／サイズについて調べた。

サイトカインアッセイは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１β、ＩＦＮα、およびＩＰ－１０を含むがこれらに限定されないサイトカインのレベルを調べた。サイトカイン（マウスまたはヒト）は、ＭＡＰＩＸシステムアナライザー（ＭｅｒｅｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（ＭｅｒｅｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＬｕｍｉｎｅｘ技術によって評価された。マウスＩＬ－６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）およびＴＧＦ－β１は、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって評価された。

組織分析

骨髄および肝臓は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用して評価される。

ＩＦＮ－γ効果

ＩＦＮ－γの効果は、ＳＴＡＴ１リン酸化および生物学的産物の両方によって評価された。

結果：

ＣＡＲＴ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘導する

腫瘍のないマウスの３つの群および腫瘍のあるマウスに（腹腔内または腫瘍に直接）、ＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量を増やしながら（３ｘ１０^６、１０ｘ１０^６または３０ｘ１０^６）投与した。最高用量では、腫瘍のないマウスおよび腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に抑制された行動、立毛、および可動性の低下を示し、４８時間以内に急激な体重損失とその後の死亡を伴う。

図１９Ａ～１９Ｃは、ＣＡＲＴ細胞が存在する前でさえ、ＩＬ－６、ＩＰ－１０、さらには驚くべきことに腫瘍からのＴＮＦ－αサイトカイン放出のレベルの増加をグラフで示す。図１９Ａ～１９Ｃは、ＣＡＲＴ細胞療法を行わなくても、がん細胞の存在によって予期せずＩＬ－６、ＩＰ－１０、およびＴＮＦ－αが増加したことを示す。ＣＡＲＴ細胞（Ｈｅｌａ－ＣＡＲＴ－細胞ＣＤ－１９）の存在下では、サイトカインの放出が大幅に増加した。これらの結果は、腫瘍自体が炎症誘発性サイトカインを放出することを示す。

初期アポトーシス細胞の添加の利点を評価するために、サイトカインＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１β、ＩＦＮα、およびＩＰ－１０を３つの実験で測定したところ、マクロファージ関連サイトカインは、ＡｐｏＣｅｌｌ投与の存在下でダウンレギュレートされたが、Ｔ細胞関連サイトカインレベルは有意に変化しなかった（表１０）。

表１０は、ＣＡＲＴ細胞投与＋／－ＡｐｏＣｅｌｌの２４時間後のサイトカイン測定を示す。ＣＡＲＴ細胞療法から生じる細胞毒性は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１β、およびＩＰ－１０を含むサイトカインを上昇させ、そのレベルは、ＡｐｏＣｅｌｌの存在下で有意にダウンレギュレートされた（ｐ＜０．０５－０．０００１）。これらのサイトカインは主にマクロファージに関連している。対照的に、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、およびＩＬ１５などのＴ細胞に関連するサイトカインのレベルは有意に変化しなかった。

図１９Ａ～Ｃおよび表１０に提示される結果は、がんおよびＣＡＲとの関連でのＣＲＳは、いくつかの要素、サイトカインを分泌することができる腫瘍、腫瘍、ＣＡＲ、その他の要因に反応する自然免疫、および自然免疫に影響を与える死を引き起こすサイトカインを分泌するＣＡＲＴ細胞を有することを示す。ＡｐｏＣｅｌｌは、Ｔ細胞やＣＡＲＴ細胞と相互作用することなく、これらのマクロファージ、単球、樹状細胞の応答をダウンレギュレートするために、主にマクロファージ、単球、樹状細胞などの自然免疫と相互作用する。

異なる腫瘍抗原に向けられた高用量のＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を受けた動物は、体重損失または行動の変化を示さない。

最高用量のＣＤ１９＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与されたマウスの１つの群に、安全で効果的な用量であることが以前に実証されている２．１０×１０^８／ｋｇアポトーシス細胞が同時に投与された。アポトーシス細胞は、ＣＤ１９に対して特異性を有するＣＡＲ改変Ｔ細胞に対して、インビトロまたはインビボで悪影響はなかった。インビトロでのアポトーシス細胞の存在／非存在下でのＣＡＲＴ細胞の同等のＥ／Ｔ比率、およびインビボでの同等の生存曲線があった（データは示さず）。

ヒトＣＤ１９＋ＣＡＲＴ＋アポトーシス細胞を受けたマウスは、少なくとも１つのマウス炎症誘発性サイトカインのレベルを有意に低下させ、体重損失を抑え、死亡率を低下させる。

アポトーシス細胞の存在下または非存在下、およびインビボでの同等の生存曲線でのＣＡＲＴの同等のＥ／Ｔ比の結果では、インビボでのＣＤ１９に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞に対するアポトーシス細胞の悪影響は見られなかった。

ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０１）が報告された（データは示さず）。ＩＦＮ－γはダウンレギュレートされなかったが、マクロファージおよび樹状細胞に対するその効果は、リン酸化ＳＴＡＴ１のレベルと、ＩＦＮ－γによって誘導されるＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９の発現との両方で阻害された（データは示さず）。

結論：

ＣＲＳは、腫瘍生物学、単球／マクロファージ／樹状細胞との相互作用、およびＣＡＲＴ細胞の効果と拡大への応答を含むいくつかの要因から進化する。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを減少させ、ＩＦＮ－γレベルまたはＣＡＲ－Ｔ細胞毒性を損なうことなく、単球／マクロファージ／樹状細胞に対するＩＦＮ－ｇ効果を阻害する。したがって、アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを減少させ、ＩＦＮ－γレベルおよびＣＡＲ－Ｔ細胞毒性を損なうことなくＩＦＮ－γ効果を阻害する。これらの結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を使用した臨床研究におけるＣＲＳの予防のためのＡｐｏｃｅｌｌの安全な使用を支持する。

実施例８：アポトーシス細胞は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をダウンレギュレートし、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を増加させる

目的：サイトカインおよびＣＡＲＴ細胞の細胞毒性に対する初期アポトーシス細胞の影響を長期間にわたって試験すること。ＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞のインビボでの有効性を実証すること。初期アポトーシス細胞およびＣＤ１９－ＣＡＲＴ細胞の相乗効果を実証すること。

方法：ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞（ＰｒｏＭａｂ）は、単独で、またはマウスでのインビトロおよび腹腔内実験のためにヒトマクロファージとの共培養後に使用された。Ｒａｊｉは、白血病誘導のためにインビボで使用された。ＬＰＳおよびＩＦＮ－ｇを使用して、追加のサイトカイン放出を引き起こした。ＣＤ１９を含む細胞に対する抗腫瘍効果のために、第２世代のＣＤ２８を含むＣＤ１９特異的ＣＡＲ改変細胞（ＰｒｏＭａｂまたはレトロネクチン製造プロトコルまたはポリブレン製造プロトコルを使用して製造）を使用した。細胞毒性アッセイをインビボ（７－ＡＡＤフローサイトメトリー）およびインビトロ（生存曲線、骨髄および肝臓の腫瘍負荷、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学）で調べた。ＣＲＳは自発的に、またはＬＰＳおよびＩＦＮ－ｇに応答して発生した。マウスＩＬ－１０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＰ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮ－ａ、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－７、および３２個のヒトサイトカインを評価した（Ｌｕｍｉｎｅｘｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＭＡＰＩＸシステム、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸＡｎａｌｙｓｔ、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）。マウスＩＬ－６Ｒａ、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、およびＴＧＦ－β１を評価した（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ））。ＩＦＮ－γ効果を評価した（ＳＴＡＴ１リン酸化、生物学的製剤）。ヒトマクロファージおよび樹状細胞は単球から生成された。初期のアポトーシス細胞は、一般に、上記の実施例１に提示されるように産生された。細胞の≧４０％は、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性、≦１５％はＰＩ陽性であった。

マウス：ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（雌、７～８週齢）に、実験の１日目と２日目に、０．２５×１０^６ＨｅＬａ－ＣＤ１９細胞を２回連続して腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。９日目にマウスは、１０×１０^６４０００－ｒａｄ（ｃＧｙ）照射されたＡｐｏＣｅｌｌの用量を腹腔内に受け（細胞処理システムを使用して）、次の日に、０．５×１０^６ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞または２．２×１０^６ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞のいずれかを含む１０×１０^６ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団の用量を腹腔内に受けた。対照として、マウスは、１０×１０^６活性化単核細胞またはモックＴ細胞を受けた。ＩＡＣＵＣ研究所のガイドラインに従って、マウスをＳＰＦ動物施設で飼育した。マウスの体重を週に２回測定し、臨床症状および腹膜炎について毎日モニターした。エンドポイントは、腹部の肥大および緊張、嗜眠、可動性の低下、または呼吸努力の増加として現れる重症の腹膜炎として定義した。カプラン・マイヤー法に従って生存分析を実施した。

結果：ＩＬ－６、ＩＰ－１０、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意なダウンレギュレーション（ｐ＜０．０１）が報告された（データは示さず）。ＩＦＮ－ｇはダウンレギュレートされなかったが、マクロファージおよび樹状細胞に対するその効果は、リン酸化ＳＴＡＴ１のレベルで阻害された（データは示さず）。マクロファージにおけるＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９のＩＦＮ－γ誘導発現は、低減した（データは示さず）。

０．５×１０^６ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞を使用した実験では、１７日目および２１日目に群あたり２匹のマウスを屠殺した。ＨｅＬａ－ＣＤ１９で治療したマウスは、腹膜への血液の蓄積、脾臓の肥大、腫瘍遺伝子座として現れる腹膜炎を示した（データは示さず）。対照ＭＮＣで治療したマウスは、腹膜の血液が少し少なく、腫瘍遺伝子座が少なかった。ＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＴおよびＡｐｏｃｅｌｌで治療したマウスには、腹膜炎の兆候はなかった。この観察結果は、図２０Ａに提示される生存曲線と相関していた。

２．２×１０^６個のＣＡＲ－Ｔ陽性細胞を使用した実験では、４分の１のＣＡＲＴ細胞で見られたのと同じパターンの効果が観察された（図２０Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ治療は、腹膜ＨｅＬａ－ＣＤ１９を有するマウスの生存を延長した（ｐ＝０．０００２）。この実験では、おそらく注入されたＣＡＲＴ細胞の数が多かったため（２．２対０．５×１０^６ＣＡＲ－Ｔ陽性細胞）、この効果はより有意であった。より有意で長期的な効果を有する場合でも、初期アポトーシス細胞は相乗効果および長期生存を有した（ｐ＝０．００３２）。ＣＡＲＴのＥ／Ｔ比は、インビトロでのアポトーシス細胞の存在／非存在下で同等であった。驚くべきことに、アポトーシス細胞の存在下で与えられたＣＡＲＴ細胞療法は、ＣＡＲ療法単独と比較して、少なくとも１２日間の有意で再現性のある追加でマウスの生存を改善した（ｐ＜０．００３２、図２０Ａおよび２０Ｂ）。

結論：ＣＡＲ－Ｔ細胞治療は、腹膜ＨｅＬａ－ＣＤ１９を有するマウスの生存を延長した。ＣＡＲ－Ｔの１日前に照射された初期アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療単独と比較して、相乗効果を示し、マウスの生存を１０日超延長した（ｐ＜０．０４４、ログランク試験）。

照射されたアポトーシス細胞注入は、ＳＣＩＤマウスのＣＤ１９を含むＨｅｌａ細胞の治療においてＣＤ１９特異的ＣＡＲＴ細胞に劇的な相乗効果をもたらした。本実施例では、実施例５および６に提示される結果と同様の結果が観察された。本実施例の照射されたアポトーシス細胞を使用することにより、実施例５および６と比較して、「移植片対白血病効果」の可能性が排除された。したがって、この驚くべき相乗効果は、提供された照射されたアポトーシス細胞を介して媒介されるように思われる。

ＣＲＳは、腫瘍生物学、単球／マクロファージ／樹状細胞との相互作用、およびＣＡＲＴ細胞の効果と拡大への応答を含むいくつかの要因から進化する。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを減少させ、ＩＦＮ－γレベルまたはＣＡＲ－Ｔ細胞毒性を損なうことなく、単球／マクロファージ／樹状細胞に対するＩＦＮ－γ効果を阻害し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を大幅に増加さる。予期せぬことに、照射されたアポトーシス細胞による治療は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を補完し、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の抗がん効果を効果的に拡大する。

実施例９：非固形腫瘍モデルに対するアポトーシス細胞治療の効果

目的：がんの生存に対するアポトーシス細胞の有効性を決定するために、がんが広く拡散し、局在化または限定されていない非固形腫瘍モデルに対するアポトーシス細胞の効果を試験すること。

方法：

Ｒａｊｉ細胞

Ｒａｊｉ細胞は、ＥＣＡＣＣ（カタログ番号８５０１１４２９）から購入され、日常的に完全培地（１０％Ｈ．Ｉ．ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＲＰＭＩ－１６４０）で培養され、３ｘ１０^５～３ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で維持された。

アポトーシス細胞は、実施例１に記載されるように調製された。産生された初期アポトーシス細胞は、少なくとも５０％のＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ陽性および５％未満のＰＩ陽性細胞であった。

非固形（びまん性）腫瘍モデル

ＳＣＩＤマウスは、実験の１日目に、１０^５個のＲａｊｉ細胞の単回静脈内注射を受けた。ＳＣＩＤマウスの対照群は、生理食塩水の単回静脈内注射を受けた。（３つのコホートが試験された。白血病はＲａｊｉ細胞を使用して２つのコホートで誘導され、１つのコホートは対照として維持された。）

固形腫瘍モデル

ＳＣＩＤマウスは、実験の１日目に、１０^５個のＲａｊｉ細胞の単回の治験薬（ＩＰ、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入を受け、対照群は、生理食塩水の単回の治験薬（ＩＰ、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注射を受ける。

アポトーシス細胞治療

予備研究では、マウスはＲａｊｉ細胞の注入の６日後に、初期アポトーシス細胞の注入を受けた。後の研究では、上記の白血病コホートの１つからのマウスは、Ｒａｊｉ細胞の注入の６日後に開始する初期アポトーシス細胞（３０×１０^６細胞）の３回の注入を受けた。

結果：

ＳＣＩＤマウスにはＴ細胞がないため、療法なしで白血病から回復する能力はない。

驚いたことに、予備研究では、図２１に示すように、Ｒａｊｉの注入から６日後のアポトーシス細胞注入（ＡＰＯ）は、アポトーシス細胞注入（ＡＰＯなし）を受けなかったマウスと比較して、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉを注射したＳＣＩＤの無腫瘍死を有意に延長した。

白血病（ＡＰＯなし）コホートでは、Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞の両方を受けたマウスの９４％と比較して、Ｒａｊｉ細胞を受けたされたマウスの７０％が寿命まで生存した（合計ｎ＝５１匹、ｐ＜０．００１）。予想通り、対照マウスの１００％が予想寿命まで生存した（図２２Ａ）。白血病コホートでは、Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞の両方を受けたマウスの４７％と比較して、Ｒａｊｉ細胞を受け、アポトーシス細胞を受けなかったマウスの９％が予想寿命を最大１２％上回って生存した（図２２Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞の両方を受けたマウスの４１％と比較して、Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞を受けたマウスは予想寿命の３０％を超えて生存しなかった（図２２Ｃ）。Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞の両方を受けたマウスの１０％と比較して、Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞を受けたマウスは完全寛解を達成しなかった（図２２Ｄ）。

結論：

アポトーシス細胞注入の投与は、白血病マウスの寿命を維持および延長し、特定の例では、初期アポトーシス細胞を投与されたマウスは完全寛解を達成した（図２および３Ａ～３Ｄ）。

実施例１０：びまん性腫瘍モデルに対するアポトーシス細胞および抗ＣＤ２０ｍＡｂの併用治療の効果

目的：本併用療法の生存に対する有効性を決定するために、がんが広く拡散し、局在化または限定されていないびまん性（非固形）腫瘍モデルに対する初期アポトーシス細胞および抗ＣＤ２０ｍＡｂの組み合わせの投与の効果を試験すること。

Ｒａｊｉ細胞、アポトーシス細胞、非固形（びまん性）腫瘍モデル、固形腫瘍モデル、およびアポトーシス細胞の治療は、上記の実施例１および９に記載されている通りであった。

抗ＣＤ２０ｍＡｂ

市販の抗ＣＤ２０ｍＡｂは、Ｒｏｃｈｅから購入された。

抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療

マウスは、５ｍｇの抗ＣＤ２０ｍＡｂの静脈内注入を受けた。

アポトーシス細胞および抗ＣＤ２０ｍＡｂの併用治療

Ｒａｊｉ細胞投与後６日目から、マウスは、各３０×１０^６個のアポトーシス細胞の静脈内注入を３回受けた。加えて、マウスは、５ｍｇの抗ＣＤ２０ｍＡｂの静脈内注入を受けた。

結果：

Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を受けたマウスの１００％は、Ｒａｊｉ細胞およびアポトーシス細胞の両方を受けたマウスの８６％と比較して、白血病マウスの予想寿命まで生存した（合計ｎ＝２８匹、ｐ＜０．０００２）（図２３Ａ）。Ｒａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を受けたマウスの２９％、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０ｍＡｂまたはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞のいずれかを受けたマウスの１００％と比較して、Ｒａｊｉ細胞を受けたマウスは、予想寿命を２４％以上超えて生存しなかった（図２３Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を受けたマウスの２９％、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０ｍＡｂを受けたマウスの５７％、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を受けたマウスの１００％と比較して、Ｒａｊｉ細胞を受けたマウスは、予想寿命を５９％以上超えて生存しなかった（図２３Ｃ）。Ｒａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を受けたマウスの２９％、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０ｍＡｂを受けたマウスの１４％、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を受けたマウスの８５％と比較して、Ｒａｊｉ細胞を受けたマウスは、予想寿命を７６％以上超えて生存しなかった（図２３Ｄ）。Ｒａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞またはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞のいずれかを受けたマウスの２９％と比較して、Ｒａｊｉ細胞またはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０ｍＡｂのいずれかを受けたマウスは、マウスの予想寿命を１００％以上超えて生存しなかった（図２３Ｅ）。

結論：

アポトーシス細胞注入は白血病マウスの寿命を延ばし、完全寛解を達成するマウスの数を増やし、抗ＣＤ２０ｍＡｂの治療効果を高めた（図２３Ａ～２３Ｅ）。

実施例１１：白血病／リンパ腫に対するＡｐｏｃｅｌｌ（初期アポトーシス細胞）の効果

目的：本明細書で提示される研究には、３つの主要な目標、（１）白血病－リンパ腫マウスモデルにおけるＡｐｏＣｅｌｌの効果を、疾患の発症、進行、およびその後の死亡に関する評価と、（２）ＡｐｏＣｅｌｌによる治療後の白血病－リンパ腫のマウスモデルにおける腫瘍細胞の分布の評価と、（３）ＳＣＩＤ－Ｂｇマウスの白血病－リンパ腫の治療におけるＡｐｏＣｅｌｌおよびリツキシマブ（ＲｔＸ）の相乗効果の可能性の評価とがあった。これらの目的を達成するための研究の一環として、Ａｐｏｃｅｌｌ投与後の白血病マウスの生存率の測定値が測定された。同様に、腫瘍細胞の分布は、Ａｐｏｃｅｌｌでの治療後に測定された。

方法：

マウス。雌ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス、７週齢（ＥＮＶＩＧＯ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）にマウスあたり０．１×１０^６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。マウスは、実験の５、８、および１１日目に、３０×１０^６個のＡｐｏＣｅｌｌの３回の静脈内投与を受けた。併用療法の場合、マウスは、Ａｐｏｃｅｌｌ投与の１．５時間後にＲｔＸ（２または５ｍｇ／ｋｇ、Ｍａｂｔｈｅｒａ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１回投与（８日目）受けた。

マウスを毎日追跡し、週に２回体重を測定した。エンドポイントは、以下の症状、対麻痺（下半身麻痺）、マウスの開始時の体重から２０％の損失、嗜眠、運動能力の低下、または呼吸努力の増加のいずれかの発症による死亡または屠殺として定義した。

カプラン・マイヤー法に従って生存分析を実施した。動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、マウスを特定病原体除去（ＳＰＦ）動物施設で飼育した。

Ｒａｊｉ細胞株。このヒトバーキットリンパ腫細胞株は、ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、カタログ番号８５０１１４２９）から購入し、完全培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ－１６４０）で日常的に培養した。

ＡｐｏＣｅｌｌ。基本的に、実施例１に記載されているように。簡潔に説明すると、濃縮単核細胞分画は、健康で適格なドナーから白血球アフェレーシスを介して収集された。アフェレーシスの完了後、細胞を洗浄し、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡｐＨ７．４、５％ヒト血清アルブミン、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液式Ａ（ＡＣＤ－Ａ）および０．５Ｕ＼ｍｌヘパリンからなる凍結培地で再懸濁した。次いで、細胞を徐々に凍結し、長期保存のために液体窒素に移した。

Ａｐｏｃｅｌｌの調製のために、凍結保存された細胞を解凍し、洗浄し、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび１０ｍＭのｈｅｐｅｓ、１０％自家血漿、５％のＡＣＤ－Ａ、０．５Ｕ＼ｍｌヘパリンナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンで補充されたＲＰＭＩ１６４０からなるアポトーシス誘導培地で再懸濁した。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２中３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を収集し、洗浄し、細胞処理システムを使用してハルトマン溶液に再懸濁した。Ａｐｏｃｅｌｌを２９０ｇ、２～８℃で１０分間遠心分離し、ハルトマン溶液に再懸濁して注射した。アポトーシスおよびＡｐｏｃｅｌｌの生存率は、ＦＣＳｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、ＡｎｎｅｘｉｎＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、医学生物学研究所、名古屋、日本）を使用して決定した。

フローサイトメトリー。マウスの脾臓、肝臓、および骨髄を屠殺したマウスから収集し（上記で定義したように、臨床兆候の悪化後）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）によってＲａｊｉ腫瘍（抗ＣＤ２０）の存在を分析した。

結果：

パートＡ：Ａｐｏｃｅｌｌは、白血病マウスの発病とその後の死亡を遅らせる

図２４は、３つの個別の実験を示すカプラン・マイヤー生存プロットである（ＲＰＭＩ群、ｎ＝１５；Ｒａｊｉ群、ｎ＝２３；Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群、ｎ＝２４）。各実験では、雌ＳＣＩＤ－Ｂｇマウス（７～８週齢）に０．１×１０^６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した対照群は、ＲＰＭＩを注射した。続いて、５、８、および１１日目に、静脈内投与（ＩＶ）によって、マウスに３０×１０^６個のＡｐｏＣｅｌｌを３回投与した。マウスを毎日追跡し、週に２回体重を測定した。エンドポイントは、以下の症状、対麻痺（下半身麻痺）、マウスの開始時の体重から２０％の損失、嗜眠、運動能力の低下、または呼吸努力の増加のいずれかの発症による死亡または屠殺として定義した。実験の詳細を表１１に示す。Ａｐｏｃｅｌｌによる有意な益な効果が見られた（ｐ＝０．００２、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験）。

個々の研究のデータを図２５Ａ～２５Ｃに示す。

上記に示したように、Ｒａｊｉ細胞の投与後に３用量のＡｐｏＣｅｌｌで治療したマウスは、疾患の進行が遅く、未治療のマウスよりも有意に遅く死亡した（ｐ＝０．００２０）。

ＡｐｏＣｅｌｌで治療した白血病マウスは、症状の発症が有意に遅れ、病気の進行が遅く、対照の未治療マウスよりも遅く死亡した。興味深いことに、Ｒａｊｉ細胞およびＡｐｏＣｅｌｌを投与されたマウスの約１０％は、この白血病／リンパ腫モデルに特徴的な予想される症状をまったく発症せず、実験が終了するまで（５３日目または６０日目）健康を維持した。

Ａｐｏｃｅｌｌは白血病マウスの腫瘍量を低減する

上記のような臨床兆候の悪化後の屠殺時に、目的の臓器、すなわち肝臓、脾臓、および骨髄が分析のために収集された。これらの標的臓器の細胞は、ヒト腫瘍細胞の存在についてフローサイトメトリーによって分析された（Ｒａｊｉ細胞はＣＤ２０に陽性である）。

以下のデータ（表１２）は、上記の３つの実験から屠殺にされたマウスの標的臓器における細胞集団の平均パーセントを示す。各実験における個々のマウスの値は、以下の表１３～１８に記載されている。

インビボ実験０１１

骨髄、脾臓、肝臓のＣＤ２０＋細胞のＦＡＣＳ分析：

ＡｐｏＣｅｌｌの３回投与を受けた１匹のマウスは、６０日目に屠殺されたときに健康であった。

肝臓、脾臓、および骨髄細胞を収集し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）によって、ヒトＣＤ２０－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２０６）、ｍＩｇＧ１－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４００１１０）の存在について分析した。

インビボ実験０１９

骨髄、脾臓、肝臓の腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析：

マウスの脾臓、肝臓、および骨髄細胞は、方法で定義されているように、臨床的悪化の後に屠殺されたマウスから収集され、ヒトＣＤ２０（ＦＩＴＣ）の存在についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）によって分析された。

脾臓、骨髄、肝臓の分析結果を以下の表１３～１５に示す。

インビボ実験０２３

フローサイトメトリーで決定した、脾臓、骨髄、肝臓でのＣＤ２０腫瘍細胞の発現（％）。マウスの脾臓、肝臓、および骨髄は、（方法で定義されているように、臨床的悪化の後に）屠殺されたマウスから収集され、ヒトＣＤ２０（ＦＩＴＣ）の存在についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）によって分析された。個々のマウスの脾臓、骨髄、肝臓の結果を以下の表１６～１８に示す。

予備的結論：結論として、マウス臓器の腫瘍分布は、生存プロットで見られる有益な効果と相関し、治療されたマウスの骨髄と肝臓で有意に減少した。

パートＢ：白血病／リンパ腫の治療におけるＡｐｏｃｅｌｌおよびリツキシマブ（ＲｔＸ）の相乗効果

次に、２つの実験で白血病マウスに対するＲｔＸおよびＡｐｏｃｅｌｌの組み合わせ効果を評価することにより、Ａｐｏｃｅｌｌ治療が白血病／リンパ腫の他の従来の治療と相乗的であるかどうかを調べた。

目的：ＲｔＸおよびＡｐｏｃｅｌｌ投与後の白血病マウスの生存率を測定し、白血病マウスの骨髄、肝臓、および脾臓の腫瘍細胞を検出する。

方法：以下の研究は、併用療法実験（Ａｐｏｃｅｌｌおよびｒｔｘ）で得られた結果の代表的な説明である。簡単に説明するとは、雌ＳＣＩＤベージュマウスに０．１×１０^６Ｒａｊｉ細胞（ｎ＝７、すべての群で）を静脈内注射した。マウスは、５日目、８日目、および１２日目に、３０×１０^６個のＡｐｏＣｅｌｌの３回の静脈内投与を受けた。８日目、Ａｐｏｃｅｌｌ注射の１．５時間後、マウスは２または５ｍｇ／ｋｇのＲｔＸの単回静脈内投与を受けた。マウスを毎日追跡し、週に２回体重を測定した。エンドポイントは、以下の症状、対麻痺（下半身麻痺）、開始時の体重から２０％の損失、嗜眠、運動能力の低下、または呼吸努力の増加の１つ以上の発症による死亡または屠殺として定義した。

結果：

図２６に示すように、Ａｐｏｃｅｌｌには、図２４に提示される結果を裏付ける有益な効果があった。リツキサン（ＲｔＸ）単独では、２ｍｇと５ｍｇの両方の投与量でのＡｐｏＣｅｌｌよりも優れた効果があったが、ＡｐｏＣｅｌｌおよびＲｉｔｕｘａｎの組み合わせは、２ｍｇ（ｐ＝０．１０４）と５ｍｇの投与量の両方で相乗効果があったが、５ｍｇで見られた相乗効果は、統計的有意性に達しなかった。マウス臓器の腫瘍分布は有益な効果と相関していた（表１９）。

実験終了－５７日目

１匹のマウス（Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ２ｍｇ／ｋｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）は、実験の終了時に無病と申告された。

１回の２ｍｇＲｔＸ用量での相乗効果は、追加の実験で測定された。この実験で明確に示されたように（図２７）、ＡｐｏｃｅｌｌとＲｔＸの相乗効果が再び有意であることが確認された（ｐ＝０．０１）。

表２０に示すように、脾臓は、腫瘍細胞によって定植されず（０．１～０．３はバックグラウンド染色を表す）、対照として使用された。対照的に、骨髄および肝臓は、腫瘍の標的であった。ＡｐｏＣｅｌｌおよびＲｔＸを別々に治療した後、骨髄および肝臓の腫瘍集団（ＣＤ２０マーカーを使用して測定したＲａｊｊｉ細胞）が減少し、２つを組み合わせて投与すると効果が高まった（Ｒａｊｉ＋ｒｔｘ（２ｍｇ／Ｋｇ）＋ＡｐｏＣｅｌｌの場合はｐ＝０．００３４（＊＊）、およびＲａｊｉ＋ｒｔｘ（５ｍｇ／Ｋｇ）＋ＡｐｏＣｅｌｌの場合は０．００３１（＊＊）（Ｔ検定））。予想通り、ＲｔＸは、白血病マウスの標的臓器における腫瘍負荷を有意に低減する。興味深いことに、Ａｐｏｃｅｌｌのみによる治療は、これらの臓器の腫瘍細胞を、従来のＲｔＸ療法による治療に匹敵するレベルまで低下させた。

結論：要約すると、生存プロット（図２４、図２６、および図２７）は、ＡｐｏｃｅｌｌおよびＲｔＸの有益な効果、およびＡｐｏｃｅｌｌおよびＲｔＸの組み合わせの相乗効果を明確に示す。注目すべきことに、従来のＲｔＸ治療をＡｐｏｃｅｌｌと組み合わせると、ＲｔＸの投与量に関係なく、生存期間が有意に増加し、２つの療法の強力な相乗効果が示された。裏付けとなる臨床的観察は、骨髄および肝臓における腫瘍細胞集団の減少であった（表１２）。

驚くべきことに、Ａｐｏｃｅｌｌの調製は、他の治療法とは無関係に、白血病マウスモデルの疾患進行および生存に非常に有益な効果をもたらした。カプラン・マイヤー分析では、マウスの１０～２０％は、生存が延長され（図２４、図２６、および図２７）、肝臓および骨髄の腫瘍細胞負荷が減少した。さらに、ＡｐｏｃｅｌｌおよびＲｔＸを組み合わせて投与した場合、顕著な相乗効果があり、疾患の発症および進行をさらに遅らせ、生存率を改善した。

実施例１２：ＧＶＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおけるプールされたアポトーシス細胞調製物の使用

以下の予備研究は、ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおける同じ注入の効果を調べた。骨髄移植（ＢＭＴ）を受けているマウスの急性ＧｖＨＤを予防するための、照射された複数ドナーの単一アポトーシス細胞注入（プールされた単核照射されたアポトーシス細胞調製物）の安全性および有効性を調べた。このモデルでは、ＢＭＴは照射されたマウスを救った（８０～１００％）。

移植片対白血病（ＧｖＬ）効果の喪失の可能性に関する疑問は、高悪性度ａＧＶＨＤを回避する可能性のあるすべての成功した治療で発生し、この効果がＧＶＨＤの重症度と相関することがわかったためである。

方法

アポトーシス細胞は、現在の実験では、調製物が４人のドナーから同時に行われたことを除いて、上記の実施例１に従って調製された。４人のドナーからの調製に続いて、細胞調製物を最後のステップ（照射前）で組み合わせ、直後に照射し、照射直後に注射した。照射は、２５Ｇｙであった。

結果：

図２８および２９に提示される２つのグラフは、生存および体重減少の両方に対する、複数の個々のドナーからのアポトーシス細胞の単回注射（点線）の明らかな効果（ｐ＜０．０１）を示す。図２８は、生存が有意に改善された単回照射された複数の個々のドナーからアポトーシス細胞で処理されたＧｖＨＤマウスモデルにおけるカプラン・マイヤー生存曲線である。図２９は、図２８の結果に続き、相関する２つの比較群の体重減少の割合である。

要約すると、複数ドナーで照射されたアポトーシス細胞の単回注入は、ＧｖＨＤのマウスモデルの平均余命を順調にかつ有意に改善した。

実施例１３：複数の個々のドナーからのアポトーシス細胞の安定性基準
この研究の目的は、複数の個々のドナーからのアポトーシス細胞の安定性基準を、非照射ＨＬＡ適合アポトーシス細胞との比較可能性研究とともに開発することである（Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄａｎｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０（１）：５８－６５、Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．（２０１５）ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄａｎｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２１（２）：Ｓ３３９－Ｓ３４０）。

アポトーシス細胞の最終産物の調製物は、各時点でサンプリングしながら、２～８℃で８、２４、４８、および６０時間保存した後、細胞数、生存率、アポトーシス表現型、および効力について評価される。アポトーシス細胞の最終産物ロットは、標準操作手順（ＳＯＰ）（実施例１、実施例５）およびバッチ記録（ＢＲ、すなわち特定の製造手順）に従って調製される。効力評価のために、初期アポトーシス細胞調製最終産物ロットの試料を、未成熟樹状細胞（時点０～２４時間）または単球（時点０～６）でのリポ多糖（ＬＰＳ）誘導性のＭＨＣ－ＩＩ発現のアップレギュレーションの阻害について試験し、ＳＯＰに従って行い、ＢＲに記録する。これらの一連の試験は、それぞれ複数の個別のドナーおよび単一のドナーに由来する調製物中のプールされた産物およびプールされていない産物に対して行われる。

加えて、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１５^高（顆粒細胞）およびＣＤ５６（ＮＫ細胞）のフローサイトメトリー解析が報告される。これらの研究の目的は、狭い範囲の結果との一貫性を実証することである。予備的な結果はこれらの目標と一致しており、ＳＯＰからの逸脱は認められず、技術的な問題は報告されていない。しかしながら、効果的な治療の範囲および安定性を結論付けるためには、さらなる研究が必要である。予備的な結果は、これらすべてのパラメータが同等であることを示す。さらに、単一ドナーの安定性研究は、少なくとも４８時間の期間を通して安定性を示した（実施例１を参照）。

実施例１４：急性移植片対宿主病の予防としての複数のドナー照射アポトーシス細胞の安全性および有効性

目的：同種異系ｈｌａ適合造血幹細胞移植を受けているヒト白血球抗原適合、関連および非関連患者の造血性悪性腫瘍における移植片対宿主病の予防のための、複数の、適合しないドナーからの照射アポトーシス細胞の単回投与の安全性、忍容性、および予備的有効性を評価するフェーズ１／２ａ、多施設、オープンラベル研究

主な目的：複数のドナーの照射されたアポトーシス細胞治療の安全性および忍容性を決定すること。

副次的目的：造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける予定の造血悪性腫瘍患者における急性ＧｖＨＤ（ａＧＶＨＤ）の予防策として、複数の個々のドナーから照射されたアポトーシス細胞の有効性を決定すること。この研究の目的のために、ＨＳＣＴは、骨髄移植（ＢＭＴ）または末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）のいずれかである可能性がある。

治療の指標：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合、関連および非関連患者の造血性悪性腫瘍における移植後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）

研究設計：これは、完全な骨髄破壊的または低強度の骨髄破壊的コンディショニングレジメンのいずれかに従って、ＨＬＡ適合関連または非関連ドナーからＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血幹細胞移植のいずれか）を受ける予定の造血性悪性腫瘍と診断された患者を対象としたオープンラベル研究、多施設、フェーズ１／２ａ研究である。

レシピエント患者によるインフォームドコンセントの署名、ドナースクリーニング期間、およびコンディショニングレジメンを開始する前の細胞収集後、適格なレシピエント患者が割り当てられる（予防的治療および関連する移植ドナーと関連しない移植ドナーによって１：１の比率で層別化され、ＨＳＣＴ移植の１２～３６時間前にいずれかに静脈内（ＩＶ）注射を受ける）：

治験アーム：リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中の照射初期アポトーシス細胞／ｋｇ体重の複数の個々のドナーから１４０ｘ１０^６±２０％の細胞／ｋｇの単回用量。

すべての患者はまた、施設内標準治療（ＳＯＣ）免疫抑制療法で治療される：完全な骨髄破壊のためのシクロスポリン／メトトレキサートまたはタクロリムス／メトトレキサートおよび強度の低下のためのミコフェノール酸／シクロスポリンまたはミコフェノール酸／タクロリムス。患者は医学的に指示された通りに入院する。

患者は、二次有効性エンドポイントについては１８０日間、一次安全性および三次有効性エンドポイントについては１年間追跡される。この研究に参加している患者の訪問数は、その状態の患者の通常の訪問数に相当する。ドナーの場合、研究の特定の訪問は、スクリーニング期間中のアフェレーシス手順のためである。

これらの患者は多くの根本的な病状を抱えており、ａＧＶＨＤと互換性のある症状を経験する可能性があるため、ＧｖＨＤ予防にアポトーシス細胞を使用した以前のフェーズ１～２ａ研究からの基本データは存在するが、毒性がアポトーシス細胞に関連するかどうかを完全に判断することは難しい場合がある（Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄａｎｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０（１）：５８－６５、ＳｉｎｇｌｅＩｎｆｕｓｉｏｎｏｆＤｏｎｏｒＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＥａｒｌｙＡｐｏｐｔｏｔｉｃＣｅｌｌｓａｓＰｒｏｐｈｙｌａｘｉｓｆｏｒＧｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ＨｏｓｔＤｉｓｅａｓｅｉｎＭｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅＨＬＡ－ＭａｔｃｈｅｄＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ＡＰｈａｓｅＩ／ＩＩａＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌ．ＢＢＭＴ２０（１）５８－６５）。

データ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）は、ＤＳＭＢ憲章に指定されている通りに会合し、事前に安全上の懸念が提起されていないことを前提として、予定された中間分析時（１８０日）も含まれる。

研究手順：

この研究は、スクリーニング、治療、およびフォローアップ期間からなる。

１．スクリーニング期間（－６０日目～－２日目）

潜在的なレシピエント患者は、任意の研究関連の手順を実施する前にインフォームドコンセントに署名する。承認前の標準的な評価は、スクリーニング期間中にドナーの移植センターによって行われ、通常、人口統計データ、病歴、ＨＬＡ一致ステータスの検証（一致は不要）、身体検査、身長と体重、バイタルサイン、妊娠検査（すべての女性）、血液学、血液化学、感染症スクリーニング、ＥＣＧおよび尿検査が含まれる。

レシピエント（研究患者）は、スクリーニング期間中に次の評価を受ける：人口統計データ、病歴、カルノフスキーのパフォーマンスステータス、ＨＬＡ一致検証、身体検査、身長と体重、バイタルサイン、妊娠検査（すべての女性）、ＥＣＧ、肺機能検査、血液学、血液化学、凝固マーカー、感染症スクリーニング、および尿検査。

最初のスクリーニング評価の後、レシピエントが研究に参加する資格がある場合、レシピエント患者は、コンディショニングレジメンの初日に、１４０ｘ１０^６±２０％細胞／ｋｇの複数のドナーアポトーシス細胞の単回静脈内注入を受けるように割り当てられる。研究１日目に予定されているアポトーシス細胞注入の前日または当日に完了するコンディショニングレジメン。

アポトーシス細胞の投与量は、レシピエント患者ごとに計算され、推定されるアフェレーシス収集数およびドナーの数がそれに応じて決定される。

末梢幹細胞移植ドナーの場合：－６日目～－１日目、ドナーは１日１回以上Ｇ－ＣＳＦを注射して前駆細胞を動員し、０日目にアフェレーシスを受けて移植用のドナー造血幹細胞を産生する。骨髄移植のための造血幹細胞の調製は、訓練を受けた病院スタッフによるセンターの標準的な慣行に従って行われる。ＨＳＣＴの造血幹細胞は、投与前に操作したり、Ｔ細胞を枯渇させたりすることはない。

骨髄移植ドナーの場合：骨髄は、センターの標準的な慣行に従って採取および調製され、他の方法で操作されることはない。

２．治療日（－１日目）

－１日目（ＨＳＣＴの１２～３６時間前）に、適格な患者は、初期アポトーシス細胞を照射した複数の個々のドナーの１４０ｘ１０^６±２０％細胞／ｋｇのいずれかの単回静脈内注入を受ける。バイタルサインは、注入中は１時間ごとに、その後の最初の２４時間は４時間ごとにモニターされる。治療に関連するＡＥは、注入直後に評価される。

０日目に、患者は地元の施設のガイドラインに従って造血幹細胞移植を受ける。

３．短期フォローアップ期間（０日目～１８０日目）

患者は、一次エンドポイントの安全性および忍容性、ならびに二次および三次エンドポイントの評価のために研究１８０日目までフォローアップされる：ａＧＶＨＤグレードＩＩ－ＩＶの累積発生率（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａらの任意のグレードの累積発生率に基づく「ｍｏｄｉｆｉｅｄＧｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」コンセンサスおよび高グレードのａＧＶＨＤ、すなわち、ａＧＶＨＤの発症までの時間、グレードＩＩ～ＩＶ、ＧＶＨＤの全身治療、およびｃＧＶＨＤの発症）。

短期のフォローアップ訪問は、移植のために入院している間は毎日（通常は少なくとも－１日から＋１４日以上）、退院後の最初の７週間（＋７、＋１４、＋２１、＋２８、＋３５、＋４２）は毎週、次いで、６０、１００、１４０および１８０日訪問する。訪問期間は、毎週の訪問（最初の７週間）ごとに±５日、その後の１８０日までのフォローアップ期間中の隔週以上の訪問の場合は±５日である。

血液試料は、１、３、７、＋７、＋２８、＋４２、６０、１００、１４０および１８０日目に採取され、移植、免疫学的回復、血漿および血清バイオマーカー（「Ｍｉｃｈｉｇａｎ」）および細胞亜集団の記録について検査される。

４．長期フォローアップ期間（１８１日目～３６５日目／１年目）

患者は、ＨＳＣＴ後１年間、非再発死亡率および全生存率（ＯＳ）、再発発生率、白血病のない生存率（ＬＦＳ）、慢性ＧＶＨＤの長期的な副次的評価項目について追跡される。少なくとも２回の長期フォローアップ訪問があり、最後の訪問はＨＳＣＴの１２±１か月後である。

研究期間：参加している各患者について、研究の期間は以下のように最大１４か月になる。
スクリーニング最大６０日（２か月）
治療１日
フォローアップ３６５日（１２か月）からなる
短期：１８０日
長期＋１８０日

研究集団：ＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血幹細胞移植のいずれか）を受ける予定の血液悪性腫瘍と診断された合計２５人の患者、少なくとも１５人の無関係なドナーが、骨髄破壊的または低強度のコンディショニングレジメンに従って、センターの標準的な診療に従ってこの研究に含まれ、過去の対照と比較される。

組み入れ／除外基準：

レシピエント患者の除外基準

１．１８歳以上の患者で、以下の悪性腫瘍に対して同種ＨＳＣＴの資格がある：
急性骨髄性または未分化または二表現型の白血病、完全寛解（任意の寛解）以上であるが、骨髄の形態による芽球が５％未満である。
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から進行した場合、完全寛解期にある急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（急性骨髄性白血病の診断の少なくとも３か月前に、ＭＤＳの診断を記録する必要がある）。または真性赤血球増加症または本態性血小板血症から進化した。
骨髄の形態により５％未満の芽球を伴う完全寛解（任意の寛解）の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）。
慢性期または加速期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
骨髄異形成症候群－多血球異形成を伴う難治性細胞減少症（ＲＣＭＤ）、ＲＡ（難治性貧血）、環状鉄芽球を伴うＲＡ（ＲＡＲＳ、すべて＜５％芽球）、過剰芽球を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ、５～２０％芽球）。

移植ドナーおよびレシピエントの患者は、ＨＬＡＡ、Ｂ、Ｃ、ＤＱおよびＤＲ遺伝子座で少なくとも８／８のＨＬＡ一致があり、抗原または対立遺伝子の不一致があってはならない。しかしながら、アポトーシス細胞形成のための白血球のドナー（複数可）は、ＨＬＡマッチングが制限されていない。

スクリーニング訪問時のパフォーマンスステータススコアが少なくとも７０％（成人の場合はカルノフスキー、１６歳未満のレシピエントの場合はランスキー）。

コンディショニング開始から４週間以内の成人の心臓左心室駆出率≧４０％、以前のアントラサイクリン曝露または心臓病の病歴がある場合は、ＭＵＧＡスキャンまたは心臓ＥＣＨＯが必要である。

ＤＬＣＯによる呼吸機能検査（一酸化炭素に対する肺の拡散能）、ＦＥＶ１（強制呼気量）およびＦＶＣ（強制肺活量）≧６０％が予測される。

室内空気で少なくとも９０％の酸素飽和度。

患者は、以下に定義する適切な臓器機能を有する必要がある。
ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）＜３×通常の上限（ＵＬＮ）。
血清クレアチニン＜２．０ｍｇ／ｄＬ（成人、＞１６歳）または＜０．８（１～２歳）、＜１（３～４歳）、＜１．２（５～９歳）、＜１．６（１０～１３歳）、および１．８（１４～１５歳）。
ジルベール病または溶血による場合を除き、血清ビリルビン＜３ｍｇ／ｄＬ。

患者、または未成年者の場合は、保護者によって署名された独自に研究に参加するための書面によるインフォームドコンセント。

研究の要件に準拠する能力。

４週間（－１日目から）、女性と男性の両方が以下に同意する必要がある：
ＢＭＴに関連する制限がある場合は、許容できる避妊方法を使用するか、最初の１か月以上は外科的に不妊を行う。
出産の可能性に関係なく、妊娠検査が陰性であること。

レシピエント患者の除外基準

組み入れ基準で指定されていないＨＳＣＴの対象となるすべての疾患。

スクリーニング訪問から３０日以内の介入的治験への参加。

進行性または制御不良の悪性腫瘍を有する。

ＢＭＴ計画にＴ細胞枯渇同種移植片が含まれている場合

ＢＭＴ計画に、免疫抑制療法の一部として抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）またはアレムツズマブが含まれている場合、または移植後のＧＶＨＤを予防するための高用量シクロホスファミド療法が含まれている場合

スクリーニング訪問から２週間以内の敗血症、低酸素血症を伴う肺炎、持続性細菌血症、または髄膜炎を含む制御不能の感染症。

ＨＢＶまたはＨＣＶによる現在知られている活動性の急性または慢性感染。

既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症。

重度または症候性の拘束性または閉塞性肺疾患または人工呼吸器のサポートを必要とする呼吸不全の患者。

研究への参加を危うくする可能性のある他の重篤および／または制御不能の病状を併発している患者（すなわち、活動性感染症、制御不能の糖尿病、制御不能の高血圧、うっ血性心不全、不安定狭心症、心室性不整脈、活動性虚血性心疾患、６か月以内の心筋梗塞、慢性肝疾患または腎疾患、活動性上部胃腸管潰瘍）。

治験薬の効果の評価を妨げる可能性のある慢性または急性の状態。

あらゆる形態の薬物乱用（薬物またはアルコール乱用を含む）、精神障害、または治験責任医師の見解では、研究の実施を妨害する可能性のある慢性状態。

臓器同種移植または幹細胞移植の既往歴（同種異系のみ）。

出産の可能性のある女性の母乳育児。

研究中に不履行または非協力的である可能性が高い患者。

治験医薬の経路および剤形

アポトーシス細胞は、ＨＳＣＴの１２～３６時間前に、１４０ｘ１０^６＋２０％細胞／ｋｇの照射された複数ドナーアポトーシス細胞産物の静脈内注入として投与される。

アポトーシス細胞は、複数の個々のドナーアポトーシス細胞からなる細胞ベースの治療法である。本産物には、同種異系ドナーの単核濃縮細胞が液体懸濁液の形で含まれており、少なくとも４０％の初期アポトーシス細胞が含まれる。懸濁液をＧＭＰ規制に従ってＰＢＳ溶液を用いて、複数の個々のドナーから調製され、注入まで２～８℃で保存すべきである。最終産物は、不透明なトランスファーパックに総量３００～６００ｍＬになり、調製後に２５Ｇｙが照射される。治験薬は、製造プロセスが完了してから４８時間以内に患者に投与されなければならない。

安全性の結果／有効性のエンドポイント／結果の測定

一次：

安全性および忍容性のエンドポイントとしては、移植までの時間、有害事象を決定するための身体検査、１８０日目と３６０日目（１年）の併用薬および安全研究所が挙げられる。さらに、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、インビトロおよびインビボの細胞増殖の欠如、ならびにインビボ活性化の欠如を示すことが予想される。このような表示は、プールされたアポトーシス細胞調製物が安全に使用できることを示す。

二次：

急性移植片対宿主病を評価するための（Ｒｏｗｌｉｎｇｓｅｔａｌ．１９９７）ＩＢＭＴＲ重症度指数に基づく「修正Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」コンセンサスを使用したａＧＶＨＤグレードＩＩ－ＩＶの累積発生率：Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇグレードとの遡及的比較。（ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ．１９９７年６月；９７（４）：８５５－６４）１８０日目
１年間の非再発死亡率および全生存期間（ＯＳ）
１年間の再発発生率
１年間の白血病のない生存（ＬＦＳ）
最初の１８０日以内のａＧＶＨＤの最大グレード
グレードＩＩＩ－ＩＶａＧＶＨＤの累積発生率
１８０日目と３６０日目（１年）の（Ｊａｇａｓｉａｅｔａｌ．，２０１５）による慢性ＧＶＨＤの発生率。
２０日目から１８０日目までのａＧｖＨＤの治療のためのコルチコステロイド（使用されているかどうかと累積投与量の両方）を含む任意の「全身治療」
Ｔ、Ｂ、ＮＫ、および単球に関連して、＋２８、１００、１８０、および３６０日（１年）の免疫再構成および機能
１８０日目および１年目までの主要な感染率（肺浸潤、ＣＭＶの再活性化、および入院を必要とするその他の感染症を含む）。

三次／探索的：

リスクのある合計日数に対する入院日数の割合、または生存して退院した合計日数。または移植後の最初の退院までの総入院日数。
臓器特異的ＧＶＨＤ
１８０日目のＴｒｅｇ、ＣＤ４Ｔｃｏｎ、ＣＤ８、ＮＫおよびＢ細胞レベル

統計分析：

研究結果は、同等のベースライン特性を持つ個人の過去の対照と比較される。

記述統計は、結果の測定値およびベースライン特性を要約するために使用される。この分析では、利用可能なすべてのデータが、欠落しているデータを代入せずに表示される。対象は、離脱または研究の完了または死亡の時点までに利用可能なデータを提供する。平均、中央値、標準偏差、最小値、最大値などの記述統計は、連続変数を要約するために使用される。アポトーシス細胞の注入を受けるすべての対象は、安全性分析に含まれる。ＨＳＣＴも受けた対象は、有効性分析に含まれる。この研究は本質的に探索的であるため、アドホック分析が計画されている。

症例数の考慮事項

合計２５人の患者が含まれ、少なくとも１５人の適合する無関係の患者が登録される。アポトーシス細胞（アクティブはすべてに与えられ、ＧｖＨＤ予防レジメンで層別化し、関連する移植ドナーと関連しない移植ドナーになる）。

集団分析の定義

すべての有効性分析は、ＩＴＴ（Ｉｎｔｅｎｔ－ｔｏ－Ｔｒｅａｔ）集団で実施され、適切な過去の対照と比較される。安全性集団は、治験薬の投与を受けるすべての患者として定義される。

統計的手法

患者、疾患、および移植の特徴は、必要に応じて頻度および割合または中央値（範囲）を使用して説明される。

安全性分析

記述統計は、治験治療注入およびＨＳＣＴ手順（２４～３０時間ウィンドウ）の間に報告されたＡＥに焦点を当てて安全性の結果を要約するために使用される。症例数の調整を含め、ＤＳＭＢレビューの結果として、研究の実施に変更が加えられることはない。そのため、中間分析の結果としてのタイプＩエラー全体のペナルティ調整は必要ない。

二次エンドポイント分析

グレードＩＩ～ＩＶのａＧＶＨＤは、競合する事象としてａＧＶＨＤの前に死亡した累積発生率推定値を使用して説明される。

好中球および血小板の回復、グレードＩＩＩ～ＩＶａＧＶＨＤ、慢性ＧＶＨＤ、感染、再発、および移植関連の死亡率は、ＴＲＭの競合事象として再発を伴う累積発生率を使用し、他のすべての競合事象として死亡を使用して説明される。．全生存率および白血病のない生存率は、カプラン・マイヤー推定量を使用して説明される。最初の１８０日以内のａＧＶＨＤの最大グレードと、１８０日でのステロイドの必要性は、それぞれマンホイットニーＵ検定とカイ２乗検定を使用した頻度と割合を使用して説明される。各細胞サブセットおよびＴＲＥＧの免疫回復は、中央値と範囲のマンホイットニー検定を使用して各時点で説明される。

実施例１５：ＧＶＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおけるプールされたアポトーシス細胞調製物と単一ドナーアポトーシス細胞調製物との比較

目的：ＧｖＨＤのマウスモデルにおけるＧｖＨＤの重症度に対する単一のドナーから得られた上腕アポトーシス細胞の有益な臨床効果を、ＧｖＨＤの重症度に対する複数の個々のドナーから得られた上腕アポトーシス細胞の臨床効果（ある場合）と比較する。ＧｖＨＤのマウスモデルでは、複数の個々のドナーがＨＬＡ不適合異種ドナーを表す。

上記の実施例１２は、複数の個々のドナーからプールされた照射アポトーシス細胞の有益な効果を示す。図２８および図２９に示される結果は、当業者が、不適合細胞の複数の供給源が細胞の抗原性の多様性を増加させた可能性があり、したがって臨床効果の劇的な減少を期待したであろうことを認識し得るので驚くべきものであった。予期せぬことに、ＧｖＨＤ重症度の低下に対する初期アポトーシス細胞の既知の有益な効果、したがって死亡までの日数の延長も、抗原性が増加したとされるプールされた不適合初期アポトーシス細胞によって軽減され（図２８）、プールされた複数の不適合ソース細胞が原因である。

追加の目的は、照射された初期アポトーシス細胞と照射されていないアポトーシス細胞の使用に違いがあるかどうかを理解することであった。

当業者は、不適合の照射された細胞が、ＡＰＣメカニズムによって、したがってそれらが注入された宿主のＴ細胞によって認識されるように、それらの抗原プロファイルを維持することを理解するであろう。したがって、異種の不適合細胞集団をプールする場合の懸念には、プールされる個々の集団間の交差反応性、プールされた集団の混合細胞リンパ反応、または細胞を減少または排除する可能性のあるプールされた集団間のＴ細胞免疫反応、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。

方法

マウスモデル：ミスマッチＧＶＨＤモデルでは、雌の７～９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ－２^ｄ）をレシピエントとして使用し、雌の８～９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ－２^ｂ）をドナーとして使用した。レシピエントは、骨髄および脾細胞移植の２４時間前に、８５０ｃＧｙで全身照射された。ドナーの骨髄細胞は、骨髄の再構成に使用された。骨髄細胞は、ＲＰＭＩ１６４０を使用して、大腿骨および脛骨から抽出された。赤血球を溶解した後、細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁した。生存率は、トリパンブルー色素排除（＞９０％生存率）を使用して評価した。ドナー脾細胞は、ＧＶＨＤの誘導に使用された。脾臓を摘出し、均質化し、単細胞懸濁液を得た。赤血球を溶解し、脾細胞をＰＢＳで再懸濁した。トリパンブルー色素を使用して、少なくとも９０％の生存細胞を評価した。

初期アポトーシス細胞：アポトーシス細胞は、実施例１と同様に、健康なドナーからの単核濃縮細胞分画アフェレーシスから産生された。簡単に言うと：

単核細胞（ＭＮＣ）の濃縮分画は、白血球アフェレーシス手順を介して健康で適格なドナーから得られた。細胞は、４００～６００ｍｌの自己血漿に加えて、１２リットルの血液からＳｐｅｃｔｒａＯＰＴＩＡ（登録商標）アフェレーシスシステムを介して収集された。ドナーから濃縮単核細胞分画の推定収量は、約１．２～１．５×１０^１０細胞であることが予想された。白血球アフェレーシス手順の前に、ドナーは試験され、以下のウイルスベクターに対して陰性であることが確認される。
１．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型、
２．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、
３．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、
４．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、
５．梅毒トレポネーマ（梅毒）、
６．ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型

細胞収集後、細胞をＲＰＭＩで洗浄し、以下のように凍結した。凍結製剤は、注射用ｐＨ７．４のＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、１０％ＤＭＳＯ、５％ヒト血清アルブミン、および１０Ｕ＼ｍｌヘパリンを接種した５％抗凝固剤クエン酸塩デキストロース溶液で構成されていた。

凍結培地はバッグで調製され、凍結手順はｃＧＭＰ条件下で閉鎖系で実行された。

白血球アフェレーシス手順の完了に続いて、濃縮されたＭＮＣ分画をＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡで洗浄し、氷冷凍結培地を５０～６５ｘ１０^６細胞＼ｍｌの濃度に再懸濁した。次いで、細胞を凍結バッグに移し、バッグを予冷アルミニウムカセットに移し、カセットを直ちに－１８～（－２５）℃に２時間移した。

２時間後、カセットをさらに２時間－８０℃に移し、次いで液体窒素（＞－１３５℃）で長期保存した。

自己血漿を５０ｇｒのアリコートに分けた。血漿アリコートを２時間－８０℃に移し、次いで－１８～（－２５）℃で長期保存した。

アポトーシス誘導のために、細胞を解凍し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび１０Ｕ＼ｍｌヘパリンを播種した５％抗凝固剤クエン酸塩デキストロース溶液を含む予熱したＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。上清抽出後、細胞を最終濃度５ｘ１０^６／ｍｌで、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ－グルタミンを補充し、１０％自家血漿、５０μｇ＼ｍｌメチルプレドニゾロン、および１０Ｕ＼ｍｌヘパリンを接種した５％抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液を添加したＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。次いで、細胞を細胞培養バッグに移し、加湿インキュベーター３７℃、５％ＣＯ_２で６時間インキュベートして、アポトーシスを安定させる。

インキュベーション後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。

初期アポトーシス細胞産物は、単一のドナーから、または１０の異なる個々のドナーを組み合わせて生成され、細胞は照射の直前に組み合わされた。複数のドナー産物の成分間では、例えば生きている非アポトーシス細胞間で干渉が発生する可能性があるため、初期アポトーシス細胞産物を細分化し、インビボで試験する初期アポトーシス細胞の試料に投与前に２５００ｃＧｙを照射し（以下試料Ｆ）、投与まで２～８℃で保存した。以下の実施例６の表３は、初期アポトーシス細胞産物のＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性／ヨウ化プロピジウム陰性比および細胞表面マーカーの詳細を示し、マウスに投与されたアポトーシス細胞の一貫性が維持されることを確立している。最終産物は、２～８℃で４８時間安定であった。

移植の当日に、マウスは、以下の実験計画に従って、５×１０^６骨髄細胞を、３×１０^６脾臓細胞、３０ｘ１０^６の単一または複数のドナー初期アポトーシス細胞産物は受けた。
照射対照
再構成対照－照射＋骨髄移植（ＢＭ）
ＧＶＨＤ対照－照射＋骨髄および脾細胞移植
単一ドナー、照射－照射＋骨髄および脾細胞移植＋単一ドナーからの照射初期アポトーシス細胞産物
単一ドナー、非照射－照射＋骨髄および脾細胞移植＋単一ドナーからの非照射初期アポトーシス細胞産物
複数のドナー、照射－照射＋骨髄および脾細胞移植＋複数のドナーからの照射された初期アポトーシス細胞産物
複数のドナー、非照射－照射＋骨髄および脾細胞移植＋複数の個々のドナーからの非照射の初期アポトーシス細胞産物。

モニタリング－移植されたマウスにタグを付け、生存をモニターした。体重は、実験の最初の２週間は２日ごとに、その後は毎日評価された。初期体重からの３５％の減少が主要エンドポイントとして決定され、マウスを屠殺し、それに応じて生存曲線が更新された。体重の結果は、実施例１２の図２９で観察された結果と同等であった。

ＧＶＨＤの重症度は、５つの臨床パラメータ、体重減少、姿勢（背中を丸める）、活性、毛の質感および皮膚完全性が組み込まれる、既知のスコアリングシステム（ＣｏｏｋｅＫＲ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｏｄｅｌｏｆｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｐｎｅｕｍｏｎｉａｓｙｎｄｒｏｍｅａｆｔｅｒｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｉ．ＴｈｅｒｏｌｅｓｏｆｍｉｎｏｒＨａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８：３２３０－３２３９）を使用して評価された。マウスを評価し、各基準について０～２まで等級分けした。５つの臨床スコアを合計することにより、臨床指標値が生成された（指標番号はＧＶＨＤの重症度とともに増加する）。

結果：

異なるマウス集団の生存率を図３０にグラフで示す。骨髄再構成を受けなかったマウスから予想されるように、照射のみの対照マウスは８日目～１２日目（ｎ＝１３）の間に死亡した。ＧＶＨＤ対照マウス（骨髄と脾臓を投与された）の大部分は、６日目～２７日目に死亡した。１匹のマウスは死亡しなかった（ｎ＝１８）。骨髄再構成対照群（ＢＭ）では、７匹中３匹のマウスが、６日目～８日目に死亡した。残りのマウスでは、骨髄はドナー骨髄によって再構成され、マウスは生きたままであった（＞５０日）。

単一ドナーの非照射マウスは、１５日目～３６日目に死亡した。したがって、以前に示されたように、単一ドナーの非照射初期アポトーシス細胞は有益な効果を有し、生存は延長された（ｐ＜０．０１）。

単一ドナーの照射マウスは、７日～３５日目に死亡し、１匹のマウスは無病生存期間（＞５０日）を維持した。これは、単一ドナーで照射されたアポトーシス細胞もまた、ＧＶＨＤに関して有益な効果を提供したことを示した。したがって、照射は初期アポトーシス細胞の免疫調節効果を害しなかった。すべてがＧＶＨＤ対照と比較して、ＧＶＨＤマウスモデルの生存に有益な効果をもたらした（ｐ＜０．０１）。

非照射の複数ドナー治療は、ＧＶＨＤ対照と比較して有益な効果を提供しなかった（ｎ＝１１）。生存パターンはＧＶＨＤ対照と同様であり、マウスは、６日目～２８日目に死亡した（ｐ＝ＮＳ－有意ではない）。驚くべきことに、非照射アポトーシス細胞とは対照的に、照射された複数の個々のドナーアポトーシス細胞（治療Ｆ）（ｎ＝１０）は、ＧＶＨＤ対照と比較して、単一ドナー治療と同様の有益な効果を示した。ＧＶＨＤの症状はかなり遅れて現れ、マウスは、１８日目～３４日目に死亡した（ｐ＜０．０１）。

照射された複数の個別ドナー（ｎ＝１０）、照射された単一ドナー（ｎ＝１０）、および照射されていない単一ドナー治療（ｎ＝１０）は同様の生存パターンを示し、これら３つの治療群間で生存への影響に有意差は観察されなかった。

実験は、ＧＶＨＤ誘導マウスにおけるアポトーシス細胞注入の明らかな効果を示した。照射された複数の個々のドナーおよび照射されたおよび照射されていない単一ドナーアポトーシス細胞の治療には、有意に延長された生存効果があった。

複数ドナー治療は、照射されていない場合、マウスの生存を延長しなかったが、マウスへの投与前のアポトーシス細胞産物の照射は、結果を改善し、治療は、単一ドナー治療として近い生存パターンを有した。

上記のように、図３０は、複数の不適合ドナーから得られた非照射アポトーシス細胞は、（１）単一の不適合ドナーから得られた非照射アポトーシス細胞、（２）単一の不適合ドナーから得られた照射アポトーシス細胞、（３）複数の不適合ドナーから得られた照射アポトーシス細胞と比較して、ＧｖＨＤおよび死亡率（生存％）の低下に対する正の臨床効果が有意に低いことを示す。さらに、３つすべて（非照射初期アポトーシス細胞、単一ドナー、照射初期アポトーシス細胞、単一ドナー、および照射初期アポトーシス細胞、複数の個別ドナー）は同様の効果を有する。

このデータが驚くべきだったことは、複数の個々のドナーから得られた非照射アポトーシス細胞の抗原性は、複数の個々のドナーから得られた照射アポトーシス細胞の抗原性と類似していると期待されていたため、なぜ両方が、移植された骨髄と同様の敵対的な抗原反応を有さないのか、かつなぜ両方がＧｖＨＤおよび死亡率を低減することができないのかということであった。

ここで抗原性が主な問題である場合、単一ドナーから得られた非照射アポトーシス細胞と単一ドナーから得られた照射アポトーシス細胞の臨床効果の間に違いが見られることが期待された。しかしながら、データはこの違いを示していない。

１つの可能性は、複数の個々のドナーから調製された非照射プールされたアポトーシス細胞調製物の有効性の欠如が、プール調製物に存在する個々の単核集団間の相互作用に起因することである。照射された細胞は抗原性を維持するが、有効性は非照射細胞とは有意に異なるため、これらの相互作用は宿主に対する抗原性に直接起因しないように思われる。したがって、照射を受けたプールされた初期アポトーシス細胞調製物における交差相互作用は予想外に排除され、宿主は細胞の投与によく反応したと思われる。

示されているように、プールされた照射ドナーは、単一の非照射ドナーと本質的に同じ効果を有していた。

実施例１６：最終アポトーシス細胞産物に対する照射の影響

アポトーシス細胞は、その固有の免疫調節および抗炎症特性のために、新しい治療戦略でますます使用されている。初期アポトーシス細胞調製物は、２０～４０％もの生存細胞を含む可能性があり（ＰＳ曝露の欠如およびＰＩの流入なしで測定、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陰性およびヨウ化プロピジウム陰性）、輸血での使用後にアポトーシスを起こす可能性があるが、一部は生存可能なままである。適合ドナーからの骨髄移植の場合、レシピエントは実際の移植ですでにより多くの生存細胞を受け取っているため、生存細胞は臨床上の問題を表さない。しかしながら、第三者輸血の場合（またはプールされた単核アポトーシス細胞調製物に表される場合は第４者以上）、生存細胞を含むアポトーシス細胞集団の使用は、第２のＧｖＨＤ誘導物質を導入する可能性がある。さらに、初期アポトーシス細胞の免疫調節能に対する照射の影響は、これまで評価されていない。当業者は、初期のアポトーシス細胞集団への追加の照射が、細胞をアポトーシスまたは壊死の後期段階に進行させる可能性があると考えるかもしれない。これは臨床応用に関して特に関連する質問のように思われるため、以下に示す実験はこの問題に対処するために設計され、少なくとも１つの目標は機能的なアポトーシス細胞の生物学的安全性を改善することである。

したがって、その目的は、アポトーシス細胞の効力が移植細胞の移植ではなくバイスタンダー効果に依存している可能性がある多くの適応症に対するアポトーシス細胞の臨床利用を促進することであった。

目的：照射はアポトーシスの誘導後に照射される、初期アポトーシス細胞に対する照射の効果を調べる。

方法（簡単に）：細胞をそれに応じて収集し、初期アポトーシス細胞を本質的に実施例５に記載されているように調製した。

３つの別々の初期アポトーシス細胞バッチを異なる日に調製した（収集４０４－１、００４４－１および００４３－１）。

各最終産物を、３つの群に分けた：

未治療

２５００ｒａｄ

４０００ｒａｄ。

照射後、初期アポトーシス細胞を直ちに（ｔ_０）、細胞数、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性－ＰＩ陰性染色、細胞表面マーカー（異なる細胞型の集団％）、および効力（樹状細胞（ＤＣ））について試験した。ｔ_０で検査後、初期アポトーシス細胞を２～８℃で２４時間保存し、同じ試験パネル（Ｔ_２４ｈ）を使用して次の日に検査した（細胞数、ＡｎｎｅｘｉｎＶ陽性、ＰＴ陰性染色、および細胞表面マーカーおよび効力）。

従来は、耐性を誘導するドナー単核初期アポトーシス細胞（初期アポトーシス細胞）の能力を評価する、放出後効力アッセイが開発された（Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ、ＢＢＭＴ２０１４同上）。このアッセイは、ＬＰＳへの曝露後のｉＤＣ膜でのＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ）および共刺激分子（ＣＤ８６）発現のフローサイトメトリー評価の使用に基づく。以前に繰り返し示されたように、寛容原性ＤＣは、アポトーシス細胞との相互作用により生成され（Ｖｅｒｂｏｖｅｔｓｋｙｅｔａｌ．，ＪＥｘｐＭｅｄ２００２，Ｋｒｉｓｐｉｎｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ２００６）、およびＬＰＳ処理したＤＣの成熟の阻害（ＤＲおよびＣＤ８６発現の阻害）は、用量依存的に生じる。

初期アポトーシス細胞臨床試験のフェーズ１／２ａ中に、各バッチが耐性を誘導する能力を評価するために、各初期アポトーシス細胞バッチ（全体の結果ｎ＝１３）に対して放出後効力アッセイを実施した（結果を図１に示す、Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄａｎｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２０（１）：５８－６５）。

ＤＣは、新鮮なバフィーコートから初期アポトーシス細胞バッチごとに生成され、未知の無関係な健康なドナーから収集され、異なる比率（それぞれ１：２、１：４、および１：８ＤＣ：初期アポトーシス細胞）で初期アポトーシス細胞と組み合わされた。初期アポトーシス細胞とのインキュベーションおよびＬＰＳへの曝露後、ＤＣ：初期アポトーシス細胞の１つ以上の比率で、ＨＬＡＤＲまたはＣＤ８６のいずれかのＤＣ膜発現のダウンレギュレーションに基づいて効力を決定した。１３個のアッセイすべてにおいて、初期アポトーシス細胞は寛容原性効果を示し、この寛容原性効果は、ほとんどのＤＣ：初期アポトーシス細胞比率の調製物、および両方のマーカーで、用量依存的に見られた。

単球で得られた未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は、健康なドナーの末梢血ＰＢＭＣから生成され、１％自家血漿、Ｇ－ＣＳＦ、およびＩＬ－４の存在下で培養された。次いで、ｉＤＣを１：２、１：４および１：８の比率でアポトーシス細胞とともに２時間プレインキュベートし、新たに調製された最終産物または最終産物のいずれかを２～８℃で２４時間保存した。保存がアポトーシス細胞の効力能力に影響を与えるかどうかを決定するために、２つの最終産物を同時に調べた。インキュベーション後、ＬＰＳを指定されたウェルに添加し、さらに２４時間放置した。インキュベーションの終わりに、ｉＤＣを収集し、洗浄し、発現の変化を決定するために、ＤＣ－ｓｉｇｎおよびＨＬＡ－ＤＲの両方またはＣＤ８６で染色した。フローサイトメーターを使用して細胞を分析し、ＤＣ－ｓｉｇｎ陽性細胞ゲートからＦＣＳ－ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析を実行し、ＤＣのみの分析を保証した。

図３１Ａおよび３１Ｂならびに図３２Ａおよび３２Ｂは、非照射単一ドナー細胞と比較した、プールされた照射アポトーシス細胞の効力試験を示す。

結果：

単一ドナーの調製

表２１は、非照射アポトーシス細胞および照射アポトーシス細胞の比較結果を示す；２４時間での平均セル損失（％）；０時間および２４時間のＡｎｎｅｘｉｎ陽性（^＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性（^－）％（初期アポトーシス細胞の％）；０時間および２４時間のＡｎｎｅｘｉｎ陽性（^＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（^＋）％（後期アポトーシス細胞の％）；０時間および２４時間の細胞表面抗原ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１４（単球）およびＣＤ１５^高（顆粒球）の存在。

表２１の結果は、非照射アポトーシス細胞と照射アポトーシス細胞の両方が、初期（行２および３）および後期（行４および５）のアポトーシス細胞の同等の割合を有していたことを示す。したがって、２５または４０Ｇｙの照射は、この高レベルのガンマ線照射の前に誘導されたアポトーシスまたは壊死プロセスを加速させなかった。さらに、細胞型に関して、照射細胞集団と対照の非照射集団との間に一貫性があった。

図３１Ａ～３１Ｂ（ＨＬＡ－ＤＲ発現）および図３２Ａ～３２Ｂ（ＣＤ８６発現）に提示される効力アッセイの結果は、非照射アポトーシス細胞と比較した場合、新鮮な（図３２Ａ、図３２Ａ）および２４時間保存された（図３１Ｂおよび図３２Ｂ）照射アポトーシス細胞の免疫調節能力に変化がなかったことを示す。

図３１Ａ～３１Ｂと図３２Ａ～３２Ｂの両方では、成熟剤ＬＰＳへの曝露後、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８６発現の両方に明らかなアップレギュレーションが存在する。単一のドナーまたはプールされた照射ドナーの両方からの新たに調製されたアポトーシス細胞の存在下で、両方の共刺激マーカーの有意な（ｐ＜０．０１）用量依存的なダウンレギュレーションが観察された。加えて、２４時間２～８℃で保存されたアポトーシス細胞の存在下で、用量依存的ダウンレギュレーションは、両方のマーカーで維持され、保存の２４時間後、最終産物は安定性および効力を示した。

樹状細胞への効果、アポトーシス細胞の免疫調節能力を試験するために、放出後効力アッセイを使用した（Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．，（２０１４）ＢＢＭＴ、同上）。樹状細胞における免疫調節アッセイの変化は観察されなかった。（データは示さず）

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）への効果。免疫調節効果をさらに試験するために、標準化されたＭＬＲアッセイが確立された。ここで、刺激細胞と応答細胞、すなわちＭＬＲの共培養は、強力で信頼性の高い増殖をもたらした。非照射アポトーシス細胞をＭＬＲに添加すると、リンパ球の増殖は５倍を超えて有意に減少し、細胞による増殖の阻害を明確に示す。照射アポトーシス細胞によって媒介されるＭＬＲにおけるリンパ球増殖の阻害は、完全に同等であった。（データは示さず）

次のステップは、完全な不適合マウスモデルにおいて、インビボで照射および非照射アポトーシス細胞を評価することであった。図２８および２９に示すように、照射および非照射初期アポトーシス細胞調製物は、同等のインビボで有益な効果を示した。

単一ドナーの調製の結論：

結論として、２５Ｇｙまたは４０Ｇｙの照射は、アポトーシスを有意に加速せず、アポトーシス細胞の集団で壊死を誘導しなかった。重要なことに、これらの集団は、インビトロおよびインビボの両方で、アポトーシス細胞の免疫調節効果を維持した。

複数のドナーの調製

次に、実験を行って、単一ドナーで観察された現象、第三者の調製が、複数の第三者ドナーにも当てはまることを確認した。予期せぬことに、プールされた個々のドナーアポトーシス細胞調製物を使用すると、単一不適合ドナーの有益な効果が失われた（図３０）。これはＧｖＨＤによるものではなく、各ドナーの有益な効果が別々に維持されていたからである（試験結果は示されず）。１つの可能性は、初期アポトーシス細胞調製物の有益な効果が、個々のドナー細胞間の相互作用により失われたことである。異なるドナーのこの相互作用の可能性が、ガンマ線照射によって回避できるかどうかをさらに調べた。

図３０に示すように、単一ドナーの有益な効果は、ガンマ線照射後に完全に回復し、照射された複数ドナー調製物および単一ドナー調製物（照射または非照射）は、同様の生存パターンを示した。

結論：

驚くべきことに、照射（およびおそらくＴ細胞受容体阻害につながる任意の方法）により、Ｔ細胞の不必要な増殖および活性化を回避するだけでなく、複数のドナーの第三者アポトーシス細胞の調製物を使用する場合、免疫調製の有益な効果も可能になることがここに初めて示されている。

実施例１７：敗血症の治療におけるアポトーシス細胞のインビボ前臨床分析

目的：敗血症患者の臓器不全および死亡率の敗血症予防のための補助的免疫調節細胞療法を開発すること。さらに、初期アポトーシス細胞（Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）および広域抗生物質が重症盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）の自然史の経過に及ぼす効果を研究するために、雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＣＬＰ誘発性敗血症の発症に対して、エルタペネム抗生物質と組み合わせて、ＣＬＰ手順の終了の４時間後に投与される、初期アポトーシス細胞（Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）の驚くべき予期しない効果をここに示す。効果は、３つの別々の実験で試験された。

方法：

敗血症の盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）マウスモデル

盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルは、他のモデルと比較して、ヒトの臨床的敗血症の性質および経過をより厳密に再現するために提案されており、多くの研究者によって敗血症のゴールドスタンダード動物モデルとみなされている。ＣＬＰモデルは、通常は回盲部接合部の下（腸閉塞を予防するため）、および盲腸の遠位端から少なくとも１センチメートル上にある盲腸の結紮を含み、そうでない場合、誘導される敗血症は非常に軽度である。盲腸の遠位端から結紮点までの距離として定義される結紮盲腸の長さは、誘導される敗血症の重症度を決定する。結紮後、盲腸を穿孔するが、このステップもまた、その後の敗血症の重症度を調節するように調整することができる。盲腸の穿孔に続いて、腹腔内への糞便物質の放出が多微生物感染を誘導し、その結果、免疫応答が悪化する。ＣＬＰモデルの利点は、その再現性と、針のサイズ、盲腸穿刺の数、および抗生物質の利用を制御することによって敗血症の重症度を変える可能性があることである。

ＣＬＰモデルを使用して、免疫系にリバランス効果を有することが示されたドナーアポトーシス細胞の効果を評価した（Ｍｅｖｏｒａｃｈ，Ｄ．，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｔ．，Ｒｅｉｎｅｒ，Ｉ．，Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ａ．，Ｓａｍｕｅｌ，Ｓ．，Ｎａｇｌｅｒ，Ａ．，Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄＯｒ，Ｒ．（２０１４）。Ｓｉｎｇｌｅｉｎｆｕｓｉｏｎｏｆｄｏｎｏｒｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｅａｒｌｙａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓａｓｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓｆｏｒｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅＨＬＡ－ｍａｔｃｈｅｄａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａｐｈａｓｅＩ／ＩＩａｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．Ｂｉｏｌ．ＢｌｏｏｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０，５８－６５、ＴｒａｈｔｅｍｂｅｒｇａｎｄＭｅｖｏｒａｃｈ，２０１７、同上）。

研究設計

ここで報告された研究は、ＣＬＰの終了から４時間後に投与されたアポトーシス細胞が、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるＣＬＰ誘発性敗血症の発症に及ぼす効果をまとめたものである。

マウス

１０～１３週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスは、ＥＮＶＩＧＯ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。ＩＡＣＵＣ研究所のガイドラインに従って、マウスをＳＰＦ動物施設で飼育した。マウスの体重を毎日測定し、臨床兆候およびマウス敗血症スコア（ＭＳＳ）臨床スコアの決定について、１日２～３回モニターした（Ｓｈｒｕｍ，Ｂ．，Ａｎａｎｔｈａ，Ｒ．Ｖ．，Ｘｕ，Ｓ．Ｘ．，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ．，Ｈａｅｒｙｆａｒ，Ｓ．Ｍ．Ｍ．，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄＭｅｌｅ，Ｔ．（２０１４）。Ａｒｏｂｕｓｔｓｃｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｔｏｅｖａｌｕａｔｅｓｅｐｓｉｓｓｅｖｅｒｉｔｙｉｎａｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ．ＢＭＣＲｅｓ．Ｎｏｔｅｓ７，１－１１による）。エンドポイントは、表のカテゴリの１つで、合計スコア１５または最大スコアとして定義された。

盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）手順

手順は、以下に簡単に説明するように実行された：盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）－実験方法。簡潔に説明すると、マウスはイソフルラン麻酔器の下で操作された。マウスをチャンバー内で４％イソフルランで約１分間麻酔し、麻酔後、マウスを手術台に移し、２％イソフルランでイソフルラン鼻腔に接続した。マウスに、０．１ｍｌの予熱した０．９％生理食塩水中のトラマドール５ｍｇ／ｋｇの皮下（Ｓ．Ｃ．）注射によって鎮痛剤を投与した。正中切開によりマウスの腹部を開いた後、盲腸を露出させた。盲腸を遠位端の７５％上で４～０絹縫合糸で結紮した。結紮後、盲腸は、スルーアンドスルー技術（盲腸を通して針を導入する）を使用して、１９ゲージの針で２回穿孔された。盲腸の穿孔に続いて、腹腔内への糞便物質の放出が行われた。その後、盲腸を腹腔に戻し、０．５ｍｌの予熱した生理食塩水を腹腔に投与し、続いてこれを４～０バイクリル縫合糸で縫合した。次いで、皮膚を９ｍｍクリップで閉じ、マウスを加熱ランプの下に置いて回復させた。処置後の最初の３６時間、マウスは１２時間ごとにトラマドールを投与された。インビボ実験の特定の実行において、マウスは、１００μｌの生理食塩水中のトラマドールの２回目の投与を受け、インビボ実験の他の実行において、マウスは、支持ケアとして輸液を加えるために、０．５ｍｌの生理食塩水中のトラマドールの２回目の投与を受けた。手術後最初の２４時間に死亡したマウスは、周術期死亡率とみなされ、敗血症ではなく周術期合併症によるものであったため、直ちに実験から除外された。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ（照射初期アポトーシス細胞）

濃縮単核細胞分画は、健康で適格なドナーから白血球アフェレーシス手順を介して収集された。アフェレーシスの完了後、細胞を洗浄し、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡｐＨ７．４、５％ヒト血清アルブミン、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液式Ａ（ＡＣＤ－Ａ）および０．５Ｕ＼ｍｌヘパリンからなる凍結培地で再懸濁した。次いで、細胞を徐々に凍結し、長期保存のために液体窒素に移した。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの調製のために、凍結保存された細胞を解凍し、洗浄し、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび１０ｍＭのｈｅｐｅｓ、１０％自家血漿、５％のＡＣＤ－Ａ、０．５Ｕ＼ｍｌヘパリンナトリウムおよび５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンで補充されたＲＰＭＩ１６４０からなるアポトーシス誘導培地で再懸濁した。次いで、細胞を、５％ＣＯ_２中３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を収集し、洗浄し、ＬＯＶＯ細胞処理システム（ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＫａｂｉ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してハルトマン溶液に再懸濁した。製造完了後、Ａｌｌｏｃｅｔｒａは、ＩｓｒａｅｌのＪｅｒｕｓａｌｅｍにあるＨａｄａｓｓａｈＥｉｎＫｅｒｅｍＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒの放射線治療ユニット（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ２２０ｅｘｃｅｌ、ＭＤＳｎｏｒｄｉｏｎ）で４０００ｃＧｙで照射された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳを２９０ｇ、２～８℃で１０分間遠心分離し、ハルトマン溶液に再懸濁して注射した。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのアポトーシスおよび生存率は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）によるＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＰＩ染色（ＭＢＬ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して決定された。ＦＣＳｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析された結果。細胞は、＞５０％のＡｎ^＋ＰＩ^－および＜７％のＡｎ^＋ＰＩ^＋であった。

場合によっては、ＣＬＰ手順の終了４時間後で、マウス１匹あたり様々な量のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞を静脈内注射した。他の例では、マウス１匹あたり２０×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞を静脈内注射した。ＣＬＰ手順は、マウス１匹あたり約２０分を要し、全体の手順は約５時間続いた。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、手順が終了してから４時間後に各マウスに注射された。対照マウスは、同じ時点でハルトマンビヒクル溶液を投与された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞のキャリブレーションのために、各マウスは１、３、６、１０または２０×１０^６の細胞を投与された。対照マウスは、ハルトマンビヒクル溶液を投与された。

抗生物質治療

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ投与直後およびその後２４時間ごとに３日間、マウスに７５ｍｇ／ｋｇのエルタペネムを腹腔内投与した。

血清サイトカイン／ケモカイン。示された時間（ＣＬＰ前、ＣＬＰ後２４時間、４８時間、および７２時間）に、約５００μｌの血液を事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに収集し、３０分間放置して凝固させた。試料を１８００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１０分間、４℃、２００μｌで遠心分離した。血清を新しい事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに移し、４℃に保った。過剰な血清は－８０℃で保存した。サイトカイン／ケモカインの測定は、ＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘシステムを使用して実行され、分析は、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘソフトウェアを使用して実行された。

臓器機能障害試験。ＣＬＰの２２～２４時間後、マウスの体重を測定し、ＭＳＳ臨床スコアを割り当て、臓器機能障害の評価のために屠殺した。マウスは眼窩後洞（静脈血）から出血した。ナイーブマウスはイソフルラン鎮痛下で出血し、ＣＬＰマウスは、死の懸念のために鎮痛なしで出血した。

血圧。ＣＯＤＡ非侵襲的血圧システム（Ｋｅｎｔｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、マウスの血圧を測定した。ベースラインを確立するために、ＣＬＰ手順の前日に血圧を測定し、ＣＬＰ手順後の４時間ごとに血圧を測定した。より正確なデータを提供するために、各マウスについて、血圧を評価するたびに３回の測定が行われた。

血液ガス。ヘパリンでコーティングされたキャピラリーチューブ（ＰａｕｌＭａｒｉｅｎｆｅｌｄ，ＫＧ，Ｌａｕｄａ－Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１００μｌの血液を収集し、すぐにＳＴＡＴプロファイルプライムマシン（ＮｏｖａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して試験した。

血液学。２５０μｌの血液をＥＤＴＡチューブ（ＭｉｎｉＣｏｌｌｅｃｔ，ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ，Ｋｒｅｓｍｕｎｓｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）に収集し、チューブを回転させて血液凝固を予防し、４℃で保存した。血液学分析は、ＡＭＬ研究所（Ｈｅｒｚｌｉｙａ，Ｉｓｒａｅｌ）によって実施された。

生化学。約５００μｌの血液を事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに収集し、凝固を可能にするために約３０分間放置した。試料を１８００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１０分間、４℃で遠心分離し、２００μｌの血清を新しい事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに移し、４℃で保存した。過剰な血清は－８０°Ｃで保存した。生化学分析は、ＡＭＬ研究所（Ｈｅｒｚｌｉｙａ，Ｉｓｒａｅｌ）によって実施された。

肺。ＣＬＰの２４時間後、マウスの体重を測定し、次いで屠殺し、肺を採取して体重を測定し、肺と体重の比率を計算した。

ＮＧＡＬ、シスタチンＣ、補体（Ｃ５ａ、Ｃ３ａ）。血液を事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに収集し、凝固を可能にするために約３０分間放置した。チューブを１８００ｇ（３０００ｒｐｍ）で１０分間、４℃で遠心分離した。血清を新しい事前にラベル付けされたエッペンドルフチューブに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（ＮＧＡＬおよびシスタチンＣ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ３ａおよびＣ５ａ）評価のために－８０℃で保存した。

Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）分析。サイトカイン／ケモカインの測定は、ＬｕｍｉｎｅｘＭＡＧＰＩＸシステムを使用して実行され、分析は、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘソフトウェアを使用して実行された。ＮＧＡＬおよびシスタチンＣは、ＬｕｍｉｎｅｘＭｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＫＩ２ＭＡＧ－Ｐ４ｋ）によって試験された。すべての試薬はキットに付属しており、すべての試薬は製造元のプロトコルに従って調製された。アッセイは、提供されたプロトコルに従って、９６ウェルプレートで行われた。プレートの読み取りは、ＬｕｍｉｎｅｘＭａｇＰｉｘシステム（ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ．）を使用して実行し、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析した。分析ソフトウェアは、ウェルあたり５０μｌの試料を使用してデータを取得し、５０個以上のビーズを収集するように設定された（単一のビーズセットあたり２００～８００事象の範囲）。生データは平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定され、各試料の各分析物の濃度は、７つの標準から各分析物に対して生成された４または５パラメータのロジスティックフィット曲線を使用して計算された。定量下限（ＬＬＯＱ）は、バックグラウンドの少なくとも３倍の最低基準を使用して決定された。ＬＬＯＱの計算は、最低標準濃度のＭＦＩからバックグラウンド（希釈剤）のＭＦＩを差し引き、検量線から濃度を逆算することによって実行された。

ＥＬＩＳＡ。補体成分は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット：Ｃ３ａ（ＴＥＣＯ，ＴＥＩ０３８）およびＣ５ａ（ＥＡ１００６３３，ＯｒｉＧｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって試験された。すべての試薬はキットに付属しており、製造元のプロトコルに従って調製された。アッセイは、提供されたプロトコルに従って、９６ウェルプレートで行われた。ＯＤプレートの読み取りは、ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ５０（ＴＥＣＡＮ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実行し、Ｍａｇｅｌｌａｎソフトウェア（ＴＥＣＡＮ）を使用して分析した。生データは４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）として測定され、濃度は６～７個の標準から生成された線形標準曲線を使用して計算された。定量下限（ＬＬＯＱ）は、最低基準を使用して決定された。ＬＬＯＱの計算は、最低標準濃度のＯＤからバックグラウンド（希釈剤）のＯＤを差し引き、検量線から濃度を逆算することによって実行された。

２Ｄ心エコー検査。ＣＬＰの２４時間後、ナイーブマウス（ｎ＝５）またはエルタペネム治療ＣＬＰマウス（ｎ＝１０）をイソフルランで麻酔し、高解像度イメージングシステム（Ｖｅｖｏ７７０，ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、心エコー検査によって左心室（ＬＶ）を画像化した。左心室構造および機能の様々なパラメータの計算のために、左心室内部距離、心拍数、および後部の壁厚を測定した。左心室容積および駆出率（ＥＦ）は、Ｔｅｉｃｈｈｏｌｚ法を使用して計算され、関連するパラメータは、先に記載したように計算された（Ｓｔｙｐｍａｎｎｅｔａｌ．，２００９）。

生体エネルギー分析。細胞の単離、播種、および分析。ＣＬＰの２４時間後、マウスを安楽死させ、脾臓を摘出し、脾臓細胞を解離させ、接着を最大にし、一晩付着させために、ポリ－Ｄ－リジン（１００μｇ／ｍＬ）でプレコートしたＸＦ９６ウェルプレートへ０．５×１０^６細胞／ウェルの密度で細胞を播種した。基礎測定値を記録した後、Ｍｉｔｏストレス試験（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の注射戦略は、オリゴマイシン（１μＭ）、ＦＣＣＰ（１μＭ）およびロテノン／アンチマイシンＡの組み合わせ（１μＭ）で構成された。解糖ストレス試験（Ａｇｉｌｅｎｔ）の注射戦略は、グルコース（１０ｍＭ）とオリゴマイシン（１μＭ）、続いて５０ｍＭの２－デオキシグルコース（２ＤＧ）で構成された。酸素消費率（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、ＸＦ９６細胞外フラックスアナライザー（ＳｅａｈｏｒｓｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈＢｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、３つの３分間の混合サイクルと各注射後の測定を使用して測定した。正規化：細胞外フラックスアッセイの完了時に、播種した細胞を溶解し、ＢＣＡアッセイを使用してそれらのタンパク質濃度を定量化した。簡単に説明すると、細胞を各ウェルにプロテアーゼ阻害剤を補充した５０μｌのＲＩＰＡ溶解培地で溶解し、５分間撹拌し、細胞を室温で３０分間インキュベートし、インキュベーション後、溶解物試料をＢＣＡ作業試薬培地に添加し、５６２μｍの吸光度で測定した。

データ分析：アッセイデータは、ＸＦＲｅｐｏｒｔＧｅｎｅｒａｔｏｒ、マクロ対応スプレッドシート（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＭＳＥｘｃｅｌで分析された。

統計的手法

特に明記されていない限り、データは中央値として表示され、エラーバーは５～９５パーセンタイル範囲を表す。マンホイットニーのノンパラメトリック検定を使用して、群間の差異を統計的有意性について調べた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ一元配置分散分析（ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ）を使用して、複数の群間の差異を統計的有意性について調べ、多重比較はダンの検定を使用して調整された。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、肺／体重比を調べた。パラメータと臨床スコアの相関は、スピアマンの順位相関係数によって評価され、０．７より高い係数または－０．７より低い係数は強い相関である。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して行われた。カプラン・マイヤー法に従って生存分析を実施した。ログランク統計検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ（ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して実行された。

結果：

ＣＬＰ手順の終了から４時間後に、尿路感染症または腹部感染症を含む重度または高リスクの細菌感染症の治療に一般的に使用される非常に効果的な抗生物質である、エルタペネム抗生物質と組み合わせて、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの効果を、いくつかの研究で評価した。マウスの体重を毎日測定し、臨床兆候およびマウス敗血症スコアの決定について、１日２～３回モニターした。エンドポイントは、生存率として定義された（合計臨床スコアが１５に達したとき、またはカテゴリの１つにおいて最大スコアに達したとき、死亡または屠殺のいずれか）。

ＣＬＰマウスの臓器機能障害の代理指標としてのＭＳＳ臨床スコアリングシステムの評価。

敗血症は、調節不全の免疫応答を誘発し、それにより、腎臓、肝臓、肺、および心臓を含む重要臓器の生理学的恒常性を劇的に破壊する。この不均衡はしばしば急速に多臓器機能障害症候群（ＭＯＤＳ）にエスカレートするが、通常、予後不良に関連する。ＭＯＤＳ様疾患は、マウスＣＬＰモデルで以前に報告されている（Ｃｏｌｅｔｔａ，Ｃ．，Ｍｏｄｉｓ，Ｋ．，Ｏｌａｈ，Ｇ．，Ｂｒｕｎｙａｎｓｚｋｉ，Ａ．，Ｈｅｒｚｉｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｅ．Ｒ．，Ｕｎｇｖａｒｉ，Ｚ．，ａｎｄＳｚａｂｏ，Ｃ．（２０１４）。Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅｏｒｇａｎｆａｉｌｕｒｅａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎａｇｅｄｍｉｃｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｓｅｐｔｉｃｓｈｏｃｋ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｉｎａｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｏｆｃｅｃａｌｌｉｇａｔｉｏｎａｎｄｐｕｎｃｔｕｒｅ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ１８，５１１、Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒ，Ｓ．，Ｗｅｉｘｅｌｂａｕｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｒａｅｖｅｎ，Ｐ．，Ｋｈａｄｅｍ，Ａ．，Ｒｅｄｌ，Ｈ．，ｖａｎＧｒｉｅｎｓｖｅｎ，Ｍ．，Ｂａｈｒａｍｉ，Ｓ．，Ｒｅｍｉｃｋ，Ｄ．，Ｋｏｚｌｏｖ，Ａ．，ｅｔａｌ．（２０１５）．Ｗｈｙｄｏｔｈｅｙｄｉｅ？Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｐｅｃｔｓｏｆｏｒｇａｎｉｎｊｕｒｙａｎｄｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｓｕｒｖｉｖｉｎｇａｎｄｄｙｉｎｇｉｎａｃｕｔｅａｂｄｏｍｉｎａｌｓｅｐｓｉｓ．ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ．Ｅｘｐ．３，４８、Ｏｓｔｅｒｂｕｒ，Ｋ．，Ｍａｎｎ，Ｆ．Ａ．，Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ．，ａｎｄＤｅＣｌｕｅ，Ａ．（２０１４）。Ｍｕｌｔｉｐｌｅｏｒｇａｎｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２８，１１４１－１１５１、Ｒｕｉｚ，Ｓ．，Ｖａｒｄｏｎ－Ｂｏｕｎｅｓ，Ｆ．，Ｍｅｒｌｅｔ－Ｄｕｐｕｙ，Ｖ．，Ｃｏｎｉｌ，Ｊ．－Ｍ．，Ｂｕｌｅｏｎ，Ｍ．，Ｆｏｕｒｃａｄｅ，Ｏ．，Ｔａｃｋ，Ｉ．，ａｎｄＭｉｎｖｉｌｌｅ，Ｖ．（２０１６）．Ｓｅｐｓｉｓｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｍｉｃｅ：ｌｉｇａｔｉｏｎｌｅｎｇｔｈｉｓａｍａｊｏｒｓｅｖｅｒｉｔｙｆａｃｔｏｒｉｎｃｅｃａｌｌｉｇａｔｉｏｎａｎｄｐｕｎｃｔｕｒｅ．ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ．Ｅｘｐ．４，２２、Ｓｅｅｍａｎｎ，Ｓ．，Ｚｏｈｌｅｓ，Ｆ．，ａｎｄＬｕｐｐ，Ａ．（２０１７）．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２４）が、臓器機能障害の組織病理学的分析は、多数のマウスを必要とする最終手順であるため、このモデルにおける治療アプローチを開発するための効果的な研究ツールではない場合がある。加えて、組織病理学的結果は、しばしば実験群間で差を示さず、疾患の重症度および転帰と相関しない。したがって、敗血症の臓器機能障害に対する診断テストを見つけること

ＭＳＳの臨床スコアと強く相関するマウスは、敗血症に臨床的に関連する研究ツールである可能性がある。

したがって、ＣＬＰの２４時間後、各マウス（輸液およびエルタペネム治療、Ｎ＝４０）に臨床スコアを割り当て、体重を測定し、さらなる分析のために眼窩後洞から血液試料を採取した。マウスを屠殺し、それらの肺を採取して、体重を測定した。臓器機能障害に対するＣＬＰの効果および、ＭＳＳ臨床スコアとの相関関係を明らかにするために、心臓血管、呼吸器、腎臓、肝臓、血液、補体などの５つの主要なシステム、ならびにいくつかの代謝物（表２４Ａおよび２４Ｂ）に関連する臓器機能障害の複数のパラメータについて血液を試験した。

ＣＬＰマウスをナイーブマウスと比較した（ＭＳＳスコア０、Ｎ＝２１）。ＣＬＰマウスは、臨床スコアに基づいて、３つのサブ群に分類された：１～４（軽度の敗血症）、７～１２（中等度の敗血症）および１３＋（重症の敗血症）。ＣＬＰの２４時間後、ほとんどのマウスは重症の臨床兆候を示し、ＭＳＳ臨床スコアの中央値は１３（９～１４の９５％ＣＩ）であり、中等度から重症の敗血症を示す（図３４Ａ）。

ＣＬＰマウスの心機能を研究するために、ＣＬＰの２４時間後、ナイーブマウス（ｎ＝５）またはエルタペネム治療ＣＬＰマウス（ｎ＝１０）の左心室（ＬＶ）を心エコー検査によって画像化し、様々な構造的および機能的心臓パラメータは、臨床スコアとの相関について試験された（表２５）。

ＣＬＰマウスにおける重症の心血管および呼吸機能障害。心血管系は、ＣＬＰ誘発性敗血症のマウスで最初に影響を受けるものの１つである。したがって、収縮期血圧が機器の検出限界である＜５０ｍｍＨｇを下回ったため、マウス血圧の非侵襲的測定の試みは成功せず、敗血症の重症度をさらに強調した。肺機能障害は、体液貯留による肺重量の増加（体重に正規化）によって明らかになり、肺重量のこの有意な増加は、ＭＳＳ臨床スコアと強く相関し（表２４；ρスピアマン＝０．７４３）、したがって、中等度および重症の敗血症のマウスではさらに有意であった（図３４Ｂ、７～１２および１３＋のＭＳＳ臨床スコアではｐ≦０．０１およびｐ≦０．０００１）。ＣＬＰマウスには明らかな構造的心筋損傷はなかったが（図３４Ｃ、上面図、Ｂモード）、ナイーブマウスよりも心拍数が有意に低く（図３４Ｃ、Ｍモード）、ＭＳＳ臨床スコアと強い逆相関があり（表２５、ρスピアマン＝－０．８７８）、この心拍数の低下は、重症敗血症のマウスで最も有意であった（図３４Ｄ、ｐ≦０．０１９４）。短縮率（ＦＳ）と駆出率（ＥＦ）は群間で有意差はなかったが（表２５、ｐ＝非有意）、ＣＬＰマウスは拡張期左心室容積が有意に低く、臨床スコアと強い逆相関があり（表２５、ρスピアマン＝－０．７０１）、重症の敗血症のマウスは、最も低い左心室容積を有した（図３４Ｅ、ｐ≦０．０３４３）。収縮期左心室容積と測定された左心室面積も、敗血症マウスで有意に低かった（表２５）。したがって、ＣＬＰマウスの心拍出量はひどく損なわれ、再び、疾患の重症度と強く逆相関した（表２５、ρスピアマン＝－０．７９９および図３４Ｆ）。

急性腎障害（ＡＫＩ）。敗血症における心血管機能障害と組み合わされた誇張された炎症反応は、腎機能に深刻な損傷を与える可能性がある。したがって、腎機能障害は、クレアチニンおよび尿素、および新しいマーカー、すなわちシスタチンＣおよびＮＧＡＬを測定することによって評価された。わずかに上昇したものの、ＣＬＰマウスでは血清クレアチニンおよびシスタチンＣに有意な増加は見られず（表２４Ａおよび２４Ｂ）、おそらくクレアチニンレベルへの影響が比較的遅いことを示す。しかしながら、尿素レベルは、臨床スコアが低い（１～４）および中程度（７～１２）のＣＬＰマウスで有意に上昇し（図３５Ａ、両方の群でｐ≦０．０１）、ＭＳＳ臨床スコアと強く相関していた（表２４Ａおよび２４Ｂ、ρスピアマン＝０．８８５２）。血清クレアチニンに対する遅発効果とは対照的に、ＮＧＡＬは敗血症モデルマウスのＡＫＩとよく相関することが示唆された（Ｏｔｔｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｂｕｓｃｈ，Ｍ．，Ｓｏｓｓｄｏｒｆ，Ｍ．，ａｎｄＣｌａｕｓ，Ｒ．Ａ．（２０１３）．Ｉｍｐａｃｔｏｆｓｅｐｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｏｒｍｏｎｐｌａｓｍａＮＧＡＬｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｋｉｄｎｅｙｉｎｊｕｒｙｉｎａｍｏｄｅｌｏｆｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｐｓｉｓ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ１７，４１９）。実際、ＮＧＡＬ血清濃度は、特に重症敗血症のＣＬＰマウスで劇的に増加し（図３５Ｂ、ｐ≦０．０１、ＭＳＳ臨床スコア１３＋）、臨床スコアと強く相関した（表２４Ａおよび２４Ｂ、ρスピアマン＝０．７５７２）。ＣＬＰマウスにおける血清カリウムの適度であるが有意な増加（図３５Ｃ、ｐ≦０．０１、１３＋のＭＳＳ臨床スコア）とともに、これらの結果はＡＫＩを示す。

急性肝障害のマーカーは、ＣＬＰマウスのＭＳＳ臨床スコアと強く相関する。肝機能障害は、敗血症患者のほぼ４０％で発生し、血清ビリルビンおよび肝トランスアミナーゼの増加、ならびにアルブミンを含むタンパク質産生の減少によって診断することができる。ＣＬＰマウスは、同じ傾向に従うことが示された。この研究では、重症敗血症のＣＬＰマウスでは、血清ビリルビンの増加は軽度だが、わずかであった（図３６Ａ、ｐ＞０．９３）。それにもかかわらず、ＡＳＴおよびＡＬＴトランスアミナーゼの両方のレベルは、ナイーブマウスと比較して、ＣＬＰマウスで有意に上昇し（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．００１）、特に重症敗血症のマウスで上昇した（図３６Ｂおよび３６Ｃ、ｐ≦０．０１）。ＡＳＴおよびＡＬＴの劇的な増加は、マウスのＭＳＳ臨床スコアに明確に反映された（表２４Ａおよび２４Ｂ、それぞれρスピアマン＝０．７２６８および０．８２１６）。ビリルビンの有意な増加を伴わない肝トランスアミナーゼの実質的な放出は、低酸素性肝炎に典型的であり、ＡＬＩのこの機序を示唆している可能性がある。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、おそらく、急性腎障害に対する保護機能を備えた抗炎症剤および抗菌剤として、ヒト敗血症患者でも上昇する。実際、このモデルのような重症敗血症および重症ＡＫＩでは、ＣＬＰマウスのＡＬＰ血清濃度は、ナイーブマウスと比較して有意に減少し、ＭＳＳ臨床スコアと強い逆相関があった（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ＜０．０００１、ρスピアマン＝－０．８４３２）。このＡＬＰの低下は、中等度および重症の敗血症のマウスで最も顕著であった（図３６Ｄ、ＭＳＳ臨床スコアが７～１２および１３＋の場合、それぞれｐ≦０．０１７およびｐ≦０．００１）。

ＡＰは、血清および骨、肝臓、腸、腎臓を含む体全体の複数の臓器に見られる内因性金属酵素である。これらの酵素は、肝臓および骨の疾患のバイオマーカーとして十分に確立されているが、それらの生理学的役割は完全には理解されていないままである。最近の証拠は、細胞外アデニンヌクレオチドおよびエンドトキシンを含む腎毒性分子の脱リン酸化を介したＡＫＩの緩和におけるＡＰの潜在的な保護効果を示す。ＣＬＰマウスのＡＬＰ血清濃度についてはあまり知られていないが、マウスのＣＬＰ後のＡＬＰの増加を示した研究はいくつかあるが、ここで見られる反対の観察結果は、ＣＬＰの重症度を反映しているようである。ＣＬＰの２４時間後、総タンパク質血清レベルと血清アルブミンレベルの両方が有意に低下し（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ＜０．０００１）、これらのタンパク質レベルの低下は、おそらく、グロブリンではなくアルブミン（主に肝臓で産生される）が低下したため、肝機能障害に起因する（図３６Ｅおよび３６Ｆ）。興味深いことに、グルコースレベルは、主に軽度の敗血症のマウスで有意に減少した（図３６Ｇ、ＭＳＳ臨床スコア１～４の場合はｐ≦０．０１）が、一般的にも減少した（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．０００１）。この現象は、糖新生の肝機能障害に関連している可能性がある。

敗血症マウスにおける顕著な血小板減少症およびリンパ球減少症。血液系は、敗血症で最初で最も影響を受けたものの１つである。敗血症患者の血液学的異常としては、血小板減少症、リンパ球減少症および好中球減少症または好中球増加症が挙げられ、これらはすべて、予後不良に関連する。ＣＬＰマウスも同様である。したがって、敗血症マウスの血液学的機能障害は、赤血球（ＲＢＣ）、血小板、白血球（ＷＢＣ、一般集団と亜集団の両方）、およびその他のパラメータ（ヘモグロビン、ヘマトクリット、および細胞体積）を含む全血球数によって評価された。表２４Ａおよび２４Ｂに見られるように、血液系に対する最も劇的な効果は、ナイーブマウスと比較して、ＣＬＰ－マウス血小板数の急激な減少（－６．４９×倍の変化）であった（ｐ＜０．０００１）。この血小板減少症は、ＭＳＳ臨床スコア（ρスピアマン＝－０．７０９９）と強い相関があり、中等度および重症の敗血症のマウスでより顕著であり、血小板数の中央値は１００×１０^３／μｌ未満であった（図３７Ａ、９５％ＣＩ範囲３７～２６０１０^３／μｌ）。ＣＬＰマウスと健康なマウスの間には、ＲＢＣ、ヘモグロビン、ヘマトクリット値、および細胞体積に差はなかった（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ＝非有意）。敗血症マウスでもわずかな好中球増加症が観察され、臨床スコアと中程度の逆相関が見られた（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．０３８２；ρスピアマン＝－０．４５３１）。しかしながら、敗血症マウスの総ＷＢＣ数は、健康なマウスよりも有意に低く（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．００１７）、ＭＳＳ臨床スコアと逆相関している可能性がある。興味深いことに、ＷＢＣ数が最も少なかったのは、重症敗血症のマウスではなく、軽度の敗血症のマウスであった（図３７Ｂ；ＭＳＳ臨床スコア１～４の場合はｐ≦０．０１）。これは主に、敗血症マウスの数が少ないリンパ球によるものであり（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．０２７５）、これは主に軽度の敗血症マウスの重症のリンパ球減少症に起因していた（図３７Ｃ、ｐ≦０．０１、ＭＳＳ臨床スコア１～４）。

ＣＬＰ後の異常な補体活性化パターン。補体免疫系は、感染に対する主要な応答者であり、敗血症では高度に活性化される。補体免疫系に対する敗血症の効果は、ＣＬＰの２４時間後にＣ３ａおよびＣ５ａの血清濃度を測定することによって評価された。予想通り、Ｃ５ａ血清濃度は、ＣＬＰマウスで上昇し、しかしながら、それらはＭＳＳ臨床スコアとは相関していなかった（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．０２１９）。図３７Ｄに見られるように、Ｃ５は、臨床スコアに関係なく、すべてのＣＬＰマウスで活性化していた。興味深いことに、Ｃ３ａレベルはＣＬＰマウスで有意に減少し、ＭＳＳ臨床スコアと強く相関していた（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．００２９、ρスピアマン＝－０．７１８３）。この減少は、重症の臨床スコアを持つマウスで最も有意であった（図３７Ｅ、ＭＳＳ臨床スコアが１３＋の場合はｐ≦０．０１２）。

ＣＬＰマウスは、有害な代謝変化を示した。敗血症の病因は劇的な代謝変化を伴うため、敗血症の主要な代謝および生体エネルギーマーカーのいくつかを調査し、それらの疾患の重症度との相関関係を見つけることは興味深いことである。ＣＬＰマウスの血中ｐＨは、ナイーブマウスよりも有意に低く、臨床スコアと強い逆相関があり（表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．００８９、ρスピアマン＝－０．７７９２）、重症敗血症のマウスの血中ｐＨ中央値は、ナイーブマウスと比較してさらに低く（図３８Ａ、それぞれ７．０４４および７．３２５）、呼吸器または代謝性アシドーシスを示唆している。上記のように（図３６Ｇ）、グルコースレベルは、敗血症マウスで有意に減少したが、これは低酸素状態にも関連している可能性がある（ブドウ糖は解糖経路で急速に異化される）。これらの現象をさらに調査するために、ＸＦ９６細胞外フラックスアナライザー（ＳｅａｈｏｒｓｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈＢｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ナイーブおよびＣＬＰマウスから単離された新鮮なＰＢＭＣの酸素消費率（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定した。これらのレベルは、ミトコンドリアの機能および解糖を直接反映する。ＣＬＰマウスからのＰＢＭＣの一般的なミトコンドリア呼吸は、特に重症の臨床スコアを持つマウスで損なわれ（図３８Ｂ）、最大呼吸の有意な減少（Ｐ＜０．０５、表３）、プロトンリークのわずかな増加、および予備呼吸容量の減少（ｐ＝非有意、表３）によって示される。

ＡＴＰ産生および結合効率の有意な低下も、ＭＳＳ臨床スコアと強く逆相関していた（表２６、ｐ≦０．００１、ρスピアマン＜－０．７および図３８Ｃ）。同じ細胞のＥＣＡＲ分析により、解糖機能の非常に軽度の変化が明らかになり、この変化は、解糖がわずかに増加した中等度の敗血症マウスでのみ見られた（図３８Ｄ、ＭＳＳ臨床スコア７～８．５）。臨床スコアと相関していた唯一の解糖パラメータは解糖予備能であった（表２６、ｐ＝非有意、ρスピアマン＝－０．４９９、図３８Ｅ）。解糖の増加の欠如と一致して、乳酸レベルの予想される増加（敗血症に典型的）は見られず、むしろわずかな減少が見られた（図３８Ｆおよび表２４Ａおよび２４Ｂ、ｐ≦０．０２５５）。敗血症マウスからのＰＢＭＣが損傷したミトコンドリア呼吸から解糖経路に移行できないことは、それらの疾患の重症度と免疫系のエネルギー需要を満たすことができないことを反映している。

まとめると、これらの結果は、重症敗血症のこのＣＬＰモデルでは、臓器機能障害の有意に変化したパラメータの大部分が、ＭＳＳ臨床スコアと強く相関していることを示す。これらのマーカーは、敗血症で損傷を受けた５つの主要な系および臓器を網羅している。さらに、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいことに基づいて、臨床スコアと強い相関関係があるすべてのマーカーを重症敗血症の予後に使用できる（表２４Ａおよび２４Ｂ、ＡＵＣ＞０．８４０）。したがって、ＭＳＳ臨床スコアリングシステムは、マウスの病態生理学的状態を強く反映しており、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療の有効性を評価するために使用できる。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳをエルタペネムに添加すると、ＣＬＰマウスの生存率が劇的に増加した。アポトーシス細胞は、誇張されたサイトカイン／ケモカイン応答を恒常性に戻すことが示されたため、ＣＬＰ誘発性敗血症マウスをＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療することで、敗血症の潜在的な療法として、免疫応答のリバランスを試みることが想定された。上記の方法に詳述されているように、マウスは敗血症を誘導するためにＣＬＰ手順を受けた。イソフルラン麻酔器を使用したＣＬＰ手順からのマウスの周術期生存率は高いとみなされ、５４匹のマウスのうち３匹（５．５％）だけが、手順後の最初の２４時間（６．５～２０時間の間隔）に死亡し、研究から除外された。対照群（ビヒクル注射のみのＣＬＰマウス）の１６匹中１５匹のマウス（９４％）は、ＣＬＰの２４～７２時間後に敗血症で死亡した。ＣＬＰ対照群と比較して、ビヒクル対照によるエルタペネム治療（ｎ＝１５）はマウスの生存に有意な影響を与えず、生存期間の中央値はわずかに高く（Ｐ＞０．９９、それぞれ３１時間および４８時間）、同様の死亡率は９３％であった。

初期結果

図３３Ａに示すように、抗生物質治療は、対照群（ＣＬＰのみ、ｎ＝１６）と比較して、マウス（ＣＬＰ＋エルタペネム＋ビヒクル、ｎ＝１５）の死亡率を改善する有意でない傾向を示した。抗生物質およびＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの組み合わせでＣＬＰマウスを治療すると、死亡率が大幅に遅延し、６０％の動物で死亡が予防された（ＣＬＰ＋エルタペネム＋Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ、ｎ＝２０、ｐ＜０．００１）。このモデルでは、マウスの９０～１００％が、５０時間以内に敗血症で死亡する。対照群と比較して、治療群は、生存率の約１０倍の改善を反映した（ログランク分析でｐ＜０．００１）。図３３Ｂに示すように、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療したマウスの臨床スコアは有意に低く、優れた臨床状態を示す。

最後に、血清サイトカイン／ケモカインの臨床スコアは、初期のインビボ測定値と相関し、図３３Ｃに示すように、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、単球／マクロファージおよび樹状細胞の活性化に関連する炎症誘発性サイトカイン／ケモカインをダウンレギュレートした。前臨床試験では、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、炎症誘発性サイトカイン／ケモカインを減らし、最初の免疫応答に続いて敗血症に関連する過剰な免疫応答をリセットすることにより、敗血症の動物モデルの死亡を遅らせ、予防した。

利用すべき正確な用量を決定するために、ＣＬＰモデルにおけるＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの用量依存性を調べた。図３３Ｄに示すように、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ効果は、１×１０^６細胞および３×１０^６個の細胞を使用して、明らかになった。しかしながら、６×１０^６個の細胞でそれが使用されるべき最小用量を２５グラムマウスあたり１～６ｘ１０^６細胞の間にあることを示し、１０および２０×１０^６個の細胞から識別不能になった。図３３Ｅは、追加の投与量を示すこれらの所見を裏付けている。

２５グラムのマウスあたり１～６×１０^６Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの単回用量は、ヒトの４０～２４０×１０^６細胞／ｋｇ細胞の用量と同等である。骨髄移植後の合併症を予防することに焦点を当てた以前のヒトの研究では、７０×１０^６アポトーシス細胞／ｋｇは、ヒトでの部分的な効果を引き起こすのに十分であり、１４０～２１０×１０^６アポトーシス細胞／ｋｇは、有意な効果を引き起こすと決定した（Ｍｅｖｏｒａｃｈｅｔａｌ．，２０１４，同上）。したがって、１４０×１０^６細胞／ｋｇの１回および２回の投与量を検討する必要があり、最高用量は（１４０×１０^６／ｋｇの２回に等しい用量で）２８０×１０^６／ｋｇであることが結論付けられた。

初期の結果は、イソフルラン麻酔器を使用したＣＬＰ手順からのマウスの回復率が非常に高いことを示した。手順後の最初の夜に死亡したのは、４２匹のマウスのうち３匹だけであった（手順後６．５～２０時間の間隔で、周術期死亡率による異なる群を参照せずに、研究から除外された）。

対照群の１６匹のマウスのうち１５匹（ビヒクル注射のみのＣＬＰマウス）は、ＣＬＰの２４～５１時間後に敗血症で死亡した（９４％）。ビヒクル対照（ｎ＝１５）によるエルタペネム治療は、マウスの生存を３０～９７時間（ｐ＝非有意）にわずかに延長し、同じ生存率で、１５匹中１４匹が死亡した（６．６％）。エルタペネムと組み合わせたＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療は、マウスのＣＬＰ誘発性敗血症生存を有意に延長した（Ｐ＜０．００１、ログランク、生存の１０倍の増加）。エルタペネムと組み合わせたＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療されたマウスは、ＣＬＰの２９～１４６時間後に死亡した（ｎ＝２０）。さらに、マウスの６０％は、７日目でも良好な状態で生存した（実験の終了、ログランクｐ値＜０．００１）。

各群の典型的なマウスのサイトカイン／ケモカインレベルを図３３Ｃに示す。

用量依存性を確認するために、１００万および３００万のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳでも重症敗血症に効果があることが示された。

フォローアップ分析

上記のように、エルタペネムと組み合わせたＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ治療は、ＣＬＰ誘発性敗血症後のマウスの生存を有意に延長した（図３９Ａ（図３３Ａに示されているように、有意性が追加される）、＊＊＊Ｐ≦０．０００５、ログランク試験）。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳおよびエルタペネムで治療されたマウスのうち、２０匹中８匹（４０％）がＣＬＰ後２９～１４６時間以内に死亡した。しかしながら、大多数のマウスは、ＣＬＰ後６～８日の実験終了時に生存し、生存期間中央値は１６０時間と有意に増加した（図３９Ｂ、Ｐ≦０．００７４、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分散分析、ダンの検定での多重比較調整済み；９５％ＣＩ：４８時間～１７２時間）。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、敗血症の重症度を軽減する。マウスの生存率は、臨床スコアと強い逆相関があった（ｒ－ピアソン－０．９２４；＊＊＊ｐ＜０．０００１）。したがって、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳおよびエルタペネムによる治療は、臨床症状の出現を実質的に軽減した。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療したマウスの最終的な臨床スコアは、ＣＬＰ対照群およびエルタペネムのみで治療したマウスよりも有意に低かった（図３９Ｃ；ＭＳＳプラトー値はそれぞれ７．７８、１４．８１、および１４．３７；＊＊＊ｐ＜０．０００１、通常の一元配置分散分析）。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの用量依存的で有益な効果も観察され、マウスあたり１×１０^６～２０×１０^６細胞用量のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳで治療されたＣＬＰマウスは、ビヒクル治療ＣＬＰマウスより４２．８５％～８７．５％長く生存した（図３９Ｄ（図３３Ｅにおいて上で示されるように有意差が追加される、Ｐ≦０．０１１５、ログランク試験））。マウスあたり１００万および３００万のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞の低用量でさえ、重症敗血症に明らかな効果があったが、６００万以上のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞を使用した場合にのみ強力な効果が見られた。３００万～６００万のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞の線量は調べられなかった。

敗血症の重症度に対するＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの効果は、免疫応答のリバランスによって達成される。従来は、ＣＬＰモデルの敗血症の進行に対する単一のアポトーシス細胞注入の劇的な効果は、単球、マクロファージ、および樹状細胞との相互作用を介した免疫系のリバランスに起因することが示唆された（ＴｒａｈｔｅｍｂｅｒｇａｎｄＭｅｖｏｒａｃｈ，２０１７、同上）。この概念を調べるために、ＬｕｍｉｎｅｘＭｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＣＬＰに続いて血清サイトカイン／ケモカインの幅広いパネルを試験した。表２８に要約されているように、３３個の異なるサイトカインおよびケモカインレベルは、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して、ＣＬＰマウスにおいてＣＬＰの２４時間後で上昇した。

興味深く、予期せぬことに、エルタペネム抗生物質単独での治療は、サイトカイン／ケモカインレベルに有益な効果をもたらさないが、エルタペネムおよびＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの併用治療は、敗血症誘発後２４時間、さらには４８時間でサイトカイン／ケモカイン放出を弱め、さらには消滅させた（図４０Ａ～４０Ｌ）。サイトカイン／ケモカイン放出の減少は、炎症促進性および抗炎症性サイトカイン／ケモカインの両方で観察された。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのサイトカインストームリバランス効果は、マウスの生存および敗血症の重症度に対するＡｌｌｐｃｅｔｒａ－ＯＴＳとエルタペネムの併用治療の効果によく対応した。これらの発見は、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳが敗血症で発生する誇張されたサイトカインストームを打ち破り、免疫応答のリバランスよってその効果を与えることを強く示唆する。

考察および結論：

自然免疫系をトリガーすると、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰのレパートリーのレベルおよび変動、ならびに活性化される結果として生じるシグナル伝達経路によって制御される、共通の応答パターンが保証される。経路の補完的な性質は、一般的なグラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、およびウイルス感染、ならびに組織損傷に対する重複しているが固有の初期炎症反応を説明している。

敗血症は、一般に、補体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＯＤ様受容体、ＲＩＧ様受容体、マンノース結合レクチン、およびスカベンジャー受容体によるＰＡＭＰまたはＤＡＭＰのいずれかの同時認識によって開始される。認識は、冗長で補完的な活性を伴う複雑な細胞内シグナル伝達システムを誘導し、これらの複数のシグナル伝達経路の活性化は、最終的に、炎症、獲得免疫、および細胞代謝に関与するいくつかの一般的なクラスの遺伝子の発現につながる。アポトーシス細胞は、動物モデルとインビトロモデルの両方で、ＰＡＭＰとＤＡＭＰに由来する抗炎症性サイトカインと炎症誘発性サイトカインの両方のダウンレギュレーションを伴うサイトカインストームに有益な効果をもたらすことが示された（例えば、上記の実施例２～８を参照）。アポトーシス細胞のクリアランスは、免疫恒常性を可能にし、一般にマクロファージと樹状細胞（ＤＣ）の両方の非炎症状態をもたらし、敗血症におけるほとんどすべての免疫誘発機序の末梢恒常性の維持に寄与する。

敗血症のこの研究では、敗血症のＣＬＰ誘発性マウスモデルが使用され、ヒト敗血症を首尾よくエミュレートした。このモデルは、急性多臓器障害を伴う重症敗血症をシミュレートした。重要なことに、Ｓｈｒｕｍｅｔａｌ（Ｓｈｒｕｍｅｔａｌ．，２０１４、同上）から採用されたＭＳＳ臨床スコア法を使用して、多臓器分析と並行して疾患の重症度を評価し、臓器機能障害のパラメータと疾患の重症度との相関を評価した。実際、ＣＬＰマウスは、低血圧、心拍出量の低下、肺機能障害、および臨床スコアと相関するＡＫＩ、ＡＫＬ、血小板減少症を有した。これらの心血管および肺の不全は、重症敗血症および敗血症性ショックの患者、およびマウス敗血症モデルで十分に報告されている。

補体系は、細菌感染に対する自然免疫応答の活性化を仲介する。しかしながら、この系は、敗血症で過度に活性化され、有害な影響をもたらす可能性がある。したがって、高レベルの補体タンパク質Ｃ３ａおよびＣ５ａが敗血症患者で検出された。Ｃ５ａの過剰な産生は、好中球機能の障害や過炎症などの有害な影響を引き起こすが、敗血症患者の一部のコホート研究では、Ｃ３ａレベルの上昇と生存またはＣ３枯渇と高い死亡率との関連が示された。Ｃ３の反対の保護効果およびＣ５の有害な効果は、ＣＬＰ後のＣ３^－／－およびＣ５^－／－またはＣ３ａＲ^－／－およびＣ５ａＲ^－／－のマウス敗血症モデルで十分に実証され、これらの研究では、Ｃ３欠損マウスは、ＷＴおよびＣ５欠損動物と比較して生存率が最も低かった。さらに、Ｃ５ａＲ^－／－マウスは、グラム陰性菌血症に耐性があったが、Ｃ３ａＲ^－／－はこの感染症に対してはるかに感受性が高かった。

興味深く、驚くべきことに、この研究の結果は、これらの相反する効果を裏付けているが、Ｃ５ａのレベルの上昇とＣ３ａのレベルの低下は、モデルの敗血症の重症度に対応しているようである。この現象の説明は、好中球がＣ５ａ受容体のみを有するのに対し、マクロファージはＣ５ａＲとＣ３ａＲの両方を有するという事実にあるかもしれない。

敗血症の病因は、代謝恒常性の大きな変化と強く関連する。呼吸器および心臓血管の機能障害、ならびに栄養失調は、エネルギー危機につながるが、免疫系の過剰活性化はエネルギー需要を大幅に高める。最近の研究は、炎症および敗血症における活性化された白血球の増大するエネルギー需要を満たすために、酸化的リン酸化から好気性解糖への代謝切り替えの証拠を提供している。したがって、好気性解糖の主な副産物である乳酸は、敗血症患者および敗血症のインビボ動物モデルの両方で大幅に増加することが見出された。高血糖症と診断されたほとんどの敗血症患者とは対照的に、ＣＬＰベースの敗血症モデルのマウスは、ここでも観察されるように、低血糖症を示す。この低血糖症は、免疫細胞による好気性解糖のための急速なグルコース異化作用の結果であると推測された。これは、ＣＬＰ後の炎症誘発性サイトカインプロファイルによって裏付けられ、しかしながら、ｐＨの大幅な低下が見られたものの、驚くべきことに、予想される高乳酸血症を伴わなかった。ＰＢＭＣのミトコンドリア呼吸機能および解糖能力を詳しく調べると、ＣＬＰマウスのミトコンドリアが大きく損傷していることが明らかになった。酸化的リン酸化によるエネルギー生産の欠陥は非常に深刻であり、代替の解糖経路では救済できなかった。解糖を加速できないこと、および明らかな低血糖症は、ＣＬＰマウスの顕著な肝不全とともに、ミトコンドリア機能障害および重症の糖新生障害によって説明することができる。

全体として、敗血症で損傷を受けた５つの主要な系および臓器を網羅する、臓器機能障害の有意に変化したマーカーの大部分も、ＭＳＳ臨床スコアと強く相関していた。この相関関係により、ＣＬＰマウスモデルの臓器機能（または機能障害）を反映する代理方法として、ＭＳＳ臨床スコアシステムを使用できるようになった。

このモデルを使用して、驚くべきことに、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの単回投与は、マウスの生存を有意に増加させるだけでなく、用量依存的に増加することがここに示された。さらに、エルタペネム抗生物質とＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの併用治療は、疾患の重症度をほぼ５０％有意に軽減した。さらに、高いサイトカインプロファイルを有していた骨髄移植を受ける患者において、Ａｌｌｏｃｅｔｒａは、１４０×１０^６細胞／ｋｇで始まる明確な用量依存性の効果を伴い、安全かつ効率的であることが示された。これが、現在の試験で敗血症患者にこの用量を選択するための基礎であった。

アポトーシス細胞の特性は、これらの機序のほとんどが活性化される敗血症、ならびにさまざまな自己免疫疾患、臓器移植、および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）における治療法としての使用の成功につながる機序を可能にするこれらの状態はすべて、サイトカインストームを特徴とする。実際、本研究では、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの有益な効果は、免疫系と相互作用し、免疫系のリバランスの能力を介して達成されることが明確に示される。

敗血症の治療における初期アポトーシス細胞の使用は、重症敗血症の生存に劇的で予想外の効果をもたらした。さらに、敗血症による死亡は、遅延させるだけでなく予防された。この驚くべき効果は、１００万個の細胞の線量でも観察された。さらに、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのケモカインに対する効果は、炎症誘発性サイトカインに対してのみ効果が期待されていたため、予想外であった。非常に高いスペクトルのサイトカインケモカインに対するそのような効果は、この研究の前には知られていなかった。

マウスモデルとヒト敗血症の類似性、および臓器機能障害の派生物としての敗血症の重症度をモニターする能力、ならびにＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの最初の有望な正の効果は、敗血症治療のための貴重な研究ツールを提供する。これらの結果は、敗血症の最初の効果的な療法として、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの将来の使用への道を開くかもしれない。

抗生物質治療、輸液蘇生、および昇圧剤の代わりに、免疫応答を調節することを目的とした治療が行われないことを強調する必要がある。むしろアポトーシス細胞は、免疫応答のリバランスの補助的かつ補完的な治療法である。

実施例１８：敗血症のインビボ第ＩＩ相試験

目的：上記の実施例１７に記載された動物におけるすべての前臨床安全性および有効性試験を完了した後、敗血症患者の臓器機能障害予防のための、無作為化、多施設、ビヒクル対照、比較、非盲検、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの安全性および有効性を評価する研究が実施される。

主な目的は、敗血症患者におけるＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの安全性を評価することである。副次的な目的は、予備的な臨床効果を評価し、提案された作用機序と生物学的効果をサポートすることである。探索的目的は、作用および生物学的効果の潜在的な機序をさらに探索することである。

各患者は、敗血症研究の標準として認められている２８日間追跡される。

方法：

この研究は、３つの臨床現場で実施される予定である。この研究には、研究に登録される３つの研究群（すべての群でｎ＝４２）が含まれ、２つの群は１回または２回のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ用量で治療され、１つの群はビヒクル（対照群）で治療される。各群の患者は、敗血症の施設内標準治療（ＳＯＣ）を使用して治療される。

結果：

ヒトの敗血症の治療の成功は、生存率の増加、サイトカインに対する抗炎症効果、および臓器の損傷または障害の減少が見られる、マウスの前臨床試験で提供された軌道に従うことが期待される。

実施例１９：第Ｉ相試験：Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ（Ｐ－ＳＯＦＡ－１）による敗血症関連臓器機能障害の予防

目的：

主な目的：敗血症患者におけるＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの１回投与および２回投与の安全性を評価すること。

副次的な目的：予備的な臨床効果を評価し、提案された作用機序と生物学的効果をサポートすること。

探索的目的：可能な追加の作用機序を探索すること。

方法：

研究設計：敗血症患者における１回および２回のＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ用量の非盲検。（Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの投与量の調製については、以下を参照）集中治療室（ＩＣＵ）または中間治療室（ＩＭＵ）に入院する予定だったため、６人の適格な患者が特定され、緊急治療室（ＥＲ）で募集された。患者は、治験薬（ＩＰ）投与後２８日間、安全性と有効性の評価のために追跡された。

最初の３人の患者に敗血症基準を満たす時間後２４±６時間以内に１４０×１０^６±２０％Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞／ｋｇの静脈内（ＩＶ）注入によってＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの１回の用量を投与した－下記参照（時間０）。

１４日後（包括的）、追加の３人の患者が募集され、上記のように１４０ｘ１０^６±２０％細胞／ｋｇのＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの１回の静脈内投与を受けた。

１４日後（包括的）に、追加の３人の患者（患者４～６）のフォローアップデータがＤＳＭＢに提出される。ＤＳＭＢの評価と推奨事項はＭｏＨに提出される。ＭｏＨの承認とＥＣへの通知に続いて、さらに４人の患者が採用される。これらの４人の患者（患者７～１０）には、１４０ｘ１０^６±２０％Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ細胞／ｋｇを２回投与する。最初は、敗血症の診断後２４±６時間以内、２番目は最初の治療後４８±６時間以内。

すべての研究患者を、ＳｕｒｖｉｖｉｎｇＳｅｐｓｉｓＣａｍｐａｉｇｎ（Ｌｅｖｙｅｔａｌ．（２０１８）ＴｈｅＳｕｒｖｉｖｉｎｇＳｅｐｓｉｓＣａｍｐａｉｇｎＢｕｎｄｌｅ：２０１８Ｕｐｄａｔｅ．ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ．，４６（６）：９９７－１０００、Ｒｈｏｄｅｓｅｔａｌ．（２０１７）ＳｕｒｖｉｖｉｎｇＳｅｐｓｉｓＣａｍｐａｉｇｎ：ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＳｅｐｓｉｓａｎｄＳｅｐｔｉｃＳｈｏｃｋ：２０１６．ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ．２０１７Ｍａｒ；４３（３）：３０４－３７７）に基づく、敗血症の施設内標準治療（ＳＯＣ）を使用して治療した。

研究手順

この研究には、事前スクリーニング、スクリーニング、治療、およびフォローアップ期間が含まれた。

事前スクリーニング期間

標準的なローカルＥＲ手順に基づいて、患者は敗血症の臨床基準を満たしていると特定され、敗血症ＳＯＣを開始した。敗血症診断の時間は、時間０として記録された。

スクリーニングおよび適格性確認期間（時間０～２４±６時間）

口頭のグラスゴー昏睡スコア（ＧＣＳ）が５で、総ＧＣＳが１３を超える患者のみが研究への参加を求められた。インフォームドコンセントフォーム（ＩＣＦ）に患者が署名した後、スクリーニング手順が実行された。スクリーニング手順としては、人口統計データ、完全な疾患関連の病歴および併用薬の収集、血液検査（生化学、血液学および凝固）、尿検査、バイタルサイン（収縮期および拡張期血圧（ＢＰ）、呼吸数（ＲＲ）、体温（Ｔ）、心拍数（ＨＲ）および酸素飽和度）、身体検査、１２誘導ＥＣＧ、感染症スクリーニング、心エコー図（必要な場合）、妊娠検査（出産の可能性のある女性の場合）、ならびにｑＳＯＦＡおよびＳＯＦＡスコアの計算が挙げられる。標準治療の一環として患者が同意書に署名する前にＥＲで実施された手順が受け入れられた。スクリーニング手順と組み入れ基準および除外基準の検証に続いて、適格性が確認された。

スクリーニング手順に加えて、ベースライン試験が実施され、尿アルブミン／クレアチニン比、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア計算、ドナー特異的抗体、自己免疫血清学および炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの血液試料、細胞表現型、白血球の転写データ、免疫機能とアポトーシス、血清と白血球の代謝、無細胞ＤＮＡと内分泌パラメータが挙げられた。

治療期間（１回の投与で治療された患者の場合は１日目、２回の投与で治療される患者の場合は１日目から３日目）：

治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療の前に、患者はＩＣＵまたはＩＭＵのいずれかに入院し、敗血症のためにＳＯＣで治療されている必要がある。

前投薬：患者は、次のように、治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の前に前投薬を受けた。
－ＩＶ注射としてのメチルプレドニゾロン４０ｍｇ－Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ輸血の５±４時間前。
－ＩＶ注射として１２．５ｍｇのプロメタジン－治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の３０±３０分前。

１回投与で治療された患者（患者１～６）：敗血症基準を満たしてから２４±６時間以内（時間０）、患者は上記のように前投薬を受け、続いて最大速度１０２ｍＬ／時で容量ポンプを使用した、３７５ｍｌのリンガー乳酸溶液中の１４０ｘ１０^６±２０％細胞／ｋｇのＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳのＩＶ注入によるＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳの１回投与を受けた。

治療日を１日目とした。治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）の注入中およびその後の２４時間、手順は次のように実行される。
－バイタルサイン（収縮期および拡張期血圧（ＢＰ）、呼吸数（ＲＲ）、温度（Ｔ）、心拍数（ＨＲ）、および酸素飽和度）の測定が行われた－注入の最初の１時間の間、１５±１０分ごとに２時間目から治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入が完了するまで３０±１５分、注入完了後６±３時間ごと。

治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前の生化学および血液学の血液検査。

炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、細胞表現型、白血球の転写データ、免疫機能およびアポトーシス、血清および白血球のメタボロミクス、無細胞ＤＮＡ、内分泌学パネルおよびＥＬＩＳｐｏｔの血液試料は、治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前に収集される。

ＳＯＦＡおよびＧＣＳの計算－治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前に行われた。

２回の投与で治療された患者（患者７－１０：敗血症の診断後２４±６時間以内（時間０））、患者は上記のように前投薬を受け、その後に最初のＩＶ注入が行われ、最初の投与から４８±６時間後に行われる。治療は上記のように前投薬を受け、続いて２回目のＩＶ注入が行われる。すべての注入は、容量ポンプを使用して、最大速度１０２ｍＬ／時、１４０ｘ１０^６±２０％細胞／ｋｇのＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ、３７５ｍｌのリンガー乳酸溶液で投与される。

最初の投与の治療日は１日目として指定され、２回目の投与の治療日は３日目として指定される。治療期間中（１日目から３日目）の手順は次のように行われる。
－バイタルサイン（収縮期および拡張期血圧（ＢＰ）、呼吸数（ＲＲ）、温度（Ｔ）、心拍数（ＨＲ）、および酸素飽和度）の測定値は次の通りである：１日目と３日目：１５±１０分ごと注入の最初の１時間、治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入が完了するまで３０±１５分ごと、および注入完了後６±３時間ごと。２日目に６±３時間ごと。

血液検査（生化学および血液学）：
－１日目：治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前。
－２日目：最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の完了後２４±６時間。
－３日目：最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の完了後、２番目の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入前の４８±６時間。

炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、細胞表現型、白血球の転写データ、免疫機能とアポトーシス、血清と白血球の代謝、および無細胞ＤＮＡの血液試料は次の通りである。
－１日目：最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前。
－２日目：最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の完了後２４±６時間。
－３日目：２回目の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の６０±６０分前。

ＥＬＩＳｐｏｔ１日目－最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与の１日目から６０±６０分前。

１２誘導ＥＣＧ：２日目、最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の完了後２４±２時間。

ＳＯＦＡおよびグラスゴーコマスケール（ＧＣＳ）スコアの計算：１、２、および３日目。

フォローアップ期間（単回投与患者の場合は２日目から２８日目、２回投与患者の場合は４日目から２８日目）：

患者は、安全性と有効性の評価のために、最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療後２８日目に次のように追跡調査された。
－有害事象と併用薬：連続的に。
－バイタルサイン（収縮期および拡張期血圧（ＢＰ）、呼吸数（ＲＲ）、温度（Ｔ）、心拍数（ＨＲ）、および酸素飽和度）、次の通り：単回投与の場合－２日目と３日目に１日２回、入院中１日１回。２回の投与の場合－４日目と５日目に１日２回、入院中１日１回。患者が退院した場合、バイタルサインは７、１４、２８日目の訪問で測定される。
－血液検査（生化学および血液学）は、７日目まで１日１回、患者が入院している場合は１１±１、１４±１、１８±１、２１±１、２４±１、２８±２日に行われた。患者が退院した場合、これらの試験は７±１、１４±２、および２８±２回の訪問で測定された。
－炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン、免疫機能およびアポトーシス、血清および白血球のメタボロミクス、および２、３、４、７±１、１４±２および２８±２日目の無細胞ＤＮＡの血液試料。
－２、３、４、および２８±２日目の白血球の細胞表現型および転写データの血液試料。
－４±１日目および２８±２日目の内分泌学パネルの血液試料。
－１２誘導心電図：１回投与で治療された患者の場合は２日目、２回投与で治療された患者の場合は４日目（治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）投与後２４±２時間）、および１４±すべての患者で２および２８±２。
－ＳＯＦＡスコアは、２、３、７、１４±２、２８±２日目に記録された。
－ドナー特異的抗体、ＥＬＩＳｐｏｔおよび自己免疫血清学は２８±２日目に評価される。

研究期間：

参加した各患者について、研究期間は治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療から２８日であった。

研究対象集団：

この時点で、この研究には６人の患者が含まれ、合計１０人の患者を対象とした。

組み入れ／除外基準：

組み入れ基準：
－あらゆる原因からの感染の疑い、推定、または報告。
－抗生物質の開始。
－敗血症３の基準を満たす：合計ＳＯＦＡスコアによって識別される臓器機能障害の存在≧ベースラインより２ポイント上。
－成人男性または女性、１８～８５歳。
－ＧＣＳが１３を超え、口頭でのスコアが５。
－患者による署名された書面によるインフォームドコンセント。

除外基準：
－敗血症の診断前３０日以内の介入的治験試験への参加。
－敗血症の診断前３０日以内に入院を必要とする重大な外傷。
－外科的介入、または外科的介入の計画、または予定された治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）注入の前後３０日以内の入院。
－妊娠中または授乳中の女性。
－進行性または制御不良の悪性腫瘍、またはがんの積極的治療（化学療法または照射）後６か月未満。
－現在の入院前に６か月未満の生存が見込まれる患者として定義される末期患者（患者を担当する医師による評価）。
－既知の活動性の急性または慢性ウイルス感染症、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または他の慢性感染症。
－重症の肺高血圧症（≧４０ｍｍＨｇ）または呼吸器依存症を伴う既知の重症の慢性呼吸器の健康問題。
－既知の活動性上部消化管潰瘍または肝機能障害。これには以下が含まれるが、これらに限定されない。生検で証明された肝硬変。門脈圧亢進症；門脈圧亢進症に起因する過去の上部消化管出血のエピソード；または肝不全、脳症、または昏睡の以前のエピソード。
－敗血症の診断前６か月以内に、既知のＮｅｗＹｏｒｋＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）クラスＩＶ心不全または不安定狭心症、心室性不整脈、活動性虚血性心疾患、または心筋梗塞。
－既知の免疫不全状態または免疫抑制性であることが知られている薬剤。
－臓器同種移植または幹細胞移植の既往歴。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ製品、投与経路、および剤形

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、ドナーの初期アポトーシス細胞で構成される細胞ベースの治療薬である。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ製品には、少なくとも４０％の初期アポトーシス細胞を含む液体懸濁液の形で同種異系ドナー単核濃縮細胞が含まれた。初期アポトーシス細胞は、上記の実施例１に従って調製された。懸濁液をリンガーの乳酸溶液で調製し、注入の４５±２５分前まで２～８℃で保存し、その後は室温で保存した。Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、照射を受け、４８ｍＬ／時間の開始速度（１６滴毎分）で、容積ポンプを用いて投与された転送パック３７５ｍＬの総容量で、レシピエント体重１ｋｇ当たり１４０ｘ１０^６±２０％の細胞が含まれており、１５～２５分ごとに１５ｍＬ／時（追加で毎分５滴）ずつ徐々に増加し、次のように最大速度１０２ｍＬ／時になる。６３（２１滴）ｍＬ／時；７８（２６滴）ｍＬ／時間；９３（３１滴）ｍＬ／時間；１０２（３４滴）ｍＬ／時間。

治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）の投与中、体液量減少のために医学的に適応がない限り、リンガーの乳酸や生理食塩水などの他のＩＶ輸液は並行して投与されなかった。

Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳは、製造プロセスが完了してから７２時間以内に患者に投与された。

標準治療（ＳＯＣ）

ＳＯＣは、ＳｕｒｖｉｖｉｎｇＳｅｐｓｉｓＣａｍｐａｉｇｎガイドライン（Ｌｅｖｙｅｔａｌ．，２０１８、同上、Ｒｈｏｄｅｓｅｔａｌ．，２０１７、同上）に準拠しており、制度的基準に基づく差異を考慮に入れる。施設内ＳＯＣには、アルブミンを含むまたは含まない晶質液、承認された適応症に応じた他の血液製剤、昇圧剤および変力剤、抗生物質、抗ウイルス剤または抗真菌剤、および必要に応じてコルチコステロイドを含む静脈内（ＩＶ）輸液が含まれる場合がある。

前投薬

患者は、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ輸血の前に、ＩＶ注射として４０ｍｇのメチルプレドニゾロンと１２．５ｍｇのＩＶプロメタジンを投与された。

併用薬

禁止されている薬：１０ｍｇ／日を超える慢性コルチコステロイド、アザチオプリン、シクロスポリン、シクロホスファミド、およびあらゆる生物学的治療を含む重要な免疫抑制剤。

安全性エンドポイント（原発性）

安全性の評価は、臨床転帰と、有害事象（ＡＥ）、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、および致命的なＳＡＥの参加者数を決定することによって達成された。

有効性エンドポイント／結果測定（二次）

以下の有効性エンドポイントが研究期間を通して測定された：
－２８日間の研究期間中に記録された次の臓器機能またはサポート測定値のいずれか１つ：
〇人工呼吸器のない日、および／または
〇昇圧剤のない日、および／または
〇腎代替療法（透析）のない日および／またはクレアチニン≦ベースライン＋２０％の日、および／または
〇血小板数が１００ｘ１０９／Ｌ以上の日数、および／または
〇通常のＡＬＴおよびＡＳＴレベルの３倍以下および／または通常のビリルビンレベルの２倍以下の日、および／または
〇ＧＣＳ１５に戻る日。
－あらゆる原因による死亡。
－ＩＣＵまたはＩＭＵおよび／または病院での累積日数。
－ＣＲＰまでの時間＜２０ｍｇ／Ｌ。
－正常になるまでの時間＋２０％の乳酸レベル。

探索的エンドポイント

以下の探索的生物学的試験は、ベースライン時、および最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療後１、２、３、４、７、１４、および２８日目に測定された。
－炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン：ＭＩＰ－１ベータ、ＴＮＦアルファ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－２、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＭＩＰ－１アルファ、ＩＬ－２２およびＧＭＣＳＦ。
－免疫機能とアポトーシス：ＨＭＧＢ１、ヒストンレベル、および補体。
－血清および白血球のメタボロミクス：ピルビン酸、ＦＦＡ、解糖、ミトコンドリア機能、レプチン、グレリン、グルカゴン。
－無細胞ＤＮＡ

以下の探索的血液検査は、ベースライン時および１、２、３日目（２回投与で治療された患者の前の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療）、４、および２８日後の最初の治験薬（ＩＰ；Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ）治療：
－細胞表現型：Ｔｒｅｇ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫおよびＢ、単球、樹状細胞、およびＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＢＴＬＡの機能と発現。
－白血球の転写データ。

ＥＬＩＳｐｏｔは、ベースラインの１日目と２８日目に測定された。
－ベースライン時および１、４、２８日目の内分泌学パネル：コルチゾール、ＡＣＴＨ、ＦＴ３、ＦＴ４、ＴＳＨ、成長ホルモン、インスリン。

以下の探索的血液検査は、ベースライン時と２８日目に測定された。
－ドナー特異的抗体：パネル反応性抗体（ＰＲＡ）。

－自己免疫血清学パネル：ＡＮＡ、抗ＤＮＡ、抗ＲＮＰ、抗ＳＳＡ、抗ＳＳＢ、カルジオリピンＩｇＧおよびカルジオリピンＩｇＭ

統計分析

統計セクションで明示的に言及されているかどうかにかかわらず、すべての臨床評価からのデータがリストされ、適切な場合は、記述統計を使用して用量群およびその他の関心のあるカテゴリ情報によって要約される。

要約統計（算術平均、標準偏差、最小値、下位四分位数、中央値、上位四分位数、最大値、非欠測値の数）は、連続変数（各時点での絶対値とベースラインからの変化、必要に応じて）、カテゴリ変数のカウントとパーセンテージが表示される。必要に応じて、結果の表示には、シフトテーブル、プロット、統計的検定、または信頼区間が含まれる。

結果：

図４１Ａ～４１Ｃから図５０Ａ～５０Ｂに示されている結果は、重症敗血症の患者を対象とした進行中の第Ｉｂ相臨床試験からの陽性の中間有効性データを提供する。中間分析は、重症敗血症の合計４３人の患者（６人の治療を受けた患者と３７人の過去の対照）のデータセットに基づいており、すべてハダサ医療センターに入院する（図４１Ａ～４１Ｃおよび４２）。敗血症で集中治療室に入院した６人の患者は、集中治療室に入院したときに既製のＡｌｌｏｃｅｔｒａ（「ＯＴＳＡｌｌｏｃｅｔｒａ」；上記の初期アポトーシス細胞）を投与されたが、３７人の患者は標準治療を受けた対照と一致する２０１６年から２０１９年の間に治療を受けたが、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ治療を受けていなかった。

主要な安全性パラメータは、２８日での±死亡率であった。驚くべきことに、対応する対照群の１１／３７（２９％）と比較して、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ治療を受けた患者は死亡しなかった（０／６（０％））（図４３、４６Ａ、および４６Ｂ）。分析された有効性パラメータには、臓器不全の臨床ＳＯＦＡスコア（スコアが高いほど、さまざまな臓器の臨床状態が陰性）（図４８Ａ～４８Ｄ、４９Ａ～４９Ｂ、および５０Ａ～５０Ｂ）、および死亡率（図４６Ａ～４６Ｂ）、敗血症からの回復（図４４Ａ～４４Ｂおよび図４５）、集中治療室での入院日数（図４５および図４７Ａ～４７Ｂ）。

以下の表２９は、重症敗血症の患者へのＡｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ投与によって実証された強力な安全性と有効性プロファイルを示す中間結果の要約を示す。３７人の患者とＯＴＳＡｌｌｏｃｅｔｒａ治療群とのマッチングは、入院時の同様の臓器不全臨床ＳＯＦＡスコア、全体的な臨床状態、年齢層、性別、および重症敗血症（肺炎、血管内、または尿路感染症）の原因に基づいた。一致したすべての患者は、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ治療群と同じ病院で治療された。マッチング特性の要約を表３０に示す。

概要：第Ｉｂ相臨床試験の中間結果は、Ａｌｌｏｃｅｔｒａ－ＯＴＳ（「既成」）初期アポトーシス細胞を使用して敗血症の患者を治療する際の安全性と有効性に対する正の中間有効性を示す。死亡は観察されず、敗血症から回復するまでの時間（ＳＰＦＡスコア＜２までの時間）および入院期間は、過去の対照と比較して有意に短縮された。

本明細書に開示される特定の特徴が本明細書に図示され、説明されてきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に開示される真の趣旨に収まるように、すべてのそのような修正および変更を網羅することを意図することを理解されたい。

Claims

必要とする対象における敗血症の治療、予防、阻害、発生率の低減、改善、もしくは緩和、またはそれらの任意の組み合わせの方法であって、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を前記対象に投与するステップを含み、前記投与が、前記対象において前記敗血症を治療、予防、阻害、発生率を低減、改善、または緩和する、方法。
前記敗血症が、軽度、重症、急性、または高悪性度敗血症を含む、請求項１に記載の方法。
前記対象の生存が増加する、請求項１に記載の方法。
臓器不全もしくは臓器機能障害、または臓器損傷、またはそれらの組み合わせの発生率が低減される、請求項１に記載の方法。
前記臓器不全が、急性多臓器不全を含む、請求項４に記載の方法。
前記初期アポトーシス細胞集団が、
（ａ）単核に富む細胞集団、
（ｂ）２４時間超安定しているアポトーシス集団、
（ｃ）単核アポトーシス細胞集団であって、非静止非アポトーシス細胞の減少、任意の生きた非アポトーシス細胞の細胞活性化の抑制、もしくは任意の生きた非アポトーシス細胞の増殖の減少、もしくはそれらの任意の組み合わせを備えた、該単核アポトーシス細胞集団、または
それらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
前記初期アポトーシス細胞集団が、初期アポトーシス細胞のプールされた集団を含む、請求項１に記載の方法。
前記対象が、ヒト対象である、請求項１に記載の方法。
前記投与が、前記初期アポトーシス細胞集団の単回注入を含む、請求項１に記載の方法。
前記投与が、アポトーシス細胞集団の複数回注入を含む、請求項１に記載の方法。
前記投与が、静脈内投与を含む、請求項１に記載の方法。
追加の療法を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記追加の療法が、初期アポトーシス細胞の投与の前、同時、または後に投与される、請求項１２に記載の方法。
前記方法が、第一選択療法を含む、請求項１に記載の方法。
前記方法が、アジュバント療法を含む、請求項１に記載の方法。
前記方法が、前記対象の免疫応答のリバランスを含む、請求項１に記載の方法。
前記リバランスが、１つ以上の炎症誘発性サイトカイン／ケモカインの分泌を低減させることを含む、請求項１６に記載の方法。
前記リバランスが、１つ以上の抗炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌を低減させることを含む、請求項１６に記載の方法。
前記リバランスが、１つ以上の炎症誘発性サイトカイン／ケモカインおよび１つ以上の抗炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌を低減させることを含む、請求項１６に記載の方法。
前記方法が、前記対象におけるサイトカインおよびケモカインストームを予防、阻害、発生率を低減、または重症度を低減する、請求項１に記載の方法。