CN102908352A

CN102908352A - 特拉唑嗪或其盐在制备用于治疗败血症/脑卒中的药物中的用途

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Publication number: CN102908352A
Application number: CN2012103347823A
Authority: CN
Inventors: 袁利佳; 邢媛媛; 佟洁琼; 黄少林; 赵鸿莲; 许晓椿
Original assignee: Beijing Sinica Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Sinica Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明涉及特拉唑嗪或其盐或其溶剂化合物在制备用于治疗人败血症/脑卒中引起细胞凋亡症状的药物制剂。本发明人现在已出人意料发现特拉唑嗪及其相关盐类衍生物具有显著抑制细胞凋亡的作用。在败血症小鼠模型、缺血性脑卒中大鼠模型及体外对巨噬细胞的药效试验中表明其具有明显抑制细胞凋亡的药理活性。

Description

特拉唑嗪或其盐在制备用于治疗败血症/脑卒中的药物中的用途

发明领域：

本发明涉及特拉唑嗪或其盐或其溶剂化合物在制备用于治疗人败血症/脑卒中引起细胞凋亡症状的药物制剂。

背景技术：

特拉唑嗪是一种化学合成物质，该化合物最初公开于美国专利申请US19850805905；US4734418A，1987年美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗高血压(NDA#019057)，1994年美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗前列腺疾病(NDA#020347)。

特拉唑嗪，英文名称：Terazosin、Terazosin hydrochloride、Hytrine。盐酸特拉唑嗪，其化学名为：1-(4-氨基-6，7-二甲氧基-2喹唑啉基)-4-(四氢呋喃-2-甲酰基)哌嗪，单盐酸盐二水合物。分子式：C19H25N5O4·HCl·2H2O分子量：459.93。美国专利4251532公开了盐酸特拉唑嗪在高血压治疗中的作用。

本品为选择性α1受体阻滞剂，能降低外周血管阻力，对收缩压和舒张压都有降低作用；具有松弛膀胱和前列腺平滑肌的作用，可缓解良性前列腺肥大而引起的排尿困难症状，常用于治疗良性前列腺增生和高血压。但是在败血症/脑卒中病症中的治疗作用未见报道。

特拉唑嗪国内外专利背景说明

细胞凋亡(apoptosis)又称编程性死亡，是生物界重要的生命现象之一。从线虫至高等哺乳类动物，从胚胎至成人，从生理到病理，从生到死整个过程，体内不同的细胞多具有此种死亡形式。早在100多年前Carl Vogt已发现这种死亡形式。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名为凋亡(apoptosis)。其后在凋亡的形态学和生物化学等领域取得新的认识。近期的研究在3方面有明确的进展。首先，从研究小线虫(C.elegans)凋亡调节基因，证实凋亡的发展是由遗传基因控制，其中以Ced-9，Ced-3和Ced-4基因的作用最先确定，哺乳动物也有相应的同源基因。其次，阐明凋亡信号传递途径，特殊的死亡信号分子激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族(称为caspases)，诱导细胞凋亡。第三，研究了凋亡和一些疾病的关系，了解疾病发病机制及应用凋亡理论和实践来防治疾病。

一、细胞凋亡的形态学和生物化学改变

细胞凋亡的形态改变是多阶段的，首先是细胞缩小，胞质凝缩，内质网疏松并和胞膜融合，核糖体、线粒体等聚集，但结构无明显改变。染色质逐渐凝集成新月状，附在核膜周边，嗜碱性增强。以后细胞核固缩成均一的致密物，进而核碎裂，胞膜完整。继之核膜出芽，固缩染色质脱落，形成膜包凋亡小体(apoptoticbodies)。最终凋亡小体被周围吞噬细胞吞噬降解。

随着细胞凋亡形态的研究，细胞生化的改变也逐步被阐明。(1)钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+的增多，激活核酸内切酶的活性，蛋白激酶C在不同细胞类别和不同周期活性表现不一。(2)核酸内切酶激活把DNA内切成180碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象。(3)组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活。(4)细胞骨架如肌动蛋白的变化。(5)细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白受体增加，磷脂酰丝氨酸的外露改变细胞表面的生化特性。

二、凋亡产生的3步骤

凋亡的发生和发展概括为3个阶段：信号传递阶段、中央调控阶段和结构改变阶段。

1.信号传递：诱导凋亡的细胞外因素(包括环境因素和体内因素)众多，进入细胞内是经信号传递阶段。各种诱导凋亡因子进入细胞内的途径是多种多样的，其中主要的是通过受体介导。接受凋亡信号的受体位于细胞表面，称为死亡受体(death receptors，DR)，当死亡配体(death ligands)和它结合激活死亡蛋白酶系统(death caspase)可以在几小时内诱导细胞凋亡。死亡受体有肿瘤坏死因子受体基因家族，CD95(Fas或Apol)和DR(或APO)系列。死亡受体分为细胞膜外和胞质两区域，前者传导死亡信号，后者称死亡区域(death domain)，参与激发蛋白酶系列和细胞产生凋亡调节机制。

2.中央调控：凋亡激发因子作用在线粒体，使线粒体内死亡基因ced-3/白细胞介素1β转化酶(ICE)和ced-4(ced为线虫基因，ICE为哺乳类基因)及死亡抑制基因ced-9/bcl-2(ced-9在线虫体内，哺乳类动物相应基因为bcl-2)激活，两者何居优势，决定细胞存活或凋亡。当ced-9/bcl-2和ced-4(连接蛋白)和ced-3/ICE相结合，ced-3不能活化，防止一连串caspases级联反应，细胞存活；当ced-9/bcl-2被促凋亡因子EGL-1结合，bcl-2失活，ced-4使ced-3/ICE活化引起细胞凋亡。线粒体释放细胞色素c(Cyto c)亦可使caspases活化，产生蛋白溶解，引起细胞凋亡。

3.细胞结构改变：在前两阶段基础上，凋亡细胞出现特异的形态变化如细胞皱缩，核致密，微绒毛消失。生化特点是多种酶活化。细胞核的改变，认为是caspases活化的DNA酶(CAD)进入细胞核内使染色体的DNA断裂引起细胞死亡。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD。

最近国内外研究表明，特拉唑嗪在前列腺癌细胞凋亡中具有诱导作用(例如可参见《海南医学》，2009年12期)；特拉唑嗪和其他药物如多沙唑嗪或托特罗定等联合用药具有治疗原发性高血压和前列腺疾病的作用(可参见《中国新药杂志》，2001年9期；《广东医学》2008年10期)；

特拉唑嗪在其他疾病相关的细胞凋亡中作用机理研究多数集中于研究特拉唑嗪对细胞凋亡的诱导作用(例如盐酸特拉唑嗪诱导PC-3细胞凋亡，《临床泌尿外科杂志》，2004年11期)，而显著抑制败血病和脑卒中等病症细胞凋亡的作用机制未见报道。

发明内容：

本发明人现在已出人意料发现特拉唑嗪具有显著抑制细胞凋亡的作用。因此，本发明涉及特拉唑嗪或其盐或其溶剂化合物在制备用于治疗细胞凋亡的药物制剂。

具体地说，本发明涉及特拉唑嗪或其盐可以有效治疗和/或预防败血病和脑卒中及其并发症引起的人体细胞凋亡。

在本发明中，术语细胞凋亡特指细胞凋亡症状是由脑卒中和败血症引起的细胞凋亡。

本发明中所用的特拉唑嗪盐指特拉唑嗪与许多种有机和无机酸和碱形成药学上可接受的酸和碱加成盐，并包括制药工业上常用的生理上可接受的盐.这类盐也是本发明的一部分.这类药物可接受的盐包括盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、苯基乙酸盐、三氯乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、羟基乙酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盆、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲用酸盐、烟酸盆、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、三邻苯二甲酸盐(tera的thalate)，磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盆、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、统由酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硫酸盐、苯破酸盐、氯苯硝酸盐、酒石酸盐等，优选的盐为特拉唑嗪盐酸盐。

本发明的化合物-特拉唑嗪用普通的赋形剂、稀释剂或载体配制，并压制成片，或配制成便于口服或肌肉或静脉内给药的药剂或溶液剂。还可经皮施用，并可以配成缓释剂型等，如口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型，更具体讲，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式.

可以通过本领城已知的方法制备药物制剂。例如，本发明化合物可用普通赋形剂、稀释剂或载体配制，并制成片剂、胶囊剂、悬液剂、粉剂等。适于这些配方的赋形剂、稀释剂和载体包括下列物质：填充剂和增量剂如乳糖、微晶纤维素、淀粉、蔗糖、甘露醇以及硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素等；溶解抑制剂如石蜡；助溶促进剂如季胺化合物；表面活性剂如十六烷醇、单硬脂酸甘油醋、吸附载体如高岭土和膨润土；以及润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和微粉硅胶。

本发明的化合物也可配制成便于口服的醒剂或溶液剂或者配成适于胸外施用的溶液剂，例如适于肌肉、皮下或静脉内途径施用的溶液剂。此外，本发明的化合物非常适于作为缓释剂型.这些制剂可以适当组成，以使它们能在一段时间内只释放活性成分或者优选在肠道特定部分释放活性成分，缓释制剂包括各种可生物降解但不易溶于水的高分子材料，包括但不限于聚丙交酷一乙交酷，聚乳酸、聚乙醇酸、聚3-经基丁酸醋，聚内酷，聚酸配、聚轻基丁酸酷一经基戊酸酷聚丙烯萄聚糖、聚乳酸一聚乙二醇、聚经乙酸一聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等。其分子量2,000-1,000,000道尔顿之间。

根据本发明，治疗临床细胞凋亡疾病所需特拉唑嗪的具体剂量，将根据病情、的严重程度，施药途径和相关因素决定，这由主治医生确定。一般可接受的和有效的每日剂量从约0.5至500mg/d，且更常见的是从约1至200mg/d。将上述剂量给需要治疗的患者每天施用一次至三次或者按照需要采用缓控释制剂以有效地治疗临床细胞凋亡疾病，

附图说明：

图1是特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例1中特拉唑嗪磷酸盐的核磁共振谱图。

图2是特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例2中特拉唑嗪硫酸盐的核磁共振谱图。

图3是特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例3中特拉唑嗪甲磺酸盐的核磁共振谱图。

图4是药效实施例1中特拉唑嗪衍生物(Tx)对败血症小鼠存活率的影响。

图5是药效实施例3中特拉唑嗪衍生物(Tx)对凋亡细胞细胞活性的影响

具体实施方式：

特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例1：特拉唑嗪磷酸盐制备

取特拉唑嗪(30克，0.0775mol)，甲醇2000ml，磷酸2ml，投入反应瓶，加热至75℃，保持1h，减压蒸去溶液，可得固体。用甲醇重结晶，得白色结晶。

特拉唑嗪磷酸盐见附图1，熔点为：250-254℃。

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)2.014(m，2H)；1.850(m，2H)；3.57(m，2H)；3.526(m，2H)；3.538(m，2H)；3.726(m，2H)；3.746(m，3H)；3.783(m，3H)；4.716(q，1H)；6.816(s，1H)；7.46(s，1H)；7.376(s，1H).

特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例2：特拉唑嗪硫酸盐制备

取特拉唑嗪(30克，0.0775mol)，甲醇2000ml，硫酸3ml，投入反应瓶，加热至75℃，保持30min，减压蒸去溶液，可得固体。用甲醇重结晶，得白色固体。

特拉唑嗪硫酸盐核磁见附图2，熔点为：219-227℃。

1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)1.845(m，2H)；1.874(m，2H)；3.756(m，2H)；3.773(m，2H)；3.784(m，2H)；3.789(m，2H)；3.812(m，2H)；3.821(m，3H)；3.913(m，3H)；4.762(q，1H)；7.165(s，1H)；7.686(s，1H)；11.638(s，1H).

特拉唑嗪盐类衍生物合成实施例3：特拉唑嗪甲磺酸盐制备

取特拉唑嗪(30克，0.0775mol)，甲醇2000ml，甲磺酸6ml，投入反应瓶，加热至75℃，保持30min，减压蒸去溶液，可得固体。用甲醇重结晶，得白色固体。

特拉唑嗪甲磺酸盐核磁见附图3，熔点＞270℃。

1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ(ppm)1.808(m，2H)；1.840(m，2H)；3.727(m，2H)；3.756(m，2H)；3.767(m，2H)；3.773(m，2H)；3.784(m，2H)；3.853(m，3H)；3.914(m，3H)；4.763(q，1H)；7.213(s，1H)；7.689(s，1H)；8.730(s，1H)；8.834(s，1H)；11.697(s，1H).

制剂实施例1：治疗败血症引起的细胞凋亡特拉唑嗪注射剂的制备。

取特拉唑嗪盐酸盐1000mg，溶于100ml无菌生理盐水中，混合均匀后，分装成10mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中，密封，灭菌制成产品。其他项目应符合中华人民共和国药典2010年版注射液项下要求。

制剂实施例2：治疗败血症引起的细胞凋亡特拉唑嗪口服片的制备。

取特拉唑嗪100g，微晶纤维素510g，无水乳糖380g，硬脂酸镁10g，按公知的制片技术和设备制成片剂，特拉唑嗪10mg/片.其他项目应符合中华人民共和国药典2010年版片剂项下要求。

制剂实施例3：治疗脑卒中引起的细胞凋亡特拉唑嗪缓释片的制备。

取特拉唑嗪磷酸盐200g，羟丙甲基纤维素K4M 250g，无水乳糖540g，硬脂酸镁10g，按公知的制片技术和设备制成片剂，特拉唑嗪磷酸盐20mg/片.其他项目应符合中华人民共和国药典2010年版片剂项下要求。

制剂实施例4：治疗脑卒中引起的细胞凋亡特拉唑嗪口服液制备。

取特拉唑嗪甲磺酸盐适量，中华人民共和国药典2010年口服液项下要求，按公知的制片技术和设备制口服液

药效实施例1：

实施例1特拉唑嗪衍生物(Tx)对败血症小鼠的作用

动物及分组SPF级雌性Balb/c小鼠，随机分为3组，即空白组(A)，模型组(B)、特拉唑嗪衍生物组(C)，每组10只。

模型建立及给药各组小鼠腹腔注射3.5％水合氯醛0.1mL/10g麻醉后，无菌条件下，模型组、Tx组行盲肠结扎穿孔术，空白组只找到盲肠但不结扎穿孔，术后1h，Tx组腹腔注射0.1mg/kg Tx，空白组和模型组分别腹腔注射等容生理盐水。术后开始观察记录小鼠行为表现、体重及存活期，计算存活率，并对重要脏器做病理切片。

数据统计数据用Mean±SD表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。

实验结果：

1.手术对败血症小鼠行为学的影响术后小鼠出现精神萎靡、嗜睡、反应迟钝、活动差、怕冷、聚居、竖毛、厌食、眼角分泌物增多等症状，表明败血症模型建造成功。

2.对胸腺和肠系膜淋巴细胞的影响流式细胞术检测表明模型组小鼠的胸腺及肠系膜的CD4+淋巴细胞出现了大量凋亡，Tx组的凋亡细胞数则明显少于模型组，但要高于空白组。

3.对脏器的影响病理切片显示，术后20h，模型组小鼠的胸腺、脾、肝、肺组织即发生了明显的病理损伤。而术后1h给药的Tx组脏器损伤程度则明显低于空白组。

4.对体重的影响模型组的动物体重要明显降低空白组和Tx组。

5.对败血症小鼠存活率的影响在1周的观察时间内，只有20％左右动物生存。模型组小鼠24小时存活率为80.25％，而72h存活率为48.60％，Tx显著提高了败血症小鼠72h存活率，达到69.5％。结果见图4对败血症小鼠存活率的影响。

实施例2特拉唑嗪衍生物(Tx)对缺血性脑卒中大鼠的作用

动物及分组SPF级SD大鼠，雌雄各半，随机分为3组，即空白组(A)、模型组(B)、特拉唑嗪衍生物(C)组，每组10只，雌雄各5只，分笼饲养。

模型建立及给药各组大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.3mL/100g麻醉后，无菌条件下，模型组和Tx组行脑中动脉结扎(middle cerebral artery occlusion，MCAO)术，空白组只分出脑中动脉但不结扎，术后1h，Tx组腹腔注射0.1mg/kg特拉唑嗪衍生物，空白组和模型组分别腹腔注射等容生理盐水。术后观察并记录大鼠行为表现及存活期，7天后，集中处死取脑做脑片，用Image Tool软件统计脑缺血面积。

实验结果

1.对缺血性脑卒中大鼠行为学的影响造模后，各组大鼠体重无明显差异。在观察期间，模型组与空白组的行为表现评分差异有统计学意义((P＜0.05)，表明缺血性脑卒中模型建造成功。Tx组在给药后的第3天与给药前的行为表现的差异有统计学意义((P＜0.05)。

2.对缺血性脑卒中大鼠脑缺血面积的影响在观察期间，空白组未见明显的脑缺血症状，模型组与空白组脑缺血面积比的差异有统计学意义((P＜0.01)；脑缺血面积比Tx组明显小于模型组((P＜0.05)。

3.Tx对大鼠脑卒中模型有明显的保护作用，显著改善大鼠的行为表现，明显减小脑梗塞面积。

表1.各组脑梗死体积比较(n＝10)

实施例3特拉唑嗪衍生物(Tx)对凋亡细胞的作用

细胞及分组将复苏的RAW264.7细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置5％CO₂、37℃培养箱，待细胞生长至对数生长期时用于实验。将RAW264.7细胞随机分为3组，即对照组、特拉唑嗪衍生物(Tx)组、凋亡组组。

模型建立及给药凋亡组和Tx组用终浓度为100μg/mL LPS(0157：B8)和100U/mL IFN-γ诱导凋亡，对照组不经过LPS(0157：B8)和IFN-γ诱导。加入凋亡刺激24h后，Tx组加入终浓度为4μg/mL的Tx，对照组和凋亡组加入等容生理盐水。

细胞毒性检测给药后24h开始进行细胞毒性检测，采用Cell Counting Kit-8试剂，用酶标仪检测450nm的吸光度。

实验结果

1.对细胞活性的影响100μg/mL LPS(0157：B8)和100U/mL IFN-γ可诱导细胞凋亡，凋亡率达到55.6％，而Tx则能保护细胞免于凋亡，逆转率约72.6％，且差异有统计学意义((P＜0.01)。结果见图5，对细胞活性的影响。

Claims

1.特拉唑嗪或其盐或其溶剂化物作为细胞凋亡抑制剂的用途。

2.特拉唑嗪或其盐在制备用于抑制细胞凋亡的药物中的应用。

3.权利要求2的用途，其中所述细胞凋亡为恶性疾病引起。

4.权利要求2或3的用途，其中所述细胞凋亡为败血症及其并发症引起的细胞凋亡。

5.权利要求2或3用途，其中所述细胞凋亡为脑卒中及其并发症引起的细胞凋亡。

6.权利要求2的用途，所述药物适用于包括人在内的哺乳类动物。

7.权利要求2的用途，所述特拉唑嗪盐为磷酸盐形式，硫酸盐形式，或甲磺酸盐形式。

8.如权利要求7所述的特拉唑嗪盐酸盐在制备用于治疗和/或预防败血病及其并发症引起的细胞凋亡药物中的应用。

9.如权利要求7所述的特拉唑嗪盐酸盐在制备用于治疗和/或预防脑卒中及其并发症引起的细胞凋亡药物中的应用。

10.特拉唑嗪或其盐或其溶剂化物与其他抑制细胞凋亡的化合物的组合物，在用于治疗人败血症/脑卒中或其它疾病引起的细胞凋亡症状的药物中的用途。

11.权利要求1或2的用途，其中特拉唑嗪盐指特拉唑嗪与许多种有机和无机酸和碱形成药学上可接受的酸和碱加成盐，并包括制药工业上常用的生理上可接受的盐。

12.权利要求1或2的用途，其中药物为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

13.权利要求1或2的用途，其中所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂、贴剂或凝胶剂形式。