CN101474173A

CN101474173A - 香豆素类化合物九里香酮在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101474173A
Application number: CNA200910045510XA
Authority: CN
Inventors: 张黎; 刘厚佳; 王晓黎; 高平挥; 卫立辛; 芮耀诚; 吴孟超
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: CN101474173B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是香豆素类化合物九里香酮用于制备抗肿瘤药物的新用途。经体内、体外实验表明，九里香酮对肿瘤细胞的生长和对动物皮下移植瘤的生长均具有抑制作用，并经动物急性毒性实验，表明九里香酮的急性毒性较低，因此，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

香豆素类化合物九里香酮在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及香豆素类化合物九里香酮制备抗肿瘤药物的新用途。

背景技术

九里香酮(murrayone)是一种香豆素类化合物，可以从芸香科植物九里香(Murraya exotica L.)和千里香(Murraya paniculata(L.)Jack)中提取获得，也可采用香豆素类化合物前体进行半合成的方法获得(中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典I部.2005：9.)。九里香酮的化学结构式如下：

九里香酮具有较好的抗菌、抗炎作用(1.邹联新，郑汉臣，杨紫仁.九里香属植物研究进展.药学实践杂志.1997；15(4)：214-219.2.颜杰，裴建梅.HPLC法测定三九胃泰颗粒中九里香酮的含量.中草药.2005；36(3)：375-376.3.睢大员，李淑惠.九里香化学及抗生育作用研究概况.中草药.1994；25(8)：435-437，448.)，但至今未见有关其具有抗肿瘤活性的报道。

发明内容

本发明提供一种应用香豆素类化合物九里香酮制备抗肿瘤药物的新用途。

本发明经体内、体外实验表明，九里香酮对肿瘤细胞的生长和对动物皮下移植瘤的生长均具有抑制作用，并经动物急性毒性实验，表明九里香酮的急性毒性较低，因此，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明九里香酮价格低廉、安全性高，辅以药学上可接受的辅料，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，具有良好的开发利用前景。

附图说明

图1为九里香酮对5种肿瘤细胞株细胞生长的抑制曲线图。

图2为九里香酮对5种肿瘤细胞株细胞生长的半数抑制浓度IC₅₀值图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1 九里香酮对肿瘤细胞生长的抑制作用实验(MTT法)

细胞株：

采用常规使用的5种肿瘤细胞株：人白血病细胞株K562，人肝癌细胞株Hep3B和HepG2，人结肠癌细胞株SW480和人宫颈癌细胞株HeLa，由上海东方肝胆外科医院肿瘤免疫与基因治疗研究中心提供(下同)。

九里香酮：

购买于成都普思生物科技有限公司，纯度大于98％(HPLC法，下同)。分别用含体积分数为10％小牛血清的DMEM培养液或用含体积分数为10％小牛血清的RPMI1640培养液配制成不同浓度的九里香酮溶液，浓度分别为5、10、20、40、80mg/mL。

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)：

购买于Sigma-Aldrich公司，用PBS磷酸盐缓冲液配制成1mg/mL溶液。

实验方法(MTT法)：

取对数生长期的肿瘤细胞株，Hep3B和HepG2分别用含体积分数为10％小牛血清的DMEM培养液培养，K562、SW480和HeLa细胞株分别用含体积分数为10％小牛血清的RPMI1640培养液培养，制成单细胞悬液后，分别将5种肿瘤细胞株接种于96孔板，每孔细胞悬液为200μL，细胞接种密度为1×10⁴个/孔，每种肿瘤细胞株各设3个组，即空白对照组、阴性对照组和九里香酮实验组。细胞先在体积分数5％ CO₂、37℃及饱和湿度下培养24小时，小心吸弃上清液，然后将含有不同浓度九里香酮的培养液200μl加入相应孔中，九里香酮浓度分别为5、10、20、40、80mg/mL，每个浓度各设6个复孔；阴性对照组的相应孔中则加等体积的肿瘤细胞悬液，空白对照组的相应孔中则为等体积细胞培养液，不含肿瘤细胞，空白对照组和阴性对照组也各设6个复孔；将该96孔板在体积分数5％ CO₂、37℃、饱和湿度下培养44小时后，将96孔板置于离心机离心5分钟，去上清，小心用PBS冲洗2遍后，各孔加入100μL浓度为1mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，37℃继续培养4小时；再将96孔板置于离心机离心5分钟，去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，震荡混匀，使沉淀充分溶解，10分钟后于酶标仪上测定吸光度A值，测定波长为490nm，按下列公式计算抑制率和半数抑制浓度(IC₅₀)。抑制率(％)＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％；半数抑制浓度(IC₅₀)采用对数机率单位法，以直线回归方程计算肿瘤细胞生长抑制率为50％的药物浓度。结果见图1、图2。由图1、图2可见，九里香酮对5种细胞株的增殖均有较强的抑制作用，其中对人白血病K562细胞的抑制作用最强。

实施例2 九里香酮对动物皮下移植瘤生长的抑制作用实验

动物：

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18g±2g，由上海医科大学动物中心提供。动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水(下同)。

细胞株：

H22小鼠肝癌细胞株、HepS小鼠肝癌细胞株：由中科院上海细胞研究所提供。

环磷酰胺粉针剂(CTX)：上海华联制药有限公司产品。

九里香酮：同上。

台盼蓝：

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒：购买于上海碧云天生物技术有限公司。

实验方法：

取8只雌性小鼠，随机分成2组，按常规分别腹腔接种H22小鼠肝癌细胞株和HepS小鼠肝癌细胞株，第9天，各选1只健康较好的小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，抽取腹腔积液，1000rpm离心5分钟，PBS洗2次，采用台盼蓝染色进行细胞计数，其活肝癌细胞大于95％，根据活细胞计数，分别用生理盐水稀释成HepS细胞悬液和H22细胞悬液，细胞浓度均为1×10⁷个/mL。

取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接种上述H22细胞悬液0.2mL。另取50只小鼠，雌雄各半，每只小鼠于右腋皮下接种上述HepS细胞悬液0.2mL。小鼠于接种后次日各随机分为5组，即阴性对照组、阳性对照组、九里香酮低、中、高剂量组，每组各10只，尾静脉注射给药，给药体积按小鼠体重每10g给药0.2mL。九里香酮低、中、高剂量组的九里香酮给药剂量按体重依次为50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，每日1次，连续10天；阴性对照组小鼠尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每日1次，连续10天；阳性对照组注射环磷酰胺(CTX)溶液，CTX给药剂量为30mg/kg，隔日1次，连用3次。第11天处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量，计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。

结果见表1。

表1 九里香酮对小鼠HepS、H22移植性肝癌的作用(Mean±SD)

*P<0.05vs生理盐水组

由表1可见，九里香酮三个剂量组与阴性对照组相比，对HepS、H22皮下移植瘤的生长均有显著的抑制作用，特别是高剂量组，其肿瘤抑制率接近阳性对照组。

实施例3 九里香酮的急性毒性实验

按常规以药物最大溶解度，给小鼠最大的给药容量，按体重单次灌胃给予九里香酮2.5g/kg，或单次腹腔注射给予九里香酮1.5g/kg，观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果如下：

1)小鼠单次灌胃给药后4小时内未见异常，给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，处死全部小鼠，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

2)小鼠腹腔注射给药后20分钟，3只小鼠出现精神萎靡、蜷缩、活动减少，给药后1小时后，全部小鼠恢复正常，给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，处死全部小鼠，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

上述结果表明，九里香酮的急性毒性较低，因此安全性好。

实施例4 九里香酮片剂的制备

取九里香酮200g，羟丙基甲基纤维素50g，微晶纤维素100g、交联羧甲基纤维素钠20g，混匀，加入适量60％乙醇制成软材，过24目筛制粒，50℃干燥2小时，干燥颗粒过30目筛整粒，加入硬脂酸镁2.5g，混匀，压成2000片。

Claims

1、香豆素类化合物九里香酮在制备抗肿瘤药物中的应用。