CN101121018A - 重组fn多肽在制备败血症等严重感染疾病的药物中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽和C端肝素结合域多肽，所述的N端肝素结合域多肽是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46－Gly282的237个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到1113bp，长711bp，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp；由酵母表达的多肽分子量为28.52kDa。所述的C端肝素结合域多肽是由FN分子中的三个III型同源结构组成，含有从Tyr1720－Tyr1991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从5428bp到6244bp，长816bp，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，由酵母表达的多肽分子量为36.09kDa。在制备败血症严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种医药领域，尤其属于重组FN肝素结合域多肽的制备及其在败血症等严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中应用。
背景技术：
纤维连接蛋白，fibronectin，以下简称FN；重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽，含237个氨基酸，分子量为29kDa，简称rhFNHN-29，重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，含272个氨基酸，分子量为36kDa，简称rhFNHC-36；纤维连接蛋白肝素结合域I，即纤维连接蛋白N端肝素结合域，简称HepI；纤维连接蛋白肝素结合域II，即纤维连接蛋白C端肝素结合域，简称HepII；弥漫性血管内凝血，Disseminated IntravascularCoagulation，简称DIC；Ampicillin，氨苄青霉素，简称Amp；牛血清白蛋白，简称BSA；T载体，简称pGEM-T@vector；YPD培养基，简称YPD；含甲醇培养基，简称BMMY；含甘油培养基，简称BMGY；Lipopolysaccharide内毒素脂多糖，简称LPS；D-Galactosamine半乳糖胺，简称GalN。
纤维连结蛋白(FN)是一个多功能的大分子糖蛋白，与细胞的粘连、迁移过程相关，参与胚胎发生、损伤修复、止血、自主防卫、肿瘤转移等。它广泛存在于细胞外基质、基底膜及各种体液。体内FN可分血清FN和细胞FN，前者由肝细胞合成和分泌，后者主要由成纤维细胞合成分泌，其他多种细胞也可合成分泌FN。FN基因位于2q34，有二个转录变异型的全序列已经测定完毕，FN1和FN2。FN基因可在三个位点进行差异剪接，产生近20种不同的转录本和结构功能相异的蛋白质。
FN分子是一个二聚体，其单体亚单位由三种类型(I、II、III型)的结构域重复不同次数构成。其中I型结构域重复出现12个，II型结构域重复出现2个，III型结构域重复出现16个。12个I型结构域的氨基酸组成数目：36、39、44、45、45、31、39、38、39、45、42、41。平均40.33±4.249，其中45个出现三次，39个出现三次。2个II型结构域的氨基酸组成数均为49个。16个III型结构域的氨基酸组成数目：70、54、66、79、77、88、91、65、78、80、79、79、91、79、78、79，平均77.07±9.61，其中79个出现五次，78个出现二次。
败血症(Sepsis)和弥漫性血管内凝血(DIC)，是临床常见危重症。败血症尤其由其产生的感染性休克容易诱发弥漫性血管内凝血(DIC)，而一旦形成弥漫性血管内凝血(DIC)，又进一步加重休克。由DIC引起的出血危害性极大。DIC也可导致多器官功能衰竭等严重的并发症，病死率高。
血液病患者常表现为感染和血小板减少出血并存的情况。由于感染和出血相互影响，形成恶性循环，临床上血液病患者内毒素血症和出血的发生率和死亡率都很高。
纤维连接蛋白(FN)是细胞外基质的重要成份，为一种具有多种功能的糖蛋白大分子，能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合，参与细胞的粘附与迁移、止血过程、损伤修复、在抗感染、维持微血管的完整性等方面具有重要作用，故曾有“调理性α2表面结合蛋白”，“细胞表面蛋白”及“细胞粘附因子”之称。大量的临床研究表明血浆纤维连接蛋白FN水平对于感染性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)的预后判断具有重要意义。这些病人血浆FN水平明显而急剧地下降。若给败血症患者补充富含FN的冷沉淀物(cryoprecipitate)，则在患者血浆FN水平恢复的同时，伴有心肺功能的改善及败血症的控制，DIC的发生率也明显下降。Barkagan等给106例败血症伴DIC患者输注含FN的冷沉淀物，取得显著疗效。Brodin B等给26例严重感染住院患者补充冷沉淀物，观察血浆FN水平及DIC相关指标的变化，结果发现，患者血浆FN水平恢复正常，且无一例发生DIC。提示FN可用于治疗败血症及DIC。由于从血浆中分离FN将造成血资源的浪费和可能传播血源性传染病，同时由于FN是一种大分子量的糖蛋白，其分子量高达450kDa，利用基因工程合成整个FN分子，目前技术上存在着一定的困难。因此本研究在以往成功制备重组FN细胞结合域多肽(rhFN55)，发现其具有治疗败血症小鼠和DIC大鼠作用的基础上，制备重组FN肝素结合域多肽，并研究其对败血症小鼠和DIC大鼠的治疗作用。
FN分子结构中含有二个与肝素结合的结构域，一个位于FN的N端，由五个I型的同源结构组成，该结构域的分子量为29kDa，由237个氨基酸组成。另一个位于FN的C端，由第12，13，14三个III型的同源结构组成，该结构域的分子量为36kDa，由272个氨基酸组成。应用FN分子结构中的肝素结合域多肽研究其对鼠败血症和DIC模型的作用，目前国内外尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的在于提出重组FN肝素结合域多肽的制备及其在败血症等严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中应用。
本发明所采用的技术方案是：所述的二种重组纤维连接蛋白N和C端肝素结合域多肽，其一的特征在于是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有从Ser46-Gly282的237个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从403bp到1113bp，长711bp，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp；由酵母表达的多肽分子量为28.52kDa。所述的另一种重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，其特征在于是由FN分子中的III-12、III-13、III-14三个III型同源结构组成，含有从Tyr1720-Tyr1991的272个氨基酸；编码该多肽的DNA序列从5428bp到6244bp，长816bp，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，由酵母表达的多肽分子量为36.09kDa。
本发明的主要内容包括以下几方面：
1.重组FN N端肝素结合域和重组FN C端肝素结合域多肽酵母表达载体的构建及多肽的制备
根据FNcDNA序列，及与FN分子结构中的氨基酸序列进行比对，确定纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽(rhFNHN-29和rhFNHC-36)克隆位置，结合酵母表达载体的酶切特点，设计rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆的PCR扩增引物和酶切位点。利用所设计和合成的PCR引物，以FNcDNA为模板，PCR合成rhFNHN-29和rhFNHC-36基因。将rhFNHN-29和rhFNHC-36基因克隆至pGEM-T载体上。将重组的pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，进行DNA序列测定。正确的克隆进一步扩增，提取重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。以双酶切和连接的方法将rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pAo815SM载体中。将重组的pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，DNA序列测定和双酶切鉴定，提取阳性克隆的重组pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。以双酶切和连接的方法将rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pPIC9K整合型酵母表达载体上。重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的选择，挑取阳性克隆的单菌斑，进行DNA序列测定和双酶切鉴定。正确的克隆进一步扩增，提取重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒。用Bgl II酶切重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒，使其线性化。将线性化的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体转染GS115酵母细胞，进行筛选，挑选阳性克隆进行小规模诱导培养、鉴定rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表达量，挑选高水平表达的菌株进行大规模的表达。发酵液先用80％硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上S-100柱和SP柱纯化rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽。对纯化的rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽进行SDS-PAGE分析，并经凝胶图像分析系统扫描计算其分子量。通过斑点杂交和Western blot方法，检测多肽结合肝素能力和FN的抗原性。
2.rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36对败血症小鼠作用的研究
应用半乳糖胺增敏内毒素败血症小鼠模型对rhFNHN-29多肽抗败血症作用进行研究。按Leist M等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏化内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)建立败血症小鼠模型，即给每只小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和内毒素(300μg)。建立败血症模型小鼠(BABL/C)共40只，雌雄各半，随机分二组，每组20只，一组为rhFNHN-29多肽治疗组，另一组为生理盐水对照组。在给小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和内毒素(300μg)前半小时，后1小时，2小时，3小时两组小鼠分别从其尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg)和等体积生理盐水。于腹腔注射药物后6小时，眶静脉采血250μl，枸椽酸钠抗凝，常规分离血浆，测定血浆TNFa水平，并观察72小时小鼠生存率。腹腔注射药物后72小时，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠的肝、肾、脾、肺、心、脑组织，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，做组织病理形态学观察。同时取肝组织做电镜观察。
3.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对DIC大鼠作用的研究
应用内毒素诱导的DIC大鼠模型对rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗DIC作用进行研究。
按Takahashi Y等用内毒素诱导法建立大鼠DIC模型的方法，即每只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，股静脉注射LPS(50mg/kg)。共建立DIC模型SD大鼠20只，体重200-250克，雌雄各半，随机分两组，每组10只，一组为rhFNHN-29多肽治疗组，另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时，注射后2小时，4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg)，对照组注射等体积生理盐水。于注射LPS后6小时，对侧股静脉抽血500μl，50μlEDTA抗凝，用于检测白细胞(WBC)，血红蛋白(Hb)，血小板(Plat)，450μl用4.5μl 3.8％的枸椽酸钠抗凝，常规分离血浆，测定血浆TNFa水平。于股静脉注射LPS后24小时处死大鼠，取大鼠的肝、肾、脾、肺、心、脑组织，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，做组织病理形态学观察。
4.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠作用的研究
应用半乳糖胺敏化内毒素小鼠模型基础上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)的血小板减少内毒素血症小鼠模型对rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗血小板减少内毒素血症作用进行研究。
模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化内毒素小鼠模型基础上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。即给每只小鼠腹腔注射血小板抗血清(APS)100μl，30分钟后腹腔注射500μl含内毒素脂多糖(LPS)300μg加半乳糖胺(GalN)10mg的混合液。通过监测血小板和72小时后小鼠的肝脏组织病理形态学观察验证模型是否成功构建。
所建立的血小板减少内毒素血症小鼠模型小鼠(BABL/C)共90只，雌雄各半，随机分三组，每组30只。rhFNHN-29治疗组、rhFNHC-36治疗组及生理盐水对照组分别于注射血小板抗体前半小时，注射内毒素脂多糖和半乳糖胺后1个小时，2个小时，3个小时，自尾静脉注射rhFNHN-29或rhFNHC-36各10mg/kg或等体积的生理盐水。另外设两个对照组，每组20只，分别腹腔注射APS 100μl(血小板抗体组，APS组)或腹腔注射500μl含LPS 300μg加GalN 10mg的混合液(半乳糖胺敏化内毒素血症组，LPS+GalN组)。注射APS 6小时后，从每组取10只小鼠，眶静脉采血700μl，取50μl(EDTA抗凝)测血常规白细胞(WBC)、血红蛋白(HB)、血小板(Plt)，650μl用1/10体积3.8％的枸橼酸钠抗凝，常规分离血浆，-20℃冷冻，备测凝血象及TNF -α水平。各组剩余小鼠观察72小时死亡率。
本发明取得如下结果和结论：
1.成功构建了重组rhFNHN-29和rhFNHC-36酵母表达载体，并在酵母细胞中表达及制备了rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽。制备的rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽经SDS-PAGE电泳分离，在凝胶图象分析系统中测定分子量，rhFNHC-36多肽分子量为36.09kDa，rhFNHN-29多肽分子量为28.52kDa。斑点杂交实验证明两多肽均能与肝素结合，但都不能与FN抗体结合。说明所合成的多肽在体外具有结合肝素的能力而没有FN的抗原性。说明利用酵母表达系统表达FN肝素结合域多肽是可行的。
2.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对内毒素败血症小鼠和DIC大鼠具有一定的治疗作用。
在rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治疗小鼠败血症的实验研究中，治疗组的死亡率分别为15％和19％，对照组的死亡率为70％。两多肽能明显降低内毒素败血症的死亡率(P＜0.01)。从肝脏病理组织学观察发现，生理盐水对照组小鼠肝脏组织呈现广泛的变性与严重坏死，而多肽治疗组的肝脏组织仅见局灶性的变性与轻微坏死。两组的肾、脾、肺、心、脑等组织未见明显病理改变。电镜观察，生理盐水对照组肝细胞胞质松散，染色变浅，细胞器崩解，而多肽治疗组小鼠轻微变性，胞质和细胞器均未见明显改变，出现糖原和脂肪颗粒，并偶见少量凋亡细胞。
ELISA法检测小鼠血浆TNFa水平，结果显示生理盐水对照组的TNFa水平显著高于正常对照组小鼠的水平(P＜0.01)，而用多肽治疗小鼠的TNFa水平显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)。
RT-PCR检测实验小鼠肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平，结果显示生理盐水对照组小鼠的TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平显著高于正常对照组小鼠的水平(P＜0.01)，而用rhFNHN-29多肽治疗的小鼠显著低于生理盐水对照组小鼠的水平(P＜0.01)，
在rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治疗LPS诱导的DIC大鼠实验研究中，病理组织学观察发现，生理盐水对照组肺组织小动脉和毛细血管出现广泛血栓，肝小静脉和毛细血管也出现广泛血栓和广泛出血，而多肽治疗组仅见较轻微血栓形成和少量的出血。生理盐水对照组的肾、脾、心、脑组织也见血栓形成和出血，而多肽治疗组的肾、脾、心、脑组织见少量血栓形成，未见明显出血。
ELISA法检测大鼠血浆TNFa水平，结果显示生理盐水对照组的TNFa水平显著高于正常对照组(P＜0.01)，多肽治疗组显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)。血象和凝血象分析显示生理盐水对照组的WBC、HB、Plat和Fbg显著低于正常对照组，PT和APTT显著高于正常对照组。而多肽治疗组的WBC、HB、Plat和Fbg显著高于生理盐水对照组，PT和APTT显著低于生理盐水对照组。
3.rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠具有保护作用。
rhFNHN-29多肽能明显降低血小板减少内毒素血症小鼠的死亡率。生理盐水对照组小鼠的72小时死亡率达90％，F rhFNHN-29多肽治疗组小鼠72小时死亡率分别为25％。病理组织学观察发现生理盐水对照组小鼠肝、脑、肺可出现广泛的变性、坏死、出血，而rhFNHN-29多肽治疗组则仅见局灶性的变性，轻微坏死。电镜观察发现生理盐水对照组小鼠肝细胞呈典型性坏死改变，而rhFNHN-29多肽治疗组肝细胞大小、形态、结构大致正常。
RT-PCR检测表明生理盐水对照组小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平高于正常小鼠，FN治疗组及rhFNHN-29多肽治疗组小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平则较对照组有明显下降。
ELISA法检测发现生理盐水对照组小鼠血浆TNF-α表达水平显著增高，rhFNHN-29多肽治疗组小鼠血浆表达水平明显低于对照组。
血象和凝血象检测表明rhFNHN-29多肽治疗组的血象、凝血象较生理盐水对照组有明显改善。
本发明具有如下优点：本发明的制备工艺合理。所制得的重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽和重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽，在抗败血症小鼠实验中，生理盐水对照组小鼠的死亡率为70％，肝脏病理组织学形态呈广泛变性与严重坏死，电镜观察发现肝细胞呈严重的变性和坏死，胞质蔬松，染色变浅，部分细胞器已经崩解，肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平显著增高，血浆TNFa水平显著增高。以上各项指标显示用生理盐水对照处理的小鼠处于内毒素败血症状态。这证明本实验败血症小鼠模型建立是成功的。而用rhFNHN-29多肽治疗的小鼠死亡率仅为15％，rhFNHC-36多肽治疗的小鼠死亡率仅为15％和19％，显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)，说明两多肽能明显降低败血症小鼠的死亡率。肝组织仅呈小面积变性和轻微坏死，电镜观察发现肝细胞轻微变性，胞质和细胞器均未见明显改变，偶见少量凋亡细胞，说明两多肽能有效地降低内毒素败血症所造成的肝组织损害。肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平和血浆TNFa水平显著低于生理盐水对照的小鼠。TNFa、IL-1β、IL-6是重要的促炎症反应细胞因子。在内毒素败血症时，内毒素刺激机体单核巨噬细胞和中性粒细胞，释放大量炎性细胞因子。这些炎症细胞因子损伤血管内皮细胞，裂解内皮下基质，使血管内皮细胞粘附力降低，微血管完整性遭到破坏，通透性增高，相应地血浆蛋白清除率增加，血浆大量渗出，使有效循环血量减少。血浆和组织间的平衡发生障碍，使组织器官功能受损伤。所以说明两多肽可能是通过降低促炎症细胞因子的表达水平而起到对内毒素败血症小鼠的保护作用。
在多肽抗DIC大鼠实验中，病理组织学观察发现生理盐水对照组大鼠肺组织小动脉和毛细血管出现广泛血栓和较大面积的出血，肝组织小静脉和毛细血管也出现血栓形成和严重的肝组织出血，肾、脾、心、脑组织也见血栓形成和出血，WBC、HB、Plat和Fbg降低，而PT和APTT延长，血浆TNFa水平增高。说明以生理盐水处理的大鼠处于DIC状态中，提示本实验成功地建立了DIC大鼠。血浆TNFa水平下降。以上结果显示两多肽对DIC大鼠有一定的治疗作用。
用rhFNHN-29多肽和rhFNHC-36多肽治疗的大鼠，肺组织小动脉和毛细血管仅出现少量血栓形成和小面积的出血，肝组织则仅见轻微血栓形成和少量出血，肾、脾、心、脑组织见少量血栓形成，WBC、HB、Plat和Fbg较生理盐水对照组增高，PT和APTT缩短，rhFNHN-29多肽能明显降低血小板减少内毒素血症小鼠的死亡率。生理盐水对照组小鼠的72小时死亡率达90％，F rhFNHN-29多肽治疗组小鼠72小时死亡率分别为25％。病理组织学观察发现生理盐水对照组小鼠肝、脑、肺可出现广泛的变性、坏死、出血，而rhFNHN-29多肽治疗组则仅见局灶性的变性，轻微坏死。电镜观察发现生理盐水对照组小鼠肝细胞呈典型性坏死改变，而rhFNHN-29多肽治疗组肝细胞大小、形态、结构大致正常。
RT-PCR检测表明生理盐水对照组小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平高于正常小鼠，FN治疗组及rhFNHN-29多肽治疗组小鼠肝组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平则较对照组有明显下降。
ELISA法检测发现生理盐水对照组小鼠血浆TNF-α表达水平显著增高，rhFNHN-29多肽治疗组小鼠血浆表达水平明显低于对照组。
血象和凝血象检测表明rhFNHN-29多肽治疗组的血象、凝血象较生理盐水对照组有明显改善。
因此，本发明的重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽和重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽能作为在制备败血症等严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中的应用。
附图说明：
图1-1为本发明的rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重组载体上的PCR鉴定图。
图中：1pUC8；2rhFNHC-36；3rhFNHN-29
图1-2为本发明的重组pAo815SM-FNHN-29载体EcoR I和BamH双酶切鉴定图。
图中：1pUC18；2pAo815SM-FNHN-29载体；3空载体对照
图1-3为本发明的bacmid-FNHC-36重组载体上rhFNHC-36基因的PCR和双酶切鉴定图。
图中：1PCR鉴定；2双酶切鉴定；3pUC8
图1-4为本发明的rhFNHN-29基因的正向测序图。
图1-5为本发明的rhFNHN-29基因的反向测序图。
图1-6为本发明的rhFNHC-36基因的正向测序图。
图1-7为本发明的rhFNHC-36基因的反向测序图。
图1-8为本发明的FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析图。
图1-9为本发明的纯化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析图。
图中：1纯化的FNHC-36多肽；2M
图1-10为本发明的rhFNHN-29多肽的分子量测定图。
图1-11为本发明的rhFNHC-36多肽分子量测定图。
图1-12为本发明的多肽结合肝素斑点杂交放射显影图。
图中：左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽
图1-13为本发明的多肽结合肝素斑点杂交酶联反应显色图。
图中：左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽
图1-14为本发明的半乳糖胺敏化内毒素败血症小鼠生理盐水对照组肝脏病理形态(10×10)图。
图1-15为本发明的半乳糖胺敏化内毒素败血症小鼠多肽治疗组肝脏病理形态(10×10)图。
图1-16为本发明的生理盐水对照组肝组织电镜超微结构(×15000)图。
图1-17为本发明的多肽治疗组肝组织电镜超微结构(×12000)图。
图1-18为本发明的细胞因子IL-1β表达图谱(619bp为β-actin；132bp为IL-1β)图。
图中1多肽治疗组；2生理盐水对照组；3正常肝组织；M pUc8
图1-19为本发明的细胞因子IL-6表达图谱(619bp为β-actin；455bp为IL-6)图。
图中：1多肽治疗组；2生理盐水对照组；3正常肝组织；M pUc8
图1-20为本发明的细胞因子TNFa表达图谱(619bp为β-actin；396bp为TNFa)图。
图中：1治疗组；2生理盐水对照组；3正常肝组织；M pUC8
图1-21为本发明的LPS诱导的DIC大鼠生理盐水对照组肺脏病理形态(10×10)。
图1-22为本发明的LPS诱导的DIC大鼠多肽治疗组肺脏病理形态(10×10)。
图1-23为本发明的LPS诱导的DIC大鼠生理盐水对照组肝脏病理形态(10×10)。
图1-24为本发明的LPS诱导的DIC大鼠多肽治疗组肝脏病理形态(10×10)。
图1-25为本发明的生理盐水对照组小鼠肝组织形态：肝细胞出现大量明显变性、坏死现象，肝组织放射状条索结构破坏严重，大量炎性细胞浸润(X250)。
图1-26为本发明的多肽治疗组小鼠肝脏病理学形态(X250)。
图1-27为本发明的多肽治疗组小鼠肝脏病理学形态(X250)。
图1-28为本发明的LPS+GalN组小鼠肝脏病理学形态(X250)。
图1-29为本发明的APS组小鼠肝细胞病理学形态(X250)。
图1-30为本发明的生理盐水对照组小鼠脑组织蛛网膜下腔出血，大量红细胞聚集，可见炎症细胞浸润(X400)。
图1-31为本发明的LPS+GalN组小鼠脑组织：少量小血管扩张，血管周围间隙增宽(X250)。
图1-32为本发明的治疗组小鼠脑组织(X250)。
图1-33为本发明的生理盐水对照组小鼠肺组织：肺泡腔内可见较多浆液性渗出物，含大量红细胞和一定量的炎性细胞(X250)。
图1-34为本发明的多肽治疗组小鼠肺组织(X250)。
图1-35为本发明的生理盐水对照组小鼠肝细胞(X3600)。
图1-36为本发明的多肽治疗组小鼠肝细胞(X6000)。
图1-37为本发明的IL-6/actin图。
图1-38为本发明的IL-1/actin图。
图1-39为本发明的TNF-a/actin图。
图中：M：Puc8Mix Marker；1正常组；2APS组；3LPS+GalN组；4生理盐水对照组；5rhFNHN-29治疗组；6多肽rhFNHC-36治疗组
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述：
一、重组FN肝素结合域多肽酵母表达载体的构建及多肽的制备
本发明将FNC端的肝素结合域多肽基因和FNN端的肝素结合域多肽基因克隆至酵母表达载体，并在GS115酵母细胞中进行表达。
1.1)FNC端和FNN端肝素结合域多肽基因PCR扩增引物设计
根据FNcDNA序列，及与FN分子结构中的氨基酸序列进行比对，确定纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽(rhFNHC-36)和N端肝素结合域多肽(rhFNHN-29)的克隆位置，结合酵母表达载体的酶切位点，设计重组rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR引物和酶切位点。
FNN端肝素结合域多肽是由FN分子中N端的五个I型同源结构组成，含有237个氨基酸(Ser46-Gly282)。编码该多肽的DNA序列长711bp(403bp-1113bp)，PCR扩增片断长741bp，双酶切后片断长729bp，该多肽命名为rhFNHN-29。其目的基因片断PCR扩增的引物如下：
上游引物 5-ATGCTC↓TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAG CAGTCAAAGCAAGCCCGGTTGTTA-3
下游引物 5-ACGTAG↓AATTCTCCG CTCGATGTGGTCTGCA-3
上游酶切位点XhoI，下游酶切位点EcoR I。
FNC端肝素结合域多肽是由FN分子中的III-12、III-13、III-14三个III型同源结构组成，含有272个氨基酸(Tyr1720-Tyr1991)。编码该多肽的DNA序列长816bp(5428bp-6244bp)，PCR扩增片断长835bp，双酶切后片断长828bp，该多肽命名为rhFNHC-36。其目的基因片断PCR扩增的引物如下：
上游引物 5-ATGCTC↓TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGGCACCAACTGAC-3
下游引物 5-ACGTAG↓AATTCTCCGCTCGTCTGTCTTTTTCCTTCC-3
上游酶切位点XhoI，下游酶切位点EcoR I。
1.2)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因的PCR扩增及纯化回收
PCR扩增体系：FNcDNA 0.1μl(50ng)，10×缓冲液5μl，dNTP 1μl，pfu 1μl(3U)，上下游引物各1μl(10pmol)，双蒸水41μl，构成50μl反应体系。
PCR扩增条件：94℃5分钟预变性，94℃30秒，63℃(rhFNHN-29，66℃)40秒，72℃40秒，25个循环，72℃10分钟。
PCR扩增产物经1％低溶点胶电泳，割取含目的基因的低溶点胶，用胶回收试剂盒回收纯化目的基因片断，加双蒸水溶解，测OD值。
1.4)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接至酵母表达载体
1.4.1)rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接到pGEM-T载体
rhFNHN-29和rhFNHC-36基因末端加A。反应体系20μl：PCR回收产物12.4μl，MgCL21.6μl，ATP2μl，10×缓冲液2μl，Taq酶2μl，在72℃连接30分钟。
rhFNHN-29和rhFNHC-36基因连接pGEM-T载体。反应体系20μl：pGEM-T载体2μl，末端加A的rhFNHN-29基因6μl，2×缓冲液10μl，T连接酶2μl，4℃连接16小时。
1.4.2)阳性重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)载体的选择
10μl连接产物加入到50μlDH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μl LB(AMP-)，37℃225rpm振摇1小时。100μl的转染液涂至三块AMP+的LB板上，37℃培养过夜。挑选单个菌斑至5mlAMP+的LB中37℃225rpm振摇6小时，提取质粒进行DNA测序和酶切鉴定。
1.4.3)rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因连接到pAo815SM载体
将以上挑选鉴定正确的阳性菌斑进一步振摇扩增，用UNIQ-200柱式质粒大量抽提试剂盒提取pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)阳性质粒。操作按说明书进行。
重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒的XhoI酶切：重组pGEM-T-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒20μl(1μl含100ng)，10×缓冲液20μl，10×BSA20μl，XhoI1.5μl，双蒸水138.5μl，200μl体系，37℃酶切2小时。酶切产物分两管，分别用95％乙醇沉淀，一管加10μl双蒸水，电泳观察酶切效果。若已酶切彻底，另一管再用EcoR I酶切。
重组pGEM-T-FNHN-29质粒的EcoR I酶切：另一管继续EcoR I酶切，上述酶切沉淀质粒，10×缓冲液4μl，10×BSA 4μl，EcoR I 2μl，双蒸水30μl.40μl体系，37℃2小时。1％低溶点琼脂糖回收FNHN-29(rhFNHC-36)基因片断，加10μl双蒸水溶解。
pAo815SM载体的酶切。取pAo815SM质粒，用XhoI酶切，酶切体系：pAo815SM质粒20μl(1μl含100ng)，10×缓冲液20μl，10×BSA20μl，XhoI1.5μl，双蒸水138.5μl，200μl体系，37℃酶切2小时，琼脂糖电泳检测酶切效果，酶切完全后用95％乙醇沉淀，加10μl双蒸水溶解。得到的产物再用EcoR I酶切，酶切体系：上述酶切沉淀质粒，10×缓冲液4μl，10×BSA4μl，EcoR I 2μl，双蒸水30μl.40μl体系，37℃2小时。1％低溶点琼脂糖回收pAo815SM线性质粒，加10μl双蒸水溶解。
连接反应：以上rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因酶切回收产物2μl，10×缓冲液1.5μl，T连接酶1μl，酶切回收的pAo815SM载体1μl，双蒸水10μl，15.5μl体系，14℃连接过夜。
1.4.4)重组pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染DH5a感受态细胞选择阳性克隆
以上15.5μl的连接产物加入到50μl DH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μlLB(AMP-)，37℃225rpm振摇1小时。每100μl转染后的DH5a菌液涂至三块AMP+的LB板上，37℃培养过夜。从转化平板上挑出5个单菌落分别到5mlAMP+的LB中，37℃225rpm振摇过夜。用质粒提取试剂盒提取质粒，EcoR I酶切验证。选出阳性克隆继续下一步试验。
pAo815SM-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒双酶切(EcoR I)：pAo815SM-FNHN-29质粒30μl，10×缓冲液(M)6μl，10×BSA 6μl，EcoR I 2μl，BamH I 2μl双蒸水14μl，60μl体系，37℃酶切3小时。琼脂糖电泳检测酶切充分后，酶切物用2％琼脂糖和1％低溶点胶回收rhFNHN-29(rhFNHC-36)基因。双蒸水溶解。
1.4.5rhFNHN-29基因(rhFNHC-36)连接到酵母表达载体pPIC9K
pPIC9K质粒双酶切(EcoR I和BamH)：pPIC9K空质粒用EcoR I和BamH在37℃酶切3小时。琼脂糖电泳检测酶切充分后，用2％琼脂糖和1％低溶点胶回收pPIC9K线性质粒，双蒸水溶解。
连接反应：EcoR I和BamH双酶切回收的FNHN-29(rhFNHC-36)基因6μl，EcoR I和BamH I双酶切的pPIC9K 1μl，T4缓冲液1μl，T4连接酶1μl，双蒸水1μl，10μl体系，14℃连接16小时。
1.4.6重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染DH5a感受态细胞选择阳性克隆
1μl重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)载体加入到50μl DH5a感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，加150μlLB(AMP-)，37℃225rpm振摇2时。每100μl转染后的菌液涂至三块AMP+的LB板上，37℃培养过夜。挑单菌斑至5mlAMP+的LB中37℃325rpm振摇6小时，测序和提取质粒并进行酶切鉴定。测序正确的质粒进一步扩增，在100mlLB(AMP+)中振摇6时，测OD值，在对数生长期中，用大柱提取质粒，按说明书进行操作，所提取的质粒溶于50μl双蒸水中。
1.5)rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽在酵母细胞中的表达
1.5.3)重组pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒转染酵母细胞及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的表达
线性质粒的准备：取20μl重组的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)质粒进行酶切。酶切体系：质粒20μl，10×缓冲液40μl，10×BSA 40μl，Bgl II 6μl，双蒸水294μl，400μl体系。37℃酶切过夜。酶切物用氯仿按1∶1抽提一次，再用氯仿抽提一次，上清用95％乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干，加双蒸水10μl溶解，得到重组的pPIC9K-FNHN-29线性质粒(pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)/Bgl II)，-20℃保存备用。
线性质粒转染酵母细胞：取2μl重组的pPIC9K-FNHN-29(rhFNHC-36)线性质粒转染GS115感受态细胞，转染的GS115细胞涂布于RDB平板上，28℃培养4-5日，挑取10单菌斑至2mlYPD中，28℃，250rpm振摇培养过夜。取100μl菌液加100μl 30％甘油混合，-80℃冰箱保存。剩余菌液全部倒入20mlBMMY中，28℃，250rpm振摇培养过夜。再诱导48小时培养，早晚各补加0.25％甲醇诱导，48小时后，4℃中，离心取上清，4×缓冲液上样电泳，鉴定是否表达及表达的量。挑选出表达最好的菌种，并保存菌种于-80℃中。
将表达量最高的菌液150μl接种到3mlYPD中，28℃，250rpm振摇培养过夜。培养过夜的3ml菌液全部再接种到200mlBMGY中，28℃，250rpm振摇培养过夜。培养过夜的菌液再按1∶20比例接种到BMMY中，早晚各补加0.25％甲醇诱导，诱导48小时.诱导结束后，4℃中，6000rpm离心5分钟，取40μl上清做SDS-PAGE电泳分析，鉴定是否表达及表达的量。
1.5.4)rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的分离纯化
酵母发酵液的沉淀分离：80％硫酸胺沉淀酵母发酵液上清(以4000ml为单位)，调Ph至7.3，放置30分钟，20℃，10000rpm离心20分钟，去上清，沉淀物再用200ml去离子水溶解，离心，去上清，150ml去离子水再溶解，40μl做SDS-PAGE电泳分析。
S-100柱的分离纯化：将以上沉淀分离的样品液50ml，上样至980ml的FFS-100柱子上。用平衡液进行洗脱纯化，平衡液为10mmNaCl，20mmTris-Cl，Ph8.5。洗脱纯化过程中，收集各个峰洗脱液体，并做SDS-PAGE电泳分析，以确定rhFNHN-29多肽所在的峰。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脱液体，再进行SP柱纯化。
SP柱的分离纯化：从S-100纯化中收集的第二个峰洗脱液调Ph值至7.0，稀释一倍后再上SP柱进一步纯化。A液：10mMNaCl，20mMTris-Cl，Ph7.0；B液：200mMNaCl，20mMTris-Cl，Ph7.0。洗脱纯化过程：样品上柱平衡好后，60％B液洗脱。收集FNHN-29多肽所在峰的洗脱液体，并进行SDS-PAGE电泳分析、分子量测定、含量测定、浓缩处理。
1.6)纯化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的生物学特性分析
1.6.1)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的含量测定
用Bradford试剂盒测定纯化液中目的蛋白的含量，按说明书操作，在酶标仪(354型，thermo LabSystems)上测590nm光密度值(OD值)，计算待测样品浓度，再用透析袋透析浓缩。
1.6.2)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽分子量测定
将纯化rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE电泳凝胶在凝胶图象分析系统中测定多肽的分子量，以低分子量标准蛋白为参照。
1.6.3)rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽结合肝素活性与FN抗原性
rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽是FN分子中的肝素结合区域。在完整的FN分子中该区域具有结合肝素的活性，为了验证在昆虫细胞中表达的rhFNHC-36多肽和在酵母细胞中表达的rhFNHN-29多肽是否保留结合肝素的能力及是否具有FN抗原性的特性，特设计了Western blot和斑点杂交实验。
Western blot：按SDS-PAGE常规方法制胶，分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为3％胶大小为10cm×10cm，20μl rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽样品(40μg)，加20μl 2×上样缓冲液，煮沸5分钟，上样电泳(上样时以相同的排列顺序上样两处，中间以一空泳道相隔，以便制成两张相似的膜，一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，电泳条件为浓缩胶8mA稳流电泳30分钟，分离胶18mA稳流电泳2小时，电泳结束后，小心将胶移至转膜仪上，在胶的上方放上一张同样大小的硝酸纤维素膜，在稳压30V状态下过夜转膜。次日将转好的膜切成两张(一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，将硝酸纤维素膜置1％BSA的TBS缓冲液中封闭1小时，再将膜置含肝素钠(625单位/ml)的TBS缓冲液中，室温孵育1小时，TBS缓冲液漂洗二次后，将膜置于含大鼠抗肝素抗体(2μg/ml)的TBS缓冲液，室温孵育1小时，TBS缓冲液漂洗后，加入辣根酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)，室温孵育1小时，显色液显色。另一张进行放射显影：将膜放在保鲜膜上，于暗室中用化学发光工作液Western Blot-ting Luminol Reagent(Santa Cruz)按每2cm2膜各加显色液A，B 0.5ml，均匀覆盖NC膜，盖上保鲜膜，室温反应5分钟。然后移入X射线胶片盒中，在预先裁减好的X射线胶片(KODAK)上爆光，时间为2分钟、5分钟。FN抗原性检测的一抗为鼠抗人FN单抗，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(斑点杂交相同)。
斑点杂交：取20μl的rhFNHC-36、rhFNHN-29多肽样品(40μg)直接点在硝酸纤维素膜上(同时处理两张膜，一张用于酶联显色，一张用于放射显影)，待样品稍干后，封膜、结合肝素、结合抗肝素抗体、结合二抗和显色同Western blot。另一张膜进行放射显影，方法同前。
结果
1目的基因在重组载体上的鉴定
1.1rhFNHC-36和rhFNHN-29基因在重组载体上的PCR鉴定
见图1-11pUC8；2rhFNHC-36；3rhFNHN-29
1.2重组pAo815SM-FNHN-29载体EcoR I和BamH双酶切鉴定
见图1-21pUC18；2pAo815SM-FNHN-29载体；3空载体对照
1.3重组pAo815SM-FNHC-36载体的BamHI和HindIII双酶切鉴定
见图1-3bacmid-FNHC-36重组载体上rhFNHC-36基因的PCR和双酶切鉴定
1PCR鉴定；2双酶切鉴定；3pUC8
1.5重组pGEM-T-FNHN-29载体中目的基因的DNA序列测定
见图1-4 rhFNHN-29基因的正向测序图
见图1-5 rhFNHN-29基因的反向测序图
1.4重组bacmid/FNHC-36载体中目的基因的DNA序列测定
见图1-6rhFNHC-36基因的正向测序图
见图1-7rhFNHC-36基因的反向测序图
2.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽SDS-PAGE分析
见图1-8 FNHC-36多肽的SDS-PAGE分析
见图1-9 纯化后FNHF-29多肽SDS-PAGE分析
1纯化的FNHC-36多肽；2M
2.2rhFNHN-29多肽的分子量测定
rhFNHN-29多肽的SDS-PAGE电泳图，经凝胶图象分析仪扫描分析，计算其分子量为28.52KD。rhFNHN-29多肽分子量测定左图为图1-10标准蛋白；右图为图1-101rhFNHN-29
2.3 rhFNHC-36多肽的分子量测定
rhFNHC-36多肽经SDS-PAGE电泳，在凝胶图像分析仪中扫描计算，其分子量为36.09。
见图1-11 rhFNHC-36多肽的分子量测定左图：FNHC-3多肽右图：标准蛋白
2.4斑点杂交
斑点杂交法检测rhFNHC-36和rhFNHN-29多肽与肝素及FN抗体结合的能力，用酶联显色和放射显影法，结果两多肽均能与肝素结合，均不能与FN抗体结合。
多肽结合肝素斑点杂交放射显影图，见图1-12左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽
多肽结合肝素斑点杂交酶联反应显色图，见图1-13左右箭头为rhFNHC-36多肽，中间箭头为rhFNHN-29多肽
讨论
本发明将纤维连接蛋白N端和C端的肝素结合域多肽基因片断克隆至酵母表达载体中，成功获得了重组的含纤维连接蛋白N端和C端肝素结合域多肽基因片断的酵母表达载体pPICK-FNHN-29(FNHC-36)，并在GS115酵母细胞中表达多肽。
本发明在用Western blot法检测多肽结合肝素能力时，多肽未能与肝素结合，可能的原因是在Western blot检测中，多肽在SDS-PAGE电泳时其空间结构被破坏，故不能与肝素结合。而在用FN抗体结合时，多肽同样未能与FN抗体结合。多肽结合肝素的能力在斑点杂交实验中得到了确认。在斑点杂交实验中多肽仍不能与FN抗体结合，提示多肽不具有FN的抗原性。以上结果显示利用酵母表达系统表达FN肝素结合域多肽是可行的。表达的多肽具有相应的结合肝素的活性。
二、rhFNHN-29及rhFNG-36多肽对败血症小鼠和DIC大鼠治疗作用的研究
FN是细胞外基质的重要成份，为一种具有多种功能的糖蛋白大分子，能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合，参与细胞的粘附与迁移、止血过程、损伤修复等。在细胞外基质中，FN具有防御和吞噬效应，在机体抗感染过程中起重要作用。首先，FN具有调理作用，血浆FN分子结构中既有与巨噬细胞结合的位点，也有与纤维蛋白原、胶原、细菌以及其他一些细胞结合的位点。当FN与这些物质结合后又与巨噬细胞结合，从而促使巨噬细胞吞噬这些物质。其次，FN能够增强内毒素脂多糖(LPS)触发的中性粒细胞功能，使多形核细胞释放含氧基团增多，增强其杀菌、吞噬功能。由于从血浆中分离和纯化FN存在着许多的问题，如血资源的浪费、血源性传染病的传播(艾滋病、肝炎等)。利用基因工程技术全分子表达FN，目前还存在着技术上的难度。所以表达FN的功能多肽，研究FN多肽的功能，并以FN的多肽来替代临床治疗中对FN的需求是一可行的方法。我们前期的研究已经证明我们制备的重组FN细胞结合域多肽(rhFN55多肽)对鼠败血症小鼠和DIC大鼠具有治疗作用。但FN肝素结合域多肽对鼠败血症和DIC的治疗作用，目前国内外尚未见报道。在前期的研究基础上，本研究进一步对rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗败血症和DIC的作用进行动物实验研究。
1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对半乳糖胺增敏内毒素败血症小鼠的作用
1.1.1内毒素败血症小鼠模型建立和rhFNHC-36多肽的治疗
按Leist M等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏化LPS小鼠建立败血症小鼠模型，即给每只小鼠腹腔注射内毒素脂多糖(LPS，Sigma)300μg和半乳糖胺(GalN，Sigma)10mg(将内毒素脂多糖300μg和半乳糖胺10mg溶于0.5ml的生理盐水中)。BABL/C小鼠60只，雌雄各半，体重20-25克，随机分三组，每组20只，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗各一组，另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射(LPS和GalN)前半小时，注射后1小时，2小时，3小时尾静脉注射rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽(10mg/kg)，对照组注射等体积生理盐水。另外10只，腹腔注射等体积生理盐水作为正常对照。各组小鼠于腹腔注射药物后6小时，眶静脉采血250μl，加10μl 3.8％的枸椽酸钠抗凝，常规分离血浆，用于测定血浆TNFa水平，并观察72小时小鼠生存率。
1.1.2病理组织学观察
各组小鼠于腹腔注射药物72小时后，颈椎脱臼法处死小鼠，每只小鼠取肝、肾、脾、肺、心、脑组织，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色。
1.1.3电镜超微结构观察
每只小鼠取肝组织，用3％戊二醛-1.5％多聚甲醛-0.1M PBS(pH7.2)4℃固定2小时以上。用0.1M PBS(pH7.2)漂洗3次。再以1％锇酸-1.5％亚铁氰化钾4℃固定1.5小时；再用0.1M PBS(pH7.2)漂洗3次，再经脱水、浸透、包埋、聚合、切片、染色，最后在日立Hu-12A型透射电镜下观察并摄片。
1.1.4肝脏细胞因子表达的影响
1.1.4.1肝组织总RNA的提取
应用Trizol法(Invitrogen Life Technology)提取总RNA。具体步骤：颈椎脱臼法处死小鼠后，立即取1克肝组织置液氮冷冻，30分钟后取出，加入1ml Trizol匀浆，加入1/10体积氯仿，振荡15秒后冰浴5分钟，4℃，12000，离心15分钟，吸取水相加等体积异丙醇溶液混匀，冰浴15分钟，4℃，12000，离心15分钟，可见白色沉淀物于EP管底部，弃上清，用75％乙醇小心漂洗，7500，4℃，离心10分钟，弃上清，沉淀物室温吹干，加适量灭菌三蒸水溶解，所取得的RNA用紫外分光光度仪准确定量和2％琼脂糖电泳分析。
1.1.4.2cDNA合成和细胞因子的PCR扩增
cDNA合成按反转录试剂盒说明书进行操作，反应体系为：总RNA 1μg，随机引物100ng，RNA酶抑制剂20U，10mM dNTPs 2μl，AMV反转录酶15U，反转录缓冲液(10×)2μl，加灭菌三蒸水至20μl.该反应体系置42℃60分钟，99℃灭活5分钟。以所获得的cDNA为模板，对TNFa、IL-1β、IL-6进行PCR扩增。所用引物是根据基因库上小鼠cDNA序列应用oligo软件设计，由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR扩增体系：cDNA1.5μl，dNTPs0.2mM，PCR缓冲液(10×)2.5μl，25mM MgCL21.5μl，上下游引物各25pmol，Taq酶1U，加灭菌三蒸水至25μl，在PCR仪中扩增(2400型PE)，以扩增β-actin为内参照。有关细胞因子和β-actin引物序列、扩增片断长度、PCR条件见表1。
表1肝脏细胞因子PCR扩增引物序列与扩增条件
| 细胞因子 | 引物序列 | 扩增片断 | 退火温度 | 循环数 |
| TNFaIL-1βIL-6β-actin | 上5’CGAGTGACAAGCCTGTAGC 3’下5’TACTTGGGCAGATTGACCTCA 3’上5’TGGGCTGTCCAGATGAGAG 3’下5’AAGGTCCACGGGAAAGACA 3’上5’GGATACAACTCCCAACAGAC3’下5’GTCTTGGTCCTTAGCCACTC 3’上5’CGCTGCGCTGGTCGTCGACA 3’下5’GTCACGCACGATTTCCCGCT 3’ | 396bp132bp455bp619bp | 54℃56℃55℃56℃ | 35353535 |
1.1.5ELISA法检测小鼠血浆TNFa水平
采用小鼠TNFa ELISA试剂盒检测小鼠血浆TNFa水平。方法如下：实验小鼠于腹腔注射药物6小时后，眶静脉采血250μl，加25μl3.8％的枸椽酸钠抗凝，常规分离血浆，将标准品按比例稀释，再将待测小鼠血浆(100μl)和稀释的标准品分别加入酶标板中，每孔100μl，设3个平行孔，室温孵育2小时，洗涤液洗3次，每孔加100μl生物素标记的TNFa抗体，室温孵育1小时，洗涤液洗3次，每孔加100μl链霉亲和素包被的辣根过氧化酶，室温孵育0.5小时，洗涤液洗3次，每孔加100μl酶结合工作液，洗涤液洗3次，加入显色剂100μl，显色20分钟，最后加100μl终止液终止显色。在酶标仪上用主波长450nm，辅助波长630nm，测每孔光密度值(OD值)。根据标准品OD值和浓度，取双对数，建立直线回归方程，计算各待测样品TNFa浓度。
1.2rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对LPS诱导的DIC大鼠的作用
1.2.1DIC大鼠模型建立及rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽的治疗
按Takahashi Y等用内毒素诱导法建立大鼠DIC模型的方法，即给每只SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg，正常对照组注射等量生理盐水。共建立DIC SD大鼠30只，体重200-250克，雌雄各半，随机分两组，每组10只，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗各一组，另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时，注射后2小时，4小时尾静脉注射rhFNHN-29(rhFNHC-36)多肽(10mg/kg)，生理盐水对照组注射等体积生理盐水。另设正常对照组SD大鼠10只，注射等体积生理盐水。各组大鼠于注射LPS后6小时，对侧股静脉抽血500μl，50μl(EDTA抗凝)用于测血常规白细胞(WBC)，血红蛋白(HB)，血小板(Plat)，450μl用4.5μl3.8％的枸椽酸钠抗凝，常规分离血浆，用于测定血浆TNFa水平、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(Fbg)。注射等体积生理盐水。
1.2.2病理组织学观察
于注射LPS后24小时处死大鼠，取大鼠的肝、肾、脾、肺、心、脑组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色。
1.2.3血常规测定
各组大鼠于注射LPS后6小时，对侧股静脉抽血50μl(EDTA抗凝)在全自动血球仪上测定白细胞(WBC)，血红蛋白(Hb)和血小板(Plat)。
1.2.4凝血象测定
1.2.4.1凝血酶原时间(PT)测定
取50μl血浆，置37℃，孵育2分钟，加入37℃预温的凝血活酶100μl，混匀，立即在半自动血凝仪上测定PT。
1.2.4.2活化部分凝血活酶时间测定(APTT)
取50μl血浆，加入50μl KPTT部分凝血活酶悬液，混匀后，置37℃，孵育3分钟，然后加入50μl 0.025CaCL2溶液，混匀，立即在半自动血凝仪上测定APPT。
1.2.4.3纤维蛋白原(Fbg)测定
取50μl血浆加950μl缓冲液，以1∶20稀释，每孔加100μl，置37℃，孵育2分钟，加入37℃预温的凝血酶50μl，混匀，立即在半自动血凝仪上测定Fbg。
1.2.5ELISA法检测大鼠血浆TNFa水平
采用大鼠TNFa ELISA试剂盒检测大鼠血浆TNFa水平。具体方法同小鼠血浆TNFa检测.
2、统计学处理：采用x2检验和t检验。
结果
1rhFNHN-29多肽对半乳糖胺敏化小鼠内毒素败血症的治疗作用
1.1rhFNHN-29多肽对半乳糖胺敏化内毒素败血症小鼠死亡率的影响
半乳糖胺敏化内毒素败血症小鼠生理盐水对照组小鼠72小时死亡率为70％，而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组小鼠的死亡率仅为15％和25％，见表2。
表2rhFNHN-29多肽治疗内毒素败血症小鼠死亡率
| 组别 | 实验鼠 | 存活鼠 | 死亡鼠 | 死亡率 |
| rhFNHN-29治疗组rhFNHC-36治疗组生理盐水对照组正常对照组 | 20202010 | 1715610 | 35140 | 15％*25％*70％**0％ |
*vs正常对照组，P＜0.01，**vs多肽治疗组，P＜0.01
1.2病理组织学观察
病理组织学观察半乳糖胺敏化内毒素败血症小鼠肝脏病理组织学形态，发现生理盐水对照组肝组织呈广泛变性与严重坏死，而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组肝组织呈小面积变性和轻微坏死，两组小鼠的肾、脾、肺、心、脑组织均未见明显变性与坏死改变。见图1-14和图1-15。
1.3电镜超微结构观察
电镜观察生理盐水对照组和多肽治疗组小鼠肝细胞结构，发现生理盐水对照组肝细胞呈严重的变性和坏死，胞质蔬松，染色变浅，可见部分细胞器已经崩解，而多肽治疗组轻微变性，胞质和细胞器均未见明显改变，偶见少量凋亡细胞。见图1-16、图1-17。
1.4多肽治疗对肝脏细胞因子表达水平的影响
RT-PCR检测实验小鼠肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平，结果发现生理盐水对照组小鼠的TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平显著高于正常对照组小鼠的水平(P＜0.01)，而rhFNHN-29多肽rhFNHC-36多肽治疗组显著低于生理盐水对照组小鼠的水平(P＜0.01)，见表3。见图1-18、图1-19，图中1多肽治疗组；2生理盐水对照组；3正常肝组织；M pUc8；见图1-20，图中1多肽治疗组；2生理盐水对照组；3正常肝组织；M pUC8
表3肝脏细胞因子表达PCR电泳条带灰度值(细胞因子/β-actin，x±SD，n＝10)
| 组别 | rhFNHN-29治疗 | rhFNHC-36治疗 | 生理盐水对照 | 正常肝组织 |
| IL-1βIL-6TNFa | 0.98±0.21*0.43±0.17*1.26±0.37* | 1.04±0.23*0.48±0.19*1.32±0.40* | 1.24±0.35**0.64±0.25**1.98±0.56** | 0.86±0.310.27±0.130.86±0.43 |
*vs正常对照组，P＜0.01，**vs多肽治疗组，P＜0.01
1.5小鼠血浆TNFa水平
ELISA法检测小鼠血浆TNFa水平，结果显示半乳糖胺敏化小鼠内毒素败血症的血浆TNFa水平，生理盐水对照组显著高于正常对照组小鼠的水平(P＜0.01)，而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组显著低于生理盐水对照组小鼠的水平(P＜0.01)，见表4。
表4 rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗败血症小鼠血浆TNFa水平(x±SD，n＝10，pg/ml)
| 组别 | 正常组 | rhFNHN-29治疗组 | rhFNHC-36治疗组 | 生理盐水对照组 |
| TNFa | 23.6±5.8 | 87.43±16.7* | 101.20±17.3* | 236.11±32.7** |
*vs正常组。P＜0.01，**vs治疗组，P＜0.01
2 rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对LPS诱导DIC大鼠的治疗作用
2.1 多肽对LPS所致DIC大鼠血象和凝血象的影响
LPS所致DIC大鼠的血像和凝血像分析，结果显示生理盐水对照组的WBC、HB、Plat和Fbg显著低于正常对照组(P＜0.01)，PT和APTT显著高于正常对照组(P＜0.01)。而rhFNHN-29rhFNHC-36多肽治疗组的WBC、HB、Plat和Fbg显著高于生理盐水对照组(P＜0.01)，PT和APTT显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)，见表5。
表5 rhFNHN-29多肽治疗的DIC大鼠血像和凝血像(n＝10)
| 组别 | WBC(×109/L) | HB(g/L) | Plat(×109/L) | PT(sec) | APTT(sec) | Fbg(g/L) |
| 正常组rhFNHN-29rhFNHC-36对照组 | 6.5±1.36.1±0.76.0±0.84.8±0.5** | 120±15127±9118±8101±11** | 615±82382±67*371±69*126±41** | 16.7±1.019.6±1.2*18.4±1.1*23.0±1.1** | 18.1±1.722.3±1.6*26.1±1.6*49.5±1.3** | 3.4±0.33.9±0.34.1±0.41.6±0.2** |
*vs正常组，P＜0.01，**vs治疗组，P＜0.01
2.2病理组织学观察
病理组织学观察发现，生理盐水对照组大鼠肺组织小动脉和毛细血管出现广泛血栓和较大面积的出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治疗组大鼠肺组织小动脉和毛细血管仅出现少量血栓形成和小面积的出血。生理盐水对照组大鼠肝组织小静脉和毛细血管也出现血栓形成，但更突出的病理改变则是见到广泛而严重的肝组织出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治疗组大鼠肝组织则见较轻微的血栓形成和少量出血。生理盐水对照组的肾、脾、心、脑组织也见血栓形成和出血，而rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治疗组的肾、脾、心、脑组织见少量血栓形成，未见明显出血。见图1-21、图1-22、图1-23、图1-24。
2.3大鼠血浆TNFa水平
ELISA法检测大鼠血浆TNFa水平，发现LPS诱导的DIC大鼠，生理盐水对照组的TNFa水平显著高于正常对照组大鼠的水平(P＜0.01)，而rhFNHN-29多肽治疗组的水平显著低于生理盐水对照组大鼠的水平(P＜0.01)，见表6。
表6rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽治疗DIC大鼠血浆TNFa水平(x±SD，n＝10，pg/ml)
| 组别 | 正常组 | rhFNHN-29治疗组 | rhFNHC-36治疗组 | 生理盐水对照组 |
| TNFa | 38.4±9.7 | 116.3±22.7* | 134.3±23.5* | 385.2+31.5** |
*vs正常组，P＜0.01，**vs治疗组，P＜0.01。
三、rhFNHN-29及rhFNHG-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠作用的研究
1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠的作用
1.1.1血小板减少内毒素血症小鼠模型建立及rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽的治疗模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化内毒素小鼠模型基础上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。即给每只小鼠腹腔注射血小板抗血清(APs)100μl，30分钟后腹腔注射500μl含内毒素脂多糖(LPS)300μg加半乳糖胺(GalN)10mg的混合液。通过监测血小板和72小时后小鼠的肝脏组织病理形态学观察验证模型是否成功构建。
所建立的血小板减少内毒素血症小鼠模型小鼠(BABL/C)共90只，雌雄各半，随机分三组，每组30只。rhFNHN-29治疗组、rhFNHC-36治疗组及生理盐水对照组分别于注射血小板抗体前半小时，注射内毒素脂多糖和半乳糖胺后1个小时，2个小时，3个小时，自尾静脉注射rhFNHN-29或rhFNHC-36各10mg/kg或等体积的生理盐水。另外设两个对照组，每组20只，分别腹腔注射APS 100μl(血小板抗体组，APS组)或腹腔注射500μl含LPS 300μg加GalN 10mg的混合液(半乳糖胺敏化内毒素血症组，LPS+GalN组)。注射APS 6小时后，从每组取10只小鼠，眶静脉采血700μl，取50μl(EDTA抗凝)测血常规白细胞(WBC)、血红蛋白(HB)、血小板(Plt)，650μl用1/10体积3.8％的枸橼酸钠抗凝，常规分离血浆，-20℃冷冻，备测凝血象及TNF-α水平。各组剩余小鼠观察72小时死亡率。
1.1.2病理组织学检测同败血症治疗
1.1.3电镜观察肝组织超微结构同败血症治疗
1.1.4肝脏细胞因子表达的影响
1.1.4.1肝组织总RNA的提取同败血症治疗
1.1.4.2cDNA合成和细胞因子的PCR扩增同败血症治疗
1.1.5血常规检测同DIC治疗
1.1.6ELISA法检测小鼠血浆TNF-a水平同败血症治疗
1.1.7凝血象检查同DIC治疗
1.1.7.1凝血酶原时间(PT)测定同DIC治疗
1.1.7.2活化部分凝血活酶时间(APTT)测定同DIC治疗
1.1.7.3纤维蛋白原(Fbg)测定同DIC治疗
2统计学处理：采用X2检验及t检验。
结果
1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠的作用
1.1rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症小鼠的保护作用生理盐水对照组小鼠的死亡率达90％，rhFNHN-29治疗组小鼠的死亡率为20％，rhFNHC-36治疗组小鼠的死亡率为25％而半乳糖胺敏化内毒素血症组(LPS+GalN组)小鼠的死亡率为70％，血小板抗体组(APS组)小鼠的死亡率为0％，见表7
表7各组小鼠死亡率
| 组别 | 实验鼠 | 存活鼠 | 死亡鼠 | 死亡率 |
| rhFNHN-29治疗组rhFNHC-36治疗组生理盐水对照组LPS+GalN组APS组 | 2020201010 | 15152310 | 551870 | 20％＊25％＊90％70％0％ |
＊表示与生理盐水对照组比较，P＜0.01。
1.2病理组织学观察
肝脏：生理盐水对照组小鼠肝组织出现大量明显变性、坏死现象，肝组织放射状条索结构破坏严重，大量炎性细胞浸润，可见呈火焰状、多角形，胞浆丰富的Kuffer细胞。LPS+GalN组小鼠肝细胞混浊肿胀，部分肝细胞变性坏死。而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组肝细胞仅见部分轻微变性坏死现象。而APS组小鼠肝细胞未见变性、坏死现象，见图1-25～1-29。
脑：生理盐水对照组小鼠脑组织出现变性、出血现象，包括：部分脑实质充血，小血管扩张，血管周围间隙增宽。部分神经元细胞出现变性，神经元细胞肿胀，神经元细胞轴突消失。蛛网膜下腔出血，大量红细胞聚集，可见炎症细胞浸润。小脑颗粒层充血，可见大量红细胞聚集。LPS+GalN组小鼠脑细胞可见少量小血管扩张，血管周围间隙增宽。APS组小鼠小脑颗粒层充血，较生理盐水对照组充血程度轻，蛛网膜下腔未扩张出血。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组未见变性、出血等现象，见图1-30～1-32。
肺：生理盐水对照组肺组织出现渗出、水肿现象，包括：肺泡壁毛细血管扩张充血，肺泡腔内可见较多浆液性渗出物，含大量红细胞和一定量的炎性细胞和巨噬细胞。而rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组仅有轻微渗出、水肿现象，部分肺泡组织毛细血管稍扩张，可见少量浆液性渗出。而LPS+GalN组和APS组未见异常。
各组的肾、心、脾等组织未见变性坏死改变。
1.3电镜观察肝组织超微结构
生理盐水对照组小鼠肝细胞核内高度致密的染色质边集，胞浆内细胞器显著退变，呈典型坏死性改变。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组肝细胞大小形态大致正常，肝细胞呈多边形，核居中，染色质丰富，少量异染色质小块散在分布于核基质中，未见凋亡细胞。见图1-35，1-36。
1.4rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对血小板减少内毒素血症组小鼠肝脏细胞因子表达的影响
RT-PCR检测表明生理盐水对照组及LPS+GalN组小鼠肝脏组织细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6mRNA表达水平均明显高于正常小鼠，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽组小鼠肝脏组织细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6mRNA表达水平则接近正常小鼠。见图1-37，图1-38，图1-39和表8。
表8肝脏细胞因子表达PCR电泳条带灰度值(细胞因子/β-actin±SD)
| 基因 | IL-6 | IL-1 | TNF-a |
| 正常组生理盐水对照组APS组LPS+GalN组rhFNHN-29治疗组rhFNHC-36治疗组 | 0.20±0.030.73±0.03＊0.20±0.050.61±0.10＊0.45±0.08#0.51±0.04# | 0.73±0.081.33±0.04＊0.77±0.091.19±0.02＊0.85±0.17#0.97±0.05# | 0.96±0.021.56±0.18＊0.94±0.051.28±0.11＊1.02±0.03#1.18±0.08# |
＊表示与正常组比较，P＜0.01；#表示与生理盐水对照组比较，P＜0.01。
3.5血常规检测发现生理盐水对照组小鼠血浆血小板(Plt)显著下降。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组小鼠血浆血小板(Plt)高于生理盐水对照组。见表9。
表9rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗血小板减少内毒素血症小鼠血象(X±SD)
| 分组(n＝6) | WBC(×109) | HB(g/L) | Plt(×109) |
| 正常组生理盐水对照组APS组LPS+GalN组FN治疗组rhFNHN-29治疗组 | 5.6±1.54.6±1.86.3±0.76.8±0.95.4±2.96.3±2.1 | 137±9.6128±4.1112±5.0105±9.3149±9.7132±8.6 | 683±9221±16＊93±31＊270±56＊139±85#102±96# |
＊表示与正常组比较，P＜0.01；#表示与生理盐水对照组比较，P＜0.01。
3.6ELISA法检测发现生理盐水组及LPS+GalN组小鼠血浆TNF-a表达水平显著增高，FN治
疗组及rhFNHN-29治疗组小鼠血浆TNF-a表达水平明显低于生理盐水对照组。见表10。
表10rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗血小板减少内毒素血症小鼠血浆TNF-a水平(X±SD)
| 分组(n＝6) | 正常组 | 生理盐水对照组 | APS组 | LPS+GalN组 | FN治疗组 | rhFNHN-29治疗组 |
| Pg/ml | 23.5±6.8 | 455±28.8＊ | 21.6±5.9 | 171±19.8＊ | 107±14.6# | 135±13.5# |
＊表示与正常组比较，P＜0.01；#表示与生理盐水对照组比较，P＜0.01。
3.7凝血象检测发现生理盐水对照组及LPS+GalN组小鼠血浆PT、APTT显著增高，Fbg水平下降。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组小鼠血浆PT、APTT明显低于生理盐水对照组，Fbg水平较生理盐水对照组升高。见表11。
表11 rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗血小板减少内毒素血症小鼠凝血象(X±SD)
| 分组(n＝6) | PT(sec) | APTT(sec) | Fbg(g/L) |
| 正常组生理盐水对照组APS组LPS+GalN组FN治疗组rhFNHN-29治疗组 | 13.67±2.4624.43±3.29＊14.07±0.8420.65±2.11＊16.60±9.71#18.43±6.32# | 12.57±0.7437.41±5.32＊22.13±3.84＊35.13±2.71＊18.27±2.63#20.37±1.60# | 2.67±0.270.75±0.16＊1.66±0.32＊1.19±0.17＊2.09±0.33#1.91±0.14# |
＊表示与正常组比较，P＜0.01；#表示与生理盐水对照组比较，P＜0.01。
讨论
败血症和DIC，是临床常见危重症。败血症尤其由其产生的感染性休克容易诱发DIC，而一旦形成DIC，又进一步加重休克。由DIC引起的出血危害性极大。DIC也可导致多器官功能衰竭等严重的并发症，病死率高。
本发明对rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽抗败血症小鼠和DIC大鼠治疗作用进行了动物实验研究。在多肽抗败血症小鼠实验中，生理盐水对照组小鼠的死亡率为70％，肝脏病理组织学形态呈广泛变性与严重坏死，电镜观察发现肝细胞呈严重的变性和坏死，胞质蔬松，染色变浅，部分细胞器已经崩解，肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平显著增高，血浆TNFa水平显著增高。以上各项指标显示用生理盐水对照处理的小鼠处于内毒素败血症状态。这证明本实验败血症小鼠模型建立是成功的。而用rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗的小鼠死亡率仅为15％和25％，显著低于生理盐水对照组(P＜0.01)，说明rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽能明显降低败血症小鼠的死亡率。肝组织仅呈小面积变性和轻微坏死，电镜观察发现肝细胞轻微变性，胞质和细胞器均未见明显改变，偶见少量凋亡细胞，说明rhFNHN-29及rhFNHC-36多肽能有效地降低内毒素败血症所造成的肝组织损害。肝组织TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表达水平和血浆TNFa水平显著低于生理盐水对照的小鼠。在内毒素败血症时，内毒素刺激机体单核巨噬细胞和中性粒细胞，释放大量炎性细胞因子。所以说明rhFNHN-29多肽可能是通过降低促炎症细胞因子的表达水平而起到对内毒素败血症小鼠的保护作用。
在多肽抗DIC大鼠实验中，病理组织学观察发现生理盐水对照组大鼠肺组织小动脉和毛细血管出现广泛血栓和较大面积的出血，肝组织小静脉和毛细血管也出现血栓形成和严重的肝组织出血，肾、脾、心、脑组织也见血栓形成和出血，WBC、HB、Plat和Fbg降低，而PT和APTT延长，血浆TNFa水平增高。说明以生理盐水处理的大鼠处于DIC状态中，提示本实验成功地建立了DIC大鼠。用rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗的大鼠，肺组织小动脉和毛细血管仅出现少量血栓形成和小面积的出血，肝组织则仅见轻微血栓形成和少量出血，肾、脾、心、脑组织见少量血栓形成，WBC、HB、Plat和Fbg较生理盐水对照组增高，PT和APTT缩短，血浆TNFa水平下降。以上结果显示rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对DIC大鼠有一定的治疗作用。其机制可能主要是多肽结合肝素和抗凝血的作用。
为了模拟血液病患者常有的感染和血小板减少并存的情况，我们建立了血小板减少内毒素血症小鼠模型，并观察rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对其疗效作用。模型是在Leist建立的半乳糖胺敏化内毒素小鼠模型基础上加用豚鼠抗小鼠血小板抗血清(APS)。通过预试验，我们发现小鼠在腹腔注射APS后6小时，血小板已降至约原水平的10％，42小时左右血小板降至最低点，约为原水平的2％，后开始逐渐恢复，96小时左右恢复至正常水平。因此我们采取在注射半乳糖胺和内毒素之前30分钟予小鼠腹腔注射APS 100μl的给药方法。由于本试验的观察时限为72小时，这种给药方式可以保证小鼠在试验中始终是处于血小板减少的状态。实验前后的血常规监测也予以证明。造模后死亡小鼠的解剖也发现腹腔出血和蛛网膜下腔出血等表现。造模小鼠的肝细胞病理检查可见变性坏死，与文献报道用半乳糖胺敏化内毒素小鼠选择性发展为肝功能衰竭相一致。因此血小板减少内毒素血症小鼠模型的建立达到了感染和血小板减少出血并存的要求。
本研究中rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组的血小板数较生理盐水对照组高，但仍低于正常水平。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组小鼠虽然生存率较半糖胺敏化内毒素血症组高，但其血小板数却较半乳糖胺敏化内毒素血症组低。提示血小板减少并不是血小板减少内毒素血症小鼠致死的主要原因，内毒素引起的炎症反应才是最主要的致死原因。rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽不能大幅度地提高血小板减少内毒素血症小鼠的血小板数，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽的治疗作用是通过减轻炎症反应、提供稳定的微血管环境，促进凝血以减少出血等方面来提高小鼠的生存率。
病理组织观察表明血小板减少内毒素血症小鼠肝、脑、肺出现变性、坏死、充血等现象，相对的给予rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗组小鼠肝、脑、肺则病变减轻。肝细胞的电镜结果也表明给予FN能减轻肝细胞的损害。
凝血象检测发现血小板减少内毒素血症小鼠血浆PT、APTT显著增高，Fbg水平下降。绘予rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗后小鼠血浆PT、APTT较生理盐水对照组明显降低，Fbg水平较生理盐水对照组升高。本研究表明rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽治疗有助于纠正血小板减少内毒素血症小鼠的凝血系统紊乱。可能是由于rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽对小鼠肝脏的保护作用，使得肝脏仍能分泌稳定凝血系统所需的凝血因子物质。另外，rhFNHN-29和rhFNHC-36多肽维持血管内膜完整性，减少微血管损伤，及时清除易导致微血管栓塞引发DIC的纤维蛋白多聚体等物质，保持止血和凝血功能的稳定，减少凝血因子的消耗，这都有利于改善小鼠止血和凝血功能。
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1.一种重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽和重组纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽在制备败血症严重感染、血小板减少出血和弥漫性血管内凝血的药物中的应用。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101596307B (zh) * | 2008-06-05 | 2013-03-27 | 福建医科大学附属协和医院 | 重组fn肝素结合域多肽在制备抗恶性肿瘤侵袭转移的药物中应用 |
| CN113226341A (zh) * | 2018-11-19 | 2021-08-06 | 伊利威克斯疗法公司 | 用于治疗败血症的早期凋亡细胞 |
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2007
- 2007-07-10 CN CNA2007100091922A patent/CN101121018A/zh active Pending
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