CN104017075A - 载脂蛋白b抗血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载脂蛋白B抗血清的制备方法，其技术方案要点是：1）将血清通过多阴离子化合物和二价金属离子处理获得低密度脂蛋白；2）将低密度脂蛋白中的杂蛋白除去，使其净含载脂蛋白B；3）将其作为抗原对免疫动物进行免疫，该发明的优势在于1）用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的LDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省（20倍），为大批量提取ApoB提供了条件，2）合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的二分之一，而且免疫的效价和成功率亦比传统方法提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医药领域，具体涉及一种载脂蛋白B抗血清的制备方法。
背景技术
载脂蛋白B（ApoB）是人血清中低密度脂蛋白（LDL）的主要结构蛋白，约占LDL蛋白质含量的97% ,其含量可反应LDL水平，血清中ApoB增高是心脑血管病的危险因素。临床上ApoB测定常作为心脑血管病的风险度估计。所有ApoB的免疫测定技术均需用ApoB抗血清，目前国际和国内通用的ApoB测定试剂盒均采用免疫比浊法(Immunoturbidimetric assay,ITA)，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度ApoB抗血清显得非常重要。
传统制备载脂蛋白B抗血清是通过将采集的人的外周血液，直接用人的血清通过超速离心，将血清中加入半饱和硫酸铵，半饱和硫酸铵吸引溶液中在蛋白质表面不具有极性区域中的水分子，使水无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间相互吸引，从而将其中的蛋白沉淀，然后取下层沉淀，然后通过调节PH使沉淀下来的蛋白质复溶，然后将复溶的蛋白质进行上柱层析，将其层析物分部收集、浓缩，通过冷冻干燥剂进行冷冻干燥，并将其放置在零下80℃的条件下保存，然后将载脂蛋白B作为抗原，每次以3mg/每只免疫动物，对免疫动物进行免疫，获得载脂蛋白B抗血清。
传统方法制备载脂蛋白B直接从人的外周血液直接进行离心，离心次数多，且耗时长，而且用半饱和硫酸氨将蛋白质进行沉淀，蛋白质的复溶困难，要求高，免疫动物时免疫效价低，成功率小。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种载脂蛋白B抗血清的制备方法，该制备方法的优点有：
1）用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的LDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省（20倍），为大批量提取ApoB提供了条件；
2）合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的二分之一，而且免疫的效价和成功率亦比传统方法提高。
为实现上述目的，本发明的载脂蛋白B抗血清的制备方法包括如下步骤：
1）血清的预处理：将用于制备载脂蛋白B的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-8mol/L的二价金属离子处理后获得低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白；
2）净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取：将获得的低密度脂蛋白依次经过生理盐水和0.5-1.1mol/L的草酸钾处理，离心过后取上层液进行透析获得低密度脂蛋白粗品，对低密度脂蛋白粗品用密度调节试剂进行密度调节，调节完成后进行超速离心，再通过凝胶柱层析获得净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白；
3）载脂蛋白B抗血清的制备：将载脂蛋白B作为抗原对动物进行免疫反应，制备载脂蛋白B抗血清。
通过采用上述方案，先用较低浓度的多阴离子化合物和二价金属离子沉淀血清中的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，离心后将沉淀物用生理盐水溶解，接着再用草酸钾沉淀多阴离子，离心后上层液透析后即为LDL粗品（其浓度是血清中LDL含量的20倍），然后经超速离心，得到净含ApoB的LDL组份，这样一次超速离心提纯的LDL量相当于直接从血清中分离LDL量的20倍，大大节约了超速离心的次数和时间。
本发明的进一步设置为，在所述2）步骤中，在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，所述密度调节试剂为溴化钾，所述低密度脂蛋白调节后的密度范围为1.03-1.05g/cm3。
通过采用上述方案，LDL的密度范围为1.003-1.063，密度较低的LDL颗粒含ApoC，而密度较高的颗粒含ApoE.故取d =1.030-1.050密度范围，净含ApoB，大大提升了ApoB的纯度。
本发明的进一步设置为，在所述2）步骤中，在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，所述超速离心的转速为40000-50000转/分，温度为8℃。
通过采用上述方案，将离心的转速设置为40000-50000转/分，温度为8℃，能够使LDL与杂蛋白分离充分，将温度恒定为8℃也能够避免在离心时LDL发生沉淀。
本发明的进一步设置为，所述超速离心的次数为两次，所述低密度脂蛋白粗品在离心前均需通过溴化钾调节密度。
通过采用上述方案，采用溴化钾进行密度的调节，不仅用量便于控制，使密度调节的更加精确，同时溴化钾也便于除去杂质离子，避免对后续制备产生影响。
本发明的进一步设置为, 所述血清中多阴离子化合物、二价金属离子和草酸钾残留的浓度依次分别为6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
通过采用上述方案，通过草酸钾与多阴离子化合物和二价金属离子反应，将三者的浓度控制到多阴离子化合物6%、二价金属离子0.3mol/L和草酸钾0.03mol/L，可以避免引入的三种试剂对制备造成影响。
本发明的进一步设置为，所述低密度脂蛋白在离心完成后可通过添加防腐剂和海藻糖低温保存。
通过采用上述方案，将低密度脂蛋白在离心完成后可通过添加防腐剂低温保存，既避免了ApoB在进行免疫之前发生变质，同时也达到一次提纯多次免疫动物的目的。
本发明的进一步设置为，所述低温保存的温度为零下4℃至零下10℃。
通过采用上述方案，将冰冻保存的温度设置为零下4℃至零下10℃，能够保证ApoB的抗原性不会变化，能够对ApoB进行较长期保存。
本发明的进一步设置为，在所述2）步骤中，在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，采用的凝胶柱层析的凝胶为琼脂糖4B凝胶柱，收集主峰层析的物质即为净含载脂蛋白B抗原的低密度脂蛋白。
通过采用上述方案，将琼脂糖4B凝胶作为层析时使用的凝胶柱，能够使主峰当中析出的物质均为净含ApoB的LDL，避免对免疫反应产生影响。
本发明的进一步设置为，在所述3）步骤中，在载脂蛋白B抗血清的制备的过程中，所述作用在免疫动物上的净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白，其密度选取为1.03-1.05g/cm、用量为每次5-9mg/每只免疫动物。
通过采用上述方案，通过采用上述方案，用在免疫动物上的ApoB为每次5-9/mg每只免疫动物，其密度选取为1.03-1.05g/cm，在免疫动物时只需要免疫2次，大多数绵羊的抗体效价即可达到要求，剩下的少数绵羊再追加免疫注射一次，抗体效价即可达到要求。不但免疫时间上只是传统方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。
本发明的进一步设置为，所述用于制备载脂蛋白B的血清均通过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗体以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体检测，且检测结果须呈阴性。
通过采用上述方案，将制备ApoB的血清通过病毒检测能够保证本发明提供的载脂蛋白B抗血清的制备方法所制备出的ApoB抗血清无毒无害，在进行ApoB测定时不会对被测定者造成损害，提高了生物安全性。
具体实施方式
本发明的制备步骤具体可分为：1）血清的预处理；2）净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取；3）载脂蛋白B抗血清的制备。
具体实施方式如下：
实施例一：1、LDL粗品的提取：收集混合人血清5L，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加10%多阴离子 25ml 和2M 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL(可用HDL粗品的提取时第一步的沉淀物),收集沉淀物加0.5M草酸钾200ml，使多阴离子沉淀并分离LDL+VLDL，离心后上层液用生理盐水透析，备用。
2、LDL组份的进一步提纯：用KBr调节透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管），50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.050，按上述离心条件离心，收集离心管上层液，用生理盐水透析后，加防腐剂和海藻糖，4℃冰箱保存，至少可稳定一年,此抗原量至少可免疫100只绵羊，临用时按需用Sepharose 4B柱层析，收集主峰,即为净含ApoB抗原的LDL组份，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，调节浓度至1mg/ml。
3、抗ApoB血清的制备：将净含ApoB抗原的LDL组份，按5mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的抗原，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部(不要在原部位)多点皮下注射，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:512或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，LDL的分子量较大为512000D，抗原牲强，除极个别羊外，二次免疫都能达到要求，个别未达到要求者以同样剂量作第三次免疫，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只和提纯的LDL和人血清产生沉淀线，与ApoA1、ApoAⅡ、ApoC、ApoE、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例二：1、LDL粗品的提取：收集混合人血清5L，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加8%多阴离子 50ml 和2M 氯化钙 500ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL(可用HDL粗品的提取时第一步的沉淀物),收集沉淀物加0.5M草酸钾400ml，使多阴离子沉淀并分离LDL+VLDL，离心后上层液用生理盐水透析，备用。
2、LDL组份的进一步提纯：用KBr调节透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管），45000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.050，按上述离心条件离心，收集离心管上层液，用生理盐水透析后，加防腐剂和海藻糖，4℃冰箱保存，至少可稳定一年,此抗原量至少可免疫100只绵羊，临用时按需用Sepharose 4B柱层析，收集主峰,即为净含ApoB抗原的LDL组份，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，调节浓度至1mg/ml。
3、抗ApoB血清的制备：将净含ApoB抗原的LDL组份，按5mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的抗原，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部(不要在原部位)多点皮下注射，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:512或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，LDL的分子量较大为512000D，抗原牲强，除极个别羊外，二次免疫都能达到要求，个别未达到要求者以同样剂量作第三次免疫，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只和提纯的LDL和人血清产生沉淀线，与ApoA1、ApoAⅡ、ApoC、ApoE、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例三：1、LDL粗品的提取：收集混合人血清5L，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加12%多阴离子 25ml 和2.4M 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL(可用HDL粗品的提取时第一步的沉淀物),收集沉淀物加0.6M草酸钾200ml，使多阴离子沉淀并分离LDL+VLDL，离心后上层液用生理盐水透析，备用。
2、LDL组份的进一步提纯：用KBr调节透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管），45000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.050，按上述离心条件离心，收集离心管上层液，用生理盐水透析后，加防腐剂和海藻糖，4℃冰箱保存，至少可稳定一年,此抗原量至少可免疫100只绵羊，临用时按需用Sepharose 4B柱层析，收集主峰,即为净含ApoB抗原的LDL组份，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，调节浓度至1mg/ml。
3、抗ApoB血清的制备：将净含ApoB抗原的LDL组份，按7mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的抗原，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部(不要在原部位)多点皮下注射，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:512或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，LDL的分子量较大为512000D，抗原牲强，除极个别羊外，二次免疫都能达到要求，个别未达到要求者以同样剂量作第三次免疫，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只和提纯的LDL和人血清产生沉淀线，与ApoA1、ApoAⅡ、ApoC、ApoE、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例四：1、LDL粗品的提取：收集混合人血清5L，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加18%多阴离子 25ml 和3.6M 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL(可用HDL粗品的提取时第一步的沉淀物),收集沉淀物加0.9M草酸钾200ml，使多阴离子沉淀并分离LDL+VLDL，离心后上层液用生理盐水透析，备用。
2、LDL组份的进一步提纯：用KBr调节透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管），47000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.050，按上述离心条件离心，收集离心管上层液，用生理盐水透析后，加防腐剂和海藻糖，4℃冰箱保存，至少可稳定一年,此抗原量至少可免疫100只绵羊，临用时按需用Sepharose 4B柱层析，收集主峰,即为净含ApoB抗原的LDL组份，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，调节浓度至1mg/ml。
3、抗ApoB血清的制备：将净含ApoB抗原的LDL组份，按7mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的抗原，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部(不要在原部位)多点皮下注射，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:512或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，LDL的分子量较大为512000D，抗原牲强，除极个别羊外，二次免疫都能达到要求，个别未达到要求者以同样剂量作第三次免疫，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只和提纯的LDL和人血清产生沉淀线，与ApoA1、ApoAⅡ、ApoC、ApoE、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例五：1、LDL粗品的提取：收集混合人血清5L，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加20%多阴离子 25ml 和4M 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL(可用HDL粗品的提取时第一步的沉淀物),收集沉淀物加1M草酸钾200ml，使多阴离子沉淀并分离LDL+VLDL，离心后上层液用生理盐水透析，备用。
2、LDL组份的进一步提纯：用KBr调节透析后的LDL+VLDL溶液，使其密度到1.030,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管），50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.050，按上述离心条件离心，收集离心管上层液，用生理盐水透析后，加防腐剂和海藻糖，4℃冰箱保存，至少可稳定一年,此抗原量至少可免疫100只绵羊，临用时按需用Sepharose 4B柱层析，收集主峰,即为净含ApoB抗原的LDL组份，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，调节浓度至1mg/ml。
3、抗ApoB血清的制备：将净含ApoB抗原的LDL组份，按8mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的抗原，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部(不要在原部位)多点皮下注射，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:512或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，LDL的分子量较大为512000D，抗原牲强，除极个别羊外，二次免疫都能达到要求，个别未达到要求者以同样剂量作第三次免疫，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只和提纯的LDL和人血清产生沉淀线，与ApoA1、ApoAⅡ、ApoC、ApoE、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）血清的预处理：将用于制备载脂蛋白B的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-8mol/L的二价金属离子处理后获得低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白；
2）净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取：将获得的低密度脂蛋白依次经过生理盐水和0.5-1.1mol/L的草酸钾处理，离心过后取上层液进行透析获得低密度脂蛋白粗品，对低密度脂蛋白粗品用密度调节试剂进行密度调节，调节完成后进行超速离心，再通过凝胶柱层析获得净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白；
3）载脂蛋白B抗血清的制备：将载脂蛋白B作为抗原对动物进行免疫反应，制备载脂蛋白B抗血清。
2.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：在所述2）步骤中，在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，所述密度调节试剂为溴化钾，所述低密度脂蛋白调节后的密度范围为1.03-1.05g/cm3。
3.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：所述血清中多阴离子化合物、二价金属离子和草酸钾残留的浓度依次分别为6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
4.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，所述超速离心的转速为40000-50000转/分，温度为8℃。
5.如权利要求4所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：所述超速离心的次数为两次，所述低密度脂蛋白粗品在离心前均需通过溴化钾调节密度。
6.如权利要求4所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：所述低密度脂蛋白在离心完成后可通过添加防腐剂和海藻糖低温保存。
7.如权利要求6所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：所述低温保存的温度为零下4℃至零下10℃。
8.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：在净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取过程中，采用的凝胶柱层析的凝胶为琼脂糖4B凝胶柱，收集主峰层析的物质即为净含载脂蛋白B抗原的低密度脂蛋白。
9.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：在载脂蛋白B抗血清的制备的过程中，所述作用在免疫动物上的净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白，其密度选取为1.03-1.05g/cm、用量为每次5-9mg/每只免疫动物。
10.如权利要求1所述的载脂蛋白B抗血清的制备方法，其特征在于：所述用于制备载脂蛋白B的血清均通过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗体以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体检测，且检测结果须呈阴性。
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