CN109053877B - 从血清中提取载脂蛋白b的方法及载脂蛋白b - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法及载脂蛋白B，涉及生物化学技术领域，本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括将血清预处理后得到的载脂蛋白B粗样品经疏水层析，洗脱得到所述载脂蛋白B。本发明选用疏水层析的方法提取载脂蛋白B，显著提高了载脂蛋白B的纯化效率，既缓解了现有技术中应用化学沉淀法提取蛋白纯度低的问题，又避免了超速离心法成本高的问题，还能够大大提高提取得到的载脂蛋白B的浓度和纯度。并且，该方法操作简单，成本低廉，对设备及技术人员要求不高，易于推广应用。此外，还具有提取效果明显，回收率高，可处理量大的优点，为实现工业化大生产提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及一种从血清中提取载脂蛋白B的方法及载脂蛋白B。
背景技术
载脂蛋白B(ApoB)是人血清中低密度脂蛋白(LDL)的主要结构蛋白，约占LDL蛋白质含量的97％，其含量可反应LDL水平，血清中ApoB增高是心脑血管病的危险因素。临床上ApoB测定常作为心脑血管病的风险度估计。所有ApoB的免疫测定技术均需用ApoB抗血清，日前国际和国内通用的ApoB测定试剂盒均采用免疫比浊法(Immunoturbidimetric assay，ITA)，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度ApoB抗血清显得非常重要。
常规从血清中提取ApoB一般通过化学沉淀和超速离心两种方法。
化学沉淀法一般经过硫酸葡聚糖(DS)和二价金属离子进行沉淀，富集血清中的脂蛋白。然后经过细化分离条件，如改变沉淀剂或缓冲条件等，进行二次分离，得到富含ApoB的低密度脂蛋白样品。化学沉淀法工艺简单、成本低，但所得样品纯度很低。
超速离心法借助于不同的密度梯度溶液，经过多次的长时间高速离心，可以得到纯度较高的ApoB。超速离心作为经典的分离载脂蛋白的手段，其操作繁琐、对技术人员要求高，且耗时长、成本高，这都阻碍了超速离心技术在载脂蛋白纯化中的大规模应用。
因此，开发一种蛋白回收率高、纯度高、提取成本低，且对设备及技术人员要求低，易于推广的提取载脂蛋白B的方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种载脂蛋白B，该载脂蛋白B具有高纯度的优点。
本发明提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，所述方法包括将血清预处理后得到的载脂蛋白B粗样品经疏水层析，洗脱得到所述载脂蛋白B。
进一步地，所述预处理包括从血清中获取低密度脂蛋白并透析得到载脂蛋白B粗样品。
进一步地，将血清经高分子化合物和二价金属离子处理后，得到所述低密度脂蛋白。
进一步地，所述高分子化合物包括硫酸葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
优选地，所述高分子化合物的用量为0.01％-0.2％(W/V)，优选用量为0.05％-0.15％(W/V)；
优选地，所述二价金属离子包括硫酸锰、氯化钙或氯化锰中的一种或多种；
优选地，所述二价金属离子的浓度为0.1-1M，优选用量为0.3-0.7M。
进一步地，将所述低密度脂蛋白在高盐缓冲液中进行透析，并经还原剂处理后，固液分离得到所述载脂蛋白B粗样品；
优选地，所述高盐缓冲液中无机盐的浓度为0.5-2M，优选浓度为0.8-1.8M；
优选地，所述高盐缓冲液中无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种；
优选地，所述还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦中的一种或多种。
进一步地，采用离心的方式进行固液分离；
优选地，离心后取上清得到所述载脂蛋白B粗样品；
优选地，所述离心的转速为10000-14000rpm，温度为0-8℃。
进一步地，所述疏水层析使用的结合缓冲液含有0.5-2M的无机盐，优选含有0.8-1.8M的无机盐；
优选地，所述无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种；
优选地，所述疏水层析使用的洗脱液为tris缓冲液。
进一步地，所述疏水层析使用的层析柱的填料选自Butyl Beads 4FF填料、Octyl填料或Phenyl填料。
进一步地，所述疏水层析使用0-100％Buffer B线性梯度洗脱，得到所述载脂蛋白B；
优选地，合并20％-50％Buffer B洗脱部分，得到所述载脂蛋白B。
另外，本发明还提供了一种载脂蛋白B，应用上述的从血清中提取载脂蛋白B的方法制备得到。
本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括将血清预处理后得到的载脂蛋白B粗样品经疏水层析，洗脱得到所述载脂蛋白B。本发明选用疏水层析的方法提取载脂蛋白B，显著提高了载脂蛋白B的纯化效率，既缓解了现有技术中应用化学沉淀法提取蛋白纯度低的问题，又避免了超速离心法成本高的问题，还能够大大提高提取得到的载脂蛋白B的浓度和纯度。并且，该方法操作简单，成本低廉，对设备及技术人员要求不高，易于推广应用。此外，还具有提取效果明显，回收率高，可处理量大的优点，为实现工业化大生产提供基础。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，所述方法包括将血清预处理后得到的载脂蛋白B粗样品经疏水层析，洗脱得到所述载脂蛋白B。
本发明所用到的生物材料为血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。本发明中的从血清中提取载脂蛋白B的方法适用于的血清包括但不限于人血清、猪血清、羊血清、马血清、牛血清或鼠血清等。
疏水层析也称疏水作用下层析(hydrophobic interaction chromatographyHIC)，属于吸附层析一类。疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质分离。
本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法，选用疏水层析的方法提取载脂蛋白B，显著提高了载脂蛋白B的纯化效率，既缓解了现有技术中应用化学沉淀法提取蛋白纯度低的问题，又避免了超速离心法成本高的问题，还能够大大提高提取得到的载脂蛋白B的浓度和纯度。并且，该方法操作简单，对设备及技术人员要求不高，易于推广应用。此外，还具有提取效果明显，可处理量大的优点，为实现工业化大生产提供基础。
在一些实施方式中，所述预处理包括从血清中获取低密度脂蛋白并透析得到载脂蛋白B粗样品。
在一些优选的实施方式中，将血清经高分子化合物和二价金属离子处理后，得到所述低密度脂蛋白。
利用高分子化合物和二价金属离子处理血清，能够有效沉淀血清中的低密度脂蛋白，提高后续载脂蛋白B的提取效率。
高分子化合物一般指相对分子质量高达几千到几百万的化合物，由千百个原子以共价键相互连接而成的，虽然它们的相对分子质量很大，但都是以简单的结构单元和重复的方式连接的。在本发明中，高分子化合物作为低密度脂蛋白的吸附剂，用于从血清中分离低密度脂蛋白。
在一些优选的实施方式中，所述高分子化合物包括硫酸葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
金属离子是某种物质溶于水后的金属元素的离子，是分子组成的物质中的金属元素。二价金属离子即化合价为+2的金属离子。在本发明中，二价金属离子作为低密度脂蛋白的沉淀剂，用于从血清中沉淀分离出低密度脂蛋白沉淀物。
优选地，所述二价金属离子包括硫酸锰、氯化钙或氯化锰中的一种或多种。
在一些优选的实施方式中，将所述低密度脂蛋白在高盐缓冲液中进行透析，并经还原剂处理后，固液分离得到所述载脂蛋白B粗样品。
本发明分离得到载脂蛋白B粗样品的方法，借用了化学沉淀法方便快捷的特点，用以富集脂蛋白，得到载脂蛋白B粗样品。
优选地，所述高盐缓冲液中无机盐的浓度为0.5-2M，例如可以为，但不限于0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M或2M，优选浓度为0.8-1.8M，更优选为1.5M。
当高盐缓冲液中无机盐的浓度在上述优选范围内时，得到载脂蛋白B粗样品收率更高，纯度更高。
优选地，所述高盐缓冲液中无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种。
优选地，所述还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦中的一种或多种。
在一个优选的实施方式中，还原剂为二硫苏糖醇。
二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称为DTT)是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H10O2S2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。
当选择二硫苏糖醇作为还原剂时，能够保护蛋白质中的巯基不致氧化而失活，得到载脂蛋白B粗样品收率更高，纯度更高。
优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为20-80mM，例如可以为，但不限于20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM或80mM；优选浓度为30-70mM；更优选浓度为50mM。
当二硫苏糖醇的浓度在上述优选范围内时，在有效节约成本的基础上，得到载脂蛋白B粗样品收率更高，纯度更高。
优选地，所述二硫苏糖醇处理时间为20-30小时，例如可以为，但不限于20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时；优选处理时间为22-28小时，更优选处理时间为24小时。
当二硫苏糖醇的处理时间在上述优选范围内时，能够使还原反应进行的更彻底，在有效节约时间成本的基础上，得到载脂蛋白B粗样品收率更高，纯度更高。
在一些优选的实施方式中，采用离心的方式进行固液分离。
优选地，离心后取上清得到所述载脂蛋白B粗样品。
优选地，所述离心的转速为10000-14000rpm，例如可以为，但不限于10000rmp、11000rmp、12000rmp、13000rmp或14000rmp，优选为12000rmp；温度为0-8℃，例如可以为，但不限于0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃，优选为4℃。
在一个优选的实施方式中，血清的预处理还包括将血清进行除杂处理，典型但非限制性的除杂处理包括离心去除不溶性杂质。
在一些优选的实施方式中，所述疏水层析使用的结合缓冲液含有0.5-2M的无机盐，例如可以为，但不限于含有0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M或2M的无机盐；优选含有0.8-1.8M的无机盐；更优选含有1.5M的无机盐。
当疏水层析使用的结合缓冲液中无机盐的含量在上述优选范围内时，能够进一步提高载脂蛋白B的纯化效率、浓度和纯度。
在一个具体的实施方式中，结合缓冲液包括20mM Tris、1.5M NaCl和0.1％Tween，pH 7.4。
优选地，所述无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种。
优选地，所述疏水层析使用的洗脱液为的tris缓冲液。
在一些优选的实施方式中，所述疏水层析使用的层析柱的填料选自Butyl Beads4FF填料、Octyl填料或Phenyl填料，优选填料为Butyl Beads 4FF填料。
在一些优选的实施方式中，所述疏水层析使用0-100％Buffer B线性梯度洗脱，得到所述载脂蛋白B；
优选地，合并20％-50％Buffer B洗脱部分，得到所述载脂蛋白B。
其中，Buffer B包括20mM Tris和0.1％Tween，PH 7.4。
本发明选用特殊的Butyl柱层析，以及相应的缓冲条件、洗脱程序等，代替了复杂低效的多步超速离心，节省成本。并且，应用本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法，载脂蛋白B的纯化效率、浓度和纯度均较高。
另外，本发明还提供了一种载脂蛋白B，应用本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法制备得到。
应用本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法制备得到的载脂蛋白B，具有活性高、特异性好的优点。
下文提供了一些实例用于示例性说明本发明，而不是限制本发明的范围。
如无特殊说明，本发明所用的实验仪器及试剂的来源如下：
主要仪器：高速离心机(湖南湘仪)、AKTA层析仪(GE)；
主要试剂：硫酸葡聚糖(Sigma)、DTT(Sigma)、Tris(Sigma)，NaCl、硫酸铵等(广化)。
实施例1
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.5M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M NaCl的高盐缓冲液中，经50mM二硫苏糖醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含1.5M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例2
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.01％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和1M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有0.5M NaCl的高盐缓冲液中，经80mM二硫苏糖醇处理20h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含2M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例3
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.2％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.1M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有2M NaCl的高盐缓冲液中，经20mM二硫苏糖醇处理30h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含0.5M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例4
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.3％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.05M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有3M NaCl的高盐缓冲液中，经15mM二硫苏糖醇处理32h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含0.2M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例5
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.5M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M NaCl的高盐缓冲液中，经50mM二硫苏糖醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含1.5M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并10％-60％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例6
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)聚乙二醇和0.5M氯化钙处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M硫酸铵的高盐缓冲液中，经50mM巯基乙醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Octyl填料，所使用的结合缓冲液含1.5M硫酸铵，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例7
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)聚乙烯吡咯烷酮和0.5M氯化锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M硫酸钠的高盐缓冲液中，经50mM三(2-羧乙基)膦处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Phenyl填料，所使用的结合缓冲液含1.5M硫酸钠，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例8
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.5M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M NaCl的高盐缓冲液中，经50mM二硫苏糖醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Phenyl Beads 6FF，所使用的结合缓冲液含1.5M NaCl，洗脱液为不含NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
实施例9
本实施例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.5M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M NaCl的高盐缓冲液中，经50mM二硫苏糖醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB的层析粗样品；
(c)将ApoB的层析粗样品过疏水层析，所用填料为Butyl Beads 4FF填料，所使用的结合缓冲液含1.5M NaCl，洗脱液为含0.5M NaCl的Tris缓冲对；
上样，平衡，0-100％Buffer B线性梯度洗脱；
合并20％-50％洗脱部分，为高活性的ApoB纯样品。
对比例1
本对比例提供了一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，包括如下步骤：
(a)以0.1％(W/V)硫酸葡聚糖(15kd)和0.5M硫酸锰处理1L血清样品，搅拌30min后离心，获取上清，得到低密度脂蛋白LDL溶液；
(b)低密度脂蛋白LDL溶液透析入含有1.5M NaCl的高盐缓冲液中，经50mM二硫苏糖醇处理24h；离心，取上清得到含ApoB样品。
对比例2
以超速离心法从血清中提取ApoB。
(a)以溴化钾固体配不同密度的梯度液，进行等密度离心，密度梯度设置为1.0、1.28、1.32、1.34的梯度，离心转速及时长25000rpm、24h，得到LDL、Lp(a)等的粗提物；
(b)用DTT解离Lp(a)，用溴化钾再次进行等密度离心，密度梯度设置为1.0、1.05、1.1、1.2的梯度，离心转速及时长25000rpm、24h，得到较纯的ApoB样品。
(c)需用溴化钾等密度离心再次进行精纯，密度梯度设置为1.0、1.02、1.05、1.2的梯度，离心转速及时长25000rpm、24h，得到ApoB免疫原。
实验例
为了对本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法进行进一步的说明，分别对应用实施例1-9及对比例1和2提供的方法提取得到的载脂蛋白B的纯度、浓度及回收率进行检测，结果如下表所示：
从上表的数据可知，应用本发明实施例1-9提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B，与对比例1提供的应用现有的化学沉淀法提取得到的载脂蛋白B相比，蛋白纯度、浓度和蛋白回收率均较高。和对比例2提供的应用现有的超速离心法相比，有效的节约了成本。
实施例1-4采用相同的试剂及填料对血清中的载脂蛋白B进行提取，仅所用试剂的用量或浓度条件不同。但应用实施例1-3提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B，无论在纯度、浓度或是蛋白回收率上，均高于实施例4。说明应用本发明优选条件之间的相互配合提取载脂蛋白B，在能够有效节约成本的基础上，提取载脂蛋白B的效率更高。其中，应用本发明实施例1提供的最优选提取条件之间的相互配合提取载脂蛋白B，在保证载脂蛋白B纯度、浓度和回收率高的情况下，能够进一步节约成本。
实施例1与实施例5采用相同的试剂及填料对血清中的载脂蛋白B进行提取，仅回收的洗脱部分不同。但应用实施例1提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B，无论在纯度、浓度或是蛋白回收率上，均高于实施例5。说明应用本发明优选洗脱条件提取载脂蛋白B，在能够有效节约成本的基础上，提取载脂蛋白B的效率更高。
实施例1与实施例6和实施例7采用相同的提取条件对血清中的载脂蛋白B进行提取，仅所使用的试剂不同。但应用实施例1提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B，无论在纯度、浓度或是蛋白回收率上，均高于实施例6和实施例7。说明应用本发明优选试剂之间的相互配合提取载脂蛋白B，在能够有效节约成本的基础上，提取载脂蛋白B的效率更高。
实验例2
为了进一步说明本发明提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B的纯度，应用Elisa对应用本发明实施例1提供的从血清中提取载脂蛋白B的方法提取得到的载脂蛋白B进行检测，具体为应用Elisa间接法检测所提取ApoB免疫原的活性和特异性：
1.将待检样本稀释至10ug/ml，每孔150ul，4℃包被过夜；
2.拍板、洗净未包被的蛋白，按1:5K、100ul的用量加相应抗体与板上的包被原反应，37℃反应30min；
3.按1:2K、100ul加二抗酶，37℃显色10min后，在酶标仪读数。
结果如下：
Elisa评价：
①：采用本发明提供的方法制备得到的ApoB蛋白；
②：采用常规三步超速离心制备得到的ApoB蛋白。
结果显示，应用本发明实施例1提供的从血清中提取载脂蛋白B与AlB、IgG、ApoAI、ApoE、apoa等均无交叉，说明载脂蛋白B纯度高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (19)
1.一种从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述方法包括将血清预处理后得到的载脂蛋白B粗样品经疏水层析，洗脱得到所述载脂蛋白B；
所述预处理包括将血清经高分子化合物和二价金属离子处理；
所述高分子化合物包括硫酸葡聚糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；
所述高分子化合物的用量为0.01％-0.2％(W/V)；
所述二价金属离子包括硫酸锰、氯化钙或氯化锰中的一种或多种；
所述二价金属离子的浓度为0.1-1M。
2.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述预处理还包括将血清经高分子化合物和二价金属离子处理后透析，得到载脂蛋白B粗样品。
3.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述高分子化合物的用量为0.05％-0.15％(W/V)。
4.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述二价金属离子的浓度为0.3-0.7M。
5.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，将低密度脂蛋白在高盐缓冲液中进行透析，并经还原剂处理后，固液分离得到所述载脂蛋白B粗样品。
6.根据权利要求5所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述高盐缓冲液中无机盐的浓度为0.5-2M。
7.根据权利要求6所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述高盐缓冲液中无机盐的浓度为0.8-1.8M。
8.根据权利要求5所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述高盐缓冲液中无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求5所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦中的一种或多种。
10.根据权利要求5所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，采用离心的方式进行固液分离。
11.根据权利要求10所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，离心后取上清得到所述载脂蛋白B粗样品。
12.根据权利要求10所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述离心的转速为10000-14000rpm，温度为0-8℃。
13.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述疏水层析使用的结合缓冲液含有0.5-2M的无机盐。
14.根据权利要求13所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述疏水层析使用的结合缓冲液含有0.8-1.8M的无机盐。
15.根据权利要求13所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、硫酸铵或硫酸钠中的一种或多种。
16.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述疏水层析使用的洗脱液为tris缓冲液。
17.根据权利要求1所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述疏水层析使用的层析柱的填料选自Butyl Beads 4FF填料、Octyl填料或Phenyl填料。
18.根据权利要求1-17任一项所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，所述疏水层析使用0-100％Buffer B线性梯度洗脱，得到所述载脂蛋白B。
19.根据权利要求18所述的从血清中提取载脂蛋白B的方法，其特征在于，合并20％-50％Buffer B洗脱部分，得到所述载脂蛋白B。
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