CN104017076A - 载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 - Google Patents
载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104017076A CN104017076A CN201410004059.8A CN201410004059A CN104017076A CN 104017076 A CN104017076 A CN 104017076A CN 201410004059 A CN201410004059 A CN 201410004059A CN 104017076 A CN104017076 A CN 104017076A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apoa1
- hdl
- sero
- preparation
- apoa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种载脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）抗血清的制备方法，其技术方案要点是：1)将用于制备ApoAⅠ的血清通过化学试剂处理提纯获得高密度酯蛋白（HDL）；2)将获得的HDL通过盐酸胍和化学试剂处理后经过离心、提纯，获得ApoAⅠ；3)将ApoAⅠ作为抗原，免疫动物，制备ApoAⅠ抗血清，该发明的优势在于1)用化学试剂处理血清制得浓缩的HDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省，为大批量提取ApoAⅠ提供了条件；2)用盐酸胍处理代替传统的有机溶剂低温脱脂步骤，方法简便，省时，透析后用凝胶柱层析，收集主峰为高纯度的ApoAⅠ得率提高；3)合理提高抗原剂量免疫动物，通过改变剂量，可缩短抗血清的制备时间，而且免疫的成功率亦比传统方法高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医药领域，具体涉及一种载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法。
背景技术
载脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）是人血清中高密度脂蛋白（HDL）的主要结构蛋白，约占HDL质量的32.5-35.0% ,因此，ApoAⅠ含量可以代表HDL水平，并与HDL中的胆固醇呈明显正相关。临床上ApoAⅠ测定常作为心脑血管病的风险度估计和ApoAⅠ缺乏症（如Tangier病：是一种罕见的遗传性疾病）的诊断。所有ApoAI的免疫测定技术均需用ApoAⅠ抗血清，目前国际和国内通用的ApoAⅠ测定试剂盒均采用免疫透射比浊法(Immunoturbidimetric assay,ITA)，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度ApoAⅠ抗血清显得非常重要。
传统技术制备载脂蛋白A1抗血清，是直接用人血清通过二次超速离心制备获得HDL，然后使用Sephsrose 4B柱层析，收集主峰为HDL组份，再用醇和醚作为溶剂，醇和醚的体积比例为2：3，在-20℃下连续搅拌12-16小时进行在脱脂，经过滤，将滤纸上的去脂HDL(ApoHDL)烘干，然后将其溶解经Sephadex G-150柱层析, 收集主峰Ⅱ为ApoA1组份,再经DEAE纤维素离子交换层析得纯品。再把制得的ApoA1免疫动物，以每次3mg/每只免疫动物的剂量进行免疫，免疫4-5次，甚至更多，制备获得ApoA1的抗血清。
传统方法直接从血浆中超速离心获得HDL需要的离心次数多，且耗时长，而且用有机溶剂对HDL进行脱脂的工艺要求严格，步骤控制难，如脱脂不完全，会影响ApoAⅠ的产率，甚至完全失败，而且在进行动物的免疫过程时，耗费的时间过长，制备时间缓慢，而且免疫动物时，免疫次数多、免疫的效价和成功率也极低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，该制备方法的优点有：
1).用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的HDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省，为大批量提取ApoAⅠ提供了条件；
2)用盐酸胍处理代替传统的有机溶剂低温脱脂步骤，方法简便，省时、透析后用凝胶柱层析，收集主峰为高纯度的ApoAⅠ且得率提高；
3)合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。
为实现上述目的，本发明的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，包括如下步骤：
1) 高密度脂蛋白的提取：将用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-6mol/L的二价金属离子处理后提纯获得高密度脂蛋白；
2) 载脂蛋白AⅠ的提取：将获得的高密度脂蛋白通过浓度为4-10mol/L盐酸胍处理后经过超速离心、梯度层析，获得载脂蛋白AⅠ；
3) 载脂蛋白AⅠ抗血清的制备：将载脂蛋白AⅠ作为抗原，对免疫动物进行免疫反应，制备载脂蛋白AⅠ抗血清。
通过采用上述方案，将血清先通过低浓度的多阴离子化合物和二价金属离子处理后能够使血清中的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白沉淀，然后再加大二者浓度沉淀高密度脂蛋白，能够减少传统工艺当中的离心所花的时间和材料，使ApoAⅠ抗血清制备的效率大大提升，为大批量提取ApoAⅠ提供了条件；然后通过超速离心（密度范围用d =1.075-1.190），目的是去掉低端富含ApoC和高端富含ApoE的HDL颗粒，有利于后继的载脂蛋白A1的提纯，同时将HDL用盐酸胍处理，相比传统的醇醚脱脂(在低温下连续拌)，无机试剂的反应条件更加容易控制，而且工艺要求简单，避免了HDL脱脂时出现问题而影响ApoAⅠ的产率的情况发生，方法简便，省时、透析后用凝胶柱层析，收集主峰为高纯度的ApoAⅠ且得率提高；最后通过用将ApoAⅠ作为抗原注射到免疫动物身上，通过免疫动物本身的免疫反应产生ApoAⅠ抗血清，通过合理的加大剂量，可缩短抗血清的制备时间，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。
本发明的进一步设置为，所述第1)步骤中，所述用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过多阴离子化合物和二价金属离子处理后，需再经过浓度为0.3-1mol/L的草酸钾获得高密度脂蛋白粗品。
通过采用上述方案，将通过多阴离子化合物和二价金属离子处理后的血清用0.3-1mol/L的草酸钾进行处理，能够除去其中多余的多阴离子和二价金属离子，确保二者不会对后续的制备产生影响。
本发明的进一步设置为，所述获得的高密度脂蛋白粗品,需进一步用超速离心提纯时将密度范围缩小到1.075-1.190 d。
通过采用上述方案，将载脂蛋白粗品进一步用超速离心提纯将密度范围缩小到1.075-1.190 d,目的是将含ApoC和ApoE较多的HDL颗粒去掉，为后继的提纯打好基础。
本发明的进一步设置为，所述获得的高密度脂蛋白需依次经过溴化钾进行密度调节，然后用生理盐水透析后，离心，提纯，获得高密度脂蛋白纯品。
通过采用上述方案，将HDL用溴化钾调节密度，然后离心机进行离心，离心后收集下层液体，用溴化钾再次调节密度，获得的高密度脂蛋白粗品,收集上层液，用生理盐水透析即可获得较高纯度的HDL，能够使离心的次数和时间大大减少，同时将高密度脂蛋白进行提纯，也能够避免在进行载脂蛋白AⅠ提取时，引入其他的杂蛋白，提高产品的品质。
本发明的进一步设置为, 所述血清中多阴离子化合物、二价金属离子和草酸钾残留的浓度依次分别为6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
通过采用上述方案，通过草酸钾与多阴离子化合物和二价金属离子反应，将三者的浓度控制到多阴离子化合物6%、二价金属离子0.3mol/L和草酸钾0.03mol/L，可以避免引入的三种试剂对制备造成影响。
本发明的进一步设置为，所述第2)步骤所述的盐酸胍处理包括将高密度脂蛋白依次通过盐酸胍、溴化钾、生理盐水和浓度为5-11mol/L的尿素进行处理。
通过采用上述方案，将HDL纯品中加入盐酸胍，将HDL中的载脂蛋白（主要为ApoAⅠ，以及ApoAⅡ、ApoC，ApoE等）分离出来，免去了有机溶剂低温脱脂的繁琐步骤，用生理盐水除去盐酸胍，用溴化钾调节其密度，然后再次离心，收集离心管下层溶液，用生理盐水除去溴化钾，再用尿素透析，通过采用上述方法，改变传统的用醇醚脱脂，避免了传统工艺制备时失败而使HDL的浪费。
本发明的进一步设置为，所述经过盐酸胍处理的高密度脂蛋白通过凝胶柱层析纯化获取载脂蛋白AⅠ，并将载脂蛋白AⅠ进行冰冻保存。
通过采用上述方案，将处理过的HDL纯品通过凝胶柱层析层析，收集主峰的样品即为ApoA1纯品，这样获取的ApoA1纯品相比传统方式，含量大大提高，同时将ApoA1进行冰冻保存，达到一次提纯多次免疫动物的目的。
本发明的进一步设置为，所述冰冻保存的温度为零下20℃至零下80℃。
通过采用上述方案，将冰冻保存的温度设置为零下20℃至零下80℃，能够保证ApoA1的抗原性不会变化，能够对ApoA1进行较长期保存。
本发明的进一步设置为，所述作用在免疫动物上的ApoAⅠ为每次8-14mg/每只免疫动物。
通过采用上述方案，用在免疫动物上的ApoAⅠ为每次8-14/mg每只免疫动物，在免疫动物时只需要免疫2次，大多数绵羊的抗体效价即可达到要求，剩下的少数绵羊再追加免疫注射一次，抗体效价即可达到要求。不但免疫时间上只是传统方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。
本发明的进一步设置为, 所述免疫动物时采用的注射方式采用背部多点皮下注射。
通过采用上述方案，采用背部多点注射，能够避免一次性大剂量注射对免疫动物造成的免疫反应过于激烈，使免疫动物死亡。
本发明的进一步设置为，所述用于制备ApoAⅠ的血清均通过乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)检测结果呈阴性。
通过采用上述方案，将制备ApoAⅠ的血清通过病毒检测能够保证本发明提供的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法所制备出的ApoAⅠ抗血清无毒无害，在进行ApoAⅠ测定时不会对被测定者造成损害，提高了生物安全性。
具体实施方式
本发明的制备步骤具体可分为：1)HDL粗品的提取；2)HDL组份的进一步提纯；3)ApoAⅠ的提取；4)抗ApoAⅠ血清的制备。
具体实施方式如下：
实施例一：1．HDL粗品的提取：收集混合人血清5L(此处需说明的是，本实施例中所采取的用量只是为了便于本发明进行步骤的阐述，具体的用量以生产情况为准)，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加10%多阴离子 25ml 和2mol/L 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL，收集作ApoB抗原提取用，收集上层液，追加10%多阴离子 250ml 和2mol/L 氯化钙 250ml，混匀，放置2小时后，4000转/分，离心20分钟，收集沉淀物即为HDL组份，加0.5mol/L草酸钾250ml，使多阴离子沉淀并分离HDL，离心后上层液（HDL组份）用生理盐水透析，备用。
2．HDL组份的进一步提纯：HDL组份的密度范围为1.063-1.21 g/cm3,用KBr调节透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机（此处需说明的是，本实施例所采用的离心机型号只是便于实施例说明，任何满足制备要求的离心机均可使用），专用离心管（30ml/每管）装10管，50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用溴化钾（KBr）调节密度到1.21g/cm3，按上述离心条件离心，收集上层液，用生理盐水透析，即为ρ=1.063-1.21 g/cm3的HDL纯品。
3．ApoAⅠ的提取：HDL纯品加盐酸胍到6mol/L，37℃保温3小时，使HDL颗粒中的载脂蛋白（主要为ApoAⅠ，以及ApoAⅡ、ApoC，ApoE等）分离出来，用生理盐水透析除去盐酸胍，用KBr调节密度到1.21 g/cm3，按上述离心条件，再次离心，收集离心管下三分之一段的溶液，用生理盐水透析除去KBr,再用6mol/L尿素透析，备用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度层析，收集主峰即为ApoAⅠ纯品，透析去除尿素，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，总计ApoAⅠ含量约2.3g，调节ApoAⅠ浓度至2mg/ml,-20℃，冰冻保存，至少可稳定二年，此ApoAⅠ抗原量至少可免疫约80只绵羊。
4．抗ApoAⅠ血清的制备：将ApoAⅠ纯品，10mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的ApoAⅠ纯品，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部多点皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:16或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，对于效价未达到1:16者以同样剂量作第三次免疫注射后第十天进行效价测定，达到要求的羊作颈静脉插管放血，并及时分离出血清，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只与ApoAⅠ纯品或提纯的HDL产生沉淀线，与ApoB、ApoAⅡ、ApoC、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例二：1．HDL粗品的提取：收集混合人血清5L(此处需说明的是，本实施例中所采取的用量只是为了便于本发明进行步骤的阐述，具体的用量以生产情况为准)，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加20%多阴离子 25ml 和4mol/L 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL，收集作ApoB抗原提取用，收集上层液，追加20%多阴离子 250ml 和4mol/L 氯化钙 250ml，混匀，放置2小时后，4000转/分，离心20分钟，收集沉淀物即为HDL组份，加1mol/L草酸钾250ml，使多阴离子沉淀并分离HDL，离心后上层液（HDL组份）用生理盐水透析，备用。
2．HDL组份的进一步提纯：HDL组份的密度范围为1.063-1.21 g/cm3,用KBr调节透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管）装10管，50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.21 g/cm3，按上述离心条件离心，收集上层液，用生理盐水透析，即为ρ=1.063-1.21 g/cm3的HDL纯品。
3．ApoAⅠ的提取：HDL纯品加盐酸胍到9mol/L，37℃保温3小时，使HDL颗粒中的载脂蛋白（主要为ApoAⅠ，以及ApoAⅡ、ApoC，ApoE等）分离出来，用生理盐水透析除去盐酸胍，用KBr调节密度到1.21，按上述离心条件，再次离心，收集离心管下三分之一段的溶液，用生理盐水透析除去KBr,再用6mol/L尿素透析，备用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度层析，收集主峰，即为ApoAⅠ纯品，透析去除尿素，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，总计ApoAⅠ含量约2.3g，调节ApoAⅠ浓度至2mg/ml,-20℃，冰冻保存，至少可稳定二年，此ApoAⅠ抗原量至少可免疫约80只绵羊。
4．抗ApoAⅠ血清的制备：将ApoAⅠ纯品，10mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的ApoAⅠ纯品，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部多点皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:16或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，对于效价未达到1:16者以同样剂量作第三次免疫注射后第十天进行效价测定，达到要求的羊作颈静脉插管放血，并及时分离出血清，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只与ApoAⅠ纯品或提纯的HDL产生沉淀线，与ApoB、ApoAⅡ、ApoC、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例三：1．HDL粗品的提取：收集混合人血清5L(此处需说明的是，本实施例中所采取的用量只是为了便于本发明进行步骤的阐述，具体的用量以生产情况为准)，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加15%多阴离子 25ml 和3mol/L 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL，收集作ApoB抗原提取用，收集上层液，追加15%多阴离子 250ml 和3mol/L 氯化钙 250ml，混匀，放置2小时后，4000转/分，离心20分钟，收集沉淀物即为HDL组份，加1mol/L草酸钾250ml，使多阴离子沉淀并分离HDL，离心后上层液（HDL组份）用生理盐水透析，备用。
2．HDL组份的进一步提纯：HDL组份的密度范围为1.063-1.21 g/cm3,用KBr调节透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKmol/LAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管）装10管，50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.21 g/cm3，按上述离心条件离心，收集上层液，用生理盐水透析，即为d=1.063-1.21 g/cm3的HDL纯品。
3．ApoAⅠ的提取：HDL纯品加盐酸胍到7mol/L，37℃保温3小时，使HDL颗粒中的载脂蛋白（主要为ApoAⅠ，以及ApoAⅡ、ApoC，ApoE等）分离出来，用生理盐水透析除去盐酸胍，用KBr调节密度到1.21，按上述离心条件，再次离心，收集离心管下三分之一段的溶液，用生理盐水透析除去KBr,再用8mol/L尿素透析，备用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度层析，收集主峰，即为ApoAⅠ纯品，透析去除尿素，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，总计ApoAⅠ含量约2.3g，调节ApoAⅠ浓度至2mg/ml,-20℃，冰冻保存，至少可稳定二年，此ApoAⅠ抗原量至少可免疫约80只绵羊。
4．抗ApoAⅠ血清的制备：将ApoAⅠ纯品，10mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的ApoAⅠ纯品，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部多点皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:16或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，对于效价未达到1:16者以同样剂量作第三次免疫注射后第十天进行效价测定，达到要求的羊作颈静脉插管放血，并及时分离出血清，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只与ApoAⅠ纯品或提纯的HDL产生沉淀线，与ApoB、ApoAⅡ、ApoC、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
实施例四：1．HDL粗品的提取：收集混合人血清5L(此处需说明的是，本实施例中所采取的用量只是为了便于本发明进行步骤的阐述，具体的用量以生产情况为准)，[经检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒表面抗体(HCV抗体)以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体(HIV抗体)均为阴性]，加18%多阴离子 25ml 和3.6mol/L 氯化钙 250ml,混匀，置30分钟，4000转/分，离心20分钟，沉淀物为LDL和VLDL，收集作ApoB抗原提取用，收集上层液，追加15%多阴离子 250ml 和3.6mol/L 氯化钙 250ml，混匀，放置2小时后，4000转/分，离心20分钟，收集沉淀物即为HDL组份，加1mol/L草酸钾250ml，使多阴离子沉淀并分离HDL，离心后上层液（HDL组份）用生理盐水透析，备用。
2．HDL组份的进一步提纯：HDL组份的密度范围为1.063-1.21 g/cm3,用KBr调节透析后的HDL溶液，使其密度到1.063 g/cm3,用BECKMAN-COULTER L-90K制备型超速离心机，专用离心管（30ml/每管）装10管，50000转/分，8℃，离心20小时，收集离心管下层液，再用KBr调节密度到1.21 g/cm3，按上述离心条件离心，收集上层液，用生理盐水透析，即为d=1.063-1.21 g/cm3的HDL纯品。
3．ApoAⅠ的提取：HDL纯品加盐酸胍到8mol/L，37℃保温3小时，使HDL颗粒中的载脂蛋白（主要为ApoAⅠ，以及ApoAⅡ、ApoC，ApoE等）分离出来，用生理盐水透析除去盐酸胍，用KBr调节密度到1.21，按上述离心条件，再次离心，收集离心管下三分之一段的溶液，用生理盐水透析除去KBr,再用9mol/L尿素透析，备用，然后用DEAE-Sepharose CL6B柱梯度层析，收集主峰，即为ApoAⅠ纯品，透析去除尿素，用岛津-UV2550型分光光度计280nm波长测定蛋白含量，总计ApoAⅠ含量约2.3g，调节ApoAⅠ浓度至2mg/ml,-20℃，冰冻保存，至少可稳定二年，此ApoAⅠ抗原量至少可免疫约80只绵羊。
4．抗ApoAⅠ血清的制备：将ApoAⅠ纯品，10mg/每只羊，用福氏完全佐剂乳化，在绵羊的背部多点皮下注射，二周后，用同样剂量的ApoAⅠ纯品，用福氏不完全佐剂乳化，再次在绵羊的背部多点皮下注射(不要在原部位)，第二次注射后十天，颈静脉抽血约5ml,分离血清，以倍比稀释法将此抗血清稀释后，对人血清作双向免疫扩散测定，效价达到1:16或以上者到第十四天作颈静脉插管放血，并及时分离出抗血清，对于效价未达到1:16者以同样剂量作第三次免疫注射后第十天进行效价测定，达到要求的羊作颈静脉插管放血，并及时分离出血清，将所有的血清混合后作为一个批次，用双向免疫扩散法进行纯度鉴定，结果应只与ApoAⅠ纯品或提纯的HDL产生沉淀线，与ApoB、ApoAⅡ、ApoC、人白蛋白不产生沉淀线，纯度达到要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1) 高密度脂蛋白的提取：将用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-6mol/L的二价金属离子处理后提纯获得高密度脂蛋白；
2) 载脂蛋白AⅠ的提取：将获得的高密度脂蛋白通过浓度为4-10mol/L盐酸胍处理后经过超速离心、梯度层析，获得载脂蛋白AⅠ；
3) 载脂蛋白AⅠ抗血清的制备：将载脂蛋白AⅠ作为抗原，对免疫动物进行免疫反应，制备载脂蛋白AⅠ抗血清。
2.如权利要求1所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述第1)步骤中，所述用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过多阴离子化合物和二价金属离子处理后，需再经过浓度为0.3-1mol/L的草酸钾沉淀除去多阴离子化合物和二价金属离子，获得高密度脂蛋白粗品。
3.如权利要求2所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述获得的高密度脂蛋白粗品,需进一步用超速离心提纯时将密度范围缩小到1.075-1.190 d。
4.如权利要求2所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述获得的高密度脂蛋白粗品需依次经过溴化钾进行密度调节，然后用生理盐水透析后，离心，提纯，获得高密度脂蛋白纯品。
5.如权利要求2所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述血清中多阴离子化合物、二价金属离子和草酸钾残留的浓度依次分别为6%、0.3mol/L和0.03mol/L。
6. 如权利要求1所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于： 所述第2)步骤所述的盐酸胍处理包括将高密度脂蛋白依次通过盐酸胍、溴化钾、生理盐水和浓度为5-11mol/L的尿素进行处理。
7.如权利要求6所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述经过盐酸胍处理的高密度脂蛋白通过凝胶柱层析纯化获取载脂蛋白AⅠ，并将载脂蛋白AⅠ进行冰冻保存。
8.如权利要求7所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述冰冻保存的温度为零下20℃至零下80℃。
9.如权利要求1所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述第3)步骤中，所述作用在免疫动物上的载脂蛋白AⅠ的量为每次8 – 14mg/每只免疫动物。
10.如权利要求1-9任意一项所述的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，其特征在于：所述用于制备载脂蛋白AⅠ的血清均通过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗体以及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗体检测，且检测结果须呈阴性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410004059.8A CN104017076B (zh) | 2014-01-06 | 2014-01-06 | 载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410004059.8A CN104017076B (zh) | 2014-01-06 | 2014-01-06 | 载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104017076A true CN104017076A (zh) | 2014-09-03 |
| CN104017076B CN104017076B (zh) | 2016-07-06 |
Family
ID=51434114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410004059.8A Active CN104017076B (zh) | 2014-01-06 | 2014-01-06 | 载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104017076B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105001329A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-10-28 | 海奥斯生物科技镇江有限公司 | 一种动物抗血清提取方法 |
| CN105452291A (zh) * | 2013-08-08 | 2016-03-30 | 杰特有限公司 | 去除污染物的方法 |
| CN106983856A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-28 | 杨宝田 | 富含载脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制剂制造方法及应用 |
| CN108362884A (zh) * | 2017-03-31 | 2018-08-03 | 谢君 | 一种肿瘤危险度和治疗效果评估的血清及组织分子指标 |
| CN109187996A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种测定载脂蛋白c-ⅲ浓度的试剂盒及制备方法 |
-
2014
- 2014-01-06 CN CN201410004059.8A patent/CN104017076B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘照平等: ""人载脂蛋白A I的分离纯化"", 《中国基层医药》, vol. 17, no. 14, 31 July 2010 (2010-07-31) * |
| 王克勤等: ""人血清脂蛋白的研究VI、 人血清高密度脂蛋白的大量分离和进一步提纯和鉴定"", 《中 国 医学 科 学 院 学 报》, vol. 1, no. 1, 30 September 1979 (1979-09-30) * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105452291A (zh) * | 2013-08-08 | 2016-03-30 | 杰特有限公司 | 去除污染物的方法 |
| CN105452291B (zh) * | 2013-08-08 | 2019-03-19 | 杰特有限公司 | 去除污染物的方法 |
| CN105001329A (zh) * | 2015-08-05 | 2015-10-28 | 海奥斯生物科技镇江有限公司 | 一种动物抗血清提取方法 |
| CN106983856A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-07-28 | 杨宝田 | 富含载脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制剂制造方法及应用 |
| CN108362884A (zh) * | 2017-03-31 | 2018-08-03 | 谢君 | 一种肿瘤危险度和治疗效果评估的血清及组织分子指标 |
| CN109187996A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种测定载脂蛋白c-ⅲ浓度的试剂盒及制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104017076B (zh) | 2016-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104017076A (zh) | 载脂蛋白aⅰ抗血清的制备方法 | |
| CN104342040B (zh) | 一种高胶融温度鱼鳞明胶的制备方法 | |
| CN107266569B (zh) | 一种柞蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法 | |
| CN107383193B (zh) | 一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法 | |
| CN101135687B (zh) | 一种用于检测apoA I、apoB的试剂盒 | |
| CN102504043B (zh) | 抗体亲和层析工业化制备保肝抗肝纤维化活性石斛多糖的方法 | |
| CN104017075A (zh) | 载脂蛋白b抗血清的制备方法 | |
| CN102127165B (zh) | 一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺 | |
| CN1119352C (zh) | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 | |
| CN111500586B (zh) | 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用 | |
| CN101974490B (zh) | 一种猪瘟病毒纯化方法 | |
| CN103074303A (zh) | 产生抗人ngal特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体与应用 | |
| CN103923211A (zh) | 一种医药级重组人血清白蛋白的纯化方法 | |
| CN102199198A (zh) | 人呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法 | |
| CN103333911A (zh) | 利用重组毕赤酵母生产蛋白a的方法 | |
| CN101671655B (zh) | 一种艾滋病毒p24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用 | |
| CN101397339B (zh) | 糖蛋白中去除/灭活病毒的方法 | |
| CN1807646A (zh) | 重组人血清白蛋白－干扰素α2b 融合蛋白的生产方法 | |
| CN102660550B (zh) | 基因重组人胸腺素β4的制备方法 | |
| CN106279376A (zh) | 一种猪圆环病毒抗原纯化方法 | |
| CN1500873A (zh) | 沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用 | |
| CN103397036B (zh) | 一种用于毕赤酵母表达重组人血清白蛋白的基因序列 | |
| CN1473843A (zh) | 重组 trail 包含体蛋白的工业化提取、复性和纯化方法 | |
| CN102329378A (zh) | 一种丙型肝炎病毒核心抗原及其抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞株 | |
| CN103641910A (zh) | 一种鸡载脂蛋白aⅰ的分离纯化及鉴定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190411 Address after: 315000 Room 03, 15 Building No. 82, 708 Lane, West Section of Huancheng North Road, Jiangbei District, Ningbo City, Zhejiang Province Patentee after: Yang Changguo Address before: 315000 No. 181 Canghai Road, Ningbo Science and Technology Park, Zhejiang Province Patentee before: Ningbo Bo Tai Bioisystech Co., Ltd |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220418 Address after: Tian'ao village, Chumen Town, Yuhuan City, Taizhou City, Zhejiang Province 317600 Patentee after: Yuhuan Nanfang Reagent Co.,Ltd. Address before: 315000 Room 03, 15 Building No. 82, 708 Lane, West Section of Huancheng North Road, Jiangbei District, Ningbo City, Zhejiang Province Patentee before: Yang Changguo |