CN104569447A - 用于动物病原体检测的无害化阳性对照品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品，所述阳性对照品由包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗按照1：1:1-8的摩尔比混合制成。本发明利用免疫学方法解决间接法酶免诊断试剂阳性对照材料的来源问题，并避免使用该类动物血清可能含有病原体而导致污染环境或造成疾病传染的潜在风险。

Description

用于动物病原体检测的无害化阳性对照品
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，具体地说，涉及一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
背景技术
随着免疫学技术的发展，利用酶联免疫学和化学发光方法对各种兽类血清中所含病原体抗体的检测试剂日益增多，主要有以下两类。第一类为动物免疫后对免疫效果进行评价的检测试剂，如常用的口蹄疫、猪瘟抗体检测试剂、犬和猫的狂犬病毒抗体检测试剂盒等；还有一类为鉴别动物感染病原体的检测试剂，如常用的各类牛、羊、猪的各种病原体感染检测试剂盒。这些试剂盒主要采用双抗原夹心法、间接法或捕获法。
间接法具体操作是将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。加酶标抗抗体，使固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。最后加入底物显色。
双抗原夹心法是指利用酶联免疫吸附法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理，以特定病原体的特异性抗体为检测目标，通过包被和标记该病原体的特异性抗原来对血清或血浆样本中病原体特异性抗体进行体外检测的试剂。
捕获法是指利用酶联免疫吸附法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理，以特定病原体的特异性IgM抗体为检测目标，通过包被抗IgM抗体来对血清或血浆样本中病原体特异性IgM抗体进行体外检测的试剂。
以上三种方法所采用的阳性对照往往是该检测试剂所测物种该类抗原阳性的血清加工后获得的，有些病原体血清属于高风险并且不易获取，即使经过灭活也有潜在生物危害，因此获取稳定、安全的阳性对照将很大程度提升试剂的安全性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测病原体的无害化阳性对照品，由包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗按照1：1:1-8的摩尔比混合制成。
所述包被抗原为待检测病原体抗原。
所述包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗利用免疫学方法制备得到。
本发明所述阳性对照品的制备方法包括如下步骤：
(1)制备包被物抗体和标记物的抗体；
(2)制备二抗；
(3)阳性对照的获得：将包被物抗体和标记物的抗体以及二抗混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释作为阳性对照
上述方法中，步骤(3)包被物抗体、标记物抗体以及二抗按照1：1:1-8的摩尔比混合。
进一步地，步骤(3)中按照与抗体混合液的体积比10:1小牛血清，按照与抗体混合液的体积比2:1加入10％的硫柳汞后，用生理盐水稀释至总体积为抗体混合液的体积的200倍后作为阳性对照。
优选地，本发明所述包被物抗体和标记物的抗体为单抗；所述二抗为多抗。
含有本发明阳性对照品的动物病原体检测试剂盒也属于本发明的保护范围。
进一步地，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。
本发明还提供了上述阳性对照品在无害化检测动物病原体中的应用。阳性对照品的浓度为0.05-20mg/ml。优选地，阳性对照品的浓度为0.5mg/ml。
本发明所采用的包被物和标记物的单抗或多抗特点如下：可与包被物和标记物反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的抗体。
本发明所采用的包被物和标记物的单抗或多抗的二抗特征如下：可与包被物和标记物的单抗或多抗反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的抗体。
本发明的有益效果在于：利用免疫学方法制备包被物和标记物单抗或多抗和制备它们的二抗，按照1:1:1-8的摩尔比混合，添加其他辅料稀释后作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源受限并避免使用含有动物病原的血清作为阳性对照的潜在风险。本发明采用严格检验的实验动物进行抗体制备从源头上保障了生物安全性，这些来源与实验动物的抗体制成的阳性对照不存在生物危害风险，同时，和从病毒感染者身体内采集相比较来源更广泛，抗体效价更高，完全可以满足试剂盒中作为阳性对照的需要。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1无害化阳性对照品的制备
通过利用免疫学方法制备鼠抗包被物和标记物单抗，并制备兔抗鼠多抗，按照包被物单抗：标记物单抗：多抗比为1：1：1加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用阳性血清潜在的风险。
1、鼠抗包被物和标记物单抗的获得：以包被物和标记物作为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，然后用有限稀释方法获得可分泌红细胞单抗的杂交瘤。具体步骤如下：
取0.2mg/ml的包被物和标记物，初次免疫采用皮下多点注射，0.1ml/点，共四点。2周后第二次免疫，剂量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，剂量同上，腹腔注射(5～7天后采血测其效价)。再过2～3周后加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射。最后一次加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取1×107脾淋巴细胞悬液备用，准备融合。
将6～10周大的BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min，用20％小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×107/ml，加入96孔板，100μl/孔放入37℃CO2孵箱培养，制得饲养细胞。
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37℃预温的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴作用90s，加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，离心，800rpm,6min。弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬细胞。将上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养，完成融合。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。最后进行有限稀释得到单克隆：克隆前1天制备饲养细胞层(同上)；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，计数，调整细胞为3～10个细胞/ml；取头天准备的有饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl，孵育于37℃、5％CO2孵箱中；在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。挑取效价高于8×107的特异性单克隆冻存，并复苏传代，挑取稳定的细胞株冻存备用。
腹水的制备：先注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠腹腔，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获2～5ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到2～5mg/ml。
单克隆抗体的纯化：将蛋白A-Sepharose置于50倍体积的Tris缓冲液(pH8.6)中(超过介质50倍v/v)，充分溶胀，在室温下将其装入直径2.5cm的玻璃层析柱中，用Tris缓冲液洗以平衡；腹水样品经三倍体积Tris缓冲液稀释后，以1-5ml/min速度上样，用Tris缓冲液洗至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)；依次用柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸--HCl缓冲液连续洗脱结合蛋白；将分部收集的洗脱的蛋白直接装入有中和缓冲液的试管中(所加有的中和缓冲液应为洗脱液的1/4体积)；用超滤器浓缩所得的单克隆抗体至1-5mg/ml，将浓缩的抗体置-20℃储存。
2.兔抗鼠IgG的多抗的制备
纯化后的鼠IgG对生理盐水透析后，取0.1mg与等体积福氏完全佐剂混和，用乳化器完全乳化，背部皮下多点免疫2Kg左右兔子一只，三周后，改用福氏不完全佐剂，0.1mg鼠IgG背部皮下再次免疫，第二次免疫4周后，取0.2mg鼠IgG耳静脉加强免疫，10天后从耳静脉取血，免疫扩散法测抗体效价，若效价大于32，则从颈动脉采血，获得鼠IgG多抗血清，若效价小于32，两周后再用同剂量鼠IgG加强免疫，直至获得满意效价。
3.包被物和标记物的单抗和兔抗鼠IgG多抗混合阳性对照的获得：取包被物和标记物的单抗各1mg和兔抗鼠IgG的多抗4mg混合并加入50ml小牛血清和10ml 10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
4.阳性对照的使用：
在使用该检测试剂检测测时直接替代阳性对照使用。
实施例2本发明阳性对照品的应用
利用免疫学方法制备兔抗包被物和标记物单抗，并制备羊抗兔多抗，按照包被物单抗：标记物单抗：多抗比为1：1：5的摩尔比例加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用阳性血清潜在的风险。
1.兔抗包被物和标记物单抗的获得：以包被物和标记物作为免疫抗原，免疫兔子，按常规兔单抗制备方法制备兔源单抗，并纯化浓缩得到浓度为5mg/ml的兔源单抗，-20℃储存。
2.羊抗兔IgG的多抗的制备
按常规免疫学方法制备，采用免疫扩散法测抗体效价，若效价大于32，则从颈动脉采血，获得鼠IgG多抗血清，若效价小于32，两周后再用同剂量兔IgG加强免疫，直至获得满意效价。所得抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化获得高纯度抗体。
3.无害化阳性对照的获得：取包被物和标记物的单抗各1mg和羊抗兔IgG的多抗4mg混合并加入50ml小牛血清和10ml10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
4.阳性对照的使用：
在使用该检测试剂检测测时直接替代阳性对照使用。
实施例3
本发明通过利用免疫学方法制备兔抗包被物和标记物多抗，并制备羊抗兔多抗，按照包被物多抗：标记物多抗：多抗比为1：1：8的摩尔比例加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用阳性血清潜在的风险。
1.兔抗包被物和标记物多抗的获得：以包被物和标记物作为免疫抗原，免疫兔子，按常规免疫学方法制备，采用免疫扩散法测抗体效价，若效价大于32，则从颈动脉采血，获得鼠IgG多抗血清，若效价小于32，两周后再用同剂量鼠IgG加强免疫，直至获得满意效价。所得抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化获得高纯度抗体，-20℃储存。
2.羊抗兔IgG的多抗的制备
按常规免疫学方法制备，采用免疫扩散法测抗体效价，若效价大于32，则从颈动脉采血，获得兔IgG多抗血清，若效价小于32，两周后再用同剂量鼠IgG加强免疫，直至获得满意效价。所得抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化获得高纯度抗体。
3.无害化阳性对照的获得：取包被物和标记物的多抗各1mg和羊抗兔IgG的多抗2mg混合并加入50ml小牛血清和10ml10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
4.阳性对照的使用：
在使用该检测试剂检测测时直接替代阳性对照使用。

Claims (10)

1.一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品，其特征在于，由包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗按照1：1:1-8的摩尔比混合制成。
2.根据权利要求1所述的阳性对照品，其特征在于，所述包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗利用免疫学方法制备得到。
3.根据权利要求1或2所述的阳性对照品，其特征在于，所述阳性对照的制备方法包括如下步骤：
(1)制备包被物抗体和标记物的抗体；
(2)制备二抗；
(3)阳性对照的获得：将包被物抗体和标记物的抗体以及二抗混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释作为阳性对照。
4.根据权利要求3所述的阳性对照，其特征在于，步骤(3)包被物抗体、标记物抗体以及二抗按照1：1:1-8的摩尔比混合。
5.根据权利要求3所述的阳性对照，其特征在于，步骤(3)中按照与抗体混合液的体积比10:1加入小牛血清，按照与抗体混合液的体积比2:1加入10％的硫柳汞后，用生理盐水稀释至总体积为抗体混合液的体积的200倍后作为阳性对照。
6.根据权利要求3所述的阳性对照，其特征在于，所述包被物抗体和标记物的抗体为单抗；所述二抗为多抗。
7.含有权利要求1或2所述阳性对照品的动物病原体检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其为ELISA检测试剂盒。
9.权利要求1或2所述阳性对照品在无害化检测动物病原体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，阳性对照品的浓度为0.05-20mg/ml。
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