CN101407813A - 丙型肝炎病毒f蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及生物医学诊断学技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)F蛋白基因及其应用。由于目前包被抗原不能覆盖HCV所有抗原决定簇，导致假阴性检测结果出现，因此寻找丰富抗原决定簇信息的病毒编码蛋白作为补充包被抗原，可以提高检出真阳性率，降低假阴性率。HCV F蛋白有望弥补目前ELISA检测HCV感染的不足。本发明所公开的编码HCV F蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其高表达的HCV F蛋白能够作为包被抗原，建立起间接ELISA检测试剂盒及其相关技术，用于筛查HCV感染者血清中特异性抗体。

Description

丙型肝炎病毒F蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及生物医学诊断学技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白基因及其在HCV生物医学诊断和研究上的应用。

背景技术

丙型肝炎是一种常见的输血后肝炎，由HCV引起，主要经血液传播，严重危害临床血液安全。HCV基因组为单正链RNA，两端各有一段非编码序列。基因组含有一个大的开放读框(ORF)，全长约9600个核苷酸，编码大约3010个氨基酸的多聚蛋白。多聚蛋白被宿主细胞和病毒蛋白酶裂解成10个结构和非结构蛋白，从N端开始依次为核心蛋白(C)、包膜蛋白、P7(P7)、非结构蛋白(NS2，NS3，NS4a，NS4b，NS5a，NS5b)，此外ORF还能够错位编码一个蛋白成分一F蛋白(Xu Z，Choi J，Yen TS，et al.Synthesis of anovel hepatitis C virus protein by ribosomal frameshift.EMBO J，2001，20：3840-8.)。目前全球HCV感染者约有1.7亿，其中，我国感染者近4千万。HCV慢性感染率高达70％以上，HCV慢性感染可导致肝硬化与肝癌等终末期肝病，以聚乙二醇IFN-α联合利巴韦林的标准疗法的总体持久应答率不到50％，疫苗研究多年来一直未有突破。面对目前疫苗研制和药物开发的困境，最有效的控制手段是提高临床血液筛查的敏感度和特异度，以此规避丙型肝炎输血传播路径，最大限度降低健康人群的感染风险，保证血液安全。HCV检测技术是预防的关键，目前的HCV检测手段主要是采用ELISA检测献血员血清HCV抗体。

ELISA所用的抗原是影响试剂盒质量的主要因素，HCV检测试剂从第一代的单一的C100-3抗原发展到三代的C22-3，C33c和NS5联合包被抗原，检测质量不断提升。但在低危人群(如义务献血者)中仍发现大量不确定和假阴性结果，而不同抗HCV ELISA试剂盒生产厂家所使用的HCV抗原的种类、质量各有差异，测定结果存在程度不等的假阴性或假阳性。上海市血液中心证实，尽管国产试剂能通过国家鉴定部门的批检，但在实际应用的过程中其灵敏性和特异性仍明显不如进口试剂，使用国产试剂进行血液筛选，发生漏检和误检的可能性较高，不能保障血液安全。第三代试剂显著增加了NS3抗原成分，同时相应减少了核心抗原成分，这虽在一定程度上提高了检测的灵敏度及降低了低危人群的非特异反应，但是由于核心抗原很难把握好减少程度致使漏检的发生。因此，提高检测HCV的准确度技术研究仍需加强。由于目前包被抗原不能覆盖HCV所有抗原决定簇，导致假阴性检测结果出现。寻找丰富抗原决定簇信息的病毒编码蛋白作为补充包被抗原，可以提高检出真阳性率，降低假阴性率。

F蛋白有望弥补目前ELISA检测HCV感染的不足，作为HCV基因组新的编码产物，与传统10种蛋白是由单一ORF编码产生不同，F蛋白是由一个与C基因读框+1位叠搭的ORF所编码。F蛋白长度约124～160氨基酸，能在HCV各基因型感染者体内诱生特异的体液和细胞免疫反应。Bain等(Bain C，Parroche P，Lavergne JP，et al.Memory T-cell-mediated immuneresponses specific to an alternative core protein in hepatitis C virus infection.JVirol，2004，p78(19)：10460-10469.)对F蛋白特异性细胞与体液免疫情况做了分析，利用人工合成的99肽在47名HCV患者中检出抗体阳性率为41.6％，同时20％患者出现特异淋巴细胞免疫反应，受激细胞分泌了IFN和IL-10。Pradel等(Pradel FK，Raj oharison A，Berland JL，et al.Antigenic relevance of Fprotein in chronic hepatitis c virus infection.Hepatology，2004，40(4)：900-909.)利用HCV 1a来源的序列于肠工程菌表达F蛋白分析154名HCV感染者血清标本，抗体检出率为62％。与传统10种HCV基因编码蛋白在各种病毒基因型间(1～6型)变异较大不同，F蛋白氨基酸序列在各个基因型间的同源率大于80％，交叉免疫反应性较好，如HCV 1a来源多肽在1～5种基因型患者中抗体阳性率大体相当。

由上可见，利用基因工程技术克隆HCV F蛋白基因重组表达载体，制备纯化F蛋白，建立间接ELISA检测试剂盒(技术)，可以弥补当前HCV免疫法检测的不足，提高检测的敏感度和特异度。并可进一步应用于HCV感染的预警、筛查和早期诊断，具有明显的社会、经济效益。

发明内容

本发明的目的是筛选出一种编码HCV F蛋白的基因，可以使HCV F蛋白在原核细胞内的表达量提高，并将HCV F蛋白作为包被抗原，建立起间接ELISA检测试剂盒及其相关技术，用于筛查HCV感染者血清中特异性抗体。

本发明在F蛋白基因野生株(HCV 1b)碱基序列(如SEQ ID NO：1所示)的基础上重新设计合成HCV F基因并予以蛋白重组表达、纯化的基础上实现的，首先对F蛋白密码子进行优化改进，在基于HCV F蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO：3所示)稳定不变的前提下合成部分不同于野生株的碱基序列，提高克隆载体在真核细胞内的表达量，这是本发明的发明点。采用原核细胞偏嗜性密码子置换技术，通过引物设计(如表1所述)，PCR法重新扩增出适合于工程菌Plyss(DE3)的全长或者截短的F基因序列，如SEQ IDNO：2所示。进而(亚)克隆了包含上述基因序列的多种载体，表达载体最后通过转染原核细胞进行表达能力的鉴定和筛选。

上述密码子优化后具备良好表达能力的重组载体在工程菌内的表达条件进一步筛选，以温度(28℃和37℃)、菌浓度(0.5OD、1.0OD)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0.6mmol/L、1mmol/L)为3因素2水平的试验条件引入L₈(2⁷)正交设计表，建立8次检测分析，筛选出最佳的诱导表达反应参数为：37℃，0.5OD Plyss工程菌加入1mmol/L IPTG诱导3h。获得pET32a(+)-F，该质粒表达截短的F蛋白(65aa～134aa)。

本发明提供了一种编码丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种包含如权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因的重组载体，所述载体为质粒载体。

上述载体包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和pET32a(+)载体。

本发明提供的基于F蛋白的用于HCV血清标志物检测的试剂盒(技术)，包含ELISA技术参数的优化和ELISA质量评价两个方面，这是本发明另外两个发明点所在。ELISA技术参数的优化采用棋盘法测定，先后对HCV F蛋白包被种类、浓度和阳性血清稀释度，封闭液的种类，封闭时间，待检血清作用时间，酶标二抗工作浓度，底物最佳显色时间进行最佳条件的筛选。具体优化的反应参数见后述ELISA技术流程。

应当指出，本发明之ELISA检测试剂盒及其相关技术的核心是包被抗原即HCV F蛋白。但不应当据此认为相关ELISA反应技术参数不能作为本发明内容的重要组成部分。

本发明还提供了的丙型肝炎病毒F蛋白基因在制备丙型肝炎病毒生物医学诊断药物中的应用，该间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒是这样制备的：

A、包含如SEQ ID NO：2所示的HCV F蛋白基因的重组载体的构建；

B、HCV F蛋白的原核表达、纯化与鉴定；

C、兔源性HCV F抗体的制备与鉴定；

D、制备间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒。

在ELISA质量评价过程中，首先制备了实验室质量控制血清，在经过56℃加热10h灭活、小牛血清(BSA)稀释、抽滤排菌后进行含量标定，以95％可信区间内数据的均值确定为靶值。以此质控血清为基础，确立了统计学法“即刻性”质控流程。质控评价同时还涵盖了对本发明涉及的ELISA试剂盒的检测准确度和精密度的内容，以及与市售ELISA试剂盒和RT-PCR检测一致度(kappa值介于0.75～0.82)的评价。

此外，本发明还提供了兔抗F多克隆抗体血清，该血清是由HCV F蛋白(65aa～134aa，图2)免疫新西兰大白兔6周后获得的，可以应用于F蛋白检测、病毒生物学研究以及抗HCV药物靶点研究。

本发明的具体技术方案包括以下六个方面：

一HCV F蛋白基因重组子构建

1F基因的合成按照HCV 1b型C基因序列，将C基因第10位密码子确定为F基因第1位密码子。将部分密码子置换成大肠杆菌偏嗜性密码子，设计11对重叠引物(表1)。引物混合，退火延伸得到长度为414bp的F基因。PCR体系组成为：10×PCR缓冲液2.5μl，11条引物各1μl(5μmol/L)，4×dNTP 1.5μl(10nmol/L)，Pfu酶0.5μl(5U/μl)，水9.5μl。PCR反应条件：94℃5min；94℃35S，55℃40S，72℃40S，30个循环；72℃10min。反应结束后加入0.5μl Taq酶(5U/μl)，72℃20min。

2构建pMD 18T-F扩增F基因片段与pMD18T连接后转化DH_5α，构建出pMD 18T-F重组子。以重组子为模板，以CF 12、CF 13为引物PCR扩增得到长度为219bp的HCV F基因片段，编码F蛋白的第65位到第134位氨基酸。PCR反应条件同上，结束后加入0.5μl Taq酶(5U/μl)，72℃20min。PCR产物与pMD 18T连接后得到pMD 18T-F重组子。

3构建pET32a(+)-F表达质粒用BamH I和Xho I双酶切pMD 18T-F重组子，回收F片段，在T4DNA连接酶的作用下，与经过相同双酶切的pET32a(+)连接。连接产物转化DH_5α，提取质粒进行BamH I和Xho I双酶切鉴定得到读框正确的pET32a(+)-F重组子。

二F蛋白的原核表达、纯化与鉴定

将pET32a(+)-F重组子转化感受Plyss(DE3)大肠杆菌，生长至对数期，加入1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导3h。收集细菌，超声破碎，取上清液和沉淀分别进行12.5％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将表达F蛋白片段的大肠杆菌以1∶100比例接种到250ml LB培养基中，生长至对数生长期，加人1mmol/L IPTG，37℃诱导3h。超声破碎细菌，取上清液进行非变性条件的镍离子树脂纯化。

三兔源性F抗体的制备与鉴定

1纯化的F蛋白免疫成年雄性新西兰大白兔，首次用1.0mg蛋白和完全弗氏佐剂进行皮下多点注射，间隔2周后用0.5mg蛋白和不完全弗氏佐剂进行皮下多点注射，以后每间隔1周注射一次，共3次。末次免疫后的第10天，采用颈动脉插管术收集血液，再使用SPA树脂纯化得到IgG型F抗体。

2Western blot鉴定F蛋白与兔源性F抗体，将大肠杆菌诱导表达的F蛋白进行12.5％的SDS-PAGE电泳，电转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜，分别与兔源性F抗体(1∶3000)或小鼠抗His单抗(1∶200)反应1h，再与AP标记的抗兔IgG或抗鼠IgG(1∶400)反应1h，NBT/BCIP显色。

四ELISA技术流程

1包被用包被液稀释高纯度的F蛋白，使蛋白终浓度为50μg/mL，将其加入到96孔酶标板孔内，每孔100μL，酶标板37℃2h后4℃包被24h，设空白对照孔。

2封闭将孔内包被液拍干，将封闭液5％BSA加满各孔37℃2h。

3准备将孔内封闭液拍干，各孔加满洗涤液(洗涤剂A/B∶A液为20×pH 7.4PBS 5ml，B液为Tween-201ml)，洗涤3次×3min。

4加样待测血清和对照血清用样品稀释液2.5％BSA进行1∶2稀释后，按100μl/孔加入，封板后置37℃反应45min。

5洗板将各孔内样品拍干，再加满洗涤液，放置1min后弃液体，在吸水纸上拍干，如此反复洗5次。

6酶标每孔加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人酶标二抗(1∶1000)100μl，封板后置37℃反应30min。

7显色每孔加TMB显色剂A和B(A液为含有0.3％H₂O₂的柠檬酸缓冲液5ml，B液为含有0.1M四甲基联苯胺TMB的柠檬酸缓冲液)各50μl，37℃避光显色10min。

8终止每孔加终止液2M H₂SO₄1滴，轻轻混匀，终止反应。

9比色以空白孔调零，测定各孔在450nm处的吸光值(A₄₅₀)。每份血清进行平行双孔检测，取平均A₄₅₀值作为该样品A₄₅₀。

10结果判定临界值(cut off)＝2.1×阴性对照A₄₅₀，样品A₄₅₀大于临界值者判定为F抗体阳性。

11质量控制连续测定3次质控血清，计算均值(X)和均差(SD)，评价SDI上限和下限。

五ELISA试剂盒反应参数优化

1抗原包被缓冲液选择分别用柠檬酸盐缓冲液(pH 5.2)、磷酸盐缓冲液(pH 7.2)和碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释包被抗原，用相同条件测定阴性和阳性标本，结果显示碳酸盐缓冲液包被效果佳。

2F抗原包被浓度选择纯化的F蛋白与包被缓冲液按照1∶1混合后以0.5、1、2μg/孔浓度包被酶标板条，同时测定10份阳性血清和10份阴性血清，结果显示最佳包被浓度都为10μg/ml。

3封闭液的选择分别用2％BSA、5％BSA和10％FBS作为封闭剂，同时测定上述血清，结果显示最佳封闭液为5％BSA。

4封闭时间的选择用5％BSA封闭60min、120min和240min，结果显示最佳封闭时间为120min。

5血清稀释度选择上述血清分别作1∶2、1∶4和1∶10稀释后用相同条件测定，结果显示标本1∶2稀释为最佳。

6血清反应时间选择上述血清分别孵育30min、45min和60min，结果显示最佳血清反应时间为45min。

7显色时间选择显色时间分别为2min、8min和15min，结果显示显色时间应控制在10min以内为宜，阴性对照孔O.D值控制在0.03～0.05之间为宜。

8结果判定标准的确定以30份健康人血清为阴性对照，以最优化检测流程进行检测，结果经统计学处理得到平均A值，以此为阴性对照A值，根据公式确定F抗体阳性临界值，公式为“阳性临界值＝2.1×阴性对照A值”。待检样品A值大于或等于阳性临界值为F抗体阳性，小于阳性临界值为F抗体阴性。

9最优检测流程的确定用包被缓冲液将F抗原稀释至10μg/ml，每孔加100μl置37℃2h，4℃过夜，吸去包被液，每孔加封闭液200μl 37℃孵育2h，吸干封闭液后每孔加100μl预先稀释的血清标本，置37℃保温45min，室温洗涤6次，每次3分钟，而后每孔加入酶标抗体工作液100ul，置37℃保温45min，室温洗涤6次，每次3分钟，最后每孔加显色液100μl，室温显色5～10min，加入终止液，在酶标仪上(450nm)测定吸收值(A值)并判定结果。

六ELISA试剂盒质量评价

1特异性实验除丙型肝炎患者血清外，再选取乙肝、甲肝、药物性肝炎患者血清样品，进行ELISA检测，每份样品设3个复孔，根据A值判定阴阳性结果，以此判定特异性。结果显示，除丙型肝炎患者血清为阳性外，其他肝炎患者均为阴性结果。

2重复性实验用同一批次制备的抗原包被板条，分别取阳性对照、阴性对照和待检测血清各3份进行检测，每份样品设10个复孔，根据A值计算批内差为4.5％。用10个不同批次制备的抗原包被板条，进行上述检测，每份样品设3个复孔，根据A值计算批间差为7.1％。

3稳定性实验制备好的抗原包被板条及检测试剂置于4℃保存，每隔1个月取出检测，共检测6次。结果显示，试剂盒可在4℃保存至少6个月以上。

用本发明所公开的HCV F蛋白基因可高表达HCV F蛋白，将其作为包被抗原，建立起间接ELISA检测试剂盒及其相关技术，用于筛查HCV感染者血清中特异性抗体。本发明为HCV生物医学诊断和HCV生物学研究提供了一种新的技术方法，对现有HCV检测技术的完善和补充。这种完善和补充的作用体现在HCV F蛋白可以独立或者联合其它抗原成分包被酶联板，获得更为丰富的HCV感染信息，弥补目前ELISA检测存在假阳性和假阴性的不足，提升检出准确度和精密度。

附图说明

图1pET32a(+)-F测序结果(包含优化之F基因)

图2IPTG浓度与可溶性F蛋白表达量的关系

其中：1号样品(1，3泳道)：0.6mM IPTG诱导，1和3泳道分别为超声裂解液上清和沉淀部分，F蛋白分别占菌体蛋白的33.4％和18.1％；2号样品(2，4泳道)：1mM IPTG诱导，2和4泳道分别为超声裂解液上清和沉淀部分，F蛋白分别占菌体蛋白的34.2％和27.1％。

图3Ni-NTA树脂纯化F蛋白

其中：1：超声裂解液上清部分；2～3：早期洗脱液；4～5：晚期洗脱液。

图4兔多克隆抗体血清用于检测HCV F蛋白

图5不同人群血清中F抗体检测的平均A₄₅₀值

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

试剂和材料

(1)大肠杆菌Plyss(DE3)及pET32a(+)载体分别购自Merck公司和Novagen公司。

(2)HCV抗体诊断试剂盒(上海复星长征公司)，Ni树脂(Invitrogen公司)，葡萄球菌A蛋白CL4B树脂(Amersham biosciences公司)，酶标板(Nunc公司)。

(3)F蛋白按以下实施例1-3方法合成，纯度为电泳纯级别。F蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

(4)抗原包被液0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)：碳酸氢钠(NaHCO3)2.9g，碳酸钠(Na2CO3)1.6g，叠氮钠(NaN3)0.2g，加蒸馏水至1000mL，pH 9.6，置4℃可备用两周。

(5)封闭液0.02M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，5％BSA(牛血清蛋白)及1％Tween20。

(6)酶标抗体工作液封闭液中加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗人IgG(KPL公司，1∶1000稀释)。

(7)洗涤液含有1％Tween20的0.02M磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)。

(8)底物及稀释液四甲基联苯胺(TMB)溶液。

(9)雄性新西兰家兔，4～4.5公斤。

(10)血清65份HCV感染者血清，均为HCV核心抗体阳性。36份HBV阳性血清，HCV感染指标均为阴性。40份正常人血清，HAV、HBV和HCV感染指标均阴性。

实施例1F蛋白基因密码子置换

参考HCV 1b型C基因序列(GI：329737)，将C基因第10位密码子确定为F基因第1位密码子，首位密码子以后按照C+1读码框阅读，直至终止密码子，得到野生型F基因序列(如SEQ ID NO：1所示)。将野生型F基因的部分密码子置换成大肠杆菌偏嗜性密码子，得到优化型F基因序列(如SEQID NO：2所示)。然后按照优化型F基因序列设计11条重叠引物(表1)，用于合成优化型F基因。PCR反应总体积25μl：10×PCR reaction buffer 2.5μl，Primer(CF 1→CF 11，5μmol/l)11×1μl，4×dNTP(10nmol/l)1.5μl，Pfu polyrase(5U/μl)0.5μl，ddH₂O 9.5μl。94℃变性5min，然后94℃35s、55℃40s、72℃40s，30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后在体系中加入0.5μl Taq酶(5U/μl)，72℃20min，使PCR产物3’末端以A结尾。图1显示了克隆质粒pET32a(+)-F测序结果。

表1

实施例2IPTG浓度与可溶性F蛋白表达量的关系

将pET32a-F重组子转化大肠杆菌Plyss菌株，经0.6mM或1.0mM IPTG诱导后离心收集细菌，将细菌进行超声波裂解，然后离心分成上清和沉淀2部分，分别煮沸后上样进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。各个样品均可见1条约32kDa的融合蛋白，即HCV F蛋白N端与载体自身的硫氧还蛋白C端融合，与预期大小吻合。0.6mM IPTG诱导产生的目标蛋白在超声裂解液上清和沉淀中的密度积分分别占菌体蛋白的33.4％和18.1％(图2，lane 1和lane 3)，1.0mM IPTG诱导产生的目标蛋白在对应样品中的密度积分则分别为34.2％和27.1％(图2，lane 2和lane 4)。超声裂解液上清中F蛋白为可溶性蛋白，沉淀中F蛋白为不溶性包涵体蛋白。

实施例3Ni-NTA树脂纯化F蛋白

离心收集IPTG诱导后表达F蛋白的细菌400ml，超声波裂解，取上清液与Ni-NTA树脂结合，洗涤杂蛋白后再洗脱F蛋白，收集不同时间段的洗脱液，行SDS-PAGE电泳，见图3。不同时间段洗脱液中均含有约32kDa的F蛋白；早期洗脱液中主要含有F蛋白，还含有杂蛋白带，F蛋白带灰度值为0.58～0.71(lane 2和lane 3)；晚期洗脱液中只有F蛋白带，未见杂蛋白带，F蛋白带灰度值为0.11～0.23(lane 4和lane 5)。应用Bradford法测定晚期洗脱液中F蛋白含量，得知其浓度为38～72μg/ml。以上结果显示，早期洗脱液中F蛋白的含量高于晚期洗脱液中F蛋白含量，但F蛋白的纯度却低于后者。

实施例4兔多克隆抗体血清用于检测HCV F蛋白

将SDS-PAGE后的F蛋白电转到硝酸纤维素膜，分别用F多抗(1∶3000)、His单抗(1∶200)以及GFP单抗(1∶500)进行Western blot检测，结果见图4。F多抗同F蛋白发生结合反应，出现1条位于32kDa左右的特异蛋白带，但是F多抗不与pET32a载体Trx蛋白结合；His单抗同F蛋白及Trx蛋白均发生结合反应，结合条带分别出现在32kDa及21kDa位置；GFP单抗不能与F蛋白以及Trx蛋白发生结合反应。

实施例5不同人群血清中F抗体的分布(一)

以高纯度F蛋白为包被抗原，用ELISA法检测不同人群血清中F抗体水平，以平均A₄₅₀值表示(表2，图5)。用包被液稀释F蛋白至终浓度为50μg/mL，将其加入到96孔酶标板孔内，每孔100μL，酶标板37℃2h后4℃包被24h，设空白对照孔。将孔内包被液拍干，将封闭液5％BSA加满各孔37℃封闭2h。将孔内封闭液拍干，各孔加满洗涤液(洗涤剂A/B∶A液为20×pH 7.4PBS 5ml，B液为Tween-201ml)，洗涤3次×3min。将待测血清和对照血清用样品稀释液2.5％BSA进行1∶2稀释后，按100μl/孔加入，封板后置37℃孵育45min。洗涤液反复洗5次后，每孔加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人酶标二抗(1∶1000)100μl，封板后置37℃反应30min。每孔加TMB显色剂A和B(A液为含有0.3％H₂O₂的柠檬酸缓冲液5ml，B液为含有0.1M四甲基联苯胺TMB的柠檬酸缓冲液)各50μl，37℃避光显色10min。每孔加终止液2M H₂SO₄1滴，轻轻混匀，终止反应。以空白孔调零，测定各孔在450nm处的吸光值(A₄₅₀)进行比色。每份血清进行平行双孔检测，取平均A₄₅₀值作为该样品A₄₅₀。结果判定依据：临界值(cut off)＝2.1×阴性对照A₄₅₀，样品A₄₅₀大于临界值者判定为F抗体阳性。

30份正常人血清平均A₄₅₀为0.044±0.011，30份乙肝患者血清平均A₄₅₀为0.054±0.023，30份丙肝患者血清平均A₄₅₀为0.125±0.061。正常人血清组与丙肝组A₄₅₀值有统计学意义差别(P＝1.82×10^-6，t＝5.95)，说明F抗体检测的敏感性较好。以正常人血清平均A₄₅₀值为阴性对照值，根据公式临界值＝2.1×阴性对照A₄₅₀，计算得到临界值为0.092。以0.092为临界值，甲肝患者(30例)、乙肝患者(30例)及药物性肝炎患者(30例)血清F抗体阳性率均为0％(0/30)；19份丙肝患者血清F抗体阳性，阳性率为63.3％(19/30)。丙肝患者血清F抗体阳性率显著高于三类肝炎患者血清F抗体阳性率(P＝1.43×10^-9，χ²＝36.6)，说明F抗体检测的特异性较好。

表2本发明试剂盒用于30份HCV感染者血清检测

实施例6不同人群血清中F抗体的分布(二)

采用相同于实施例5中的ELISA检测方法，在另外一次独立实验中，本发明之ELISA试剂盒检测53份HCV感染者与非HCV感染者血清。10名健康人血清标本同时用于检验本发明试剂盒特异性，平均A₄₅₀值0.047，所有阴性对照者A₄₅₀值均位于0.047×(1±0.5)即0.024～0.071区间内，再次证实本发明之试剂盒具备符合检测稳定性的技术要求。以阳性判断值(健康者血清检测A₄₅₀值0.047加2×SD)0.147为标准，35例HCV感染者血清平均A₄₅₀为0.170±0.024，检测到F蛋白能同15份血清发生反应，反应频率为43％(15/35)。6例HBV感染者(A₄₅₀为0.053±0.014)、1例药物性肝炎患者(A₄₅₀为0.114)及1例HAV感染者(A₄₅₀为0.031)血清均未检测到针对F蛋白的特异性抗体。8例非HCV感染的肝病患者血清检测A₄₅₀值与10例健康人血清检测A₄₅₀值无差别(P＞0.05)。35例HCV感染者检测A₄₅₀值平均水平明显高于18例非HCV感染者A₄₅₀值，两组资料的不成对t检验存在统计学显著性差异P＜0.005。这些数据再一次证实本发明建立起的以HCV F蛋白为包被抗原的ELISA试剂盒具有较好的敏感性和特异性，如表3所示。

表3本发明试剂盒用于35份HCV感染者血清检测

实施例7本发明试剂盒的临床试用

同样采用实施例5中的ELISA检测方法，应用本试剂盒对第二军医大学长海医院和解放军88医院收集的50份丙型肝炎患者血清进行检测。其中，35份正常人血清A₄₅₀为0.038±0.017，乙型肝炎血清A₄₅₀为0.063±0.031，丙型肝炎血清A₄₅₀为0.875±0.052。丙型肝炎组检测值与正常组不成对资料t检验及与乙肝组配对资料t检验结果现实，t值分别为6.13和5.89，P＝0.000。以0.080为阳性判断值，丙肝组检测F抗体阳性检出率为64％(32/50)，乙肝组为0％(0/50)，(P＝0.000，χ²＝45.3)证实试剂盒检测敏感性与特异性较好，如表4所示。

表4本发明试剂盒的临床试用

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述方案只作为阐明各个方面的单个例子。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附表(图)可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>丙型肝炎病毒F蛋白基因及其应用

<130>说明书，权利要求书

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgccaaacg taacaccaac cgccgcccac aggacgtcaa gttcccgggc ggtggtcaga    60

tcgttggtgg agtttacctg ttgccgcgca ggggccccag gttgggtgtg cgcgcgacta   120

ggaaggcttc cgagcggtcg caacctcgtg gaaggcgaca acctatccca aaggctcgcc   180

gacccgaggg cagggcctgg gctcagcccg ggtacccttg gcccctctat ggcaatgagg   240

gcctggggtg ggcaggatgg ctcctgtcac cccgcggctc ccggcctagt tggggcccca   300

cggacccccg gcgtaggtcg cgtaacttgg gtaaggtcat cgataccctt acatgcggct   360

tcgccgatct catggggtac attccgctcg tcggcgcccc cctag                   405

<210>2

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgccgaacg ttaccccgac cgctgctcac cgtacctctt cttctcgtgc tgttgttcgt    60

tctctggttg aattcacctg ctgccgtgct ggtgctccgg gttgggtttg cgctcgtctg   120

ggtcgtctgc cgtctggtcg taacctggtt gaaggtgaca acctgtctca gcgtctggct   180

gacccgcgtg ctggtccggg tctgtctccg ggtaccctgg gtccgtctat ggctatgcgt    240

gcttggggtg gtcaggacgg ttcttgccac ccggctgctc cgggtctggt tggtgctccg    300

cgtaccccgg gtgttggtcg tgttacctgg gttcgttctt ctatcccgct gcacgctgct    360

tctccgatct cttggggtac cttccgttct tctgctccgc cgtag                    405

<210>3

<211>134

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg

1               5                   10                  15

Ala Val Val Arg Ser Leu Val Glu Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala

            20                  25                  30

Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Leu Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn

        35                  40                  45

Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu Ser Gln Arg Leu Ala Asp Pro Arg Ala

    50                  55                  60

Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg

65                  70                  75                  80

Ala Trp Gly Gly Gln Asp Gly Ser Cys His Pro Ala Ala Pro Gly Leu

                85                  90                  95

Val Gly Ala Pro Arg Thr Pro Gly Val Gly Arg Val Thr Trp Val Arg

            100                 105                 110

Ser Ser Ile Pro Leu His Ala Ala Ser Pro Ile Ser Trp Gly Thr Phe

        115                 120                 125

Arg Ser Ser Ala Pro Pro

    130

Claims (7)

1、一种丙型肝炎病毒F蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、一种包含如权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因的重组载体，其特征在于所述载体为质粒载体。

3、根据权利要求2所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因的重组载体，其特征在于所述载体包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和pET32a(+)载体。

4、一种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因在制备丙型肝炎病毒生物医学诊断药物中的应用。

5、根据权利要求4所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因在制备丙型肝炎病毒生物医学诊断药物中的应用，其特征在于是该诊断药物是以丙型肝炎病毒F蛋白基因表达的丙型肝炎病毒F蛋白作为捕获抗原的间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒。

6、根据权利要求5所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因在制备丙型肝炎病毒生物医学诊断药物中的应用，其特征在于该间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒是这样制备的：

A、包含如SEQ ID NO：2所示的HCV F蛋白基因的重组载体的构建；

B、HCV F蛋白的原核表达、纯化与鉴定；

C、兔源性HCV F抗体的制备与鉴定；

D、制备间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒。

7、根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒F蛋白基因在制备丙型肝炎病毒生物医学诊断药物中的应用，其特征在于该间接酶联免疫吸附试验检测试剂盒制备的D步骤中：

I、抗原包被缓冲液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液；

II、HCV F抗原包被浓度为10μg/ml；

III、封闭液为5％BSA；

IV、封闭时间为120min；

V、血清稀释度为1∶2；

VI、血清反应时间为45min；

VII、显色时间为10min以内。

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