BG66205B1 - Изследване на комбинация на hcv антиген/антитяло - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до изследване комбинацията на HCV антиген на сърцевината и NS3/4a антитялото, която може да открие HCV антигени, антитела, присъстващи в проба, при прилагане на единствена твърда матрица, така както и твърди подложки за имуноизследване, за използване при изследването.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася най-общо до вирусната диагностика. По-специално изобретението се отнася до изследване на комбинация антиген/антитяло за правилна диагноза за хепатит С вирусна инфекция.

Предшестващо състояние на техниката

Вирусът на хепатит С (HCV) е главната причина за парентерален не-А, не-В хепатити (NANBH), който се предава широко чрез преливане на кръв и сексуален контакт. Вирусът присъства в 2,0% от кръвните донори. Хроничен хепатит се развива при 50% от инфекциите, а от тях 20% от инфектираните индивиди развиват цироза на черния дроб, което понякога води до хепатоклетъчнакарцинома. В съответствие, изследването и контролирането на заболяването е от медицинска значимост.

НС V за първи път е идентифициран и охарактеризиран като причина за NANBH от Houghten et al. вирусната геномна последователност на НС V е известна, както и методи за получаване на последователността. Виж например, International Publication Nos. WO 1989/004669; WO 1990/011089; и WO 1990/014436. HCV e c 9,5 kb позитивен-сенс, едноверижен РНК геном и е член на семейството на Flaviridae вирусите. Били са идентифицирани най-малкото шест отделни, но свързани генотипа на HCV, основани на филогенетични анализи, (Simmonds et al.,

J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Вирусът кодира единичен полипротеин, притежаващ повече от 3000 аминокиселинни остатъци (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA (1991) 88:17111715). Полипротеинът се преработва ко- и посттранслационно както в структурен, така и в неструктурен (NS) протеини.

По-специално, както е посочено на фигура 1, няколко протеина се кодират от НС V генома. Редът и номенклатурата на продуктите от разцепването на HCV полипротеина е както следва: NH₂-C-El-p7-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NSb

СООН. Първоначалното разцепване на полипротеина се катализира от протеазите на гостоприемника, които освобождават три структурни тикопротеина, “Е1” (известен, също така, като Е) и “Е2” (известен, също така, като Е2/ NS 1), така както и неструктурни (NS) протеини, които съдържат вирусните ензими. NS областите се наименоват като NS2, NS3, NS4 и NS5. NS2 е интегрален мембранен протеин с протеолитична активност. NS2, било то самостоятелно или в комбинация с NS3, разцепва NS2-NS3 sissle връзка, който на свой ред генерира NS3 N-терминуса и освобождава голям полипротеин, който включва както серин протеазна, така и РНК хеликазна активност. NS3 протеазата служи за преработване на остатъка от полипротеина. Завършването на узряването на полипротеина се инициира от автокаталитично разцепване при NS3-NS4a свързването, катализирано otNS3 серин протеаза. Впоследствие, НБЗ-медиирани разцепвания на НС V полипротеина изглежда включват разпознаване на свързването на полипротеиновото разцепване чрез NS3 молекула от друг полипептид. При тези реакции, NS3 освобождава NS3 кожактор (NS4a), два протеина (NS4b и NS5a), както и една РНК-зависима РНК полимераза (NS5b).

Описани са известен брой общи и специфични полипептиди, полезни като имунологични и диагностични реагенти за HCV, произлезли от НС V полипротеин. Виж например, Houghton et al., European Publication Nos. 318,216 и 388,232; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA (1992) 89:1001110015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publication Nos. WO 1993/000365; Chien et al., International Publication Nos. WO 1993/000365; Chien et al., International Publication Nos. WO 1994/0101778. Тези публикации предоставят в широки граници ниво на техниката за НС V най-общо, така както и върху получаването и използването на НС V полипептидни имунологични реагенти.

Чувствителни, специфични методи за скриниране и идентифициране на носители на

HCV и кръв и кръвни продукти, заразени с HCV биха предоставили значителен напредък в медицината. Пост-трансфузионен хепатит (РТН)

66205 Bl се появява при приблизително 10% от пациентите с трансфузии, a HCV е изчислен на над 90% от тези случаи. Грижите за болните, както и предпазването и предаването на HCV чрез кръв и кръвни продукти или чрез близък личен контакт изискват сигурни средства за диагностициране и прогнозиране. В съответствие са разработени известен брой изследвания за серодиагностика на HCV инфекции. Виж например, Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D. Y., International Publication No. WO 1994/001778; Valenzuela et al., International Publication No. WO 1997/044469; и Kashiawakuma et al., U.S. Patent No. 5,871,904.

Значителен проблем, срещан при някои изследвания на основата на серуми е това, че съществува значителен интервал между инфектирането и откриването на вируса, често надвишаващ 80 дни. Този интервал на изследването може да създаде сериозни рискове за пациентите с преливане на кръв. За превъзмогването на този проблем са били разработени тестове на основата на нуклеинова киселина (NAT), които откриват директно вирусна РНК, и тестове за НСV протеина на сърцевината на антигена, които изследват вирусния антиген, вместо отговора на антитялото. Виж, Kashiawakuma et al., US Patent No. 5,871,904; Bled et al., Transfusion (2000) 40:575-579.

Въпреки това, остава необходимост от чувствителни, точни диагностични и прогностични средства, за да може да се предостави на пациентите адекватни грижи, както и предпазване и предаване на HCV чрез кръв и кръвни продукти или чрез близък личен контакт.

Кратко описание на изобретението

Настоящото изобретение се основава, отчасти, върху откритието, че НС V антителата на сероконверсията са типични анти-сърцевинни и aHTH-NS3 (хеликаза). В съответствие с това, изобретението предоставя комбинирано изследване на антитялото на сърцевината на НС V и NS3 антитяло, което може да установи и двете, както HCV антигени, така и антитела, присъстващи в проба, при използване на една единствена твърд матрикс.

Следователно, при един вариант за изпълнение, посоченото изобретение се отнася до твърда подложка за имуноизследване, включваща поне едно антитяло на сърцевината на НС V и поне един изолиран HCV NS3/4a епитоп, свързан към него. Антитялото и NS3/4a епитопът могат да бъдат които и да е от тук описаните молекули. Освен това, твърдата подложка може да включва който и да е от антигените с множествен епитоп, описани в настоящото, така че антигенът с множествен епитоп, включва аминокиселинната последователност; посочена на фигури 7A-7F.

При някои варианти за изпълнение на изобретението, твърдата подложка включва поне две НСV антитела за анти-сърцевината, свързани с нея. Освен това, антитялото за сърцевината може да е моноклонално антитяло. Допълнително, NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационния NS3/4a епитоп, включващ аминокиселинната последователност, обрисувана на фигури 4A-4D.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до твърда подложка за имуноизследване, включваща поне две антитела на сърцевината на HCV и поне един HCV NS3/4a конформационен епитоп, включващ аминокиселинната последователност, обрисувана на фигури 4A-4D, свързан към него.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на НС V инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, както е описано по-горе; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват HaHCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне едното антитяло на сърцевината и NS3/4a епитопа, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, при което маркираното антитяло на сърцевината се насочва срещу един друг НС V епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитяло на сърцевината, свързано към

66205 Bl твърдата подложка; (ii) антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, реактивна с NS3/4a епитоп; (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към антигена от (ii); и (d) откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени, като индикация за НС V инфекция в биологичната проба. NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационен епитоп, притежаващ NS3/4a последователността, обрисувана на фигури 4A-4D.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на HCV инфекция в биологични проби. Методът включва:

(a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване с поне две антитела сърцевината на НС V, свързани към него, както е описано по-горе; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне две антитела на сърцевината и NS3/4a епитопа, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (b) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване HCV антитялото на сърцевината, при което маркираното антитялото на сърцевината се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитяло на сърцевината, свързано към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на НС V полипротеин, слят към една hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към hSOD аминокиселинната последователност; и (d) откриват се комплексите, образувани между антитела и антигени, като индикация за НС V инфекция в биологичната проба. NS3/4a епитопът може да е конформационен епитоп, като конформационен епитоп, притежаващ NS3/4a последователността, обрисувана на фигури 4A-4D.

Ако което и да е от горепосочените варианти за изпълнение, антитялото на сърцевината може да се насочи срещу N-терминалната област на НС V антигена на сърцевината, като срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани от носително спрямо последователността на НС V1 полипротеина, и/или маркираното за разпознаване антитяло на сърцевината на HCV може да се насочи срещу С-терминалната област на НС V антигена на сърцевината, като срещу аминокиселини 120-130 наНСУ, номерирани относително спрямо последователността на НСVI полипротеина. Освен това, антигенът, който влиза в реакция с HCV антитялото от биологична проба може да произхожда от NS3 областта, като епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеина и може да се слее с аминокиселинна последователност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD). При този вариант за изпълнение, второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно с hSDO аминокиселинната последователност.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване наНСУ инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални антитела на сърцевината НС V и конформационен епитоп, включващ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4A-4D; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне две антитела на сърцевината и NS3/4a конформационен епитоп; прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, при което първото антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване НС V антитялото на сърцевината, при което маркираното антитяло на сърцевината се насочва срещу един друг HCV епитоп на сърцевината, различен от поне две антитела на сърцевината, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеин, слят към една hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) едно второ антитяло, маркирано за разпознаване, при което второто антитяло, маркирано за разпознаване, е реактивно към hSOD аминокиселинната последователност; откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени, като индикация за НС V инфекция в биологичната проба.

При някои варианти за изпълнение, най

66205 Bl малко двете антитела на сърцевината са насочени срещу N-терминална област на НС V антигена на сърцевината, така че срещу аминокиселини 10-53 наНСУ, номерирани относително по отношение на НС V1 полипротеина, а маркираното за разпознаване антитяло на сърцевината на HCV се насочва срещу С-терминалната област на НС V антигена на сърцевината, като срещу аминокиселини 120-130 наНСУ, номерирани относително спрямо последователността на НСVI полипротеина.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на НС V инфекция в биологични проби. Методът включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, включваща слят антиген с множествен епитоп; (Ь) комбинира се биологична проба с твърдата подложка, при условия, които позволяват на НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свържат към поне едно антитяло на антисърцевина, NS3/4a епитоп и слят антиген с множествен епитоп; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо антитяло, маркирано за разпознаване, е маркирано за разпознаване НС V антитялото на сърцевината, се насочва срещу един друг НСV епитоп на сърцевината, различен от поне едното антитяло на сърцевината, свързано към твърдата подложка; (ii) едно първо и едно второ антитяло влизат в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, реактивна с NS3/4a епитопа и слят антиген с множествения епитоп, съответно; и (iii) второто антитяло, маркирано за разпознаване е реактивно с антигени от (ii); (d) откриват се комплекси, образувани между антитела и антигени, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.

Антитялото на анти-сърцевината може да е насочено срещу N-терминалната област на HCV антиген на сърцевината и това първо белязано за откриване антитяло на анти-сърцевината може да е насочено срещу N-терминалната област на НС V антиген на сърцевината, както е описано по-горе. Освен това, първият антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба може да включва епитоп от с23с областта на HCV полипротеина, и може да е слят с hSOD аминокиселинна последователност. В този контекст, второто антитяло белязано за открива не влиза в реакция с hSOD аминокиселинна последователност. Допълнително, вторият антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба може да включва епитоп от с23с областта на HCV полипротеина, както и един епитоп, който включва аминокиселинни Lys₁₀ до Ser^ на HCV полипротеина, с делеция на Arg47 и заместване на Leu до Тгр в позиция 44, с относителна номерация спрямо последователността на HCV полипротеина. Епитопът може да е слят към hSOD аминокиселинна последователност. В този случай, второто белязано за откриване антитяло влиза в реакция с hSOD аминокиселинната последователност. Слетият антиген с множество епитопи може да включва аминокиселинната последователност, описана на фигури 7A-7F.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на НС V инфекция в биологична проба, като посоченият метод включва: (а) предоставя се твърда подложка за имуноизследване, която включва две НСV анти-сърцевина моноклонални антитела, HCV NS3/4a конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4A-4D и слят антиген с множествен епитоп, който включва аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7A-7F, към който е свързан; (Ь) биологична проба се комбинира с твърда подложка при условия, които позволяват НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват поне към двете анти-сърцевина антитела, NS3/ 4а конформационен епитоп, и слят антиген с множествен епитоп, съответно; (с) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано антитяло за откриване, при което това първо маркирано антитяло за откриване е маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло, при което маркираното анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, свързан към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на НС V полипротеин, слят към hSOD аминокиселинна последователност и епитоп от с22 областта на НС V полипротеин, слят към hSOD аминокиселинна последователност; (iii) второ маркирано антитяло за откриване, при което това второ маркирано антитяло за откриване влиза в реакция с hSOD

66205 Bl аминокиселинна последователност; (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако присъстват, като индикация за НС V инфекция в биологична проба.

При този вариант за изпълнение, най-малкото две анти-сърцевина антитела срещу N-терминална област на НС V антиген на сърцевината, такива както срещу аминокиселинна последователност 10-53 от HCV, номериран относително спрямо НСVI полипротеин, и маркиран за откриване HCV анти-сърцевина антитяло срещу Стерминална област на HCV антиген на сърцевината, както срещу аминокиселинна последователност 120-130 от HCV, номериран относително спрямо последователността на НСVI полипротеина. Освен това, епитопът от с22 областта може да включва аминокиселини Lys₁₀ до Ser_M на HCV полипротеина, с една делеция на Arg₄₇ и заместване на Leu с Тгр в позиция 44, номерирана относително спрямо последователността на НС VI полипротеина.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до комплекти за имунодиагностични тестове, където се включва твърдата подложка за имунологичното изследване, описана по-горе и инструкции за провеждане на имунодиагностичния тест.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до методи за получаване на твърдата подложка за имунологичното изследване, където се включва: (а) предоставяне на твърда подложка; и (Ь) свързване на HCV анти-сърцевина антитялото, като един или два или повече, и най-малко един изолиран HCV NS3/4a негов епитоп, и при желание, негов слят антиген с множествен епитоп. По-долу се описват антисърцевина антителата, NS3/4a епитопи и антигени с множествен епитоп.

При един допълнителен вариант, изобретението се отнася до слят антиген с множествен епитоп, който включва аминокиселинна последователност, посочена на фигури 7A-7F, или аминокиселинна последователност с поне 80% идентичност на последователността, като 90% или повече идентичност на последователността, която специфично влиза в реакция с анти-HCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид, инфектиран с НС V. При някои варианти за изпълнение, слетият антиген с множествен епитоп се състои от аминокиселинна последователност, посо чена на фигури 5A-5F.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до полинуклеотид, включващ кодираща последователност за слят антиген с множествен епитоп, по-горе, рекомбинантни вектори, включващи полинуклеотиди, клетки гостоприемници, трансформирани с рекомбинантни вектори, и методи за получаване на рекомбинантен слят антиген с множествен епитоп, включващи: (а) предоставяне на популация от клетки гостоприемници, по-горе; и (Ь) култивиране на популацията от клетки при условия, при което се експресира слетия антиген с множествен епитоп, кодиран от кодиращата последователност, присъстваща в рекомбинантния вектор.

Тези, както и други аспекти на настоящото изобретение ще станат очевидни след справка със следващото подробно описание и прикрепените фигури.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 е диаграмно представяне на НС V генома, което обрисува различни области на полипротеина, от който произлизат реагентите (реагенти и антитела) от настоящия опит.

Фигура 2 представлява схематична фигура на репрезентативен опит на комбинация антитяло/антиген от изобретението.

Фигура 3 обрисува аминокиселинната на репрезентативен NS3/4a конформационен антиген за използване в настоящите изследвания. Удебеленият аланин в позиция 182 е заместен с нативен серин, който присъства нормално в тази позиция.

Фигури 4А до 4D обрисуват ДНК и съответната аминокиселинна последователност на друг репрезентативен NS3/4a конформационен антиген за използване в настоящите изследвания. Аминокиселините в позиция 403 и 404 на фигури 4А до 4D представят замествания на Pro с Thr, и lie със Ser на нативната аминокиселинна последователност на НС V-1.

Фигура 5 представлява диаграма на структурата на pd.HCV 1 a.ns3ns4aPI.

Фигура 6 е диаграмно представяне на

MEFA 12.

Фигури 7А до 7F показват ДНК и съответната аминокиселинна последователност на

МЕРА.

66205 Bl

Фигура 8 представлява схематична фигура на репрезентативно имуноизследване съгласно изобретението, при използване HaMEFA 12.

Подробно описание на изобретението

В практиката, настоящото изобретение използва, ако не е посочено друго, конвенционални методи на химията, биохимията, рекомбинантни ДНК техники и имунология, в обхвата на специалиста в областта. Тези техники са подробно обяснени в литературата. Виж например, Fundamental Virology, 2^nd Edition, vol, I&II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); Blackwell Scientific Publications); I. E. Creghton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and

Аланин: Ala (A) AcnaparHH:Asn(N) Цистеин: Cys (C) Глутаминова киселина: Glu (E) Хистидин: His (H) Левцин: Leu (L) Метионин: Met (M) Пролян: Pro (P) Треонин: Thr (T) Тирозин: Tyr (Y)

I. Дефиниции

При описанието на настоящото изобретение се използват следните термини и се счита, че се дефинират, както е посочено по-долу.

Термините “полипептид” и “протеин” се отнасят до полимер от аминокиселинни остатъци и не се ограничават до минимална дължина на продукта. Следователно, пептиди, олигопептиди, димери, мултимери и други подобни, се включват в определението. И двете, протеините в цяла дължина, както и техните фрагменти се обхващат от определението. Термините включват, освен това, постекспресионни модификации на полипептида, например, гликозилиране, ацетилиране, фосфорилиране и други. Освен това, за целите на настоящото изобретение, “полипептид” се отнася до протеин, който включва модификации, като делеции, добавки и замествания (обикновено консервативни в природата), към нативната последователност, толкова дълги, че протеинът да може да поддържа желаната активност. Тези модификации могат да са пред

Company, 1993); A. L. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Трябва да се отбележи, че както се използва в настоящата заявка и прилежащите патентни претенции, пълния или непълен член в единствено число включва множество референции, при условие, че съдържанието не показва ясно, че става въпрос за друго. Така например, отпратка към “антиген” включва смес от два или повече антигена и други подобни.

В текста се използват следните съкращения на аминокиселини:

AprHHHH:Arg(R) Аспартамова киселина: Asp (D) Глутамин: Gin (Q) Глицин: Gly (Q) Изолевцин: lie (I) Лизин: Lys (К) Фенилаланин: Phe(F) Серин: Ser (S) Триптофан: Trp (W) Валин: Val(V) умишлени, както чрез сайт-насочен мутагенез, или могат да са спонтанни, както чрез мутации на гостоприемниците, които продуцират протеините или грешки, дължащи се на PCR амплифицирането.

Един НСV полипептид и полипептид, както е дефинирано по-горе, произлязъл от HCV полипротеина. Полипептидът няма необходимост физически да произлиза от HCV, но може да се продуцира синтетично или рекомбинантно. Освен това, полипептидът може да произлиза от който и да е от многобройните HCV щамове, както от щамове 1, 2, 3 или 4 HCV. Известни са голям брой консервативни и вариабилни области измежду тези щамове, като най-общо, аминокиселините последователности на епитопи, произлизащи от тези области, имат висока степен на хомоложност на последователността, например, хомоложност на аминокиселинна последователност от повече от 30%, за предпочитане над 40%, когато са линеаризилани и двете последователности. Така например, терминът “NS3/4a”

66205 Bl полипептид се отнася до нативен NS3/4a от различните HCV щамове, така както и NS3/4a аналози, мутеини и имуногенни фрагменти, както се дефинират по-долу. Пълният генотип на голяма част от тези щамове е известен. Виж например, US патент 6,150,087 и GenBank Accession Nos. AJ 238800 и AJ 238799.

Термините “аналог” и “мутеин” се отнасят до биологично активни производни на стандартен образец молекули, или фрагменти на такива молекули, които задържат желаната активност, като имунореактивност при опитите, описани в настоящото. Най-общо, терминът “аналог” се отнася до съединения, които притежават последователност на нативен полипептид и структура с една или повече аминокиселинни добавки, замествания (обикновено консервативни в природата) и/или делеции по отношение на нативната молекула, толкова дълги, че модификациите да не разрушават имуногенната активност. Терминът “мутеин” се отнася до пептиди, които притежават един или повече пептиди имитиращи (“пептоиди”), като тези, описани в International Publication No, WO 1991/004282. За предпочитане, аналогът или мутеинът притежава поне същата имуноактивност, като нативната молекула. Методи за получаване на аналози на полипептиди и мутеини са известни от състоянието на техниката и са описани по-долу.

Особено предпочитани аналози включват замествания, които са консервативни в природата, т.е., тези замествания, които се осъществяват вътре в семейството на аминокиселини, които са свързани в техните странични вериги. Специфично, аминокиселините обикновено се разделят на четири семейства: (1) сиселинни аспартат и глутамаг; (2) основни - лизин, аргинин, хистидин; (3) неполярни - аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) полярни без заряд - глицин, аспаргин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин понякога се класифицират като ароматни аминокиселини. Например, с право се счита, че едно изолирано заместване на левцин с изолевцин или валин, на един аспартат с глутамат, на треонин със серин, или на друго консервативно заместване на аминокиселина със структурно свързана аминокиселина, няма да има голям ефект върху биологичната активност. Например, полипептидьт, представляващ интерес, може да включва до приблизително 5-10 консервативни или неконсервативни аминокиселинни замествания, или даже до приблизително 15-25 консервативни или неконсервативни аминокиселинни замествания, или което и да е цяло число между 5-25, докато желаното действие на молекулата остава интактно. Специалистът в областта лесно може да определи областите на молекулата, представляваща интерес, които могат да толерират промени във връзка с Hopp/Woods и Kyte-Doolittle участъци, добре известни от състоянието на техниката.

Под “фрагмент” се разбира полипептид, който се състои от само една част от интактната последователност на цялата дължина на полипептида и структура. Фрагментът може да включва С-терминална делеция и/или N-терминална делеция на нативния полипептид. “Имуногенен фрагмент” на определен HCV протеин обикновено включва поне приблизително 5-10 съседни аминокиселинни остатъка от молекулата в цяла дължина, за предпочитане поне приблизително 15-25 съседни аминокиселинни остатъка от молекулата в цяла дължина, и по-предпочитано поне приблизително 20-50 или повече съседни аминокиселинни остатъка на молекулата в цяла дължина, които дефинират един епитоп, или което и да е цяло число между 5 аминокиселини и последователността с цяла дължина, при положение, че въпросния фрагмент запазва имунореактивността в изследването, описано в настоящото. Например, предпочитани имуногенни фрагменти, включват, но без да се ограничават до, фрагменти наНСУ сърцевината, които включват, например, аминокиселини 1045,10-53,67-88 и 120-130 на полипротеина, епитоп 5-1-1 (в NS3 областта на вирусния геном), така както и дефинираните епитопи от El, Е2, сЗЗс (NS3), сЮО (NS4), (NS3/4a и NS5 областите на НС V полипротеина, така както и който и да е друг от различни епитопи, идентифицирани от HCV полипротеина. Виж например, Chien et al., Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:83339; Chien et al., International Publication No. WO 1993/000365; Chien, D. Y. International Publication No. WO 1994/001778; US патенти Nos. 6,150,087 и 6,121,020.

Терминът “епитоп”, както се използва в

66205 Bl настоящото се отнася до последователност от поне приблизително 3 до 5, за предпочитане приблизително 5 до 10 ии 15, и не повече от приблизително 1000 аминокиселини (или което и да е цяло число между тях), което определя последователност; която сама по себе си или като част от по-голяма последователност, се свързва към антитяло, генерирано в отговор на такава последователност. Не съществува критична горна граница за дължината на фрагмента, който може да включва близко до цялата дължина на последователността на протеина, или даже слят протеин, който да включва два или повече епитопа на НС V полипротеина. Епитоп, който може да се използва във въпросното изобретение не се ограничава до полипептид, който да притежава точната последователност на участъка на родителския протеин, от който произлиза. Всъщност, вирусните геноми са в състояние на постоянен поток и съдържат няколко вариабилни домена, които проявяват сравнително високи нива на вариабилност между изолатите. Следователно, терминът “епитоп” обхваща последователности, идентични на нативната последователност, така както и модификации на нативната последователност, като делеции, прибавяния и замествания (обикновено консервативни в природата).

Области от определен полипептид, които включват епитоп могат да се идентифицират при използване на какъвто и да е брой епитоп-картиращи техники, добре известни от състоянието на техниката. Виж например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glann E. Morris, Ed., 1996) Humans Press, Totowa, New Jersey. Например, линейни епитопи могат да се определят чрез например, конкурентно синтезиране на голям брой пептиди върху твърда подложка, пептидите съответстващи на участъци от молекулата на пептида, и поставяне в реакция на пептидите с антитела, докато пептидите са все още свързани към подложките. Такива техники са известни от състоянието на техниката и са описани в, например, патент на САЩ № 4,708,871; Gaysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Gaysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Gaysen et al., (1986) Molec. Immunol. 23:709-715.

При използване на такива техники са били идентифицирани голям брой епитопи на НС V. Виж например, Chien et al., Viral Hepatitis and Liver

Dease (1994) pp. 320-324, както и по-долу. Подобно, конформационни епитопи лесно могат да се идентифицират чрез определяне пространствената конформация аминокиселини, като например, рентгенови лъчи и 2-измерен ядреномагнитен резонанс. Виж например Epitope Mepping Protocols, по-горе. Могат да се идентифицират, също така, антигенни области на протеините, при използване на стандартни участъци за антигенност и хидропатия (стр. 14-6,7), както тези изчислени при използване на, например, Omiga версия 1.0 софтуерна програма, предоставена от Oxford Molecular Group. Тази компютърна програма използва Hopp/Woods метод, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828, за определяне на профилите на антигенност, и Kyte-Doolittle техника, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132, за плотове на хидропатия.

Както се използва в настоящото, терминът “конформационен епитоп” се отнася до участък от цяла дължина на протеин, или негов аналог или мутеин, притежаващ нативни структурни белези за аминокиселинната последователност, кодираща епитопа, в природния протеин в цяла дължина. Нативните структурни белези включват, но без да се ограничават до, гликозилиране и триизмерни структури. Дължината на последователността, определяща епитопа може да е обект на вариации в широки граници, тъй като се вярва, че тези епитопи са образувани от триизмерната форма на антигена (например, прегъване). Следователно, аминокиселините, които определят епитопа могат да са относително малко на брой, но да са широко разпръснати по дължината на молекулата (или даже по различни молекули, в случай на димери, и т.н.), като се внасят в правилната конформация на епитопа чрез нагъване. Участъкът на антигена между остатъците, които дефинират епитопа не могат да са критични за конформационалната структура на епитопа. Например, делеция или заместване на тези намесващи се последователности може да не засегне конформационния епитоп, при положение, че последователностите, които са критични за конформацията на епитопа се поддържат (например, необходимите цистеини за дисулфидните мостове, сайтове на гликозилиране, и др.).

Конформационните епитопи, присъстващи

66205 Bl в NS3/4a областта лесно се идентифицират при използване на методи, дискутирани по-горе. Освен това, присъствието или отсъствието на конформационен епитоп в определен полипептид може лесно да се определи чрез скриниране на антигена, представляващ интерес, с антитяло (поликлонален серум или моноклонален за конформационния епитоп) и сравняване на неговата реактивност с тази на денатурирана версия на антигена, който задържа единствено линейни епитопи (ако присъстват). При едно такова скриниране с използване на поликлонални антитела може да представлява предимство абсорбирането първо на поликлоналния серум с денатурирания антиген и да се види дали задържа антителата към антигена, представляващ интерес. Освен това, в случая на NS3/4a, молекула, която запазва нативната конформация ще притежава протеазна и, при желание, хеликазна ензиматична активност. Такива активности могат да се установят при използване на ензимни методи, както са описани по-долу.

За предпочитане, конформационен епитоп се получава рекомбинантно и се експресира в клетката, от която може да се извлече при условия, които запазват неговите структурни характеристики, например, без денатуриране на епитопа. Такива клетки включват клетки от бактерии, дрожди, насекоми и бозайници. Експресирането и изолирането на конформационните епитопи от HCV полипротеина са описани в, например, International Publication WO 1994/033053, WO 1992/008732. Алтернативно, възможно е да се експресират антигените и след това да се ренатурира протеина след възстановяване. Разбира се, също така, че химичния синтез също предоставя конформационен мимитоп на антигена, които влизат в кръстосана реакция с конформационния епитоп на “нативния” антиген.

Терминът “слят антиген с множествен епитоп” или “MEFA”, както се използват в настоящото се счита, че включва полипептид, в който множествените НС V антигени са част от единична, непрекъсната аминокиселинна верига, която верига не се среща в природата. HCV антигените могат да се свържат директно един с друг чрез пептидни мостове или могат да са отделно чрез намесване на аминокиселинни последователности. Слетите антигени също могат да съдържат последователности екзогенни заНСУ полипротеина.

Освен това, присъстващите HCV последователности могат да образуват множествени генотипи и/или изолирани НС V. Примери за определени MEFAs за използване в настоящите имуноизследвания са дадени в подробности в, например, International Publication No WO 1997/044469 и са описани по-долу.

“Антитяло” се счита молекула, която по химични или физични начини се свързва специфично към полипептида, представляващ интерес. Следователно, HCV антитялото на сърцевината е молекула, която специфично се свързва към НС V протеина на сърцевината. Терминът “антитяло”, както се използва в настоящото включва антитела, получени от поликлонални, както и от моноклонални препарати, така както и от следните: хибридни (химерни) молекули на антитела (виж например, Winter et al., (1991) Nature 349:293-299; и патент на САЩ № 4,816,567); и F(ab) фрагменти; Fv молекули (нековалентни хетеродимери, виж например, Inbar et al„ (1972) Proc. Natl. Acad. Sci USA 69:26592662; и Ehrlich et al., (1980) Biochem. 19:40914096); Fv молекули c единични вериги (sFV) (виж например, Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883); структури на димерни и тримерни фрагменти на антитела; минитела (виж например, Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al., (19920) J Immunology 149B:120-126); молекули на хуманизирани антитела (виж например, Riechman et al., (1988) Nature 332:332-327; Verhoyen et al., (1988) Science 239:1534-1536; и патентна публикация на Великобритания № GB 2,276,169, публикувана на 21.09.1994); и които и да са функционални фрагменти, получен от такива молекули, като такива фрагменти запазват свойствата на имунологично свързване на родителската молекула на антитяло.

Както се използва в настоящото, терминът “моноклонално антитяло” се отнася до състав на антитяло, притежаващ хомогенна популация от антитела. Терминът на се ограничава по отношение на видовете или източника на антитела, нито се счита, че се ограничава от начина, по който се получава. Следователно, терминът обхваща антитела, получени от миши хибридоми, така както и човешки моноклонални антитела, получени при използване по-скоро на човешки, отколкото на миши хибридоми. Виж

66205 Bl например, Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.

“Рекомбинантен протеин” е такъв протеин, който запазва желана активност и който е бил получен чрез рекомбинантни ДНК техники, както се описва в настоящото. Най-общо, генът, представляващ интерес се клонира и се експресира в трансформирани организми, както се описва по-долу. Организмът гостоприемник експресира чуждия ген, за да се получи протеина при условия на експресия.

Под “изолиран” се разбира, когато се отнася до полипептид, че посочената молекула се отделя и разделя, от целия организъм, с който молекулата се открива в природата или присъства при същественото отсъствие на други биологични макромолекули от същия тип. Терминът “изолиран”, с оглед на полинуклеотида, е молекула нуклеинова киселина лишена, частично или изцяло, от последователности, които нормално са асоциирани с нея в природата; или последователност, както съществува в природата, но с хетероложни последователности асоциирани с нея; или молекула, диасоциирана от хромозомата.

Под “еквивалентна антигенна детерминанта” се разбира антигенна детерминанта от различни подвидове или щамове на HCV, както от щамове 1, 2 или 3 на HCV. По-специално, известни са епитопи, като 5-1-1, и такива епитопи варират между щамовете 1,2 и 3. Така, епитопа 5-1 -1 от три различни щама са еквивалентни антигенни детерминанти и следователно са “копия”, въпреки че техните последователности не са идентични. Най-общо, аминокиселинните последователности не са идентични. Най-общо, аминокиселинните последователности на еквивалентни антигенни детерминанти ще имат висока степен на хомоложност на последователности, например, хомоложност на аминокиселинната последователност от повече от 30%, за предпочитане повече от 40%, когато двете последователности се линеаризират.

“Хомоложност” се отнася до процента на подобност между два полинуклеотида или две полипептидни части. Две ДНК, или две полипептидни последователности са “хомоложни по същество” една с друга, когато последователностите проявяват поне приблизително 50%, за предпочитане поне приблизително 75%, още попредпочитано приблизително поне 80-85%, за предпочитане поне приблизително 90%, и найпредпочитано поне приблизително 95-98% подобност на последователностите, пир определена дължина на молекулите. Както се използва в настоящото, хомоложни по същество се отнася, също така до последователности.

Най-общо, “идентичност” се отнася до едно точно съответствие нуклеотид-към-нуклеотид или аминокиселина-към-аминокиселина на две полинуклеотидни или полипептидни последователности, съответно. Процентът на идентичност може да се определи чрез директно сравняване на информацията от последователността между две молекули чрез линеаризиране на последователностите, преброяване на точния брой съвпадения между двете линеаризирани последователности, като се разделя на дължината на най-късата последователност и се умножава резултата по 100.

Могат да се използват лесно предоставени компютърни програми за помощ в анализа на подобността и идентичността, както ALIGN, Dayhoff, Μ. О. in Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, които адаптират локалната хомоложност алгоритъм на Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489,1981 за анализ н пептиди. Програми за определяне на подобност и идентичност на нуклеотидни последователности се предоставят от Wisconsin Sequence Analys Package, Version 8 (на разположение от Genetics Computer Group, Madison, WI) например, BESTFIT, FASTA и GAP програми, които също се опират на алгоритъма на Smith and Waterman. Тези програми лесно се използват с параметрите по подразбиране, препоръчани от производителя и описани в Wisconsin Sequence Analys Package, посочен по-горе. Например, процентът на подобност между определена нуклеотидна последователност и една сравнителна последователност може да се определи при използване на алгоритъма на хомоложност на Smith and Waterman с таблица обобщаваща грешките и неудобството от интервала от шест нуклеотидни позиции.

Друг метод за установяване на процента на подобност, в контекста на настоящото изобретение, е използването на MPSRCH пакет програми с авторско право на University of Edinburgh,

66205 Bl разработени от John F. Collins and Shane S. Sturrok, и разпространени от IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, СА). От тази серия пакети на Smith and Waterman може да се използва алгоритъм, при който се използват параметри на грешката за таблица на резултатите (например, отворени наказателни дупки от 12, разширени наказателни дупки за един, и дупка за шест). От данните, които генерира “Match” стойността рефлектира “подобността на последователностите”. Други подходящи програми за изчисляване на процента на идентичност или на подобност на последователностите са известни, най-общо, от състоянието на техниката, например, друга програма за линеаризиране е BLAST, която се използва при параметрите по подразбиране. Например, BLASTN и BLASTP могат да се използват при използване на следните параметри по подразбиране: генетичен код = стандартен; филтър няма; верига = и двете; отрязване = 60; очакване = 10; Матрикс BLOSUM62; Описания = 50 последователности; сортиране по = HIGH SCORE; база данни = неизлишен, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS транслация + Swiss протеин + Spupdate + PIR. Подробности за тези програми могат да се намерят на следните интернет адреси: http.7/www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Алтернативно, хомологията може да се определи чрез хибридизиране на полинуклеотидите при условия, които позволяват образуването на солидни дуплекси между хомоложни области, последвано от смилане едноверижна-специфична нуклеаза(и), и определяне на размера на смлените фрагменти. ДНК последователности, които са хомоложни по същество могат да се идентифицират при експеримент на Southern хибридизация при, например, строги условия, както са дефинирани за тази определена система. Дефинирането на подходящите условия на хибридизиране е в уменията на специалиста в областта. Виж например, Sambrook et al., по-горе; DNA Cloning, по-горе; Nucleic Acid Hybridization, no-rope.

“Кодираща последователност” или последователност, която “кодира” избран полипептид е молекула нуклеинова киселина, която се транскрибира (в случай на ДНК) и транслира (в случай на РНК) в полипептид in vitro или in vivo, когато се постави под контрола на подходящи регулаторни последователности. Свързването на ко диращите последователности се определя чрез стартов кодон при 5' (амино) терминуса и стоп кодон на транслацията при 3' (карбокси) терминуса. Последователността за терминация на транскрипцията може да е локализирана в посока 3' от кодиращата последователност.

“Операционно свързан” се отнася до подреждане на елементи, при което, така описаните елементи са в конфигурация, така че да осъществяват желаната тяхна функция. Следователно, даден промотор, операционно свързан към кодираща последователност е в състояние да осъществи експресията на кодиращата последователност, когато присъстват факторите за правилна транскрипция, и др. Не е необходимо промоторът да е съседен с кодиращата последователност, докато действа за насочване на неговата експресия. Следователно, например, участието на нетранслирани все още, но транскрибирани последователности може да се установи между промоторната последователност и кодиращата последователност, както могат и транскрибираните интрони, и промоторната последователност може все пак да се разглежда, като “операционно свързана” към кодиращата последователност.

“Контролен елемент” се отнася до полинуклеотидна последователност, която спомага за експресията на кодиращата последователност, към която е свързана. Терминът включва промотори, последователности за терминация на транскрипцията, регулаторни домени в посока upstream, сигнали за полиаденилация, нетранслирани области, включително 5'-UTRs и 3'-UTRs и при необходимост, лидерни последователност и енхансери, които колективно предоставят възможност за транскрипцията и транслацията на кодиращата последователност в клетката гостоприемник.

“Промотор”, както се използва в настоящото е ДНК регулаторна област, способна да свързва РНК полимераза в клетката гостоприемник и да инициира транскрипцията на кодиращата последователност в посока downstream (3' посока) операционно свързана с нея. За целите на изобретението, промоторната последователност включва минималния брой бази или елементи, необходими за иницииране на транскрипция на гена, представляващ интерес при нива за откриване над фона. Измежду промотор

66205 Bl ните последователности е сайт за иницииране на транскрипцията, така както и домени за свързване на протеин (консенсус последователности), отговорни за свързването на РНК полимеразата. Еукариотни промотори често, но не винаги, съдържат “ТАТА” блок и “CAT” блок.

Контролни последователности, “насочват транскрипцията” на кодираща последователност в клетка, когато РНК полимеразата се свързва с промоторната последователност и транскрибира кодиращата последователност в иРНК, която на свой ред се транслира в полипептида, кодиран от кодиращата последователност.

“Експресионна касета” или “експресионна структура” се отнася до обединяване, което направлява експресията на последователността(ите) или гена(ите), представляващ интерес. Експресионната касета включва контролни елементи, както е описано по-горе, като промотор, който е операционно свързан към (както към директната транскрипция на) последователността(ите) или гена(ите), представляващ интерес, и често включва последователност за полиаденилиране, също така. При някои варианти за изпълнение на изобретението, експресионната касета, описана в настоящото, може да се съдържа в плазмидна структура. В допълнение към компонентите на експресионната касета, плазмидната структура също може да включва един или повече маркери за селекция, сигнал, който позволява на плазмидните структури да съществуват като едноверижни ДНК (например, М13 начало на репликация), поне един множествен сайт на клониране, и “начало на репликация” от бозайник (например, начало на репликация от SV40 или аденовирус).

“Трансформация”, както се използва в настоящото, се отнася до инсерирането на екзогенен полинуклеотид в клетка гостоприемник, независимо от използвания метод за инсериране: например, трансформиране чрез директно поемане, трансфекция, инфекция и други подобни. Екзогенният полинуклеотид може да се поддържа като неинтегриран вектор, например, епизом, или алтернативно, може да е интегриран в генома на гостоприемника.

“Клетка гостоприемник” е клетка, която е трансформирана, или е способна на трансформация от екзогенна ДНК последователност.

“Обикновена твърда подложка” означава единичен твърд матрикс, към който, HCV полипептидите, които се използват при посочените имуноизследвания, се свързват ковалентно или чрез нековалентни средства, като хидрофобна абсорбция.

“Имунологично реактивен” означава, че посочения антиген ще реагира специфично с анти-HCV антитела, присъстващи в биологична проба от индивид инфектиран с НС V.

“Имунен комплекс” означава комбинацията, образувана когато антитялото се свързва към един епитоп върху антигена.

Както се използва в настоящото, “биологична проба” се отнася до тъканна проба или течност, изолирана от субект, включително, но без да се ограничава до, например, кръв, плазма, серум, фекалийна маса, урина, костен мозък, жлъчка, гръбначномозъчна течност, лимфна течност, кожни проби, външна секреция от кожа, респираторния, чревния и урогениталния тракт, сълзи, слюнка, млеко, кръвни клетки, органи, биопсии, както и проби от съставки на in vitro клетъчни култури, включващи, но без да се ограничават до кондиционирана среда, получена от прорастването на клетки и тъкани в културална среда, например, рекомбинантни клетки, и клетъчни съставки.

Както се използва в настоящото, “маркер” и “маркери за откриване” се отнася до молекула, способна до бъде открита, включващ, но без да се ограничават до, радиоактивни изотопи, флуоресцентни вещества, хемилуминесцентни вещества, хромофори, ензими, ензимни субстрати, ензимни кофактори, ензимни инхибитори, хромофори, багрила, метални йони, метални соли, лиганди (например, биотин, стрептавидин или хаптени) и други подобни. Терминът “флуоресцентно вещество” се отнася до вещество или до част от него, което е способен да проявява флуоресценция в границите за откриване. Определени примери за маркери, които могат да се използват при изобретението включват, но без да се ограничават до пероксидаза от хрян (HRP), флуоресцеин, FITC, родамин, дансил, умбелиферон, диметилакридиниев естер (DMAE), тексаско червено, луминол, NADPH и алфа-бетагал актозидаза.

II. Начини за осъществяване на изобретението

Преди да се опише с подробности насто66205 Bl ящото изобретение, трябва да се разбира, че това изобретение не се ограничава до определени лекарствени форми или параметри на методи, които, естествено, могат да варират. Трябва да се разбира, също така, че използваната терминология в настоящото е за целите единствено на описанието на определени варианти за изпълнение на изобретението, и не се счита за ограничаваща.

Въпреки, че в практиката на настоящото изобретение могат да се използват многобройни състави и методи, подобни или еквивалентни на тези, описани в настоящото, предпочитаните материали и методи са описани в настоящото.

Както се отбелязва по-горе, настоящото изобретение се основава на откритието на нови диагностични методи за точно определяне на ранна HCV инфекция. Методите се основават върху идентифицирането и използването на високоимуногенни НС V антитела и антигени, които присъстват при ранните стадии на НС V сероконверсията, като по този начин се увеличава точността на откриване и се намаляват грешните резултати. Методите могат да се провеждат по подходящ начин под формата на единично изследване.

По-специално, изследването се провежда върху твърда подложка, към която е свързан един или повече HCV анти-сърцевина антитела (насочени или срещу същия или срещу различни НС V епитопи на сърцевината) и един епитоп, произлизащ 0TNS3/4a областта на HCV полипротеина. Примери за определени анти-сърцевина антитела, полезни в настоящото изобретение включват, но без да се ограничават до, молекули на антитела, като моноклонални антитела, насочени срещу епитопи в областта на сърцевината, открита между аминокиселини 10-53; аминокиселини 10-45; аминокиселини 67-88; аминокиселини 120-130; или антитела, насочени срещу който и да е от епитопите на сърцевината, идентифицирани в, например, Houghton et al., US патент № 5,350,671; Chien et al., Chien et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA(1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., European Publication No WO 1993/000365; Chien, D. Y., International Publication No WO 1994/ 0101778; и патент на САЩ с обществено притежание US Patent Application Serial Nos. 08/403,590 и 08/444,818.

NS3/4a областта на HCV полипротеина е описана и аминокиселинната последователност и цялата структура на протеина са описани в, например, Yao et al., Structure (November 1999) 7:1353-1363; Sali et al., Biochem. (1998) 37:33923401; и Bartenschlager, R., J. Virol Hepat. (1999) 6:165-181, виж също така, Dasmahapatra et al., US Patent No. 5,843,752. Въпросното имуноизследване използва поне един конформационен епитоп, получен от NS3/4a областта, която съществува в конформацията, както е открита в естествено срещана в природата HCV частица или неговия инфектиращ продукт, като се показва чрез консервиране от протеаза и, при желание, хеликазна ензимна активност, нормално проявявани от NS3/4a генния продукт и/или имунореактивност на антиген с антитела в биологична проба от субекти инфектирани с НС V, и загуба на имунореактивностга на епитопите при денатуриране на антигена. Например, конформационният епитоп може да се разруши чрез нагряване, промяна на pH до изключително кисело или основно, или чрез прилагане на известни органични денатуриращи средства, като дитиотреитол (DTT) или подходящ детергент. Виж например, Protein Purification Methods, a prectical approach (E.L.V. Harris and S. Angal eds., IRL Press) и денатурирания продукт, в сравнение с продукта, който не е третиран както погоре.

Протеазната и хеликазната активност могат да се определят при използване на стандартни ензимни изследвания, добре известни от състоянието на техниката. Например, протеазната активност може да се определи при използване на опит, добре известен от състоянието на техниката. Виж например, Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Chao et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5:152-158; и Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Особено подходящо изследване за тестване на протеазна активност е посочено в примерите по-долу.

Подобно, изследвания за хеликазна активност са добре известни от състоянието на техниката и хеликазната активност на NS3/4a епи

66205 Bl топ може да се определи при използване на, например, ELISA изследване, както е описано от например, Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; сцинтилационна система за изследване на проксималност, както е описано в Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126; високоефективно скрининг изследване за вложеното количество, както е описано в, например, Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 и Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; така както и от други методи на изследване, известни от състоянието на техниката. Виж например, Khu et al., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama et al., Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; и Hesson et al., Biochemistry (2000)39:2619-2625.

Дължината на антигена е достатъчна за поддържането на имунореактивен конформационен епитоп. Често полипептидът, съдържащ използван антиген ще е почти в цяла дължина, въпреки че полипептидът може, също така да е съкратен, например, за да се увеличи разтворимостта или да се подобри секрецията. Обикновено, конформационен епитоп, открит в NS3/4a, се експресира в клетка като рекомбинантен полипептид и този полипептид предоставя епитопа в желаната форма, както е описано подробно по-долу.

Репрезентативни аминокиселинни последователности за NS3/4a полипептиди са показани на фигура 3 и фигура 4А до 4D. Удебеленият аланин, който се появява в позиция 182 на фигура 23 е заместен с нативния серин, открит в тази позиция, с цел да се предотврати автокатализа на молекулата, която може иначе да се получи. Аминокиселинната последователност показана на позиции 2-686 на фигури 4А до 4D съответства на аминокиселинни позиции 10271711 на НСV-1. Иницииращ кодон (ATG), кодиращ Met е показан в позиция 1. Допълнително Thr, който обикновено се среща в позиция 1428 на HCV-1 (аминокиселинна позиция 403 на фигура 4) е мутиран в Pro, a Ser, който обикновено се среща в позиция 1429 на HCV-1 (аминокиселинна позиция 404 на фигура 4) е мутиран в Пе. Въпреки това, даже и нативната последователност, със или без N-терминален Met, посочения аналог, със или без N-термина лен Met, или други аналози и фрагменти могат да се използват в посочените изследвания, дотолкова доколкото епитопът се продуцира при използване на метод, който задържа или отново връща състоянието на неговата нативна конформация, така че протеазната активност; и при желание, хеликазната активност се запазва. Dasmahapatra et al., US Patent No 5,843,752 и Zhang et al., US Patent No 5,990,276, и двамата описват аналози HaNS3/4a.

NS протеазата на NS3/4a е открита при приблизителна позиция 1027-1207, номерирано относително спрямо НС V-1, позиции 2-182 на фигура 4. Структурата на NS3 протеазата и активния сайт са известни. Виж например, De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. Промени на нативната последователност, които биха били нормално толерирани, ще са тези извън активния сайт на молекулата. По-специално, желателно е да се поддържат аминокиселини 1или 2-155 от фигура 4, с малки или само консервативни замествания. Аминокиселини, които се намират извън 155 биха толерирали по-големи промени. Допълнително, ако се използват фрагменти на NS3/4a последователността, открита на фигура 4, тези фрагменти биха включвали най-общо най-малкото аминокиселини 1- или 2-155, за предпочитане аминокиселини 1- или 2-175, и най-предпочитано аминокиселини 1- или 2-188, със или без N-терминалния Met. Хеликазният домен се открива при приблизителни позиции 1193-1657 или HCV-1 (позиции 207632 на фигура 4). Следователно, хеликазната активност е желана, този участък на молекулата ще бъде поддържан с малки или единствено консервативни промени. Специалистът в областта лесно ще определи други области, които биха толерирали промени, основаващи се върху известната структура на NS3/4a.

Твърдата подложка може, също така, да съдържа други антигени. Например слети антигени с множествен епитоп (названи “MEFAs”), както се описва в публикация на международна заявка No WO 1997/044469, може да са свързани към твърдата подложка, при използуване в изследването. Такъв MEFAs включва множествени епитопи от две или повече от вирусните области, показани на фигура 1 и таблица 1. Поспециално, както е показано на фигура 1 и таб66205 Bl лица 1, един HCV полипротеин, при разцепване, продуцира поне десет различни продукта, по реда на NH₂-CbpneBHHa-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4aNS4b-NS5a-NS5b-COOH. Полипептидът на сърцевината се намира в позиции 1-191, номерира- 5 нето е относително спрямо HCV-1 (виж Choo et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:24512455, за HCV-1 генома). Този полипептид, понататък се преработва за продуциране на НС V полипептид с приблизителни аминокиселини 1-173. 10 Полипептидите на обвивката, Е1 и Е2, се намира в позиции 192-383 и 384-746, съответно. Р7 доменът се намира при позиции 747-809. NS2 е интегрален протеин на мембраната с протеолитична активност и се намира при позиции 810-1026 15 на полипротеина. NS2q било то самостоятелно или в комбинация с NS3 (намерен в приблизителни позиции 1027-1657), разцепва NS2-NS3 sissle връзка, което на свой ред генерира NS3 Nтерминус и освобождава голям полипротеин, който включва както серин протеазна, така и РНК хеликазна активност. NS3 протеазата, открита в позиции 1027-1207, служи да се преработи оставащия полипротеин. Хеликазната активност се открива при позиции 1193-1657. Завършването на узряването на полипротеина се инициира чрез автокаталитично разцепване при връзката на NS3-NS4a, катализирано otNS3 серин протеаза. Последващо НБЗ-медиирано разцепване на HCV полипротеина се оказва, че включва разпознаване на връзките на полипротеина за разцепване чрез NS3 молекула на друг полипептид. При тези реакции, NS3 освобождава NS3 кофактор (NS4a, открит в позиции 1658-1711), два протеина (NS4b, открит в позиции 1712-1972, и NS5a, открит в позиции 1973-2420), и РНК зависима РНК полимераза (NS5b, открит в позиции 2413011).

ТАБЛИЦА 1
Домен	Приблизителни свързвания*
С(сърцевина)	1-191
Е1	192-383
Е2	384-746
Р7	747-809
NS2	810-1026
NS3	1027-1657
NS4a	1658-1711
NS4b	1712-1972
NS5a	1973-242
NS5b	2421-3011

* Брой по отношение на HCV-1. Виж Choo et al., (1991) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455.

Множествените HCV антигени са част от единична, непрекъсната верига на аминокиселини, чиято верига не се среща в природата. Така, линейният ред на епитопите е различен от този на в генома, към който те принадлежат. Линейният ред на последователностите на MEFAs, който се използва в настоящото е за предпочитане подреден за оптимална антигенност. За предпочи1 Z

66205 Bl тане, епитопите са от повече от един HCV щам, като по този начин предоставят добавената възможност да се откриват множество щамове на HCV в единично изследване. Следователно, MEFAs, който се използва в настоящото може да включва различни имуногенни области, произлизащи от полипротеин, описан по-горе. Освен това, протеинът получен в резултат на изместването на рамката в областта на сърцевините на полипротеина, както е описано в International Publication No WO 1999/063941 може да се използва като MEFAs. При желание, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или повече от един или повече епитопи, произлизащи от НС V полипротеин могат да се срещнат в слетия протеин.

Например, епитопи, произлизащи от, например, хипервариабилна област на Е2, като област; подобна на областта на разпростиране на аминокиселини 384-410 или 390-410, може да се включи в MEFA антигена. Изключително ефективен Е2 епитоп е този, който включва консенсус последователност, произлизаща от тази област, като консенсус последователност GlySer-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-SerLeu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, която представлява консенсус последователност за аминокиселини 390-410 на HCV тип 1 генома. Репрезентативен Е2 епитоп присъстващ в MEFA на изобретението може да включва хибриден епитоп на разпростиране на аминокиселини 390444. Такъв хибриден Е2 епитоп може да включва консенсус последователност, представляваща аминокиселини 390-410, слята към нативната аминокиселинна последователност за аминокиселини 411 -444 на НС V Е2.

Допълнително, антигените могат да произлизат от различни HCV щамове. Множество вирусни щамове на НСV са известни, и епитопи произлизащи от който и да е от тези щамове могат да се използват в слят протеин, добре известно е, че който и да е вид организъм варира от един отделен организъм до друг и освен това един определен организъм, като вирус може да има голям брой различни щамове. Например, както е обяснено по-горе, HCV включва наймалкото 6 генотипа. Всеки от тези генотипове включва еквивалентни антигенни детерминанти. По-специално, всеки щам включва известен брой антигенни детерминанти, които присъстват върху всички щамове на вируса, но са леко раз лични от един вирусен щам до друг. Например, HCV включва антигенни детерминанти, известни като 5-1-1 (виж фигура 1). Тази определена антигенна детерминанта се явява в три различни форми върху три различни вирусни щама на HCV. В съответствие, при един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, всичките три форми на 5-1 -1 се появяват върху слят антиген с множествен епитоп, използван в посоченото имуноизследване. Подобно, еквивалентни антигенни детерминанти от областта на сърцевината на различни HCV щамове също могат да присъстват. Най-общо, еквивалентни антигенни детерминанти имат висока степен на хомоложност по отношение на аминокиселинната последователност, която степен на хомоложност обикновено е 30% или повече, за предпочитане 40% или повече, при линеаризиране. Епитопът с множество копия, на настоящото изобретение също може да включва множество копия, които са точни копия на същия епитоп.

Репрезентативни MEFAs за използване в настоящото изследване са описани в International Publication No. WO 1997/044469. Допълнителни репрезентативни MEFAs за използване в настоящото, включват тези, названи като MEFA 13 и MEFA 13.1. Трябва да се разбира, че тези MEFAs са слабо репрезентативни и други епитопи, произлизащи от HCV генома също ще намерят приложение в настоящото изследване и могат да се инкорпорират в тези други MEFAs.

ДНК последователността и съответната аминокиселинна последователност на MEFA 12 е показана на фигури 7А до 7F. Общата структурна формула на MEFA 12 е показана на фигура 6 и е както следва: hSOD-El (тип 1) HVR консенсус (тип 1а)-Е2 HVR консенсус (типове 1 и 2)-сЗЗс къс (тип 1)-5-1-1 (тип 1)-5-1-1 (тип 3)5-1-1 (тип 2)-с100 (тип 1)-NS5 (тип 1 ^сърцевина (типове 1-2). Този епитоп с множество копия включва следната аминокиселинна последователност, номерирана относително спрямо HCV-1 (номерирането на комплекта на аминокиселинната последователност, посочен по-горе, следва номерирането предоставено в Choo et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455, където аминокиселина #1 е първия метионин, кодиран от кодиращата последователност на областта на сърцевината): аминокиселини 1-69 на супероксид дисмутаза (SOD, използвана за да за

66205 Bl сили експресията на протеина); аминокиселини 303 до 320 на полипротеина от Е1 областта; аминокиселини 390 до 410 на полипротеина, представляващи консенсус последователност за свръхвариабилната област на НСV-1 a Е2; аминокисе- 5 лини 384 до 414 на полипротеина от областта Е2, представляващи консенсус последователност за Е2 свръхвариабилни области на HCV-1 и HCV-2; аминокиселини 1211-1457 на HCV-1 полипротеина, които дефинират хеликазата; три 10 копия на епитоп от 5-1-1, аминокиселини 16891735, една от HCV-1, една от HCV-З и една от HCV2, чиито копия са еквивалентни антигенни детерминанти на трите различни вирусни щама на НС V; НС V полипептид С100 на НС V-1, аминоки- 15 селини 1901 -1936 на полипротеина; две точни ко пия на епитоп от NS5 областта на НС V-1, всяко от които с аминокиселини 2278 до 2313 на HCV полипротеина; и две копия на три епитопа от областта на сърцевината, две от HCV-1 и едно от НС V-2, които копия са еквивалентни антигенни детерминанти, представени от аминокиселини 9 до 53 и 64-88 на HCV-1 и 67-84 на HCV-2.

Таблица 2 показва аминокиселинните позиции на различни епитопи на MEFA 12 с отпратка към фигури 7А до 7F в настоящото. Номерирането в таблиците е относително, спрямо HCV-1. Виж Choo et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA(1991) 88:2451-2455. MEFAs 13 и 13.1 също споделят общата формула, уточнена погоре, за MEFA 12, с модификации, както е посочено на таблици 3 и 4, съответно.

Таблица 2. MEFA 12
mefa aa#	5’ край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-69*	Nco1	hSOD
72-89	Mlul	E1	303-320	1
92-112	Hindi 11	E2 HVR' консенсус	390-410	1
113-143		E2 HVR1aконсенсус	380-414	1.2
146-392	Spel	C22C къс	1211-1457	1
395-441	Sph1	5-1-1	1689-1735	1
444-490	Nrul	5-1-1	1689-1735	3
493-539	Clal	5-1-1	1689-1735	2
542-577	Aval	C100	1901-1936	1
580-614	Xbal	NS5	2278-2313	1
618-653	Bglll	NS5	2278-2313	1

66205 Bl

(продължение)
654-741	Ncol	Епитопи ΐ	9-53, R47L	1
		сърцевинаи	64-88	1
			67-84	2
742-829	Ball	Епитопи F	9-53, R47L	1
		сърцевината	64-88	1
			67-84	2

* SOD протеина е срязан, така че за ко- вината се мутира, за да се предпазят антителата нюгата за определяне, маркиран cHRP анти-SOD ¹⁵ _от HCV сърцевината, използвани при антитяло не свързва MEFA. Епитопът на сърце- определянето, да се свържат към MEFA.

Таблица 3. MEFA 13
mefa aa#	5’ край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-156	Nco1	Мутиран hSO (aa 70-72, AU
161-178	Mlul	E1	303-320	1
181-201	Hindi 11	E2 HVRJ консенсус	390-410	1
202-232		E2 HVR1a< консенсус	384-414	1,2
235-451		СЗЗС къс	1211-1457	1
454-500	Hindlll	5-1-1 Pimut*	1689-1735	1
503-549	Nrul	5-1-1 Pimut*	1689-1735	3
552-598	Clal	5-1-1 Pimut*	1689-1735	2
601-636 _	Aval	C100	1901-1936	1

66205 Bl (продължение)

639-674	Xbal	NS5	2278-2313	1
677-712	Bglll	NS5	2278-2313	1
713-800		Епитопи ί сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
801-888		Епитопи 1 сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

* 5-1-1 епитопите са модифицирани чрез елиминиране на възможни сайтове на разцепване (CS или СА) насочени чрез NS3/4a рекомбинантен протеин. Вместо CS или СА, последователността е променена на PI. Допълнително, SOD протеина е мутиран, така че конюгата за определяне, маркиран с HRP анти-SOD антитяло не свързва MEFA. Епитопът на сърцевината се мутира, за да се предпазят антителата от НС V сърцевината, използвани при определянето, да се свържат към MEFA.

Таблица 4. MEFA 13.1
mefa aa#	5' край страна	епитоп	hcv aa#	Щам
1-86	Nco1	Мутиран hSO (aa 70-72, AU
89-106	Mlul	E1	303-320	1
109-129	Hindlll	E2 HVR‘ консенсус	390-410	1
130-160		E2 HVR1a* консенсус	384-414	1.2

66205 Bl

(продължение)
163-379		СЗЗС къс	1211-1457	1
382-428	Hindlll	5-1-1 Plmut*	1689-1735	1
431-477	Nrul	5-1-1 Plmut*	1689-1735	3
480-526	Clal	5-1-1 Plmut*	1689-1735	2
521-564	Aval	C100	1901-1936	1
567-602	Xbal	NS5	2278-2313	1
605-640	Bglll	NS5	2278-2313	1
641-728		Епитопи i сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2
729-816		Епитопи i сърцевината	9-53, R47L 64-88 67-84	1 1 2

* 5-1-1 епитопите са модифицирани чрез елиминиране на възможни сайтове на разцепване (CS или СА) насочени чрез NS3/4a рекомбинантен протеин. Вместо CS или СА, последователността е променена на PI. Допълнително, SOD протеина е мутиран, така че конюгата за определяне, маркиран с HRP анти-SOD антитяло не свързва MEFA. Епитопът на сърцевината се мутира, за да се предпазят антителата от HCV сърцевината, използвани при определянето, да се свържат към MEFA.

При една форма на изследването, пробата се комбинира с твърда подложка, както е описано по-долу. Ако пробата е инфектирана с НСV, антигените на сърцевината, така както и антителата на НС V за тези епитопи, присъстващи върху твърдата подложка, ще се свържат към съставките на твърдата подложка. След това се прибавя анти-сърцевина антитяло маркирано за откриване. Маркираното анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен епитоп, а не като анти-сърцевина антитялото, което е свързано към твърдата подложка. Това анти-сърцевина антитяло свързва антигена на сърцевината, задържан от анти-сърцевина антителата върху твърдата подложка.

Добавя се, също така, антиген, който влиза в реакция с задържаното HCV антитяло от биологичната проба, която е заловила НС V антитяло от пробата, влиза в реакция с NS3/4a епитоп. Този антиген е, за предпочитане, епитоп, произлязъл от NS3/4a областта на HCV полипротеина. Този антиген свързва задържаното НС V антитяло от пробата. Известни са голям брой антигени, включващи такива епитопи, включително, но без да се ограничават до, антигени произлизащи от сЗЗс и с100 областите, така както и слети протеини, включващи NS3/4a епитоп, като с25. Тези, както и други NS3/4a епитопи се използват в настоящото изследване и са известни от състоянието на техниката и са описани в Houghton et al., US Patent No. 5,350,671; Chien et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA(1992) 89:1001110015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., European Publication Nos. WO 1993/000365; Chien et al., European Publication Nos. WO 1993/000365; Chien D. Y„ International Publication Nos. WO 1994/0101778;

66205 Bl и общо притежавани заявки за патент на САЩ с входящ No 08/403,590 и 08/444/818.

Прибавя се второ маркирано антитяло, насочено срещу описания по-горе антиген. Антитялото може да е насочено срещу който и да е епитоп, включително в антигена. Например, антитялото може да се насочи срещу NS3/4a областта, присъстваща в антигена. Алтернативно, ако горният антиген се експресира като слят протеин, второто маркирано антитяло може да се насочи срещу слетия партньор. Могат да се прибавят в изследването допълнителни антигени и антитела, по-специално, ако твърдата подложка включва MEFA. Тези формати на изследванията са обяснени по-долу.

Репрезентативно изследване при условията на изобретението е посочено на фигура 2. Както е показано на фигурата, твърдата подложка включва две анти-сърцевина моноклонални антитела, наименовани 11-13 и 11-7. Тези антитела са насочени срещу един епитоп, открит в Nтерминалната област на протеина на сърцевината при аминокиселини 10-53, номериран относително спрямо последователността на НСVI полипротеина. Твърдата подложка включва, също така, един епитоп за NS3/4a. Биологичната проба се добавя към твърдата подложка. HCV антигена на сърцевината, така както и антителата, насочени срещу NS3/4a епитопи, и двете присъстващи в пробата, ще се свържат с реактива за задържане върху твърдата подложка.

Маркирано с пероксидаза от хрян (HRP) анти-сърцевина моноклонално антитяло с 11 -14, насочено срещу С-терминалната област на сърцевината, открита в аминокиселинни позиции 120-130, номерирана относително спрямо последователността на HCV 1 полипротеина се прибавя след това. Слят протеин, който включва последователност от човешки SOD (hSOD) и епитоп от сЗЗс областта се прибавя като второ HRPмаркирано антитяло, насочено срещу SOD участъка на слетия протеин. SOD-сЗЗс сливането се свързва към aHTH-NS3 антитяло и анти-SOD антитялото, на свой ред, свързва SOD-сЗЗс слетия протеин. Откриване на маркировката означава наличие на НС V инфекция.

Друг репрезентативен пример при условията на изобретението, е посочен на фигура 8. Конфигурацията на изследването на антитялото е антиген-антитяло-антиген сандвич изследване на задържането, при използване на NS3/4a и MEFA 12. Твърдата подложка включва двете анти-сърцевина моноклонални антитела, описани погоре, епитоп за NS3/4a, така както и репрезентативен MEFA, MEFA 12, който включва съкратена версия на човешки SOD. Както при горното изследване, биологичната проба се прибавя към твърдата подложка. HCV антигенът на сърцевината, така както антителата насочени срещу NS3/4a епитопа и епитопите върху MEFA, присъстващи в пробата, свързват реактив за задържаното върху твърдата подложка. Прибавят се два антигена, един който реагира с антитела от пробата, които свързват NS3/4a (както е описано по-горе) и един който реагира с антитела от пробата, който свързва MEFA 12. На фигура 8, антигенът, който влиза в реакция с комплекса MEFA 12/антитяло от пробата, е сливане между една SOD молекула и c22ks Дeлτa47-L44W. c22ks антигенът е от областта на сърцевината и включва аминокиселините Lys₁₀ до Ser₉₉ на полипротеина, както и делеция на Arg₄₇, обикновено присъстваща и заместването на Leu от Тгр, в позиция 44. Конюгатът за откриване на антитяло е второто HRP-маркирано моноклонално анти-SOD антитяло, описано по-горе.

Гореописаните изследвания на антиген/ антитяло комбинация са изключително полезни, тъй като и двете, НС V антигена на сърцевината и антителата за NS3/4a и/или сърцевината могат да се открият чрез същата подложка в същото изследване. Освен това, както е описано погоре, допълнителни HCV епитопи, като SOD-слят към с1000, 5-1-1, NS5 антигени, както и протеинът, получен от отместването на рамката в областта на сърцевината на полипротеина, както и описания в International Publication No. WO 1999/063941, могат да се използват при коктейл на комбинацията, за да покрият други не-структурни епотипи HaHCV.

С цел по-нататъшното разбиране на изобретението се предлага по-подробно разглеждане, след взимане предвид получаването на антитела за използване във въпросното имуноизследване; получаване на полипептиди за използване в имуноизследването; и методи за провеждане на имуноизследване.

Получаване на антитела за използване в HCV имуноизследване

Както е обяснено по-горе, изследването

66205 Bl използва различни антитела, които са свързани към твърдата подложка (например, едно или повече анти-сърцевина антитела), и които откриват комплексите антиген/антитяло, образувани когато HCV инфекцията присъства в пробата. Тези антитела могат да са поликлонални или моноклонални препарати, моноспецифични антисеруми, човешки антитела, или могат да са хибридни или химерни антитела, както хуманизираните антитела, променени антитела, (Fab’)₂ фрагменти, (Fab) фрагменти, Fv фрагменти, антитела с единичен домен, структури на димерни или тримерни фрагменти, минитела, или техни функционални фрагменти, които се свързват към въпросния антиген.

Антителата се продуцират при използване на техники, добре известни на специалистите в областта и описани в, например, патенти на САЩ Nos. 4,011,308; 4,722,890; 4,016,043; 3,876,504; 3,770,380; и 4,372,745. Например, поликлонални антитела се генерират чрез имунизиране на подходящо животно, като мишка, плъх, заек, овца или коза, с антиген, представляващ интерес. С цел да се засили имуногенността, антигенът може да е свързан към носител преди имунизирането. Такива носители са добре известни на специалистите в областта. Имунизирането обикновено протича чрез смесване или емулгиране на антигена във физиологичен разтвор, за предпочитане в помощно средство, като пълен адювант на Freund, и инжектиране на сместа или емулсията парентерално (обикновено подкожно или интрамускулно). Обикновено на животното се прилага лекарствено средство с подсилващо действие 2-6 седмици по-късно с една или повече инжекции от антиген във физиологичен разтвор, за предпочитане непълен адювант на Freund. Антителата могат да се генерират, също така чрез in vitro имунизиране, при използване на методи, известни от състоянието на техниката. Поликлоналният антисерум се получава след това от имунизираното животно. Виж, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671, за описание на получаването на анти-HCV поликлонални антитела.

Моноклонални антитела обикновено се получават при използване на методи на Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, или негова модификация. Характерно, мишка или плъх се имунизира, както е описано по-горе. Въпреки това, вместо да се взима кръв от животното, за да се отдели серума, далакът (и при желание някои големи лимфни възли) се отстранява и се разделя (дисоцциира) на единични клетки. При желание, клетките от далака могат да се скринират (след отстраняване на неспецифично адхерентните клетки) чрез прилагане на клетъчна суспенсия в блюдо или ямка, с покритие от антигена. В-клетките, експресиращи свързан към мембраната имуноглобулин, специфичен за антигена, ще се свържат към блюдото, и не се промиват с остатъка от суспенсията. Получените В-клетки, цели или дисоциирани клетки от далак, след това се индуцират да се слеят с миеломни клетки, за да образуват хибридоми, и се култивират в селективна среда (например, среда с хипоксантин, аминоптерин, тимидин, “НАТ”). Получените хибридоми се посяват чрез пределно разреждане, и се изследват за продукция на антитела, които се свързват специфично към имунизиращия антиген (и който не се свързва към несвързаните антигени). Селекционираните хибридоми, секретиращи моноклонални антитела след това се култивират или in vitro (например, в колби за тъканни култури или hollow fiber реактори), или in vivo (например, като асцити в мишки).

Продуцирането на различни анти-HCV моноклонални антитела е описано в, например, Houghton et al., патент на САЩ No 5,350,671; Chien et al., International Publication Nos. WO 1993/000365; общопритежавана U.S. заявки за изобретение c входящи номера Nos., 08/403,590 и 08/444,818; и Kawahiwakuma et al., US Patent No. 5,871,904.

Както е обяснено по-горе, фрагментите от антитела, които запазват способността да разпознават антигена, представляващ интерес, също ще намерят приложение във въпросното имуноизследване. От състоянието на техниката са известни голям брой фрагменти на антитела, които съд ържат сайтове за свързване на антигена, способни да проявят имунологични свойства на свързване на молекула на интактно антитяло. Например, фрагменти на функционални антитела могат да се продуцират чрез разцепване на константна област, която не е отговорна за свързването на антигена, от молекулата на антитялото, при използване на, например, пепсин, за продуциране на F(ab’)₂ фрагменти. Фрагментите ще съ66205 Bl държат два сайта за свързване на антигени, но ще липсва участък от константната област от всяка от тежките вериги. Подобно, при желание, Fab фрагменти, съдържащи единичен сайт за свързване на антиген, могат да се продуцират, например, чрез смилане на поликлонално или моноклонално антитяло с папаин. Функционални фрагменти, включващи единствено вариабилните области на тежката и леката верига, също могат да се продуцират при използване на стандартни техники, като рекомбинантно продуциране или преференциално протеолитично разцепване на молекулите на имуноглобулина. Тези фрашенти са известни като Fv. Виж например, Inbar et al., (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:26592662; Hochman et al., (1976) Biochem 15:27062710; и Ehrlich et al., (1980) Biochem 19:40914096.

Едноверижен Fv (“sFv” или “scFv”) полипептид е ковалентно свързан V_H-V_L хетеродимер, който се експресира от генно сливане, включващо V_H- и У_ь-кодиращи гени, свързани чрез пептид-кодиращ линкер. Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883. Описани са голям брой методи за разпознаване и развитие на химични структури (линкери) за конвертиране на естествено агрегиране задържаното, но химически разделени, леки и тежки полипептидни вериги от V областта на антитяло в sFv молекула, която ще се нагъне в триизмерна структура, по същество подобна на структурата на антигенсвързващия сайт. Виж например, патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. sFv молекулите могат да се продуцират при използване на методи, описани в техническата същност на изобретението. Виж например, Huston et al., (1988) Proc. Natl, Acad, Sci. USA 85:5879-5883; патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. Критериите за проектирането включват определяне на подходящата дължина за обхващане на разстоянието между С-терминуса на една верига и N-терминуса на другата, при което линкерът; обикновено образуван от малки хидрофилни аминокиселинни остатъци, които нямат тенденция за слепване или за образуване на вторични структури. Такива методи са описани в предшестващото състояние на техниката. Виж например, патенти на САЩ Nos. 5,091,513; 5,132,405; и 4,946,778. Подходящите линкери обикновено включват полипептидни вериги на алтернативни комплекти на глицинови и серинови остатъци, и могат да включват остатъци на глутаминова киселина и лизинови остатъци, инсерирани за засилване на разтворимостта.

“Мини-антитела” или “минитела” също ще намерят приложение в настоящото изобретение. Минителата са sFv полипептидни вериги, които включват домени на олигомеризация при техните С-терминуси, разделени от sFv от шавнирна (hinge) област. Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584. Доменът на олигомеризация включва самоасоцииращи се алфа-спирали, например, левцин “зипери”, които могат след това да се стабилизират чрез допълнителни дисулфидни мостове. Доменът на олигомеризация е проектиран да е съвместим с векторното нагъване през мембраната, процес, за който се предполага, че подпомага in vivo нагъването на полипептида във функционален свързващ протеин. Обикновено, минителата се продуцират при използване на рекомбинантни методи, добре известни от техническата същност на изобретението. Виж например, Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al., (1992) J Immunology 1496:120-126.

Получаване на антигени за използване при HCV имуноизследвания

Както е обяснено по-горе, молекулите от настоящото изобретение обикновено се продуцират рекомбинантно. Така, полинуклеотидите, кодиращи НС V антигените за използване в настоящото изобретение, могат да се получат при използване на стандартни техники на молекулярната биология. Например, полинуклеотидните последователности, кодиращи гореописаните молекули могат да се получат при използване на рекомбинантни методи, както чрез скриниране на сДНК и геномни библиотеки от клетки, експресиращи гена, или чрез ген, произлизащ от вектор, известен с това, че включва същия. Освен това, желаният ген може да се изолира директно от молекулите на вирусните нуклеинови киселини, при използване на техники, описани в състоянието на техниката, както Houghton et al., US Patent No. 5,350,671. Генът, представляващ интерес може да се продуцира, също така, синтетично, а не да се клонира. Молекулите могат да се проектират с подходящи кодони за определената последователност. След това се сглобява пълната последователност от припокриваА А

66205 Bl щи се олигонуклеотиди, изготвени чрез стандартни методи и сглобени в пълна кодираща последователност. Виж например, Edge et al., (1981) Nature 292:756; Nambair et al., (1984) Science 223:1299; и Jay et al., (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Следователно, определени нуклеотидни последователности могат да се получат от вектори, пренасящи желаните последователности или да се синтезират изцяло или частично при използване на различни техники на олигонуклеотиден синтез, известни от състоянието на техниката, както сайт-насочен мутагенез и полимеразна верижна реакция (PCR) техники, когато са подходящи. Виж например, Sambrook, по-горе. По-специално, един метод за получаване на нуклеотидни последователности, кодиращи желаните последователности е чрез хибридизиране комплементарните сетове на припокриващи се синтетични олигонуклеотиди, продуцирани чрез конвенционален, автоматизиран полинуклеотиден синтезатор, следвано от лигиране с подходяща ДНК лигаза и амплифициране на лигираната нуклеотидна последователност чрез PVR. Виж например, Jayaraman et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088.

Допълнително, насочената синтеза на олигонуклеотиди (Jones et al., (1986) Nature 54:7582), насочения мутагенез на олигонуклеотиди на предварително съществуващи нуклеотидни области (Richmann et al., (1988) Nature 332:323327), и Verhoeyen et al., (1988) Science 239:15341536, и ензимно запълване на олигонуклеотиди с “празнини” при използване на Т₄ ДНК полимераза (Queen et al., (1989) Proc. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) могат да се използват за изобретението, за да се предоставят молекули, с променени или засилени антиген-свързващи способности, и/или намалена имуногенност.

След като веднъж се изготвят или изолират кодиращите последователности, такива последователности могат да се клонират в който и да е подходящ вектор или репликон. Голям брой клониращи вектори са известни на специалистите в областта и селекцията на който и да е подходящ вектор за клониране е въпрос на избор. Подходящите вектори включват, но без да се ограничават до, плазмиди, фаги, транспозони, космиди, хромозоми или вируси, които са способни на репликация когато се асоциират с правилен контролен елемент.

След това, кодиращата последователност се поставя под контрола на подходящи контролни елементи, в зависимост от системата, която ще се използва за експресиране. По този начин кодиращата последователност може да се постави под контрола на промотор, сайт за свързване на рибозом (за бактериална експресия) и, при желание, оператор, така че ДНК последователността, представляваща интерес да се транскрибира насочената синтеза на олигонуклеотиди Nature 54:75-82), (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) последователности PHK чрез подходящи трансформанти. Кодиращата последователност може да съдържа или да не съдържа сигнален пептид или ледерна последователност, които могат по-късно да бъдат отстранени от гостоприемника чрез пост-транслационен процесинг. Виж например, патенти на САЩ Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

В допълнение към контролните последователности, може да е желателно да се добавят регулаторни последователности, които да позволяват регулирането на експресията на последователностите, свързани с растежа на клетката гостоприемник. Регулаторните последователности са известни на специалистите в областта и примери включват тези, които причиняват експресията на гена, който трябва да се “включи” или “изключи” в отговор на химичен или физичен стимул, включително присъствието на регулаторно съединение. Друг тип регулаторни елементи също могат да присъстват във вектора. Например, енхансерни елементи могат да се използват в настоящото, за увеличаване нивата на експресията на структурите. Примери, които включват SV40 ранен генен енхансер (Dijkema et al., (1985) EMBO J. 4:761) енхансер/ промотор произлизащ от дългия краен повтор (LTR) на Raous Sarcoma Virus (Gorman et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) и елементи, произлизащи от човешки CMV (Boshart et al., (1985) Cell 41:521), както и елементи, включени в последователността на интрон А на CMV (патент на САЩ No. 5,688,688). Експресионната касета може да включва, освен това, начало на репликация за автономна репликация в подходяща клетка гостоприемник, един или повече маркери за селекция, един или пове

66205 Bl че рестрикционни сайтове, потенциал за голям брой копия е силен промотор.

Един експресионен вектор се конструира така, че посочената кодираща област да се локализира във вектора с подходящите регулаторни последователности, позициониране и ориентиране на кодиращата последователност, като се имат предвид контролните последователности, да са такива, че кодиращата последователност да се транскрибира под “контрола” на контролни последователности (т.е. РНК полимераза, която се свързва към ДНК молекула при контролните последователности, да транскрибира кодиращите последователности). Модифициране на последователностите, кодиращи молекулата, представляваща интерес може да е желано за достигане на този край. Например, при някои случаи може да е необходимо да се модифицира последователността така, че да може да се прикрепи към контролните последователности в подходящата ориентация; т.е., да се поддържа рамката на разчитане. Контролните последователности и други регулаторни последователности могат да се лигират към кодиращата последователност преди инсериране във вектор. Алтернативно, кодиращата последователност може директно да се клонира в експресионен вектор, който вече съдържа контролните последователности и подходящ рестрикционен сайт.

Както е обяснено по-горе, може да е желателно, също така, да се продуцират мутанти или аналози на антигена, представляващ интерес. Това е в сила особено за NS3/4. Методи за постигане на това са описани в, например, Dasmahapatra et al., US Patent No. 5,843,752 и Zhang et al., US Patent No 5,990,276. Мутанти или аналози на този и други НС V протеини за използване при въпросното изследване могат да се приготвят чрез делетиране на участък от последователността, кодираща полипептида, представляващ интерес, чрез инсериране на последователност, и/или чрез заместване на един или повече нуклеотида в последователността. Техники за модифициране на нуклеотидни последователности, като сайт-насочен мутагенез, и други подобни, са добре известни на специалиста в областта. Виж, например, Sambrook et al., по-горе; Kunkel, Т. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al., (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983)

Methods Enzymol. 100-468; Dalbie-McFarland et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409.

Молекулите могат да се експресират в широка гама от системи, включително експресионни системи от насекоми, бозайници, бактерии, вируси и дрожди, също известни от предшестващото състояние на техниката.

Например, експресионна система от клетки на насекоми, като бакуловирусни системи, са известни на специалистите в областта и са описани в, например, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Материали и методи за експресионни системи от бакуловирус/клетки на насекоми се предоставят на пазара под формата на комплекти, между другото на Invitrogene, San Diego СА (“МахВас” комплект). Подобно, експресионни системи от клетки на бозайници и бактерии са известни от предшестващото състояние на техниката и са описани в, например, Sambrook et al., по-горе. Експресионни системи от дрожди също са известни от предшестващото състояние на техниката и са описани в, например, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London.

Известни са, също така, голям брой клетки гостоприемници, за използване с горните системи. Например, известни са от предшестващото състояние на техниката клетъчни линии от бозайници и включват имортализирани клетъчни линии, предоставени от American Type Culture Collection (ATCC), както, но без да се ограничава до, клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО), HeLa клетки, клетки от бъбрек на бебе хамстер (ВНК), клетки от бъбрек на маймуна (COS), клетки от бъбрек на човешки ембрион, клетки от човешка хепатокарцинома (например Hep G2), Madin-Darby клетки от говежди бъбрек (“MDBK”), така както и други. Подобно, бактериални гостоприемници, като Е. coli, Bacillus subtilis и Streptococcus spp., ще намерят приложение с настоящите експресионни структури. Гостоприемници дрожди, които намират приложение в настоящото изобретение включват, между другото, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha. Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichiaguillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки от насекоми за използване с

66205 Bl експресионни вектори от бакуловирус включват, между другото, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni.

Молекули нуклеинови киселини, които съдържат нуклеотидни последователности, представляващи интерес могат стабилно да бъдат интегрирани в генома на клетката гостоприемник или да се поддържат върху стабилен епизомален елемент в подходяща клетка гостоприемник, при използване на различни техники на доставяне на гени, добре известни от предшестващото състояние на техниката. Виж например, патент на САЩ No. 5,399,346.

Според избраната експресионна система и гостоприемник, молекулите се продуцират чрез култивиране на клетките гостоприемник, трансформирани чрез експресионен вектор, описани по-горе при условия, при които протеинът се експресира. Експресираният протеин се експресира, след това, от клетките гостоприемник и се пречиства. Ако експресионната система секретира протеина в растителната среда, продуктът може да се пречисти директно от средата. Ако не се секретира, той може да се изолира от клетъчните лизати. Изборът на подходящите растежни условия и на методите на извличане са известни от предшестващото състояние на техниката.

Рекомбинантното продуциране на различни HCV антигени е описано вече. Виж например, Houghton et al., US патент № 5,350,671; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., International Publication No WO 1993/ 000365; Chien, D. Y., International Publication No WO 1994/0101778.

Имунодиагностични изследвания

След като се продуцира, горните анти-сърцевина антитела и НБЗ/4антигени се поставят върху подходяща твърда подложка за използване в посочените имуноизследвания. Твърда подложка, за целите на изобретението, може да е който и да е материал, който е неразтворим матрикс и може да има твърда или полутвърда повърхност. Примерни твърди подложки включват, но без да се ограничават до, субстрати като нитроцелулоза (например, под формата на мембрана или микротитърна ямка); поливинилхлорид (например, повърхност или микротитьрна ямка); полистиролов латекс (например, перли или микротитьрно блюдо); поливинилидин флуорид; диазотизирана хартия; найлонови мембрани; активирани перли, магниточувствителни перли, и други подобни. Определени подложки включват блюда, пелети, дискове, капиляри, кухи влакна, игли, карфици, твърди влакна, целулозни перли, порьозни стъклени перли, силикагел, полистиролови перли, при желание омрежени с дивинилбензен, перли от присадени съполимери, полиакриламидни перли, диметилакриламидни перли, при желание омрежени с №№=бис-акрилоилетилендиамин, и стъклени частици с покритие от хидрофобен полимер.

При желание, молекулите, които трябва да се добавят към твърдата подложка лесно могат да се направят функционални за създаване на стиролови или акрилатни остатъци, като по този начин да се направи възможно инкорпорирането на молекулите в полистирол, полиакрилат или полимери, като полиамид, полиакриламид, полиетилен, поливинил, полидиацетилен, полифенилен-винилен, полипептид, полизахарид, полисулфонил, полипропол, полиимидазол, политиофен, полиетер, епокси, кварцово стъкло, силикагел, полифосфат, хидрогел, агароза, целулоза, и други подобни.

При един контекст; твърдата подложка първо се привежда в реакция с HCV анти-сърцевина антитела и NS3/4 епитоп (колективно наричани “компоненти на твърдата фаза”, в настоящото), и при желание, един или повече MEFAs, при условия подходящи за свързване, така че молекулите да са достатъчно имобилизирани към твърдата подложка. Понякога, имобилизирането към твърдата подложка може да бъде усилено, като първо се свърже антигена и/или антитялото към протеин с по-добри свойства на свързване към твърда фаза. Подходящи свързващи протеини включват, но без да се ограничават до, макромолекули като серумен албумин, говежди серумен албумин (BSA), хемоцианин от keyhole limpe (вид риба), молекули имуноглобулин, тироптобулен, овалбумин, и други протеини, добре известни на специалистите в областта. Други реагенти, които могат да бъдат използвани за свързване на молекули към подложката включват полизахариди, полимлечни киселини, полигликолови киселини, полимерни аминокиселини, аминокиселинни съполимери, и други подобни. Такива молекули и методи на присъединяване

66205 Bl тези молекули към антигени са добре известни на специалистите в областта. Виж например, Brinkley, М. А. (1992) Bioconjugate Cham. 3:2-13; Hashida et al., (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; и Anjaneyulu and Storos (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

След като влезе в реакция твърдата подложка с компонентите на твърдата фаза, всички неимобилизирани компоненти на твърдата фаза се отстраняват от подложката чрез промиване, а свързаните с подложката компоненти се привеждат тогава в контакт с биологичната проба, за която се предполага, че съдържа HCV антитела и антигени (колективно наречени в настоящото “лигандни молекули”), при подходящи условия на свързване. След промиване, за да се отстранят всички несвързани лигандни молекули, второ анти-сърцевина антитяло насочено срещу друг епитоп, различен от анти-сърцевина антитялото, свързван към подложката, се прибавя при подходящи условия на свързване. Добавеното антисърцевина антитяло съдържа откриваем маркер, както е описано по-горе, и действа към свързване на който и да е антиген, който би могъл да присъства в пробата, която е реагирала с антисърцевина антитялото свързано с подложката. Прибавят се, също така, един или повече антигени, които могат да реагират с антитела, които присъстват в пробата, която на свой ред е реагирала с NS3/4 епитопа. Както е обяснено погоре, антигенът произлиза характерно от NS3/4 областта на HCV полипротеин, и по-специално от сЗЗс областта на HCV. Виж например, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671. Нуклеотидните и аминокиселинните последователности за човешка SOD са известни и са посочени в Hallewell et al., U.S. No. 5,710,033. Маркирано антитяло, насочено срещу човешки SOD може, следователно, да се използва за откриване присъствието на комплекси, образувани между NS3/4 епитоп, което и да е антитяло в пробата, което влиза в реакция с този епитоп, и HCV полипептиди, които на свой ред свързват антитялото в пробата.

Ако присъства MEFA върху твърдата подложка, един или повече допълнителни антигени, които влизат в реакция с антитела от биологичната проба, които са свързани с антигени, присъстващи върху MEFA, също могат да се добавят към изследването. Особено полезен, в този контекст, е един антиген, произлизащ от областта на сърцевината на НС V, и поспециално, от с22 антигена, който включва 119 N-терминални аминокиселини на сърцевината на HCV полипротеина. Един определен антиген, произлизащ от с22 е c22ks Дeлτa47-L44W, който включва аминокиселини Lys_]0 до Ser₉₉ на полипротеина, както и делеция на Arg47, обикновено присъстваща и заместване на Leu с Тгр в позиция 44. Както при описания по-горе сЗЗс епитоп, този антиген може да се достави като слят с hSOD и същото маркирано антитяло, насочено срещу човешки SOD може да се използва за откриване присъствието на комплекси, образувани между антителата, които присъстват в пробата и NS3/4a епитопа и/или MEFA, които комплекси също са свързани с HCV антигените (например, сЗЗс и с22).

По-специално, може да се използва ELISA метод, при който ямките на микротитърните блюда са с покритие от съставките на твърдата фаза. Биологична проба, съдържаща или за която се подозира, че съдържа лигандни молекули се добавя след това към ямките с покритието. След период на инкубиране, достатъчен за да се позволи свързването на лигандните молекули към имобилизираните съставки на твърдата фаза, блюдото(ата) може да се промие, за да се отстранят несвързаните молекули и маркираната за откриване вторично свързана молекула (маркирано анти-сърцевина антитяло), молекула, съдържаща NS3 епитоп, и антитяло, насочено срещу молекулата, съдържаща NS3 епитоп могат да се добавят. На молекули се дава възможност да взаимодействат с който и да е задържан антиген и антитяло от проба, блюдото се промива и се открива присъствието на маркираните антитела чрез използване на методи, добре известни от предшестващото състояние на техниката.

Гореописаните реагенти, включително твърдата подложка на имуноизследването със свързаните антитела и антигени, така както и антителата и антигените, които ще влязат в реакция със задържаната проба могат да се доставят като китове (комплекти), с подходящи инструкции и други необходими реагенти, с цел да се проведе имуноизследването, както е описано по-горе. Китовете могат да съдържат освен това, според определеното имуноизследване, което се използва, подходящи маркери и други

66205 Bl пакетирани реагенти и материали (т.е. промивни буфери и други подобни). Стандартни имуноизследвания, като тези описани по-горе, могат да се проведат при използване на тези китове.

III. Експериментална част

По-долу се излагат примери за изпълнение на изобретението за специфични варианти за изпълнение, за провеждане на настоящото изобретение. Примерите се предлагат единствено с илюстративна цел, и нямат цел да ограничават обхвата на настоящото изобретение по какъвто и да е начин.

Направени са усилия за осигуряването на точност по отношение на използваните цифри (например, количества, температури, и др.), но някои експериментални грешки и отклонения могат, разбира се, да се допуснат.

Пример 1

HCV антиген/антитяло комбинирано изследване

Настоящото НС V антиген/антитяло комбинирано изследване се сравнява с други НС1 изследвания, за да се тестват границите на откриване на сероконверсията и да се сравнят тези граници с тези, получени при други, достъпни от търговската мрежа, изследвания, както следва.

А. Материали и методи

Кръвни проби: Използват се панели от достъпни на пазара човешки кръвни проби. Такива панели се доставят от например, Boston Biomedica, Inc., West Bridgeswater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, МА (ВСР); и North American Biologies, Inc., BocoRatan, FL (NABI). Дните, отбелязани в таблиците 5 и 6 са дните, в които се взима кръв от субектите.

Моноклонални антитела: Моноклонални антитела cll-3, cll-7 и cl 1-14 се получават от Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey, cl 1-3 и cl 1-7 антителата са насочени срещу Nтерминалния участък на сърцевината (аминокиселини 10-53, номерирани относително по отношение на НС VI полипротеина). Моноклоналното антитяло cl 1-14 е насочено срещу С-терминалния участък на сърцевината (аминокиселини 120130, номерирани относително по отношение на HCV1 полипротеина). cll-14 антитялото се конюгира с пероксидаза от хрян (HRP), при използване на стандартни процедури.

Моноклонално антитяло 5А-3 е анти-SOD антитяло, насочено срещу аминокиселини 1 до 65 на SOD и е получено чрез стандартни техники. Антитялото се конюгира с HRP, както е описано по-горе.

B. Антигени сЗЗс антигенът (266 аминокиселини, аминокиселини 1192 до 1457 на НС VI полипротеина) се експресира като вътрешен SOD слят полипептид в Е. coli чрез методи, описани за синтеза на 5-1-1 антигена (Choo, et al., Science (1989) 244:359-362). Рекомбинантният антиген се пречиства както е описано в Chien et al., Proc. Natl., Acad. Sci. (1989) 89:10011-10015. Виж, също така, Houghton et al., патент на САЩ No. 5,350,671 за получаване на протоколи за SODсЗЗс.

NS3/4a епитопът, който се използва при изследването е конформационен епитоп, който притежава последователността, посочена на фигура 3.

C. Формати на имуноизследвания

Abbott PRISM изследвания (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване за откриване, основаващо се на антитяло. Изследването се провежда при използване на препоръките на производителя.

ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (наречена Ortho 3.0 изследване в настоящото, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) представлява изследване за откриване, основаващо се на антитяло. Изследването се провежда при използване на препоръките на производителя.

Roche Amplicor изследване (Roche, Pleasant, СА) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване, основано на PCR. Изследването се провежда при използване на препоръките на производителя.

Gen-Probe ТМА изследване (San Diego, СА) се доставя от търговската мрежа и представлява изследване на амплификацията, медиирана от транскрипцията. Изследването се провежда при използване на препоръките на производителя.

Ortho антигенно изследване (Ortho Clinical

Diagnostics, Raritan, New Jersey) представлява изследване за откриване, основаващо се на антиген. Изследването се провежда при използ66205 Bl ване на препоръките на производителя.

Посоченото HCV антиген/антитяло комбинирано имуноизследване се провежда както следва. 4 mg/ml от всяко от пречистените моноклонални антитела С11 -7 и С11 -3 х физиологичен 5 разтвор във фосфатен буфер (PBS), pH 7,4 се комбинират и се смесват добре. 90 ng NS3/4a рекомбинантен антиген се прибавя към същия покривен буфер. Сместа се смесва в продължение на 30 min преди покриването. Прибавят се 200 10 ml от горния разтвор на ямка от 96-ямково Costar mediym binding микротитърни блюда (Coming, Inc.). Блюдата се инкубират при 15-30°С в продължение на 16-24 h. Блюдата се промиват двукратно с dH₂O, следвано от 300 microl/ямка бу- 15 фер за след нанасяне на покритие (1% говежди серумен албумин (BSA) в продължение на 1 h и 300 microl на ямка стабилизиращ буфер (1 х PBS, манитол, полиетиленгликол (PEG), желатин) в продължение на 1 h. Блюдата се аспирират и из- 20 сушават при 4°С в лиофилизатор в продължение на 24 h. Блюдата се пълнят с десикант.

За да се проведе антиген/антитяло комбинираното имуноизследване, 100 microl засилен лизисен буфер (1: N-лаурилсаркозин, 0,65 М 25 NaCl, 50 mg/ml миши IgG със степен на чистота технически чист (Sigma, St. Louis, МО), 1%BSA сулфхидрил-модифициран (Bayer), 0,1% Казеин) се прибавят към блюдото. След това се прибавят 100 ml от пробата. Инкубира се върху шейкер 30 при 40°С за 1 h. Блюдата се промиват шест пъти с 1 х PBS, 0,1% Tween-20, върху Ortho Plate Washer. 200 ml разтвор за конюгиране (1:75 разреждане на cll-14-HRP с 250 ng/изследване SOD-сЗЗс антиген плюс 1:5000 разреждане на 35 миши анти-SOD-HRP в HCV 3.0 разредител на проба (от ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test

System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) без SOD екстракт, всичките приготвени 30 min преди прибавянето). Разтворът се инкубира 45 min при разклащане на 40°С. Промива се шесткратно, както по-горе, и се прибавят 200 ml разтвор на субстрат (1 OPD таблек/100 ml). OPD таблекта съдържа о-фенилендиамин дихидрохлорид и водородна пероксидаза за развиване на цветната реакция с пероксидазата от хрян, и се доставя от Sigma, St. Louis, МО. Инкубира се 30 min при 15-30°С на тъмно. Реакцията се спира чрез прибавяне на 50 ml 4N H₂SO₄ и блюдата се отчитат при 492 nm, спрямо абсорбцията при 690 ши като контрола.

D. Резултати

Резултатите от различните изследвания са показани на таблици 5 и 6, които представят два отделни експеримента, извършени върху кръвни проби, поставени при HCV инфекция, както е посочено. Потъмнените области показват откриване на вирус. Както е показано по-долу, комбинираното изследване антиген/антитяло на Chiron открива сероконверсия във всичките проби, докато всички други изследвания на основата на антиген и антитяло не показват сероконверсия даже и в една проба. По-специално, нито едно от изследванията на основата на антитяло не открива сероконверсия поне до 18-ия ден (таблица 5). Таблица 6 показва, че нито едно от изследванията на основата на антитяло не открива сероконверсия от 85-ия ден нататък.

Следователно, на основата на горните резултати, става ясно, че новото комбинирано изследване антиген/антитяло намалява броят на негативните грешки, получени при използване на други конвенционални антитяло-антиген-основаващи се изследвания.

Таблица 5 HCV сероконверсия
Дни	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplico	GenProbe TMA	Ortho A	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	>5x10s	9,25	18,6	2,8
4	0,1	0,0	>5x1'0®	9,29	19,0	3,1
7	0,1	0,0	>5x10s	9,52	22,3	1.5
13 _	0,3	0,1	>5x105	9,59	26,2	1.7

66205 Bl (продължение)

18	1,3	0,4	>5x10°	9,70	15,9	1.2
21	2,2	1,0	>5х105	9,39	11,3	1,5
164	4,2	4,4	4x104	9,28	0,11	2,5

Таблица 6 HCV сероконверсия
Дни	Abbott PRISM	Ortho 3.0	Roche Amplico	GenProbe TMA	Ortho A	Chiron Ag/Ab
0	0,1	0,0	BLD		0,11	0,5
13	0,1	0,0	>5x10s		44,0	3,0
20	0,1	0,0	>5x105		24,2	1.3
22	0,3	4,7	>5x105		29,2	1.6
85	5,4	4,7	BQR		0,06	1.1
131	4,3	4,7	BQR		0,09	1.0
135	4,6	4,7	3x10^		0,09	1.2
138	5,5	4,7	BLD		0,08	1,2
146	5,9	4,7	BLD		0,11	2.1
152	5,2	4,7	BQR		0,07	1.8

Пример 2

Продуциране на NS3/4a конформационен епитоп с Thr до Pro и Ser до Пе замествания

Конформационен епитоп NS3/4a се получава както следва. Този епитоп притежава последователността, определена на фигури 4А до 4D и се различава от нативната последователност при позиции 403 (аминокиселини 1428 на НС V-1 в цяла дължина последователности) и 404 (аминокиселина 1429 наНСУ-1 в цяла дължина последователност). Специфично, Thr, който нормално се среща в позиция 1428 на нативната последователност е мутиран в Pro и Ser, които :е срещат, в позиции 1429 на нативната последователност са мутирани в Пе.

По-специално, използваният дрождев експресионен вектор е pBS241.1, описан по-горе. Плазмид pd.hcvla.ns4aPI, който кодира репрезентативен NS3/4a епитоп, използван в посочените имуноизследвания, се продуцира както следва. Използва се двуетапна процедура. Първо, следните ДНК части се лигират заедно: (а) синтетични олигонуклеотиди, които биха предоставили 5' Hindlll сайтове за клониране, последвано от последователност АСААААСААА, инициатор ATG, и кодони за НС V1 а, като започ

66205 Bl ва c аминокиселина 1027 и продължава до Bgll сайт при аминокиселина 1046; (Ь) 683 bp BgllClal рестрикционен фрагмент (кодиращ аминокиселини 1046-1274) OTpAcHLTns3ns4aPI; и (с) pSP72 вектор (Promega, Madison, WI, GenBank/ EMBL Accession Number X65332), който е смлян c Hindlll и Clal, дефосфорилиран, и пречистен през гел. Плазмид pAcHLTns3ns4aPI произлиза от pAcHLT, експресионен вектор от бакуловирус, достъпен от търговската мрежа на BD Pharmingen (San Diego, СА). По-специално, pAcHLT EcoRIPstl вектор се получава, така както и следните фрагменти: EcoRI-Alwnl, 935 Ьр, съответстващ на аминокиселини 1027-1336 HaHCV-1 генома; Alwnl-SacII 247 Ьр, съответстващ на аминокиселини 1336-1419 на HCV-1 генома, Hinfl-Bgll, 175 Ьр, съответстващ на аминокиселини 14491509 на HCV-1 генома; Bgll-PstI, 619 Ьр, съответстващ на аминокиселини 1510-1711 на НС V-1 генома; плюс кодона за край на транскрипцията. SacII-Hinfl, синтетично генериран фрагмент от 91 Ьр, съответстващ на аминокиселини 1420-1448 на HCV-1 генома и съдържащ PI мутации (Thr1428 мутиран в Pro, Ser-1429, мутиран в Пе), се лигира със 175 bp Hinfl-Bgll фрагмент и 619 Ьр Bgll-PstI фрагмент, описан по-горе се субклонира в pGEM-5Zf(+) вектор, смлян с SacII и Pstl. pGEM-5Zf(+) е предлаган на пазара Е. coli вектор (Promega, Medison, WI, GenBank/EMBL Accession Number X65308). След трансформиране на компетентни НВ101 клетки, миниекранен анализ на отделни клонове и проверка на последователности, 885 bp SacII-PstI фрагмента от pGEM.5PI клон 2 се пречиства през гел. Този фрагмент се лигира с EcoRI-Alwnl 935 Ьр фрагмент, Alwnl-SacII 247 Ьр фрагмент и pAcHLT EcoRI-PstI вектор, описан по-горе. Получената структура се нарича pAcHLTns3ns4aPI.

Горната лигираща смес се трансформира в НВ 101 -компетентни клетки и се посява в Lauria агарови блюда, съдържащи 100 microg/ml ампицилин. Минипреп анализ на индивидуални клонове води до идентифицирането на предполагаеми позитивни клона, два от които се амплифицират. Плазмидната ДНК за pSP72 1 аНС, клонове #1 и #2 се приготвят с Qiagen Maxiprep кит и се секвенират.

Следващо, следните фрагменти се лигират заедно: (а) 761 bp Hindlll-Clal фрагмент от pSP721aHC #1 (pSP72.1aHC се генерира чрез ли гиране заедно на следните: pSP72, който е бил смлян с Hindlll и Clal, синтетични олигонуклеотиди, който би предоставил 5' Hindlll сайт на клониране, следвано от последователността АСААААСААА, кодона за иницииране ATG, и кодони за НС V1 а, започващ с аминокиселина 1027 и продължаващ до BgHI сайт при аминокиселина 1046, и 683 bp BgHI-Clal рестрикционен фрагмент (кодиращ аминокиселини 1046-1274) от pAcHLTns3ns4aPI); (Ь) 1353 bp BamHIHindlll фрагмент за дрождевия хибриден промотор ADH2/GAPDH; (с) 1320 bp Clal-Sall фрагмент (кодиращ НС V1 а аминокиселини 1046-1711 с Thr 1428 мутиран на Pro и Ser 1429 мутиран на Пе) от pAcHLTns3ns4aPI; и (d) pBS24.1 дрождев експресионен вектор, който е смлян с BamHI и Sall, дефосфорилиран и пречистен през гел. Лигиращата смес се трансформира в компетентни НВ 101 и се посява върху Lauria агарови блюда, съдържащи 100 microg/ml ампицилин. Минипреп анализ на индивидуални клонове води до идентифицирането на клонове с очаквания 3446 bp BamHI-Sall инсерт, който се състои от ADH2/ GAPDH промотор, кодона за иницииране ATG и HCVlaNS3/4a от аминокиселини 1027-1711 (показан като аминокиселини 1-686 на фигури 4А4D), с Thr 1428 (аминокиселинна позиция 403 на фигури 4A-4D) мутиран на Pro и Ser 1429 (аминокиселинна позиция 404 на фигури 4A-4D) мутиран на Пе. Структурата се нарича pd.HCVla.ns3ns4aPI (виж фигура 5).

Щам AD3 на S. cerevisiae се трансформира с pd.HCVla.ns3ns4aPI и единичните трансформанти се проверяват за експресия след изчерпване на глюкозата в средата. Рекомбинантният протеин се експресира при високи нива в дрожди, както се открива чрез оцветяване с Coomassie Blue и потвърждаване чрез имуноблотинг анализ, при използване на поликлонално антитяло за хеликазния домен HaNS3.

Пример 3

Пречистване HaNS3/4a конформационен епитоп

NS3/4a конформационният епитоп се пречиства както следва. Клетки от S. cerevisiae, както по-горе, експресиращи NS3/4a епитоп се събират както е описано по-горе. Клетките се суспендират в лизисен буфер (50 mM Tris pH 8,0,

150 тМ NaCl, 1 тМ EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 microM пепетатин 1 microM леупептин) и се ли66205 Bl зират в Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Switzerland) или друга еквивалентна апаратура, при използване на стъклени перли, при съотношение от 1:1:1 клетки:буфер:0,5 mm стъклени перли. Лизатът се центрофугира при 30100 х g в продължение на 30 min при 4°С и пелетата (плътната утайка), съдържаща неразтворимата белтъчна фракция се прибавя към промивен буфер (6 ml/начално тегло на клетъчната пелета) и се поставят на клатачен апарат при стайна температура в продължение на 15 min. Промивният буфер се състои от 50 mM NaPO₄ pH 8,0, 0,3 М NaCl, 5 тМ бета-меркаптоетанол, 10% глицерол, 0,05% октил глюкозид, 1 mM EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 microM пепстатин, 1 microM леупептин. Клетъчните отломки се отстраняват чрез центрофугиране при 30100 х g в продължение на 30 min при 4°С. Супернатантата се изхвърля, а пелетата се запазва.

Протеинът се екстрахира от пелетата както следва. 6 ml/g екстракционен буфер се прибавят и се поставят на клатачен апарат при стайна температура в продължение на 15 min. Екстракционният буфер се състои от 50 mM Tris pH 8,0, 1 М NaCl, 5 mM бета-меркаптоетанол, 10% глицерол, 1 mM EDTA, 1 тМ PMSF, 0,1 microM пепстатин 1 microM леупептин. Центрофугира се при 30100 х g в продължение на 30 min при 4°С. Супернатантата се запазва и се прибавя амониев сулфат към 17,5%, при използване на следната формула: обем на супернатантата (ml) умножен по х % амониев сулфат/ (1 - х% амониев сулфат) = ml от 4,1 М наситен амониев сулфат за прибавяне към супернатантата. Амониевият сулфат се прибавя на капки при разбъркване върху лед, и разтворът се бърка върху лед 10 min. Разтворът се центрофугира при 3017700100 х g в продължение на 30 min при 4 °C и пелетата се запазва и се съхранява от 2°С до 8°С до 48 h.

Пелетата се ресуспендира и се пропуска през Poly U колона (Poly U Sepharose 4В, Amersham Pharmacia) при 4°С, както следва. Пелетата се ресуспендира в 6 ml Poly U изравняващ буфер на грам тегло на пелетата. Изравняващият буфер се състои от 25 mM HEPES pH 8,0, 200 тМ NaCl, 5 тМ DTT (прибавя се свеж), 10% глицерол, 1,2 ? октил глюкозид. Разтворът се поставя на клатачен апарат при стайна температура и се центрофугира при 30100 х g в продължение на 30 min при 4°С.

Poly U колоната (1 ml смола на грам стартова пелета) се подготвя. Скоростта на линейния поток е 60 cm/hr и скоростта на обвиващия поток е 133% от 60 cm/hr. Колоната се уравновесява с уравновесяващ буфер, а супернатантата на ресуспендирана пелета на амониевия сулфат се натоварва на уравновесената колона. Колоната се промива до базовата линия с уравновесяващ буфер и протеинът се елюира посредством стьпково елюиране в следния Poly U буфер за елюиране: 25 mM HEPES pH 8,0, 1 М NaCl, 5 mM DTT (прибавя се свеж), 10% глицерол, 1,2 ? октил глюкозид. Колонният елюат се пропуска през SDS-PAGE (оцветен с Coomassie) и аликвотни части се замразяват и се съхраняват при 80°С. Присъствието HaNS3/4a епитоп се потвърждава чрез Western blot, при използване на поликлонално антитяло срещу 5-1-1 епитоп (HCV 4а).

Допълнително, наблюдава се ензимната протеазна активност по време на пречистване както следва. NS3/4a пептид (KKGS WIVGRIVLS GKPAIIPKK), и фракциите, които съдържат NS3/ 4а конформационния епитоп, се разреждат в 90 microl реакционен буфер (25 mM Tris pH 7,5, 0,15 тМ NaCl, 0,5 тМ EDTA, 10% глицерол 0,05 п-додецил B-D-малтозид, 5 тМ DTT) и позволява смесването за 30 min при стайна температура. 90 microl от сместа се прибавят към микротитърно блюдо (Costar, Inc., Coming, NY) и се прибавят 10 microl от HCV субстрата (AnaSpec, Inc., San Jose СА). Блюдата се размесват и се отчитат на Fluorostar четящо устройство за блюда. Резултатите се отразяват като относителни флуоресцентни единици (RFU) за минута.

При използване на тези методи, продуктът от екстрахиране 1М NaCl съдържа 3,7 RFU/ min активност; преципитатьт с амониев сулфат е с активност от 7,5 RFU/min, а продуктът от Poly U пречистването е с активност от 18,5 RFU/min.

Пример 4

Съревнователно изследване

Следното съревнователно изследване се провежда с цел да се оцени дали NS3/4 конформационен епитоп открива различни антитела от други HCV антигени. По-специално, NS3/4 антигенът се сравнява с с200 антигена, както следва.

66205 Bl

0,5 microg и 1,0 microg NS3/4, продуциран както е описано по-горе, или с200 (Hepatology (1992) 15:19-25, на разположение от ORTHO HCV VERSION 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnosistics, Raritam, New Jersey) се смесват c 20 microl от проба PH V914-5 (кръв от ранна cepoконверсия, получена от кръв от инфектиран индивид) в общ обем от 220 microl (1 х PBS). Сместа се инкубира 1 h в микроямки при 37°С. След това сместа се прехвърля в блюда с покритие от NS3/4 и се инкубират в продължение на 1 h при 37°С. Блюдата се промиват и се изследват както следва.

microg с200 антиген се прибавя към 10 microl от проба PHV914-5 в общ обем от приблизително 220 microl. Сместа се инкубира в продължение на 1 h при 37°С и 200 microl се прехвърлят в блюдо с покритие от NS3/4 и се инкубира в продължение на 1 h при 37°С. Блюдата се промиват петкратно с 1 х PBS, 0,1% Tween-20. Прибавят се 200 microl разтвор на конюгат (описан по-горе), а блюдата се инкубират и се изследват. Контроли, които се състоят от

PHV914-5 и 1 х PBS (без антиген) също се обработват, както по-горе.

Резултатите са показани на таблица 7. Резултатите от процентното инхибиране, показани на фигура 4 са изчислени като колона 3 минус (колона 2 разделена на колона 3, умножено по 100). Както може да се види, данните показват, че NS34a се неутрализира чрез ранни сероконверсни антитела, а с200 не. Постига се силен сигнал, когато антителата в PHV914-5 сЗЗс член на панел на ранна сероконверсия реагира с блюдо с покритие от NS34a. с200 антигенът не се неутрализира от тези антитела. Това е показано в горния панел на таблица 7. Когато NS33a се смеси с PHV914-5 проба, то се неутрализира и поради това не присъстват антитела в пробата, за да реагират с NS34a, който покрива микроблюдото. Данните показват, че NS34a може да открие различен клас антитела, от тези, които се откриват чрез с200.

66205 Bl ug 0,037 1,677

0,5 ug 0,066 1,672

0,5 ug NA 1,524

ТАБЛИЦА 7

о	о
σι	σι	с	с
с	с	са	са
са	са

§ 8 8 +

ИЗСЛЕДВАНЕ HA СЪРЕВНОВАНИЕ ЗА ДА СЕ ПОКАЖЕ, ЧЕ NS34a АНТИГЕН ОТКРИВА РАЗЛИЧНИ АНТИТЕЛА В РАНЕН сЗЗс ПАНЕЛ НА СЕРОКОНВАРСИЯ В СРАВНЕНИЕ С с200 АНТИГЕН

66205 Bl

Пример 5

Изследване на стабилността на NS3/4a конформационен епитоп

За да се оцени ролята за стабилност на NS3/ 4а епитопа за провеждането на изследването, са осъществени следните изследвания, за да се определи имунореактивността на NS3/4a спрямо време при стайна температура. Малки аликвотни части от изходен NS3/4a се оставят да престоят при стайна температура, след което се замразяват на интервали, както е показано на таблица 8. Всички ампули едновременно се покриват и се тестват срещу два ранни NS3 сероконверсни панела.

Както се вижда от таблица 8, изходен NS3/ 4а не е стабилен и имунореактивността намалява с времето. Освен това е необходимо поддържа нето на конформацията на NS3/4a за имунореактивността.

Други изследвания на стабилността се провеждат както следва. Две конформационни моноклонални антитела, направени срещу NS3/ 4а, при използване на стандартни процедури се заместват с анти-HCV панела на ранни сероконверсии. Ампули с изходен NS3/4a се съхраняват при стайна температура на интервали от време 3,6 и 24 h. NS3/4a от замразените ампули се покриват при 90 ng/ml и се изследват при използване на гореописаната процедура. Резултатите подсказват, че двата моноклонала са действително конформационни и тяхната активност е чувствителна на обработване с изходния NS3/4a антиген при стайна температура. Реактивността на позитивната контрола моноклонално антитяло не се променя.

66205 Bl

контрола j

сравнение

s/co I

0,0

0,0 |

I

0,0

o o'

o o'

0,7

3,0

B

Ν Ώ

ζ

s/co

o o'

o o'

o o'

Т“ o’

CO o'

co o'

o’

o o'

o o'

o o'

o o'

o o'

o o'

*

I oo/s

o o'

o o'

o o

r o

CM o'

in o'

in o'

0*0

o o'

o o'

o o'

o o'

o o'

35,5

s/co

o o'

o o'

o o'

τ- Ο

co o'

co o'

o o'

o o'

o o'

o o'

o o’

o o’

0) CM

I

s/co

o o'

o o

o o'

T d

9*0

I

0,0

o o'

0,0

o o’

o o’

o o'

21,4

0

s/co

0,0

o o'

o'

0,2

N o'

I

I

0,0

o o'

0,0

0,0

0,0

o o’

co

Q

s/co

o o'

o o'

co o'

I

I

o

<

s/co

o o'

g

И0

I

I

o o'

o o'

o o'

in o'

I

I

Време

PHV 904-1

PHV 904-2

PHV 904-3

PHV 904-4

PHV 904-5

PHV 904-6

PHV 904-7

PHV 914-1

PHV 914-2

<?· Xf 4o > X CL

PHV 914-4

PHV 914-5

PHV 914-6

ТАБЛИЦА 8

66205 Bl

ί 1 j ΐ ί 1		ΐ		! ι j
0‘0	0,1			0,75
ί ο ο’	ο			1,75
0,0	τ- ο’			1,75 I
το	τΟ			1,88
το'	0,1	•		3,08
				4,14
1				8,75 i
PHV 914-7	PHV 914-8		Ензим	RFU/min

ТАБЛИЦА 8 (продължение;

66205 Bl

Пример 6

Имунореактивност на NS3/4a конформационен епитоп спрямо денатуриран NS3/4a

Имунореактивността на NS3/4a, който е денатуриран чрез SDS за препарата с NS3/4a конформационния епитоп до крайна концентрация 2%. Денатурираният№3/4аи конформационният NS3/4a се нанасят като покритие върху микротитърни блюда, както е описано по-горе. с200 антигенът (Hepatology (1992) 15:19-25, предлаган от ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey също се нанася като покритие върху микротитърните блюда. с200 антигенът се използва като контрола за сравнение, тъй като се предполага, да не е конформационен, поради присъствието на редуциращите средства (DTT) и детергенти (SDS) в неговия състав.

Имунореактивността се тества срещу два ранни НС V панела на сероконверсия, PHV 904 и PHV 914 (намиращи се на пазара проби от човешка кръв от Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, МА). Резултатите се показани натаб10 лица 9. Данните подсказват, че денатурираната и неутрализирана NS3/4a (както и с200) не открива панели на ранна сероконверсия, като ранен NS3/4a конформационен епитоп.

1------------------------------------------------------	NS3/4a спрямо денатуриран NS3/4a	—
	2 изходен NS3/4a *набодв2% SDS
		NS3/4a	dNS3/4a*	c200		NS3/4a	dNS3/4a*	c200
		OD	OD	OD		s/co	s/co	s/co
HCV	PHV 904-1	0,012	0,012 .	0,009		0,02	0,02	0,01
Сероконверсии	PHV 904-2	0,011	0,009 1	0,008		0,02	0,01	0,01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045		1,80	0,11	0,07
	PHV 904-4	2,401	0,273	0,129		3,85	0,44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347		4,85	1,28	0,58
	PHV 904-6	2,711	E472	0,774		4,35	2,37	1,28
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943		5,28	2,99	1,55
	PHV 914-1	0,006	0,004	0,001		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-2	0,005	0,004	0,002		0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098	0,003	0,001		0,16	0,00	0,00
	PHV 914-4	1,118	0,006	0,004		1,79	0,01	0,01
	PHV 914-5	2,035	0,044	0,022		3,26	0,07	0,04
	PHV 914-6	2,092	0,074	0,025		ЗД5	0,12	0,04
	PHV 914-7	2,519	0,281	0,132		4,04	0,45	0,22
	PHV 914-8	2,746	0,907	0,500		4,40	1Л6	0,82
	PHV 914-9	3,084	1,730	0,931		4,94	2,78	1,53
HCV 3.0	Негат. Контр.	0,023	0,024 ·	0,008
Контроли	Негат. Контр.	0,027	0,024	0,007
	Негат. Контр.	0.021	0.017	0,005
	Средно	0.024	0.022	0,007
	отрязан	0,624	0,622	0,607
	Поз. Контр.	1,239	0,903	0,575		1,99	1,45	0,95
	Поз. Контр.	1,445	0,916	0,614		2,32	1,47	1,01

Таблица 9

66205 Bl

Имунореактивността на конформационния епитоп също се тества при използване на моноклонални антитела 3aNS3/4a, изготвени при ползване на стандартни процедури. Тези моноклонални антитела се тестват след това в ELISA фор- 5 мат срещу NS3/4a и денатуриран NS3/4a и с200 антиген. Данните показват, че aHTH-NS3/4a моноклонали реагират с NS3/4a и денатуриран NS3/

4а по подобен начин, като сероконверсните панели, показани на таблица 10. Резултатите предоставят, също така, друго доказателство, че NS3/4a е конформационен в природата, както могат да се направят моноклоналните антитела, които са подобни по реактивност на ранни сЗЗс сероконверсни панели.

Таблица 10

Блюда

NS3/4a dNS3/4a с200

Момонклонал		OD	OD	OD
4В9/ЕЗ	1:100	1,820	0,616	0,369
	1:1000	1,397	0,380	0,246
	1:10000	0,864	0,173	0,070
	1:20000	0,607	0,116	0,085
5B7/D7	1:100	2,885	0,898	0,436
	1:1000	2,866	0,541	0,267
	1:10000	1,672	0,215	0,086
	1:20000	1,053	0,124	0,059
1А8/Н2	1:100	1,020	0,169	0,080
	1:1000	0,921	0,101	0,043
I	1:10000	0,653	0,037	0,013
	1:20000	0,337	0,027	0,011

В съответствие е описано ново изследване за откриване на HCV. От гореописаното ще се разбере, че въпреки че са описани в настоящото конкретни варианти за изпълнение на изобретението с цел за илюстриране, различни модификации могат да се направят, без да се отстраняваме от идеята на описаното в настоящото.

Claims (39)

1. Патентни претенции

   1. Твърда подложка за имуноизследване, включваща най-малкото едно анти-сърцевина ан- титяло на вируса на хепатит С (НС V) и най-малкото един изолиран HCVNS3/4a епитоп, свързан към него.
2. 2. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че включва най-малкото две анти-сърцевина антитела на HCV, свързани към него.
3. 3. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че посоченото най-малко едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу N-терминал50

   66205 Bl ната област на сърцевината на НС V антигена.
4. 4. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че посоченото най-малко едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 1053 на HCV, номерирани относително спрямо последователността на НС V1 полипротеина.
5. 5. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че посоченото най-малко едно анти-сърцевина антитяло е моноклонално антитяло.
6. 6. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че NS3/4a епитопът е конформационен епитоп и съдържа аминокиселинна последователност, посочена на фигури 2A-4D.
7. 7. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че включва освен това слят антиген с множествен епитоп, свързан към него.
8. 8. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че посоченият слят антиген с множествен епитоп включва аминокиселинна последователност, посочена на фигури 7A-7F.
9. 9. Твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални анти-сърцевина антитела за хепатит С вирус (HCV) и HCV NS3/ 4а конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4A-4D.
10. 10. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че посочените две моноклонални антисърцевина антитела са насочени срещу една Nтерминална област на HCV антигена на сърцевината.
11. 11. Твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че посочените две моноклонални антисърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 наНСУ, номерирани относително спрямо HCV1 последователността на полипротеина.
12. 12. Твърда подложка за имуноизследване, включваща две моноклонални анти-сърцевина антитела за хепатит С вирус (HCV), НС V NS3/4a конформационен епитоп, съдържащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 4A-4D, и слят антиген с множествен епитоп, съ държащ аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7A-7F, свързани към нея.
13. 13. Метод за откриване на хепатит С вирус (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че:

    (a) се предоставя твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 1;

    (b) се комбинира биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват HCV антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочения поне един анти-сърцевина антитяло и посочения NS3/4a епитоп, съответно;

    (c) се прибавя към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано антитяло, при което посоченото първо маркирано антитяло е маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различни HCV епитопи на сърцевината, отколкото свързано поне едното анти-сърцевина антитяло, свързано към твърдата подложка; (й) антиген, който влиза в реакция с НС V антитяло от биологичната проба, реактивоспособна с посочения NS3/4a епитоп; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с антигена от(й);

    (d) се откриват комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация заНСУ инфекция в биологичната проба.
14. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу Nтерминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло е насочено срещу Стерминална област на HCV антиген на сърцевината.
15. 15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 10-53 наНСУ, номерирани относително спрямо НС VI последователността на полипротеина и посоченото маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо HCV 1 последователнос

    66205 Bl тта на полипротеина.
16. 16. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че посоченият антиген, който влиза в реакция с НС V антитяло от биологичната проба съдържа епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеина.
17. 17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че сЗЗс епитопът е слят с аминокиселинна последователност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна последователност на hSOD.
18. 18. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че NS3/4a епитопът е конформационен епитоп и включва аминокиселинната последователност, отразена на фигури 4А4D.
19. 19. Метод за откриване на хепатит С вирус (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 2;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, съответно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен НС V епитоп на сърцевината, отколкото свързаното поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация заНСУ инфекция в биологичната проба.
20. 20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че посоченият NS3/4a епитоп е конформационен епитоп и съдържа аминокиселинната последователност посочена на фигури 4A-4D.
21. 21. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 9;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволява НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a конформационен епитоп, съответно;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен НС V епитоп на сърцевината, отколкото свързаните поне две анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
22. 22. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела, са насочени срещу Nтерминална област на HCV антигена на сърцевината и посоченото маркирано за откриване HCV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антигена на сърцевината.
23. 23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 наНСУ, номерирани относи

    66205 Bl телно спрямо HCV1 последователността на полипротеина и посоченото маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 на HCV, номерирани относително спрямо НС VI последователността на полипротеина.
24. 24. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 7;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, и посочения слят антиген с множествен епитоп;

    (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен HCV епитоп на сърцевината, отколкото поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) първи и втори антигени, влизащи в реакция с NS3/4a епитоп и посочения слят антиген с множествен епитоп, съответно; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с антигена от (ii);

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за НС V инфекция в биологичната проба.
25. 25. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу Nтерминална област на НС V антигена на сърцевината и посоченото първо маркирано за откриване НСV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на HCV антиген на сърцевината.
26. 26. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че посоченото поне едно анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 10-53 HaHCV, номерирани относи телно спрямо HCV 1 последователността на полипротеина и посоченото маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 HaHCV, номерирани относително спрямо HCV1 последователността на полипротеина.
27. 27. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият първи антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба съдържа епитоп от сЗЗс областта HaHCV полипротеина.
28. 28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че сЗЗс епитопът е слят с аминокиселинна последователност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна последователност на hSOD.
29. 29. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият втори антиген, който влиза в реакция с HCV антитяло от биологичната проба, включва епитоп от с22 областта HaHCV полипротеина.
30. 30. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че епитопът от с22 областта съдържа аминокиселини Lys₁₀flo Ser^ от HCV полипротеина, с делеция на Arg₄₇ и заместване на Leu с Тгр в позиция 44, номерирани относително спрямо НСVI последователността на полипротеина, при което посоченият епитоп е слят с аминокиселинна последователност на човешка супероксид дисмутаза (hSOD) и второто маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената аминокиселинна последователност на hSOD.
31. 31. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченият антиген с множествен епитоп съдържа аминокиселинната последователност, посочена на фигури 7A-4F.
32. 32. Метод за откриване на хепатит С вирусна (HCV) инфекция в биологична проба, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка за имуноизследване съгласно претенция 12;

    (b) комбинира се биологична проба с посочената твърда подложка при условия, които позволяват НС V антигени и антитела, когато присъстват в биологичната проба, да се свързват към посочените поне две анти-сърцевина антитела и посочения NS3/4a епитоп, съответно;

    66205 Bl (c) прибавя се към твърдата подложка от етап (Ь) при условия за образуване на комплекс (i) едно първо маркирано за откриване антитяло, при което посоченото първо маркирано за откриване антитяло е маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло, където посоченото маркирано анти-сърцевина антитяло е насочено срещу различен НСV епитоп на сърцевината, отколкото свързаното поне двете анти-сърцевина антитела, свързани към твърдата подложка; (ii) епитоп от сЗЗс областта на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност и епитоп от с22 областта на HCV полипротеина, слят към hSOD аминокиселинна последователност; и (iii) второ маркирано за откриване антитяло, при което посоченото второ маркирано за откриване антитяло е реактивоспособно с посочената hSOD аминокиселинна последователност;

    (d) откриват се комплекси, образувани между антителата и антигените, ако има такива, като индикация за HCV инфекция в биологичната проба.
33. 33. Метод съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела са насочени срещу N-терминална област на НС V антигена на сърцевината и посоченото първо маркирано за откриване НС V анти-сърцевина антитяло е насочено срещу С-терминална област на НС V антиген на сърцевината.
34. 34. Метод съгласно претенция 33, характеризиращ се с това, че посочените поне две анти-сърцевина антитела са насочени срещу аминокиселини 10-53 на HCV, номерирани относително спрямо НС VI последователността на полипротеина и посоченото маркирано за откриване НСV анти-сърцевина антитяло е насочено срещу аминокиселини 120-130 HaHCV, номерирани относително спрямо НСVI последователността на полипротеина.
35. 35. Метод съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че епитопът от с22 областта включва аминокиселини Lys₁₀ до Ser_w на НС V полипротеина, с делеция на Arg47 и заместване на Leu с Тгр в позиция 44, номерирани относително спрямо НСVI последователността на полипротеина.
36. 36. Комплект за имунодиагностичен тест, включващ твърдата подложка за имуноизследване съгласно която и да е претенция от 1 до 12, и инструкции за провеждане на имунодиагностичен тест.
37. 37. Метод за получаване на твърда подложка за имуноизследване, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка; и (b) свързва се поне едно анти-сърцевина антитяло за хепатит С вирус (НС V) и поне един изолиран HCV NS3/4a конформационен негов епитоп.
38. 38. Метод за получаване на твърда подложка за имуноизследване, характеризиращ се с това, че методът включва:

    (a) предоставя се твърда подложка; и (b) свързват се две анти-сърцевина антитела за хепатит С вирус (HCV) и един изолиран НС V NS3/4a конформационен негов епитоп.
39. 39. Метод съгласно която и да е претенция от 37 и 38, характеризиращ се с това, че се свързва поне един слят антиген с множествен епитоп към твърдата подложка.