SK17772002A3 - Kombinačné stanovenie HCV antigén/protilátka - Google Patents
Kombinačné stanovenie HCV antigén/protilátka Download PDFInfo
- Publication number
- SK17772002A3 SK17772002A3 SK1777-2002A SK17772002A SK17772002A3 SK 17772002 A3 SK17772002 A3 SK 17772002A3 SK 17772002 A SK17772002 A SK 17772002A SK 17772002 A3 SK17772002 A3 SK 17772002A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hcv
- antibody
- epitope
- core
- antigen
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 201
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 200
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 200
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 57
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 94
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 52
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 204
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 97
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 84
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 59
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 124
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 80
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 55
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 102200076914 rs104893959 Human genes 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 2
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102100038388 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- ZZOXHLNZOZHWJS-LNTAAPBVSA-N 1-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-6,7-dimethoxyisoquinoline;[(8r,9s,10r,13s,14s)-10,13-dimethyl-17-oxo-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] hydrogen sulfate Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CC1=NC=CC2=CC(OC)=C(OC)C=C12.C1C(OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 ZZOXHLNZOZHWJS-LNTAAPBVSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101150031523 4a gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000928106 Alain Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000222128 Candida maltosa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N D-Asparagine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229930182846 D-asparagine Natural products 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101100289061 Drosophila melanogaster lili gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101150038760 Ns3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 229920000265 Polyparaphenylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate group Chemical group C(C=C)(=O)[O-] NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005844 autocatalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- AYGYHGXUJBFUJU-UHFFFAOYSA-N n-[2-(prop-2-enoylamino)ethyl]prop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NCCNC(=O)C=C AYGYHGXUJBFUJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000015 polydiacetylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
SK 1777-2002 A3
KOMBINAČNÉ STANOVENIE HCV ANTIGÉN/PROTILÁTKA
Oblasť techniky
Tento vynález sa všeobecne týka vírusovej diagnostiky. Konkrétne sa tento vynález týka kombinačného stanovenia antigén/protilátka na presnú diagnózu infekcií vírusom hepatitídy C.
Doterajší stav techniky
Vírus hepatitídy C (HCV) je zásadnou príčinou parenterálnej hepatitídy iného typu ako A a B (NANBH), ktorá sa väčšinou prenáša transfúziou krvi a pohlavným stykom. Tento vírus je prítomný u 0,4 až 2,0 % darcov krvi. Chronická hepatitída sa rozvinie zhruba u 50 % infekcii a zhruba u 20 % infikovaných osôb sa vyvinie cirhóza, ktorá niekedy vedie k hepatocelulárnemu karcinómu. Preto má štúdium a kontrola tejto choroby lekársky význam.
Houghten a kol. ako prví identifikovali a charakterizovali HCV ako príčinu NANBH. Vírusová genómová sekvencia HCV je známa a k dispozícii sú taktiež spôsoby zistenia tejto sekvencie. Pozri napríklad Medzinárodné publikácie č. WO 89/04669, WO 90/11089 a WO 90/14436. HCV má genóm jednovláknovej RNA 9,5 kb v kladnom smere a patrí do skupiny vírusov Flaviridae. Bolo identifikovaných aspoň šesť rozlíšených, avšak príbuzných genotypov HCV na základe fylogenetických analýz [Simmonds a kol., J. Gen. Virol., 74, 2391-2399 (1993)]. Vírus kóduje jednotlivý polyproteín majúci viac ako 3000 aminokyselinových zvyškov [Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), Han a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1711-1715 (1991)]. Polyproteín sa spracováva kotranslačne a posttranslačne na štruktúrne a neštruktúrne (NS) proteíny.
048/B
Konkrétne, ako ukazuje obrázok 1, sa niekoľko proteinov kóduje HCV genómom. Poradie a nomenklatúra produktov štiepenia HCV polyproteínu je nasledujúce: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH.
Počiatočné štiepenie polyproteínu sa katalyzuje proteázami hostiteľa, ktoré uvoľňujú tri štruktúrne proteíny, N-terminálny nukleokapsidový proteín (zvaný “jadro”) a glykoproteíny obálky, Έ1 (tiež známe ako E) a Έ2” (tiež známe ako E2/NS1), rovnako ako neštruktúrne (NS) proteíny obsahujúce vírusové enzýmy. Oblasti NS sa nazývajú NS2, NS3, NS4 a NS5. NS2 je proteín integrálnej membrány s proteolytickou aktivitou. NS2, buď samotný alebo v kombinácii s NS3, štiepi väzbu NS2, NS3, čím sa ďalej tvorí koniec N NS3 a uvoľňuje sa veľký polyproteín, ktorý zahŕňa aktivity serínproteázy a RNA helikázy. NS3 proteáza slúži na spracovanie zvyšného polyproteínu. Dokončenie zrenia polyproteínu začína autokatalyktickým štiepením spojenia NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serín proteázou. Nasledujúce štiepenia HCV polyproteínu sprostredkované NS3 zahrňujú rozpoznanie miest štiepenia polyproteínu molekulou NS3 iného polypeptidu. V týchto reakciách uvoľňuje NS3 kofaktor NS3 (NS4a), dva proteíny (NS4b a NS5a) a RNA-dependentnú RNA polymerázu (NS5b).
Opisuje sa rad všeobecných a špecifických polypeptidov použiteľných ako imunologické a diagnostické prostriedky pre HCV odvodené z HCV polyproteínu. Pozri napríklad Houghton a kol., európska publikácia č. 318 216 a 388 232, Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Houghton a koľ, Hepatology, 14, 381-388 (1991), Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778. Tieto publikácie poskytujú rozsiahly základ pojednávajúci všeobecne o HCV rovnako tak ako o príprave a použití HCV polypeptidových imunologických reakčných prostriedkov.
048/B
Citlivé a špecifické spôsoby pre skríning a identifikáciu nosičov HCV a HCV kontaminovanej krvi, či krvných produktov by poskytli dôležitý pokrok v lekárstve. Posttransfúzna hepatitída (PHT) sa vyskytuje zhruba u 10 % pacientov po transfúzii a HCV zodpovedá za 90 % týchto prípadov. Starostlivosť o pacientov rovnako tak aj o prevenciu prenosu HCV krvou a krvnými produktmi alebo tesným osobným kontaktom vyžaduje diagnostické a prognostické prostriedky. Existuje niekoľko spôsobov rozboru pre sérodiagnózu infekcie HCV. Pozri napríklad Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989), Kuo a kol., Science, 244, 362-364 (1989), Choo a koľ, Br. Med. Bull., 46, 423-441 (1990), Ebeling a kol., Lancet, 335, 982-983 (1990), van der Poel a kol., Lancet, 335, 558-560 (1990), van der Poel a koľ, Lancet, 337, 317-319 (1991), D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778, Valenzuela a kol., medzinárodná publikácia č. WO 97/44469 a Kashiwakuma a kol,, US patent č. 5 871 904.
Značným problémom pri rozboroch založených na krvnom sére je dlhý interval medzi infekciou a detekciou vírusu, ktorý často prekračuje 80 d. Tento interval môže predstavovať pre príjemcu krvnej transfúzie značné riziko. Na prekonanie tohto problému slúžia vypracované testy založené na nukleových kyselinách (NAT) detekujúce priamo vírusovú ribonukleovú kyselinu a testy antigénu jadra HCV, ktoré stanovujú vírusový antigén namiesto protilátkovej odpovede. Pozri napríklad Kashiwakuma a kol., US patent č. 5 871 904, Beld a kol., Transfusion, 40, 575 - 579 (2000).
Ostáva však potreba citlivého diagnostického a prognostického spôsobu zaisťujúceho adekvátnu starostlivosť o pacienta rovnako tak ako prevenciu prenosu HCV krvou a krvnými produktmi alebo tesným osobným kontaktom.
048/B
Podstata vynálezu
Tento vynález sa čiastočne zakladá na zistení, že protilátky sérokonverzie HCV sú zvyčajne protilátkami proti jadru a proti NS3 (helikáza). V súlade s tým tento vynález poskytuje kombinačný rozbor antigénu jadra HCV a protilátky NS3 detekujúcej antigény HCV aj protilátky prítomné vo vzorke s použitím jedného tuhého nosiča.
Preto sa v jednom svojom uskutočnení tento vynález zameriava na pevný nosič pre imunoesej obsahujúci aspoň jednu protilátku proti jadru HCV a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a pripojený k tomuto nosiču. Protilátka a epitop NS3/4a môže byť ktorákoľvek z molekúl, ktoré sa tu opisujú. Navyše môže pevný nosič zahŕňať ktorýkoľvek z antigénov získaných spojením viacerých epitopov, ktoré sa tu opisujú, ako je antigén získaný spojením viacerých epitopov zahrňujúcich aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
V určitých uskutočneniach sú na pevný nosič pripojené aspoň dve protilátky proti jadru. Ďalej môže byť protilátkou proti jadru monoklonálna protilátka. Navyše môže byť epitop NS3/4a a konformačný epitop, ako je konformačný epitop NS3/4a zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu zobrazenú na obrázkoch 4A až 4D.
V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na pevný nosič pre imunoesej, ku ktorému sa pripájajú aspoň dve monoklonálne protilátky proti jadru HCV a aspoň jeden konformačný epitop NS3/4a HCV s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázkoch 4A až 4D.
V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej, ako sa opisuje vyššie, (b) kombináciu biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok, ktoré umožnia antigénom HCV a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, väzbu na aspoň jednu protilátku proti jadru respektíve epitopu NS3/4a, (c) pridanie pevného nosiča z
048/B kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru je zameraná proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s antigénom (ii) a (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke. Epitop NS3/4a môže byť konformačným epitopom, ako je konformačný epitop majúci sekvenciu NS3/4a znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) poskytnutie pevného nosiča pre imunoesej s aspoň dvoma protilátkami proti jadru HCV pripojenými na tento nosič, ako sa opisuje vyššie, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok umožňujúcich antigénom HCV a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, väzbu na aspoň dve protilátky proti jadru respektíve epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD a (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami s antigénmi, ak sú prítomné, indikujúce infekciu HCV v biologickej vzorke. Epitop NS3/4a môže byť konformačným epitopom, ako je konformačný epitop majúci sekvenciu NS3/4a znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
048/B
V ktoromkoľvek z vyššie opísaných uskutočnení môže byť protilátka proti jadru zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako napríklad proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, a/alebo môže byť detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako sú aminokyseliny 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1. Navyše môže byť antigén reagujúci s protilátkou HCV biologickej vzorky z oblasti NS3, ako je epitop c33c oblasti HCV polyproteínu a môže byť spojený s ľudskou aminokyselinovou sekvenciou superoxid dismutázy (hSOD). V tomto uskutočnení je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu je spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje vrátane monoklonálnych protilátok proti jadru HCV a konformačného epitopu zahrňujúceho aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok umožňujúcich väzbu HCV antigénu a protilátok, pokiaľ sa vyskytujú vo vzorke, s aspoň dvoma protilátkami proti jadru a konformačným epitopom NS3/4a, pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s opísanou aminokyselinovou sekvenciou hSOD, a detekciu komplexov medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, indikujúcu infekciu HCV v biologickej vzorke.
V určitých uskutočneniach sú aspoň dve protilátky proti jadru zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako je oblasť aminokyselín 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteín HCV1 a detegovateľne značená
048/B protilátka proti jadru HCV je zameraná proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako je oblasť aminokyselín 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke. Tento spôsob zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej zahrňujúceho antigén získaný spojením viacerých epitopov, (b) kombináciu biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich väzbu HCV antigénu a protilátok, ak sú v biologickej vzorke, s aspoň jednou protilátkou proti jadru, epitopom NS3/4a a antigénom získaným spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde touto prvou detegovateľne značenou protilátkou je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde značená protilátka proti jadru je zameraná proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) prvého a druhého antigénu reagujúceho s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a antigénom získaným spojením viacerých epitopov a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s antigénmi (ii), (d) detekciu komplexov tvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú vo vzorke, indikujúce infekciu HCV biologickej vzorky.
Protilátka proti jadru sa môže zameriavať proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa môže zameriavať proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako sa opisuje vyššie. Ďalej môže prvý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahovať epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV a môže byť spojený s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. V tejto súvislosti je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Navyše druhý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky môže obsahovať epitop z oblasti c22 polyproteínu HCV, ako je epitop obsahujúci aminokyseliny Lys10 až Sergg polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
048/B
Tento epitop môže byť spojený s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Ak je tomu tak, je druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD. Antigén získaný spojením viacerých epitopov môže obsahovať aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
V ďalšom uskutočnení sa tento vynález zameriava na spôsob detekcie infekcie HCV v biologickej vzorke, ktorý zahŕňa (a) zaistenie pevného nosiča pre imunoesej obsahujúceho dve monoklonálne protilátky proti jadru HCV, konformačný epitop HCV NS3/4a obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén získaný spojením viacerých epitopov obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F, ktoré sa k nemu pripájajú, (b) kombináciu biologickej vzorky s pevným nosičom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu HCV antigénov a protilátok, ak sú v biologickej vzorke, s aspoň dvoma protilátkami proti jadru, s konformačným epitopom NS3/4a respektíve antigénom s viacpočetným spojením epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču v kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde sa značená protilátka proti jadru zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako posledné dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde táto druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s aminokyseiinovými sekvenciami hSOD, (d) detekciu komplexov tvorených medzi protilátkami a antigénmi, ak sú prítomné, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
V tomto uskutočnení sa aspoň dve protilátky proti jadru môžu zameriavať proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteín HCV1, a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa zameriava proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV, ako proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na
048/B sekvenciu polyproteínu HCV1. Navyše môže epitop z oblasti c22 obsahovať aminokyseliny Lys10 až Serg9 polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1.
V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na imunodiagnostické súpravy obsahujúce pevný nosič pre imunoeseje opísaný vyššie a inštrukcie na uskutočňovanie imunodiagnostického testu.
V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na spôsoby prípravy pevného nosiča pre imunoesej zahrňujúcu (a) zaistenie pevného nosiča a (b) väzbu aspoň jednej protilátky proti jadru HCV, ako je jedna, dve alebo viacej protilátok a aspoň jedného izolovaného pripojeného epitopu HCV NS3/4a a prípadne antigénu získaného spojením viacerých epitopov. Protilátky proti jadru, epitopy NS3/4a a antigény s viacpočetným spojením epitopov sú podľa opisu uvedeného vyššie.
V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na antigén s viacpočetným spojením epitopov zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F alebo aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 80 % sekvenčnou identitou, ako je 90 % alebo vyššia sekvenčná identita reagujúci špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke z jednotlivca infikovaného HCV. V určitých uskutočneniach sa antigén s viacpočetným pripojením epitopu skladá z aminokyselinovej sekvencie opísanej na obrázkoch 5A až 5F.
V ďalších uskutočneniach sa tento vynález zameriava na polynukleotid zahrňujúci kódovaciu sekvenciu pré antigén s viacpočetným spojením epitopov uvedených vyššie, rekombinantné vektory zahrňujúce polynukleotidy, hostiteľské bunky transformované rekombinantnými vektormi a spôsoby tvorby rekombinantného antigénu s viacpočetným spojením epitopov zahrňujúci; (a) zaistenie populácie hostiteľských buniek, ako sa opisuje vyššie, a (b) pestovanie populácie buniek za podmienok, pri ktorých sa exprimuje antigén obsahujúci spojenie viacerých epitopov kódovanou sekvenciou prítomnou v rekombinantnom vektore.
048/B
Tieto a ďalšie aspekty tohto vynálezu budú zrejmé pri odkaze na nasledujúci podrobný opis a pripojené výkresy.
Prehľad obrázkov na výkresoch i ·
Obrázok 1 je diagram znázorňujúci HCV genóm s rôznymi oblasťami polyproteínu, od ktorých sa odvodzujú reakčné zložky eseje (proteíny a protilátky).
Obrázok 2 je schematický výkres reprezentatívnej kombinačnej eseje protilátka/antigén podľa tohto vynálezu.
Obrázok 3 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu reprezentatívneho NS3/4a konformačného antigénu na použitie v týchto esejách. Zvýraznený alanín v polohe 182 nahrádza natívny serín, ktorý sa normálne vyskytuje v tejto polohe.
Obrázky 4A až 4D znázorňujú deoxyribonukleovú kyselinu a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu ďalšieho reprezentatívneho NS3/4a konformačného antigénu na použitie v týchto esejách. Aminokyseliny v polohách 403 a 404 obrázkov 4A až 4D predstavujú substitúcie Pro namiesto Thr a lle namiesto Ser natívnej aminokyselinovej sekvencie HCV-1.
Obrázok 5 je diagram konštrukcie pd.HCV1a.ns3ns4aPI.
Obrázok 6 je diagram znázorňujúci MEFA 12.
Obrázky 7A až 7F znázorňujú deoxyribonukleovú kyselinu a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu MEFA.
Obrázok 8 je schematický výkres reprezentatívnej imunoeseje podľa tohto vynálezu s použitím MEFA 12.
048/B
Nasleduje podrobný opis vynálezu.
Prax tohto vynálezu sa používa, pokiaľ sa neopisuje inak, konvenčné spôsoby chémie, biochémie, spôsoby s rekombinantnou deoxyribonukleovou kyselinou a spôsoby imunológie v rámci súčasnej znalosti odboru. Tieto spôsoby sa úplne vysvetľujú v literatúre. Pozri napríklad Fundamental Virology,
2. vydanie, diel I & II (B. B. Fields a D. M. Knipe, red.), Handbook of Experimental Immunology, diely I až IV (D. M. Weir a C. C. Blackwell, red., Blackwell Scientific Publications), T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. vydanie, 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan, red., Academic Press, Inc.).
Je potrebné poznamenať, že v tomto opise a pripojených nárokoch zahŕňajú singulárne formy odkazy na množné číslo, ak zrejme obsah neurčuje inak. Takže napríklad odkaz na “antigén” zahŕňa zmes dvoch alebo viacerých antigénov a podobne.
V celom texte sa používajú nasledujúce skratky aminokyselín.
Alanín: Ala (A) | Arginín: Arg (R) |
Asparagín: Asn (N) | Kyselina aspargová: Asp (D) |
Cysteín: Cys (C) | Glutamín: Gin (Q) |
Kyselina glutámová: Glu (E) | Glycín: Gly (G) |
Histidín: His (H) | Izoleucin: lle (I) |
Leucín: Leu (L) | Lyzín: Lys (K) |
Metionín: Met (M) | Fenylalanin: Phe (F) |
Prolín: Pro (P) | Serín: Ser (S) |
Treonín: Thr (T) | Tryptofán: Trp (W) |
Tyrozin: Tyr (Y) | Valín: Val (V) |
048/B
I. Definície
Pri opise tohto vynálezu sa používajú nasledujúce pojmy, ktorých význam je podľa definície opísanej nižšie.
Pojmy “polypeptid” a “proteín” sa vzťahujú k polyméru aminokyselinových zvyškov a nie sú obmedzené minimálnou dĺžkou produktu. Peptidy, oligopeptidy, diméry, multiméry a podobne sa zahŕňajú do tejto definície. Definícia zahŕňa proteíny plnej dĺžky aj fragmenty. Tieto pojmy taktiež zahŕňajú postexpresné modifikácie polypeptidu, napríklad glykozyláciu, acetyláciu, fosforyláciu a podobne. Ďalej sa pre účely tohto vynálezu pojem “polypeptid” vzťahuje na proteín zahrňujúci modifikácie, ako sú delécia, adícia a substitúcia (všeobecne konzervatívne svojou povahou) natívnej sekvencie, ak proteín zachováva požadovanú aktivitu. Tieto modifikácie môžu byť úmyselné, ako je tomu prostredníctvom mutagenézy smerovanej na miesto, alebo môžu byť náhodné, ako je tomu prostredníctvom mutácií hostiteľa poskytujúcich proteíny, alebo chyby následkom amplifikácie PCR.
Polypeptid HCV je polypeptid, ako sa definuje vyššie, odvodený od polyproteínu HCV. Tento polypeptid nemusí byť fyzicky odvodený od HCV, avšak môže byť vytvorený synteticky alebo rekombinantne. Navyše tento polypeptid môže byť odvodený od ktoréhokoľvek z kmeňov HCV, ako sú kmene 1, 2, 3 alebo 4. Je známe množstvo zachovaných a premenných oblastí medzi týmito kmeňmi a všeobecne aminokyselinové sekvencie epitopov odvodené od týchto oblastí budú mať vysoký stupeň sekvenčnej homológie, to jest homológiu aminokyselinovej sekvencie viac ako 30 %, prednostne viac ako 40 % pri zoradení sekvencií. Pojem “NS3/4” polypeptid sa teda vzťahuje na natívny NS3/4a z ktoréhokoľvek z rôznych kmeňov HCV rovnako ako na analógy NS3/4a, muteíny a imunogénne fragmenty, ako sa definujú nižšie. Sú známe úplné genotypy mnohých z týchto kmeňov. Pozri napríklad US patent č. 6 150 087 a GenBank Accession č. AJ238800 a AJ238799.
048/B
Pojmy “analóg” a “muteín” sa týkajú biologicky aktívnych derivátov referenčnej molekuly alebo fragmentov týchto derivátov, ktoré zachovávajú požadovanú aktivitu, ako je imunoreaktivita v esejách, ktoré sa tu opisujú. Všeobecne sa pojem “analóg” týka zlúčenín majúcich natívnu polypeptidovú sekvenciu a štruktúru s adíciou jednej alebo viacerých aminokyselín, substitúciami (všeobecne svojou povahou konzervatívnymi) a/alebo deléciami oproti natívnej molekule, ak tieto modifikácie neničia imunogénnu aktivitu. Pojem “muteín” sa týka peptidov majúcich jedno alebo viac peptidových mimetík (“peptoidov’j, ako sa opisujú v medzinárodnej publikácii č. WO 91/04282. Prednostne má analóg alebo muteín aspoň rovnakú imunoaktivitu ako natívna molekula. Spôsoby prípravy polypeptidových analógov a muteínov sú známe v odbore a opisujú sa dalej nižšie.
Obzvlášť preferované analógy zahŕňajú substitúcie, ktoré sú svojou povahou konzervatívne, to jest také substitúcie, ktoré nastávajú v skupine aminokyselín príbuzných vo svojich vedľajších reťazcoch. Konkrétne sa aminokyseliny delia do 4 skupín: (1) kyslé - aspartát a glutamát, (2) bázické lyzín, arginín, histidín, (3) nepoláme - alanín, valín, leucín, izoleucin, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán a (4) polárne bez náboja - glycín, asparagín, glutamín, cysteín, serín, treonín, tyrozín. Fenylalanín, tryptofán a tyrozín sa niekedy klasifikujú ako aromatické aminokyseliny. Napríklad sa dá rozumne predvídať, že izolovaná náhrada leucínu izoleucínom alebo valínom, aspartátu glutamátom, treonínu serínom alebo podobná konzervatívna náhrada aminokyseliny štruktúrne príbuznou aminokyselinou nebude mať veľký účinok na biologickú aktivitu. Napríklad môže daný polypeptid zahŕňať až zhruba 5 až 10 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo dokonca až zhruba 15 až 25 konzervatívnych alebo nekonzervatívnych aminokyselinových substitúcií alebo akékoľvek celé číslo medzi 5 až 25, ak pozostáva požadovaná funkcia molekuly neporušená. Ten, kto má skúsenosti v odbore, môže ľahko určiť oblasti danej molekuly, ktoré môžu tolerovať zmenu s odkazom na grafy Hopp/-Woods a Kyte-Doolittle dobre známe v odbore.
048/B “Fragmentom” sa rozumie polypeptid skladajúci sa iba z časti intaktnej polypeptidovej sekvencie a štruktúry plnej dĺžky. Fragment môže zahŕňať Cterminálnu deléciu a/alebo N-terminálnu deléciu natívneho polypeptidu. “Imunogénny fragment” daného proteínu HCV bude všeobecne zahŕňať aspoň 5 až 10 súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou, prednostne aspoň zhruba 15 až 25 súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou a najprednostnejšie aspoň zhruba 20 až 50 alebo viac súvisiacich aminokyselinových zvyškov molekuly s plnou dĺžkou, ktoré definujú epitop, alebo akýkoľvek počet medzi 5 aminokyselinami a sekvenciu s plnou dĺžkou s podmienkou, že daný fragment zachováva imunoreaktivitu v esejách, ktoré sa tu opisujú. Preferované imunogénne fragmenty napríklad zahŕňajú, avšak bez obmedzenia, fragmenty jadra HCV obsahujúce napríklad aminokyseliny 10 až 45, 10 až 53, 67 až 88 a 120 až 130 polyproteínu, epitop 5-1-1 (v oblasti NS3 vírusového genómu) rovnako tak ako epitopy odvodené od oblastí E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3/4a a NS5 polyproteínu HCV, rovnako tak ako ktorýkoľvek z ďalších epitopov identifikovaných z polyproteínu HCV. Pozri napríklad Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1001110015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, Chien, D. Y., medzinárodná publikácia č. WO 94/01778, US patent č. 6 150 087 a 6 121 020.
Pojem “epitop”, ako sa tu používa, sa týka sekvencie aspoň zhruba 3 až 5 prednostne zhruba 5 až 10 či 15 a nie viac ako zhruba 1000 aminokyselín (alebo sekvencia s akýmkoľvek počtom medzi týmito hodnotami), ktorá definuje sekvenciu, ktorá je sama časťou väčšej sekvencie a viaže sa na protilátku vytvorenú na základe odpovede na túto sekvenciu. Neexistuje žiadna kritická horná medza pre dĺžku fragmentu, ktorá môže obsahovať proteínovú sekvenciu takmer plnej dĺžky alebo dokonca spojený proteín zahrňujúci dva alebo viac epitopov polyproteínu HCV. Epitop používaný v rámci tohto vynálezu sa neobmedzuje na polypeptid majúci presnú sekvenciu časti materského proteínu, z ktorého sa odvodzuje. Vírusové genómy sú skutočne v stave konštantného toku a obsahujú niekoľko premenných domén vykazujúcich relatívne vysoké stupne variability medzi izolovanými časťami. Preto pojem
048/B epitop zahŕňa sekvencie identické s natívnou sekvenciou rovnako tak ako modifikácie natívnej sekvencie, ako sú delécia, adícia a substitúcia (všeobecne svojou povahou konzervatívne).
Oblasti daného polypeptidu zahrňujúce epitop sa dajú identifikovať s použitím množstva spôsobov mapovania epitopov dobre známych v odbore, Pozri napríklad Epitop Mapping Protocols v monografii Methods in Molecular Biology, diel 66 (Glenn E. Morris, redakcia, 1996) Human Press, Totowa, New Jersey. Napríklad lineárne epitopy sa dajú stanoviť súčasnou prípravou veľkého počtu peptidov na pevných nosičoch, kde peptidy zodpovedajú častiam molekuly proteínu, a reakciou peptidu s protilátkami, pri ktorej peptidy zostávajú pripojené na nosiče. Tieto spôsoby sú známe v odbore a opisujú sa napríklad v US patente č. 4 708 871, Geysen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 39984002 (1984), Geysen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 172-182 (1985), Geysen a kol., Molec. Immunol., 23, 709-715 (1986).
S použitím týchto spôsobov sa identifikuje množstvo epitopov HCV. Pozri napríklad Chien a kol., Viral Hepatitis and Liver Disease, str. 320-324 (1994) a ďalšie nižšie. Podobne sa ľahko identifikujú konformačné epitopy stanovením priestorovej konformácie aminokyselín, napríklad róntgenovou kryštalografiou a dvojrozmernou nukleárnou magnetickou rezonanciou. Pozri napríklad Epitope Mapping Protocols, vyššie. Antigénne oblasti proteinov sa dajú taktiež identifikovať s použitím štandardných vynesení antigénneho pôsobenia a hydropatie, ako sú výpočty s použitím napríklad programového vybavenia Omiga verzia 1.0 od Oxford Molecular Group. Tento počítačový program používa spôsob Hopp/Woods, Hopp a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981) na stanovenie antigénneho pôsobenia a spôsob Kyte-Doolittle, Kyte a kol., J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982) pre vynesenie hydropatie.
Pojem “konformačný epitop”, ako sa tu používa, sa týka časti proteínu s plnou dĺžkou alebo analógu alebo muteinu tohto proteínu majúceho štruktúrne vlastnosti natívne ako aminokyselinová sekvencia kódujúca epitop v rámci prirodzeného proteínu s plnou dĺžkou. Natívne štruktúrne vlastnosti zahŕňajú,
048/B avšak bez obmedzenia, glykozyláciu a trojrozmernú štruktúru. Dĺžka epitopu definujúca sekvenciu môže byť predmetom širokých zmien, pretože sa uvažuje, že tieto epitopy sa vytvárajú trojrozmerným tvarom antigénu (napríklad skladaním). Preto stačí relatívne málo aminokyselín na definíciu epitopu, avšak sú široko rozptýlené pozdĺž dĺžky molekuly (alebo dokonca rôznych molekulách v prípade dimérov, atď.) s tvorbou správnej konformácie epitopu skladaním. Časti antigénu medzi zvyškami definujúcimi epitop nemusia byť pre konformačnú štruktúru epitopu kritické. Napríklad delécia alebo substitúcia týchto zasahujúcich sekvencií nemusí ovplyvňovať konformačný epitop s podmienkou, že sekvencie kritické pre konformáciu epitopu sú zachované (napríklad cysteíny zúčastňujúce sa disulfidových väzieb, miesta glykozylácie atď.).
Konformačné epitopy prítomné v oblasti NS3/4a sa ľahko identifikujú s použitím vyššie diskutovaných spôsobov. Navyše prítomnosť alebo neprítomnosť konformačného epitopu v danom polypeptide sa dá ľahko stanoviť skríningom antigénu protilátkou (polyklonálnym sérom alebo monoklonálnym voči konformačnému epitopu) a porovnaním reaktivity s prípadom denaturovanej verzie antigénu, ktorá zachováva najvyššie lineárne epitopy. Pri takomto skríningu s použitím polyklonálnych protilátok môže byť výhodné absorbovať polyklonálne sérum najprv denaturovaným antigénom a pozorovať, či zadržiava protilátky proti danému antigénu. Navyše v prípade NS3/4a molekula zachovávajúca natívnu konformáciu bude mať taktiež proteázové a prípadne aj helikázové enzymatické aktivity. Tieto aktivity sa dajú detegovať s použitím enzymatických analýz, ako sa ďalej opisujú nižšie.
Prednostne sa konformačný epitop tvorí rekombinantne a exprimuje sa v bunke, z ktorej sa dá odstrániť za podmienok zachovávajúcich jeho požadované štruktúrne funkcie, napríklad bez denaturácie epitopu. Tieto bunky zahŕňajú baktérie, kvasinky, bunky hmyzu a cicavcov. Expresia a izolácia rekombinantných konformačných epitopov z polyproteínu HCV sa opisuje napríklad v medzinárodnej publikácii č. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternatívne sa dajú exprimovať antigény a ďalej
048/B denaturovať proteín po jeho získaní. Uvažuje sa, že chemická syntéza môže taktiež poskytnúť konformačné antigénové mimitopy vykazujúce skríženú reakciu s “natívnym konformačným epitopom antigénu.
Pojem “viacpočetný epitopový spojený antigén” alebo “MEFA”, ako sa tu používa, znamená polypeptid, v ktorom tvorí viac HCV antigénov časť jedného spojitého reťazca aminokyselín, ktorý sa v prírode nevyskytuje. HCV antigény sa dajú spájať priamo navzájom peptidovými väzbami alebo sa dajú oddeľovať vloženými sekvenciami aminokyselín. Spojené antigény môžu taktiež obsahovať sekvencie exogénne voči HCV polyproteínu. Navyše môžu prítomné HCV sekvencie vznikať z viacerých genotypov a/alebo izolovaných časti HCV. Príklady konkrétnych MEFA na použitie v imunoesejách podľa tohto vynálezu sa podrobne opisujú napríklad v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469 a ďalej sa opisujú nižšie.
Pojem “protilátka znamená molekulu, ktorá sa chemicky alebo fyzikálne viaže na daný polypeptid. Preto je protilátka jadra HCV molekula, ktorá sa špecificky viaže na proteín jadra HCV. Pojem “protilátka, ako sa tu používa, zahrňuje protilátky získané z polyklonálnych aj monoklonálnych prípravkov, rovnako tak ako hybridné (chimérické) protilátkové molekuly (pozri napríklad Winter a kol., Náture, 349, 293-299 (1991) a US patent č. 4 816 567, F (ab')2 a F(ab) fragmenty, molekuly Fv (nekovalentné heterodiméry, pozri napríklad Inbar a kol., Proc Natl Acad Sci USA, 69, 2659-2662 a Ehrich a koľ, Biochem., 19, 4091-4096 (1980), molekuly Fv s jedným reťazcom (sFv) (pozri napríklad Huston a kol., Proc Natl Acad Sci 85, 5879-5883 (1988), dimérne a trimérne konštrukty protilátkových fragmentov, miniprotilátky (pozri napríklad Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992), Cumber a kol., J. Immunology, 149B, 120126 (1992), humanizované protilátkové molekuly (pozri napríklad Riechmann a kol., Náture, 332, 323-327 (1988), Verhoeyan a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988) a patentovú publikáciu UK, č. GB 2 276 169, publikovanú 21. septembra 1994) a akékoľvek funkčné fragmenty získané z týchto molekúl, kde tieto fragmenty zachovávajú imunologické väzbové vlastnosti materskej protilátkovej molekuly.
048/B
Pojem “monoklonálna protilátka” sa týka protilátkového zloženia majúceho homogénnu populáciu protilátok. Tento termín sa neobmedzuje na druh alebo zdroj protilátky ani sa neobmedzuje spôsobom, ktorým vzniká. Preto tento termín zahŕňa protilátky získané z myších hybridómov rovnako ako ľudské monoklonálne protilátky získané s použitím skôr ľudských ako myších hybridómov. Pozri napríklad Cote a kol., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, str. 77.
“Rekombinantnný” proteín je proteín, ktorý zachováva svoju požadovanú aktivitu a ktorý bol pripravený technikami rekombinantnej deoxyribonukleovej kyseliny, ako sa tu opisuje. Všeobecne sa daný gén klonuje a potom sa exprimuje v transformovaných organizmoch, ako sa ďalej opisuje nižšie. Hostiteľský organizmus exprimuje cudzí gén za získania proteínu za podmienok expresie.
Pojem “izolovaný” vo vzťahu k polypeptidu znamená, že je daná molekula oddelená a diskrétna oproti celému organizmu, v ktorom je táto molekula prítomná v prírode, alebo je prítomná v podstate za neprítomnosti iných biologických makromolekúl toho istého typu. Pojem “izolovaný” v súvislosti s polynukleotidom je molekula nukleovej kyseliny zbavená ako celok alebo časť sekvencii normálne pripojených k tejto molekule v prírode alebo sekvencie, ak existuje v prírode, avšak majú pripojené heterológne sekvencie, alebo molekula oddelená z chromozómu.
Pojem “ekvivalentný antigénny determinant” znamená antigénny determinant z rôznych poddruhov, alebo kmeňov HCV, ako sú kmene 1, 2 alebo 3 HCV. Konkrétnejšie sú známe epitopy ako 5-1-1 a tieto epitopy sa menia medzi kmeňmi 1, 2 a 3. Epitop 5-1-1 z rôznych kmeňov teda predstavuje antigénne determinanty, takže kópie a dokonca ani ich sekvencie nie sú identické. Všeobecne budú mať aminokyselinové sekvencie ekvivalentných antigénnych determinantov vysoký stupeň sekvenčnej homológie, t.j. sekvenčnú homológiu viac ako 30 %, prednostne viac ako 40 %, keď sú obe sekvencie zoradené.
048/B “Homológia” sa týka percentuálnej podobnosti medzi dvoma polynukleotidovými alebo dvoma polypeptidovými zvyškami. Dve deoxyribonukleové kyseliny alebo dve polypeptidové sekvencie sú “podstatne homológne” navzájom, ak sekvencie vykazujú aspoň 50 %, prednostne aspoň 75 %, prednostnejšie aspoň 80 až 85 %, ešte prednostnejšie aspoň 90 % a najprednostnejšie aspoň 95 až 98 % sekvenčnej podobnosti na definovanej dĺžke molekúl. Pojem podstatne homológny, ako sa tu používa, sa taktiež vzťahuje na sekvencie vykazujúce úplnú identitu so špecifickou sekvenciou deoxyribonukleovej kyseliny alebo polypeptidu.
Všeobecne sa “identita” týka presnej korešpondencie medzi nukleotidmi alebo aminokyselinami v dvoch polynukleotidových alebo polypeptidových sekvenciách. Percento identity sa dá stanoviť priamym porovnaním sekvenčnej informácie medzi dvoma molekulami zoradením sekvencií, zistením presného počtu zodpovedajúcich zhodných dvojíc medzi dvoma zoradenými sekvenciami, delením dĺžkou kratšej sekvencie a násobením výsledku 100.
Na pomoc pri analýze podobnosti a identity sa dá použiť ľahko dostupný počítačový program, ako je ALIGN, M. O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure M. O. Dayhoff, redakcia, 3, Suppl. 5, 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, ktorý prispôsobuje algoritmus lokálnej homológie Smithe a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482-489 (1981) na peptidovú analýzu. Programy na stanovenie nukleotidovej sekvenčnej podobnosti a identity sú k dispozícii ako Wisconsin Sequence Analysis Package, verzia 8 (dodáva Genetics Computer Group, Madison, Wl), napríklad programy BESTFIT, FASTA a GAP, ktoré sa taktiež zakladajú na algoritme Smithe a Watermana. Tieto programy sa dajú ľahko použiť s parametrami štandardného nastavenia odporúčanými výrobcom a opísanými vo vyššie citovanom Wisconsin Sequence Analysis Package. Napríklad percentuálna podobnosť danej nukleotidovej sekvencie s referenčnou sekvenciou sa stanoví použitím algoritmu homológie Smithe a Watermana s tabuľkou skóre v štandardnom nastavení a s medzerou šiestich nukleotidových polôh.
048/B
Ďalší spôsob zistenia percentuálnej podobnosti v súvislosti s týmto vynálezom je použitie súboru programu MPSRCH, University of Edinburgh, autorov John F. Collinsa a Shane S. Sturroka distribuovaný spoločnosťou IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Z týchto súborov sa dá použiť Smithov-Watermanov algoritmus s použitím parametrov štandardného nastavenia zo skórovacej tabuľky [napríklad “gap open penalty 12”, “gap extension penalty 1” a “gap 6’’]. Hodnota “Match” (zhody) vytvorená z údajov odráža “sekvenčnú podobnosť’’. Ďalšie vhodné programy pre výpočet percenta identity alebo podobnosti medzi sekvenciami sú v odbore dobre známe, napríklad ďalší program BLAST použitý s parametrami štandardného nastavenia. Napríklad BLATN a BLASTP je použiteľný s nasledujúcimi parametrami so štandardným nastavením: genetický kód = štandardný, filter = žiadny, vlákno = obe, skrátenie = 60, očakávanie = 10, Matrica = BLOSUM62, opisy = 50 sekvencií, hodnotenie = vysoké skóre, databáza = neredundantná, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS preklady + Swiss proteín + Spupdate + PIR. Podrobnosti o týchto programoch sa dajú nájsť na nasledujúcej internetovej adrese http./www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternatívne sa dá homológia stanoviť hybridizáciou polynukleotidov za podmienok tvoriacich stabilné duplexy medzi homológnymi oblasťami s následným natrávením jednovláknovo špecifickou nukleázou a stanovením veľkosti natrávených fragmentov. Sekvencie DNA, ktoré sú v podstate homológne, sa dajú identifikovať Southernovou hybridizáciou napríklad za prísnych podmienok definovaných pre daný systém. Definícia príslušných podmienok hybridizácie spadá do oblasti skúsenosti v odbore. Pozri napríklad Sambrook a kol., vyššie, DNA Cloning, vyššie, Nucleic Acid hybridization, vyššie.
“Kódovacia sekvencia” alebo sekvencia, ktorá kóduje zvolený polypeptid, je molekula nukleovej kyseliny, ktorá sa prepisuje (v prípade deoxyribonukleovej kyseliny) a prekladá (v prípade mRNA) do polypeptidu in vitro alebo in vivo pri umiestnení pod kontrolu príslušných regulačných sekvencií. Medze kódovacej sekvencie sa stanovia štartovacím kodónom pri
048/B konci 5' (amino) a kodónom zastavenia translácie pri konci 3' (karboxy). Sekvencia ukončenia transkripcie sa môže pripájať v polohe 3’ ku kódovacej sekvencii.
Pojem operabilne spojený” sa týka usporiadania elementov, v ktorých sa takto opisované zložky konfigurujú tak, aby uskutočňovali svoje požadované funkcie. Preto je daný promótor operabilne pripojený ku kódovacej sekvencii schopný uskutočňovať expresiu kódovacej sekvencie za prítomnosti vhodných transkripčných faktorov atď. Promótor nemusí byť spojený s kódovacou sekvenciou, ak je jeho funkciou smerovať jej expresiu. Preto napríklad vložené nepreložené a pritom prepísané sekvencie môžu byť medzi sekvenciou promótora a kódovacou sekvenciou, ako je to pre prepisované intróny, a sekvencia promótora sa pritom môže považovať za “operabilne pripojenú” ku kódovacej sekvencii.
Pojem “kontrolný element” sa týka sekvencie polynukleotidu, ktorá napomáha expresii kódovacej sekvencie, ku ktorej sa pripája. Tento pojem zahŕňa promótory, sekvencie ukončenia transkripcie, domény vzostupné regulácie, signály polyadenylácie, nepreložené oblasti, vrátane 5'-UTR a 3'UTR a vo vhodných prípadoch vedúce sekvencie a enhancery, ktoré spoločne zaisťujú transkripciu a transláciu kódovacej sekvencie v bunke hostiteľa.
Pojem “promótor”, pokiaľ sa používa tu, je DNA regulačná oblasť schopná väzby RNA polymerázy v hostiteľskej bunke a začatia transkripcie zostupnej (smer 3') kódovacej sekvencie, ku ktorej je operačne pripojená. Pre účely tohto vynálezu zahŕňa sekvencia promótora minimálny počet báz alebo elementov nevyhnutných pre začatie transkripcie daného génu na úrovniach detegovateľných nad pozadím. V rámci sekvencie promótora je miesto zahájenia transkripcie rovnako tak ako domény väzby proteínu (sekvencie konsenzu) zodpovedné za väzbu RNA polymerázy. Eukaryotické promótory často, avšak nie vždy, obsahujú boxy “TATA” a boxy “CAT”.
048/B
Kontrolná sekvencia “smeruje transkripciu” kódovacej sekvencie v bunke, keď sa RNA polymeráza viaže na sekvenciu promótora a prepisuje kódovaciu sekvenciu do mRNA, ktorá sa potom prekladá do kódovaného polypeptidu kódovacou sekvenciou.
“Expresná kazeta” alebo “expresný konštrukt” sa týka súboru schopného smerovať expresiu danej sekvencie (sekvencií) alebo daného génu (génov). Expresná kazeta zahŕňa kontrolné prvky, ako sa opisujú vyššie, ako je promótor, ktorý je operačne pripojený k danej sekvencií (sekvenciám) alebo danému génu (génom) a často taktiež zahŕňa sekvenciu polyadenylácie. Pri určitých uskutočneniach tohto vynálezu môže byť expresná kazeta, ktorá sa tu opisuje, obsiahnutá v rámci plazmidového konštruktu. Navyše k zložkám expresnej kazety môže plazmidový konštrukt taktiež obsahovať jeden alebo viac voliteľných markerov, ktorých signál umožňuje existenciu plazmidového konštruktu vo forme jednovláknovej deoxyribonukleovej kyseliny (napríklad pôvod M13 replikácie), v aspoň jednom mieste viacpočetného klonovania a “cicavčí pôvod replikácie (napríklad SV40 alebo adenovírusový pôvod replikácie).
Pojem “transformácia”, ako sa tu používa, sa týka vloženia exogénneho polynukleotidu do hostiteľskej bunky bez ohľadu na spôsob použitý pri tomto vložení: napríklad transformácia priamym zachytením, transfekciou, infekciou a podobne. Ohľadom konkrétnych spôsobov transfekcie pozri ďalej nižšie. Exogénny polynukleotid sa môže udržovať ako neintegrovaný vektor, napríklad epizóm alebo alternatívne môže byť integrovaný do hostiteľovho genómu.
“Hostiteľská bunka je bunka, ktorá sa transformovala alebo je schopná transformácie exogénnou sekvenciou deoxyribonukleovej kyseliny.
“Zvyčajný pevný nosič” znamená jednotlivú tuhú matricu, ku ktorej sa polypeptidy použité v daných imunoesejách viažu kovalentne alebo nekovalentnými spôsobmi, ako je hydrofóbna adsorpcia.
048/B
Pojem imunologický reaktívny” znamená, že daný antigén bude reagovať špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke od jednotlivca infikovaného HCV.
Pojem “imunitný komplex” znamená kombináciu vytvorenú pri väzbe protilátky na epitop antigénu. 1
Pojem “biologická vzorka”, ako sa tu používa, sa týka vzorky tkaniva alebo kvapaliny izolovanej zo subjektu vrátane, avšak bez obmedzenia, napríklad krvi, plazmy, séra, hmoty stolice, moču, kostnej drene, žlči, spinálnej tekutiny, lymfatickej tekutiny, vzoriek kože, vonkajších sekrétov kože, respiračného intestinálneho a urogenitálneho traktu, sĺz, slín, mlieka, krviniek, orgánov, biopsií a taktiež vzoriek zložiek bunkovej kultúry in vitro vrátane, avšak bez obmedzenia, upravených médií získaných z rastu buniek a tkanív v médiu, napríklad rekombinantných buniek a bunkových zložiek.
Pojmy “značka” a “detegovateľná značka, ako sa tu používajú, sa týkajú molekuly schopnej detekcie vrátane, avšak bez obmedzenia, rádionuklidov, fluorescenčných látok, chemiluminiscenčných látok, chromofórov, enzýmov, enzýmových substrátov, enzýmových kofaktorov, enzýmových inhibítorov, chromofórov, farbív, kovových iónov, kovových solí, ligandov napríklad biotín, strepavidín alebo haptény) a podobne. Pojem “fluorescenčná látka” sa týka látky alebo jej časti, ktorá je schopná vykazovať fluorescenciu v detegovateľnom rozmedzí. Konkrétne vzorky značiek, ktoré sa dajú využiť v rámci tohto vynálezu, zahŕňajú, avšak bez obmedzenia, chrenovú peroxidázu (HRP), fluoresceín, FITC, rodamín, dansyl, umbeliferón, dimetylakridíniumester (DMAE), texaskú červeň, luminol, NADPH a α-β-glaktožidázu.
II. Spôsoby uskutočnenia vynálezu
Pred podrobným opisom tohto vynálezu je potrebné si uvedomiť, že sa tento vynález neobmedzuje na konkrétne formulácie alebo že sa parametre procesu môžu samozrejme meniť. Je potrebné si taktiež uvedomiť, že
048/B terminológia, ktorá sa tu používa, slúži iba pre účely opisov konkrétnych uskutočnení tohto vynálezu a nie je obmedzujúca.
Aj keď počet zmesí a spôsobov podobných alebo ekvivalentných tým, ktoré sa tu opisujú, sa dá použiť v praxi tohto vynálezu, sú preferovanými látkami a spôsobmi tie, ktoré sa tu opisujú.
Ako sa poznamenáva vyššie, zakladá sa tento vynález na objave nových diagnostických spôsobov pre presné stanovenie skorej infekcie HCV. Tieto spôsoby sa zakladajú na identifikácii a použití vysoko imunogénnych HCV protilátok a antigénov, ktoré sa vyskytujú v skorých fázach sérokonverzie HCV, čím sa zvyšuje správnosť detekcie a znižuje sa výskyt falošných výsledkov. Tieto spôsoby sa dajú vhodným spôsobom uskutočňovať vo formáte jednotlivej eseje.
Konkrétnejšie sa esej uskutočňuje na pevnej podložke, ku ktorej sa naviaže jedna alebo viac protilátok proti jadru HCV (smerovanej buď proti rovnakým alebo iným epitopom jadra HCV) a epitop odvodený od oblasti NS3/4a polyproteínu HCV. Príklady konkrétnych protilátok proti jadru použiteľných v tomto vynáleze zahŕňajú, avšak bez obmedzenia, protilátkové molekuly, ako sú monoklonálne protilátky zamerané proti epitopom v oblasti jadra medzi aminokyselinami 10 až 53, aminokyselinami 10 až 45, aminokyselinami 67 až 88, aminokyselinami 120 až 130 alebo protilátky zamerané proti epitopom jadra identifikovaným napríklad v Hougton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a koľ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89. 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol, 8, S33-39 (1993), Chien a koľ, medzinárodná publikácie č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778 a US patentové prihlášky č. 08/403 590 a 08/444 818 prijaté do všeobecného vlastníctva.
Oblasť NS3/4a polyproteínu HCV sa opisuje a aminokyselinová sekvencia a celková štruktúra proteínu sa uverejňuje napríklad v Yao a kol., Structure, 7, 1353-1363 (1999), Sali a kol., Biochem., 37, 3392-3401 (1998) a R. Bartenschlager, J. Viral Hepat., 6, 165-181 (1999). Pozri tiež Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 843 752. Imunoeseje subjektu používajú aspoň jeden
048/B konformačný epitop odvodený od oblasti NS3/4a, ktorý sa vyskytuje v konformácii nájdenej v prirodzenej častici HCV alebo v jej neúčinnom produkte, ako sa ukazuje zachovaním proteázovej a prípadne helikázovej enzymatickej aktivity normálne vykazovanej produktom génu NS3/4a a/alebo imunoreaktivitou antigénu s protilátkami v biologickej vzorke subjektu infikovaného HCV a stratou imunoreaktivity epitopu pri denaturácii antigénu. Napríklad konformačný epitop sa dá porušiť zahrievaním, zmenou pH na mimoriadne kyslé alebo bázické alebo pridaním známych organických denaturačných prostriedkov, ako je ditiotreitol (DTT) alebo príslušný detergent, pozri napríklad Protein Purification Methods, a practical approach (E. L. V. Harris a S. Angal, red., IRL Press), a denaturovaný produkt sa porovnáva s produktom, ktorý sa nespracováva ako sa opisuje vyššie.
Proteázová a helikázová aktivita sa dá stanoviť použitím štandardných spôsobov stanovenia enzýmov dobre známych v odbore. Napríklad proteázová aktivita sa dá stanoviť s použitím esejí dobre známych v odbore. Pozri napríklad Takeshita a kol., Anál. Biochem., 247, 242-246 (1997), Kakiuchi a kol., J. Biochem., 122, 749-755 (1997), Sali a koľ, Biochemistry, 37, 3392-3401 (1998), Choo a kol., J. Virol. Meth., 72, 109-115 (1998), Cerretani a kol., Anál. Biochem., 266, 192-197 (1999), Zhang a kol., Anál. Biochem., 270, 268-275 (1999), Kakiuchi a kol., J. Virol. Meth., 80, 77-84 (1999), Fowler a kol., J. Biomol. Screen, 5, 153-158 (2000) a Kim a kol., Anál. Biochem., 284, 42-48 (2000). Obzvlášť vhodnú esej na stanovenie aktivity proteázy ukazujú príklady opísané nižšie.
Podobne sú v odbore dobre známe eseje aktivity helikázy a aktivita helikázy epitopu NS3/4a sa dá stanoviť napríklad s použitím eseje ELISA, ako sa opisuje napríklad v Hsu a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 594599 (1998) a scintilačným systémom, ako opisuje Kyono a kol., Anál. Biochem., 257. 120-126 (1998) skríningovými esejami s vysokými výkonmi, ako sa opisujú napríklad v Hicham a kol., Antiviral Res., 46, 181-193 (2000) a Kwong a koľ, Methods Mol. Med., 24, 97-116 (2000) rovnako tak ako inými spôsobmi esejí známymi v odbore. Pozri napríklad Khu a kol., J. Virol., 75, 205-214 (2001),
048/B
Utama a kol., Virology, 273. 316-324 (2000), Paolini a kol., J. Gen. Virol., 81_, 1335-1345 (2000), Preugschat a koľ, Biochemistry, 39, 5174-5183 (2000), Preugschat a kol., Methods Mol. Med., 19, 353-364 (1998) a Hesson a kol., Biochemistry, 39, 2619-2625 (2000).
Dĺžka antigénu je dostatočná na udržanie imunoreaktívneho konformačného epitopu. Často má používaný polypeptid obsahujúci antigén takmer plnú dĺžku, avšak tento polypeptid môže byť taktiež skrátený, napríklad na zvýšenie rozpustnosti alebo zlepšenie sekrécie. Všeobecne sa môže konformačný epitop v NS3/4a exprimovať ako rekombinantný polypeptid v bunke a tento polypeptid poskytuje epitop žiadanej formy, ako sa opisuje podrobne nižšie.
Reprezentatívne aminokyselinové sekvencie pre polypeptidy NS3/4a ukazujú obrázky 3 a obrázky 4A až 4D. Zvýraznený alanín v polohe 182 na obrázku 3 sa substituuje namiesto aktívneho serínu prítomného v tejto polohe, aby sa zabránilo autokatalýze molekuly, ktorá inak mohla nastať. Aminokyselinová sekvencia znázornená v polohách 3 až 686 obrázkov 4A až 4D zodpovedá aminokyselinovým polohám 1027 až 1711 HCV-1. Iniciačný kodón (ATG) kódujúci Met je znázornený ako poloha 1. Navyše Thr normálne prítomný v polohe 1428 HCV-1 (aminokyselinová poloha 403 obrázku 4) sa mutuje na Pro a Ser normálne prítomný v polohe 14289 HCV-1 (aminokyselina poloha 404 v obrázku 4) sa mutuje na lle. Avšak natívna sekvencia s alebo bez N-terminálneho Met, znázornený analóg s alebo bez N-terminálneho Met alebo ďalšie analógy a fragmenty sa dajú použiť v esejách subjektu, pokiaľ sa epitop tvorí použitím spôsobu, ktorý zachováva alebo obnovuje natívnu konformáciu, takže sa zachováva proteázová a prípadne taktiež helikázová aktivita. Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 843 752 a Zhang a kol., US patent č. 5 990 276 opisujú analógy NS3/4a.
NS3 proteáza NS3/4a je zhruba v polohách 1027-1207, číslované vzhľadom na HCV-1, polohy 1 až 182 obrázku 4. Štruktúra NS3 proteázy a aktívne miesto sú známe. Pozri napríklad De Francesco a kol., Antivir. Ther., 3, 99-109 (1998), Koch a kol., Biochemistry, 40, 631-640 (2001). Zmeny natívnej
048/B sekvencie, ktoré sa dajú normálne tolerovať, sú tie, ktoré sú vo vnútri aktívneho miesta molekuly. Konkrétne je vhodné zachovávať aminokyseliny 1- alebo 2 až 155 obrázku 4 s málo substitúciami alebo iba s konzervatívnymi substitúciami. Aminokyseliny mimo 155 budú tolerovať väčšie zmeny. Navyše, ak sa použijú fragmenty sekvencie NS3/4a znázornené na obrázku 4, budú tieto fragmenty všeobecne zahŕňať aspoň aminokyseliny 1 alebo 2 až 155, prednostne aminokyseliny 1 alebo 2 až 175 a najprednostnejšie aminokyseliny 1 alebo 2 až 182 s N-terminálnymi Met alebo bez nich. Helikázová doména je zhruba v polohách 1193 až 1657 HCV-1 (polohy 207 až 632 na obrázku 4). Preto, ak sa požaduje helikázová aktivita, bude táto časť molekuly zachovaná s málo zmenami alebo iba s konzervatívnymi zmenami. Ten, kto má skúsenosti v odbore, môže ľahko stanoviť ďalšie oblasti, ktoré budú tolerovať zmenu na základe známej štruktúry NS3/4a.
Pevný nosič môže taktiež obsahovať ďalšie antigény. Napríklad antigény tvorené spojením viacerých epitopov (zvané “MEFA”), ako sa opisujú v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469, sa môžu viazať na pevný nosič na použitie v esejách subjektu. Tieto MEFA obsahujú viacpočetné epitopy odvodené od dvoch alebo viacerých rôznych vírusových oblastí znázornených na obrázku 1 a v tabuľke 1. Konkrétne, ako ukazuje obrázok 1 a tabuľka 1, tvorí HCV polyproteín pri štiepení aspoň desiatich rôznych produktov v poradí NH2jadro-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Polypeptid jadra sa vyskytuje v polohách 1 až 191, číslované vzhľadom na HCV-1 [pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2451-2455 (1991) ohľadom genómu HCV1], Tento polypeptid sa ďalej spracováva za získania HCV polypeptidu s aminokyselinami zhruba 1 až 173. Polypeptidy obálky, E1 až E2 sa vyskytujú zhruba v polohách 192 až 383 respektíve 384 až 746. Doména P7 je zhruba v polohách 747 až 809. NS2 je integrálny membránový proteín s proteolytickou aktivitou a je zhruba v polohách 810 až 1026 polyproteínu. NS2, buď samotný alebo v kombinácii s NS3 (v polohách zhruba 1027 až 1657) štiepi väzbu NS2NS3, ktorá tvorí koniec N NS3 a uvoľňuje veľký polyproteín zahrňujúci aktivity serín proteázy a RNA helikázy. NS3 proteáza v polohách 1027 až 1207 slúži na spracovanie zvyšného polyproteínu. Helikázová aktivita je zhruba v polohách
048/B
1193 až 1657. Dokončenie zretia polyproteínu sa zahajuje autokatalytickým štiepením spojenia NS3-NS4a katalyzovaným NS3 serin proteázou. Nasledujúce štiepenie HCV polyproteínu sprostredkované NS3 zahŕňa rozpoznanie spojov štiepenia polyproteínu molekulou NS3 ďalšieho polypeptidu. V týchto reakciách NS3 uvoľňuje kofaktor NS3 (NS4a v polohách 1658 až 1711), dva proteíny (NS4b zhruba v polohách 1712 až 1972 a NS5a zhruba v polohách 1973 až 2420) a RNA-dependentnú RNA polymerázu (NS5b prítomnú zhruba v polohách 2421 až 3011).
Tabuľka 1
Doména | Približné rozmedzie * |
C (core) | 1-191 |
E1 | 192-383 |
E2 | 384-746 |
P7 | 747-809 |
NS2 | 810-1026 |
NS3 | 1027-1657 |
NS4a | 1658-1711 |
NS4b | 1712-1972 |
NS5a | 1973-2420 |
NS5b | 2421-3011 |
* Číslovanie vzhľadom na HCV-1. Pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991).
Viacpočetné antigény HCV sú časťou jedného spojitého reťazca aminokyselín, ktorý sa nevyskytuje v prírode. Preto je lineárne poradie epitopov odlišné od ich lineárneho poradia v genóme, v ktorom sa vyskytujú. Lineárne poradie sekvencií MEFA na použitie v tomto vynáleze je prednostne usporiadané na dosiahnutie optimálneho antigénneho pôsobenia. V preferovaných spôsoboch pochádzajú epitopy od viacej ako jedného kmeňa
048/B
HCV, čím sa zaisťuje prídavná schopnosť detegovať viacpočetné kmene HCV v jednej eseji. Preto môžu MEFA na použitie v tomto vynáleze obsahovať rôzne imunogénne oblasti odvodené od vyššie opísaného polyproteínu. Navyše proteín získaný z posunu rámca v oblasti jadra polyproteínu, ako sa opisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 99/63941, je použiteľný v MEFA. V prípade požiadavky sa v hybridnom proteíne môže vyskytnúť aspoň 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 alebo viac epitopov odvodených od polyproteínu HCV.
Napríklad epitopy odvodené od hypervariabilnej oblasti E2, ako je oblasť aminokyselín 384 až 410 alebo 390 až 410, môžu byť súčasťou antigénu MEFA. Obzvlášť účinným epitopom E2 je taký, ktorý zahŕňa sekvenciu konsenzu odvodenú z tejto oblasti, ako je sekvencia konsenzu Gly-Ser-Ala-AlaArg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, ktorá predstavuje sekvenciu konsenzu pre aminokyseliny 390 až 410 genómu HCV typu 1. Reprezentatívny epitop E2 prítomný v MEFA podľa tohto vynálezu môže obsahovať hybridný epitop v rozmedzí aminokyselín 390 až 444. Tento hybridný epitop E2 môže zahŕňať sekvenciu konsenzu predstavovanú kyselinami 390 až 410 pripojenú k natívnej aminokyselinovej sekvencii pre aminokyseliny 411 až 444 HCV E2.
Navyše sa môžu antigény odvodzovať od rôznych kmeňov HCV. Sú známe viacpočetné vírusové kmene HCV a epitopy odvodené od ktoréhokoľvek z týchto kmeňov sa dajú používať v spojenom proteíne. Je dobre známe, že v akomkoľvek druhu organizmu existuje individuálna premenlivosť a ďalej, že daný organizmus, ako je vírus, môže mať množstvo rôznych kmeňov. Napríklad, ako sa opisuje vyššie, zahŕňa HCV aspoň 6 genotypov. Každý z týchto genotypov zahŕňa ekvivalentné antigénne determinanty. Konkrétnejšie zahŕňa každý kmeň množstvo antigénnych determinantov, ktoré sú prítomné vo všetkých kmeňoch vírusu, avšak sú mierne rozdiely medzi jednotlivými kmeňmi vírusu. HCV napríklad zahŕňa antigénny determinant známy ako 5-1-1 (pozri obrázok 1). Tento konkrétny antigénny determinant je v troch rôznych formách na troch rôznych vírusových kmeňoch HCV. V súlade s tým sa v preferovanom uskutočnení podľa tohto vynálezu vyskytujú všetky tri formy 5-1-1 na antigéne
048/B získanom spojením viacerých epitopov použitom v imunoesejách uskutočňovaných na subjekte. Podobne môžu byť taktiež prítomné ekvivalentné antigénne determinanty z oblasti jadra rôznych kmeňov HCV. Všeobecne majú ekvivalentné antigénne determinanty vysoký stupeň homológie v zmysel aminokyselinovej sekvencie, ktorý je všeobecne 30 % alebo viac, prednostne 40 % alebo viac pri zoradení. Epitop viacpočetnej kópie podľa tohto vynálezu môže taktiež zahŕňať viac kópií, ktoré sú presnými kópiami toho istého epitopu.
Reprezentatívne MEFA na použitie v týchto analýzach sa opisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 97/44469. Ďalšie reprezentatívne MEFA na toto použitie zahŕňajú MEFA 12, MEFA 13 a MEFA 13.1. Je potrebné si uvedomiť, že tieto MEFA sú čisto reprezentatívne a v týchto analýzach sa dajú používať ďalšie epitopy odvodené od genómu HCV a dajú sa inkorporovať do týchto alebo iných MEFA.
Sekvenciu DNA a zodpovedajúcu aminokyselinovú sekvenciu MEFA 12 znázorňujú obrázky 7A až 7F. Všeobecný štruktúrny vzorec MEFA 12 znázorňuje obrázok 6 a je nasledujúci: hSOD-E1 (typ 1) -E2 HVR konsenzus (typ 1a) -E2 HVR konsenzus (typy 1 a 2) -c33c krátky (typ 1) -5-1-1 (typ1) -5-11 (typ3) -5-1-1 (typ 2) -c100 (typ 1) -NS5 (typ 1) -NS5 (typ 1) -jadro (typy 1+2) jadro-(typy 1+2). Tento epitop s viacpočetnými kópiami zahŕňa nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu, číslované vzhľadom na HCV-1 (číslovanie aminokyselín opísané nižšie vyplýva z určenia číslovania podľa Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991), kde aminokyselina 1 je prvý metionín kódovaný kódovacou sekvenciou oblasti jadra): aminokyseliny 1 až 69 superoxid dismutázy (SOD sa používa na zvýšenie rekombinantnej expresie proteínu), aminokyseliny 303 až 320 polyproteínu z oblasti E1, aminokyseliny 390 až 410 polyproteínu predstavujúceho sekvenciu konsenzu pre hypervariabilnú oblasť HCV-1a a E2, aminokyseliny 384 až 414 polyproteínu z oblasti E2, predstavujúce sekvenciu konsenzu pre hypervariabilné oblasti E2 HCV-1 a HCV-2, aminokyseliny 1211 až 1457 polyproteínu HCV-1 definujúce helikázu, tri kópie epitopu z 5-1-1, aminokyseliny 1689 až 1735, jedna z HCV-1, jedna z HCV-3 a jedna z HCV-2, kde tieto kópie sú ekvivalentné antigénnym
048/B determinantom z troch rôznych vírusových kmeňov HCV, HCV polypeptid C100 HCV-1, aminokyseliny 1901-1936 polyproteínu, dve presné kópie epitopu z oblasti NS5 HCV-1, každá z aminokyselín 2278 až 2313 HCV polyproteínu, a dve kópie troch epitopov z oblasti jadra, dve z HCV-1 a jedna z HCV-2, ktoré sú ekvivalentné antigénnym determinantom predstavovaným aminokyselinami 9 až 53 a 64 až 88 HCV-1 a 67 až 84 HCV-2.
Tabuľka 2 ukazuje polohy aminokyselín rôznych epitopov v MEFA 12 s odkazom na obrázky 7A až 7F. Číslovanie v tabuľkách sa vzťahuje na HCV-1. Pozri Choo a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455 (1991). MEFA 13 a 13.1 taktiež zdieľajú všeobecný vzorec opísaný vyššie pre MEFA 12 s modifikáciami znázornenými v tabuľkách 3 a 4.
048/B
Tabuľka 2 - MEFA12
Mefa aa# | Koncové miesto 5' | epitop | hcv aa# | kmeň |
1-69* | ΝοοΊ | hSOD | ||
72-89 | Mlul | E1 | 303-320 | 1 |
92-112 | Hindl 11 | E2 HVR1a konsenzus | 390-410 | ; 1. |
113-143 | E2 HVR1+2 konsenzus | 384-414 | 1,2 | |
146-392 | Spel | C33C krátky | 1211-1457 | 1 |
395-441 | Sphl | 5-1-1 | 1689-1735 | 1 |
444-490 | Nrul | 5-1-1 | 1689-1735 | 3 |
493-539 | Clal | 5-1-1 | 1689-1735 | 2 |
542-577 | Aval | C100 | 1901-1936 | 1 |
580-615 | Xbal | NS5 | 2278-2313 | 1 |
618-653 | Bglll | NS5 | 2278-2313 | 1 |
654-741 | Ncol | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
742-829 | Balí | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
‘Proteín SOD je skrátený tak, že detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, sa neviaže na MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok proti jadru HCV použitých v detekcii s MEFA.
048/B
Tabuľka 3 - MEFA 13
Mefa aa# | Koncové miesto 5' | epitop | hcv aa# | kmeň |
1-156 | A/co1 | mutovaný hSOD (aa70- 72, ALA) | ||
161-178 | Mlu\ | E1 | 303-320 | 1 |
181-201 | Hind! 11 | E2 HVR1a konsenzus | 390-410 | 1 |
202-232 | E2 H VR 1+2 konsenzus | 384-414 | 1,2 | |
235-451 | C33C krátky | 1211-1457 | 1 | |
454-500 | HindlU | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 1 |
503-549 | Nru\ | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 3 |
552-598 | Cla\ | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 2 |
601-636 | Ava\ | C100 | 1901-1936 | 1 |
639-674 | Xba\ | NS5 | 2278-2313 | 1 |
677-712 | Bgf\\ | NS5 | 2278-2313 | 1 |
713-800 | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
801-888 | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
*Epitopy 5-1-1-sa modifikujú elimináciou možných miest štiepenia (CS alebo CA) cielených NS3/4a rekombinantným proteínom. Namiesto CS alebo CA sa sekvencia mení na Pl. Navyše sa proteín SOD mutuje takým spôsobom, že sa detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neviaže na MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok jadra HCV použitých pri detekcii na MEFA.
048/B
Tabuľka 4-MEFA 13.1
Mefa aa# | Koncové miesto 5' | epitop | hcv aa# | Kmeň |
1-86 | /Vco1 | mutovaný hSOD (aa 70-72, ALA) | ||
89-106 | Mlul | E1 | 303-320 | 1 |
109-129 | HindlW | E2 HVR1a konsenzus | 390-410 | 1 |
130-160 | E2 HVR1+2 konsenzus | 384-414 | 1,2 | |
163-379 | C33C krátky | 1211-1457 | 1 | |
382-428 | HindlW | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 1 |
431-477 | Nrul | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 3 |
480-526 | Clal | 5-1-1 Plmut* | 1689-1735 | 2 |
529-564 | A val | C100 | 1901-1936 | 1 |
567-602 | Xbal | NS5 | 2278-2313 | 1 |
605-640 | Bglll | NS5 | 2278-2313 | 1 |
641-728 | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 | |
729-816 | epitopy jadra | 9-53, R47L 64-88 67-84 | 1 1 2 |
*Epitopy 5-1-1 sa modifikujú elimináciou možných miest štiepenia (CS alebo CA) cielených NS3/4a rekombinantným proteínom. Namiesto CS alebo CA sa sekvencie menia na Pl. Navyše sa proteín SOD mutuje takým spôsobom, že sa detekčný konjugát, protilátka proti SOD značená HRP, neviaže na MEFA. Epitop jadra sa mutuje, aby sa predišlo väzbe protilátok jadra HCV použitých pri detekcii na MEFA.
048/B
V jednom formáte eseje sa vzorka kombinuje s pevným nosičom, ako sa ďalej opisuje nižšie. Ak sa vzorka infikuje HCV, budú sa antigény jadra, rovnako tak ako protilátky proti týmto epitopom prítomné na pevnom nosiči, viazať na zložky pevného nosiča. Potom sa pridá detegovateľne značená protilátka proti jadru. Značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu ako protilátka proti jadru, ktorá sa viaže na pevný nosič. Táto protilátka proti jadru sa viaže na antigén jadra zachytený protilátkami proti jadru na pevnom nosiči.
Taktiež sa pridáva antigén reagujúci so zachytenou protilátkou HCV z biologickej vzorky, ktorá je reaktívna s NS3/4a epitopom. Tento antigén je prednostne epitop odvodený od oblasti NS3 polyproteínu HCV. Tento antigén viaže zachytenú protilátku HCV zo vzorky. Je známe množstvo antigénov vrátane týchto epitopov, avšak bez obmedzenia, odvodených z oblastí c33c a c100 rovnako tak ako hybridných proteínov zahrňujúcich epitop NS3, ako je c25. Tieto a ďalšie epitopy NS3 sú použiteľné v týchto esejách a sú známe v odbore a opisujú ich napríklad Hougton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10011-10015 (1992), Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993). Medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná publikácia č. WO 94/01778 a US patentové prihlášky prijaté do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818.
Pridá sa druhá značená protilátka smerovaná proti vyššie opísanému antigénu. Túto protilátku je možné nasmerovať proti ktorémukoľvek epitopu obsiahnutému v antigéne. Napríklad je možné túto protilátku smerovať proti oblasti NS3 prítomnej v antigéne. Alternatívne, ak sa antigén vyššie exprimuje ako spojený proteín, dá sa druhá značená protilátka smerovať proti partnerovi fúzie. Ďalšie antigény a protilátka sa dajú pridávať do eseje, najmä ak pevný nosič obsahuje MEFA. Tieto formáty eseje sa vysvetľujú ďalej nižšie.
Reprezentatívna esej podľa tohto vynálezu sa znázorňuje na obrázku 2. Ako ukazuje obrázok, zahŕňa pevný nosič dve monoklonálne protilátky proti jadru nazvané C11-3 a C11-7. Tieto protilátky sa smerujú proti epitopu prítomnému v N-terminálnej oblasti proteínu jadra pri aminokyselinách 10 až
048/B
53, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1. Pevný nosič taktiež zahŕňa epitop NS3/4a. K pevnému nosiču sa pridá biologická vzorka. Antigén jadra HCV, rovnako tak ako protilátky smerované proti epitopu NS3/4a taktiež prítomné vo vzorke, viažu prostriedky pre zachytenie na pevnom nosiči.
Monoklonálna protilátka značená chrenovou peroxidázou c11-14 smerovaná proti C-terminálnej oblasti jadra pri polohách aminokyselín 120 až 130, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, sa následne pridá. Spojený proteín zahrňujúci sekvenciu z ľudskej SOD (hSOD) a epitop z oblasti c33c sa pridá a je druhou protilátkou značenou chrenovou peroxidázou smerovanou proti časti SOD spojeného proteínu. Spojenie SOD-c33a sa viaže na protilátku proti NS3 a protilátka proti SOD sa viaže na spojený proteín SODc33c. Detekcia značky indikuje prítomnosť infekcie HCV.
Ďalšia reprezentatívna esej podľa tohto vynálezu sa znázorňuje na obrázku 8. Konfiguráciou protilátkovej eseje je sendvičová esej antigénprotilátka-antigén s použitím NS3/4a a MEFA 12. Pevný nosič zahŕňa dve monoklonálne protilátky proti jadru opísané vyššie, epitop NS3/4a reprezentatívnej MEFA, MEFA 12, zahrňujúci skrátenú verziu ľudskej SOD. Podobne ako pri eseji opísanej vyššie sa pridá biologická vzorka k pevnému nosiču. Antigén jadra HCV rovnako tak ako protilátky proti epitopu NS3/4a a epitopom MEFA prítomné vo vzorke sa viažu na zachytávacie prostriedky na pevnom nosiči. Pridajú sa dva antigény, jeden reaktívny s protilátkami vzorky, ktorý viaže NS3/4a (ako sa opisuje vyššie) a jeden reaktívny s protilátkami vzorky, ktorý viaže MEFA 12. Na obrázku je antigén reaktívny s komplexom MEFA 12/protilátka vzorky spojením medzi molekulu SOD a c22ks delta47L44W. Antigén c22ks je z oblasti jadra a zahŕňa aminokyseliny Lys10 až Serg9 polyproteínu, rovnako tak ako deléciu Arg47 normálne prítomnej a substitúciu Leu namiesto Trp v polohe 44. Detekčným konjugátom protilátky je druhá monoklonálna protilátka proti SOD, značená HRP opísaná vyššie.
Vyššie opísané kombinačné eseje antigén/protilátka sú obzvlášť výhodné, pretože sa dá detegovať antigén jadra HCV aj protilátky proti NS3/4a a/alebo jadru rovnakým nosičom v tej istej eseji. Navyše, ako sa opisuje vyššie,
048/B dajú sa použiť ďalšie HCV epitopy, ako je SOD pripojená k c100, 5-1-1, NS5 antigénom rovnako tak ako proteín z posunu rámca v oblasti jadra polyproteínu, ktorý sa opisuje v medzinárodnej publikácii č. WO 99/63941, v kombinačnej zmesi pre pokrytie iných neštruktúrnych epitopov HCV.
Pre ďalšie pochopenie tohto vynálezu sa nižšie poskytuje podrobná diskusia ohľadom tvorby protilátok na použitie v oblasti imunoesejí, tvorby polypeptidov na použitie v imunoesejách a spôsobov uskutočňovania imunoesejí.
Tvorba protilátok na použitie v imunoesejách HCV.
Ako sa opisuje vyššie, využíva esej rôzne protilátky, ktoré sa viažu na pevný nosič (napríklad jednej alebo viacerých protilátok proti jadru) a ktoré detegujú komplex antigén/protilátka tvorené pri prítomnosti infekcie HCV vo vzorke. Tieto protilátky môžu byť polyklonálnymi alebo monoklonálnymi protilátkovými prípravkami, monošpecifickými antisérami, ľudskými protilátkami alebo to môžu byť hybridné alebo chimérické protilátky, ako sú humanizované protilátky, pozmenené protilátky, fragmenty F(ab')2’, fragmenty F(ab), fragmenty Fv, jednodoménové protilátky, dimérne a trimérne protilátkové konštrukty fragmentov, miniprotilátky alebo ich funkčné fragmenty, ktoré sa viažu s daným antigénom.
Protilátky sa tvoria spôsobmi dobre známymi tomu, kto má skúsenosti v odbore a opisujú sa napríklad v US patentoch č. 4 011 308, 4 722 890, 4 016 043, 3 876 504, 3 770 380 a 4 372 745. Napríklad polyklonáine protilátky sa tvoria imunizáciou vhodného zvieraťa, ako je myš, krysa, králik, ovca alebo koza, daným antigénom. Na zvýšenie imunogenity sa antigén môže spájať pred imunizáciou s nosičom. Tieto nosiče sú dobre známe tomu, kto má bežnú prax v odbore. Imunizácia sa všeobecne uskutočňuje miešaním alebo emulgáciou antigénu vo fyziologickom roztoku, prednostne v adjuvantnom prostriedku, ako je Freundov úplný adjuvant a injekciou zmesi alebo emulzie parenterálne (všeobecne subkutánne alebo intramuskuláme). Zviera sa všeobecne vystaví o
048/B až 6 týždňov neskôr jednej alebo viacerým posilňovacím injekciám antigénu vo fyziologickom roztoku, prednostne s použitím Freundovho neúplného adjuvantu. Protilátky sa taktiež môžu vytvárať imunizáciou in vitro spôsobmi známymi v odbore. Polyklonálne antisérum sa potom získa z imunizovaného zvieraťa. Pozri napríklad Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohľadom opisu tvorby polyklonálnej protilátky proti HCV.
Monoklonálne protilátky sa všeobecne pripravia spôsobom Kohlera a Milsteina, Náture, 256, 495-497 (1975) alebo jeho modifikáciou. Zvyčajne sa myš alebo krysa imunizuje, ako sa opisuje vyššie. Avšak skôr ako odobratie krvi zvieraťu na získanie séra sa vyberie slezina (a prípadne niekoľko veľkých lymfatických uzlín) a rozdelia sa na jednotlivé bunky. V prípade požiadavky sa môžu bunky sleziny rozdeliť (po odstránení nešpecifický adherujúcich buniek) aplikáciou bunkovej suspenzie na misku alebo jamku potiahnutú antigénom. Bbunky exprimujúce imunoglobulín viazaný na membránu špecifický pre antigén sa viažu na misku a nevymyjú sa so zvyškom suspenzie. Výsledné B-bunky alebo všetky disociované slezinné bunky sa potom indukujú pre spojenie s bunkami myelómu pre vytvorenie hybridómov a pestujú sa v selektívnom médiu (napríklad v hypoxantínovom, aminopterínovom, tymidínovom médiu “HAT”). Výsledné hybridómy sa prenesú na misky obmedzujúcim zriedením a analyzujú sa ohľadom tvorby protilátok, ktoré sa špecificky viažu na imunizujúci antigén (a ktoré sa neviažu na nepríbuzné antigény). Zvolené monoklonálne hybridómy vylučujúce protilátku sa potom pestujú buď in vitro (napríklad v bankách pre tkanivové kultúry alebo v reaktoroch s dutými vláknami) alebo in vivo (napríklad ako ascity u myši).
Tvorba príbuzných monoklonálnych protilátok proti HCV sa opisuje napríklad v Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, US patentová prihláška prijatá do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818 a Kashiwakuma a koľ, US patent č. 5 871 904.
Ako sa opisuje vyššie, protilátkové fragmenty zachovávajúce schopnosť rozpoznávať daný antigén taktiež nachádzajú použitie pri imunoesejách
048/B subjektov. V odbore je známe množstvo protilátkových fragmentov, ktoré obsahujú antigénové väzbové miesta schopné vykazovať imunologické väzbové vlastnosti intaktnej protilátkovej molekuly. Napríklad je možné vytvárať funkčné protilátkové fragmenty štiepením konštantnej oblasti nezodpovednej za väzbu antigénu z protilátkovej molekuly použitím napríklad pepsínu za získania fragmentov F(ab')2. Tieto fragmenty obsahujú dve antigénové väzbové miesta, avšak chýba im časť konštantnej oblasti od každého z ťažkých reťazcov. Podobne sa dajú taktiež v prípade požiadavky získať Fab fragmenty obsahujúce jednotlivé antigénové väzbové miesto napríklad digesciou polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok papaínom. Dajú sa taktiež získať funkčné fragmenty obsahujúce iba variabilnú oblasť ťažkých a ľahkých reťazcov s použitím štandardných spôsobov, ako je rekombinantná tvorba preferenčného proteolytického štiepenia imunoglobulínových molekúl. Tieto fragmenty sa opisujú ako Fv. Pozri napríklad Inbar a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2569-2662 (1972), Hochman a koľ, Biochem, 15, 2706-2710 (1976) a Ehrich a kol., Biochem., 19, 4091-4096 (1980).
Jednoreťazcový Fv (“sFv” alebo “scFv”) polypeptid je kovalentne spojený Vh-Vl heterodimér, ktorý sa exprimuje spojením génov vrátane VH- a VL kódovacích génov spojených linkerom kódujúcim peptid. Huston a kol., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 85 5879-5883 (1988). Opisuje sa množstvo spôsobov na rozlíšenie a tvorbu chemických štruktúr (linkerov) pre konverziu prirodzene agregovaných avšak chemicky oddelených ľahkých a ťažkých polypeptidových reťazcov z protilátkovej V oblasti do sFv molekuly, ktoré sa skladajú do trojrozmernej štruktúry v podstate podobnej štruktúre miesta väzby antigénu. Pozri napríklad US patent č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Molekuly sFv sa dajú vytvoriť s použitím spôsobov opísaných v odbore. Pozri napríklad Huston a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, 5879-5883 (1988), US patent č. 5 091 513, 5 132 405 a 4 946 778. Kritériá konštrukcie zahŕňajú stanovenie príslušnej dĺžky na premostenie vzdialenosti medzi koncom C jedného reťazca a koncom N druhého reťazca, kde linker všeobecne tvorí malé hydrofilné aminokyselinové zvyšky, ktoré nejavia snahu na zvinovanie či tvorbu sekundárnych štruktúr. Takéto spôsoby sa opisujú v odbore, pozri napríklad US
048/B patent č. 5 091 513, 5132 405 a 4 946 778. Vhodné linkery všeobecne zahŕňajú polypeptidové reťazce striedavých zoskupení glycínových a serínových zvyškov a môžu zahŕňať glutámovú kyselinu a lyzínové zvyšky vložené na zvýšenie rozpustnosti.
“Miniprotilátky” alebo “minilátky taktiež nachádzajú použitie v tomto vynáleze. Miniprotilátky sú sFv polypeptidové reťazce zahrňujúce domény oligomerizácie a ich konce C oddelené od sFv oblastí zavesenia. Pack a kol., Biochem., 31, 1579-1584 (1992). Doména oligomerizácie zahŕňa samoasociačné α-helixy, napríklad leucínové zippery, ktoré sa dajú ďalej stabilizovať prídavnými disulfidickými väzbami. Oligomerizačná doména sa navrhuje tak, aby bola kompatibilná s vektorovým skladaním naprieč membránou, spôsobom uvažovaným pre skladanie polypeptidu in vivo na funkčný väzbový proteín. Všeobecne sa tvoria miniprotilátky s použitím rekombinantných metód dobre známych v odbore. Pozri napríklad Pack a kol., Biochem., 31_, 1579-1584 (1992), Cumber a koľ, J. Immunology, 149B, 120126 (1992).
Tvorba antigénov na použitie v imunoeseji HCV
Ako sa opisuje vyššie, tvoria sa molekuly podľa tohto vynálezu všeobecne rekombinantným spôsobom. Polynukleotidy kódujúce antigén HCV na použitie v tomto vynáleze sa teda dajú pripraviť štandardnými spôsobmi molekulárnej biológie. Napríklad polynukleotidové sekvencie kódujúce vyššie opísané molekuly sa dajú získať rekombinantnými spôsobmi, ako je skríning cDNA a genómové knižnice z buniek exprimujúcich gén alebo odvodením génu z vektora, ktorý ich obsahuje. Ďalej sa dá požadovaný gén izolovať priamo z molekúl vírusovej nukleovej kyseliny spôsobmi známymi v odbore, ako opisuje Houghton a kol., US patent č. 5 350 671. Daný gén sa dá taktiež získať synteticky namiesto klonovania. Molekuly sa dajú konštruovať s príslušnými kodónmi pre danú sekvenciu. Úplná sekvencia sa potom vytvorí z prekrývajúcich sa oligonukleotidov pripravených štandardnými spôsobmi a usporiadaných do úplnej kódovacej sekvencie. Pozri napríklad Edge, Náture,
048/B
292, 756 (1981), Nambair a kol., Science 223, 1299 (1984) a Jay a kol., J. Biol. Chem., 259, 6311 (1984).
Konkrétne nukleotidové sekvencie sa dajú teda získať z vektorov nesúcich požadované sekvencie alebo sa dajú pripraviť synteticky, úplne alebo čiastočne s použitím rôznych spôsobov prípravy oligonukleotidov známych v odbore, ako je mutagenéza smerovaná na miesto a polymerázová reťazová reakcia (PCR). Pozri napríklad Sambrook, vyššie. Najmä je jeden zo spôsobov získania nukleotidových sekvencií kódujúcich požadované sekvencie aneláciou komplementárnych súborov presahujúcich syntetické nukleotidy získané v konvenčnom automatickom polynukleotidovom syntetizátore s nasledujúcou ligáciou príslušnou DNA ligázou a amplifikáciou ligovanej nukleotidovej sekvencie prostredníctvom PVR. Pozri napríklad Jayaraman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 4084-4088 (1991).
Navyše sa dá v rámci tohto vynálezu použiť syntéza smerovaná na oligonukleotidy [Jones a kol., Náture, 54, 75-82 (1986)], mutagenézu vopred existujúcich nukleotidových oblastí smerovanú na oligonukleotidy [Riechmann a kol., Náture, 332, 323-327 (1988) a Verhoeyen a kol., Science, 239, 1534-1536 (1988)] a enzymatické zaplňovanie oligonukleotidov s medzerami použitím T4DNA polymerázy [Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 1002910033 (1989)] získaním molekúl vykazujúcich pozmenené alebo zvýšené schopnosti väzby antigénu a/alebo zníženú imunogenicitu.
Akonáhle sa kódovacie sekvencie pripravia alebo izolujú, môžu sa klonovať do akéhokoľvek vhodného vektora alebo replikónu. Mnohé klonovacie vektory sú známe pre toho, kto má skúsenosti v odbore, a výber príslušného klonovacieho vektora je vecou voľby. Vhodné vektory zahrňujú, avšak bez obmedzenia, plazmidy, fágy, transpozóny, kozmidy, chromozómy alebo vírusy schopné replikácie pri spojení s vhodnými kontrolnými prvkami.
Kódovacie sekvencie sa potom umiestnia pod kontrolu vhodnými kontrolnými prvkami v závislosti od systému použitého na expresiu. Kódovacia sekvencia sa dá teda umiestniť pod kontrolu promótora, väzbové miesta ribozómov (pre bakteriálnu expresiu) a prípadne operátora, takže sa daná
048/B sekvencia deoxyribonukleovej kyseliny prepisuje do ribonukleovej kyseliny vhodným transformantom. Kódovacia sekvencia môže a nemusí obsahovať signálny peptid alebo vedúcu sekvenciu, ktorá môže byť neskôr odstránená hostiteľom posttranslačným spracovaním. Pozri napríklad US patent č. 4 431
739,4 425 437,4 338 397. !
’ ·
Navyše ku kontrolným sekvenciám sa môže požadovať pridanie regulačných sekvencií umožňujúcich reguláciu expresie sekvencií vzhľadom na rast hostiteľskej bunky. Regulačné sekvencie sú známe tomu, kto má skúsenosti v odbore, a príklady zahŕňajú také sekvencie, ktoré spôsobujú expresiu génu pre zapnutie alebo vypnutie ako odpoveď na chemický alebo fyzikálny podnet vrátane prítomnosti regulačnej zlúčeniny. Vo vektore môžu byť taktiež prítomné ďalšie regulačné prvky. Napríklad enhancerové prvky sa dajú použiť na zvýšenie hladín expresie konštruktov. Príklady zahŕňajú skorý génový enhancer SV40 [Dijkema a koľ, EMBO J., 4, 761 (1985)], enhancer/promótor odvodený od LTR vírusu Rousovho sarkómu [Gorman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6777 (1982)] a prvky odvodené od ľudského CMV [Boshart a kol., Celí, 41_, 521, (1985)] ako prvky obsiahnuté v sekvencií CMV intrónu A (US patent č. 5 688 688). Expresná kazeta môže ďalej zahŕňať pôvod replikácie pre autonómnu replikáciu vo vhodnej hostiteľskej bunke, jeden alebo viac voliteľných markerov, jedno alebo viac reštrikčných miest, možnosť vysokého počtu kópií a silný promótor.
Expresný vektor sa konštruuje tak, aby boli dané kódovacie sekvencie uložené vo vektore s príslušnými regulačnými sekvenciami, a aby umiestnenie a orientácia kódovacích sekvencií vzhľadom na kódovacie sekvencie bolo také, že sa kódovacie sekvencie prepisujú “za kontroly” kontrolných sekvencií (t.j. RNA polymeráza, ktorá sa viaže na molekule RNA pri kontrolných sekvenciách prepisuje kódovaciu sekvenciu). Modifikácia sekvencií kódujúcich danú molekulu sa môže požadovať na tento účel. Napríklad môže byť v niektorých prípadoch nevyhnutné modifikovať sekvenciu takým spôsobom, aby sa pripájala ku kontrolným sekvenciám v príslušnej orientácii, t.j. udržovať čítací rámec. Kontrolné sekvencie a ďalšie regulačné sekvencie sa môžu pripájať ku
048/B kódovacej sekvencii pred vložením do vektora. Alternatívne sa dá kódovacia sekvencia klonovať priamo do expresného vektora, ktorý už obsahuje kontrolné sekvencie a príslušné reštrikčné miesto.
Ako sa opisuje vyššie, dá sa požadovať tvorba mutantov, alebo analógov daného antigénu. To platí najmä pre NS3/4a. Spôsoby, akými sa to dá dosiahnuť, sa opisujú napríklad v Dasmahapatra a kol., US patent č. 5 846 752 a Zhang a koľ, US patent č. 5 990 276. Mutanty alebo analógy tohto a ďalších HCV proteínov na použitie v esejách subjektu sa dajú pripraviť deléciou časti sekvencie kódujúcej daný polypeptid, inzerciou sekvencie a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov v sekvencii. Spôsoby modifikácie nukleotidových sekvencii, ako je mutagenéza smerovaná na miesto a podobne, sú dobre známe tomu, kto má skúsenosti v odbore. Pozri napríklad Sambrook a kol., vyššie, T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 448 (1985), Geisseisoder a kol., BioTechniques, 5, 786 (1987), Zoller a Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), Dalbie-McFarland a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79, 6409 (1982).
Molekuly sa dajú exprimovať širokým rozmedzím systémov vrátane hmyzích, cicavčích, bakteriálnych, vírusových a kvasinkových expresných systémov, ako sa opisujú v odbore.
Napríklad systémy expresie hmyzích buniek, ako sú bakulovírusové systémy, sú dobre známe tomu, kto má skúsenosti v odbore a opisujú sa napríklad v Summers a Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiály a spôsoby pre systémy expresie bakulovírus/hmyzia bunka sú komerčne dostupné v súprave, okrem iných od Invitrogen, San Diego CA (“MaxBac” kit). Podobne systémy expresie bakteriálnych a cicavčích buniek sú v odbore dobre známe a opisujú sa napríklad v Sambrook a kol. vyššie. Kvasinkové systémy expresií sú taktiež v odbore dobre známe a opisujú sa napríklad v Yeast Genetic Engineering (Barr a kol., redakcia, 1989) Butterworths, London.
048/B
Množstvo príslušných hostiteľských buniek na použitie s vyššie opísanými systémami je taktiež známe. Napríklad sú v odbore známe cicavčie bunkové línie a zahrňujú imortalizované bunkové línie od American Type Culture Collection (ATCC), ako sú avšak bez obmedzenia, bunky vaječníka čínskeho škrečka (CHO), HeLa bunky, obličkové bunky mláďat škrečkov (BHK), opičie obličkové bunky (COS), ľudské embryonálne obličkové bunky, bunky ľudského hepatocelulárneho karcinómu (napríklad Hep G2), bunky hovädzích obličiek Madin-Darby (“MDBK”) a ďalšie. Podobne bakteriálni hostitelia, ako je E. coli, Bacillus subtilis a Streptococcus spp., nájdu použitie s uvažovanými konštruktami expresie. Kvasinkový hostitelia použiteľní v tomto vynáleze zahrňujú okrem iných Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe a Yarrowia lipolytica. Hmyzie bunky na použitie s vektormi expresie bakulovírusu zahrňujú okrem iných Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda a Trichoplusia ni.
Molekuly nukleových kyselín zahrňujúce dané nukleotidové sekvencie, sa môžu stabilne integrovať do genómu hostiteľskej bunky alebo udržiavať na stabilnom epizomálnom elemente vo vhodnej hostiteľskej bunke s použitím rôznych spôsobov dodávania génu dobre známych v odbore. Pozri napríklad US patent č. 5 399 346.
V závislosti od systému expresie a zvoleného hostiteľa sa tieto molekuly získajú pestovaním hostiteľských buniek transformovaných vyššie opísaným vektorom expresie za podmienok, pri ktorých sa exprimuje proteín. Exprimovaný proteín sa potom izoluje z hostiteľských buniek a purifikuje. Ak systém expresie vylučuje proteín do média, dá sa produkt purifikovať priamo z média. Ak sa nevylučuje, môže sa izolovať z lyzátov buniek. Voľba vhodných rastových podmienok a spôsobov získavania spadá do oblasti skúseností v odbore.
048/B
Opisuje sa rekombinantná tvorba rôznych HCV antigénov. Pozri napríklad Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., J. Gastroent. Hepatol., 8, S33-39 (1993), Chien a koľ, medzinárodná publikácia č. WO 93/00365, D. Y. Chien, medzinárodná patentová prihláška č. WO 94/01778.
Imunodiagnostické eseje
Pripravené protilátky proti jadru a antigény NS3/4a opísané vyššie sa umiestnia na vhodný pevný nosič na použitie pri imunoeseji subjektov. Pevný nosič pre účely podľa tohto vynálezu môže byť akákoľvek látka, ktorá má nerozpustnú matricu a môže vykazovať tuhý alebo polotuhý povrch. Príklady pevných nosičov zahŕňajú, avšak bez obmedzenia, substráty, ako je nitrocelulóza (napríklad v membráne vo forme mikrotitračnej jamky), polyvinylchlorid (napríklad listy alebo mikrotitračné jamky), polystyrénový latex (napríklad guľôčky alebo mikrotitračné misky), polyvinylidínfluorid, diazotovaný papier, nylonové membrány, aktivované guľôčky, magnetické guľôčky a podobne. Konkrétne nosiče zahŕňajú dosky, pelety, disky, kapiláry a duté vlákna, ihly, kolíčky, tuhé vlákna, celulózové guľôčky, guľôčky z pórovitého skla, silikagély, polystyrénové guľôčky prípadne zosietené divinylbenzénom, kopolymérové guľôčky, polyakrylamidové guľôčky, latexové guľôčky, dimetylakrylamidové guľôčky prípadne zosietené N,N'-bisakryloyletyléndiamínom a sklenené častice potiahnuté hydrofóbnym polymérom.
V prípade požiadavky sa dajú molekuly pridávané k pevnému nosiču ľahko vybaviť funkčnými skupinami s vytvorením strénových alebo akrylátových zvyškov, čím sa umožňuje inkorporácia molekúl do polystyrénu, polyakrylátu alebo ďalších polymérov, ako je polyimid, polyakrylamid, polyetylén, polyvinyl, polydiacetylén, polyfenylén-vinylén, polypeptid, polysacharid, polysulfón, polypyrol, polyimidazol, polytiofén, polyéter, epoxidové polyméry, kremičité sklo, silikagél, siloxán, polyfosfát, hydrogél, agaróza, celulóza a podobne.
048/B
V jednom z prípadov sa pevný nosič nechá najprv reagovať s protilátkami proti jadru HCV a epitopom NS3/4a (tu spoločne nazývané “komponenty pevnej fázy) a prípadne s jednou alebo viacerými MEFA za vhodných podmienok väzby tak, aby sa molekuly dostatočne imobilizovali na nosiči. Niekedy sa dá imobilizácia nosiča zvýšiť najprv pripojením antigénu a/alebo protilátky k proteínu s lepšími väzbovými vlastnosťami voči tuhej fáze. Vhodné spojovacie proteíny zahŕňajú, avšak bez obmedzenia, molekuly, ako sú sérumalbumíny vrátane bovinného sérumalbumínu (BSA), keyhole limpet hemocyanínu, molekúl imunoglobulínu, tyroglobulínu, ovalbumínu a ďalších proteínov dobre známych v odbore. Dajú sa použiť ďalšie prostriedky pre väzbu molekúl na nosič vrátane polysacharidov, polymliečnych kyselín, polyglykolových kyselín, polymérnych aminokyselín, aminokyselinových kopolymérov a podobne. Tieto molekuly a spôsoby pripájania týchto molekúl k antigénom poznajú dobre tí, ktorí majú skúsenosti v odbore. Pozri napríklad M. A. Brinkley, Bioconjugate Chem., 3 2-13 (1992), Hashida a kol., J. Appl. Biochem., 6, 56-63 (1984) a Anjaneyulu a Staros, International J. of Peptide and Protein Res., 30, 117-124 (1987).
Po reakcii tuhého nosiča so zložkami tuhej fázy sa akékoľvek neimobilizované komponenty tuhej fázy odstránia z nosiča premytím a komponenty naviazané na nosič sa potom privedú do styku s biologickou vzorkou s podozrením na protilátky a antigény HCV (tu spoločne nazývané “molekuly ligandov) pri vhodných väzbových podmienkach. Po premytí na odstránenie nenaviazaných molekúl ligandu sa za vhodných podmienok väzby pridá druhá protilátka proti jadru zameraná proti inému epitopu ako protilátka proti jadru naviazaná na nosič. Pridaná protilátka proti jadru obsahuje detegovateľnú značku, ako sa opisuje vyššie a pôsobí v zmysle väzby akéhokoľvek antigénu jadra, ktorý môže byť prítomný vo vzorke, ktorý reagoval s protilátkou proti jadru naviazanou na nosič. Taktiež sa pridá jeden alebo viac antigénov, ktoré môžu reagovať s protilátkami prítomnými vo vzorke, a ktoré reagovali s epitopom NS3/4a. Ako sa opisuje vyššie, zvyčajne sa antigén odvodzuje od oblasti NS3 polyproteínu HCV a najmä od oblasti c33c HCV. Pozri Houghton a kol., US patent č. 5 350 671, Chien a kol., Proc. Natl. Acad.
048/B
Sci., 89, 10011-10015 (1989), medzinárodná prihláška č. WO 93/00365 US patentová prihláška prijatá do všeobecného vlastníctva č. 08/403 590 a 08/444 818 ohľadom opisu tejto oblasti a epitopov, ktoré sa od nej odvodzujú. Pridá sa taktiež značená protilátka zameraná proti tomuto antigénu. Táto protilátka bude teda viazať antigén, ktorý reagoval s protilátkami proti NS3 prítomnými vo vzorke. Na tento účel sa dá zaistiť výhodne epitop c33c ako spojenie medzi c33c a ľudskou superoxid dismutázou (hSOD) získanou rekombinantne, napríklad spôsobmi opísanými v Houghton a kol., US patent č 5 350 671. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie pre ľudskú SOD sú známe a opisujú sa v Hallewell a kol. US patent č. 5 710 033. Značená protilátka zameraná proti ľudskej SOD sa teda dá použiť na detekciu prítomnosti komplexov tvorených medzi epitopom NS3/4a, akýmikoľvek protilátkami vo vzorke reagujúcimi s týmto epitopom a polypeptidmi HCV, ktoré sa viažu na protilátku vo vzorke.
V prípade prítomnosti MEFA na pevnom nosiči sa dá k eseji taktiež pridať jeden alebo viac ďalších antigénov reaktívnych s protilátkami z biologickej vzorky, ktoré sú viazané na antigény prítomné na MEFA. Obzvlášť užitočný je v tejto súvislosti antigén odvodený od oblasti jadra HCV a najmä od c22 antigénu, ktorý zahŕňa 119 N terminálne aminokyseliny jadra HCV polyproteínu. Jeden konkrétny antigén odvodený od c22 je c22ks delta47L44W, ktorý obsahuje aminokyseliny Lysio až Sergg polyproteínu, rovnako tak ako deléciu Arg47 normálne prítomného a substitúciu Leu namiesto Trp v polohe 44. Podobne ako epitop c33c opísaný vyššie sa dá tento antigén získať ako spojenie s hSOD a rovnakou značenou protilátkou zameranou proti ľudskej SOD a dá sa použiť na detekciu prítomnosti komplexov tvorených medzi protilátkami prítomnými vo vzorke a epitopom NS3/4a a/alebo MEFA, ktorého komplexy sú taktiež viazané s antigénmi HCV (napríklad c33c a c22).
Konkrétnejšie sa dá použiť metóda ELISA, kde sú jamky mikrotitračnej dosky potiahnuté komponentmi pevnej fázy. Biologická vzorka obsahujúca molekuly ligandu alebo vzorka, u ktorej je podozrenie na obsah týchto molekúl, sa potom pridá do týchto potiahnutých jamiek. Po dobe inkubácie dostatočnej na umožnenie väzby molekuly ligandu s imobilizovanou zložkou pevnej fázy sa
048/B miska (misky) premyje (premyjú) na odstránenie neviazaných zvyškov a pridá sa detegovateľne značená molekula sekundárnej väzby (značená protilátka proti jadru), molekula obsahujúca NS3 epitop a protilátka zameraná proti molekule obsahujúcej NS3 epitop. Tieto molekuly sa nechajú reagovať s akýmkoľvek zachyteným antigénom a protilátkou vo vzorke, miska sa premyje a prítomnosť značených protilátok sa deteguje spôsobmi dobre známymi v odbore.
Vyššie opísané reakčné prostriedky pre esej vrátane pevného nosiča imunoeseje s naviazanými protilátkami a antigénmi, rovnako tak ako s protilátkami a antigénmi, ktoré majú reagovať so zachytenou vzorkou, sa dajú získať v súpravách s vhodnými pokynmi a ďalšími nevyhnutnými reakčnými prostriedkami na uskutočnenie imunoesejí podľa opisu vyššie. Táto súprava môže taktiež obsahovať, v závislosti od konkrétnej imunoeseje, vhodné značky a ďalšie balené chemikálie a látky (napríklad premývacie pufry a podobne). Štandardné imunoeseje, ako sú tie, ktoré sa opisujú vyššie, sa môžu uskutočniť s použitím týchto súprav.
III. Experimentálna časť
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujú príklady špecifických uskutočnení tohto vynálezu. Tieto príklady slúžia iba na ilustratívne účely a žiadnym spôsobom sa neuvažujú ako obmedzenie obsahu tohto vynálezu.
Je snahou zaistiť správnosť ohľadom použitých hodnôt (napríklad množstvo, teplota atď.), avšak je potrebné pripustiť určitú experimentálnu chybu a odchýlku.
048/B
Príklad 1
Kombinačná imunoesej HCV antigén/protilátka
Kombinačná imunoesej HCV antigén/protilátka, ktorá sa tu opisuje, sa porovnáva s inými esejami HCV na testovanie detekčných medzí sérokonverzie a porovnanie týchto medzí s medzami získanými v iných komerčne dostupných esejách nasledujúcim spôsobom.
A. Materiály a spôsoby uskutočnenia
Vzorky krvi
Používajú sa komerčne dostupné súbory vzoriek ľudskej krvi. Tieto súbory sa dajú získať napríklad od Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater MA (BBI), Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) a North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI). Dni v tabuľkách 5 a 6 sú dni, v ktorých boli vzorky krvi odobraté od osôb.
Monoklonálne protilátky
Monoklonálne protilátky c11-3, c11-7 a c11-14 sa získajú od Ortho Clinical Dagnostics, Raritan, New Jersey. Protilátky c11 -3 a c11-7 sú zamerané proti N-terminálnej časti jadra (aminokyseliny 10 až 53, číslované vzhľadom na polyproteín HCV1). Monoklonálna protilátka c11-14 je zameraná proti Cterminálnej časti jadra (aminokyseliny 120 až 130, číslované vzhľadom na HCV1 polyproteín). Protilátka c11-14 sa konjuguje s chrenovou peroxidázou (HRP) štandardnými spôsobmi.
Monoklonálna protilátka 5A-3 je protilátka proti SOD, zameraná proti aminokyselinám 1 až 65 SOD a pripravuje sa štandardnými spôsobmi. Táto protilátka sa konjuguje s HRP, ako sa opisuje vyššie.
048/B
B. Antigény
Antigén c33c (266 aminokyselín, aminokyseliny 1192 až 1457 HCV1 polyproteínu) sa exprimuje ako vnútorný SOD spojený polypeptid v E. coli spôsobmi opísanými na prípravu antigénu 5-1-1 (Choo a kol., Science, 244, 359-362 (1989). Rekombinantný antigén sa purifikuje podľa opisu v Chien a kol., Proc. Natl. Acad. Sci, 89, 10011-10015 (1989). Pozri Houghton a kol., US patent č. 5 350 671 ohľadom spôsobov prípravy SOD-c33c.
Epitop NS3/4a použitý v eseji je konformačný epitop majúci sekvenciu znázornenú na obrázku 3.
C. Spôsoby usporiadania imunoeseje
Esej Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) je komerčne dostupná a je to detekčná esej založená na protilátke. Táto esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.
ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (nazývaná Ortho 3.0 esej v tomto patente, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekčná esej založená na protilátke. Analýza sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.
Súprava Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) je komerčne dostupná súprava založená na PCR. Esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.
Súprava Gen-Probe TMA (San Diego, CA) je komerčne dostupná transkripčne sprostredkovaná amplifikačná súprava. Esej sa uskutočňuje podľa inštrukcií výrobcu.
Súprava pre antigénovú esej Ortho (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) je detekčná súprava založená na antigéne. Esej sa uskutočňuje podľa návodu výrobcu.
Kombinačná imunoesej HCV antigén subjektu/protilátka sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom. 4 mg/ml každej z purifikovaných monoklonálnych protilátok C11-7 a C11-3 v 1x fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS), pH 7,4, sa kombinuje a dobre premieša. K tomu istému poťahovaciemu
048/B si pufru sa pridá 90 ng rekombinantného antigénu NS3/4a. Roztok sa mieša pred potiahnutím počas 30 min. 200 μΙ vyššie opísaného roztoku sa pridá na jamku v 96-jamkových mikrotitračných miskách s médiom Costar (Corning, Inc.). Misky sa inkubujú pri teplote 15 až 30 °C počas 16 až 24 h. Premyjú sa dvakrát dH2O, potom 300 μΙ na jamku pufra na potiahnutie (1% bovinný sérumalbumín, BSA, 1x PBS) počas 1 h a stabilizačným pufrom 300 μΙ na jamku (1x PBS, 1% BSA, manitol, polyetylénglykol, želatína) v priebehu 1 h. Roztoky sa ašpirujú a sušia pri teplote 4 °C v lyofilizačnom zariadení počas 24 h. Misky sa naplnia desikačným prostriedkom.
Na uskutočnenie kombinačnej imunoeseje antigén/protilátka sa do misky pridá 100 μΙ obohateného pufra na cytolýzu [1 % N-laurylsarkozínu, 0,65 M chlorid sodný, 50 mg/ml IgG čistoty na technické použitie (Sigma, St. Louis, MO), 1 % BSA s modifikovanými tioskupinami (Bayer), 0,1 % kazeínu]. Potom sa pridá 100 mol vzorky. Ten sa inkubuje na trepacom zariadení pri teplote 40 °C počas 1 h. Misky sa premyjú šesťkrát 1 x PBS, 0,1 % Tween-20 na zariadení Ortho Plate Washer. 200 ml roztoku konjugátu [zriedenie 1:75 c1114-HRP s 250 ng/esej SOD-c33c antigénu plus zriedenie 1:5000 myšej protilátky proti SOD-HRP v HCV 3.0 zrieďovacom prostriedku pre vzorky (od ORTHO HCV verzia 3.0ELISATest System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) bez SOD extraktu, všetko sa pripraví 30 minút pred pridaním]. Roztok sa inkubuje 45 minút za trepania pri teplote 40 °C. Premyje sa šesťkrát ako vyššie a pridá sa 200 ml roztoku substrátu (1 tableta OPD/10 ml). Tableta OPD obsahuje dihydrochlorid o-fenyléndiamínu a peroxid vodíka pre tvorbu zafarbenia chrenovou peroxidázou a získa sa od Sigma, St. Louis, MO. Zmes sa inkubuje počas 30 minút pri teplote 15 až 30 °C v tme. Reakcia sa zastaví prídavkom 50 ml 4N roztoku kyseliny sírovej a misky sa odpočítajú pri vlnovej dĺžke 492 nm vzhľadom na absorbanciu pri 690 nm ako kontrole.
D. Výsledky
Výsledky rôznych esejí ukazujú tabuľky 5 a 6 znázorňujúce samostatné experimenty uskutočnené na vzorkách krvi exponovaných infekcii HCV.
045/B
Šrafované plochy ukazujú detekciu vírusu. Ako sa ukazuje vyššie, kombinačná esej antigén/protilátka deteguje sérokonverziu vo všetkých vzorkách, zatiaľ čo všetky ostatné eseje založené na protilátke a antigéne aspoň v jednom zo vzoriek nedegekujú sérokonverziu. Konkrétne žiadna z esejí založených na protilátke nedegekuje prítomnosť HCV infekcie v deň 22. Navyše esej založená na antigéne Ortho nie je schopná detegovať sérokonverziu od dní 85 ďalej.
Preto je na základe vyššie opísaných výsledkov zrejmé, že nová kombinačná esej protilátka/antigén znižuje počet falošne negatívnych výsledkov získaných s použitím iných konvenčných esejí založených na protilátke a antigéne.
048/B
Tabuľka 5 - Sérokonverzia HCV
Dni | Abbott PRISM | Ortho 3.0 | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho AG | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | ,,,,,:>5χ10|ΐ' | Bllilll | 11111 | llililll |
4 | 0,1 | 0,0 | IIS8S!i | lllllllll | ||
7 | 0,1 | 0,0 | ISIBIIIII | lllfiSillll | lliliils | |
13 | 0,3 | 0,1 | llllllllll | llllfilill | lllllllll | Illlíllllll |
18 | 0,4 | Bllilll | llililll! | llililll | 1IJ1(Í|B|||||||| | |
21 | lilllll | lll!!!·! | !«! | Ilifill | ililll | |
164 | lllllit | Illllliíi | lllllllll | |f|f|||||| | 0,11 | Sijjgjfii |
Tabuľka 6 - Sérokonverzia HCV
Dni | Abbott PRISM | Ortho 3.0 | Roche Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho AG | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | BLD | 0,11 | 0,5 | |
13 | 0,1 | 0,0 | Ijllilll | llllill! | ^llllillííll | |
20 | 0,1 | 0,0 | illlllllil | lllllllll | IM | |
22 | 0,3 | 0,0 | llililll | liliil! | ||
85 | llililll | BQR | 0,06 | Jlllgjlllligl | ||
131 | lillliäiillill | llilSlIlí | BQR | 0,09 | ||
135 | 1· | lliallll | 0,09 | |||
138 | Ililll | 1111·^^ | BLD | 0,08 | illlíllllll | |
146 | llllill | lllllllll | BLD | 0,11 | lllllllll! | |
152 | ^llllí | lllllllll | BQR | 0,07 |
048/B
Príklad 2
Tvorba konformačného epitopu NS3/4a zo substitúciami Thr na Pro a Ser na lle.
Konformačný epitop NS3/4a sa získa nasledujúcim spôsobom. Tento epitop má sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a líši sa od natívnej sekvencie by poskytlo klonovacie miesto 5' Hindlll nasledované sekvenciou ACAAACAAA, iniciátor ATG a kodóny HCV1a počínajúc aminokyselinou 1027 s pokračovaním k miestu Bgll aminokyseliny 1046, (b) reštrikčný fragment 683 bp Bg1 l-Clal (kódovacie aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI a (c) vektor pSP72 (Promega, Madison, Wl, GenBank/EMBL č. X65332, ktorý bol spracovaný Hindlll a Clal, defosforylovaný a podrobený gélovej purifikácii. Plazmid pAcHLTns3ns4aPI sa odvodzuje od pAcHLT, vektoru bakulovírusovej expresie komerčne dostupného od BD Pharmingen (San Diego, CA). Konkrétne sa pripraví vektor pAcHLT EcoRI-Pstl a nasledujúce fragmenty: EcoRI-Alwnl, 935 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1027 až 1336 genómu HCV-1, Älwnl-Sacll, 247bp zodpovedajúci aminokyselinám 1336 až 1419 genómu HSV-1, Hinfl-Bgll, 175 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1449 až 1509 genómu HSC-1, Bgll-Pstl, 619 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1510 až 1711 genómu HCV-1 plus transkripčný terminačný kodón. Sacll-Hinfl odvodený fragment 91 bp zodpovedajúci aminokyselinám 1420 až 1448 genómu HCV-1 a obsahujúci mutácie Pl (Thr-1428 mutovaný na Pro, Ser-1429 mutovaný na lle) sa liguje s fragmentom 175 bp Hinfl-Bgll a fragmentom 619 bp Bgll-Pstl
048/B opísaným vyššie a subklonuje do vektora pGEM-5Zf(+) spracovaného Sacll a Pstl. pGEM-5Zf(+) je komerčne dostupný vektor E. coli (Promega, Madison, Wl, GenBank/EMBL Accession Number X65308). Po transformácii kompetentných buniek HB101, sa uskutočňuje miniskríning jednotlivých klonov a verifikácia sekvencie, fragment 885 bp Sacll-Pstl z pGEM5. PI klonu 2 sa čistí gélovou purifikáciou. Tento fragment sa liguje s EcoRI-Alwnl 935 bp fragmentom, Alwnl Sacll 247 bp fragmentom a pAcHLT EcoRI-Pstl vektorom opísaným vyššie. Výsledný konštrukt sa nazýva pAcHLTns3ns4aPI.
Ligačná zmes opísaná vyššie sa transformuje do HB101 kompetentných buniek a nanesie na agarové dosky Luria obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu. Analýzy miniprep jednotlivých klonov vedú k identifikácii predpokladaných pozitívnych vzoriek, z ktorých sa dva amplifikujú. Plazmid DNA pre pSP72 1aHC, klony 1 a 2, sa pripravia s použitím súpravy Qiagen Maxiprep a sekvencuje.
Potom sa spolu ligujú nasledujúce fragmenty (a) 761 bp Hindlll-Clal z pSP721aHC 1 [pSP72.1aHC sa tvoria ligáciou spolu s nasledujúcimi: pSP72 spracovaný Hindlll a Clal, syntetické oligonukleotidy poskytujúce klonovacie miesto 5' Hindlll, nasledované sekvenciou ACAAACAAA, iniciačný kodón ATG a kodóny HCV1a, počínajúc aminokyselinou 1027 s pokračovaním k miestu Bglll pri aminokyseline 1046 a 683 bp Bglll-Clal reštrikčný fragment (kódovacie aminokyseliny 1046 až 1274) z pAcHLTns3ns4aPI], (b) 1353 bp BamHl-HindlII fragment pre kvasinkový hybridný promótor ADH2/GAPDH, (c) 1320 bp ClalSall fragment (kódujúci HCV1a aminokyseliny 1046 až 1711 s Thr 1428 mutovaným na Pro a Ser 1429 mutovaným na lle) z pAcHLTns3ns4aPI a (d) pBS24.1 kvasinkový expresný vektor, ktorý je spracovaný BamHi a Sali, defosforylovaný a čistený gélovou purifikáciou. Ligačná zmes sa transformuje na kompetentnú HV101 a nanáša na agarové dosky Luria obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu. Analýzy miniprep jednotlivých kolónií vedú k identifikácii klonov s očakávanou vloženou časťou 3446 bp BamHl-Sall, ktorá obsahuje ADH2/GAPDH promótor, iniciačný kodón ATG a HCV1a NS3/4a z aminokyselín 1027 až 1711 (znázornené ako aminokyseliny 1 až 686 na obrázkoch 4A až
048/B
4D) s Thr 1428 (poloha aminokyseliny 403 na obrázkoch 4A až 4D) mutovaným na Pro a Ser 1429 (poloha aminokyseliny 404 na obrázkoch 4A až 4D) mutovaným na lle. Konštrukt sa nazýva pd.HCVIa. ns3ns4aPI (pozri obrázok 5).
S. cérevisiae, kmeň AD3, sa transformuje pd.HCV1a.ns3ns4aPI a jednotlivé transformanty sa overia ohľadom expresie po vyčerpaní glukózy v médiu. Rekombinantný proteín sa exprimuje pri vysokých hladinách v kvasinkách ako sa deteguje farbením modrou Coomassie a overí imunoblotovacou analýzou s použitím polyklonálnej protilátky proti helikázovej doméne NS3.
Príklad 3
Purifikácia konformačného epitopu
Konformačný epitop NS3/4a sa purifikuje nasledujúcim spôsobom. Bunky S. cerevisiae opísané vyššie exprimujúce epitop NS3/4a sa zbierajú, ako sa opisuje vyššie. Bunky sa suspendujú v pufre pre cytolýzu (50 mM Trip pH 8,0, 150 mM chloridu sodného, 1 mM EDTA, 1 mM PMSD, 0,1 μΜ pepstatínu, 1 μΜ leupeptínu) a podrobia sa cytolýze v zariadení Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Švajčiarsko) alebo ekvivalentnej aparatúre s použitím sklenených guľôčok v pomere 1:1:1 bunky:pufor:sklenené guľôčky 0,5 mm. Lyzát sa centrifuguje pri 30100 g počas 30 min pri teplote 4 °C a peleta obsahujúca nerozpustnú proteínovú frakciu sa pridá k premývaciemu pufru (6 ml/g východiskovej hmotnosti pelety buniek) a zmes sa pomaly mieša nakláňaním pri teplote miestnosti počas 15 min. Premývací pufor obsahuje koncentrácie 50 mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, 0,3 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10 % glycerolu, 0,05 % oktylgukozidu, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 pM pepstatínu, 1 pM leupeptínu. Zvyšky z rozpadnutých buniek sa odstránia centrifugáciou pri 30100 g v priebehu 30 min pri teplote 4 °C. Supernatant sa odstráni do odpadu a peleta sa zachová.
048/B
Z pelety sa extrahuje proteín nasledujúcim spôsobom. Pridá sa 6 mg/g extrakčného pufra a zmes sa nakláňa pri teplote miestnosti počas 15 min. Extrakčný pufor obsahuje koncentráciu 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M chloridu sodného, 5 mM β-merkaptoetanolu, 10 % glycerolu, 1 mM EDTA, 1 mM PSMF, 0,1 μΜ pepstatínu, 1 μΜ leupeptínu. Táto zmes sa centrifuguje pri 30100 g počas 30 min pri teplote 4 °C. Supernatant sa zachová a pridá sa síran amónny do koncentrácie 17,5 % s použitím nasledujúceho vzorca: objem supernatantu (ml) násobený x % síranu amónneho / (1-x % síranu amónneho) = ml 4,1 M nasýteného síranu amónneho na pridanie k supernatantu. Síran amónny sa pridáva po kvapkách pri miešaní na ľade a roztok sa mieša na ľade počas 10 min. Roztok sa centrifuguje pri 17700 g počas 30 min pri teplote 4 °C a peleta sa zachová a ukladá pri teplote 2 až 8 °C počas až 48 h.
Peleta sa resuspenduje a aplikuje na kolónu Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) pri teplote 4 °C nasledujúcim spôsobom. Peleta sa resuspenduje v 6 ml Poly U ekvilibračného pufra na gram hmotnosti pelety. Ekvilibračný pufor obsahuje 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM chloridu sodného, 5 mM DTT (pridáva sa čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukozidu. Roztok sa mieša nakláňaním pri teplote 4 °C počas 15 min a centrifuguje pri 31000 g počas 30 min pri teplote 4 °C.
Pripraví sa stĺpec Poly U (1 ml živice na gram východiskovej hmotnosti pelety). Lineárny prietok je 60 cm/h a prietok náplne 133 % z 60 cm/h. Stĺpec sa upraví ekvilibračným pufrom a supernatant resuspendovanej amóniumsulfátovej pelety sa nanesie na ekvilibrovanú kolónu. Kolóna sa premyje na východiskovú hodnotu ekvilibračným pufrom a proteín sa eluuje stupňovou elúciou v nasledujúcom elučnom pufre Poly U: 25 mM HEPES pH 8,0, 1M chloridu sodného, 5 mM DTT (pridáva sa čerstvý), 10 % glycerolu, 1,2 % oktylglukozidu. Eluát z kolóny sa nanesie na SDS-PAGE (farbený Coomassie) a alikvóty sa zamrazia a uložia pri teplote -80 °C. Prítomnosť epitopu NS3/4a sa overí Westernovým blotovaním s použitím polyklonálnej protilátky zameranej proti NS3 proteázovej doméne a monoklonálnej protilátky proti 5-1-1 epitopu (HCV 4a).
048/B
Navyše sa monitoruje proteázová enzymatická aktivita v priebehu purifikácie nasledujúcim spôsobom. Peptid NS4A (KKGSWIVGRIVLSGKPAIIPKK) a vzorka obsahujúca konformačný epitop NS3/4a sa zriedi v 90 μΙ reakčného pufra (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 10 % glycerolu, 0,05 % n-dodecyl B-D-maltozidu, 5 mM DTT) a nechá sa miešať počas 30 min pri teplote miestnosti. 90 μΙ zmesi sa pridá do mikrotitračnej misky (Costar, Inc., Corning, NY) a pridá sa 10 μΙ HCV substrátu (AnaSpec, Inc., San Jose CA). Miska sa mieša a odpočíta sa čítacím zariadením Fluostar. Výsledky sa vyjadrujú ako relatívne fluorescenčné jednotky (RFU) za minútu.
Pri použití týchto spôsobov obsahuje produkt extrakcie 1 M roztokom chloridu sodného aktivitu 3,7 RFU/min, zrazenina síranu amónneho má aktivitu 7,5 RFU/min a produkt purifikácie Poly U má aktivitu 18,5 RFU/min.
Príklad 4
Kompetičné štúdie
Nasledujúce kompetičné štúdie sa uskutočňujú na vyhodnotenie, či konformačný epitop NS3/4a deteguje rôzne protilátky alebo rôzne antigény HCV. Konkrétne sa porovnáva antigén NS3/4a s antigénom c200 nasledujúcim spôsobom.
0,5 pg a 1,0 pg NS3/4a získaného, ako sa opisuje vyššie alebo c200 (Hepatology, 15, 19-25 (1992) od ORTHO HCV, Version 3.0 ELISA Test System, OrthoClinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) sa zmieša s 20 μΙ vzorky PHV914-5 (skorý sérokonverzný odber krvi získaný z krvi infikovaného jednotlivca) v celkovom objeme 220 μΙ (1 x PBS). Zmes sa inkubuje počas 1 h v mikrojamkách pri teplote 37 °C. Zmes sa prenesie na misky potiahnuté NS3/4a a inkubuje sa počas 1h pri teplote 37 °C. Misky sa premývajú a analyzujú nasledujúcim spôsobom.
048/B pg antigénu c200 sa pridá k 10 μΙ vzorky PHV914-5 v celkovom objeme zhruba 220 μΙ. Zmes sa inkubuje počas 1 h v mikrojamke pri teplote 37 °C a 200 μΙ sa prenesie na misku potiahnutú NS3/4a (100 ng/esej) a inkubuje sa počas 1 h pri teplote 37 °C. Misky sa premyjú päťkrát 1 x PBS, 0,1 % Tween-20. 200 μΙ roztoku konjugátu (podľa opisu vyššie) sa pridá a misky sa inkubujú a analyzujú. Kontroly obsahujúce PHV914-5 a 1 x PBS (bez antigénu) sa taktiež spracujú, ako sa opisuje vyššie.
Výsledky ukazuje tabuľka 7. Výsledky percenta inhibície v stĺpci 4 sa vypočítavajú ako hodnoty stĺpca 3 mínus (stĺpec 2 delený stĺpcom 3 krát 100). Ako je viditeľné, údaje ukazujú, že NS34a sa neutralizuje protilátkami skorej sérokonverzie a c200 v žiadnom prípade. Silný signál sa získa pri reakcii protilátok v člene súboru skorej sérokonverzie PHV914-5 c33c s poťahom NS34a na miske. Antigén c200 sa neneutralizuje týmito protilátkami. To je viditeľné vo vrchnej časti tabuľky 7. Keď sa NS34a zmieša so vzorkou PHV9145, neutralizuje sa a preto nie sú vo vzorke prítomné žiadne protilátky, ktoré by reagovali s NS34a naneseným na mikromiske. Údaje ukazujú, že NS34a môže detegovať inú skupinu protilátok ako c200.
048/B
Tabuľka 7 - Kompetičné štúdie ukazujú detekciu rôznych protilátok v súbore skorej sérokonverzie c33c antigénom NS34a v porovnaní s antigénom c200
1 | 2 | 3 | 4 | |
kontrola | ||||
C200 | + | PHV914-5 | 1xPBS | % inhibicie |
s | s | |||
1 pg | 1,450 | 1,645 | 12 | |
1 pg | 1,545 | 1,687 | 8 | |
0,5 pg | 1,557 | 1,913 | 19 | |
0,5 pg | 1,719 | 1,804 | 5 | |
NS3/4a | + | PHV914-5 | ||
s | s | |||
1 pg | 0,054 | 1,599 | 97 | |
1 pg | 0,037 | 1,677 | 98 | |
0,5 pg | 0,066 | 1,672 | 96 | |
0,5 pg | NA | 1,524 | NA |
Príklad 5
Štúdie stability konformačného epitopu NS3/4a
Na vyhodnotenie úlohy stability epitopu NS3/4a pri uskutočnení eseje sa uskutočňuje nasledujúca štúdia zisťujúca imunoreaktivitu NS3/4a proti času pri teplote miestnosti. Malé alikvóty zásobného roztoku NS3/4a sa ponechajú v pokoji pri teplote miestnosti a potom sa zamrazia v časových intervaloch udaných v tabuľke 8. Všetky fľaštičky sa súčasne potiahnu a testujú proti dvom NS3 sérokonverzným súborom.
Ako ukazuje tabuľka 8, zásobná NS3/4a nie je stabilná a imunoreaktivita s časom klesá. Navyše je pre imunoreaktivitu nevyhnutné udržať konformáciu NS3/4a.
048/B
Ďalšie stabilitné štúdie sa uskutočňujú nasledujúcim spôsobom. Dve konformačné monoklonálne protilátky pripravené proti NS3/4a štandardnými spôsobmi sa substituujú pre skoré sérokonverzné súbory proti HCV. Zásobné fľaštičky NS3/4a sa uchovávajú pri teplote miestnosti v časových intervaloch 3, 6 a 24 h. NS3/4a zo zamrazených fľaštičiek sa poťahuje pri 90 ng/ml a podrobí analýze spôsobom opísaným vyššie. Výsledky ukazujú, že tieto dve monoklonálne látky sú skutočne konformačné a ich reaktivita je citlivá na zachádzanie so zásobným antigénom NS3/4a pri teplote miestnosti. Reaktivita pozitívnej kontroly monoklonálnej protilátky sa nemení.
04B/B
Tabuľka 8
Kontrola | Referenčná | s/co | 0,0 | 0,0 | O | Xi·’ | R '.'.•.•.•h-.*. | iní: | 0,0 | 0,0 | 0,0 | r- o | O « | 5Í CO | :<3> 1*1 | 4,9 | |||||
52 | z | s/co | 0,0 | 0,0 | 0,0 | ô | CO o | 9‘0 | r- o’ | o o’ | O'O | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | o | 0,75 | |||
46 | s/co | 0,0 | 0,0 | 0,0 | o’ | 0,2 | 0,5 | m o’ | o o' | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | o' | m r~ | ||||
35,5 | — | s/co | 0,0 | 0,0 | o o | o” | 0,3 | 9‘0 | o ó | 0,0 | o o | o o | o o | 0,0 | 0,0 | o | 1,75 | ||||
29 | x | s/co | 0,0 | 0,0 | O'O | T“ o | 0,6 | BI | Ä o# | 0,0 | 0,0 | o o | 0,0 | 0,0 | 0,0 | v o” | r o | 1,88 | |||
21.4 | o | s/co | O'O | O'O | V O~ | 0,2 | 0,7 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | o ó | 0,0 | o | o‘ | 3,08 | |||||
to | Q | s/co | 0,0 | 0,0 | 0,3 | e •O;?: | Ä Ä | Ä M | R: | 0,0 | 0,0 | 0,0 | a | 0,4 | M· o | S'O | 0,7 | 4,14 | |||
o | < | s/co | 0,0 | o o | B | Ifl Oi | óo·: $tl | β Ä | o | 0,0 | o o | 0,0 | 0,5 | O·:?;; e | OB | itlllilli! | tlIlIÉlIlI | 8,75 | |||
Čas (h) | PHV 904-1 | PHV 904-2 | PHV 904-3 | PHV 904-4 | PHV 904-5 | PHV 904-6 | PHV 904-7 | PHV 914-1 | PHV 914-2 | PHV 914-3 | -ί 1 5Í cd > x CL | PHV 914-5 | CO 1 5Í CD > X Dl | PHV 914-7 | PHV 914-8 | Enzým | RFU/min |
048/B
Príklad 6
Imunoreaktivita konformačného epitopu NS3/4a v porovnaní s denaturovaným NS3/4a
Imunoreaktivita konformačného epitopu NS3/4a získaného podľa opisu vyššie sa porovnáva s NS3/4a denaturovaným prídavkom SDS do prípravku konformačného epitopu NS3/4a do konečnej koncentrácie 2 %. Denaturovaný NS3/4a a konformačný NS3/4a sa nanáša na mikrotitračné misky, ako sa opisuje vyššie. Na mikrotitračné misky sa taktiež nanáša antigén c200 [Hepatology, 15, 19-25 (1992) ORTHO, HCV Version 3,0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Dagnostics, Raritan, New Jersey], Antigén c200 sa používa na porovnanie a predpokladá sa, že je nekonformačný vzhľadom na prítomnosť redukujúceho činidla (DTT) a detergentu (SDS).
Imunoreaktivita sa testuje proti dvom súborom skorej HCV sérokonverzie, PHV 904 a PHV 914 (komerčne dostupné vzorky ľudskej krvi od Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Výsledky ukazuje tabuľka 9. Údaje ukazujú, že denaturovaná alebo linearizovaná forma NS3/4a (rovnako tak ako c200) nedeteguje skoré sérokonverzné súbory tak skoro ako konformačný epitop NS3/4a.
048/B
Tabuľka 9
NS3/4a proti denat. NS3/4a | ||||||||
*NS3/4a + 2 % SDS | ||||||||
NS3/4a | dNS3/4a* | c200 | NS3/4a | dNS3/4a* | c200 | |||
OD | OD | OD | s/co | s/co | s/co | |||
HCV | PHV 904-1 | 0,012 | 0,012 | 0,009 | 0,02 | 0,02 | 0,01 | |
Sérokonverzia | PHV 904-2 | 0,011 | 0,009 | 0,008 | 0,02 | 0,01 | 0,01 | |
PHV 904-3 | 1,124 | 0,071 | 0,045 | 1M8011 | 0,11 | 0,07 | ||
PHV 904-4 | 2,401 | 0,273 | 0,129 | 0,44 | 0,21 | |||
PHV 904-5 | 3,022 | 0,793 | 0,347 | llllll | illHI | 0,57 | ||
PHV 904-6 | 2,711 | 1,472 | 0,774 | llllli | s/ll2í37::li | 4,28 | ||
PHV 904-7 | 3,294 | 1,860 | 0,943 | :1β«Ι | llllli | |||
PHV 914-1 | 0,006 | 0,004 | 0,001 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | ||
PHV 914-2 | 0,005 | 0,004 | 0,002 | 0,01 | 0,01 | 0,00 | ||
PHV 914-3 | 0,098 | 0,003 | 0,001 | 0,16 | 0,00 | 0,00 | ||
PHV 914-4 | 1,118 | 0,006 | 0,004 | 0,01 | 0,01 | |||
PHV 914-5 | 2,035 | 0,044 | 0,022 | ľ :3,26.: / | 0,07 | 0,04 | ||
PHV 914-6 | 2,092 | 0,074 | 0,025 | 0,12 | 0,04 | |||
PHV 914-7 | 2,519 | 0,281 | 0,132 | 0,45 | 0,22 | |||
PHV 914-8 | 2,746 | 0,907 | 0,500 | 111· | 1111111 | 0,82 | ||
PHV 914-9 | 3,084 | 1,730 | 0,931 | |||$||| | lltOII | |||
HCV 3.0 | Neg. kont. | 0,023 | 0,024 | 0,008 | ||||
Kontroly | Neg. kont | 0,027 | 0,024 | 0,007 | ||||
Neg. kont. | 0,021 | 0,017 | 0,005 | |||||
priemer | 0,024 | 0,022 | 0,007 | |||||
odrezanie | 0,624 | 0,622 | 0,607 | |||||
Poz. kont. | 1,239 | 0,903 | 0,575 | 1,99 | 1,45 | 0,95 | ||
Poz. kont. | 1,445 | 0,916 | 0,614 | 2,32 | 1,47 | 1,01 |
Imunoreaktivita konformačného epitopu sa taktiež testuje s použitím monoklonálnych protilátok proti NS3/4a štandardnými spôsobmi. Tieto monoklonálne protilátky sa potom testujú v usporiadaní ELISA proti NS3/4a a
048/B denaturovanému NS3/4a a antigénu c200. Údaje ukazujú, že monoklonálne protilátky proti NS3/4a reagujú s NS3/4a a denaturovaným NS3/4a podobným spôsobom ako so sérokonverznými súbormi, ako ukazuje tabuľka 10. Tento výsledok taktiež poskytuje ďalší dôkaz toho, že NS3/4a je svojou povahou konformačný, ako sa môžu stať monoklonálne protilátky, ktoré sú svojou reaktivitou podobné skorým sérokonverzným súborom c33c.
Tabuľka 10
NS3/4a | Miska | |||
dNS3/4a | c200 | |||
Monoklonálny | OD | OD | OD | |
4B9/E3 | 1:100 | 1,820 | 0,616 | 0,369 |
1:1000 | 1,397 | 0,380 | 0,246 | |
1:10000 | 0,864 | 0,173 | 0,070 | |
1:20000 | 0,607 | 0,116 | 0,085 | |
5B7/D7 | 1:100 | 2,885 | 0,898 | 0,436 |
1:1000 | 2,866 | 0,541 | 0,267 | |
1:10000 | 1,672 | 0,215 | 0,086 | |
1:20000 | 1,053 | 0,124 | 0,059 | |
1A8/H2 | 1:100 | 1,020 | 0,169 | 0,080 |
1:1000 | 0,921 | 0,101 | 0,043 | |
1:10000 | 0,653 | 0,037 | 0,013 | |
1:20000 | 0,337 | 0,027 | 0,011 |
Opisujú sa nové eseje na detekciu HCV. Z opisu vyššie je potrebné si uvedomiť, že špecifické uskutočnenia tohto vynálezu tu slúžia iba na účely ilustrácie. Dajú sa uskutočniť rôzne modifikácie bez odchýlky od myšlienky a obsahu vynálezu, ktorý sa tu opisuje.
048/B
Claims (46)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripája aspoň jedna protilátka proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jeden izolovaný epitop HCV NS3/4a.
- 2. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú aspoň dve protilátky proti jadru HCV.
- 3. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 4. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 5. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že aspoň jednou protilátkou proti jadru je monoklonálna protilátka.
- 6. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a obsahuje sekvenciu aminokyselín znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
- 7. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje pripojený antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov.32 045/B
- 8. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
- 9. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a HCV NS3/4a konformačný epitop zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
- 10. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sú tieto dve protilátky proti jadru zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 11. Pevný nosič pre imunoeseje podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sú tieto dve protilátky proti jadru zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 12. Pevný nosič pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že sa k nemu pripájajú dve monoklonálne protilátky proti jadru vírusu C (HCV), HCV NS3/4a konformačný epitop zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D a antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov zahrňujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
- 13. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 1, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej32 045/B vzorke, viazať sa s aspoň jednou protilátkou proti jadru respektíve s epitopom NS3/4a, (c) pridanie pevného nosiča z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénom (ii), (d) detekciu komplexov vytvorených protilátkami a antigénmi, ak k ich tvorbe dochádza, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
- 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti Cterminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV.32 045/B
- 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že sa epitop c33c spája s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
- 18. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
- 19. Spôsob detekcie infekcie vírusom C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 2, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru, respektíve epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD,32 045/B (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
- 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že epitop NS3/4a je konformačný epitop a obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 4A až 4D.
- 21. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 9, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru respektíve konformačný epitop NS3/4a, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD, (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.32 045/B
- 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že tieto aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti Cterminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 24. Spôsob detekcie infekcie vírusom hepatitídy C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 7, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich HCV antigénom a protilátkam, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazať sa s aspoň jednou protilátkou proti jadru, epitopom NS3/4a a antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značená protilátká proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV ako aspoň jedna protilátka proti jadru viazaná na pevný nosič, (ii) prvého a druhého antigénu, ktorý reaguje s protilátkou HCV z biologickej vzorky reaktívnej s epitopom NS3/4a respektíve s antigénom vzniknutým spojením viacerých epitopov a (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s antigénmi (ii),32 045/B (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ dochádza k ich tvorbe, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
- 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že táto aspoň jednaI protilátka proti jadru je zameraná proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti Cterminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že aspoň jedna protilátka proti jadru je zameraná proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 27. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento prvý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c33c polyproteínu HCV.
- 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že tento epitop c33c je spojený s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
- 29. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento druhý antigén reagujúci s protilátkou HCV z biologickej vzorky obsahuje epitop z oblasti c22 polyproteínu HCV.32 045/B
- 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že epitop z oblasti c22 obsahuje aminokyseliny Lys10 až Ser99 polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1, kde sa tento epitop spája s aminokyselinovou sekvenciou ľudskej superoxid dismutázy (hSOD) a druhá detegovateľne značená protilátka je reaktívna s touto aminokyselinovou sekvenciou hSOD.
- 31. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že tento antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F.
- 32. Spôsob detekcie infekcie vírusom C (HCV) v biologickej vzorke, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:(a) zaistenie pevného nosiča pre imunoeseje podľa nároku 12, (b) spojenie biologickej vzorky s týmto pevným nosičom za podmienok umožňujúcich, aby sa HCV antigény a protilátky, pokiaľ sa vyskytujú v biologickej vzorke, viazali na aspoň dve protilátky proti jadru, konformačný epitop NS3/4a, respektíve antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov, (c) pridanie k pevnému nosiču z kroku (b) za podmienok tvorby komplexu (i) prvej detegovateľne značenej protilátky, kde táto prvá detegovateľne značená protilátka je detegovateľne značenou protilátkou proti jadru HCV, kde táto značená protilátka proti jadru sa zameriava proti inému epitopu jadra HCV, ako aspoň dve protilátky proti jadru viazané na pevný nosič, (ii) epitopu z oblasti c33c polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD a epitopu z oblasti c22 polyproteínu HCV pripojeného na aminokyselinovú sekvenciu hSOD (iii) druhej detegovateľne značenej protilátky, kde je táto druhá detegovateľne značená protilátka reaktívna s aminokyselinovou sekvenciou hSOD,32 045/B (d) detekciu komplexov vytvorených medzi protilátkami a antigénmi, pokiaľ sa tvoria, ako indikáciu infekcie HCV v biologickej vzorke.
- 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že tieto aspoň, dve protilátky proti jadru sa zameriavajú proti N-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV a prvá detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV sa zameriava proti C-terminálnej oblasti antigénu jadra HCV.
- 34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že aspoň dve protilátky proti jadru sú zamerané proti aminokyselinám 10 až 53 HCV, číslované vzhľadom na sekvenciu polyproteínu HCV1 a detegovateľne značená protilátka proti jadru HCV je zameraná proti aminokyselinám 120 až 130 HCV, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 35. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že epitop z oblasti c22 zahŕňa aminokyseliny Lysi0 až Sergg polyproteínu HCV s deléciou Arg47 a substitúciou Leu namiesto Trp v polohe 44, číslované vzhľadom na polyproteínovú sekvenciu HCV1.
- 36. Súprava na imunodiagnostické skúšky, vyznačujúca sa tým, že obsahuje pevný nosič pre imunoeseje podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 a pokyny na uskutočňovanie imunodiagnostickej skúšky.
- 37. Spôsob prípravy pevného nosiča, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:(a) zaistenie pevného nosiča, a (b) väzbu aspoň jednej protilátky proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a aspoň jedného izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.32 045/B
- 38. Spôsob prípravy pevného nosiča pre imunoeseje, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:(a) zaistenie pevného nosiča a (b) väzbu dvoch protilátok proti jadru vírusu hepatitídy C (HCV) a izolovaného HCV NS3/4a konformačného epitopu.
- 39. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 37 alebo 38, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa väzbu aspoň jedného antigénu vzniknutého spojením viacerých epitopov s pevným nosičom.
- 40. Antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F alebo aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 80 % sekvenčnou identitou s touto sekvenciou, ktorá reaguje špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke od jednotlivca infikovaného HCV.
- 41. Antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že tento antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 7A až 7F alebo aminokyselinovú sekvenciu s aspoň 90 % sekvenčnou identitou s touto sekvenciou, ktorá reaguje špecificky s protilátkami proti HCV prítomnými v biologickej vzorke od jednotlivca infikovaného HCV.
- 42. Antigén podľa nároku 40 vzniknutý spojením viacerých epitopov, vyznačujúci sa tým, že tento antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obrázkoch 5A až 5F.32 045/B
- 43. Polynukleotid obsahujúci kódovaciu sekvenciu pre antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 42.
- 44. Rekombinantný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:(a) polynukleotid podľa nároku 43, a (b) kontrolné elementy operabilne pripojené k tomuto nukleotidu, ktorými možno prepisovať a prekladať kódovaciu sekvenciu v hostiteľskej bunke.
- 45. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná rekombinantným vektorom podľa nároku 44.
- 46. Spôsob prípravy antigénu vzniknutého spojením viacerých epitopov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:(a) zaistenie populácie hostiteľských buniek podľa nároku 45 a (b) pestovanie tejto populácie buniek za podmienok, pri ktorých sa exprimuje antigén vzniknutý spojením viacerých epitopov kódovaný sekvenciou prítomnou v tomto rekombinantnom vektore.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US21208200P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
US28081101P | 2001-04-02 | 2001-04-02 | |
US28086701P | 2001-04-02 | 2001-04-02 | |
PCT/US2001/019369 WO2001096875A2 (en) | 2000-06-15 | 2001-06-14 | Hcv antigen/antibody combination assay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK17772002A3 true SK17772002A3 (sk) | 2003-10-07 |
SK287694B6 SK287694B6 (sk) | 2011-06-06 |
Family
ID=27395684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1777-2002A SK287694B6 (sk) | 2000-06-15 | 2001-06-14 | Pevný nosič imunoeseje a spôsob jeho prípravy, spôsob detekcie infekcie HIV a súprava na imunodiagnostickú skúšku |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6632601B2 (sk) |
EP (2) | EP1354204B2 (sk) |
JP (3) | JP4837229B2 (sk) |
CN (3) | CN1256591C (sk) |
AT (2) | ATE368221T1 (sk) |
AU (2) | AU2001272945A1 (sk) |
BG (1) | BG66205B1 (sk) |
BR (2) | BRPI0111682B8 (sk) |
CA (2) | CA2413003C (sk) |
CY (2) | CY1107537T1 (sk) |
CZ (1) | CZ304185B6 (sk) |
DE (2) | DE60125240T3 (sk) |
DK (2) | DK1354204T4 (sk) |
ES (2) | ES2288969T3 (sk) |
HK (2) | HK1061861A1 (sk) |
HU (1) | HU228873B1 (sk) |
MX (2) | MXPA02012424A (sk) |
NO (1) | NO332275B1 (sk) |
PL (1) | PL213363B1 (sk) |
PT (2) | PT1350105E (sk) |
SI (1) | SI1354204T2 (sk) |
SK (1) | SK287694B6 (sk) |
WO (2) | WO2001096875A2 (sk) |
Families Citing this family (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08510240A (ja) * | 1993-05-12 | 1996-10-29 | カイロン コーポレイション | C型肝炎ウイルスe2/ns1領域の保存モチーフ |
MXPA02012424A (es) * | 2000-06-15 | 2003-04-25 | Chiron Corp | Ensayo de combinacion de antigenos/anticuerpos para el virus de hepatitis c. |
US7491808B2 (en) * | 2000-06-15 | 2009-02-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HCV non-structural protein mutants and uses thereof |
ES2296803T3 (es) | 2000-08-17 | 2008-05-01 | Tripep Ab | Vacunas que contienen ribavirina. |
US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
DE10106295C1 (de) * | 2001-02-02 | 2002-08-22 | Gaifar German American Inst Fo | Protein mit mehreren Antigen-Epitop-Sequenzen, welches immobilisiert ist |
AR033448A1 (es) * | 2001-03-28 | 2003-12-17 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Prueba de combinacion antigeno-anticuerpo para hepatitis c para una deteccion temprana de la infeccion |
JP4353793B2 (ja) | 2001-06-26 | 2009-10-28 | アボット・ラボラトリーズ | Hcv抗原とhcv抗体との同時検出のための方法 |
US7101683B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
US7049060B2 (en) * | 2001-11-05 | 2006-05-23 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV anti-core monoclonal antibodies |
US7332269B2 (en) * | 2001-11-11 | 2008-02-19 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV core protein sequences |
FR2839555B1 (fr) | 2002-05-10 | 2007-07-27 | Bio Rad Pasteur | Procede de detection simultanee d'un antigene et d'un anticorps d'un microorganisme infectieux |
WO2004021871A2 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Chiron Corporation | Hcv assay |
US20040152070A1 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-05 | Shah Dinesh O. | Method of detection of HCV antibodies in combination assay or sole antibody assay |
WO2005019828A1 (en) | 2003-08-20 | 2005-03-03 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Epitope protection assay and method for detecting protein conformations |
EP1802778B1 (en) * | 2004-08-27 | 2011-10-05 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Hcv multiple epitope fusion antigens with modified proteolytic cleavage sites and uses thereof |
CN101287989B (zh) * | 2005-02-02 | 2016-04-13 | 菲鹏生物股份有限公司 | 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 |
AU2006335256B2 (en) | 2005-11-22 | 2012-10-18 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Norovirus and sapovirus antigens |
US7794692B2 (en) * | 2005-12-02 | 2010-09-14 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis |
US7887803B2 (en) | 2005-12-02 | 2011-02-15 | Amorfix Life Sciences | Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases |
WO2007098607A1 (en) | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Amorfix Life Sciences Ltd. | Methods and compositions to treat and detect misfolded-sod1 mediated diseases |
CN1908666B (zh) * | 2006-08-14 | 2010-05-12 | 武汉大学 | 一种检测乙肝核心抗体的双夹心法酶联免疫诊断试剂盒及应用 |
EP2185195A2 (en) | 2007-08-16 | 2010-05-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
EP2414839B1 (fr) * | 2009-03-30 | 2014-06-25 | Biomérieux | Support solide de détection du vhc |
US20100297607A1 (en) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Jian Zheng | Reagents For HCV Antigen-Antibody Combination Assays |
WO2011127316A1 (en) | 2010-04-07 | 2011-10-13 | Novartis Ag | Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle |
CN106771219B (zh) * | 2010-06-17 | 2020-04-07 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多表位测定 |
EP2591097A1 (en) | 2010-07-06 | 2013-05-15 | Novartis AG | Norovirus derived immunogenic compositions and methods |
WO2012006500A2 (en) * | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
JP5911889B2 (ja) * | 2011-01-13 | 2016-04-27 | オーソ−クリニカル・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッドOrtho−Clinical Diagnostics, Inc. | 梅毒トレポネーマトリプレット抗原 |
FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
CA2906417C (en) | 2013-03-14 | 2022-06-21 | Robert Ziemann | Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies |
MX362075B (es) | 2013-03-14 | 2019-01-07 | Abbott Lab | Ensayo de combinación de antígeno-anticuerpo del virus de la hepatitis c (vhc) y métodos y composiciones para usarlo. |
CN105209616A (zh) | 2013-03-14 | 2015-12-30 | 雅培制药有限公司 | 用于改进的抗体检测的hcv ns3重组抗原及其突变体 |
CN103630690B (zh) * | 2013-12-17 | 2014-08-20 | 朱之炜 | 丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其检测方法 |
CA2980718C (en) | 2015-03-27 | 2021-06-01 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Hcv ns4a/modified ns3 polypeptides and uses thereof |
EP3285806A4 (en) * | 2015-04-20 | 2019-03-27 | Qoolabs, Inc. | SINGLE DOMAIN CAMELID HCV ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF |
US11639933B2 (en) * | 2017-09-27 | 2023-05-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital affinity linkage assay |
CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
CN115838420B (zh) * | 2022-10-31 | 2023-05-05 | 北京科跃中楷生物技术有限公司 | 一种可溶性hcv重组蛋白的制备方法及其制备的抗体检测试剂 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5683864A (en) * | 1987-11-18 | 1997-11-04 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies |
GB2212511B (en) * | 1987-11-18 | 1992-01-22 | Chiron Corp | Hepatitis c virus |
US6171782B1 (en) | 1987-11-18 | 2001-01-09 | Chiron Corporation | Antibody compositions to HCV and uses thereof |
IE62868B1 (en) * | 1987-11-18 | 1995-03-08 | Chiron Corp | Hepatitis C virus |
US5350671A (en) | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
JP2730153B2 (ja) | 1989-03-16 | 1998-03-25 | 日本合成ゴム株式会社 | 熱可塑性樹脂組成物およびその製造方法 |
UA50829C2 (uk) * | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
RO113059B1 (ro) * | 1989-05-18 | 1998-03-30 | Chiron Corp | Polinucleotida capabila de hibridizare pe o secventa hcv, metoda pentru detectarea unei secvente hcv si procedeu de eliminare a hcv din sange |
US6194140B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
HU217025B (hu) * | 1990-04-04 | 1999-11-29 | Chiron Corp. | Hepatitis C vírus-(HCV) antigénkészítmények az anti-HCV-antitestek kimutatására immunoassay-kben |
US5712087A (en) | 1990-04-04 | 1998-01-27 | Chiron Corporation | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens |
CA2049679C (en) | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
PT97247B (pt) * | 1991-04-03 | 1997-10-31 | Chiron Corp | Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv |
HU227547B1 (en) | 1991-06-24 | 2011-08-29 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
UA39944C2 (uk) | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
WO1994025601A2 (en) * | 1993-04-27 | 1994-11-10 | N.V. Innogenetics S.A. | New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
US6001604A (en) * | 1993-12-29 | 1999-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents |
JP3217600B2 (ja) | 1994-07-12 | 2001-10-09 | 株式会社先端生命科学研究所 | 非a非b型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ |
DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
US5843752A (en) | 1995-05-12 | 1998-12-01 | Schering Corporation | Soluble active hepatitis C virus protease |
US5990276A (en) | 1996-05-10 | 1999-11-23 | Schering Corporation | Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease |
US6514731B1 (en) * | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
NZ333431A (en) * | 1996-05-24 | 2000-05-26 | Chiron Corp | Multiple epitope fusion protein selected from HIV or HCV, method of immunoassay and assay device |
EP0870830A3 (en) * | 1997-02-10 | 2004-02-25 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Chimera hepatitis C virus antigen |
EP1021719B1 (en) * | 1997-09-22 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method for detecting antibodies in a sample |
US7316905B1 (en) * | 1998-07-30 | 2008-01-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Method for measurement of hepatitis C virus |
MXPA02012424A (es) * | 2000-06-15 | 2003-04-25 | Chiron Corp | Ensayo de combinacion de antigenos/anticuerpos para el virus de hepatitis c. |
-
2001
- 2001-06-14 MX MXPA02012424A patent/MXPA02012424A/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 CN CNB018112439A patent/CN1256591C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 EP EP01952160A patent/EP1354204B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 SI SI200130682T patent/SI1354204T2/sl unknown
- 2001-06-14 DK DK01952160.8T patent/DK1354204T4/da active
- 2001-06-14 CN CNB2004100116606A patent/CN100463922C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 HU HU0500444A patent/HU228873B1/hu unknown
- 2001-06-14 ES ES01952156T patent/ES2288969T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CA CA2413003A patent/CA2413003C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 MX MXPA02012401A patent/MXPA02012401A/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 US US09/881,654 patent/US6632601B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019369 patent/WO2001096875A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 DK DK01952156T patent/DK1350105T3/da active
- 2001-06-14 DE DE60125240T patent/DE60125240T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 DE DE60129598T patent/DE60129598T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AU AU2001272945A patent/AU2001272945A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 EP EP01952156A patent/EP1350105B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 SK SK1777-2002A patent/SK287694B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 CN CNB018112463A patent/CN1214244C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 CZ CZ20024058A patent/CZ304185B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 US US09/881,239 patent/US6630298B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 AU AU2001272948A patent/AU2001272948A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-14 AT AT01952156T patent/ATE368221T1/de active
- 2001-06-14 CA CA2412035A patent/CA2412035C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 PL PL365599A patent/PL213363B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 BR BRPI0111682A patent/BRPI0111682B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 WO PCT/US2001/019156 patent/WO2001096870A2/en active IP Right Grant
- 2001-06-14 AT AT01952160T patent/ATE348337T1/de active
- 2001-06-14 JP JP2002510948A patent/JP4837229B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 PT PT01952156T patent/PT1350105E/pt unknown
- 2001-06-14 BR BRPI0111731A patent/BRPI0111731C1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-14 PT PT01952160T patent/PT1354204E/pt unknown
- 2001-06-14 JP JP2002510953A patent/JP4834279B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-14 ES ES01952160T patent/ES2277932T5/es not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-06 NO NO20025878A patent/NO332275B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-01-07 BG BG107441A patent/BG66205B1/bg unknown
- 2003-08-08 US US10/637,323 patent/US6797809B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-19 US US10/643,853 patent/US7319144B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-07-06 HK HK04104878A patent/HK1061861A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-07-26 US US10/899,715 patent/US7241879B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-12-21 HK HK05111793.1A patent/HK1079796A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-07 CY CY20071100319T patent/CY1107537T1/el unknown
- 2007-08-20 CY CY20071101092T patent/CY1106820T1/el unknown
-
2011
- 2011-03-28 JP JP2011071150A patent/JP2011125350A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7319144B2 (en) | Polynucleotides encoding a multiple epitope fusion antigen for use in an HCV antigen/antibody combination assay | |
EP1799868B1 (en) | Hcv non-structural protein mutants and uses thereof | |
EP1546414B1 (en) | Hcv assay | |
US10753939B2 (en) | HCV NS4a/modified NS3 polypeptides and uses thereof | |
RU2274863C2 (ru) | Определение комплекса hcv-антиген/антитело | |
EP1829891B1 (en) | Immunoassays for Anti-HCV Antibodies |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: GRIFOLS WORLDWIDE OPERATIONS LIMITED, DUBLIN 2, IE Free format text: FORMER OWNER: NOVARTIS VACCINES & DIAGNOSTICS, INC., EMERYVILLE, CA, US Effective date: 20161025 |
|
MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20210614 |