JP2013529894A - パルボウイルスb19のウイルス様粒子を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願において使用される科学用語および技術用語は全て、別段の指定がない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本出願において使用される場合、以下の単語または句は指定された意味を有する。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、それ自体が当然変動し得る、特に例示されている分子またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される用語法は、単に本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、限定的なものではないことも理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、別段の指定のない限り、その全てが当技術分野の通常の技術の範囲内である、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技法および免疫学の従来の方法を用いるであろう。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版、2000年);DNA Cloning:A Practical Approach、第I&II巻(D. Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N. Gait編、1984年);A Practical Guide to Molecular Cloning(1984年);およびFundamental Virology、第4版、2001年(B. N. FieldsおよびD. M. Knipe編);Handbook of Experimental Immunology、第I〜IV巻(D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編、Blackwell Scientific Publications);A. L. Lehninger、Biochemistry(Worth Publishers, Inc.、current edition);Methods In Enzymology(S. ColowickおよびN. Kaplan編、Academic Press, Inc.)を参照されたい。本明細書に記載のものと同様または同等であるいくつもの方法および材料を本発明の実施において用いることができるが、本明細書には、好ましい材料および方法が記載されている。さらに、本明細書において引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、上記のものであろうが下記のものであろうが、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。
本発明は、パルボウイルスVP1およびパルボウイルスVP2をコードする組換え核酸分子に関する。コードされるVP1およびVP2は、任意の所望のパルボウイルス、または任意の所望の組み合わせ由来であってよい。コードされるVP1およびVP2は、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。パルボウイルスは、パルボウイルスB19であることが最も好ましい。一部の態様では、VP1をコードする配列およびVP2をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。VP1をコードする配列およびVP2をコードする配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることが好ましい。
本発明は、本明細書に記載の、パルボウイルスVP1およびパルボウイルスVP2をコードする組換え核酸分子を含有する組換え宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、VP1をコードするヌクレオチド配列およびVP2をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、別々の核酸分子、例えば、別々のベクター上にある。これらの実施形態において、宿主細胞は、2つの異なる組換え核酸分子を含有する。宿主細胞は、実質的に等量の、VP1をコードするヌクレオチド配列とVP2をコードするヌクレオチド配列(例えば、実質的に等量の、2つの異なる組換え核酸)を含有することが好ましい。VP1をコードするヌクレオチド配列、VP2をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらのそれぞれの制御エレメントは、単一の核酸分子、例えば、バイシストロン性ベクターなどの成分であることがより好ましい。これらの実施形態において、宿主細胞は、複数のコピーで存在し得る単一の組換え核酸分子を含有する。
本発明は、VP1およびVP2を含有するパルボウイルス・VLPを生成するためのプロセスを提供する。VLPは、任意の所望のパルボウイルス由来のVP1およびVP2、または任意の所望の組み合わせを含有してよい。本明細書に記載の通り、VP1タンパク質およびVP2タンパク質は、天然に存在するパルボウイルスのVP1またはVP2と同じ、または実質的に同じアミノ酸配列を有してよい、あるいは、1もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を含有してよい。例えば、VP1を変異させて、そのホスホリパーゼ活性を不活化することができる。例えば、VP1のアミノ酸配列は、点変異(例えば、His153Ala)、またはWO06/032697、EP 1791858もしくはUS20070286870に記載の任意の変異を含有してよい。VP1およびVP2を含有するVLPは、ヒトに感染するパルボウイルス、すなわち、デペンドウイルス属、エリスロウイルス属、またはボカウイルス属のパルボウイルス由来であることが好ましい。VLPは、パルボウイルスB19 VP1およびパルボウイルスB19 VP2を含有することが最も好ましい。プロセスは、VP1およびVP2を生成する宿主細胞を、本明細書に記載の通り、組換え核酸にコードされるVP1タンパク質およびVP2タンパク質が生成され、VP1およびVP2を含有するVLPに集合させる条件下で維持するステップを含む。本発明の方法では、VP1は、宿主細胞により、VP2に対して低いアバンダンスで生成される。可溶性のVP1が可溶性のVP2よりも低いアバンダンスで生成されることが好ましい。場合によって、プロセスは、VLPを培養培地から、細胞溶解物もしくはホモジネートから、またはそれらの任意の組み合わせから単離または精製するステップをさらに含む。
本発明は、本明細書に記載の方法によって生成されるVP1およびVP2を含有するパルボウイルス・VLPを含む免疫原性組成物、および本明細書に記載のパルボウイルスのVP1およびVP2をコードする組換え核酸を含有する免疫原性組成物も提供する。
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ミョウバン(硫酸アルミニウムカリウム(AlK(SO4)2))、またはミョウバン誘導体、例えば、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合し、次いで、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて滴定し、沈殿させることによってin−situで形成されるミョウバン誘導体などである。
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、ビタミンAの酸化形態であり、部分的なビタミンA機能のみを持つレチノイン酸である。
一実施形態において、本発明において用いるためのアジュバントは、クエン酸緩衝液中の水中油エマルジョン(スクアレン)であるMF59C.1である。MF59C.1は、有効なアジュバントであり、パルボウイルスB19に対する高い力価の中和性抗体の生成を増強することが示されている(Ballouら、JID、187巻:675〜678頁(2003年))。
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した、鉱質を含有する組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などが挙げられる。本発明は、無機塩、例えば、水酸化物(例えば、オキシ水酸化物)、リン酸塩(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)、硫酸塩などを包含する[例えば、Vaccine Design...(1995年)Powell & Newman編ISBN:030644867X、Plenumの第8章および9章を参照されたい]、または、任意の適切な形態(例えば、ゲル、結晶、非晶質など)を取り、吸着が好ましい化合物と、異なる鉱質化合物との混合物を包含する。鉱質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる。
本発明においてアジュバントとして用いるのに適した油エマルジョン組成物としては、MF59などのスクアレン−水エマルジョン[Vaccine Design...(1995年)Powell & Newman編、ISBN:030644867X、Plenumの第10章](マイクロフルダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方した5%スクアレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85)が挙げられる。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)も用いることができる。
・スクアレンとTween80とSpan85とのサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの体積での組成は、約5%スクアレン、約0.5%ポリソルベート80および約0.5%Span85であり得る。重量の点において、これらの比率は、4.3%スクアレン、0.5%ポリソルベート80および0.48%Span85になる。このアジュバントは、「MF59」として公知である。MF59エマルジョンは、有利には、シトレートイオン、例えば10mMクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見いだされるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Quillaia saponaria Molinaの木の樹皮由来のサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Smilax ornata(サルサパリラ(sarsaprilla))、Gypsophilla paniculata(ブライダルベール(brides veil))、およびSaponaria officianalis(ソープルート(soap root))から商業的に取得可能である。サポニンアジュバント処方物としては、QS21などの精製された処方物、ならびにISCOMなどの脂質処方物が挙げられる。QS21は、Stimulon(商標)として販売されている。
ビロソームおよびウイルス様粒子(VLP)も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、場合によってリン脂質と組み合わされる、またはリン脂質と一緒に処方される、ウイルス由来の1または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製的であり、概して、いかなる天然のウイルスのゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質を、組換え生成することができる、またはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはVLPにおいて用いるのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス(例えば、HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルス(例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質など)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(例えば、コートタンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(例えば、レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)に由来するタンパク質が挙げられる。
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖(LPS)の無毒性の誘導体など、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびADP−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を包含する。
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキンなど(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12など)(WO99/40936およびWO99/44636)、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節物質はIL−12である。
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア(Singhら)(2001年)J Cont Release 70巻:267〜276頁)、または粘膜接着剤、例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体などが挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる(WO99/27960)。
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ(ラクチド−co−グリコリド)を用いて、生分解性かつ無毒性の材料(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど)から形成された微小粒子(すなわち、直径約100nm〜約150μm、より好ましくは直径約200nm〜約30μm、最も好ましくは直径約500nm〜約10μmの粒子)が好ましく、場合によって、それを、負に荷電した表面を有するように処理する(例えば、SDSを用いて)または正に荷電した表面を有するように処理する(例えば、CTABなどの陽イオン洗浄剤を用いて)。
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、US6,090,406、US5,916,588およびEP A0626169に記載されている。
本発明において用いるのに適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル(WO99/52549)を包含する。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(WO01/21207)ならびに少なくとも1つの追加的な非イオン性界面活性剤、例えば、オクトキシノールなどと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤(WO01/21152)が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン(polyoxytheylene)−8−ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。
PCPP処方物は、例えば、Andrianovら(1998年)Biomaterials 19巻:109〜115頁およびPayneら(1998年)Adv Drug Delivery Review 31巻:185〜196頁に記載されている
ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル(normuramyl)−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド(Imiquamod)およびその同族化合物(例えば、「レシキモド(Resiquimod)3M」)が挙げられ、Stanley(2002年)Clin Exp Dermatol 27巻:571〜577頁およびJones(2003年)Curr Opin Investig Drugs 4巻:214〜218頁においてさらに記載されている。
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与されるであろう。直接的な送達は、例えば、シリンジおよび皮下針を用いた非経口的な注射(例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔(interstitial space)へ)、または粘膜を通じて、例えば、直腸投与、経口投与(例えば、錠剤、噴霧)、膣への投与、局所投与、経皮(transdermal)投与(例えば、WO99/27961を参照されたい)または経皮(transcutaneous)投与(例えば、WO02/074244およびWO02/064162を参照されたい)、鼻腔内投与(例えば、WO03/028760を参照されたい)、眼への投与、耳への投与、肺への投与または他の粘膜投与などによって実現することができる。免疫原性組成物も、皮膚の表面に直接移すことによって局所的に投与してもよい。局所投与は、いかなるデバイスも利用することなく、または包帯または包帯様デバイスを利用して裸の皮膚を免疫原性組成物と接触させることによって実現することができる(例えば、米国特許第6,348,450号を参照されたい)。
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールに従ってもよい。多回用量は、一次免疫化スケジュールおよび/または追加免疫化スケジュールで用いることができる。多回用量スケジュールにおいて、様々な用量を、同じまたは異なる経路、例えば非経口的な初回刺激および粘膜での追加刺激、粘膜での初回刺激および非経口的な追加刺激などにより与えてよい。例えば、多回用量スケジュールは、初回刺激、その後の2回の追加刺激を含んでよい。初回刺激用量および/または追加刺激用量は、アジュバントと共投与することが好ましいであろう。
治療的な処置の効力を評価する1つの方式は、本発明の組成物を投与した後に、感染をモニターすることを伴う。予防的処置の効力を評価する1つの方式は、組成物を投与した後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答をモニターすることを伴う。
本発明は、医薬品として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬品は、哺乳動物における免疫応答を生じさせることができること(すなわち、免疫原性組成物である)が好ましく、ワクチンであることがより好ましい。本発明は、哺乳動物における免疫応答を上昇させるための医薬品の製造における本発明の組成物の使用も提供する。医薬品は、ワクチンであることが好ましい。ワクチンを使用して、小児における伝染性紅斑、赤血球悪液質の患者における一過性の骨髄無形成クリーゼ、通常鎌状赤血球貧血、溶血性貧血または遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全および免疫不全の患者における貧血、免疫抑制された個体における持続感染、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における持続性の、時には致死的な血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化および妊娠中の女性における胎児水腫または自然流産を予防および/または処置することが好ましい。
本発明は、本発明の免疫原性組成物の1または複数の容器を含むキットも提供する。組成物は、個々の抗原がそうであり得るように、液体の形態であってよい、または凍結乾燥されてよい。組成物用の適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスティックを含めた種々の材料から形成されていてよい。容器は、滅菌アクセスポートを有してよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってよい)。
酵母におけるパルボウイルスB19の発現
パルボウイルスB19のVP2遺伝子およびVP1遺伝子を、以下の通り特徴づけられるS.cerevisiae AD3において同時発現させた:MATa、leu2、ura3−52、prb1−1122、pep4−3、prc1−407,gal2、[cir○]::pDM15(pGAP/ADR1::G418R),::Yip5ΔleuAD。
パルボウイルスB19精製プロトコール
ウシ血清アルブミン(alumin)(BSA)を用いたBCAタンパク質アッセイ(Pierce)を、タンパク質の濃度を決定するための標準の参照として使用した。一部の場合では、BCAの結果で較正することによって示される通り1吸光度単位=1mg/mlと仮定して、280nmにおけるUV吸光度を用いた。
38mLのポリアロマーチューブ(Seton Scientific)中にスクロース棚を調製した。スクロース棚は2つの層:20%スクロース5mLおよび70%スクロース26mLを有する。清澄化した溶解物6mLを、スクロースの最上部に穏やかに加えた。このステップは、最大8mLの清澄化した溶解物を用いて実施し、2mL未満の70%スクロースを使用した。スクロース棚を、4℃、JS−24ローター内で100,000×gで4時間遠心分離した。
VP1/VP2特異的な抗体(Santa Cruz BioTech カタログ番号sc−71852)を用いたウェスタン分析により、スクロース棚から最大量のタンパク質を含有する画分を同定した。これらの画分をプールした、または別々に保持した(特定の試行に基づく)。これらの画分を、緩衝液A(25mMのトリス,100mMのNaCl、pH7.5)で1:4希釈し、予め洗浄しかつ予め平衡化したカラムに6cm/時間でローディングした。ローディングされたタンパク質の中になお存在するスクロースにより、タンパク質がより速い流速(すなわち、60cm/時間)でカラムに結合することが部分的に妨げられた。NaCl勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出した。クロマトグラフィーを以下の通り実行した:
緩衝液A:25mMのトリス、100mMのNaCl、pH7.5;緩衝液B:25mMのトリス、2MのNaCl、pH7.5;洗浄:緩衝液Aを用いて5CV;勾配:0〜40%のB(10CV);洗浄:100%のB、5CV;流速:0.2ml/min。分画:溶出の間に1ml。約5%のBから約10%のBまでプール。11.6。
緩衝液の交換および濃縮。
パルボウイルスB19・VLPの分析
VLPの純度
クーマシーおよびウェスタン分析によってVLPの純度が示された。クーマシー染色したSDS−PAGEおよび対応するウェスタンの例が図16に示されている
VLPの同定
2つの抗体を用いてVLPの同定を行った。1つの抗体(Santa Cruz BioTech カタログ番号sc−71852)は、共通のVP2領域を認識し、よって、VP1とVP2の両方を同定することができる(α−VP1/VP2抗体)。第2の抗体(USBio P3113−81D)は、VP1に独特の領域だけを認識し、よって、VP1のみを同定することができる。完全に煮沸されていない画分が還元されると、VP2の二量体がなお目に見える。予測通り、α−VP1抗体で膜をプローブすると、VP2バンドは存在しないが、同じVP1バンドが目に見える。
VLPに集合しなかったタンパク質を除去するためにスクロース棚を用いてVLPを選択した。精製されたVLPを、単量体の含有量について、SEC、native PAGE、DLSおよび電子顕微鏡法を用いて分析した。結果により、VLPが、VLPを代表する単一の高分子量種で>99%であることが確認された(図17)。
VLPは、MF59中および25mMのトリス、100mMのNaCl緩衝液中の両方で、4℃で少なくとも3カ月安定に見えた。これは、クーマシー染色したSDS−PAGE、パルボウイルスに特異的な抗体を用いたウェスタン、native PAGEおよび電子顕微鏡法を用いて検査した。さらに、VLPは、0.05%SDSを用いて分裂させて単量体にすることができたが、0.5%Triton X−100ではできなかった。
タンパク質を、Charles River Laboratories Endosafe−PTSシステムを用いて内毒素について分析した。これは、内毒素のLimulus Amebocyte Lysate検出を用いるカートリッジに基づくシステムである(製品コードPTS20)。アッセイを、Endotoxin Specific Buffer(製品コードBG120)を製造者の指示通りに用いて実施して、二次的な活性化経路を通じてβ−グルカン(酵母細胞壁の成分)によって生じる偽のバックラウンドシグナルを減少させた。複数のアッセイからの結果により、材料の用量5μg当たりの範囲が0.036EU/用量から検出可能限界の0.013EU/用量を下回るまでであろうことが実証された。
マウスの免疫原性データ
Balb/cマウス(n=10)において免疫原性を試験した。免疫前の血清を、第1の免疫化の前日に取得した。免疫化は、異なるアジュバント(リン酸緩衝生理食塩水、ミョウバン、またはMF59)とともにさまざまな濃度(0.05μg、0.5μgまたは5μg)のIMによって施した。20日目にマウスから採血し、21日目にマウスに第2の免疫化を受けさせた。第2の免疫化の3週間後(3wp2、41日目)にマウスから再度採血し、42日目にマウスに第3の免疫化を施した。56日目(2wp3−第2の2週間後)および84日目(6wp3−第3の6週間後)に血清試料を再度取得した。
細胞に基づく中和
中和アッセイは、qRT−PCRに基づき、ウイルス基質としてCD36+およびおよびグロボシド+(主要な細胞受容体)である赤血球前駆細胞を用いた。アッセイにより、感染中にのみ存在するRNA配列の存在または非存在を測定した。中和力価を決定するために、血清を、ウイルスと一緒にプレインキュベートした後、細胞と混合した。48時間後に細胞を回収し感染についてプローブした。免疫化したマウスについての最も高い中和力価は、6×104であった。このアッセイで検査した回復期のヒト血清は、1×104の中和力価(IC50)を有した。
Claims (35)
- パルボウイルスのウイルス様粒子(VLP)を生成する方法であって、(a)第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸分子を含有する宿主細胞を提供するステップと、(b)前記VP1タンパク質およびVP2タンパク質が発現され、VLPに集合する条件下で前記宿主細胞を維持するステップとを包含する、方法。
- VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで生成される、請求項1に記載の方法。
- VP1およびVP2を含有するVLPが生成される、請求項2に記載の方法。
- 前記組換え核酸分子がバイシストロン性ベクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の制御エレメントが前記第2の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の制御エレメントが、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第2の制御エレメントが、ADH2/GAPDHプロモーター(配列番号19)である、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞を、VP1およびVP2が生成され、これらのタンパク質がVLPに集合するのに適した培養条件下で維持する、請求項1に記載の方法。
- 前記VLPを単離するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記VLPを、宿主細胞の馴化培地、宿主細胞の溶解物、宿主細胞のホモジネート、またはそれらの組み合わせから単離する、請求項10に記載の方法。
- 単離された前記VLPをさらに精製する、請求項11に記載の方法。
- 単離された前記VLPを、スクロースクッション、スクロース勾配遠心分離、クロマトグラフィー法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される精製方法を用いてさらに精製する、請求項12に記載の方法。
- 請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子(VLP)。
- 請求項14に記載のパルボウイルス・VLPを含む免疫原性組成物。
- 第1の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP1をコードするヌクレオチド配列と、第2の制御エレメントに作動可能に連結しているパルボウイルスVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸であって、適切な宿主細胞内にVP1をコードする前記配列とVP2をコードする前記配列とが同量存在する場合、VP1が、VP2よりも低いアバンダンスで発現される、組換え核酸。
- 前記第1の制御エレメントが弱いプロモーターであり、前記第2の制御エレメントが強力なプロモーターである、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記第1の制御エレメントが前記第2の制御エレメントの改変体であり、前記改変体が、VP2と比較してVP1の生成を転写的に、翻訳的に、または転写的かつ翻訳的に減少させる修飾を含む、請求項17に記載の組換え核酸。
- 前記修飾が、VP1をコードする核酸の上流のTATAボックスの少なくとも一部分の欠失、VP1をコードする核酸の上流の接合部位の欠失、VP1をコードする核酸の上流の転写開始部位もしくは転写終止部位の導入、またはそれらの組み合わせを含む、請求項18に記載の組換え核酸。
- 前記第2の制御エレメントが、ADH2/GAPDHプロモーター(配列番号19)である、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記核酸が、DNAまたはRNAの形態であり、かつ一本鎖または二本鎖のいずれかである、請求項20に記載の組換え核酸。
- プラスミドである、請求項21に記載の組換え核酸。
- 前記プラスミドが検出可能なマーカーを含む、請求項22に記載の組換え核酸。
- 請求項16から23までのいずれか一項に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
- 前記組換え核酸が前記宿主細胞のゲノムに組み込まれているか、または染色体外のエレメントに保有されている、請求項24に記載の宿主細胞。
- 酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、トリの細胞、細菌、テトラヒメナの細胞またはそれらの組み合わせである、請求項25に記載の宿主細胞。
- 請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法に従って生成される、VP1およびVP2を含有するパルボウイルスのウイルス様粒子(VLP)を、診断用キット内の抗原として用いる方法。
- 生物学的試料中の抗パルボウイルス抗体を検出する方法であって、個体から得られた生物学的試料を準備するステップと、前記試料を、請求項1から13までのいずれか一項に記載のパルボウイルス・VLPと組み合わせるステップと、抗体−VLP複合体を検出するステップとを包含し、抗体−VLP複合体が存在することにより、抗パルボウイルス抗体が前記生物学的試料中に存在することが示される、方法。
- 前記生物学的試料が血液試料または血清試料である、請求項28に記載の方法。
- 請求項16に記載の組換え核酸を含む免疫原性組成物を、哺乳動物における免疫応答を上昇させることができる医薬品として使用する方法。
- 前記医薬品を使用して、小児における伝染性紅斑、鎌状赤血球貧血、溶血性貧血、遺伝性球状赤血球症、慢性赤血球形成不全、免疫不全の患者における貧血、成人における持続性の関節症、免疫無防備状態の患者における血球減少症、マラリア原虫に同時感染している間の貧血の悪化、マラリアにおける貧血の悪化、妊娠中の女性における胎児水腫および自然流産からなる群から選択される状態を処置または予防する、請求項28に記載の方法。
- パルボウイルスVP1および/またはVP2に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、有効量の請求項16から23までのいずれか一項に記載の組換え核酸を投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。
- 前記組換え核酸を筋肉内注射によって投与する、請求項33に記載の方法。
- パルボウイルスVP1および/またはVP2に対する免疫応答を誘導する方法であって、個体に、請求項14に記載のウイルス様粒子または請求項15に記載の免疫原性組成物を有効量で投与し、それによって、免疫応答を誘導するステップを包含する、方法。
- 前記ウイルス様または免疫原性組成物を筋肉内注射によって投与する、請求項34に記載の方法。
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