PT1791858E - PROTENA DE CáPSIDE VP1 MODIFICADA DO PARVOVRUS B19 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Proteína de cápside VPl modificada do parvovírus B19" 0 presente invento refere-se a proteínas e partículas da cápside do parvovírus B19 modificadas, às suas utilizações e à preparação de medicamentos, incluindo vacinas, para o tratamento de doenças associadas ao parvovírus BI9. 0 parvovírus B19 foi descoberto em 1975 como sendo a causa de infecções sistémicas nos adultos, que ou eram assintomáticas ou apresentavam sintomas moderados não específicos como dor de cabeça, pirexia, mal-estar, fadiga e mialgia (1, 2, 3) . Em 1984, o parvovírus B19 foi identificado como sendo o agente etiológico do eritema infeccioso, também conhecido como quinta doença (4). Embora esteja distribuído por todo o mundo, o vírus encontra-se restringido exclusivamente a hospedeiros humanos. No que diz respeito a diferenças regionais, cerca de 40 a 60 porcento da população apresenta anticorpos contra as proteínas virais aos 20 anos de idade. A infecção é endémica, embora atinja surtos regionais durante o final do Inverno e a Primavera. 0 vírus é muito estável. Em geral, é transmitido oralmente a partir de indivíduos com a infecção aguda (5). Além desta via de infecção principal, o vírus poderá ser transmitido através do sangue e de produtos derivados do sangue administrados parentericamente e verticalmente da mãe para o feto (6, 7, 8, 9). A replicação produtiva em grande escala do parvovírus B19 tem lugar nas células progenitoras eritróides (10). Assim, durante a infecção aguda, a carga virai é extremamente elevada e poderão estar presentes até 1013 partículas e/ou genomas virais por mililitro de sangue periférico. O vírus liga-se às células precursoras dos eritrócitos, utilizando o antigénio de grupo sanguíneo P (globosídeo) como receptor celular para a adsorção (11). Após a infecção e a eliminação do sangue periférico, demonstrou-se que estavam presentes genomas virais em células da medula óssea e da pele, em células sinoviais, em tecidos do fígado e no endotélio do miocárdio (12, 13, 14, 15, 16, 17). Actualmente, não é claro se estas células produzem proteínas virais e/ou partículas B19 infecciosas e se o genoma virai pode ser reactivado para uma replicação produtiva. 2

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Em geral, a infecção por parvovírus B19 não apresenta sintomas clínicos ou poderá resultar numa doença análoga a uma gripe. As crianças, em particular, poderão sofrer de eritema infeccioso (quinta doença), uma erupção autolimitante (18, 19, 20) . O parvovírus B19 foi adicionalmente associado a um espectro amplo de doenças (Tabela 1) : a anemia transitória, a leucocitopenia ou a trombocitopenia poderão ocorrer sem necessidade de qualquer terapia. Contudo, em alguns doentes, observou-se trombocitopenia grave, aplasia pura dos glóbulos vermelhos ou pancitopenia. Além destas sequelas hematológicas da infecção aguda, é possível uma ocorrência ocasional de hepatite, miocardite, miosite, lesão pulmonar aguda e doença neurológica (12, 21, 22, 23, 24) . Nas mulheres grávidas, o aborto espontâneo, a hidrópsia fetal não imune e a morte fetal intra-uterina têm sido referidos como manifestações clínicas (25, 26) . Nas grávidas não imunes com infecção aguda, tem-se verificado uma taxa de morte fetal de cerca de 9% (9, 27) . Contudo, também há estudos que descrevem uma percentagem mais elevada para o desenvolvimento de hidrópsia fetal em mulheres grávidas não imunes infectadas por B19 (28). Dependendo da condição hematológica do hospedeiro, por exemplo, doentes com anemia das células falciformes ou talassemia, a infecção por B19 resulta em crise aplástica. A infecção persistente por parvovírus B19 tem sido referida tanto em doentes possuidores como não possuidores de imunodeficiências subjacentes (29, 30) .

Além destas manifestações gerais, a infecção por parvovírus B19 poderá induzir um espectro amplo de fenómenos auto-imunes. As citopenias auto-imunes são perturbações hematológicas bem conhecidas que poderão afectar qualquer linhagem de células da medula óssea. Na grande maioria dos casos, apenas uma das linhas celulares é afectada. Contudo, uma destruição concomitante com mediação auto-imune dos granulócitos neutrófilos e dos trombócitos devido a infecção persistente por parvovírus B19 é conhecida (31). 0 parvovírus B19 tem sido identificado como um possível desencadeador em alguns casos de trombocitopenia imune (32, 33, 34, 35) . O espectro clínico de doenças auto-imunes das articulações vai das artralgias moderadas até à vasculite necrotizante grave (Tabela 1) . Em alguns surtos de eritema infeccioso, foram normalmente referidas artralgias e artrite. A infecção por B19 3

ΕΡ 1 791 858 /PT poderá produzir uma poliartropatia periférica simétrica nos adultos. Os sintomas são geralmente autolimitados, mas poderão persistir durante vários meses. Ocasionalmente, foi demonstrada a existência de viremia combinada com anticorpos IgM/IgG contra as proteínas estruturais VP1 e/ou VP2 em doentes com poliartralgia/poliartrite duradoura. Alguns deles satisfizeram os critérios da artrite reumatóide (AR) (26, 37). Contudo, o desenvolvimento de AR após infecção aguda por parvovírus parece ser raro (38, 39). Nas crianças, a relação da infecção por B19 com a artrite-artralgias é bem conhecida. Algumas das crianças afectadas poderão desenvolver artrite crónica indistinguível da artrite idiopática juvenil (40, 41, 42, 43) . O espectro clínico engloba a mono-, a oligo- e a poliartrite. Adicionalmente, uma viremia persistente é frequentemente observada em crianças com artrite idiopática juvenil sistémica. Nas crianças com várias formas de artrite juvenil, o ADN de B19 foi amplificado em 57% do soro e/ou do líquido sinovial proveniente daquelas com infecção prévia por parvovírus B19. Em muitos doentes, a presença continuada de partículas virais e imunocomplexos pôde ser demonstrada no sangue periférico, assim como no líquido sinovial (44). Apesar do desenvolvimento e da presença da imunorreacção específica do BI 9, as crianças foram incapazes de eliminar o vírus e apresentaram um estado prolongado de viremia ou persistência virai no líquido sinovial. A infecção por parvovírus B19 tem sido associada a várias formas de vasculite, colagenose e poderá mimetizar o lúpus eritematoso sistémico (LES) nas crianças e nos adultos (39, 45, 46) . Analogamente à situação que ocorre nos doentes com artrite, a infecção por parvovírus B19 nos doentes com LES também tem sido descrita quer como o agente que causa quer como o agente que desencadeia a doença reumática (47, 48, 49, 50, 51) . Recentemente, foi descrita uma associação entre a infecção persistente por parvovírus B19 e a produção de anticorpos antifosfolípidos em doentes adultos e pediátricos com doença reumática (52) . A síndrome antifosfolípido (SAF) (53), tal como algumas infecções por parvovírus B19, é caracterizada por uma ampla variedade de manifestações hemocitopénicas e vaso-oclusivas. Adicionalmente, a perda fetal recorrente e a associação com auto-anticorpos dirigidos contra fosfolípidos carregados negativamente e cofactores 4

ΕΡ 1 791 858 /PT proteicos, principalmente a p2-glicoproteina I, são caracteristicas importantes da SAF. A hipótese que considera uma patogenicidade comum da síndrome antifosfolípido e das caracteristicas de auto-imunidade observadas na infecção por B19 é apoiada não só pela associação próxima entre a presença de anticorpos antifosfolipidos e a infecção por parvovírus B19, como também pela semelhança de sintomas clínicos nos doentes com infecção por parvovírus B19 e nos doentes com SAF. A cápside icosaédrica do parvovírus B19 consiste em duas proteínas estruturais, VP1 (83 kDa) e VP2 (58 kDa) , que são idênticas excepto ao nível de 227 aminoácidos (aa) na extremidade amino-terminal da proteína VP1 (a região única de VP1) . Um motivo da fosfolipase A2 está presente na sequência de aminoácidos da região única VP1, abrangendo as posições 130 a 195 (centro activo da fosfolipase A2) (54). Um dos mecanismos patogénicos envolvidos no desencadeamento da produção de anticorpos antifosfolipidos poderá ser a actividade análoga à fosfolipase A2 observada na região única VP1 da proteína estrutural VP1 do parvovírus B19 (54). Esta actividade enzimática está presente em partículas de B19 infecciosas, em cápsides vazias recombinantes consistindo em proteínas VP1/VP2 e em preparações da região única VP1 purificada. Poderá contribuir para os processos inflamatórios induzidos pela produção de leucotrienos e de prostaglandinas, mas também poderá conduzir à geração de produtos de clivagem naturais e invulgares de compostos fosfolipídicos celulares, que poderão induzir anticorpos antifosfolipidos em combinação com um "background" genético distinto.

Até ao momento, não se encontra disponível uma vacina para prevenir a infecção por parvovírus B19. Com respeito aos rumos graves que são observados em associação com a infecção, os problemas associados à infecção em mulheres grávidas e o potencial do vírus para induzir uma grande variedade de doenças auto-imunes, o desenvolvimento de uma vacina segura que proteja contra as infecções por parvovírus B19. As cápsides vazias recombinantes purificadas, consistindo em proteínas VP1/VP2 expressas por vectores de baculovírus, foram utilizadas num ensaio de fase I e mostraram uma indução bem sucedida de anticorpos neutralizantes de B19 em voluntários (55) . A aplicação desta vacina esteve, contudo, associada a 5

ΕΡ 1 791 858 /PT uma variedade de efeitos secundários. Além de inchaço no local das injecções, mais de 50% dos voluntários referiram sinais mais gerais de doença tais como febre, dor de cabeça e diarreia. Estes efeitos secundários indicam que a aplicação da vacina resulta numa manifestação sistémica de efeitos secundários que se sabe estarem ligados à activação de reacções de defesa básicas associadas à inflamação. Durante as reacções imunes precoces que têm lugar no seguimento, por exemplo, de infecções, estes efeitos estão essencialmente associados à activação de fosfolipases A2 celulares e citosólicas. Estas enzimas são responsáveis pela produção de ácido araquidónico na qualidade de precursor para a produção de prostaglandinas e de leucotrienos, e a indução de várias citoquinas e quimioquinas conducentes a febre e a mal-estar geral. Os efeitos secundários observados por Bailou e colaboradores, utilizando cápsides vazias contendo VP1/VP2 produzidas por baculovirus recombinantes (55), devem-se provavelmente à actividade análoga à fosfolipase A2 que faz parte da região única VP1 da proteina de cápside virai VPl.

Girod et al. (The Journal of General Virology 83(5) (2000):973-978) descrevem a actividade da fosfolipase A2 de parvovirus do virus adeno-associado tipo 2 (VAA-2).

Shields et al. (American Journal of Obstetrics & Gynaecology 182(1) (2000): 18) descrevem uma proteina da cápside do parvovirus B19 utilizada para incubação com vários sistemas celulares diferentes, resultando num crescimento e numa formação de colónias reduzidos das células incubadas. WO 03/006067 descreve parvovirus de animais e os seus efeitos oncotóxicos. WO 00/306668 A refere que o parvovirus B19 se liga ao antigénio P nas células hospedeiras, por exemplo, as células hematopoiéticas humanas e outras células sanguíneas, e que as proteínas da cápside ou os seus fragmentos podem inibir um crescimento das células que possuem o antigénio P. O problema destacado no presente invento consiste em disponibilizar medicamentos, como seja uma vacina para o parvovirus B19, destinados à prevenção e/ou ao tratamento de 6

ΕΡ 1 791 858 /PT doenças associadas ao parvovírus B19, com efeitos secundários mínimos.

Este problema é abordado pelo presente invento através de uma alternância/modificação vantajosa da proteína de cápside VP1 do parvovírus B19, reduzindo, assim, a actividade análoga à fosfolipase A2 da região única VPl da proteína de cápside virai VPl.

De acordo com um aspecto do presente invento, é disponibilizada uma proteína de cápside VPl modificada do parvovírus B19, que possui uma actividade enzimática análoga à fosfolipase A2 reduzida em comparação com a proteína de cápside VPl de tipo selvagem do parvovírus B19 que possui a sequência de aminoácidos da Seq. ID 1, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido conservados no centro activo da fosfolipase A2 estão alterados na posição 153: histidina, na posição 157: tirosina, na posição 162: lisina e/ou na posição 168: tirosina.

De acordo com o presente invento, a actividade de fosfolipase natural é reduzida (o que inclui a abolição completa da actividade). Por conseguinte, as regiões da proteína que estão envolvidas na redução desta actividade de fosfolipase podem ser alteradas de acordo com o presente invento. Estas alterações, em comparação com a sequência de tipo selvagem, poderão ser introduzidas por meio de trocas, deleções ou inserções de aminoácidos. A redução da actividade de fosfolipase pode ser facilmente avaliada pelo perito na arte, por exemplo, confiando na metodologia aqui descrita, especialmente de acordo com o teste descrito na Fig. 2 de Dorsch et al., 2002 (54). Por outro lado, as modificações não devem alterar significativamente o desempenho imunológico da vacina (isto é, na medida em que as propriedades imunogénicas não devem ser negativamente afectadas pela mutação).

De acordo com o presente invento, os resíduos de aminoácido na região única VPl da proteína de cápside VPl (aminoácidos 100-220, especificamente 130 a 195) são alterados. Esta região é altamente conservada em todos os três genótipos de parvovírus B19 que foram identificados até ao momento (60; Fig. 2). Contudo, embora esta região seja 7 ΕΡ 1 791 858 /PT obviamente conservada, é possível observar diferenças na actividade dos diferentes genótipos de parvovírus B19: genótipo 1: 100%, genótipo 2: 70%, genótipo 3: 59%. A referência à actividade de tipo selvagem significa que o genótipo mais próximo é seleccionado para comparação do mutante com o tipo selvagem (por exemplo, se for preparado um mutante de genótipo 2, a actividade de fosfolipase do mutante é comparada com o tipo selvagem de genótipo 2).

Em geral, a proteína VP1 completa poderá ser submetida a uma introdução de mutações para reduzir ou eliminar a sua actividade análoga à fosfolipase A2. Contudo, uma vez que as mutações fora da região única VP1 (aminoácidos 100-220, especificamente 130 a 195) apresentam geralmente um potencial de redução baixo, se é que existente, da actividade de fosfolipase, de acordo com o presente invento efectuam-se mutações no interior desta região única VP1. No entanto, também poderão introduzir-se mutações na região fora da região única VP1, por exemplo, por truncamento amino ou através de mutações na região de aminoácidos 50-90, especialmente 59-81. O facto de uma mutação cumprir ou não a redução da actividade de fosfolipase esperada pode ser facilmente abordado através de uma combinação da expressão do mutante com um ensaio de actividade funcional. Estes testes de actividade de fosfolipase estão disponíveis na arte e são aqui também descritos.

Os sítios de mutação especificamente preferidos encontram-se à volta dos aminoácidos de ligação ao Ca2+ (Tyr(130), Gly(132), Gly(134), Asp(154)) ou à volta da rede catalítica (His(153), Tyr(157), Tyr(168)), incluindo a ligação aos fosfolípidos (Lys(162)), isto é, os aminoácidos 125-140 e 150-175, especialmente 127-137, 152-160 e 165 a 171 (ver também a SeqlD No. 1 e a Fig. 2 para consultar as sequências).

As trocas preferidas são as trocas habitualmente utilizadas em estratégias de mutação redutoras de actividade enzimática, por exemplo, a substituição de um aminoácido com uma cadeia lateral funcional (His, Lys, Tyr, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gin, etc.) por um aminoácido com uma cadeia lateral não funcional do mesmo tamanho ou de tamanho diferente (Ala, Phe, Leu, Pro, Ile, etc.) ou com uma cadeia lateral funcional 8 ΕΡ 1 791 858 /PT diferente (por exemplo, Asn ->· Asp, Gin ->· Ser, etc.) . Por vezes, uma ligeira diferença também é suficiente (Vai -► Ala, Ser ->· Thr, etc. ) .

De acordo com uma concretização adicional preferida do presente invento, um ou mais dos residuos de aminoácido conservados no centro activo da fosfolipase A2 estão alterados. Os residuos de aminoácido na posição 153: histidina; 157: tirosina; 162: lisina; 168: tirosina e 195: ácido aspártico foram descritos como sendo partes da triade catalítica da fosfolipase A2 pancreática de bovino e como estando envolvidos na orientação e especificidade para o substrato (58, 59) . A modificação de um ou mais dos residuos nas posições 153: histidina, 157: tirosina, 162: lisina, 168: tirosina resulta numa redução ainda mais pronunciada da actividade análoga à fosfolipase A2, enquanto a modificação e a alternância/alteração do residuo 195: ácido aspártico resulta numa actividade análoga à fosfolipase A2 reforçada.

Assim, de acordo com o presente invento, um ou mais dos residuos de aminoácido na posição 153: histidina, posição 157: tirosina, posição 162: lisina e/ou posição 168: tirosina estão alterados.

De acordo com ainda outra concretização preferida, a histidina 153 é alterada para alanina, a tirosina 157 é alterada para fenilalanina, a lisina 162 é alterada para leucina e/ou a tirosina 168 é alterada para fenilalanina.

Em geral, a mutação de acordo com o presente invento deve ser tão minima quanto possivel (de forma a não alterar demasiado as propriedades imunogénicas): geralmente, um número reduzido de substituições de aminoácidos (6, 5, 4, 3, 2 ou, preferencialmente, 1) e uma inserção ou deleção curta (30, 20, 10, 5 ou 1 aminoácidos) deverão ser suficientes para reduzir ou remover eficientemente a actividade de fosfolipase. Contudo, inserções ou deleções mais compridas (50, 100, 200 aminoácidos) ou um número mais elevado de substituições não estão excluídas, desde que as propriedades imunogénicas não sejam significativamente alteradas. As últimas opções, contudo, as mutações múltiplas, também são menos preferidas devido a aspectos de custo. 9

ΕΡ 1 791 858 /PT Ο facto de os mutantes possuírem ou não propriedades imunogénicas similares pode ser facilmente determinado, por exemplo, mediante a reacção com anticorpos específicos ou mediante a determinação in vitro ou in vivo da capacidade para induzir respostas imunes. Geralmente, os mutantes deverão apresentar (com ou sem adjuvantes específicos) cerca de 50% da imunogenicidade in vivo do tipo selvagem (sem adjuvantes ou, de preferência, com o mesmo adjuvante que o mutante), determinada por meio de pelo menos um método cientificamente aplicado e aceite (via avaliação de pares), por exemplo, a ligação de anticorpos, os testes ELISpot, etc. (consultar também a secção de exemplos do presente pedido).

De acordo com o presente invento, a região única VP1 modificada ou a proteína de cápside VP1 modificada do presente invento resulta numa actividade enzimática análoga à fosfolipase A2 reduzida em comparação com a proteína de cápside VP1 de tipo selvagem. De preferência, a redução é de pelo menos 30% em comparação com o tipo selvagem (isto é, 70% ou menos da actividade do tipo selvagem). É adicionalmente preferida uma redução para 50% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos ou 10% ou menos da actividade do tipo selvagem. A actividade de referência do tipo selvagem e do mutante são preferencialmente determinadas de acordo com um teste estandardizado de actividade enzimática análoga à fosfolipase A2, especialmente de acordo com a figura 2 de (54).

De modo especial, aqueles mutantes que não possuem de todo esta actividade (isto é, abaixo de 5%, abaixo de 1% ou abaixo de 0,1%, dependendo dos limites de detecção do método) são muito apropriados em termos de segurança e utilização em vacinas de acordo com o presente invento.

Preferencialmente, a alternância/alteração dos resíduos de aminoácido é efectuada por mutagénese dirigida.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína de cápside VP1 modificada fornecida pelo presente invento. 10

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De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizado um vector de expressão recombinante compreendendo as moléculas de ácido nucleico que codificam a região única VP1 modificada e a proteina de cápside VP1 modificada fornecidas pelo presente invento.

Preferencialmente, o vector de expressão recombinante de acordo com o presente invento compreende adicionalmente a proteina de cápside VP2 do parvovirus B19, especialmente em que a proteina é expressa juntamente com a proteína de cápside VP1 modificada. Contudo, a expressão combinada das proteínas VP1 e VP2, utilizando dois vectores que são introduzidos nas células, também tem as suas vantagens para fins específicos.

Mais preferencialmente, o vector de expressão recombinante de acordo com o presente invento compreende um produto de fusão, na medida em que a região única VP1 modificada ou a proteína de cápside VP1 modificada está fundida com a proteína de cápside VP2.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada uma célula hospedeira compreendendo o vector de expressão recombinante de acordo com o presente invento.

Preferencialmente, a células hospedeira consiste em E. coli, uma levedura ou uma célula animal.

Mais preferencialmente, a célula hospedeira é

Saccharomyces cerevisiae. Esta espécie de levedura tem sido utilizada há duas décadas para produzir partículas HBsAg recombinantes que protegem contra a infecção pelo vírus da hepatite B. A utilização de vacinas contra o VHB derivadas de S. cerevisiae recombinante é segura, e apenas muito raramente se observam efeitos secundários.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizado um processo de produção da região única VP1 modificada ou da proteína de cápside VP1 modificada ou do produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2, através de transformação de uma célula hospedeira, expressão da proteína de cápside VP1 (e opcionalmente da proteína de cápside VP2) e recuperação da(s) 11

ΕΡ 1 791 858 /PT proteína(s), opcionalmente como partículas análogas a um vírus, utilizando a célula hospedeira de acordo com o presente invento.

Preferencialmente, neste processo, a região única VP1 modificada e/ou a proteína de cápside VP1 modificada e/ou o produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 são isolados e/ou purificados.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada a região única VP1 modificada e/ou a proteína de cápside VP1 modificada ou o produto de fusão da região única VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 obteníveis pelo processo de acordo com o presente invento.

De acordo com ainda outro aspecto do presente invento, é disponibilizada a região única VP1 modificada e/ou a proteína VP1 modificada ou o produto de fusão da região única VP1 modificada e/ou da proteína VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 para utilização como medicamentos.

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizada a utilização da região única VP1 modificada, da proteína VPl modificada, com ou sem a proteína de cápside VP2, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento contra a infecção por parvovírus B19 e/ou as doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovírus B19.

De acordo com ainda um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizada a utilização do produto de fusão da região única VPl modificada, da proteína VPl modificada e da proteína de cápside VP2 para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento contra a infecção por parvovírus B19 e/ou as doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovírus B19.

Preferencialmente, o tratamento é contra as artralgias; a artrite, mais preferencialmente a monoartrite, a oligoartrite, a poliartrite, a artrite reumatóide e/ou a artrite idiopática juvenil; o lúpus eritematoso sistémico (LES); a vasculite, mais preferencialmente a vasculite leucoclástica, a púrpura de Henlein-Schoenoch, a síndrome do exantema papulo-purpúrico em 12

ΕΡ 1 791 858 /PT "luvas e meias" (SEPPLM), a doença de Kawasaki, a arterite de células gigantes (ACG), a poliarterite nodosa e/ou a granulomatose de Wegener; a dermatomiosite; a neutropenia auto-imune; a trombocitopenia auto-imune; a púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); a anemia hemolitica auto-imune e/ou a sindrome hemofagocitica associada a um virus (SHAV).

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada a utilização da região única VP1 modificada, da proteína de cápside VP1 modificada ou do produto de fusão da região única VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com o presente invento, num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VP1 do vírus B19 numa amostra que se pretende testar.

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizada a utilização das células hospedeiras do presente invento num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VP1 do vírus B19 numa amostra que se pretende testar.

De acordo com outro aspecto do presente invento, são disponibilizadas partículas análogas a um vírus recombinantes que consistem na proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento, com ou sem a proteína de cápside VP2.

De acordo com ainda outro aspecto do presente invento, são disponibilizadas partículas análogas a um vírus recombinantes que consistem no produto de fusão da região única VP1 modificada, da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com o presente invento.

De acordo com outro aspecto do presente invento, aquelas partículas análogas a um vírus recombinantes podem ser utilizadas para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento contra a infecção por parvovírus B19 e/ou as doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovírus B19. 0 tratamento é preferencialmente contra as artralgias; a artrite, mais preferencialmente a monoartrite, a oligoartrite, a poliartrite, a artrite reumatóide e/ou a artrite idiopática 13

ΕΡ 1 791 858 /PT juvenil; o lúpus eritematoso sistémico (LES); a vasculite, mais preferencialmente a vasculite leucoclástica, a púrpura de Henlein-Schoenoch, a sindrome do exantema papulo-purpúrico em "luvas e meias" (SEPPLM), a doença de Kawasaki, a arterite de células gigantes (ACG), a poliarterite nodosa e/ou a granulomatose de Wegener; a dermatomiosite; a neutropenia auto-imune; a trombocitopenia auto-imune; a púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); a anemia hemolitica auto-imune e/ou a sindrome hemofagocítica associada a um virus (SHAV).

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada a utilização das partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com o presente invento, num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VP1 do vírus BI9 numa amostra que se pretende testar.

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizada uma composição farmacêutica, especialmente uma preparação vacinai, para induzir uma resposta imune que proporciona uma protecção contra o parvovírus B19 humano, compreendendo a região única VP1 modificada, a proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento, com ou sem a proteína de cápside VP2.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada uma composição farmacêutica, especialmente uma preparação vacinai, para induzir uma resposta imune que proporciona uma protecção contra o parvovírus B19 humano, compreendendo o produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento.

De acordo com ainda outro aspecto do presente invento, é disponibilizada uma composição farmacêutica, especialmente uma preparação vacinai, para induzir uma resposta imune que proporciona uma protecção contra o parvovírus B19 humano, compreendendo as partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com o presente invento.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas de acordo com o presente invento compreendem adicionalmente um ou mais veículos e/ou adjuvantes adequados para fins de vacinação. 14

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Por conseguinte, as composições disponibilizadas pelo presente invento, especialmente sob a forma de uma vacina, poderão compreender adicionalmente uma substância imunoestimulante, preferencialmente seleccionada entre o grupo que compreende um composto policatiónico, de preferência um polimero policatiónico, mais preferencialmente um péptido policatiónico, especialmente a poliarginina, a polilisina ou um péptido antimicrobiano; polímeros; desoxinucleótidos imunoestimulantes (ODN); péptidos contendo pelo menos dois motivos LysLeuLys; compostos neuroactivos, especialmente a hormona de crescimento humana; o alúmen, o adjuvante de Freund completo ou incompleto ou combinações deles. A presente vacina compreende preferencialmente - uma proteina de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento como antigénio, - um péptido compreendendo uma sequência Ri-XZXZnXZX-R2, em que N é um número inteiro compreendido entre 3 e 7, preferencialmente 5, X é um resíduo de aminoácido natural e/ou não natural carregado positivamente, Z é um resíduo de aminoácido seleccionado entre o grupo que consiste em L, V, I, F e/ou W, e Ri e R2 são seleccionados, independentemente um do outro, entre o grupo que consiste em -H, -NH2, -COCH3, -COH, um péptido com até 2 0 resíduos de aminoácido ou um grupo reactivo peptídico ou um adaptador peptídico com ou sem um péptido; e X-R2 poderá ser uma amida, um éster ou um tioéster do resíduo de aminoácido C-terminal do péptido (na descrição seguinte também designado por "Péptido A") e/ou - uma molécula de ácido oligodesoxinucleico imunoestimulante (ODN) possuindo a estrutura de acordo com a fórmula (I)

II

B NUC-

15 ΕΡ 1 791 858 /PT em que

R1 é seleccionado entre a hipoxantina e o uracilo, qualquer X é 0 ou S qualquer NMP é um 2'-desoxinucleósido-monofosfato ou -monotiofosfato seleccionado entre o grupo que consiste em desoxiadenosina-, desoxiguanosina-, desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuridina-, desoxitimidina-, 2-metildesoxiinosina-, 5-metildesoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosepurina-, 2-aminodesoxirribosepurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetildesoxiguanosina- ou N-isopentenildesoxiadenosina-monofosfato ou -monotiofosfato, NUC é um 2'-desoxinucleósido seleccionado entre o grupo que consiste em desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxiinosina, desoxicitosina, desoxiinosina, desoxitimidina, 2-metildesoxiuridina, 5-metildesoxicitosina, desoxipseudouridina, desoxirribosepurina, 2-aminodesoxirribosepurina, 6-S-desoxiguanina, 2-dimetildesoxiguanosina ou N-isopentenildesoxiadenosina, a e b são números inteiros compreendidos entre 0 e 100, na condição de a + b estar compreendido entre 4 e 150 e B e E são grupos comuns para as extremidades 5' ou 3' de moléculas de ácidos nucleicos (na descrição seguinte também designada por "I-/U-ODN").

Obviamente, a presente vacina poderá conter adicionalmente outras substâncias, por exemplo, diluentes, veículos, substâncias tampão ou estabilizadoras farmaceuticamente aceitáveis adequadas, etc. A vacina de acordo com o presente invento poderá também conter outros adjuvantes ou adjuvantes adicionais, especialmente um adjuvante Al(OH)3 (alúmen). O termo alúmen, tal como aqui utilizado, inclui todas as formas de adjuvantes à base de Al3+ utilizadas em medicina e em investigação humana e animal. Ele inclui especialmente toda as formas de hidróxido de alumínio tal como definidas em Rõmpp, lOth Ed., páginas 139/140, as suas formas gel, o fosfato de alumínio, etc. 16

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Os péptidos ou compostos policatiónicos que serão utilizados de acordo com o presente invento poderão ser qualquer composto policatiónico que apresente o efeito caracteristico de acordo com WO 97/30721. Os compostos policatiónicos preferidos são seleccionados entre os polipéptidos básicos, os policatiões orgânicos, os poliaminoácidos básicos ou suas misturas. Estes poliaminoácidos deverão ter um comprimento de cadeia de pelo menos 4 residuos de aminoácido. As substâncias contendo ligações peptidicas, tais como a polilisina, a poliarginina e os polipéptidos contendo mais de 20%, especialmente mais de 50% de aminoácidos básicos, num intervalo de mais de 8, especialmente mais de 20 residuos de aminoácido, ou suas misturas são especialmente preferidas. Outros policatiões preferidos e as suas composições farmacêuticas estão descritos em WO 97/30721 (por exemplo, a polietilenoimina) e em WO 99/38528. Preferencialmente, estes polipéptidos contêm entre 20 e 500 residuos de aminoácido, especialmente entre 30 e 200 residuos.

Estes compostos policatiónicos poderão ser produzidos quimicamente ou de forma recombinante, ou poderão ser derivados de fontes naturais.

Os (poli)péptidos catiónicos também poderão ser péptidos microbianos antibacterianos policatiónicos. Estes (poli)péptidos poderão ser de origem procariótica ou eucariótica, ou poderão ser produzidos quimicamente ou de forma recombinante. Os péptidos também poderão pertencer à classe dos péptidos antimicrobianos naturais. Estes péptidos de defesa do hospedeiro ou defensivos também são uma forma preferida do polímero policatiónico de acordo com o presente invento. Geralmente, um composto que permite como produto final a activação (ou regulação negativa) do sistema imune adaptável, preferencialmente mediada por células APC (incluindo as células dendríticas) , é utilizado como polímero policatiónico.

Adicionalmente, também os compostos neuroactivos, como seja a hormona de crescimento (humana) (tal como descrita, por exemplo, em WO 01/24822), poderão ser utilizados como imunoestimulantes (imunizantes). 17

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Os compostos policatiónicos derivados de fontes naturais incluem o VIH-REV ou o VIH-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos de antenapedia, quitosano ou outros derivados de quitina) ou outros péptidos derivados destes péptidos ou proteínas por meio de produção bioquímica ou recombinante. Outros compostos policatiónicos preferidos são a catelina ou substâncias relacionadas ou derivadas da catelicidina, especialmente as catelicidinas e/ou as catelicidinas de ratinho, bovinas ou, especialmente, humanas. As substâncias relacionadas ou derivadas da catelicidina contêm a totalidade ou partes da sequência da catelicidina com pelo menos 15-20 resíduos de aminoácido. As derivações poderão incluir a substituição ou a modificação dos aminoácidos naturais por aminoácidos que não se encontram entre os 20 aminoácidos padrão. Adicionalmente, é possível introduzir resíduos catiónicos adicionais nestas moléculas de catelicidina. Estas moléculas de catelicidina são preferencialmente combinadas com a composição de antigénio/vacina de acordo com o presente invento. Contudo, e de modo surpreendente, estas moléculas de catelina revelaram-se também eficazes como um adjuvante para um antigénio, sem a adição de adjuvantes adicionais. É, por conseguinte, possível utilizar estas moléculas de catelicidina como adjuvantes eficientes em formulações vacinais, com ou sem substâncias imunoactivadoras adicionais. A vacina de acordo com o presente invento contém preferencialmente, como Péptido A, KLKL5KLK, e/ou como I-/U-0DN, oligo d(IC) 13 (a combinação de Peptido A e Oligo d(IC)i3 é também designada por IC31). Estas duas substâncias são especificamente vantajosas de acordo com o presente invento. A vacina de acordo com o presente invento poderá compreender um oligodesoxinucleótido contendo um motivo CpG na qualidade de ácido nucleico imunomodulador. Os ácidos nucleicos imunomoduladores que serão utilizados de acordo com o presente invento podem ser de origem sintética, procariótica e eucariótica. No caso de uma origem eucariótica, o ADN deverá ser derivado, com base na árvore filogenética, de espécies menos desenvolvidas (por exemplo, insectos, mas também outras). Numa concretização preferida do invento, o 18

ΕΡ 1 791 858 /PT oligodesoxinucleótido (ODN) imunogénico é uma molécula de ADN produzida sinteticamente, ou misturas destas moléculas. Derivados ou modificações de ODN, tais como os análogos substituídos com tiofosfato (resíduos de fosfato são substituídos por tiofosfato), como descritos, por exemplo, nas patentes US 5,723,335 e US 5,663,153, e outros derivados e modificações que preferencialmente estabilizam a(s) composição(ões) imunoestimulante(s) , mas não alteram as suas propriedades imunológicas também estão incluídos. Um motivo sequencial preferido é um motivo de ADN com seis bases, que contém um dinucleótido CpG (não metilado) flanqueado por duas purinas em 5' e duas pirimidinas em 3' (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-

Pyr-3' ) . Os motivos CpG contidos nos ODN de acordo com o presente invento são mais comuns no ADN microbiano do que no ADN dos vertebrados superiores e apresentam diferenças no padrão de metilação. Surpreendentemente, as sequências que estimulam as células APC de ratinho não são muito eficientes para as células humanas. Os ODN palindrómicos ou não palindrómicos preferidos que serão utilizados de acordo com o presente invento estão referidos, por exemplo, nos pedidos de patente austríacos A 1973/2000, A 805/2001, EP 0 468 520 A2, WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259 e WO 99/56755, todos aqui incorporados por meio de referência. Os ODN/ADN poderão ser produzidos quimicamente ou de forma recombinante, ou poderão ser derivados de fontes naturais. As fontes naturais preferidas são os insectos. A vacina de acordo com o presente invento poderá conter preferencialmente um péptido policatiónico e um oligodesoxinucleótido contendo um motivo CpG em combinação. A combinação de CpG-ODN com o péptido policatiónico apresenta efeitos de melhoramento nas composições vacinais, que são comparáveis aos efeitos da combinação do Péptido A com I-/U-ODN e que podem não só ser combinados com o Péptido A e I-/U-0DN, como também ser mesmo utilizados em vez deles. Obviamente, misturas de diferentes ácidos nucleicos imunoestimulantes (I-/U-ODN, CpG-ODN, ...) e de variantes do Péptido A (assim como outros imunizantes) também poderão ser utilizadas de acordo com o presente invento. 19

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Foi anteriormente demonstrado (WO 02/13857) que os péptidos antimicrobianos naturais derivados de catelicidina ou os seus derivados possuem uma actividade estimulante sobre a resposta imune e, por conseguinte, constituem adjuvantes indutores de tipo 1 (imunizantes) extremamente eficazes. As fontes principais de péptidos antimicrobianos consistem em grânulos de neutrófilos e células epiteliais que revestem os tractos respiratório, gastrintestinal e geniturinário. Em geral, eles são encontrados naqueles locais anatómicos mais expostos à invasão microbiana e são segregados nos fluidos corporais internos ou armazenados em grânulos citoplasmáticos de fagócitos profissionais (neutrófilos).

Em WO 02/32451, é descrito um adjuvante indutor de tipo 1 (imunizante) que é capaz de reforçar fortemente a resposta imune a um antigénio especifico co-administrado, constituindo, deste modo, um adjuvante extremamente eficaz. O Péptido A compreendendo uma sequência Ri-XZXZnXZX-R2 . Um péptido especificamente preferido é KLKLLLLLKLK. Além de péptidos antimicrobianos naturais, péptidos antimicrobianos sintéticos foram também produzidos e investigados. Demonstrou-se que o péptido antimicrobiano sintético KLKLLLLLKLK-NH2 possui uma actividade quimioterapêutica significativa em ratinhos infectados com Staphylococcus aureus; neutrófilos humanos foram activados para produzir o anião superóxido (02“) via a calreticulina da superfície celular. Verificou-se que o número exacto e a posição de K e L eram críticos para a actividade antimicrobiana do péptido sintético. O presente invento é especialmente benéfico caso a vacina seja administrada subcutânea, intramuscular, intradérmica ou transdermicamente. Contudo, outras formas de aplicação, tais como a aplicação parentérica, intravenosa, intranasal, oral ou tópica, também são adequadas para o presente invento. O antigénio de parvovírus de acordo com o presente invento poderá ser misturado com um adjuvante (imunizante) (composição) ou especificamente formulado de outro modo, por exemplo, como lipossoma, formulação de libertação prolongada, etc... 20

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As vacinas de acordo com o presente invento poderão ser administradas a um individuo em quantidades eficazes conhecidas pelo perito na arte. A optimização da quantidade de antiqénio e da quantidade de imunizante pode partir de quantidades estabelecidas e utilizar métodos disponíveis.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizado um kit de diaqnóstico compreendendo uma região única VP1 modificada, uma proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento e reagentes suplementares.

De acordo com ainda outro aspecto do presente invento, é disponibilizado um kit de diagnóstico compreendendo um produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento e reagentes suplementares.

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é disponibilizado um kit de diagnóstico compreendendo partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com o presente invento e reagentes auxiliares.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizada a região única VP1 modificada, a proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento, com ou sem a proteína de cápside VP2, como um agente para modificar a actividade de uma actividade da fosfolipase A2 do hospedeiro, por exemplo, por meio de terapia génica ou utilizando KNA ou ARNi anti-sentido.

De acordo com outro aspecto do presente invento, é disponibilizado o produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com o presente invento, como um agente para modificar a actividade de uma actividade da fosfolipase A2 do hospedeiro. uma

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, são disponibilizadas partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com o presente invento, como um agente para modificar a actividade de uma actividade da fosfolipase A2 do hospedeiro. 21

ΕΡ 1 791 858 /PT Ο presente invento é adicionalmente ilustrado pelos exemplos e figuras que se seguem, a partir dos quais poderão ser retiradas caracteristicas, concretizações e vantagens adicionais. Deverá entender-se que os presentes exemplos são fornecidos apenas a titulo ilustrativo e não limitativo da descrição. A Fig. 1 ilustra uma comparação imunológica da proteína de tipo selvagem e da proteína mutante. A Fig. 2 representa um alinhamento da proteína VP1 de parvovírus.

Exemplo 1. A produção de antigénios VP1/VP2 sem actividade enzimática pode ser obtida através de alteração dos resíduos que fazem parte do centro activo por meio de mutagénese dirigida. Apesar do tamanho global das enzimas celulares com actividade de fosfolipase A2 dependente de Ca2+ e da região única VP1 virai ser diferente, os alinhamentos comparando as sequências de aminoácidos revelaram um determinado número de resíduos conservados na região que representa o centro activo da enzima. Observaram-se aminoácidos conservados nas seguintes posições:

Resíduo 153: histidina, resíduo 157: tirosina, resíduo 162: lisina, resíduo 168: tirosina, resíduo 195: ácido aspártico. Os respectivos aminoácidos foram descritos como sendo partes da tríade catalítica da fosfolipase A2 pancreática de bovino e como estando envolvidos na orientação e especificidade para o substrato. Por conseguinte, a alteração destes resíduos na região única VP1 por mutagénese dirigida foi efectuada utilizando a reacção da polimerase em cadeia com iniciadores mutados e sobreposição, tal como inicialmente descrito por Ho e colaboradores (56). Como ilustrado na Tabela 2, a actividade análoga à fosfolipase A2 da região única VP1 pôde ser reduzida por troca de ambas as tirosinas 157 e 168 por fenilalanina e por alteração da lisina 162 para leucina. Contudo, a troca do ácido aspártico 195 por alanina conduziu a um reforço inesperado da actividade da enzima virai, o que indica a existência de diferenças 22 ΕΡ 1 791 858 /PT distintas entre as enzimas fosfolipase A2 virai e celular. Uma destruição quase total da actividade enzimática só pôde ser obtida através da alteração da histidina 153 para alanina. É possivel concluir que este resíduo de aminoácido faz parte do centro activo e é muito importante para a actividade enzimática da região única VP1. A sua alteração está associada à destruição completa da actividade análoga à fosfolipase A2 virai.

Tabela 1: Doenças auto-imunes que são referidas em associação com a infecção por parvovírus B19. Órgãos envolvidos Doença

Articulações Artralgias

Artrite

Monoartrite

Oligoartrite

Poliartrite

Artrite reumatóide

Artrite idiopática juvenil

Tecido conjuntivo/vasos Lúpus eritematoso sistémico (LES)

Vasculite

Vasculite leucoclástica Púrpura de Henlein-Schoenoch Síndrome do exantema papulo-purpúrico em "luvas e meias" (SEPPLM)

Doença de Kawasaki

Arterite de células gigantes (ACG) Poliarterite nodosa Granulomatose de Wegener Dermatomiosite Células sanguíneas Neutropenia auto-imune

Trombocitopenia auto-imune Púrpura trombocitopénica idiopática (PTI)

Anemia hemolítica auto-imune Síndrome hemofagocítica associada a um vírus (SHAV) 23

ΕΡ 1 791 858 /PT BI 9

Tabela 2: Actividade enzimática região única VP1 do parvovírus mutagénese dirigida.

Posição alterada por mutagénese dirigida tipo selvagem, genótipo 1 mutantes no centro activo histidina 153 —» alanina tirosina 157 —» fenilalanina lisina 162 —» leucina tirosina 168 —» fenilalanina ácido aspártico 195 —» alanina análoga à fosfolipase A2 na e variantes construídas por

Actividade enzimática (%) 100 0 10 61 54 204 mutantes que não no centro activo 80 144 143 leucina 76 —» glutamina, fenilalanina 81 —» alanina isoleucina 66 —» leucina, leucina 70 —> glutamina leucina 59 —» glutamina, leucina 62 —> glutamina variações em regiões não conservadas parvovírus B19, região única VP1, genótipo 2/estirpe Berlin 70 alal8—>asp, gln21—>lys, asn68—>ser, asn72—>asp, ser73—»thr, ser96—>pro, alai 01—»thr, vall23—»ile, vali 92—>ala parvovírus B19, região única VP1, genótipo 3/estirpe V9 59 lys4—>thr, ser5—>thr, gly6—>asn, aspl2—>ser, lysl7—»gln, alal8—»asp, gln21—>lys, glu25—»gln, val30—»ala, asn68—>ser, ser98—>asn, hislOO—>ser, vall23—>ile, serl44—>asn, vall92—>ala

Exemplo 2.

Estudo comparativo de imunogenicidade entre proteínas VP1 de tipo selvagem e mutante. 24

ΕΡ 1 791 858 /PT

Inoculação de ratinhos. Grupos de 5 ratinhos Balc/C fêmeas foram inoculados com 50 μg de preparações purificadas de região única VPl/tipo selvagem e de região única VP1/H153A em emulsão em adjuvante completo de Freund. Recolheram-se amostras de sangue retrobulbares nos dias 0, 3, 7, 10, 14, 18 e 28 após a inoculação. Os soros foram testados quanto à presença de anticorpos IgG contra a região única VPl/tipo selvagem em ensaios ELISA.

Produção de proteína. As sequências que codificam a região única VPl/tipo selvagem e a região única VP1/H153A foram clonadas no vector de expressão de T7 pET21a_int em fusão com uma inteina e um domínio de ligação da quitina como anteriormente descrito (Dorsch et al., 2001; Dorsch et al., 2002). As construções foram introduzidas na estirpe de E. coli BL21. As bactérias foram inoculadas em meio LB (caldo luria) contendo 100 μg/ml de ampicilina e incubadas a 37°C. A expressão da proteína recombinante foi induzida por adição de IPTG 1 mM durante pelo menos 3h de cultura. As bactérias foram colhidas por centrifugação, ressuspensas em 30 ml de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5, e lisadas por meio de utilização de uma prensa francesa. Os resíduos foram depositados a lOOOOg. O sobrenadante foi carregado numa coluna de quitina (NEB) utilizando o sistema FPLC (Pharmacia Biosystems, Freiburg). A coluna foi lavada com 2 volumes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5; 8 volumes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 mM, pH 8,5; e 2 volumes de HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,5. Em seguida, a proteína foi eluída utilizando 3 volumes de DTT 50 mM em tampão HEPES 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM , pH 8,5. As fracções foram testadas quanto à presença das proteínas recombinantes por SDS-PAGE e coloração com prata. As fracções positivas foram reunidas e concentradas mediante utilização de um concentrador Centriplus (volume de exclusão 3 kD; Amicon, Beverly, EUA). A concentração de proteína foi determinada após diálise contra PBS (KH2P04 0, 9 mM; Na2HP02.12H20 8,0 mM; KC1 2,7 mM; NaCl 137 mM) , utilizando um ensaio de Bradford (Bio Rad Laboratories, Hércules, EUA).

Ensaio ELISA. Placas de microtitulação (Maxisorb, Nunc, Wiesbaden, Alemanha) foram revestidas durante a noite com proteína purificada (região única VPl/tipo selvagem, 25 ΕΡ 1 791 858 /PT 100 ng/poço) em tampão NaCC>3 0,2 M, pH 9,2, contendo NaCl 0,15 M. Os soros foram utilizados em diluições de 1:100 em PBS/Tween-20 a 0,5%, e os anticorpos IgG foram detectados utilizando IgG policlonal de coelho anti-ratinho conjugado com HRP como anticorpo secundário (diluição 1:5000 em PBS/Tween-20 a 0,5%, Dako, Hamburgo, Alemanha) e TMB como substrato. A densidade óptica foi determinada a 450 nm.

Resultados A partir do dia 7 após a inoculação, foi possivel detectar anticorpos IgG dirigidos contra a região única VPl/tipo selvagem em ratinhos que haviam sido inoculados com as preparações purificadas tanto de região única VPl/tipo selvagem como de região única VP1/H153A (Figura 1). As quantidades de anticorpos aumentaram continuamente até ao dia 28 após a inoculação. Não foi possivel observar diferenças de reactividade nos ratinhos inoculados quer com a região única VPl/tipo selvagem quer com a região única VP1/H153A. Estes resultados indicam que ambas as proteinas são extremamente antigénicas. Os anticorpos induzidos contra a variante região única VP1/H153A têm a capacidade de se ligar à região única VPl/tipo selvagem que foi utilizada como antigénio no ensaio ELISA, indicando um grau elevado de reactividade cruzada. Os ratinhos que foram inoculados com PBS em emulsão em adjuvante completo de Freund não desenvolveram nenhuma quantidade significativa de anticorpos específicos para VP1. O antigénio região única VP1 de tipo selvagem e o antigénio mutante (Hisl53Ala) foram inoculados em ratinhos. A produção de anticorpos específicos para VP1 foi analisada por ELISA. Não se observaram diferenças na capacidade de ambos os antigénios para desencadear a produção de anticorpos específicos para VP1. Os anticorpos contra o antigénio mutante Hisl53Ala foram identicamente activos na ligação à região única VP1 de tipo selvagem e vice-versa. Isto indica que a variante mutante Hisl53Ala da região única VP1 do parvovírus BI9 possui uma capacidade comparável à do domínio proteico de tipo selvagem para desencadear a produção de anticorpos. Uma vez que se sabe que os principais epítopos neutralizantes estão localizados em partes da proteína diferentes do centro activo da enzima análoga à fosfolipase A2 virai e não foram afectados por nenhuma das mutações introduzidas, é improvável 26 ΕΡ 1 791 858 /PT que ocorram efeitos ao nível da imunogenicidade da proteína (57) . A combinação de ambas as abordagens - a produção de cápsides VP1/VP2 em S. cerevisiae recombinante e a destruição da actividade análoga à fosfolipase A2 - tem potencial para produzir uma vacina que permite a prevenção da infecção por parvovírus BI9, sem um número reduzido de efeitos secundários devido à produção elevada de leucotrienos e de prostaglandinas e sem o potencial perigoso para induzir reacções auto-imunes que poderão resultar em doença reumática para toda a vida.

Legenda

Figura 1. Desenvolvimento de anticorpos IgG contra a região única VPl/tipo selvagem. Grupos de 5 ratinhos foram inoculados com a região única VPl/tipo selvagem, a região única VP1/H153A ou com PBS. As amostras de soro recolhidas nos dias indicados após a inoculação foram testadas por meio de ensaios ELISA, utilizando a região única VP1 como antigénio. Em cada caso, determinaram-se os valores médios provenientes do teste das amostras individuais de 5 ratinhos.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Inter cell AG <120> Parvovirus <130> r49100 <140> EP05799042.6 <141> 2005-09-23 <150> EP04450180.7 <151> 2004-09-24 <160> 4 <170> Patentln version 3.3

<210> 1 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovirus B19 32

ΕΡ 1 791 858 /PT <4 Ο 0> 1 IVfet Ser Lys Lys Ser Q y Lys Trp Trp Q u Ser Asp Asp Lys Phe Al a 1 5 10 15 Lys AI a Vai Tyr G n G n Phe Vai G u Phe Tyr G u Lys Vai Thr Gy 20 25 30 Thr Asp Leu G u Leu 11 e G n I I e Leu Lys Asp H S Tyr Asn I I e Ser 35 40 45 Leu Asp Asn Pro Leu Q u Asn Pr o Ser Ser Leu Phe Asp Leu Vai Al a 50 55 60 Arg I I e Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pr o Asp Leu Tyr Ser H s H s 65 70 75 80 Phe Q n Ser H s Q y G n Leu Ser Asp H s Pr o H s Al a Leu Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Ser H s AI a G u Pro Arg Gy G u Asn Al a Vai Leu Ser Ser 100 105 110 G u Asp Leu H S Lys Pro Gy G n Vai Ser Vai G n Leu Pr o Gy Thr 115 120 125 Asn Tyr Vai Gy Pro Gy Asn G u Leu G n Al a Gy Pro Pr o G n Ser 130 135 140 AI a Vai Asp Ser AI a AI a Arg I I e H S Asp Phe Arg Tyr Ser Q n Leu 145 150 155 160 AI a Lys Leu Gy I I e Asn Pr o Tyr Thr H s Trp Thr Vai Al a Asp G u 165 170 175 Q u Leu Leu Lys Asn 11 e Lys Asn Q u Thr G y Phe G n AI a G n Vai 33

ΕΡ 1 791 858 /PT 180 185 190

Vai Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Qy AI a AI a AI a Pro Val AI a H s 195 200 205 Phe G n Q y Ser Leu Pro Q u Vai Pro AI a Tyr Asn AI a Ser G u Lys 210 215 220 Tyr Pr o Ser fvfet Thr Ser Vai Asn Ser AI a G u AI a Ser Thr Qy AI a 225 230 235 240 Qy Qy Q y Qy Ser Asn Ser Vai Lys Ser IVfet Trp Ser Q u Qy AI a 245 250 255 Thr Phe Ser AI a Asn Ser Vai Thr cys Thr Phe Ser Arg Q n Phe Leu 260 265 270 11 e Pro Tyr Asp Pr o G u H s H s Tyr Lys val Phe Ser Pro AI a AI a 275 280 285 Ser Ser Cys H s Asn AI a Ser Qy Lys G u AI a Lys Val cys Thr I I e 290 295 300 Ser Pro 11 e Itèt Q y Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 305 310 315 320 AI a Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pr o Leu G u Phe G n H s Leu 11 e G u 325 330 335 Asn Tyr Qy Ser 11 e AI a Pr o Asp AI a Leu Thr Val Thr 11 e Ser G u 340 345 350 11 e AI a Vai Lys Asp Vai Thr Asp Lys Thr Qy Qy Qy Val G n Val 355 360 365 Thr Asp Ser Thr Thr Qy Arg Leu Cys IVfet Leu Val Asp H s G u Tyr 370 375 380 Lys Tyr Pr o Tyr Vai Leu Qy G n Qy G n Asp Thr Leu AI a Pr o G u 385 390 395 400 Leu Pr o 11 e Trp Vai Tyr Phe Pr o Pr o G n Tyr AI a Tyr Leu Thr Val 405 410 415 Qy Asp Vai Asn Thr G n Qy 11 e Ser Qy Asp Ser Lys Lys Leu AI a 420 425 430 Ser G u G u Ser AI a Phe Tyr Vai Leu G u H s Ser Ser Phe G n Leu 435 440 445 Leu Q y Thr Qy Qy Thr ai a Ser K/fet Ser Tyr Lys Phe Pr o Pro Val 450 455 460 34

ΕΡ 1 791 858 /PT

Pro Pr o G u Asn Leu G u G y Cys Ser G n H s Phe Tyr G u IVtet Tyr 465 470 475 480 As η Pr o Leu Tyr Q y Ser Ar g Leu Gy Val Pr o Asp Thr Leu G y G y 485 490 495 Asp Pr o Lys Phe Arg Ser Leu Thr H S G u Asp H s AI a 11 e G n Pro 500 505 510 α η Asn Phe IVfet Pr o Gy Pr o Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys G u 515 520 525 G y Asp Ser Ser Asn Thr Gy AI a Gy Lys AI a Leu Thr G y Leu Ser 530 535 540 Thr Gy Thr Ser Q n Asn Thr Ar g 11 e Ser Leu Arg Pr o G y Pro Val 545 550 555 560 Ser G n Pro Tyr H s H s Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gy 11 e 565 570 575 Asn AI a I I e Ser H s Gy G n Thr Thr Tyr Gy Asn AI a G u Asp Lys 580 585 590 G u Tyr G n G n G y Val Gy Arg Phe Pr o Asn G u Lys G u G n Leu 595 600 605 Lys Q n Leu Q n 3 y Leu Asn tyfet H s Thr Tyr Phe Pr o Asn Lys Gy 610 615 620 Thr G n G n Tyr Thr Asp G n 11 e G u Arg Pr o Leu IVtet Val Gy Ser 625 630 635 C A Γι Vai Trp Asn Arg Arg AI a Leu H s Tyr G u Ser G n Leu Trp Ser Lys 645 650 655 11 e Pr o Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr G n Phe AI a AI a Leu Gy 660 665 670 G y Trp Gy Leu H S G n Pro Pro Pr 0 G n 11 e Phe Leu Lys 11 e Leu 675 680 685 Pr o G n Ser Q y Pr o 11 e G y Q y I I e Lys Ser Mít Gy I I e Thr Thr 690 695 700 Leu Vai G n Tyr AI a Val Gy I I e rvfet Thr Val Thr K/fet Thr Phe Lys 705 710 715 720 Leu Gy Pr o Arg Lys AI a Thr G y Arg Trp Asn Pr o G n Pr o Gy Val 725 730 735 Tyr Pro Pro H s AI a AI a Gy H s Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro 740 745 750 Thr AI a Thr Asp AI a Lys G n H s H S Arg H s Gy Tyr G u Lys Pr o 755 760 765 G u G u Leu Trp Thr AI a Lys Ser Arg Val H S Pro Leu 770 775 780 35

ΕΡ 1 791 858 /PT

<210> 2 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovírus Β19 <400> 2

IVfet Ser Lys Lys Ser Asp Lys Trp Trp G u Ser Asp Asp Lys Phe Al a 1 5 10 15 Lys Asp Vai Tyr Lys G n Phe Vai G u Phe Tyr G u Lys Vai Thr G u 20 25 30 Thr Asp Leu G u Leu 11 e G n 11 e Leu Lys Asp H s Tyr Asn 11 e Ser 35 40 45 Leu Asp Asn Pro Leu G u Asn Pr o Ser Ser Leu Phe Asp Leu Vai Al a 50 55 60 Arg 11 e Lys Ser Asn Leu Lys Asp Thr Pro Asp Leu Tyr Ser H s H s 65 70 75 80 Phe G n Ser H s Gy G n Leu Phe Asp H s Pro H s AI a Leu Ser Pr o 85 90 95 Ser Ser Ser H s Thr G u Pr o Arg ay a u Asp AI a Vai Leu Ser Ser 100 105 110 G u Asp Leu H s Lys Pr o α y G n Vai Ser 11 e G n Leu Pro ay Thr 115 120 125 Asn Tyr 11 e Gy Pro ay Asn G u Leu G n AI a Gy Pro Pr o G n Ser 130 135 140 AI a Vai Asp Ser AI a AI a Arg 11 e H s Asp Phe Arg Tyr Ser G n Leu 145 150 155 160 AI a Lys Leu ay 11 e 165 Asn Pro Tyr Thr H s 170 Trp Thr vai Al a Asp 175 Q u G u Leu Leu Lys 180 Asn 11 e Lys Asn Gu 185 Thr ay Phe G n AI a 190 G n Al a Vai Lys Asp 195 Tyr Phe Thr Leu Lys 200 ay AI a AI a AI a Pro 205 Vai Al a H S 36

ΕΡ 1 791 858 /PT

Phe G n G y Ser Leu Pro G u Val Pr o AI a Tyr Asn AI a Ser G u Lys 210 215 220 Tyr Pr o Ser Mit Thr Ser Val Asn Ser AI a Q u AI a Ser Thr G y AI a 225 230 235 240 Gy G y Gy Gy Ser Asn Pro Val Lys Ser IVfet Trp Ser Q u G y AI a 245 250 255 Thr Phe Thr AI a Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg G n Phe Leu 260 265 270 1 1 e Pr o Tyr G u Pro G u H S Arg Tyr Lys Val Phe Ser Pr o AI a Al a 275 280 285 Ser Ser CVs H s Asn AI a Ser Qy Lys G u AI a Lys Val CVs Thr 11 e 290 295 300 Ser Pr o I I e rvbt G y Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 305 310 315 320 AI a Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pro Leu G u Phe G n H s Leu i i e G u 325 330 335 Asn Tyr G y Ser 11 e AI a Pro Asp AI a Leu Thr Val Thr I I e Ser Q u 340 345 350 11 e AI a Vai Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gy Gy Qy Val G n Val 355 360 365 Thr Asp Ser Thr Thr Gy Arg Leu CVs twfet Leu Val Asp H s G u Tyr 370 375 380 Lys Tyr Pr o Tyr Vai Leu G y G n Qy G n Asp Thr Leu AI a Pr o G u 385 390 395 400 Leu Pro 11 e Trp Vai Tyr Phe Pr o Pro G n Tyr AI a Tyr Leu Thr Al a 405 410 415 Gy Asp Vai Asn Thr G n Gy 11 e Ser Qy Asp Ser Lys Lys Leu Al a 420 425 430 Ser G u G u Ser AI a Phe Tyr Val Leu G u H s Ser Ser Phe G u Leu 435 440 445 Leu Q y Thr Qy G y Ser AI a Thr ivfet Ser Tyr Lys Phe Pr o Pr o Val 450 455 460 Pro Pr o G u Asn Leu G u G y CVs Ser G n H S Phe Tyr Q u IVfet Tyr 465 470 475 480 Asn Pr o Leu Tyr G y Ser Arg Leu Gy Val Pr o Asp Thr Leu Gy Gy 485 490 495 37

ΕΡ 1 791 858 /PT

Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr H S G u Asp H s AI a 1 1 e G n Pr o 500 505 510 Q η Asn Phe IVfet Pr o Gy Pr o Leu Vai Asn Ser Vai Ser Thr Lys G u 515 520 525 G y Asp Thr Ser Asn Thr Gy AI a Gy Lys AI a Leu Thr Gy Leu Ser 530 535 540 Thr Mil 3 y Thr Ser G n Ser Thr Ar q ! ! Θ Ser Leu Ar Q Pr o G y Pr o Val 545 550 555 560 Ser Q n Pro Tyr H s H s Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gy 11 e 565 570 575 Asn AI a I I e Ser H S Gy Q n Thr Thr Tyr Gy Asn Al a G u Asp Lys 580 585 590 G u Tyr G n G n Q y Vai Gy Arg Phe Pr o Asn G u Lys G u G n Leu 595 600 605 Lys G n Leu Q n G y Leu Asn I I e H s Thr Tyr Phe Pr o Asn Lys Gy 610 615 620 Thr G n G n Tyr Thr Asp Q n I I e Q u Arg Pr o Leu IVfet Val Gy Ser 625 630 635 640 Vai Trp Asn Arg Ar g AI a Leu H s Tyr Q u Ser Q n Leu Trp Ser Lys 645 650 655 1 1 e Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Q n Phe Al a ai a Leu Gy 660 665 670 G y Trp Gy Leu H s G n Pro Pro Pr o G n I I e Phe Leu Lys I I e Leu 675 680 685 Pr o G n Ser ay Pro I I e Gy Q y 11 e Lys Ser IVfet Qy 11 e Thr Thr 690 695 700 Leu Vai Q n Tyr AI a Vai Gy I I e IVfet Thr Vai Thr IVfet Thr Phe Lys 705 710 715 720 Leu G y Pro Arg Lys AI a Thr G y Arg Trp Asn Pr o G n Pr o Gy Val 725 730 735 Tyr Pr o Pr o H s AI a AI a Gy H S Leu Pr o Tyr Vai Leu Tyr Asp Pro 740 745 750 Thr AI a Thr Asp AI a Lys G n H S H s Arg H S Gy Tyr G u Lys Pr o 755 760 765 G u G u Leu Tr p Thr Ala Lys Ser Arg Val H s Pr o Leu 770 775 780 38

ΕΡ 1 791 858 /PT

<210> 3 <211> 781 <212> PRT <213> Parvovírus Β19 <400> 3 rvfet 1 Ser Lys Thr Thr 5 Asn Lys Trp Trp G u 10 Ser Ser Asp Lys Phe 15 Al a α η Asp Vai Tyr 20 Lys G n Phe Vai G n 25 Phe Tyr Gu Lys Al a 30 Thr Gy Thr Asp Leu α u Leu 11 e G n 11 e Leu Lys Asp H s Tyr Asn I I e Ser 35 40 45 Leu Asp Asn Pro Leu G u Asn Pr o Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Al a 50 55 60 Arg 65 11 e Lys Ser Asn Leu 70 Lys Asn Ser Pro Asp 75 Leu Tyr Ser H s H s 80 Phe G n Ser H s G y G n Leu Ser Asp H s Pr o H s Al a Leu Ser Ser 85 90 95 Ser Asn Ser Ser Al a G u Pro Arg Gy G u Asn Al a Vai Leu Ser Ser 100 105 110 Q u Asp Leu H s Lys Pro Gy G n Vai Ser l I e G n Leu Pro Gy Thr 115 120 125 Asn Tyr Vai Gy Pr o Gy Asn G u Leu G n Al a Qy Pro Pro G n Asn 130 135 140 AI a Vai Asp Ser Al a Al a Arg I I e H s Asp Phe Arg Tyr Ser G n Leu 145 150 155 160 AI a Lys Leu Q y 11 e Asn Pro Tyr Thr H s Trp Thr Val Al a Asp G u 165 170 175 Q u Leu Leu Lys Asn 11 e Lys Asn Gu Thr Gy Phe G n Al a Q n Al a 180 185 190 Vai Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gy Al a Ai a Al a Pro Val Al a H S 195 200 205 Phe G n Q y Ser Leu Pro G u Vai Pro Al a Tyr Asn Al a Ser G u Lys 210 215 220 Tyr Pr o Ser Nfet Thr Ser Vai Asn Ser Al a G u Al a Ser Thr Gy Al a 225 230 235 240 39

ΕΡ 1 791 858 /PT 0y Qy Qy Qy Ser Asn Pro Thr Lys Ser Ivfet Trp Ser G u Qy Al a 245 250 255 Thr Phe Thr AI a Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Q n Phe Leu 260 265 270 I I e Pr o Tyr Asp Pr o G u H s H s Tyr Lys Val Phe Ser Pro Al a Al a 275 280 285 Ser Ser Cys H S Asn Al a Ser Q y Lys Q u Al a Lys Val Cys Thr 11 e 290 295 300 Ser Pr o I I e IVfet Q y Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn 305 310 315 320 AI a Leu Asn Leu Phe Phe Ser Pr o Leu G u Phe G n H s Leu 11 e G u 325 330 335 Asn Tyr Qy Ser I I e Al a Pr o Asp Al a Leu Thr Val Thr 11 e Ser G u 340 345 350 I I e AI a Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Qy G y Qy Val G n Val 355 360 365 Thr Asp Ser Thr Thr Qy Arg Leu Cys IVfet Leu Val Asp H s G u Tyr 370 375 380 Lys Tyr Pr o Tyr Val Leu Qy G n Qy Q n Asp Thr Leu Al a Pr o G u 385 390 395 400 Leu Pr o I I e Trp Val Tyr Phe Pr o Pr o Q n Tyr Al a Tyr Leu Thr Val 405 410 415 Qy Q u Vai Asn Thr Q n Qy 11 e Ser Qy Asp Ser Lys Lys Leu Al a 420 425 430 Ser G u Q u Ser Al a Phe Tyr Val Leu G u H s Ser Ser Phe Q u Leu 435 440 445 Leu Qy Thr Q y G y Ser Al a Thr IVfet Ser Tyr Lys Phe Pr o Al a Val 450 455 460 Pr o Pr o G u Asn Leu G u G y Cys Ser G n H s Phe Tyr G u IVfet Tyr 465 470 475 480 Asn Pr o Leu Tyr G y Ser Arg Leu G y Val Pr o Asp Thr Leu Qy Qy 485 490 495 Asp Pr o Lys Phe Arg Ser Leu Thr H s G u Asp H s Al a 11 e G n Pro 500 505 510

Qn Asn Phe Ivfet Pr o Qy Pr o Leu II e Asn Ser Vai Ser Thr Lys 0u 40

ΕΡ 1 791 858 /PT 515 520 525

Gy Asp Asn Ser Asn Thr α y AI a 3 y Lys AI a Leu Thr 3 y Leu Ser 530 535 540 Thr Gy Thr Ser G n Asn Thr Arg lie Ser Leu Arg Pr o Gy Pro Vai 545 550 555 560 Ser Q n Pr o Tyr H s H s Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Vai Thr Q y 11 e 565 570 575 Asn AI a 11 e Ser H s Gy G n Thr Thr Tyr Gy Asn AI a G u Asp Lys 580 585 590 G u Tyr G π Q n G y Vai Q y Arg Phe Pro Asn G u Lys G u Q n Leu 595 600 605 Lys G n Leu G n G y Leu Asn Ivfet Hs Thr Tyr Phe Pr o Asn Lys Gy 610 615 620 Thr G n G n Tyr Thr Asp G n I I e G u Arg Pro Leu IVfet Vai Gy Ser 625 630 635 640 Vai Trp Asn Arg Arg AI a Leu H s Tyr G u Ser G n Leu Trp Ser Lys 645 650 655 1 1 e Pr o Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr G n Phe AI a AI a Leu Gy 660 665 670 G y Trp G v Leu H S G n Pro Pro Pro G n I I e Phe Leu Lys 11 e Leu 675 680 685 Pro G n Ser 3y Pr o 11 e Gy G y I I e Lys Ser IVtet Q y 11 e Thr Thr 690 695 700 Leu Vai Q n Tyr AI a Vai G y 11 e rvfet Thr Vai Thr iyfet Thr Phe Lys 705 710 715 720 Leu Gy Pr o Arg Lys AI a Thr 3 y Arg Trp Asn Pro Q n Pro 3 y Vai 725 730 735 Tyr Pro Pr o H s AI a AI a 3 y H s Leu Pro Tyr Vai Leu Tyr Asp Pro 740 745 750 Thr AI a Thr Asp AI a Lys G n H s H s Arg H s 3 y Tyr G u Lys Pro 755 760 765 G u Q u Leu Trp Thr AI a Lys Ser Arg Vai H s Pr o Leu 770 775 780 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> adjuvante 41 ΕΡ 1 791 858 /PT <4Ο0> 4

Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys 1 5 10

Lisboa, 2010-07-20

Claims (37)

1. ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de cápside VP1 modificada do parvovírus B19, que possui uma actividade enzimática análoga à fosfolipase A2 reduzida em comparação com a proteína de cápside VP1 de tipo selvagem do parvovírus BI 9 que possui a sequência de aminoácidos da SeqlD 1, em que um ou mais dos resíduos de aminoácido conservados no centro activo da fosfolipase A2 estão alterados na posição 153: histidina, na posição 157: tirosina, na posição 162: lisina e/ou na posição 168: tirosina.
2. 2. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a histidina 153 ser alterada para alanina.
3. 3. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a tirosina 157 ser alterada para fenilalanina.
4. 4. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a lisina 162 ser alterada para leucina.
5. 5. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a tirosina 168 ser alterada para fenilalanina.
6. 6. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a alternância dos resíduos de aminoácido ser efectuada por mutagénese dirigida ao local.
7. 7. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica a proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Vector de expressão recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7. ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 2/6
9. 9. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender adicionalmente a proteína de cápside VP2 do parvovírus B19.
10. 10. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a proteína de cápside VP1 modificada estar fundida com a proteína de cápside VP2.
11. 11. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10 .
12. 12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, que é E. coli, levedura, de preferência Saccharomyces cerevisiae, ou células animais.
13. 13. Processo de produção da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou do produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com a reivindicação 10, mediante a utilização da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11 ou 12.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que a proteína de cápside VP1 modificada e/ou o produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 são isolados e/ou purificados. ou produto de da proteína de acordo com a
15. 15. Proteína de cápside VP1 modificada fusão da proteína de cápside VP1 modificada e cápside VP2, obteníveis pelo processo de reivindicação 13 ou 14.
16. 16. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15, ou produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com a reivindicação 15 para utilização como medicamentos.
17. 17. Utilização da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 e 16, com ou sem a proteína de cápside VP2, para o fabrico de um ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 3/6 medicamento destinado ao tratamento contra a infecção por parvovirus BI 9 e/ou as doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovirus B19.
18. 18. Utilização do produto de fusão da proteína de cápside VPl modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com a reivindicação 15 ou 16, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento contra a infecção por parvovirus B19 e/ou as doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovirus B19.
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada por o tratamento ser contra artralgias; artrite, mais preferencialmente monoartrite, oligoartrite, poliartrite, artrite reumatóide e/ou artrite idiopática juvenil; lúpus eritematoso sistémico (LES); vasculite, mais preferencialmente vasculite leucoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome do exantema papulo-purpúrico em "luvas e meias" (SEPPLM), doença de Kawasaki, arterite de células gigantes (ACG), poliarterite nodosa e/ou granulomatose de Wegener; dermatomiosite; neutropenia auto-imune; trombocitopenia auto-imune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica auto-imune; e/ou síndrome hemofagocítica associada a um vírus (SHAV).
20. 20. Utilização da proteína de cápside VPl modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 e 16, ou do produto de fusão da proteína de cápside VPl modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com a reivindicação 15 ou 16, num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VPl do vírus BI 9 numa amostra que se pretende testar.
21. 21. Utilização das células hospedeiras de acordo com a reivindicação 11 ou 12, num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VPl do vírus B19 numa amostra que se pretende testar.
22. 22. Partículas análogas a um vírus recombinantes constituídas pela proteína de cápside VPl modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 15 a 16, com ou sem a proteína de cápside VP2. ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 4/6
23. 23. Partículas análogas a um vírus recombinantes constituídas pelo produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada e da proteína de cápside VP2 de acordo com a reivindicação 15 ou 16.
24. 24. Utilização das partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com a reivindicação 22 ou 23, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento contra infecção por parvovírus B19 e/ou doenças auto-imunes e reumáticas associadas ao parvovírus B19.
25. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por o tratamento ser contra artralgias; artrite, mais preferencialmente monoartrite, oligoartrite, poliartrite, artrite reumatóide e/ou artrite idiopática juvenil; lúpus eritematoso sistémico (LES); vasculite, mais preferencialmente vasculite leucoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome do exantema papulo-purpúrico em "luvas e meias" (SEPPLM), doença de Kawasaki, arterite de células gigantes (ACG), poliarterite nodosa e/ou granulomatose de Wegener; dermatomiosite; neutropenia auto-imune; trombocitopenia auto-imune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica auto-imune e/ou síndrome hemofagocítica associada a um vírus (SHAV).
26. 26. Utilização das partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com a reivindicação 22 ou 23, num ensaio destinado a detectar anticorpos dirigidos contra a proteína VP1 do vírus B19 numa amostra que se pretende testar.
27. 27. Composição farmacêutica, especialmente uma preparação de vacina, destinada a induzir uma resposta imune que proporciona protecção contra o parvovírus B19 humano, compreendendo a proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 e 16, com ou sem a proteína de cápside VP2.
28. 28. Composição farmacêutica, especialmente uma preparação de vacina, destinada a induzir uma resposta imune que proporciona protecção contra o parvovírus B19 humano, ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 5/6 compreendendo ο produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 15 ou 16.
29. 29. Composição farmacêutica, especialmente uma preparação de vacina, destinada a induzir uma resposta imune que proporciona uma protecção contra o parvovírus BI 9 humano, compreendendo as partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com a reivindicação 22 ou 23.
30. 30. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, compreendendo adicionalmente um ou mais veículos e/ou adjuvantes adequados para fins de vacinação.
31. 31. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, que compreende adicionalmente uma substância imunoestimulante, de preferência seleccionada entre o grupo que compreende polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, desoxinucleótidos imunoestimulantes (ODN), péptidos contendo pelos menos dois motivos LysLeuLys, compostos neuroactivos, especialmente hormona de crescimento humana, alúmen, adjuvantes completo ou incompleto de Freund ou suas combinações.
32. 32. Kit de diagnóstico compreendendo: i) uma proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 ou 16 e ii) reagentes suplementares.
33. 33. Kit de diagnóstico compreendendo: i) um produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com as reivindicações 15 ou 16 e ii) reagentes suplementares.
34. 34. Kit de diagnóstico compreendendo: i) partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com a reivindicação 22 ou 23 e ii) reagentes suplementares. ΕΡ 1 791 858/ΡΤ 6/6
35. 35. Proteína de cápside VP1 modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 ou 16, com ou sem a proteína de cápside VP2, como aqente para modificar a actividade de uma actividade de fosfolipase A2 do hospedeiro.
36. 36. Produto de fusão da proteína de cápside VP1 modificada de acordo com a reivindicação 15 ou 16, como agente para modificar a actividade de uma actividade de fosfolipase A2 do hospedeiro.
37. 37. Partículas análogas a um vírus recombinantes de acordo com a reivindicação 22 ou 23, como agente para modificar a actividade de uma actividade de fosfolipase A2 do hospedeiro. Lisboa, 2010-07-20