BRPI0609161A2

BRPI0609161A2 - e-selectina recombinante preparada em células de inseto

Info

Publication number: BRPI0609161A2
Application number: BRPI0609161-0A
Authority: BR
Inventors: Gale Smith; Vittoria Coice; Peter Pushko
Original assignee: Novavax Inc
Priority date: 2005-03-10
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2010-02-23
Also published as: EP1871802A4; US20110245186A1; WO2006099006A2; NZ562204A; RU2007137494A; MX2007011067A; JP2008532518A; US20100035813A1; CA2600690A1; SG160387A1; AU2006223422A1; IL185838A0; NO20075070L; KR20080026085A; US20070244043A1; WO2006099006A3; EP1871802A2

Abstract

E-SELECTINA RECOMBINANTE PREPARADA EM CELULAS DE INSETO. As características inventivas incluem peptídeos recombinantes de E-selectina de mamíferos, ácidos nuclélcos que codificam os referidos peptídeos, vetores e células possuindo esses ácidos nuclélcos, e métodos de preparo dos peptideos. Características inventivas adicionais incluem usos dos peptídeos recombinantes de E-selectina para induzir a tolerância mucosal à E-selectina, na fabricação de medicamentos para o tratamento de condições ou doenças associadas à inflamação.

Description

"E-SELECTINA RECOMBINANTE PREPARADA EM CÉLULAS DE

INSETO"

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica o beneficio dePedido de Patente Provisória US n°: 60/660.258 depositado em de março 10 de 2005. Todos os ensinos do pedido de paten-te acima são incorporados neste por referência.

Histórico da Invenção

A E-selectina é uma molécula de adesão celular deglicoproteina da superfície celular que é indutivel por ci-tocina e é encontrada exclusivamente em células endoteliais.A E-selectina medeia a adesão de vários leucócitos, incluin-do neutrófilos, monócitos, eosinófilos, células killer natu-rais (NK) e um subconjunto de células T, ao endotélio ativa-do . A expressão de E-selectina é induzida em células endote-

v

liais humanas em resposta às citocinas associadas à inflama-ção de IL-I e de alfa TNF, assim como ao lipopolissacarideo(LPS), com a regulação transcricional.

As intervenções anti-inflamatórias convencionaisincluem a retirada do conjunto de leucócitos circulatórios,inibindo a função do leucócito, e o uso de fármacos imunos-supressores tais como a ciclosporina A e FK506. Entretanto,a maioria de agentes imunossupressores disponíveis - têm efei-tos colaterais sistêmicos que limitam seu uso em longo pra-zo .

Demonstrou-se que a administração mucosal de auto-antigenos suprime a atividade da inflamação e da doença nosmodelos de derrame e de arteriosclerose assim como em diver-sos modelos de auto-imunidade tais como o diabetes, artrite,e encefalomielite alérgica experimental. A administração demúltiplas doses baixas de E-selectina através administraçãonasal/oral induz a tolerância mucosal a E-selectina. A tole-rância mucosal é um modelo bem estabelecido por meio do quala tolerância imunológica é induzida a um antigeno especificocom a instilação ou a alimentação nasal desse antigeno. 0antigeno administrado nasalmente encontra o tecido linfóidenasalmente associado que evoluiu para proteger o hospedeirodos patógenos invasores e desenvolveu a propriedade inerentede impedir que o hospedeiro reaja às proteínas inaladas quenão são patogênicas. A tolerância ativa com produção de cé-lulas T reguladoras ocorre após repetitivas administraçõesde baixa-dose de antigeno.A expressão de E-selectina não é constitutiva,sendo virtualmente limitada ao endotélio que está se tornan-do ativado em resposta aos estímulos inflamatórios tais comoIL-I, alfa TNF, ou LPS. A E-selectina pode ser cronicamenteexpressa no local da inflamação local in vivo, e como tal aE-selectina serve como uma molécula tolerizante apropriadapara guiar as células T reguladoras que foram tolerizadas aE-selectina aos locais da ativação endoteliais. Estas célu-las T reguladoras que tiveram que ser tolerizadas com um re-gime de dose baixa secretam citocinas tais como IL-10 e fa-tor de transformação de crescimento (TGF) bl na re-estimulação do antigeno que suprime THl respostas imunológi-cas.

Embora a ativação destas células T seja especificapara o antigeno tolerizante (neste caso E-selectina) , as ci-tocinas imunomoduladoras secretada em resposta à ativaçãoque têm efeitos não específicos. Assim, onde quer que o an-tigeno tolerizante esteja presente, a imunossupressão localocorrerá.

Usando a E-selectina como o agente tolerizante,alguém pode direcionar a imunossupressão para o segmentovascular ativado.

Sumário da Invenção

As características da presente invenção incluempeptideos de mamíferos recombinantes de E-selectina, os áci-do nucléico que codificam estes peptideos, os vetores e ascélulas que têm estes ácido nucléico, e os métodos de fazeros peptideos. Características inventivas adicionais incluemmétodos de tratamento de doenças inflamatórias usando pepti-deos de mamíferos recombinantes de E-selectina para induzira tolerância mucosal a E-selectina.

A invenção fornece uma série de peptideos E-selectina de mamíferos. Um peptideo de E-selectina consisteessencialmente nos resíduos #20 - 303 do tipo E-selectinahumana nativo (SEQ ID N°.: 1). Este peptideo pode ter um oumais marcadores de terminais C unido a ele, incluindo um di-peptideo carbóxi terminal RS. Além disso, a invenção incluieste peptideo com um peptideo sinal secretório de N-terminalunido a ele. Enquanto os peptideos recombinantes humanos sãopreferidos, outros peptideos de mamíferos, preferivelmentede 200 a 400 aminoácidos, tendo pelo menos a identidade de60% com SEQ ID N°. : 1, podem ser usados. As misturas e ascombinações de peptideos E-selectina de mamiferos são tambémcontempladas .

Os marcadores de C-terminal dos peptideos da in-venção incluem marcadores de purificação e marcadores de es-tabilização tais como marcadores de cmyc e marcadores dehistidina. Os peptideos sinal secretórios de N-terminal in-cluem peptideos derivados de células tanto de mamíferos comode insetos. Os peptideos sinal secretórios de N-terminal in-cluem as seqüências secretórias AcMNPV gp64 env MGWSWIFLFL-LSGTASVHS (SEQ ID N°. : 3) , a seqüência de peptideo sinalMGWSWIFLFLLSGTAS (SEQ ID N°.: 4), assim como o peptideo si-nal humano do tipo nativo de seqüência 5 MIAS QFLS ALTLVLLI-KES GA (SEQ ID N°. : 2). Os peptideos da invenção podem serproduzidos em várias linhagens celulares e incluem célulasde inseto, células de mamíferos, células bacterianas e deleveduras.

A invenção caracteriza também as moléculas de áci-do nucléico que codificam uma série de peptideos de mamífe-ros de E-selectina. As moléculas de ácido nucléicas codifi-cam um peptideo de E-selectina que consiste essencialmentede resíduos #20 - 303 de E-selectina humana do tipo nativo(SEQ ID N°.: 1). As moléculas de ácido nucléico que codifi-cam este peptideo de E-selectina que pode ter um ou maismarcadores C-terminal ligados a ele, incluindo um dipeptideocarbóxi terminal RS. Além disso, a invenção inclui as molé-culas de ácido nucléico que codificam este peptideo de E-selectina básico com um peptideo sinal secretório N-terminalunido a ele. Enquanto as moléculas de ácido nucléico que co-dificam peptideos recombinantes humanos são preferidas, pre-ferivelmente de 200 a 400 aminoácidos, codificando outrospeptideos de mamiferos tendo identidade de pelo menos 60%com SEQ ID N°.: 1 pode ser usado. As misturas e as combina-ções de peptideos de mamiferos de E-selectina são tambémcontempladas.

A invenção caracteriza também as moléculas de áci-do nucléico que codificam o marcador de purificação e marca-dor de estabilização tais como o marcador cmyc e marcador dehistidina. As moléculas de ácido nucléico podem codificarpeptideos sinal N-terminal secretórios incluindo peptideosderivados de células de mamíferos e de inseto. As moléculasde ácido nucléico podem codificar os peptideos sinal N-terminal secretórios incluindo a seqüência secretória AcMNPVgp64 env MGWSWIFLFLLSGTASVHS (SEQ ID N°.: 3), a seqüência depeptideo sinal MGWSWIFLFLLSGTAS (SEQ ID N°. : 4), assim comoo peptideo sinal humano do tipo nativo de seqüência 5 MIASQFLS ALTLVLLIKES GA (SEQ ID N°. : 2). As moléculas de ácidonucléico podem ser usadas para produzir os peptideos da in-venção em várias linhagens celulares e inclui células de in-seto, células de mamíferos, células bacterianas e de levedu-ras .

A invenção caracteriza também um baculovirus tendouma seqüência de nucleotideos que codifica um peptideo de E-selectina, um vetor tendo uma seqüência de nucleotideos quecodifica um peptideo de E-selectina, ou um vetor de transfe-rência recombinante de baculovirus incluindo o segmento deDNA que codifica um peptideo sinal de baculovirus ligado ao`ácido nucléico que codifica um peptideo de E-selectina. Aseqüência de DNA é posicionada de modo que o peptideo codi-ficado de E-selectina seja traduzido no frame com o peptideosinal codificado. Este vetor de transferência recombinantedo baculovirus é ligado preferivelmente operacionalmente aum promotor do baculovirus para expressar o ácido nucléicoque codifica um peptideo de E-selectina em uma célula dohospedeiro. As células do hospedeiro podem incluir célulasde inseto, células bacterianas e células de mamíferos. Pre-ferivelmente, o vetor de transferência recombinante do bacu-lovirus inclui seqüências para secretar um peptideo de E-selectina da invenção em um meio de cultura para a referidacélula hospedeira do inseto. A invenção caracteriza também uma composição quetem um ou mais peptideos de E-selectina ou nucleotideos e umveiculo, preferivelmente um veiculo farmaceuticamente acei-tável . As células e as composições isoladas das células queincluem um peptideo de E-selectina ou um nucleotideo que co-dificam um peptideo de E-selectina são também parte da in-venção. As células úteis incluem células de mamíferos, célu-las bacterianas e células de inseto, preferivelmente célulasde inseto.

A invenção ainda caracteriza um método de produzirum peptideo de E-selectina da invenção. Isto inclui iniciarpela criação de um vetor de transferência recombinante queinclua um segmento de DNA que codifica um peptideo sinal dobaculovirus ligado a um ácido nucléico que codifica um pep-tideo de E-selectina, de modo que a seqüência sinal e o áci-do nucléico que codificam um peptideo de E-selectina sejamtraduzidos no frame. 0 segmento de DNA que codifica um pep-tideo sinal do baculovirus é ligado operacionalmente a umpromoter do baculovirus para expressar e secretar um pepti-deo de E-selectina em células de inseto. Primeiro as célulasdo inseto são cotransfectadas com o DNA recombinante do ve-tor de transferência e do baculovirus para gerar o baculovi-rus recombinante. 0 baculovirus recombinante é coletado. De-pois as células de inseto são infectadas com o baculovirusrecombinante coletado. As células infectadas de inseto sãocultivadas em um meio para expressar e secretar um peptideode E-selectina. 0 meio de cultura é coletado e purificadopara coletar o peptideo de E-selectina.

A invenção inclui também um método de tratar umadoença mediada por inflamação ou uma condição em um indiví-duo, induzindo a tolerância mucosal a um peptideo de E-selectina solúvel.

Isto é realizado pela administração de doses bai-xas múltiplas individuais de E-selectina através de uma rotade administração nasal ou oral.

Breve Descrição dos Desenhos

Os objetos e as características da invenção podemser mais bem compreendidos em referência a seguinte descri-ção e desenhos detalhados.

A Figura 1 (SEQ ID N°. : 8) são as designações deseqüência de aminoácidos e estrutura da função da proteínade um peptideo de E-selectina recombinante humano.A Figura 2 mostra o alinhamento de peptideos de E-selectina humanos recombinantes a E-selectina humana do tiponativa.

Descrição Detalhada da Invenção

Esta invenção fornece peptideos de E-selectina re- combinantes, DNA que codifica os peptideos de E-selectina, emétodos de produzir e de utilizar os peptideos. As seguintesdefinições são inteiramente usadas.Definições:

A prática da presente invenção empregará, a menos que indicada de outra maneira, as técnicas convencionais dabiologia molecular, microbiologia e as técnicas de DNA re-combinante, que estão dentro da habilidade da técnica. Taistécnicas são explicadas inteiramente na literatura. Veja,por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular

Clonagem: A Laboratory Manual, segunda edição; Oligonucleo-tide Synthesis (MJ. Gait, ed. , 1984); Nucleic Acid Hybridi-zation (B.D. Harnes & SJ. Higgins, eds., 1984); A PracticalGuide to Molecular Clonagem (B. Perbal, 1984); e uma série,Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Short Proto-

cols In Molecular Biology, (Ausubel et al., ed., 1995). To-das as patentes, pedidos de patente, e publicações menciona-das neste, supra e infra, são incorporadas por este meio porreferência em suas totalidades.

Como usado aqui, de a "região N-terminal" de um

peptideo refere-se às seqüências de peptideo codificadas pe-las seqüências de polinucleotideo (de fita dupla ou simples)situadas dentro ou na extremidade 5' de um gene e inclui,mas não é limitada a, a região de codificação de proteína 5'de um gene. Como usado aqui, a região "amino terminal" refe-re-se a extremidade amino terminal de um peptideo até osprimeiro 300 aminoácidos ou 1/3 do peptideo, começando peloprimeiro aminoácido do peptideo. A região "amino terminal"de um peptideo não é mais curta que 3 aminoácidos no compri-mento e não mais longa que 350 aminoácidos no comprimento.Outros comprimentos possiveis da região "amino terminal" deum peptideo incluem, mas não são limitados a, 5, 10, 20, 25,50, 100 e 200 aminoácidos.

Como usado aqui, a região "carbóxi terminal" ou aregião "C-terminal" de um peptideo refere-se às seqüênciasde polipeptideo codificadas pelas seqüências de polinucleo-tideo (de fita dupla ou única) situadas dentro ou na extre-midade 3' de um gene, e inclui, mas não é limitada a, a re-gião codificador a de proteina 3' de um gene. Como usada a-qui, a região "carbóxi terminal" refere-se à extremidadeterminal carbóxi de um peptideo de até 300 aminoácidos ou de1/3 do peptideo a partir do último aminoácido do peptideo. A"extremidade 3'" não inclui a cauda poliA, se a mesma esti-ver presente. A região "carbóxi terminal" de um polipeptideonão é mais curta que 3 aminoácidos no comprimento e não émais longa que 350 aminoácidos no comprimento. Outros com-primentos possiveis da região "carbóxi terminal" de um pep-tideo incluem, mas não são limitados a, 5, 10, 20, 25, 50,100 e 200 aminoácidos.

Um peptideo de E-selectina que tenha uma seqüênciade aminoácidos similar a um segundo peptideo de E-selectinaé um que satisfaça pelo menos a um dos seguintes: (a) umpeptídeo de' E-selectina que tem uma seqüência de aminoacidosque seja pelo menos 60%f pelo menos 65%, pelo menos 70%, pe-lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% idênticos à seqüênciade aminoacidos de um segundo peptídeo de E-selectina; (b) umpeptídeo de E-selectina codificado por uma seqüência de nu-cleotídeos que hibridize sob circunstâncias estritas uma se-qüência de nucleotídeos que codifica um segundo agente pro-teináceo de pelo menos 25 resíduos contíguos de aminoacidos,pelo menos 4 0 resíduos contíguos de aminoacidos, pelo menos50 resíduos contíguos de aminoacidos, pelo menos 60 aminoresíduos contíguos, pelo menos 70 resíduos contíguos de ami-noacidos, pelo menos 80 resíduos contíguos de aminoacidos,pelo menos 90 resíduos contíguos de aminoacidos, pelo menos100 resíduos contíguos de aminoacidos, pelo menos 125 resí-duos contíguos de aminoacidos, ou pelo menos 150 resíduoscontíguos de aminoacidos; e (c) um peptídeo de E-selectinacodificado por uma seqüência de nucleotídeos que seja pelomenos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%,pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos95% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de nucleotídeosque codifica um segundo peptídeo de E-selectina.

Um primeiro peptídeo de E-selectina com estruturasimilar a um segundo peptídeo de E-selectina refere-se a umpeptídeo de E-selectina que tenha uma estrutura secundária,terciária ou quaternária similar ao segundo peptídeo de E-selectina. A estrutura de um peptídeo de E-selectina podeser determinada pelos métodos conhecidos por aqueles versa-dos na técnica, incluindo, mas não limitada a, seqüenciamen-to de peptídeo, cristalografia de raio X, ressonância magné-tica nuclear, no dicroísmo circular, e microscopia de elé-tron cristalográfico.

Para determinar a identidade percentual de duasseqüências de aminoácidos ou de duas seqüências de ácidosnucléicos, as seqüências são alinhadas para fins de compara-ção ótima (por exemplo, os intervalos podem ser introduzidosna seqüência de uma primeira seqüência de aminoácidos ou deácidos nucléicos para o alinhamento ótimo com segundo umaseqüência de aminoácidos ou do ácido nucléico). Os resíduosou os nucleotídeos de aminoácidos em posições corresponden-tes de aminoácidos ou em posições de nucleotídeos são entãocomparados. Quando uma posição na primeira seqüência é ocu-pada pelo mesmo resíduo de aminoácidos ou nucleotídeos que aposição correspondente na segunda seqüência, então as molé-culas são idênticas nessa posição. A identidade percentualentre as duas seqüências é uma função do número das posiçõesidênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é, identida-de percentual = número de posições sobrepostas idênticas /número total de posições . vezes . 100%). As duas seqüênciaspodem ter o mesmo comprimento.

A determinação de uma identidade percentual entreduas seqüências também pode ser realizada usando um algorit-mo matemático. Um exemplo preferido, mas não limitado, de umalgoritmo matemático utilizado para a comparação de duas se-qüências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 2264-2268, modified as in Karlinand Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 5873-`5877. tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e X-BLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403. Asbuscas de nucleotideos BLAST podem ser executadas com o con-junto de parâmetros do programa de nucleotideos NBLAST, porexemplo, para valor - 100, comprimento de palavra = 12 paraobter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de umácido nucléico da presente invenção. As buscas da proteinaBLAST podem ser executadas com o conjunto de parâmetros doprograma XBLAST, por exemplo, para valor - 50, comprimentode palavra = 3 para obter as seqüências de aminoácidos homó-logas a uma molécula da proteina da presente invenção. Paraobter alinhamentos com intervalos para fins de comparação,Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul etal., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamen-te, PSI-BLAST pode ser usado para executar uma busca iteradaque detecte relacionamentos distantes entre as moléculas(Id.). Ao utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (porexemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados (veja, por exem-plo, o Web site de NCBI). Outro exemplo preferido, não limi-tado, de um algoritmo matemático utilizado para a comparaçãodas seqüências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN(versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamen-to de seqüência de GCG. Ao utilizar o programa ALIGN paracomparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de residuo depeso PAM 12 0, uma penalidade de comprimento de intervalo de, e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usados.

A identidade percentual entre duas seqüências podeser determinada usando as técnicas similares àquelas descri-tas acima, com ou sem a permissão de intervalos. Ao calculara identidade percentual, tipicamente somente as combinaçõesexatas são contadas.

Como usado aqui, o termo "análogo" no contexto deum análogo do peptideo de E-selectina refere-se a uma segun-da molécula orgânica ou inorgânica que possua uma função si-milar ou idêntica ao peptideo de E-selectina e é estrutural-mente similar ao peptideo de E-selectina. 0 termo "análogo"inclui uma molécula cuja estrutura do núcleo seja a mesmacomo, ou se pareça bastante com a do peptideo de E-selectina, mas que tenha uma modificação quimica ou fisica.0 termo "análogo" inclui os copolimeros do peptideo de E-selectina que podem ser ligados a outros átomos ou molécu-las. Um "análogo biologicamente ativo" e "análogo" são usa-dos permutavelmente neste para cobrir uma molécula orgânicaou inorgânica que exiba substancialmente o mesmo efeito ago-nista ou antagonista do peptideo de E-selectina.

Um "análogo de nucleotideo" do peptideo de E-selectina, Como usado aqui, refere-se a um nucleotideo emque o açúcar pentose e/ou um ou mais ésteres de fosfato sãosubstituídos com seu análogo respectivo. Os análogos exem-plares de éster de fosfato incluem, mas não são limitados a,alquilfosfonatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, fosfotri-éteres , fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforoselenoatos,fosforodiselenoatos, fosforoanilotioatos, fosforoanilidatos,fosforoamidatos, boronofosfatos, etc. , incluindo nenhunscontra-ions associados, se presente. São incluidos tambémdentro da definição de "análogo de nucleotideo" os monômerosde nucleobase que podem ser polimerizados nos análogos depolinucleotideos em que o éster de fosfato de DNA/RNA e/ou aestrutura principal do éster de fosfato do açúcar sejamsubstituídos com um tipo diferente de ligação. Ainda inclui-dos dentro de "análogo de nucleotideo" estão os nucleotideosem que a fração de nucleobase é não-convencional, isto é,difere de um de G, A, T, U ou C. Geralmente um nucleobasenão-convencional terá a capacidade de formar pelo menos pon-tes de hidrogênio com a fração de nucleobase presente em umafita de polinucleotideo adjacente contra-direciona1 ou for-necer uma base que não interaja, e não interfira.Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" refe-re-se à quantidade de um peptideo de E-selectina ou um ácidonucléico que seja suficiente para reduzir ou melhorar a pro-gressão, severidade e/ou duração da inflamação ou um ou maissintomas da mesma, impedir o desenvolvimento da inflamaçãoou de o um ou mais sintomas da mesma, impedir o avanço dainflamação ou de um ou mais sintomas da mesma, ou para im-plementar ou melhorar os efeitos profiláticos ou terapêuti-cos de uma outra terapia.

Como usado neste, o termo "quantidade eficaz" re-fere-se a quantidade de peptideo de E-selectina que é sufi-ciente para induzir a tolerância a E-selectina através daadministração nasal.

Como usado aqui, o termo "fragmento" no contextodo uma proteína de E-selectina refere-se a um peptídeo ou aum polipeptídeo que compreendem uma seqüência de aminoácidosde pelo menos 25 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo me-nos 40 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 50 re-síduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 60 amino resí-duos contíguos, pelo menos 70 resíduos contíguos de aminoá-cidos, pelo menos 80 resíduos contíguos de aminoácidos, pelomenos 90 resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 100resíduos contíguos de aminoácidos, pelo menos 125 resíduoscontíguos de aminoácidos, pelo menos 150 resíduos contíguosde aminoácidos, pelo menos 17 5 resíduos contíguos de aminoá-cidos , pelo menos 2 00 resíduos contíguos de aminoácidos, oupelo menos 250 resíduos contíguos de aminoácidos da seqüên-cia de aminoácidos de um E-selectina mamíferos. Um fragmentode uma proteína ou de um polipeptídeo útil na invenção man-tém pelo menos uma função de uma E-selectina de mamífero. Umfragmento de uma proteína ou de um polipeptídeo pode manterduas, três, quatro ou mais funções de uma E-selectina de ma-mífero . Como usado aqui, o termo "em combinação" quando sereferir aos tratamentos terapêuticos refere-se ao uso demais de um tipo de terapia (por exemplo, mais de um agenteprofilático e/ou agente terapêutico). O uso do termo "nacombinação" não restringe a ordem em que as terapias (porexemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos) são admi-nistradas a um indivíduo. Uma primeira terapia (por exemplo,um primeiro agente profilático ou terapêutico) pode ser ad-ministrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30minutos, 4 5 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12horas, 24 horas, 4 8 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 • semanas, 8 sema-nas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subse-qüente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 4 5minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 ho-ras, 48 horas., 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12semanas em seguida) a administração de uma segunda terapia(por exemplo, um agente segundo profilático ou terapêutico)a um indivídu o.

Como usado aqui, "isolado" ou "purificado" quandousado em referência a um peptideo ou ácido nucléico signifi-ca que uma seqüência natural foi removida de seu ambientecelular normal (por exemplo, cromossornai) ou sintetizado emum ambiente não-natural (por exemplo, sintetizado artifici-almente) . Assim, a seqüência "isolada" ou "purificada" podeestar em uma solução livre de células ou colocada em um am-biente celular diferente. O termo "purificado" não implicaque a seqüência é o único nucleotideo ou peptideo presente,mas que está essencialmente livre (aproximadamente 90 a 95%puro) de material não-nucleotideo ou não-peptideo associadonaturalmente a ela, e é assim distinta dos cromossomos iso-lados.

Como usado aqui, os termos "isolado" e "purifica-do" no contexto de um agente proteináceo (por exemplo, umpeptideo, um polipeptideo, uma proteína ou um anticorpo) re-fere-se a um agente proteináceo que esteja substancialmentelivre de material celular e em algumas modalidades, substan-cialmente livre dos agentes proteináceos heterólogos (istoé, proteínas contaminadoras) de célula ou da fonte do tecidode que são derivadas, ou livrar substancialmente dos precur-sores quimicos ou de outros produtos quimicos quando sinte-tizados quimicamente. A expressão "substancialmente livre dematerial celular" inclui preparações de um agente proteiná-ceo em que o agente proteináceo é separado dos componentescelulares das células das quais é isolado ou produzido re-combinantemente. Assim, um agente proteináceo que seja subs-tancialmente livre de material celular inclui preparações deum agente proteináceo que tenha menos do que aproximadamente30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) do agente proteináceoheterólogo (por exemplo, proteína, polipeptideo, peptideo,ou anticorpo; referido também como "proteína contaminado-ra") - Quando o agente proteináceo é produzido recombinante-mente, está também preferivelmente substancialmente livre domeio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menosdo que aproximadamente 20%, 10%, ou 5% do volume da prepara-ção da proteína. Quando o agente proteináceo é produzido pe-la sintese quimica, está preferivelmente substancialmentelivre de precursores quimicos ou outros produtos quimicos,isto é, é separado dos precursores quimicos ou dos outrosprodutos quimicos que são envolvidos na sintese do agenteproteináceo. Do mesmo modo, tais preparações de um agenteproteináceo têm menos do que aproximadamente 30%, 20%, 10%,5% (pelo peso seco) de precursores quimicos ou compostos àexceção do agente proteináceo do interesse. Preferivelmente,os agentes proteináceo divulgados aqui são isolados.

Como usado aqui, o termo "ácido nucléico" é permu-tável com o termo "polinucleotideo" e geralmente refere-se atodo o poli-ribonucleotídeo ou poli-desoxirribonucleotideo,que puder ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modi-ficado ou qualquer combinação disso. Os "ácidos nucléicos"incluem, sem limitação, ácido nucléico de fita única e du-pla. Como usado aqui, o termo "ácido nucléico" inclui tambémDNAs ou RNAs como descrito acima que contém uma ou mais ba-ses modificadas- Assim, DNAs ou RNAs com as estruturas prin-cipais modificadas por razão da estabilidade ou por outrasrazões são "ácidos nucléicos". 0 termo "ácido nucléico" comoé usado neste engloba tais formas quimicamente, enzimatica-mente ou metabolicamente modificados de ácido nucléico, as-sim como as formas quimicas de DNA e de RNA característicasdos virus e das células, incluindo, por exemplo, célulassimples e complexas. Um "ácido nucléico" ou "seqüência deácido nucléico" pode também incluir regiões de RNA ou DNA defita única ou dupla ou todas as combinações dos mesmos.

Como usado aqui, "ácido nucléico" abrange o DNA defita dupla, o DNA de fita única e o RNA de fita dupla ou defita única de mais de 8 nucleotideos no comprimento. 0 termo"polinucleotideo" inclui uma forma polimérica dos nucleoti-deos de qualquer comprimento, ribonucleotideos ou os deso-xirribonucleotideos, que compreende bases purina e pirimidi-na, ou outras bases naturais, quimicamente ou bioquimicamen-te modificadas, não-naturais, ou derivadas de nucleotideos.A estrutura principal do polinucleotideo pode compreenderaçúcares e grupos de fosfato, como pode ser tipicamente en-contrado no RNA ou no DNA, ou grupos modificados ou substi-tuídos de açúcar ou de fosfato. Um polinucleotideo pode com-preender nucleotideos modificados, tais como nucleotideos5 metilados e análogos de nucleotideos. A seqüência de nucleo-tideos pode ser interrompida por componentes não-nucleotideos.

Como usado aqui, "paciente" ou "indivíduo" refere-se a um mamífero, preferivelmente ser humano, ao qual é ad-

ministrado o peptideo de E-selectina.

Como usado aqui, a expressão "veiculo farmaceuti-camente aceitável" inclui, mas não é limitada a, composiçõesaquosas ou não aquosas que compreendem sais dos grupos áci-dos ou básicos que podem estar presentes nos compostos iden-

tifiçados usando os métodos da presente invenção. Os compos-tos que são básicos na natureza são capazes de formar umavariedade ampla de sais com vários ácidos inorgânicos e or-gânicos . Os ácidos que podem ser usados para preparar farma-ceuticamente sais aceitáveis de adição ácida de tais compos-

tos básicos são aqueles que formam sais de adição ácida ató-xicos, isto é, sais que contêm os ânions farmacologicamenteaceitáveis, incluindo, mas não limitados a, os sais sulfúri-co, citrico, maléico, acético, oxálico, clorídrico, bromi-drico, iodidrico, nitrato, sulfato, bissulfato, fosfato,

fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato,citrato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotena-to, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato,fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoa-to, glutamato, me tanosulfonato, etanosulfonato, benzenosul-fonato, p-toluenosulfonato e o pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis-(2-hidróxi-3-naftoato)). Os compostos que in-cluem uma fração amina podem formar sais farmaceuticamenteaceitáveis com vários aminoácidos, além dos ácidos menciona-dos acima. Os compostos que são ácidos na natureza são capa-zes de formar sais baixos com os vários cátions farmacologi-camente aceitáveis. Os exemplos de tais sais incluem saisalcalinos ou alcalino-terrosos e, particularmente, sais decálcio, magnésio, sódio litio, zinco, potássio, e ferro.

Como usado aqui, as "seqüências de polipeptideocodificadas por" referem-se às seqüências de aminoácidos ob-tidas após a tradução da região codificadora de proteína deum gene, como definidas neste.

Como usado aqui, os termos "proteína" e "peptideo"e "polipeptideo" são usados permutavelmente para se referira uma cadeia de aminoácidos unidas por ligações de peptideo.Em uma modalidade especifica, uma proteína é composta de me-nos de 200, menos de 175, menos de 150, menos de 125, menosde 100, menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35,menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 15, menos de10, ou mais menos de 5 aminoácidos ligados junto pelo pepti-deo ligam-se. Uma proteína é composta de pelo menos 200, pe-lo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 350, pelo menos4 00, pelo menos 4 50, pelo menos 500 ou mais aminoácidos li-gados por ligações de peptideo.

Uma "região codificadora de proteína" refere-se àparcela de RNAm que codifica um polipeptideo.A presente invenção é baseada, em parte, no reco-nhecimento de que certas partes ou domínios do dominio ex-tracelular de E-selectina podem ter efeitos benéficos. Ospeptideos recombinantes, preferivelmente o fragmento 20 a303 do peptideo humano de E-selectina, e o DNA e as célulasque codificam ou produzem estes peptideos são úteis nestainvenção.

Exemplo de uma Composição que Compreende o Pepti-deo Solúvel de E-Selectina Projetado para Induzir a Tolerân-cia

O peptideo de E-selectina é uma solução liquidasolúvel límpida de proteina que é fornecida em solução tam-pão salina fosfato (PBS). A substância fármaco é derivada decélulas Sf-9S de inseto (Spodoptera frugzperda da familiaLepidopteran) infectadas com vetor de baculovirus AcMNPV re-combinante (virus Autographica calif orni.ica multinuclearpolyhedrosis da familia Baculoviridae) codificando na porçãoextracelular da proteina de E-selectina humana com os domí-nios do fator do crescimento epidérmico (EDF) ligando a lec-tina fundidos ao sinal secretório gp64 nos terminal amino ecmyc e marcadores de peptideo de poli-histidina no carbóxiterminal (1).

O gene clonado que codifica a proteina de E-selectina humana recombinante é um polipeptideo de 331 ami-noácidos compreendido de 19 aminoácidos do peptideo sinalsecretório da proteina do envelope gp64 do baculovirus A-cIVfNPV, de 291 aminoácidos da proteina humana de E-selectina (porção extracelular aa 20 - aa 310 com dominioligando a lectina aa 40 - aa 120 e domínio EGF aa 200 - na 275), de 9 aminoácidos da proteína cmyc, de 6 aminoácidos de um peptídeo espaçador neutro do, e de um marcador de poli-histidina de 6 aminoácidos (6 x HIS) . Em uma forma alternativa, o marcador cmyc é omitido, e em um outra formula alternativa, o marcador cmyc e seu marcador é omitido, (figura 2) . 0 peptideo sinal secretório, que é derivado da proteína do envelope gp64 do baculovirus AcMINPV, facilita o transporte intracelular do peptideo alvo, processamento, e a se-creção da proteína de E-selectina humana recombinante. A porção extracelular do polipeptideo de E-selectina humana da substância fármaco serve como uma molécula efetora de tole-rogênio para estimular a supressão de respostas inflamató-rias e outras imunológicas ativas na patologia do derrame. 0 peptideo cmyc, que é um epitopo monoclonal do anticorpo localizado no domínio não transformador de cmyc, age como um marcador de identidade para a molécula humana recombinante da proteína de E-selectina durante a purificação da proteína. O 6 x HIS peptideo, que se liga aos metais pesados tais como niquel, cobalto, e outro com uma constante de ligação forte (Kd > IO"9 M) , é usado para purificar proteínas humanas recombinantes de E-selectina por cromatografia de afinidade de metal imobilizado.

Estoque do Virus que Codifica um Peptideo de E -

selectina

A clonagem de DNA recombinante de um fragmento de DNA sintetizado in vitro usou um gene de códon otimizado que codifica a porção extracelular da E-selectina humana (resi-duos de aminoácidos 20 - 310) fundido com os marcadores car-bóxi terminais do peptideo cmyc e do peptideo de poli-histidina (6 x HIS), baseado nas seqüências de nucleotideos disponíveis do GenBank n° de acesso NM 000655, para a ex-pressão em um sistema vetor de expressão do baculovirus (BEVS). Um fragmento de DNA 999 bp Eco RI contendo o gene de E-selectina humana foi inicialmente clonado no local de clonagem múltipla do vetor de sub-clonagem pCR-BLUNT Il-TOPO (InVitrogen) e subseqüentemente em seqüência do promotor de

poliedro dentro do poliedro do vetor de transferência do bacmideo, pFASTBACI (InVitrogen). As células de inseto Sf-9S foram transfectadas com DNAs de bacmideo recombinante que contém o gene humano de E-selectina no genoma AcMNPV. Os baculovirus recombinantes foram isolados de células transfec-

tadas e selecionadas pela purificação de placa para clones virais expressando altos niveis de proteína E-selectina humana recombinante.

Um estoque mestre de virus (9,6 L) foi estabelecido pela infecção de células Sf-9S de inseto (passagem 60; WCB #38) em um MOI de 0,1 pfu/mL de um isolado recombinante amplificado purificado em placa do baculovirus (R612) que expressou altos niveis da proteina E-selectina humana recombinante e propiciou altos titulos de virus. O estoque mestre de virus foi caracterizado pela integridade do gene e a pro-dução da proteina recombinante. A caracterização que incluiu ensaios de esterilidade microbiana, ensaio de detecção de micoplasma, ensaio de detecção de espiroplasma, ensaio cror-nogênico de endotoxina de LAL, teste de agente adventicio invitro , e teste de agente adventício in vivo (AnMed/Taconic) , foi executada em amostras do estoque mestre de virus. Os testes de agente adventicio puderam detectar a presença do RNA viral que pode infectar células de inseto ou que pode ser virus veiculo.

A identidade das seqüências do gene de E-selectina humana recombinante fundidas aos marcadores do peptideo cmyc e de poli-histidina foi demonstrada pela determinação da seqüência de nucleotideos e pela análise de ambas as fitas de DNA de seqüências de nucleotideos de inserção e de flanquea-do de DNA genômico do baculovirus isolado dos baculovirus recombinantes no estoque mestre de virus e codificando o gene de E-selectina humana. A análise da seqüência de nucleotideos revelou uma combinação de 100% das seqüências humanas do gene de E-selectina no DNA genômico do estoque mestre de virus e no vetor de transferência do baculovirus, pFASTBACl, sintetizado in vitro e usado na clonagem do gene. A seqüência de aminoácidos predita da seqüência de nucleotideos da amostra de DNA genômico combinou 100% com a seqüência predita de aminoácidos de E-selectina humana. O estoque mestre de virus passou no teste da identidade.

A capacidade do estoque mestre de virus de suportar a replicação do virus em titulos elevados foi determinada por ensaios de placa do baculovirus de sobrenadantes clarificados de células Sf-9S de inseto infectado por três (3) dias em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 unidades de formação de placas (pfu) por célula. Um titulo de virus de 5 x IO7 pfu/mL foi determinado pelo ensaio da placa deagarose do baculovirus em células Sf-9S de inseto usando uma amostra do estoque mestre de virus passada em células Sf-9S de inseto. 0 estoque mestre de virus foi avaliado ainda para a produção da proteina de E-selectina humana recombinante por SDS-PAGE e por análises western-blot de usados celulares e sobrenadantes celulares Sf-9S de inseto infectado nos dias 1 a 3 dias com o estoque mestre de virus em um MOI de 3 a 5 pfu por célula. Os usados celulares e os sobrenadantes celulares contiveram uma proteina recombinante com um peso molecular de 50 kDa e com ligação especifica a um anticorpo monoclonal (BBA2; R&D) à proteina de E-selectina humana.

O estoque mestre de virus, que foi qualificado para a produção do estoque de virus, foi usado na produção do estoque de trabalho de virus destinado para a produção de produtos da proteina de E-selectina humana recombinante. O estoque de trabalho de virus (9,6 L) foi estabelecido pela infecção de células Sf-9S de inseto (passagem 52; WCB#37) em um MOI de 0,1 pfu/células com um inóculo do estoque mestre de virus. O estoque mestre e de trabalho do virus foi armazenado em frascos de PETG envolvidos protegidos da luz por um curto prazo (< 3 meses) em uma caixa fria protegida da luz (2 a 8°C) e por um longo prazo em congeladores de temperatura extremamente baixa ^ 70°C.

Bancos Celulares

A expressão da proteina de E-selectina humana recombinante foi melhor realizada em células Sf-9S de inseto. Um banco celular mestre de células Sf-9S de inseto foi estabelecido de um único frasco de células Sf-9S, que foram a-daptadas aos meios livres de soro, de cultura de célula em suspensão, e selecionadas para a secreção das proteínas re-combinantes expressas dos vetores do baculovirus de células Sf-9 parentais obtidas de ATCC. 0 banco mestre de células Sf-9S foi estabelecido com uma linhagem celular Sf-9 derivada originalmente das células epiteliais ovarianas de Spodoptera frugiperda mas submetida a diversas adaptações significativas para maximizar a expressão da proteína recombinante em biorreatores de grande escala em meios livres de soro co- mo culturas da suspensão.

O banco mestre de células Sf-9S consiste em crio-frascos de 586 x 3,5 mL de células de Spodoptera frugiperda na passagem No. 48 da célula em meios congelados de células de inseto (7,5% dimetil sulfóxido, 46% Sf-900 II SFM, meios condicionados 47%). O banco celular de trabalho foi estabelecido descongelando um criofrasco (um total de 3,5 x IO7 células) do banco celular mestre e semeando células nos meios livres de soro frescos de células HyQ SFX de inseto (100 mL; no. do lote. ALF 14050) em um frasco do agitador (500 mL). As células foram permitidas aclimatar por diversos dias e cultivadas como uma cultura em suspensão a 28°C e em 125 rpm. Quando a densidade celular alcançou 0,6 x IO7 célu-las/mL, a cultura foi dividida em uma relação dividida de 1:20 em mais frascos de agitador em um volume final de 800mL por frasco de 2 L. As novas culturas foram sub-cultivadas similarmente para que diversas passagens para assegurar que as células crescessem otimamente e não fossem contaminadas. A cultura de células Sf-9S na passagem 49 alcançou uma den-sidade celular de 5,36 x 106 células/mi e uma viabilidade de 94%, e as células foram isoladas por centrifugação de baixa velocidade (500 x g) e resuspensas em meios congelados de células de inseto, compreendidos do seguinte:

4 6,5 partes de meio livre de soro da célula HyQ SFX de inseto (condicionado)

46,5 partes de meio livre de soro da célula HyQ SFX de inseto (fresco)

7,0 partes de Dimetil Sulfóxido (Sigma lote n°

68H1092)

As células (1 x 107 células/mL) foram dispensadas assepticamente em 49 criofrascos (3,5 mL/ frasco) e em 30 criofrascos (1,0 mL/frasco) e congeladas lentamente em 1 °C por minuto para o armazenamento em um congelador de temperatura extremamente baixa < -70 °C.

Seqüência de Nucleotídeos de E-Selectina Humana Recombinante Códon Otimizada

A seguinte seqüência é uma seqüência de nucleoti-deos do gene de E-selectina humana recombinante códon otimizada do genoma do baculovirus no estoque mestre de virus para a produção da proteína de E-selectina humana recombinante.

1 ATGGGTTGGT CTTGGATTTT CTTGTTCTTG TTGTCTGG-TACTGCTTCTGT

51 TCACTCTTGG TCTTACAACACTTCTACTGAAGCTATGACTTAC-

GACGAAG

101 CTTCTGCTTACTGTCAAC7\AAGATACACTCACTTGGTTGCTATTCA

AAAC151 AAGGAAGAAATTGAATACTTGAACTCTATTTTGTCTTACTCTCCAT

CTTA

2 01 CTACTGGATTGGTATMARCADORAAAGGTTAACAACGTTTGGGTTT

GGGTTGGTA

251 CTCAAAAGCCATTGACTGAAGAAGCTAAGAACTGGGCTCCAGGTGA

ACCA

3 01 AAC AAC AG AC AAAa GG AC G AAG AC T G T GT T G AAAT T T AC AT T AAG AG

AGA

3 5IAAAGGACGTTGGTATGTGGAACGACGAAAGATGTTCTAAGAAGAAGT

TG

4 01 CTTTGTGTTACACTGCTGCTTGTACTAACACTTCTTGTTCTGGTCA

CGGT

451 GAATGTGTTGAAACTATTAA CAACTACACTTGTAAGTGTGACC-

CAGGTTT

501 CTCTGGTTTGAAGTGTGAACAAATTGTTAACTGTACTGCTTTGGAA

TCTC

551 CAGAACACGGTTCTTTGGTTTGTTCTCACCCATTGGGTAACTTCTC

TTAC

601 AACTCTTCTTGTTCTATTTCTTGTGACAGAGGTTACTTGCCATCTT CTAT 651 GGAAACTATGCAATGTATGTCTTCTGGTGAATGGTCTGCTCCAATTCCAG 701 CTTGTAACGTTGTTGAATGTGACGCTGTTACTAACCCAGCTAACGG

TTTC

7 51 GTTGAATGTTTCCAAAACCCAGGTTCTTTCCCATGGAACACTACTT

GTAC

801 TTTCGACTGTGAAGAAGGTTTCGAATTGATGGGTGCTCAATCTTTG

CAAT

8 51 GTACTTCTTCTGGTAACTGGGACAACGAAAAGCCAACTTGTAAGGC

TGTT901 ACTGGTGGTGCTTCTACMARCADORAGCTGCTGAACAAAAGTTGAT

TTCTGAAGA

951 AGACTTGAACGGTACMARCADORATCTGGT (SEQ ID NO: 5)

Amplificação Celular A amplificação celular das células que contêm E-

selectina humana recombinante foi compreendida 16,8 L em frascos plásticos do agitador de 2,0 L de Corning (21 frascos que contêm 800 mL de meios livres de soro de HyQ SFX por frasco). Os frascos de cultura foram incubados em um incuba- dor de agitador de plataforma (Fisher) equipado com braça-deiras de frasco acionadas por mola. As células foram incubadas em 28 ± 1°C e 125 ± 25 rpm.

Infecção Viral

As células Sf-9S foram diluidas com os meios li- vres de soro frescos a uma densidade celular final de 2,0 x IO6 células/mi e distribuídas como alíquotas de 800 mL em 21 frascos (2 L) . As células de inseto foram infectadas com o baculovirus que contém o peptideo de HuE-selectina em um MOI de 3 pfu/células. O virus foi recuperado do estoque de virus e dispensado em frascos em uma capa de biosegurança da classe 100. As culturas de células infectadas foram mantidas em 28°C e em 125 rpm. As culturas de células infectadas foram monitoradas periodicamente para os efeitos citopáticos virais (CPE), a densidade celular, e a viabilidade celular. A infecção do virus foi realizada por 3 dias.

Em 3 dias pós-inf ecção, o CPE viral alcançou +3 (isto é, formação do corpo de inclusão, e desarranjo de membrana) , a densidade celular foi 1,1 x IO6 células/mL, e via-bilidade da célula diminuído a 50%. As culturas de célula infectadas foram colhidas como descrito abaixo. Colheita

As suspensões de células infectadas foram transferidas dos frascos aos frascos do centrifugador de 500 mL em uma capela de biosegurança. As suspensões de células infectadas foram sujeitadas à centrifugação de baixa velocidade em um centrifugador Sorval RC-5B em 2300 rpm e a 4°C por 10 min para remover as células infectadas. Os sobrenadantes da cultura de células infectadas que contêm E-selectina humana recombinante extracelular foram clarificados pela centrifu-gação em um centrif ugador Sorval RC-5B em 7500 rpm e 4 °C por 45 min. Os sobrenadantes clarificados foram decantados em um balão de vidro de 20 L dentro de uma capa de biosegurança de classe 100 e foram armazenados durante a noite em uma caixa fria em 2 - 8°C para concentração e diafiltração subseqüentes.

Concentração e Diafiltração por Ultrafiltração O sobrenadante clarificado da cultura de células (16,0 L) que contém peptideos de E-selectina humana recombinante extracelular foi concentrado usando um sistema piloto de ultrafiltração Flex StandBenchtop de AJG Technologies a fim de obter um volume controlável para uma purificação mais adicional. Com este sistema, o sobrenadante clarificado da cultura de célula foi transferido em uma taxa de fluxo de 230 mL/min, através da tubulação limpa de silicone com uma bomba peristáltica Masterfiex de um balão de vidro de 20 L a um cartucho de ultrafiltração oco de fibra A/G Tech UFP-10-C-9A, que tivesse uma interrupção de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. O retentado que contém o peptideo de E-selectina humana recombinante foi coletado separado do filtrado e concentrado (20 vezes) a 0,8 L pela passagem continua através de cartucho de ultrafiltração de módulo espiral. Após a concentração, o sobrenadante concentrado da cultura de células foi diafiltrado por 90 min com 10 L do tampão 1 Q. O diafil-trado foi concentrado (0,8 L) e duas lavagens (0,7 L cada) do cartucho foram coletadas nos frascos estéreis Nalgene (total 3,2 L) e armazenadas em uma caixa fria (2 - 8 °C) durante a noite para a purificação subseqüente da proteina pela cromatografia de troca aniônica de Q.

Crornatografia de Troca Aniônica de Sefarose Q A etapa inicial de captação de proteina subseqüente ao processamento da substância fármaco do peptideo de E-selectina humana recombinante foi uma etapa de cromatografia de troca aniônica usando uma forte resina de troca aniônica, Sefarose Q de fluxo rápido. Pretendeu-se que esta etapa removesse as endotoxinas, os veiculos de processo, e os conta-minadores da proteina do hospedeiro dos peptideos de E-selectina humana recombinante. A etapa de cromatografia de troca aniônica de Q foi executada usando um sistema validado Pharmacia AKTA Explorer Biopilot FPLC controlado pelo software Unicorn ®. A resina Sefarose Q de fluxo rápido (400 mL) foi carregada em uma coluna cromatografica Pharmacia XX 50/30. A coluna Q foi limpa e regenerada com tampão de regeneração Q [hidróxido de sódio 0,5 N e cloreto de sódio 1,0 M] em uma taxa de fluxo de 10 mL/min, enxaguada com 5 volu-mes de coluna (2000 mL) de água WFI em uma taxa de fluxo de 10 mL/min a um pH de 7,1, e equilibrada com cinco volumes de coluna (2000 mL) do tampão 1 Q em uma taxa de fluxo de 10 mL/min.

0 diafiltrado concentrado (3,2 L) foi carregado em uma taxa de fluxo de 20 mL/min. (13,6 mg de proteína /mL, da resina Q). A coluna carregada de Q foi lavada com 10 volumes de coluna (4000 mL) do tampão 1 Q em uma taxa de fluxo de 20 mL/min. A coluna Q corre através (FT; 3200 mL) e lava as frações (1600 mL) coletadas e armazenadas em 4°C para o teste em processo para peptideos de E-selectina humana recombi-nante não ligados residuais. As proteínas ligadas à coluna de Q foram eluidas em uma taxa de fluxo de 20 mL/min com o tampão 2 Q formando um gradiente linear de 0 - 1000 mM de cloreto de sódio. As frações (200 x 10 mL) do material elui-do Q absorvente de UV280 foram coletadas e armazenadas temporariamente em uma caixa fria em 4 °C. A coluna Q usada foi limpa com tampão de regeneração Q.

As amostras (0,1 mL) de frações do eluido Q, assim como as frações de carga, atravessadas, e lavadas, foram su-jeitadas ao teste em processo incluindo SDS-PAGE e análises western blot usando soro de E-selectina humana. As frações do eluido de Q, que contêm proteínas de E-selectina humana recombinante como o constituinte principal, foram identificadas em um único pico (frações 80 - 112) por SDS-PAGE e por análise western blot e agrupadas (320 mL). Nenhuma quantidade significativa de proteínas de E-selectina humana recombinante não se ligou à coluna de Q; assim, nenhum reprocessa-mento das frações de FT foi necessário.

Cromatografia de Afinidade de Agarose Ni-NTA A presença de um peptideo de poli-histidina marcador (6 x HIS) no carbóxi terminal da proteina de E-selectina humana recombinante permitiu a purificação destas proteinas de ligação a metal pesado de outras proteinas restantes na fração agrupada Q do eluido pela cromatografia de afinidade a metal imobilizado usando uma resina baseada em Ni++. A e-tapa cromatografica de afinidade Ni-NTA no processo de produção subseqüente foi usada para purificar a proteina de E-selectina humana recombinante e remover os contaminadores e os baculovirus restantes da proteina do hospedeiro. A etapa de cromatografia da afinidade Ni-NTA foi executada usando um sistema validado Pharmacia AKTA Explorer Biopilot FPLC controlado pelo software Unicorn ®. A resina Agarose Superflow Ni-NTA (38 mL) foi carregada em uma coluna cromatografica de Pharmacia XK 26. Ni-NTA foi carregado com o hexaidrato de sulfato de niquel (0,1 M) , limpo com NaOH 0,5 N em uma taxa de fluxo de 3 mL/min. , enxaguado com 5 volumes de coluna de água WFI em uma taxa de fluxo de 3 mL/min, e equilibrada com cinco volumes de coluna (190 mL) Ni-NTA do tampão 1 em uma taxa de fluxo de 3 mL/min a um pH de 8,5. A fração agrupada Q do eluido foi carregada em uma taxa de fluxo de 3 mL/min. (19,8 proteina/mL da resina Ni-NTA). A coluna Ni-NTA carregada foi lavada com 3 volumes de coluna (115 mL) Ni-NTA do tampão I em uma taxa de fluxo de 3 mL/min. A coluna FT Ni-NTA (32 0 mL) e as frações da lavagem (115 mL) foram coletadas e armazenadas em 4 °C para o teste em processo para pro-teinas de E-selectina humana recombinante não ligadas residuais. As proteínas ligadas à coluna Ni-NTA foram eluidas em uma taxa de fluxo de 3 mi/mm com tampão 2 Ni-NTA formando um gradiente linear de 0 - 300 milímetros de imidazol de sódio. As frações (43 x 3 mL) do material absorvente do eluido DY280 Ni-NTA foram coletadas e armazenadas temporariamente em uma caixa fria em 4 °C. A coluna Ni-NTA usada foi limpa com tampão de regeneração EDTA.

As amostras (0,1 mL) de frações do eluido Ni-NTA, assim como as frações de carga, atravessadas, e lavadas, foram sujeitadas ao teste em processo incluindo SDS-PAGE e a-nálises western blot usando soro de E-selectina humana. As frações do eluido Ni-NTA, que contêm proteínas de E-selectina humana recombinante como o constituinte principal, foram identificadas em um único pico (frações 12 - 2 6) por SDS-PAGE e por análises western blot e agrupadas (43 mL) . Nenhuma quantidade significativa de proteínas de E-selectina humana recombinante não se ligou à coluna de NiNTA; assim, nenhum reprocessamento das frações FT foi necessário.

A amostra (2 mL) das frações agrupadas da coluna do eluido Ni-NTA foi sujeitada ao teste em processo incluindo SDS-PAGE e análises western blot usando soro de E-selectina humana, ensaios da proteína de BCA, e da endotoxi-na de LAL. Adicionalmente, um ensaio da placa de agarose do baculovirus foi executado em uma alíquota da fração agrupada Ni-NTA do eluido para enumerar a quantidade de baculovirus presente neste estágio do processo de purificação. O titulo do virus foi 6, 42 x 107 pfu/mL para um total de 2,76 x IO9pfu para uma redução de 3 logio no vírus fornecido pelas e-tapas de cromatografia Q e Ni-NTA. Diafiltração

Para remover o imidazol, um veículo de processo, da fração agrupada Ni-NTA do eluído e para formular a substância farmaco no tampão apropriado, solução de PBS, a fração agrupada Ni-NTA do eluído foi sujeitada a diafiltração em uma caixa fria (2 - 8°C). A fração agrupada do eluído Ni-NTA foi dialisada de encontro a 2 x 90 volumes (4 L) da solução de PBS por 15 e 7 horas, respectivamente, em 22°C. O volume final do dialisado foi de 41 mL. A amostra (1 mL) do dialisado foi removida para o teste em processo incluindo a análise SDS PAGE, análise western blot, ensaio de proteína de BCA, e ensaio cromogênico cinético de LAL.

Filtração Terminal

Para remover os contaminadores microbianos, o dialisado (41 mL) foi passado assepticamente em uma capela de biosegurança (classe 100) através de membrana de filtro de 0,22 -i Stericap Millipore em um frasco estéril Nalgene. A membrana usada foi sujeitada a um ensaio no ponto de ebulição para determinar a integridade da membrana, o resultado (50 psi) excedeu a especificação da integridade da membrana de 32 psi e forneceu garantia para o afastamento microbiano da substância fármaco. O volume final do filtrado foi de 36,5 mL. Os filtrado 0,2 \x foi armazenado em um congelador de temperatura extremamente baixa em < - 70 °C. O filtrado 0,2 |j descongelado, foram diluídos com a solução de PBS a um volume final de 95 mL para impedir a agregação da proteínana concentração previamente elevada da proteina, e filtrados assepticamente através de uma segunda membranas de 0,2 \i em uma capela de biosegurança (classe 100). Os resultados do testar do ponto de ebulição da segunda membrana de 0,2 p u- sada indicaram que a membrana ficou intacta.

As amostras do primeiro filtrado de 0,2 ]i foram sujeitadas a teste de proteina de BCA e em processo de LAL. O resultado do ensaio da proteina de BCA para o primeiro filtrado de 0,2 p foi de 5,28 mg/mL para um rendimento total de 192,72 mg. O resultado do ensaio de endotoxina de LAL para o primeiro filtrado de 0,2 \i foi de 1,84 EU/mL para um total de 67 EU.

Um volume total de 95 mL foi realizado da segundo filtração terminal. Para remover os baculovirus residuais na substância fármaco, um cartucho de filtro de membrana Pall DV20 sub 0,1 |i foi utilizado na etapa de formulação e de filtração dos produtos fármaco. A carga total de endotoxina para o produto de volume final (substância fármaco) foi de 45,6 EU; o rendimento da proteina total- para o produto de volume final foi de 133 mg, como determinado por um ensaio validado de proteina de BCS.

Ensaio da Hipersensibilidade do Tipo Atrasada

O teste de hipersensibilidade do tipo atrasado foi executado nos ratos hipertensivos em seguida ao tratamento intranasal com várias doses de E-selectina humana recombi-nante. O ensaio de hipersensibilidade do tipo atrasada das amostras da substância fármaco (1,0 mL) foi executado para determinar a potência do produto in vivo, que é correlação-nada com a capacidade de E-selectina humana de tolerizar e impedir o derrame em animais hipertensivos. A supressão de DTH neste estudo envolveu a medida da espessura animal da orelha causada pela inflamação em função das diferentes doses de E-selectina humana recombinante e de placebo usadas na indução da tolerância mucosal.

Os ratos (SRR-SP) hipertensivos propensos a derrame (n = 20) foram divididos espontaneamente em quatro grupos e inoculados intranasalmente (20 yL/narina) em dias alternados por cinco (5) tratamentos:

Grupo 1: Placebo de PBS, tolerizado com tratamentos de 40 jiL, n = 5,

Grupo 2: E-selectina humana recombinante tratamentos de 5 V pg/40 pL, n = 5

Grupo 3: E-selectina humana recombinante tratamentos de jiL/4 0 JiL, n = 5

Grupo 4: E-selectina humana recombinante tratamento de 0,1 )ag /40 \iL, n = 5

Duas semanas após o fim da programação de toleri-zação, os animais foram imunizados (sensibilização ao anti-geno) subcutaneamente com alíquotas (200 \iL) de E-selectina humana recombinante formulada com o adj uvante de Freund completo (FCA) em uma concentração final de antigeno de 375 pg/mL. Duas semanas após a imunização, a espessura da orelha dos animais tratados foi medida usando compassos de dobra cutânea padrão. Mais tarde, inj eções no lóbulo da orelha (100 p.L) de E-selectina humana recombinante em uma concentração de antigeno de 50 \iq /l 00 ]iL em PBS (reaplicação doantigeno ou desafio do antígeno).

Medidas da espessura da orelha repetidas foram feitas em 48 e 72 horas após o desafio para avaliar a hiper-sensibilidade do tipo atrasada.

A tolerização dos linfócitos a E-selectina, em especial a tolerização mucosal, é um método de tratamento eficaz de doenças inflamatórias incluindo:

Os altos níveis de citocinas pró-inflamatórias são também associados a um número de doenças e de condições, incluindo doenças auto-imunes. As doenças associadas à inflamação incluem, mas não são limitadas a, síndrome de choque tóxico, artrite reumatóide, osteoartrite, diabetes e doença inflamatória do intestino, demência associada com a infecção de HIV, glaucoma, neuropatia ótica, neurite ótica, isquemia da retina, danos óticos induzidos pelo laser, vitreoretino-patia proliferativa induzida por cirurgia ou trauma, isquemia cerebral, hipóxia-isquemia, hipoglicemia, envenenamento por ácido domoico, anóxia, envenenamento por monóxido de carbono ou de manganês ou de cianeto, mal de Huntington, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, meningite, esclerose múltipla e o outra doenças desmielinizantes, traumatismo craniano ou da medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica, apreensões, convulsões, atrofia olivopontocerebelar, síndrornes da dor neuropática, neuropatia diabética, neuropatia relacionada a HIV, síndromes MERRF e MELAS, mal de Leber, ence-falopatia de Wernicke, síndrome de Rett, homocisteinúria, hiperprolinemia, hiperhomocisteinemia, hiperglicinemia não cetótica, aminoacidúria hidroxibutírica, deficiência de sul-fito oxidase, doença dos sistemas combinados, encefalopatia por chumbo, sindrome de Tourett, encefalopatia hepática, dependência quimica, tolerância quimica, dependência de fárma-co, depressão, ansiedade e a esquizofrenia, artrite traumá-tica, sindrome de Guillain-Barre, doença de Crohn, colite ulcerativa, psoriase, enxerto contra a doença do hospedeiro, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, lesão de re-perfusão, sepsia, doenças de reabsorção óssea incluindo os-teoporose, doença obstrutiva pulmonar crônica, falência car- diaca congestiva, aterosclerose, sindrome do choque tóxico, asma, dermatite de contato, angioplastia coronária translu-minal percutânea (PTCA) e diabetes mellitus insulino-dependente.

As variações, as modificações, e outras execuções do que é descrito neste ocorrerão àquelas versados na técnica sem partir do espirito e do âmbito da invenção. As referências fornecidas são incorporadas abaixo neste por referência em suas totalidades. Todas as patentes, pedidos de patente, e referências publicadas citados neste são incorpo- radas por este meio por referência em sua totalidade.

Quando esta invenção for particularmente mostrada e descrita com referência às modalidades preferidas da mesma, será compreendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas na mes- ma sem partir do âmbito da invenção abrangida pelas reivindicações anexas. Aqueles versados na técnica reconhecerão que outras modalidades e configurações conhecidas na técnica estariam dentro do espirito e do âmbito da presente invenção.Lista de Seqüência Final PCT Lista de Seqüência

<110> Novavax, Inc. Smith, Gail Pushko, peter cioce, vittoria

<120> E-selectina recambinante produzida a partir de células de insetos

<130> 219065/2528

<150> 60/660258 <151> 2005-03-10

<160> 9

<170> Patente na versão 3.3

<210> 1

<211> 610.

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Característica da misc <223> E-selectina do tipo nativo

<400> 1

Met lie Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu vai Leu Leu lie 15 10 15

Lys Glu Ser Gly Ala Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr 20 25 30

Tyr Asp Glu Ala Ser Ala Tyr cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Vai 35 40 45

Ala lie Gln Asn Lys Glu Glu lie Glu Tyr Leu Asn ser lie Leu Ser 50 55 60

Tyr ser Pro Ser Tyr Tyr Trp lie Gly rle Arg Lys Vai Asn Asn vai 65 70 75 80

Trp Vai Trp vai Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn 85 90 95

Trp Ala Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg G7n Lys Asp Glu Asp cys Vai 100 105 110

Glu lie Tyr lie Lys Arg Glu Lys Asp vai Gly Met Trp Asn Asp Glu 115 ■ 120 •■ 125

Arg Cys ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr 130 135 140

Asn Thr Ser cys ser Gly His Gly Glu cys vai Glu Thr lie Asn AsnLista de seqüência final PCI

145 150 155 160

Tyr Thr Cys Lys Cys Asp Pro Gly Phe ser Gly Leu Lys Cys Glu Gln 165 170 175

lie vai Asn Cys Thr Ala Leu Glu ser pro Glu His Gly Ser Leu vai 180 185 190

Cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe ser Tyr Asn ser Ser Cys ser lie 195 200 205

ser cys Asp Arg Gly Tyr Leu pro ser ser Met Glu Thr Met Gln cys 210 215 220

Met Ser ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro lie Pro Ala Cys Asn vai Vai 225 230 235 240

Glu cys Asp Ala Vai Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Vai Glu Cys Phe 245 250 255

Gln Asn pro Gly Ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr cys Thr Phe Asp Cys 260 265 270

Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln ser Leu Gln cys Thr ser 275 280 285

Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr cys Lys Ala Vai Thr Cys 290 295 300

Arg Ala Vai Arg Gln Pro Gln Asn Gly ser vai Arg cys Ser His ser 305 310 315 320

Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys Ser Ser Cys Asn Phe Thr cys Glu 325 330 335

Glu Gly Phe Met Leu Gln Gly Pro Ala Gln vai Glu Cys Thr Thr Gln 340 345 350

Gly Gln Trp Thr Gln Gln lie Pro Vai cys Glu Ala Phe Gln Cys Thr 355 360 365

Ala Leu ser Asn Pro Glu Arg Gly Tyr Met Asn Cys Leu pro ser Ala 370 375 380

ser Gly Ser Phe Arg Tyr Gly ser ser Cys Glu Phe ser cys Glu Gln 385 390 395 400

Gly Phe vai Leu Lys Gly Ser Lys Arg Leu Gln Cys Gly pro Thr Gly 405 410 415Lista de seqüência final PCT

Glu Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr cys Glu Ala vaT Arg cys Asp Ala 420 425 430

vai His Gln pro pro Lys Gly Leu Vai Arg cys Ala His Ser Pro lie 435 440 445

Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser ser cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly 450 455 460

Phe Glu Leu His Gly Ser Thr Gln Leu Glu Cys Thr Ser Gln Gly Gln 465 470 475 480

Trp Thr Glu Glu Vai Pro Ser cys Gln Vai vai Lys Cys ser Ser Leu 485 490 495

Ala Vai Pro Gly Lys lie Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro Vai Phe ' 500 505 510

Gly Thr Vai Cys Lys Phe Ala cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly 515 520 525

Ser Ala Ala Arg Thr cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu 530 535 540Pro Thr cys Glu Ala Pro Thr Glu ser Asn ile Pro Leu vai Ala Gly 545 550 555 560

Leu ser Ala Ala Gly Leu ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu 565 570 575

Trp Leu Arg Lys cys Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Vai Pro Ala ser 580 585 590

Ser Cys Gln ser Leu Glu ser Asp Gly ser Tyr Gln Lys Pro ser Tyr 595 600 605

lie Leu 610

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de peptídeo sinal humano do tipo nativo

<400> 2

Met lie Ala Ser Gln Phe Leu Ser Ala Leu Thr Leu Vai Leu Leu lie 15 10 15

Lys Glu ser Gly Alalista de seqüência final PCT

<210> 3 <211> 19 <212> prt

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência seczetózia THe AcMNPV gp64 env

<400> 3

Met Gly Trp ser Trp IIe Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser 1 5 10 15

vai His ser

<210> 4 <211> 16 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de peptideo sinal

<400> 4

Met Gly Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu ser Gly Thr Ala Ser 15 Í0 15

<210> 5 <211> 974 <212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de nucleotideos do gene de E-selectina humana recombinante códon otimizada

<400> 5 atgggttggt cttggatttt cttgttcttg ttgtctggta ctgcttctgt tcactcttgg 60

tcttacaaca cttctactga agctatgact tacgacgaag cttctgctta ctgtcaacaa 120

agatacactc acttggttgc tattcaaaac aaggaagaaa ttgaatactt gaactctatt 180

ttgtcttact ctccatctta ctactggatt ggtattagaa aggttaacaa cgtttgggtt 240

tgggttggta ctcaaaagcc attgactgaa gaagctaaga actgggctcc aggtgaacca 300

aacaacagac aaaaggacga agactgtgtt gaaatttaca ttaagagaga aaaggacgtt 360

ggtatgtgga acgacgaaag atgttctaag aagaagttgc tttgtgttac actgctgctt 420

gtactaacac ttcttgttct gctcacggtg aatgtgttga aactattaac aactacactt 480

gtaagtgtga cccaggtttc tctggtttga agtgtgaaca aattgttaac tgtactgctt 540

tggaatctcc agaacacggt tctttggttt gttctcaccc attgggtaac ttctcttaca 600

actcttcttg ttctatttct tgtgacagag gttacttgcc atcttctatg gaaactatgc 660

aatgtatgtc ttctggtgaa tggtctgctc caattccagc ttgtaacgtt gttgaatgtg 720Lista de seqüência final PCT

acgctgttac taacccagct aacggtttcg ttgaatgttt ccáaaaccca ggttctttcc 780

catggaacac tacttgtact ttcgactgtg aagaaggttt cgaattgatg ggtgctcaat 840

ctttgcaatg tacttcttct ggtaactggg acaacgaaaa gccaacttgt aaggctgtta 900

ctggtggtgc ttctactaga gctgctgaac aaaagttgat ttctgaagaa gacttgaacg 960

gtactagatc tggt 974

<210> 6 <211> 307 <212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> E-selectina reccsmbinante: sinal qaitinase - marcador MS

<4O0> 6

Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Vai Leu Trp Leu Vai Ala Vai Ser 1 S 10 15

Asn Ala lie Trp Ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp 20 25 30

Glu Ala ser Ala Tyr cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu vai Ala lie 35 40 45

Gln Asn Lys Glu Glu lie Glu Tyr Leu Asn Ser lie Leu ser Tyr Ser 50 55 60

Pro ser Tyr Tyr Trp lie Gly lie Arg Lys Vai Asn Asn vai Trp vai 65 70 75 80

Trp Vai Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Trp Ala 85 90 95

Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp cys Vai Glu lie 100 105 110

Tyr lie Lys Arg Glu Lys Asp Vai Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys 115 120 125

Ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ala cys Thr Asn Thr 130 135 140

ser cys ser Gly His Gly Glu cys Vai Glu Thr lie Asn Asn Tyr Thr 145 150 155 160

Cys Lys cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu Lys cys Glu Gln lie Vai 165 170 175

Asn Cys Thr Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Gly ser Leu vai Cys Ser 180 185 190Lista de seqüência final PCT

His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Asn ser ser Cys ser ile ser Cys 195 200 205

Asp Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Met Glu Thr Met Gln Cys Met Ser 210 215 220

Ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro lie Pro Ala Cys Asn Vai vai Glu cys 225 230 235 240

Asp Ala vai Thr Asn Pro Ala Asn Gly phe Vai Glu Cys Phe Gln Asn 245 250 255

pro Gly ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr cys Thr Phe Asp Cys Glu Glu 260 265 270

Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln cys Thr Ser Ser Gly 275 280 285

Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala vai Thr His His His 290 295 300

His His m's 305

<210> 7 <211> 301 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> E-selectina recombinante: sinal quitinase - sem marcadores

<400> 7

Met pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Vai Leu Trp Leu vai Ala Vai Ser 1 5 10 15

Asn Ala ile Trp ser Tyr Asn Thr Ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp 20 25 30

Glu Ala ser Ala Tyr cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu Vai Ala He 35 40 45

Gln Asn Lys Glu Glu Ile Glu Tyr Leu Asn Ser lie Leu Ser Tyr Ser 50 55 60

Pro Ser Tyr Tyr Trp ile Gly ile Arg Lys Vai Asn Asn vai Trp vai 65 70 75 80

Trp Vai Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Trp Ala 85 90 95Lista de seqüência final PCT

Pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp cys Vai Glu lie 100 105 110

Tyr lie Lys Arg Glu Lys Asp vai Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg cys 115 120 125

ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu cys Tyr Thr Ala Ala cys Thr Asn Thr 130 135 140

Ser Cys ser Gly His Gly Glu Cys Vai Glu Thr ile Asn Asn Tyr Thr 145 150 155 160

cys Lys Cys Asp Pro Gly Phe Ser Gly Leu-Lys Cys Glu Gln Ile vai 165 170 175

Asn Cys Thr Ala Leu Glu ser Pro Glu His Gly ser Leu vai cys ser 180 185 190

His Pro Leu Gly Asn Phe ser Tyr Asn ser ser cys ser ile ser cys 195 200 205

Asp Arg Gly Tyr Leu Pro ser ser Met Glu Thr Met Gln Cys Met Ser 210 215 220

Ser Gly Glu Trp Ser Ala pro Ile Pro Ala cys Asn vai vai Glu cys 225 230 235 240

Asp Ala vai Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe vai Glu cys Phe Gln Asn 245 250 255

Pro Gly ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr cys Thr phe Asp cys Glu Glu 260 265 270

Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln cys Thr ser ser Gly 275 280 2S5

Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr cys Lys Ala vai Thr 290 295 300

<210> 8 <211> 331 <212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> E-selectina xecombinante: sinal Ig em ratos, cmyc, marcador HZS

<220>

<221> SIGNAL <222> CD • • C19)

<223> AcMNPV gp64 env seqüência sinal secretóriaLista de seqüência final PCT

<220>

<22l> extracellular

<222> (20)..(310)

<223> Porção extracelular de E-selectina humana

<220>

<221> lectin-binding

<222> (40) . . (120)

<223> Domínio de ligação à pectina de E-selectina humana

<220>

<22l> EGFdomain

<222> (200)..(275)

<223> Domínio EGF de E-selectina humana

<220>

<221> c-myc-epitope

. <222> (311)..(319)

<223> epítopo cmyc (a ser removido)

<220>

<221> 6x his tag

<222> (326)..(331)

<223> marcador 6 x his

<400> 8

Met Gly Trp Ser Trp ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser 15 10 15

vai His ser Trp ser Tyr Asn Thr ser Thr Glu Ala Met Thr Tyr Asp 20 25 30

Glu Ala Ser Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu vai Ala lie 35 40 45

Gln Asn Lys Glu Glu He Glu Tyr Leu Asn ser ile Leu Ser Tyr ser 50 55 60

Pro Ser Tyr Tyr Trp lie Gly lie Arg Lys vai Asn Asn vai Trp vai 65 70 75 80

Trp Vai Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Trp Ala 85 90 95

pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp cys Vai Glu Ile 100 105 110

Tyr ile Lys Arg Glu Lys Asp Vai Gly Met Trp Asn Asp Glu Arg Cys 115 120 125

Ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr Asn Thr 130 135 140

Ser cys ser Gly His Gly Glu cys Vai Glu Thr lie Asn Asn Tyr Thr 145 150 155 160Lista de seqüência final PCT

Cys Lys cys Asp Pro G7y Phe Ser Gly Leu Lys cys Glu Gln lie vai 165 170 175

Asn Cys Thr Ala Leu Glu ser Pro Glu His Gly ser Leu Vai Cys Ser 180 185 190

His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Asn ser ser cys Ser lie ser Cys 195 200 205

Asp Arg Gly Tyr Leu Pro ser ser Met Glu Thr Met Gln cys Met ser 210 215 220

ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro lie Pro Ala Cys Asn Vai Vai Glu Cys 225 230 235 240

Asp Ala vai Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe Vai Glu Cys Phe Gln Asn 245 250 255

pro Gly Ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr cys Thr Phe Asp Cys Glu Glu 260 265 270 -

Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser Ser Gly 275 280 285

Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala vai Thr Gly Gly Ala 290 295 300

Ser Thr Arg Ala Ala Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 30S 310 315 320

Gly Thr Arg Ser Gly His His His His His His 325 330

<210> 9 <211> 346 <212> PRT

<213> Seqüência axtificial

<220>

<223> E-selectina do tipo nativo ÇgenBank Acc. #M30640,aminoácidos

1-350 "

<400> 9

Met lie Ala ser Gln Phe Leu ser Ala Leu Thr Leu Vai Leu Leu He 15 10 15

Lys Glu Ser Gly Ala Trp ser Tyr Asn Thr ser Thr Glu Ala Met Thr 20 25 30

Tyr Asp Glu Ala ser Ala Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Thr His Leu vai 35 40 45Lista de seqüência final PCT

Ala He Gln Asn Lys Glu Glu r7e Glu Tyr Leu Asn ser He Leu Ser50 55 60

Tyr ser Pro ser Tyr Tyr Trp lie Gly lie Arg Lys vai Asn Asn vai65 70 75 80

Trp Vai Trp vai Gly Thr Gln Lys Pro Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn85 90 95

Trp Ala pro Gly Glu Pro Asn Asn Arg Gln Lys Asp Glu Asp cys vai100 105 110

Glu lie Tyr lie Lys Arg Glu Lys Asp vai Gly Met Trp Asn Asp Glu115 120 125

Arg cys ser Lys Lys Lys Leu Ala Leu cys Tyr Thr Ala Ala Cys Thr130 135 140

Asn Thr ser Cys Ser Gly His Gly Glu cys vai Glu Thr lie Asn Asn145 150 155 160

Tyr Thr cys Lys cys Asp Pro Gly Phe ser Gly Leu Lys cys Glu Gln165 170 175

lie Vai Asn cys Thr Ala Leu Glu ser Pro Glu His Gly Ser Leu Vai180 185 190

Cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe ser Tyr Asn Ser Ser cys ser He195 200 205

ser cys Asp Arg Gly Tyr Leu Pro ser ser Met Glu Thr Met Gln Cys210 215 220

Met ser ser Gly Glu Trp Ser Ala Pro lie Pro Ala cys Asn Vai Vai225 230 235 240

Glu Cys Asp Ala vai Thr Asn Pro Ala Asn Gly Phe vai Glu Cys Phe245 250 255

Gln Asn Pro Gly ser Phe Pro Trp Asn Thr Thr cys Thr phe Asp Cys260 265 270

Glu Glu Gly Phe Glu Leu Met Gly Ala Gln Ser Leu Gln Cys Thr Ser275 280 285

Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys pro Thr cys Lys Ala vai Thr cys290 295 300

Arg Ala Vai Arg Gln Pro Gln Asn Gly Ser vai Arg Cys ser His ser305 310 315 320Lista de seqüência final PCT

Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys Ser Ser cys Asn Phe Thr Cys Glu325 330 335

Glu Gly Phe Met Leu Gln Gly pro Ala Gln340 345

Claims

1. Peptídeo isolado de mamifero, CARACTERIZADO pe-lo fato de ser selecionado do grupo que consiste em um pep-tideo consistindo essencialmente de residuos #20-303 de E- selectina humana do tipo nativa (SEQ ID NO:l), um peptideoconsistindo essencialmente de residuos #20-303 de E-selectina humana do tipo nativa (SEQ ID N0:1) ligado a um oumais marcadores de C-terminal, um peptideo consistindo es-sencialmente de residuos #20-303 de E-selectina humana do tipo nativa (SEQ ID NO:l) ligado a um peptideo sinal secre-tório de N-terminal, e um peptideo de 200-400 aminoácidostendo pelo menos 60% de semelhança com a SEQ ID NO:l, e mis-turas e combinações dos precedentes.

2. Peptideo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos um ou mais mar-cadores de C-terminal são escolhidos a partir do grupo con-sistindo em um marcador de purificação e um marcador de es-tabilização .

3. Peptideo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido marcador de puri-ficação é selecionado do grupo consistindo em um marcadorcmyc e um marcador de histidina.

4. Peptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo sinal se- cretório é selecionado do grupo consistindo em (SEQ NO ID:3)e (SEQ ID NO:4).

5. Peptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo é produ-zido em uma célula de inseto.

6. Ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de quecodifica um peptideo selecionado do grupo que consiste em umpeptideo consistindo essencialmente de residuos #20-303 de E-selectina humana do tipo nativa (SEQ ID NO:l), um peptideoconsistindo essencialmente de residuos #20-303 de E-selectina humana do tipo nativa (SEQ ID NO:l) ligado a um oumais marcadores de C-terminal, um peptideo consistindo es-sencialmente de residuos #20-303 de E-selectina humana do tipo nativa (SEQ ID N0:1) ligado a um peptideo sinal secre-tório de N-terminal, e um peptideo de 200-400 aminoácidostendo pelo menos 60% de semelhança com a SEQ ID N0:1, e mis-turas e combinações dos precedentes.

7. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação `6, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido um ou mais mar-cadores de C-terminal é selecionado do grupo consistindo emum marcador de purificação e um marcador de estabilização.

8. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação`7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido marcador de pu- rificação é selecionado do grupo consistindo em um marcadorcmyc e um marcador de histidina.

9. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação`6, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo sinalsecretório é selecionado do grupo consistindo em (SE ID NO:3) e (SEQ ID NO:4).

10. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação`6, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo con-siste em um ou mais marcadores de C-terminal selecionados dogrupo consistindo em um marcador de purificação e um marca-dor de estabilização, e o referido marcador de N-terminal éselecionado do grupo consistindo em (SEQ ID NO:3) e (SEQ IDNO: 4 ) .

11. Ácido nucléico, de acordo com a reivindicação10, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador de purificaçãoé selecionado do grupo consistindo em um marcador cmyc e ummarcador de histidina.

12. Baculovirus, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a seqüência de nucleotideos que codifica um pep-tideo, conforme definido na reivindicação 1.

13. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compre-ende uma seqüência de nucleotideos que codifica um peptideo,conforme definido na reivindicação.1.

14. Vetor de transferência de baculovirus recombi-nante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o segmentode DNA que codifica um peptideo sinal de baculovirus ligadoao ácido nucléico que codifica um peptideo, conforme defini-do na reivindicação 1, o referido ácido nucléico estandotranslacionalmente em estrutura com o segmento de DNA quecodifica o referido peptideo sinal.

15. Vetor de -transferência de baculovirus recombi-nante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelofato de que está operativamente ligado a um promotor de ba-culovirus para formar uma ligação operável para expressar oreferido ácido nucléico que codifica um peptideo, conformedefinido na reivindicação 1, em uma célula de inseto.

16.. Vetor de transferência de baculovirus recombi-nante, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelofato de que inclui seqüências para secretar um peptideo,conforme definido na reivindicação 1, em üm meio de culturapara a referida célula de inseto hospedeira.

17. Célula isolada, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende o peptideo conforme definido na reivindicação 1.

18.- Célula isolada, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende o ácido nucléico conforme definido na reivindica-ção 10.

19. Célula isolada, de acordo com a reivindicação(18, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula é sele-cionada do grupo consistindo em uma célula de mamifero, umacélula bacteriana e uma célula de inseto.

20. Célula isolada, de acordo com a reivindicação(19, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula é uma.célula de inseto.

21. Método para a produção de um peptideo, confor-me definido na . reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende as etapas de:a) construção de um vetor de transferênciarecombinante que compreende um segmento de DNA codificandoúm peptideo sinal de baculovirus ligado ao ácido nucléico,conforme definido na reivindicação 10, o referido ácido nu-cléico estando translacionalmente em estrutura com o segmen-to de DNA que codifica o referido peptideo sinal e operati-vamente ligado a um promotor de baculovirus para expressarum peptideo, conforme definido na reivindicação 1, em célu-las de inseto e secretar o referido peptideo;b) co-transf ec.ção das primeiras células deinseto com o vetor de transferência recombinante e DNA dobaculovirus para gerar um baculovirus recombinante;c) colheita do baculovirus recombinante;d) infecção das segundas células de insetocom o baculovirus recombinante colhido e cultura das célulasde inseto infectadas em um meio de cultura para expressar esecretar o peptideo, conforme definido na reivindicação 1, ee) coleta do meio de cultura e purificaçãodo peptideo, conforme definido na reivindicação 1, secretado.

22. Método para o tratamento de uma condição oudoença mediada por inflamação em um indivíduo que necessitedo mesmo, pela indução da tolerância mucosal a um peptideode E-selectina solúvel, CARACTERIZADO pelo fato de que com-preende administrar ao referido indivíduo baixas doses múl-tiplas de E-selectina por administração nasal, onde a refe-rida E-selectina consiste em um peptideo, conforme definidona reivindicação 1.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22.CARACTERIZADO pelo fato de que a referida E-selectina con-siste essencialmente de um peptideo, conforme definido nareivindicação 1.

24. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende o peptideo, conforme definido na reivindicação 1,e um veiculo.

25. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende o ácido nucléico,.conforme definido na reivindi-cação 10, e um veiculo.