SE520177C2 - Användning av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, för framställning av läkemedel för ihibering av hematopoietiska stamceller - Google Patents

Description

30 1.- n. s s -- t: . .t 1. .a -. s i -» i. f, -. s u. H, . v» I» . . - . _ - in - n 1 . t 2 genetisk stamcellsbrist (15), antyder att donatorcellema behöver en kompetitiv fördel framför recipientcellerna för att uppnå signifikant inympning och långtidschimerism. Eftersom inga lämpliga metoder är tillgängliga för odling av stora mängder nativa parvovirus B19 virus, som sedan skulle kunna inaktiveras, har genetiskt modifierade expressionssystem för produktion av parvovirus B19 antigener utvecklats (5-7). Rekombinanta parvovirus B19 kapsider, producerade i ett baculovirussystem och bestående av två strukturella polypeptider, det mindre VPl proteinet (83 kDa) och det större VP2 proteinet (52 kDa) (6). Parvovirus B19 VPl och VP2 självsammankopplas och bildar viruslika partiklar. Parvovirus B19 kapsider utvärderades nyligen i ett kliniskt försök som ett kandidatvaccin mot parvovirus B19 infektion och visades inducera en god neutraliserande respons utan att förorsaka allvarliga biverkningar (19). Elektronmikroskopiska analyser av parvovirus B19 kapsider visade att de var rätt så lika plasmahärstammande virioner (6). Nativa, replikerande virus och rekombinanta kapsider uppvisar emellertid antagligen struktur- och konforrnationsskillnader samt skillnader i presentation för immunsystemet. Dessa kapsider visades tidigare agglutinera humana celler (17) och sålunda visa sig ha en receptorbindande kapacitet för deras naturliga målceller.

Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning erbjuder möjligheten att inhibera hematopoietiska stamcellkolonibildningsanalyser med parvovirus B19 kapsider. Vi visar att dessa kapsider har en effekt liknande den hos nativt parvovirus, dvs att hematopoietiska stamceller inhiberas av dessa parvovirus B19 kapsider, och därför kan de finna användning i ett stamcells- transplantationsprogram.

En aspekt av uppfinningen är inriktad på användning av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, för framställning av ett läkemedel för inhibering av hematopoietiska stamceller. Denna inhibering kan utföras i cellkultur eller i en patient.

Den cellulära receptorn för parvovirus B19 är P-antigenet (2). P-antigenet uttrycks på erytrocyter, erytroidstamceller, megakaryocyter, endotel, njurbarken, placenta, fetalt myokardium (16) och prononnoblaster från fetal lever (18). Ehuru parvovirus B19 kan infektera och lysera ett brett område av humana vävnads- och celltyper som uttrycker P- antigen, har endast erytroidstamceller visats vara sådana som tillåter parvovirus B19 replikation; det är också kant att viruset kräver mitotiskt aktiva .eller för sin egen replikation.

Effekten av parvovirus B19 infektion på hematopoietiska celler in vivo har studerats i hematologiskt normala personer. De uppvisar transient anemi och vanligen frånvaro av retikulocyter, samt varierande grader av neutropeni och trombocytopeni. I experimentell \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk Kextdoc 10 15 20 25 30 i. tu» 520 177 3 infektion av normala humana frivilliga personer, avslöjade benmärgsprover en allvarlig förlust av erytroidprekursorceller och en förlust av både erytroid- och myeloidstamceller i det perifera blodet.

I en utföringsform av denna aspekt av uppfinningen är läkemedlet ett läkemedel för inhibering av endotelcelltillväxt.

I en annan utföringsform är läkemedlet ett läkemedel för behandling av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.

I ytterligare en utföringsforrn är läkemedlet ett läkemedel för förbehandling av en patient före stamcellstransplantation. I en föredragen utföringsform är patienten ett foster.

Icke-myeloablativ konditionering före postnatal stamcellstransplantation är en ny utveckling (20,21). Sådana högdoskemoradioterapi. Emellertid kommer kanske inte fullständig donatorhematopoietisk protokoll är mindre toxiska för patientema än chimerism att uppnås till samma utsträckning med icke-myeloablativ terapi. Genom att använda sådana protokoller är det nu möjligt, enligt föreliggande uppfinning, att administrera parvovirus B19 kapsid till patienten före stamcellstransplantation och därigenom inhibera recipient hematopoies och främja donatorcellinympning.

Ett sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient för inhibering av hematopoietisk stamcelltillväxt hos nämnda patient. Därvid administreras åt patienten en P- antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsid- partiklar, eller P-antigenblockerande delar därav.

Ytterligare ett sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient för inhibering av endotelcelltillväxt hos nämnda patient, varvid en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav administreras åt nämnda patient. Ännu ett sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient som lider av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.

Därvid administreras åt nämnda patient en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke- infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav.

En ytterligare sätt att utnyttja uppfinningen är att behandla en patient för inhibering av hematopoietisk stamcelltillväxt hos nämnda patient före stamcellstransplantation. Därvid N° administreras t nämnda patient en P-antigenblockerande mängd av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav. I en föredragen tillämpning är patienten ett foster.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk tcxtdoc L. 520 177 *l Administreringssättet är t ex intravaskulärt, intramuskulärt, intradermalt eller intravenöst. Konstituenter och/eller spädmedel som vanligen används för formulering av sådana preparat kan användas. För vägledning hänvisas till den amerikanska och europeiska Farmakopén.

Den erfordrade P-antigenblockerande mängden av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar eller P-antigenblockerande delar därav kommer att bestämmas på basen av patientens ålder, vikt och kliniska tillstånd. Rekommendationer kommer att ges i den kommersiella förpackningen som inkluderar parvoviruskapsidpartiklar eller P-antigenblockerande delar därav. Rekommendationerna ges baserat på experimentella data.

En kommersiell Förpackning som innehåller tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartiklar, eller P-antigenblockerande delar därav, kommer att inkludera skrivna instruktioner för dosering och administrering åt en patient för hematopoietisk stamcellstillväxtinhibering, instruktioner för dosering och administrering för hematopoietisk stamcellstillväxtinhibering i en patient före stamcellstransplantation åt nämnda patient, såsom ett foster, instruktioner för dosering och administrering åt en patient för endotelcelltillväxtinhibering och/eller instruktioner för dosering och administrering åt en patient som lider av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, t ex polycytemi vera.

Experiment Kolonibildningsanalyser utfördes med användning av färska humana fosterleverceller, navelsträngsblodceller och fullvuxna benmärgsceller. När rekombinanta parvovirus B19 tomma kapsider sattes till dessa celler såg man en minskning av kolonibildningen av BFU-E (burst fonning unit-erythroid), CFU-GM (colony forrning unit- granulocyte, macrophage) och CFU-GEMM (colony forrning unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte, megakaryocyte) celler i ett ll-dagars analyssystem. Kolonibildningen av prekursorceller räddades genom förinkubering av parvovirus B19 kapsider med anti-B19 monoklonala antikroppar eller med parvovirus B19 IgG positiva humana sera, innan blandningen sattes till cellerna.

Ytterligare bevis på att inhiberingen av kolonibildningen faktiskt förrnedlades av parvovirus B19 kapsider erhölls med användning av monoklonala antikroppar mot den cellulära receptom för parvovirus B19, P-antigenet. När färska fosterleverceller förinkuberades med monoklonala antikroppar mot P-antigenet, innan parvovirus B19 kapsider tillsattes, minskade inhiberingen av kolonibildningen. Därtill, när en monoklonal antikropp 10 15 20 25 30 520 177ï“?flfH*fl** 5 användes mot PI-antigenet, som inte är involverat i bindningen av parvovirus B19 till cellytan, blev det inget skydd. Dessa effekter är lika de som rapporterats när nativt virus sattes till erytroidstamceller (2) och innebär att samma P-antigenstruktur används i båda fallen. /lßlygllfl Preparering av donatorceller Humana foster i en ålder av 6-12 havandeskapsveckor erhölls från legala aborter; patientema hade frivilligt donerat fostervävnad. Studien godkändes av Huddinge Sjukhus etiska kommitté. Havandeskapsålder uppskattades i enlighet med specifika anatomiska markörer och ges som menstruationsålder. Aborteringar utfördes med vakuumaspiration.

Fosterlever dissekerades under sterila betingelser, placerades i ett sterilt rör som innehöll RPMI164O och sönderdelades genom passage genom ett vinylnät för att bilda en singelcellsuspension. Kämförsedda celler tvättades sedan tre gånger, räknades och späddes i odlingsmedium.

Navelsträngsblodprover erhölls omedelbart efter vaginal förlossning från normala födslar. Prover av fullvuxen benmärg erhölls från friska allogena donatorer. Suspensioner av farska celler hepariniserades och späddes i 0,9% NaCl och separerades på Lymphoprep (Nycomed, Parma, Oslo, Norge) för gradientcentrifugering vid 2000 varv per minut under 20 min. Celler avlägsnades försiktigt med en Pasteurpipett, tvättades tre gånger i 0,9% NaCl, räknades och späddes i odlingsmedium. lmmunologiska reagens Rekombinanta parvovirus B19 tomma kapsidpartiklar (6) var en gåva från Medlmmune (Gaithersburg, MD, USA). Dessa kapsider producerades i en rekombinant baculovirus-insektscell (Spodoferafrugiperda) expressionssystem, som tidigare beskrivits (6).

Rekombinanta humana papillomaviruskapsider (HPV6) och Cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) kapsider var en gåva från Dr. J. Dillner, Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige.

Dessa kapsider hade producerats i liknande baculovirus-insektscellsystem i laboratoriema hos Dr. J. Schiller, National Cancer Institute, USA resp Dr. R. Kimbauer, University of Vienna, Österrike. Anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) köptes (Chemicon AB, Malmö, Sverige), i likhet med anti-Pl (Seraclone) monoklonal antikropp (Labdesign, Stockholm, Sverige). Anti-P-monoklonal antikropp (CLB-ery-2) (16) var en gåva från Dr. de Jong och Dr. von dem Berne (Central L^bor-^to“y of the lletherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam, Nederländema). Alla monoklonala antikroppar var mus IgM med undantag för anti-parvovirus B19 som var IgG. Parvovirus B19 IgG-positiva \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT'\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 20 25 30 520 177 6 (parvovirus B19 IgM-negativa) sera erhölls från två asymptomatiska individer på vårt laboratorium.

Kolonibildning Ett kommersiellt kit "Stem cell CFU kit" (GIBCO BRL, Life Technology Inc., NY, USA) användes för att studera kolonibildning. Det halvfasta systemet imiterar den extracellulära matrix som produceras av stromaceller. De inkluderade komponentema är: Iscoves modifierade Dulbeccos medium, modifierat fetalt bovinserum, metylcellulosa, 2- merkaptoetanol, konditionerat medium och erytropoietin. Kolonier identifierades som BFU-E (burst forrning unit-erythroid cells) med tätt packade hemoglobiniserade celler, CFU-GM (colony forming units-granulocytes, macrophages) med arrangemang av icke- hemoglobiniserade celler, och CFU-GEMM (colony fonning units-granulocytes, erythroid cells, macrophages, megakaryocytes) med hemoglobiniserade celler och små samt stora perifera celler.

Viruskapsider späddes i buffert (20 mM Tris, O,5M NaCl, pH 8,5) och 30 uL av varje spädning sattes till 25x103 fetala celler (50xl03 för postnatala celler) i 100 uL odlingsmedium och inkuberades under 1 timme vid +4°. Blandningama överfördes sedan till inkubationsbrickor och odlingsmedium tillsattes till en slutvolym av 0,5 mL per brunn.

Cellema inkuberades under ll dagar i en fuktad atmosfär vid 5% C02, och poängsattes sedan beträffande BFU-E, CFU-E och CFU-GEMM härstammade kolonibildning.

I ytterligare experiment förinkuberades parvovirus B19 kapsider eller fosterceller med antikroppar före inkuberingen av cellerna under 11 dagar: a) 25 ul av antingen parvovirus B19 IgG positivt serum eller anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) förinkuberades med 25 ul av parvovirus B19 kapsider under 2 h vid +4°. Blandningama sattes sedan till celler såsom ovan beskrivits. b) 25 ul av antingen anti-P (CLB-ery-2) eller anti-Pl (Seraclone) monoklonal antikropp sattes till 25xlO3 celler suspenderade i 100 ul medium. Celler och monoklonal antikropp förinkuberades under 1 h vid 4°C. Blandningama tvättades två gånger i kallt odlingsmedium innan parvovirus B 19 kapsider sattes till cellema såsom ovan beskrivits.

Alla analyssatser inkluderade tripletter av varje serum, monoklonal antikropp eller kapsidspädning. Tripletter av mediumkontroll (ingen tillsatt kapsid eller antikropp) och tripletter av kapsidkontroll (ingen tillsatt antikropp) inkluderades i varje experiment. När färska humana celler användes, vid varje tillfalle från olika donatorer, varierade det totala antalet räknade kolonier mellan experimenten. Lämpliga kontroller (”endast kapsid”) visas \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk tcxtdoc 10 15 20 25 30 i < I r .- 520 177 7 därför i figurema. Medeltal av räknade kolonier från triplettema i representativa experiment ges. Räknade kolonier i mediumkontroll ansågs vara 100% i respektive experiment.

Bgëyflt Viruskapsiders effekt på fosterlevercellkolonibildning Kolonibildning av BFU-E, CFU-GM och CFU-GEMM analyserades genom odling av färska fosterleverceller i odlingsmedium i en ll-dagars standardanalys. De resulterande räknade koloniema uttrycks som procent av mediumkontrollen. Kapsiderna visades inhibera kolonibildning hos alla cellerna (BFU-E, CF U-GM, CFU-GEMM) (Tabell 1).

Rekombinanta papillomaviruskapsider (Cottontail rabbit papillomavirus och human papillomavirus typ 6) inkluderades som kontroll vid odlingen av fosterleverceller. Dessa kapsider är strukturellt liknande parvovirus B19 kapsider, men de använder inte samma receptor som parvovirus B19. Papillomaviruskapsidema hade ingen effekt på kolonibildning av någon celltyp (som testats i området 0,01-100 tig/ml) (icke-visade data).

Neutralisering av B19 kapsiderna Parvovirus B19 kapsider förinkuberades med anti-B19 monoklonal antikropp (MAB8292) innan blandningen sattes till fosterleverceller för 11 dagars inkubationsperioden.

Ehuru en relativt hög koncentration av parvovirus B19 kapsider (7 tig/ml, jämför Tabell 1) användes, hade anti-B19 monoklonal antikroppen (20 tig/ml) förmåga att fullständigt blockera den inhiberande effekten på BFU-E och minska effekten på CFU-GM och CFU- GEMM kolonibildning (Tabell 2A).

Två parvovirus B19 IgG positiva sera från asymptomatiska individer testades också beträffande deras neutraliserande effekt på kapsider före inkubering av blandningen med fosterleverceller. Parvovirus B19 kapsider (0,14 tig/ml) inhiberade ensamma BFU-E till 18% av mediumkontrollen. När parvovirus B19 kapsider förinkuberades med serum 1 (1110 spädning), minskade inhiberingen (Tabell 2B). Den neutraliserande kapaciteten hos serum 2 var lägre.

Blockering av P-antigen på fosterleverceller Fosterleverceller förinkuberades med anti-P-monoklonal antikropp (CLB-ery-2).

Genom att blockera parvovirus B19 cellulära receptom med denna monoklonala antikropp minskade parvovirus B19 kapsidens inhiberande effekt med åtminstone 25% för de olika cellerna (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM) (Tabell 3). kontrollmonoklonal antikropp mot P1 antigenet (Seraclone; som inte är involverad i Genom att använda en \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 520 177 8 parvovirus B19 bindning) sågs ingen effekt på kolonibildning jämfört med parvovirus B19 kapsidkontrollen.

Kolonibildning av navelsträngsblod och fullvuxna benmärgsstamceller Parvovirus B19 kapsiders inhiberande effekt på kolonibildning testades också med användning av färska stamceller som härstammade från navelsträngsblod och fullvuxna benmärgsprover. Den inhiberande effekten var jämförbar med odlingar av fosterleverceller (Tabell 4). Neutralisering av parvovirus B19 kapsider med anti-parvovirus B19 monoklonal antikropp (MAB8292) i samma koncentrationer som i Tabell 2A var också jämförbar med odlingar av fosterleverceller (icke-visade data).

De erhållna resultaten beträffande parvovirus B19 kapsiders inhiberande effekt på kolonibildning föreslår att de kan användas för att inhibera hematopoes i recipienter fore in utero stamcellstransplantation. Ett angreppssätt vid fosterstamcellstransplantationer skulle vara att behandla recipienten med parvovirus B19 kapsider för att undertrycka stamcellsaktivet och därigenom öka donator-till-recipient cellförhållande. I en tidigare studie om vävnadsdistribution av stamceller i humant foster uppskattade vi att en foster- transplantation med 5 x 107 celler i den andra trimestern leder till ett donator-till-recipient förhållande av ungefär l:l000 - 1110000. Det är i hög grad diskutabelt om ett sådant lågt förhållande i hematopoietiska organ skulle vara tillräckligt för att ge de transplanterade cellerna en kompetitiv fördel framför de nativa stamcellema (14). Därtill skulle det vara möjligt att förbehandlat donatorceller med anti-P-monoklonala antikroppar för att skydda dem mot suppression av kapsidema, varigenom dessa celler skulle ges en till och med fördelaktigare status.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATEN"l'\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 9 n» ~- Tabell 1. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellema förinkuberades med spädningar av parvovirus B19 kapsider fore ll-dagars odlingen.

Räknade ko1onier(% av mediumkontroll) Parvovirus B19 kansid (ua/mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 70 22% 14% 3 1% 0,7 39% 54% 63% 0,007 79% 95% 94% Medium (=100%). räknade kolonier 95 3 7 16 Tabell 2. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellerna fiñrinkuberades med följ ande reagens fore ll-dagars odlingen.

A Parvovirus B19 kapsid (7 ug/mL) + spädningar av Anti-parvovirus B19 Räknade kolonier (% av mediumkontroll) mab (ua/mL) BFU-E CF U-GM CFU-GEMM 20 >1 00% 74% 67% 2 69% 35% 45% 0,2 52% 21% 19% 0,02 52% 30% 21% endast kapsid 43% 30% 21% Medium (=100%). räknade kolonier 1 14 66 42 B Parvovirus B19 kapsid (0.l4 ug/mL) + spädningar av två humana parvovirus Räknade kolonier (% av mediumkontroll) B19 IQG Dositiva sera BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Serum 1, 1:10 70% 78% 90% Serum 1, 1:l00 25% 23% 40% Serum 2, 1:10 48% 57% 57% Serum 2, 1:l00 17% 27% 67% endast kapsid 18% 17% 63% Medium ( =100%1. räkande kolonier 157 81 30 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svcnsk texLdoc . . . . . u m. _.. . . .. S. . »- . «. .. .s -. » »o - 4 -. ». i, -. « | n - ~ f'- I ... » .. ., f.. - .. . . . . . a . i ,, . f -. . l = . - . n i H .l 1. .. U- A- 10 Tabell 3. Kolonibildande enhetsanalys av fosterleverceller. Cellema fórinkuberades med följande reagens fore ll-dagars odlingen Parvovirus B19 kapsid (0. 14 ug/mL) Räknade kolonier (% av mediumkontroll) + av Anti-P mab (titer) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM 1 :5 5 1% 39% 93% 1:500 23% 10% 43% endast kapsid 18% 17% 63% Medium (=1 00%1, räknade kolonier 157 81 30 Parvovirus B19 kapsid (O. l4ug/mL) + av Anti-Pl mab (LLQ/mL) 400 25% 20% 50% 4 1 7% 22% 47% endast kapsid 18% 17% 63 % Medium (=100%). räknade kolonier 157 81 30 Tabell 4. Kolonibildande enhetsanalys av navelsträngsblod resp fullvuxna bemnärgsceller.

Cellema inkuberades med soädningar av B19 kapsid (LLQ/ml) fore ll-dagars odlingen.

Räknade kolonier (% av mediumkontroll) Parvovirus B19 kapsid (ua/mL) BFU-E CFU-GM CFU-GEMM Navelsträngsblodceller 7 10% 54% 43% 0,7 33% 62% 43% 0,07 49% 72% 50% 0,007 57% 67% 70% 0,0007 84% 79% 93% Medium (=100%), räknade kolonier 134 39 30 Benmärgsceller 7 18% 36% 6% 0,7 43% 45% 28% 0,07 63% 41% 44% 0,007 76% 80% 78% 0,0007 86% 77% 78% Medium (=l00%l. räknade celler 134 39 30 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk textdoc 10 15 20 25 30 520 177 11 Referenser 1. Anderson LJ, Young NS. Human parvovirus B19. Ed.: Parks WP. Monographs in Virology. Vol. 20. Karger. 1997. 2. Brown KE, Anderson SM, Young NS: Erythrocyte P antigen: Cellular receptor for B19 parvovirus. Science 262: 114, 1993. 3. Mortimer PP, Humphries RK, Moore JG, Purcell RH, Young NS: A human parvovirus-like virus inhibits haemotopoietic colony formation in vitro. Nature 302: 426, 1983 4. Saunders PW, Ried MM, Cohen BJ: Human parvovirus induced cytopenias: A report of five cases. Br J Haematol 63: 407, 1986 5. Kajigaya S, Shimada T, F ujita S, Young NS: A genetically engineered cell line that produces empty capsids of B19 (human) parvovirus. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7601, 1989 6. Kajigaya S, F uj ii H, Field A, Anderson S, Rosenfeld S, Anderson LJ, Shimada T, Young NS: Self-assembled B19 parvovirus capsids, produced in baculovirus system, are antigenically and immunogenically similar to native virions. Proc Natl Acad Sci USA 88: 4646, 1991 7. Brown CS, van Lent J WM, Vlak JM, Spaan WJM: Assembly of empty capsids by using baculovirus recombinants expressing human parvovirus B19 structural proteins. J Virol 65: 2702, 1991 8. Zanjani ED, Macintosh FR, Harrison MR: Hematopoietic chimerism in sheep and in nonhuman primates by in utero transplantation of fetal hematopoietic stem cells. Blood cells 17: 349, 1991 9. Zanjani ED, Pallavieini MG, Ascensao JL, Flake AW, Langlois RG, Reitsma M, Mackintosh FR, Stutes D, Harrisson MR, Tavassoli M: Engraftment and long tenn expression of human fetal hemopoietic stem cells in sheep following transplantation in utero. J Clin Invest 89: 1178, 1992 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 20 25 30 » . - . i I 520 177 12 10. Shields LE, Bryant EM, Easterling TR, Andrews RG: F etal liver cell transplantation for the creation of lymphohematopoietic chimerism in fetal baboons. Am J Obstet Gynecol 173: 1157, 1995 11. Touraine JL, Raudrant D, Rebaud A, Roncarolo MG, Laplace S, Gebuhrer L, Betuel H, Frappas D, F reycon F, Zabot MT, Touraine F, Souillet G, Philippe N, Vullo C: In utero transplantation of stem cells in human: immunological aspects and clinical follow up of patients. Bone marrow transplant 9: 121, 1992 12. Flake AW: Succesful treatment of XSCID by in utero transplantation of CD34 enriched patemal bone marrow cells. Blood 86: 125a, 1995 13. Wengler GS, Lanfranchi A, Frusca T, Verardi R, Neva A, Brugnoni D, Giliani S, F iorini M, Mella P, Guandalini F, Mazzolari E, Pecorelli S, Notarangelo LD, Porta F, Ugazio AG: In- utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X- linked severe combined immunodeficiency (SCIDX1). Lancet 348: 1484, 1996 14. Westgren M, Ek S, Bui TH, Jansson B, Kjaeldgaard A, Markling L, Nennesmo I, Seiger Å, Sarby B, Thomström S, Ríngdén O: Tissue distribution of transplanted fetal liver cells in the human fetal recipient. Am J Obstet Gynecol 176: 49, 1996 15. Flake AW, Zanjani ED: In utero hematopoietic stem cell transplantation, JAMA 278: 932, 1997 16. von dem Bome A.E.G.Kr., M.J.E. Bos, N. Joustra-Maas, J .F. Tromp, R. Van Wijngaarden-du Bois, P.A.T. Tetteroo: A murine monoclonal IgM antibody specific for blood group P antigen (globoside). Br J Hematol 63: 35, 1986 17. Brown KE, Cohen BJ: Haemagglutination by parvovirus B 19. J Gen Virol 73(Pt 8): 2147, 1992. 18. Morey AL, Flemming KA: Immunophenotyping of fetal haemopoietic cells pennissive for human parvovirus B19 replication in vitro. Br J Haematol 82: 302, 1992 \\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc 10 15 X . . . » ß 520 177 13 19. Bostic J, Koenig S: Quantitative analysis of Parvovirus B19 neutralizing responses in immune sera by an RT-PCR based assay. Abstract 4.5. VIIth Intemational Parvovirus Workshop, Heidelberg, Germany, 1997. 20. Giralt S, Estey E, Albitar M, van Besien K, Rondon G, Anderlini P, O'Brien S, Khouri I, Gajewski J, Mehra R, Claxton D, Andersson B, Beran M, Przepiorka D, Koller C, Kornblau S, Korbling M, Keating M, Kantarjian H, Champlin R: Engrafiment of allogeneic hematopoietic progenitor cells with purine analog-containing chemotherapy: harnessing grafi- versus-leukemia without myeloblative therapy. Blood 89: 4531, 1997 21. Slavin S, Nagler A, Naparstek E, Kapelushnik Y, Aker M, Cividalli G, Varadi G, Kirchbaum M, Ackerstein A, Samuel S, Amar A, Brautbar C, Ben-Tal O, Eldor A, Or R: Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood 91: 756, 1998.

\\FSERVER\OSCARUSER\PATENT\29-\29624\svensk texLdoc

Claims (5)

10 15 520 177 /L/ Patentkrav

1. Användning av tomma, icke-infektiösa, rekombinanta parvoviruskapsidpartíklar, eller P-antigenblockerande delar därav, för framställning av ett läkemedel för inhibering av hematopoietiska stamceller.

2. Användning enligt kravet l, vari läkemedlet är ett läkemedel for inhibering av endotelcelltillväxt.

3. Användning enligt kravet l, vari läkemedlet är ett läkemedel för behandling av hematologiska proliferativa stömingar hos P-antigenpositiva celler, såsom polycytemi vera.

4. Användning enligt kravet l, vari läkemedlet är ett läkemedel för fórbehandling av en patient före stamcellstransplantation.

5. Användning enligt kravet 4, vari patienten är ett foster. K:\Patent\l 9-\l 929-\l 92962400\O30 l 3 l kravdoc