KR100240385B1 - 재조합 bpi 단백질, bpi 단백질의 용도 및 그의 제조방법 - Google Patents

재조합 bpi 단백질, bpi 단백질의 용도 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BPI 단백질 및 음이온성 화합물을 함유하고, (1) 살균작용을 나타내지 않으며 (2) 내독소 중화작용을 갖는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 BPI 단백질의 이용 방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
재조합 BPI 단백질, BPI 단백질의 용도 및 그의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
본 출원은 1990년 8월 13일자 출원된 미국 특허출원 제 567,016호 및 1991년 4월 5일자 출원된 미국 특허출원 제681,551호의 일부 계속 출원이다.
1991년 4월 5일자 출원된 미국 특허출원 제 681,551호는 1990년 1월 22일자 출원된 미국 특허출원 제 468,696호의 일부 계속 출원인 1990년 8월 13일자 출원된 미국 특허출원 제 567,016호의 일부 계속 출원이며, 미국 특허출원 제 468,696호는 1989년 2월 14일자 출원된 미국 특허출원 제 310,842호의 일부 계속 출원이다.
상기 특허출원의 내용은 모두 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다.
[발명의 배경]
그람 음성균 감염은 특히 입원환자 및 면역손상 환자에 있어서의 이환율 및 치사율을 유발하는 가장 중요한 원인이다.[Duma, R, T., Am. J. of Med., 78(Suppl. 6A) : 154-164(1985); 및 Kreger B.E., D.E. Craven and W.R. McCabe, Am. J. Med., 68 : 344∼355(1980)].
현재 입수 가능한 항생 물질들이 일반적으로 감염 치료에 효과가 있기는 하지만, 이들 물질은 지질다당류(LPS)와 연관된 병리생리학적 작용을 중화시키지는 못한다. LPS는 그람 음성균의 외막의 주요 성분으로서 생명체가 용해될때 방출된다[Shenep, J. L. and K. A. Morgan, J. Infect. Dis., 150(3) : 380-388(1984)].
항생 물질에 의한 치료중에 방출되는 LPS는 염증 반응을 일으키는 강력한 자극제이다.
생체내에서의 LPS에 의한 많은 유해한 작용은 염증 세포에 의해 방출되는 가용성 매개 물질에 의한 것이다[Morrison D. C. and R. J. Ulevich, Am. J. Pathol., 93(2) : 527∼617(1978)].
LPS는 숙주의 염증 세포에 의해 매개 물질의 방출을 유발하는데, 이는 궁극적으로 파종성 혈관내 응고 (DIC), 성인 호흡 장해 증후군(ARDS), 심기능 부전능, 기관 부전증, 간 부전증(간담즙 부전증), 뇌 부전증(CNS 부전증), 신 부전증, 다기관 부전증 및 쇼크를 유발할 수 있다.
가용성 LPS는 호중구 화학 주성의 감소, 부착력의 증가, 육탄단 모노포스페이트 측로 활성의 증가, O2라디칼 생성의 증가, 보체에 대한 표면 수용체의 과도 조절 및 과립 단백질의 주위 매질로의 방출등을 유발한다[Morrison and Ulevich(1978)].
내독혈증은 혈류중에 내독소, 즉 열안정성 세균 독소가 존재하는 것과 관련되어 있는 증세이다.
내독소는 감염 반응을 촉발하는데 이는 감염에 대항하는 유의한 작용이지만, 그것이 통제되지 않는 경우에는 숙주에 손상을 입힐 수 있다.
내독혈증은 간에 내독소 결합 단백질의 생산을 유도하고, 백혈구로 부터 살균성 단백질의 방출을 유발한다.
본 발명들의 연구에 따르면, 이들 백혈구 단백질중 하나, 즉 BPI는 전에는 그의 시험관내 살균 활성만이 알려져 있었지만, 시험관내에서 호중구와 단핵세포를 자극하는 내독소의 작용을 억제하고 생체내에 투여하면 내독소 또는 세균 침입에 의한 사망을 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다.
나아가, BPI는 항생 작용은 나타내지만 숙주 세포에 대해서는 세포 독성 기능을 갖지 않는 것으로 밝혀져 있다.
단핵세포와 호중 과립구는 세균 감염에 대항하는 숙주의 방어계에 있어서 중요한 역할을 담당하고, 내독혈증의 병리학에도 관여한다.
이들 세포는 미생물을 삼켜서 세포내에서 죽이며, 생체내 및 생체외에서 가용성 단백질을 방출시켜 내독소에 대해 반응을 나타내는데, 가용성 단백질은 살균 단백질 분해, 옵소닌, 발열, 보체 활성화 및 조직 손상 작용을 나타낸다.
내독소에 의해 자극된 단핵세포에 의해 방출되는 사이토킨의 일종인 종양 괴사 인자(TNF)는 내독소의 생체내 독성 작용을 어느 정도 모방한다.
동물에 TNF 를 주입하면, 방렬, 쇼크 및 글루코스 대사의 변화등이 일어난다.
TNF는 또한 호중구의 강력한 자극물질이다.
IL-1, IL-6 및 IL-8같은 다른 사이토킨류도 LPS의 병리생리학적 작용을 매개한다. 항생물질 치료에 있어서의 발전에도 불구하고, 내독혈증과 관련된 이환율과 치사율은 아직도 높다.
항생물질 단독으로는 LPS의 독성 작용을 중화시키는데 있어서 효과를 나타내지 못한다.
따라서, 직접적으로 내독소 중화효과를 갖는 치료법에 대한 요구가 있어왔다.
현재 채택되고 있는 내독혈증의 처치법에서는 항생물질과 지지요법이 이용되고 있다.
현재 적용 가능한 대부분의 보조 요법은 저혈압과 발열같은 내독소 쇼크 증세를 치료하긴 하지만 내독소를 불호라성화시키지는 못한다.
다른 치료법들은 LPS에 대한 숙주의 염증성 반응을 억제한다.
후술하는대로, 현행 치료법들은 독성, 면역원성 또는 동물 모델과 인체 임상 실험 사이에서 그 효능이 재현되지 않는 점등때문에 그 제한이 크다.
폴리믹신 B(PMB)는 내독소의 성분중 가장 독성이 크고 생물학적으로 활성을 갖는 성분인 지질 A에 결합하여 구조적으로 파괴하는 것으로 밝혀진 염기성 폴리펩티드 항생물질이다.
PMB는 시험관내에서 내독소가 호중구 과립의 방출을 활성화하는 것을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 인체내에서 그람 음성균의 감염을 처치할 수 있는 잠재적인 치료 약물이다.
그러나, 전신 독성을 나타내기 때문에 국소용 약제로 사용되는 경우를 제외하고는 사용에 제한이 있다.
항생물질과 다량의 메틸프레드니솔론 소듐 석세네이트(MPSS)를 함께 사용하는 병용요법은 개를 이용한 그람 음성균 패혈증의 실험 모델에 있어서 사망을 예방하는 것으로 알려져 있다.
전신 패혈증의 임상학적 징후가 있는 223명의 환자를 대상으로 한, 다중심, 이중맹안, 플라세보-조절된 임상 실험에 있어서 MPSS와 항생물질을 이용한 또 다른 연구는 치료 그룹과 플라세보 그룹간에 있어서 치사율이 유의할만한 차이를 나타내지 않는다는 결론을 내리고 있다.
나아가, 연구자들은 플라세보 그룹에 있어서 14일 이내에 발생하는 이차 감염의 해소율이 훨씬 높은 것을 발견하고 있다.
내독혈증을 처치하기 위한 비교적 새로운 접근 방법은 내독소 중화 항체를 이용하여 수동 면역화하는 것이다.
이.콜리. J5에 대한 과면역 인간 면역글로불린이 그람 음성균 세균혈증을 갖는 환자의 치사율 및 쇼크를 50% 감소시킨다는 것이 알려져 있다.
다른 연구 그룹에서는 생쥐 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체 및 인간 단클론성 항체를 이용한 동물 모델에 있어서의 유망한 결과를 밝히고 있다.
단클론성항체는 과면역 혈청에 비하여 예를들면 보다 일정한 약제 역가 및 인간 병원성물질의 전파가 감소되었다는 점에서 유리하기는 하지만, LPS를 중화시키기 위해 면역글로불린을 투여하는 것과 관련하여 아직 많은 문제점들이 남아있다.
면역글로불린 자체에 대한 숙주의 반응에 의하여 과민감성이 유발될 수 있다. 보체 활성화 및 면역 착체의 침전에 뒤따르는 조직 손상도 패혈증 환자에게 항-내독소 항체를 사용한 치료법을 적용시키는데 있어서 관련된 또 다른 문제점이다.
BPI는 1975년에 처음으로 발견된 호중구 과립 단백질이다[Weiss, J., R. C. Franson, S, Becherdite, K, Schmeidler, and P. Elsbach J. Clim, Invest., 55 : 33(1975)].
BPI는 1978년에 인간 호중구로 부터 고도로 정제된 형태로 얻어졌으며, 세포막의 투과성을 증가시키고 시험관내에서 인산염 완충 식염수중에서 분석했을때 그람 음성균에 대하여 살균 작용을 갖는 것으로 밝혀져 있다[Weiss, J. et al. J. Biol. chem, 253(8) : 2664∼2672(1978)].
나아가, 바이스(Weiss)등은 BPI가 포스포리파제 A2의 활성을 증가시키는 것을 밝혀내고, BPI가 시험관내 살균 활성뿐만아니라 전(前)염증 작용도 갖는다는 것을 시사하였다.
토끼의 BPI는 1979년에 정제되었으며[Elsbach et al. J. Biol. Chem 254(21) : 11000∼11009] 인간에서 분리된 BPI와 동일한 살균 및 투과성 증가 활성을 갖는 것으로 밝혀지므로써, 연구에 사용할 수 있는 또 다른 재료를 제공하였다.
토끼와 인간에게서 얻어진 BPI는 모두 시험관내에서 K1-캡슐화 이.콜리를 비롯한 각종 그람 음성균에 대하여 효과적인 것으로 밝혀져 있다[Weiss et al., Infection and Immunity 38(3) : 1149∼1153(1982)].
바이스(Weiss)등은 1984년에 BPI의 시험관내 살균 작용에 있어서의 리포다당류의 역할을 제안하였다[J. Immunol. 132(6) : 3115(1984)].
이들 연구자들은 BPI가 그람 음성균의 외막에 결합하여 LPS의 세포의 방출을 일으키고, LPS 생합성을 선택적으로 자극한다는 것을 입증하였다.
1984년에, 비슷한 특성을 갖는 단백질이 인간 호중구로 부터 분리되어 양이온성 항미생물 단백질 57(CAP 57)로 명명되었다[Shafer, W. M., C. E. Martin and J. K. Spitznagel, Infect. Immun., 45 : 29(1984)].
이 단백질은 N-말단 아미노서열, 아미노산 조성, 분자량 및 출처에 의해 결정하였을때 BPI와 동일하다[Spitznagel et al., Blood 76 : 825∼834, 1990].
또 다른 연구 그룹에서 호브데(Hovde)와 그레이(Gray)는 1986년 BPI와 실질적으로 동일한 특성을 갖는 살균성 당단백질을 보고한 바 있다[Hovde and Gray, Infection and Immunity 54(1) : 142∼148(1986)].
1985년 오오이(Ooi)등은 BPI가 호중구 프로테아제에 의해 절단된 후에도 시험관내 살균작용을 유지하는 것을 보고하면서 단백질 단편이 그의 활성을 계속 보유한다는 것을 시사하였다[Ooi and Elabach, Clinical Research 33(2) : 567A(1985)].
BPI의 시험관내 살균 활성 및 투과성 증가 활성은 모두 이 단백질의 N-말단 25KD 단편내에 존재한다[Ooi, C. E., et al. J. Biol. Chem. 262 : 14891(1987)].
BPI가 세균의 외막에 있는 내독소와 관련된 구조에 결합한다는 증거는 다음과 같다.
(1) BPI의 투과성 증가 활성에 대하여 표면이 매끄러운 이.콜리 균주보다 표면이 거친 이.콜리 균주가 보다 증가된 민감성을 나타낸다[Weiss, J. et al. Infect. Immun. 51 : 594(1986)].
(2) 내독소의 구조를 변화시키는 Prm A 돌연변이에 의해 폴리미진 비. 및 BPI 모두에 대한 결합이 감소된다[Farley, M.M. et al. Infect. Immun. 56 : 1536-1539(1987) 및 Farley et al. Infect. Immun. 58 : 1589∼1592(1988)];
(3) 폴리믹신 B(PMB)는 에스. 티피무리움(S. typhimurium)에 결합하기 위해 BPI를 보체로서 필요로 한다[Farley 1988]; 및
(4) BPI는 또 다른 내독소 결합 단백질인 리포다당류 결합단백질(LBP)과 아미노산 서열 상동성을 나타내며 면역 교차 반응성을 나타낸다[Tobias et al., J. Biol. Chem. 263(27) : 13479∼13481(1988)].
LBP-LPS 착체는 단핵세포상의 세포 표면 수용체(CD 14)에 결합하여 염증성 사이토킨 종양 괴사 인자(TNF)의 합성 및 방출을 증가시킨다[Schumann et al. Suence 249 : 1429∼1431].
즉, LBP는 LPS의 면역 자극 활성을 촉진시킨다.
BPI는 LBP와 정반대의 작용을 나타낸다.
BPI는 LPS에 결합하고, 호중구와 단핵세포 활성을 억제한다[Marra ey al., J. Immunol. 144 : 662∼666(1990); Marra and Scott, WO 90/09183, 공개일 1990년 8월 23일; C. J. Fisher et al. Circulatory Shock 34 : 120(1991)].
BPI를 코딩하는 cDNA가 그레이(Gary)등에 의해 얻어져서 서열이 밝혀져 있다[Gray et al. Clim. Res 36 : 620A(1988) 및 Gray et al. J. Biol. Chem. 264(16) : 9505∼9506(1989)].
이들은 BPI가 25KDa단편의 가용성 형태로 절단 및 방출될 수 있는 막 단백질이라고 보고하였다.
원래는 그람 음성균에 BPI가 결합하면 LPS 구조를 파괴하고, 작은 소수성 분자에 대한 미생물의 투과성을 변화시켜서 세포를 죽게한다고 보고되어 있었다(Weiss, et al., 1978).
보다 최근에 상기 저자들은 이러한 효과가 혈청 알부민의 부재하에서만 발생한다는 것을 입증하였다.
BPI는 혈청 알부민의 존재하에 배양된 세균에 첨가된 경우에는 살균 작용을 나타내지 않으며, 이것은 알부민이 널리 퍼져있는 생체내에서는 세균을 죽이지 않는다는 것을 시사하는 것이다[Mannion et al. J. Clim. Invest. 85 : 853∼860(1990) 및 Mannion et al. J. Clim. Invest. 86 : 631∼ 641)].
즉, 종래 문헌에서는 BPI의 유익한 효과가 시험관내 살균 작용에만 한정되어 있는 것으로 이해되고 있었던 것이다.
본 발명에서 본 발명자들은 BPI가 LBP같은 다른 공지된 내독소 결합 단백질과는 달리 혈청과 혈장의 존재하에서 내독소에 결합하며, BPI가 시험관내 및 생체내에서 각각 내독소의 면역 자극 활성 및 독성 작용을 억제한다는 것을 밝히는 바이다.
즉, BPI는 내독혈증 및 내독소 쇼크를 비솟한 내독소-관련 장해의 치료 및 예방에 있어서 신규하고 독특한 용도를 갖는다.
나아가, BPI는 그레이(Gray)등에 의해 호중구 과립막으로 부터 가용성 형태로 방출되기 위해서는 25kDa 단편으로 절단되어야만 하는 막단백질인 것으로 보고되었다[J. Biol. Chem. 264(16) : 9505∼9509(1989)].
본 발명은 활성 형태의 풀-랭쓰(full length)가용성 BPI의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명자들은 최초로 그레이등이 분리하지 못했던 두가지 형태의 분자, 즉 각각 상이한 생체내 혈청 반감기 프로필을 가지며 상이한 치료학적 가능성을 갖는 글리코실화 형태의 분자와 비글리코실화 형태의 분자를 분리하였다.
[발명의 요약]
본 발명은 (1) 살균 작용을 나타내지 않으며 (2) 내독소 중화작용을 갖는, BPI 단백질과 음이온성 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (1) 내독소와 특이적으로 결합하고 (2) 내독소와의 결합에 있어 BPI 단백질과 경쟁하며 (3) 내독소-유발 치사를 억제하는 생물학적으로 활성인 BPI 변형체를 제공한다.
본 발명은 또한 세포로 부터 재조합 BPI 단백질을 생산 및 분비하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 세포를 재조합 BPI 단백질이 분비되는 조건하에서 배양 배지내에서 배양함을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 세균 세포로부터 재조합 BPI 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 시그널 서열을 갖지 않으면서 BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 세균 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 세균 세포를 BPI 단백질이 생산되는 조건하에서 배양 배지에서 배양함을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 곤충 세포로 부터 재조합 BPI 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (A) BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 곤충 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 곤충 세포를 BPI 단백질이 생산되는 조건하에서 배양함을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 내독소-BPI 단백질 착체가 형성되는 조건하에서 피험자에게서 채취한 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고, 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하여 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 하는 피험자 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 피험자에게서 채취한 결합 및 미결합 내독소-함유 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) 내독소가 결합될 수 있는 모든 내독소 결합 단백질이 변성되도록 시료를 처리하여 미결합 내독소를 얻고; (b) BPI 단백질이 단계 (a)의 미결합 내독소에 결합될 수 있는 조건하에 처리 시료를 BPI 단백질과 접촉시켜 내독소-BPI 단백질 착체를 형성하며; (c) 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하여 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 내독소가 BPI 단백질에 결합하여 착체를 형성할 수 있는 조건하에 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고; 이 착체를 검출함을 특징으로 하는 시료중의 내독소의 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 그 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 설계되어 있는 외과용 기구의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는, 외과용 기구를 BPI 단백질로 피복하여 BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루도록 하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 그의 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 설계되어 있는 매립식 침입성 장치의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는, 매립식 침입성 장치를 BPI 단백질로 피복하여 BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루도록 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 나아가 내독소가 BPI 단백질과 착체를 형성하는 조건하에서, 투여전에 내독소-함유 유체를 BPI 단백질과 접촉시켜 유체를 오염 제거함을 특징으로 하는, 내독소-함유 유체를 피투여자에게 투여하기전에 오염 제거하는 방법을 제공한다.
유체는 혈액, 혈장, 혈청, 등장액, 의약, 세포배양 시약 또는 골수일 수 있다.
본 발명은 (a) 미결합 내독소 분자와 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액; (b)(1) 활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2) 내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 특정 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c)(1) BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항체와 경쟁하지 않으며 (2) 내독소 결합부위 또는 그 부근에서 BPI 단백질과 특이적으로 결합하는 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 함유되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1 및 제2항체에 의해 결합되어 제1항체-BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질을 검출할 수 있는 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 미결합 내독소 분자에 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액; (b)(1) 활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2) 내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 특정 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c) CD BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항체와 경쟁하지 않으며 (2) 내독소 결합 부위 또는 그 근처에서 BPI 단백질에 특이적으로 결합하는 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 포함되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1 및 제2항체에 의해 결합되어 제1항체-활성 BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고, 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 활성 BPI 단백질의 양을 측정할 수 있는, 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 양을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 내독소와 결합하여 피투여자의 내독혈증을 예방하는데 유효한 양의 BPI 단백질을피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 내독혈증의 예방방법을 제공한다.
본 발명은 내독소와 결합하여 내독혈증으로 고통받는 피투여자를 치료하는데 유효한 양의 BPI 단백질을 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 내독혈증으로 고통받는 피투여자의 치료 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 T7 프로모터/BPI 단백질 플라스미드 제작물로 형질 전환시킨 JM109(DE) 플레이트의 사진. 사진은 1125초 노출에 f8에서 찍은 것이다.
A. pT7BPI-F(+)는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 플-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열 포함)을 포함한다.
B. pT7BPI-F(-)는 T7 프로모터 하류에 그릇된 방향으로 위치한 풀-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열 포함)을 포함된다(생성된 단백질은 T7 유전자 10의 260 아미노산 리더 펩티드와의 융합 단백질이다).
C. pT7BPI-S는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 풀-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열을 포함하지 않음)을 포함한다.
D. pT7212-F는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 프롤린-212 절단된 BPI 단백질서열(시그널 서열 포함)을 포함한다.
E. pT7212-S는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 프롤린-212 절단된 BPI 단백질 서열(시그널 서열 포함하지 않음)을 포함한다.
제2도는 pT7BPI 단백질 플라스미드 제작물의 도식도.
제3도는 ELISA 분석에 있어서 BPI 단백질 활성을 나타내는 표준곡선
제4도는 BPI 단백질 샌드위치 ELISA±내독소±폴리믹신 B. 프로토콜은 다음과 같다 : PBS+1% BSA를 희석액으로 사용하여 1μg/ml의 폴리믹신 B 설페이트의 존재 및 부재하, 그리고 1μg/ml의 이.콜리 0111B4 내독소의 존재 및 부재하에 BPI 단백질을 형성시킨다.
제5도는 BPI를 코딩하는 cDNA의 도식도.
제6도는 BPI 단백질의 C-말단을 절단하여 얻은 BPI 단백질 변이유발성 프라이머 25kDa Pro 212 TGA의 누클레오티드 및 아미노산 서열
제7도는 BPI 단백질의 C-말단을 절단하여 얻은 BPI 단백질 변이유발성 프라이머 38kDa Pro 337 TGA의 누클레오티드 및 아미노산 서열
제8도는 BPI 단백질 변이유발성 프라이머의 누클레오티드 및 아미노산 서열 : 바람직하게는 BPI 단백질의 C-말단의 절단부인 ATG 5′ HindⅢ.
제9도는 pSVBPIMDH의 도식도.
제10도는 pAc373의 도식도.
제11도는 (1) nBPI 단백질(롯트번호 # 148104), (2) rBPI 단백질(롯트번호 # 148159) 및 (3) rBPI 단백질(롯트번호 # 148179)의 SDS-PAGE 분석
제12도는 BPI의 cDNA 서열
제13도는 p337의 단백질 서열
제14도는 p212의 단백질 서열
제15도는 호중구감소증 쥐 모델을 이용한 BPI의 효능을 보여주는 선그래프.
제16도는 생체내에서의 BPI 효능을 보여주는 막대 그래프.
제17도는 BPI 효능을 보여주는 막대그래프.
제18도는 BPI 혈청 반감기를 보여주는 선그래프.
제19도는 BPI가 내독소에 결합하는 것을 보여주는 선그래프.
BPI 결합은 각종 농도의 폴리믹신 B 설페이트로 처리한 내독소-피복 웰상에서 분석하였다.
결과는 완충액 대조(-●-), 10μg/ml 폴리믹신 B(-○-), 100μg/ml 폴리믹신 B(-▲-) 및 1mg/ml 폴리믹신 B(-△-)의 흡광도(O.D. 405)를 나타낸다.
데이타는 4회 반복 실험치의 평균 ±SK이다.
제20도는 BPI 내독소 결합을 나타내는 선그래프.
BPI는 완충액으로 희석하거나(-●-) 또는 순수한 혈장(-○-)으로 희석하고 내독소 결합에 대하여 분석하였다.
제21도는 BPI 내독소 결합을 나타내는 선그래프.
BPI는 NaCl(-●-), MgCl2(-○-) 또는 CACl2(-▲-)의 농도(이온강도 Mμ로 표시)를 증가시키면서 희석한후 설명된대로 내독소 결합을 분석하였다.
제22도는 내독소 활성의 조절에 있어서 BPI와 LBP의 역할을 나타내는 도식도.
제23도는 LBP/BPI 키메라로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체.
제24도는 CHO-BPI로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체.
제25도는 BPI(DP 결합)로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체.
제26도는 BPI의 생물학적으로 활성인 변형체를 제조하기 위한 제작물
[발명의 상세한 설명]
본 명세서에서 사용된 단어와 절은 다음과 같은 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 “BPI”는 감수성 그람 음성균의 외막에 결합하는 원래 그대로의 또는 천연의 생물학적으로 활성인 인간 57kD 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된“생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 단편”은 BPI의 생물학적 활성을 가지며 BPI내에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 분자량 57kD 미만의 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 유사체”는 BPI와 실질적으로 동일한 서열을 갖고 BPI와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 유사체에는 예를들면 BPI 서열내에 아미노산이 변화되거나 또는 BPI 서열의 아미노 말단 또는 카복시 말단 또는 이들 말단 모두에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 부가되는 것에 BPI 서열과는 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 “생물학적으로 활성인 BPI 변형체”는 (1) BPI내에 존재하는 아미노산 서열의 일부 및 BPI내에 존재하지 않는 아미노산 서열을 포함하고, (2) BPI와 실질적으로 동일한 생물학적 활성, 즉 내독소 중화작용을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “재조합체”는 유전공학적 방법에 의해 제조한 폴리펩티드를 의미한다.
즉, BPI, 생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 단편, 생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 유사체 및 생물학적으로 활성인 BPI 변형체는 재조합체일 수 있다.
그러나, 본 명세서에 있어서 BPI는 재조합 BPI와 동일하지 않으며, 재조합 BPI는 원래 그대로의 또는 천연의 폴리펩티드와는 일부 분자적 특성, 즉 글리코실화 패턴에 있어서 BPI와 상이하다.
본 명세서에서 사용된 BPI 단백질은 (1) BPI, (2) 생물학적으로 활성인 BPI 단편, (3) 생물학적으로 활성인 BPI 폴리펩티드 유사체 또는 (4) 생물학적으로 활성인 BPI 변형체를 의미하며, 이들 모두는 재조합체이거나 비재조합체일 수 있다.
본 발명은 BPI 단백질과 음이온성 화합물을 함유하며 (1) 살균 작용을 나타내지 않고 (2) 내독소 중화작용을 나타내는 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시에 있어서, 음이온성 화합물은 단백질, 프로테오글리칸(예를들면 헤파린) 또는 합성 중합체(예를들면 덱스트란 설페이트 또는 폴리글루탐산)일 수 있다.
바람직하게는 음이온성 화합물은 혈청 알부민같은 단백질이다.
본 발명은 또한 (1) 내독소에 특이적으로 결합하고, (2) 내독소와 결합하는데 있어서 BPI 단백질과 결쟁하며 (3) 내독소-유발 치사성을 억제하는 생물학적으로 활성인 BPI 변형체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “내독소”는 발열원성의 세균성 독소를 의미한다.
생물학적으로 활성인 BPI 단편의 한 예를 제13도에 나타내었다.
생물학적으로 활성인 BPI 단편의 다른예는 제14도에 나타나있다.
또한, 생물학적으로 활성인 BPI 변형체의 예가 제23도에 나타나있다.
생물학적으로 활성인 BPI 변형체의 다른예는 제24도에 나타나있다.
또, 생물학적으로 활성인 BPI 변형체의 또 다른 예가 제25도에 나타나있다.
본 발명은 또한 세포로 부터 재조합 BPI 단백질을 생산 및 분비하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 세포를 재조합 BPI 단백질이 분비되는 조건하에서 배양 배지에서 배양함을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 벡터는 시그널 서열을 더 포함한다.
이 방법에 따르면, 포유동물 세포가 바람직하다.
포유동물의 예에는 HeLa, CHO, DUX B11, Sp2/0, W138, DHK, HEPG2 및 COS-1 세포등이 포함되는데 이들에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 생산된 BPI를 제공한다.
한 구현예에서는, BPI 단백질은 제11도에 나타낸 것과 같은 148159 rBPI 단백질로 명명된 재조합 BPI 단백질이다.
또한 본 발명은 제11도에 나타낸 것과 같은 148179 rBPI 단백질로 명명된 재조합 BPI 단백질을 제공한다.
흥미롭게도, 차이니스 햄스터 난(CHO)세포같은 포유동물내에서 생산된 재조합 BPI 단백질은 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영도(SDS-PAGE)상에서 약간 변형된 이동 패턴을 나타내는데, 이는 이 분자가 포유동물 세포내에서는 호중구나 HL60 세포에서와는 달리 가공된다는 것을 시사하는 것이다.
이러한 가공은 분자가 오히려 과립막안으로 패킹되는데 관여하기 때문이거나 또는 과립막 안으로 패킹되는 결과일 수 있다.
본 발명은 또한 글리코실화 BPI 단백질을 제공한다.
상기 방법에 따르면, 이렇게 분비된 BPI 단백질은 풀-랭쓰 가용성 BPI 단백질일 수 있다.
또한 본 발명은 세균 세포로 부터 재조합 BPI 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) 시그널 서열을 갖지 않으면서, BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 세균 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 세균 세포를 BPI 단백질이 생산되는 조건하에서 배양 배지에서 배양함을 특징으로 한다.
세균 세포의 예에는 이.콜리가 포함되지만 이에만 한정되는 것은 아니다.
BPI 단백질은 세균에 대한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 이렇게 생산된 BPI 단백질은 BPI 단백질 cDNA를 함유하는 벡터중에서 통상적인 리더 서열을 제거함으로써 세균에 대한 독성 효과를 없앨 수 있다.
풀 랭쓰 클론의 형태로 제공되며 그래이 등[Gray et al.(1989) Jorun. of Biol. Chem., 264 : 9509]에 의해 보고된 발현 플라스미드내에 시그널 서열이 포함되어 있으면 세균 콜로니가 얻어지지 않는 반면, 시그널 서열이 제거되어 있으면 수많은 콜로니가 얻어질 수 있는 것으로 보여진다.
또한, 상술한 방법은 비글리코실화 형태의 풀 랭쓰 BPI 단백질을 발현시킨다.
본 발명은 또한 글리코실화 BPI 단백질을 포함하지 않는 비글리코실화 형태의 BPI 단백질을 제공한다.
본 발명은 곤충 세포로 부터 재조합 BPI 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) BPI 단백질을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 제작하고; (b) 곤충 세포를 벡터로 형질 감염시키며; 및 (c) 이렇게 형질 감염시킨 곤충 세포를 BPI 단백질이 분비되는 조건하에서 배양 배지중에서 배양함을 특징으로 한다.
상술한 방법의 한 예에서는, 곤충 세포는 BPI 단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 배큘로비루스(baculovirus)벡터의 숙주로 작용한다.
또, 곤충세포에서 유래된 BPI 단백질은 포유동물로 부터 유래된 BPI 또는 호중구에서 발견되는 천연의 BPI 단백질과는 상이한 SDS-PAGE 이동 패턴을 나타낸다.
즉, 본 발명은 배큘로비루스에 의해 감염된 곤충 세포에 의해 가공된 것과 같은 새로운 BPI 단백질 종을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산되는 생물학적으로 활성인 BPI 변형체를 제공한다.
또한 본 발명은 내독소-BPI 단백질 착체가 형성되는 조건하에서 피험자에게서 채취한 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고, 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하여 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 하는 피험자 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 피험자에게서 채취한 결합 및 미결합 내독소-함유 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
이 방법은 (a) 내독소가 결합될 수 있는 모든 내독소 결합 단백질이 변성되도록 시료를 처리하여 미결합 내독소를 얻고; (b) BPI 단백질이 단계 (a)의 미결합 내독소에 결합될 수 있는 조건하에 처리 시료를 BPI 단백질과 접촉시켜 내독소-BPI 단백질 착체를 형성시키며; (c) 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하려 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 단계 (a)에서의 변성 반응은 고온을 이용하여 실시할 수 있다.
예를들면, 고온은 95℃일 수 있다.
또는, 산을 이용하여 변성 반응을 행할수도 있다.
본 발명은 또한 내독소가 BPI 단백질에 결합하여 착체를 형성할 수 있는 조건하에 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고; 이 착체를 검출함을 특징으로 하는 시료중의 내독소의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 한 예에서는, 검출 가능한 물질로 표지화된 BPI 단백질과 시료를 접촉시키기전에 내독소를 함유하는 시료를 시료중의 내독소가 지지체에 부착될 수 있는 조건하에 적절한 지지체로 옮긴다.
본 발명은 또한 피험자로 부터 생물학적 유체 시료를 채취하고, 상술한 방법을 이용하여 상기 시료중의 내독소를 검출하므로써 내독혈증을 진단함을 특징으로 하는 내독혈증의 진단방법을 제공한다.
시료는 세포성 시료일 수 있다.
또는 시료는 혈청, 뇨, 혈액, 조직 추출액 또는 객담 같은 생물학적 유체 시료일 수 있다.
본 발명의 실시화에 있어서, BPI 단백질은 형광성 표지로 표지화할 수 있으며 형광 측정계를 이용하여 검출을 행할 수 있다.
또한, BPI 단백질을 방사성 표지로 표지화하고, 방사선 사진을 이용하여 검출을 행할 수 있다.
또, BPI 단백질을 효소로 표지화하고 분광계를 이용하여 검출을 행할 수 있다.
본 발명은 또한 그 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 설계되어 있는 외과용 기구의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는, 외과용 기구를 BPI 단백질로 피복하여 BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루도록 하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 그 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 되어 있는 매립식 침입성 장치의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는 매립식 침입성 장치를 BPI 단백질로 피복하여 BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루도록 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시에 있어서, 생물학적 시료는 혈액힐 수 있다.
또는 생물학적 시료는 조직 시료일 수 있다.
또, 생물학적 시료는 근육 시료일 수 있으며, 또 연골 조직일 수 있다.
또 생물학적 시료는 뼈일 수 있다.
또 본 발명의 실시에 있어서, 외과용 기구는 카테테르 튜브일 수 있다.
또는, 외과용 기구는 외과용 스태플일 수 있다.
덧붙여, 본 발명의 실시에 있어서, 장치는 외과용 이식물일 수 있다.
본 발명은 또한 내독소가 BPI 단백질과 착체를 형성하는 조건하에서, 피투여자에게 투여전에 내독소-함유 유체를 BPI 단백질과 접촉시켜 유체를 오염 제거함을 특징으로 하는, 내독소-함유 유체를 피투여자에게 투여하기전에 오염제거하는 방법을 제공한다.
유체는 혈액, 혈장, 혈청, 등장액, 의약, 세포배양 시약 또는 골수일 수 있다.
본 발명은 (a) 미결합 내독소 분자와 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액; (b)(1) 활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2) 내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 특정 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c)(1) BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항체와 경쟁하지 않으며 (2) 내독소 결합부위 또는 그 부근에서 BPI 단백질과 특이적으로 결합하는 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1항체 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 함유되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1항체 및 제2항에 의해 결합되어 제1항체-BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고, 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질을 검출할 수 있는, 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 미결합 내독소 분자에 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액 (b)(1) 활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2) 내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 특정 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c)(1) BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항체와 경쟁하지 않으며 (2) 내독소 결합 부위 또는 그 근처에서 BPI 단백질에 특이적으로 결합하는 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1항체 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 포함되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1항체 및 제2항체와 결합하여 제1항체-BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고, 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 활성 BPI 단백질의 양을 측정할 수 있는, 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 양을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 내독소와 결합하여 피투여자의 내독혈증을 예방하는데 유효한 양의 BPI 단백질을 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 내독혈증의 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 내독소와 결합하여 내독혈증으로 고통받는 피투여자를 처치하는데 유효한 양의 BPI 단백질을 피투여자에게 투여함을 특징으로 하는 내독혈증으로 고통받는 피투여자의 처치 방법을 제공한다.
본 발명의 실시에 있어서, 내독혈증을 예방하거나 또는 내독혈증으로 고통받는 피투여자를 처치하는데 유효한 BPI 단백질의 양은 피투여자 체중 1kg당 약 0.1∼10mg이다.
또, 유효량은 피투여자의 체중 1kg당 약 1∼10mg/kg이다.
본 발명은 하기 상세한 실험예에서 보다 상세히 설명된다.
이 실험예란은 본 발명의 이해를 돕기위한 것이며 후술하는 특허청구의 범위란에 기재된 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 추정되어서는 안된다.
[상세한 설명]
[실시예 1]
[재료 및 방법]
시약 및 용액 : 이.콜리 0111 : B4의 내독소 및 에스.티피무륨(S. typhimurium) RE 변이주의 내독소는 RIBI 임뮤노켐 리서치 인코포레이션(해밀톤, MT)으로 부터 구입하고, 시토칼라신 B 및 폴리믹신 B 설페이트(7900u/mg)는 시그마 케미칼 컴패니(세인트 루이스, MO)로 부터 구입하였다.
천연 인간 종양 괴사인자는 엔도겐 인코포레이션(보스톤, MA)으로 부터 구입하였다.
무칼슘 무마그네슘 HBSS 및 RPMI 1640은 기브코 BRL 그랜드 아일랜드(N. Y)로 부터 구입하였다.
BPI 정제 : 새로운 무발열원생 컬럼 및 발열원-제거 완충액을 이용하여 엄격한 무발열원 조건하에서서 정제를 행하는 것을 제외하고는 전술(Marra, M. N. et al. J. Immunol. 144 : 662, 1990)한 것과 동일한 방법으로 호중구 과립 제제로 부터 BPI를 정제하였다.
완충액도 피로사르트(Pyrosart) 필터(Sartorius Filters, Hayward, (A)를 이용하여 발열원을 제거하였다.
이들 조건하에서 BPI를 정제하면 기존에 보고(Marra, M. N. et al. J. Immunol. 144 : 662, 1990)된 것보다 거의 4배정도 높은 내독소-중개 호중구 자극 중화작용을 갖는 물질이 얻어진다.
항-BPI 항체의 면역친화성 정제 : BPI 분자의 N-말단 20 아미노산에 해당하는 20 아미노산 펩티드(BPI 펩티드 1-20)로 면역화한 토끼로 부터 혈청을 채취하였다. 채취된 혈청의 IgG 분획을 프로테인 A 세파로스(파마시아, 피스카타웨이, N. J.)를 이용하여 정제하였다.
활성화 CNBr 세파로스(파마시아)에 결합된 BPI 펩티드 1-20을 이용하여 상기 분획으로 부터 특이적 항-펩티드 IgG를 정제하였다.
결합 IgG를 수집 및 폴링하고, 흡착된 IgG를 펩티드 컬럼에 3회 더 통과시켜 잔류 특히 항체를 제거함으로써 면역 흡착된 음성 대조군을 얻는다.
280nm에서 흡광도를 측정하여 항체 농도를 결정하였다.
면역친화성 정제 및 흡착된 IgG를 웨스턴 블롯팅법에 의해 특이성을 시험하였다. 면역친화성 정제된 항체에서 사용된 것보다 103배 높은 농도에서도, 면역 흡착된 대조 IgG에서는 활성이 관찰되지 않았다.
내독소 결합 분석 : 마이크로타이터 플레이트에 고정화한 내독소에 BPI를 결합시키는 것은 토비아스등(Tobias, P.S. et al. J. Biol. Chem. 264 : 10867. 1989)에 의해 기술된 방법을 변형하여 수행하였다.
간단히 설명하면 임뮬론2 96웰 마이크로타이터 플레이트(다이나텍크 바이오테크놀로지 프로덕트, 칸틸리, VAO를 살모넬라 티피무륨 RE 변이주로 부터 얻고 50mM 붕산염 pH+20mM EDTA에 용해시킨 4μg/웰의 당지질을 이용하여 37℃에서 밤새 피복하였다.
이어, 흐르는 증류 탈이온수를 이용하여 플레이트를 잘 세척하고 37℃에서 건조하였다.
무발연원 PBS중에서 제조한 5mg/ml 매우 저농도의 내독소 BSA(시그마, 세인트 루이스, MO)를 이용하여 분석 플레이트를 37℃에서 30분간 차단하였다.
플레이트를 가볍게 친다음, 몇몇 실험에서 폴리믹신 B를 웰에 첨가하고 37℃에서 30분간 더 보온하였다.
플레이트를 다시 한번 가볍게 친 다음, BPI시료를 첨가하였다.
BPI 또는 폴리믹신 B를 함유하는 모든 완충액은 무발열원 PBS중에서 제조하였다. BPI 시료는 무발열원 완충액으로 희석하거나, 또는 일부 실험에서는 정상적인 지원자에게서 얻은 혈청이나 혈장을 37℃에서 진탕하게 3시간 동안 보온하였다.
플레이트를 1mg/ml 무발열원 BSA-함유 PBS로 세척한후, 상술한 바있는 토끼 다클론성 항-BPI 펩티드 IgG 항체 및 염소-항-토끼 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체(기브코 BRL 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드, 그랜드 아일랜드, N. Y.)를 차례로 이용하여 전개시킨다.
Vmax 키네틱 마이크로플레이트 판독기(몰레큘라 디바이시스 인코포레이티드, 멘로파크, (A)를 이용하여 405mm에서 흡광도를 측정하였다.
인간 부착성 단핵 세포에 의한 내독소 중개 TNF 유도의 BPI억제 : 배큐테이너 튜브를 포함하는 산 시트레이트 덱스트로스(벡톤 딕킨슨, 리더포드, N. J.)내에서 수집한 혈액을 Ca2+와 Mg2+를 제거한 행크 평형화 염용액(hank′s balanced salt solution : HBSS)로 희석하였다.
피콜-파크(파마시아 인코포레이티드, 피스카타웨이, N. J.)를 이용하여 단핵 세포를 분리하여 수집하고 HBSS로 3회 세척하고, 현미경을 이용하여 단구세포의 비율을 평가하였다.
글루타민과 항생제를 함유하며 혈청은 함유하지 않는 적절한 부피의 RPMI 1640을 이용하여 세포를 희석하여 대략 1×106단구세포/ml로 되도록 한다.
세포를 96웰 평편 바닥 조직 배양 플레이트(코스타, 캠브리지, MA)에 플레이팅하고, 가습 항온기(7% O2)내에서 37℃에서 2시간 동안 보온하였다.
세포를 따뜻한 무혈청 RPMI 1640으로 3회 세척하였다.
최종 세척액을 흡출한 후에, 제자리에서 열불활성화시킨 10% 혈청을 함유하는 200μl/웰 RPMI 1640을 첨가하였다.
각각의 웰에 완충액, 폴리믹신 B 또는 BPI중에서 예비 보온한 이.콜리 내독소의 10×용액 22μl를 첨가하였다.
세포를 내독소 혼합물과 함께 37℃에서 4시간 동안 보온한후, 상층액을 수집하고 ELISA(엔도겐 인코포레이티드, 보스톤, MA)에 의해 TNFα 항원을 분석하였다.
쥐 기관지 제포성 대식구에 의한 내독소-유도 TNFα 분비의 억제 : 마취시킨 정상적인 스위스-웸스터 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소(리스트, 캄벨, CA)를 비강내 투여하였다.
투여하기 20분전에, 생쥐에게 50μl 식염수, BPI 또는 폴리믹신 B용액을 비강내 투여하였다.
내독소 투여후 1시간후에, 생쥐를 다시 마취시키고, 1% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.7ml 식염수를 기관을 통하여 폐에 투여하였다. 폐를 부드럽게 주물렀다. 0.5ml 부피의 기관지 폐포 세척(BAL)액을 흡출하고, 원심분리하여 세포를 펠릿화한후 BAL 시료를 -70℃에서 보관하였다.
WEHI 클론 13 생쥐 섬유육종 세포에 대한 세포독성을 측정하므로써 BAL 액중의 TNFα 농도를 측정하였다.
인간 rTNFa(키론, 에머빌, CA)를 표준물질로 사용하였다.
[결과]
BPI는 세균성 지질다당류에 결합한다 : 상술한 것과 같은 방법으로 고정화 에스.티미무륨 Re 내독소에 결합된 BPI를 검출하기 위한 변형 ELISA 프로토콜을 이용하여 BPI가 내독소에 결합하는 것을 입증하였다.
BPI는 농도 의존방식으로 내독소에 결합하면, 이 결합은 폴리믹신 B에 의해 억제되는데 이는 BPI가 지질 A에 또는 그 부근에 결합한다는 것을 시사한다(제19도).
혈장(제20도)이나 혈청의 존재하에서도 상당한 양의 BPI가 내독소에 결합되는데, 이는 BPI가 혈액 단백질뿐만 아니라 생리적 염의 존재하에서도 내독소에 결합되는 것을 시사하는 것이다.
이러한 데이타는 BPI가 혈청 알부민의 존재하에서 세균을 죽이지는 않지만 세균에 결합한다는 것을 밝힌 만니온등[Mannion, B. A. et al. J. Clin. Invest. 86 : 631 1990]의 관찰과 일치하는 것이다.
또한 세균의 BPI의 치사 작용으로 부터 벗어날 수 있는 Ca2+및 Mg2+의 농도(20∼80mM)에서도 BPI가 내독소에 결합하는 것은 그다지 감소되지 않는다(제21도).
BPI는 시험관내에서 내독소-중개 THF 분비를 차단한다 : 생체내에서 내독소에 반응하여 TNF가 방출되는 것은 내독소 쇼크의 병발생에 있어서 중요한 역할을 담당할 수 있다.
내독소-중개 TNF 분비를 조절하는데 있어서 BPI의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 내독소 및 BPI와 함께 예비 보온한 내독소에 반응하여 인간 부착성 말초 혈액 단핵 세포에 의해 TNF가 분비되는 것을 측정하였다(표 1).
BPI는 농도 의존적 방식으로 단핵 세포들에 의한 내독소-자극 TNF 분비를 특이적으로 예방하였다.
덧붙여, BPI에 의한 억제는 과량의 내독소(100∼1000ng/ml) 또는 0.1% 치사 에스.아우레우스에 의해 극복되는데, 이는 BPI가 단구의 작용을 간섭하는 것이 아니라 내독소에 의한 단구의 특이적 활성화를 차단하는 것을 시사한다.
[표 1]
완충액, BPI 또는 폴리믹신 B와 함께 37℃에서 30분간 예비 보온한 이.콜리 0111 : B4 내독소를 이용하여 인간 말초혈액 단핵 세포류를 자극하였다. 내독소 혼합물을 첨가하고 4시간후에 상층액을 회수하였다.
ELISA에 의해 TNFα의 분비를 정량화 하였다.
BPI는 내독소의 생체내 발열원성을 차단한다 : 실험적 내독소 주입에 반응하여 방출된 사이토킨은 발열을 비롯하여 생리적 변화를 유발한다.
본 발명자들은 내독소 또는 BPI와 함께 예비 보온한 내독소를 토끼에게 주사하므로써 내독소의 발열원성에 미치는 BPI의 효과를 연구하였다. 온도변화를 주사후 세가지의 1시간 간격으로 검사하였다.
각각의 군에서 세마리의 동물 시험에 대해 ∑(△T)를 계산하는데 있어서 가장 큰 온도 증가를 채용하였다.
≥1.4℃의 값은 발열원성인 것으로 간주한다(유.에스. 파마코필 컨벤션 인코포레이티드. 1990 록빌, MO, Test 151, p.1515).
FDA 참고표품 내독소 400EU만을 주사한 군에서는 총 3.9℃의 온도 증가가 관찰되는 반면, 2μg BPI로 예비 처리한 내독소는 총 1.1℃의 온도 증가를 보여 발열원성이 아니었다.
완충액으로 부터 처리한 대조군 동물 또는 BPI 처리 동물에게서는 반응이 관찰되지 않았다.
BPI는 생체내에서 내독소-중개 TNF 분비를 차단한다 : BPI가 생체내에서 내독소-중개 TNFα 분비를 억제할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 생쥐의 폐에서 내독소에 대한 BPI의 중화작용을 시험한다.
내독소 공격전 20분전에 폐에 BPI를 투여하면 폐포의 대식세포에 의해 기관폐포 세정액내로 분비되는 TNF의 양이 현저히 감소된다(제2도).
식염수로 처리한 다섯 마리의 생쥐중 4마리는 1,000pg/ml 이상의 TNFα 농도를 나타낸 반면, BPI로 처리한 생쥐의 경우에는 다섯마리중 한마리만이 1,000pg/ml 이상의 TNFα 농도를 보였다.
전체적으로, BPI는 생쥐의 폐포 대식세포에 의한 내독소-중개 TNFα 분비를 8.2배 감소시킨다.
식염수 대조군에 비하여, BPI에 의한 TNF 분비의 감소는(스튜던트 t-시험법에 의할때) p〈0.05 정도로 현저한 것이었다(식염수 대조군의 기하학적 평균±SD=3.3 64±0.402, BPI로 처리한 군=2.109±0.764).
폴리믹신 B(PMB)의 몰농도가 BPI의 50배 이상임에도 불구하고 폴리믹신 B는 식염수 대조군에 비하여 TNFα 분비 감소에 있어서 그 효과가 미미하였다(p〈0.02).
이런 데이타는 가용성 BPI가 생체내에서 내독소를 중화함을 시사하는 것이다.
[표 2]
정상의 마취 생쥐에게 10ng의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 비강내 경로를 통하여 투여하였다.
투여하기 20분전에, 마취된 생쥐를 비강내 경로를 통하여 50μl 식염수, BPI 또는 폴리믹신 B 용액으로 처리하였다.
클론 13 생쥐 섬유육종 세포인 WEHI에 대한 세포독성을 측정하므로써 기관폐포 세정(BAL)액의 TNFα를 분석하였다.
표준물질로는 인간 rTNFα를 사용하였다.
본 발명자들에 의한 데이타는 BPI가 농도 의존 방식으로 인간 부착성 단핵 세포류에 의한 시험관내 내독소-자극 TNF 분비를 특이적으로 억제하는 것을 보여준다. 내독소-유도 TNF 분비에 대한 억제는 BPI와 LBP에 있어서 상이하다.
간세포에 의해 합성되는 60kDa의 급성 단백질인 LBP는 BPI와 44%의 아미노산 서열 상동성을 가지며 생체내 및 시험관내에서 내독소에 결합한다(Tobias, P. S. K. Sol dau, and R. J. Uleritch. 1986. Isolation of a lipopolysaccharide-binding acute phase reactant from rabbit serum. J. Exp. Med. 164 : 777)(Schuman, R. R., S. R. Leong, G. W. Flaggs. P. W. Gary, S. D. Wright. J. C. Mathison. P. S. Tobias, and R. J. ULeritch, 1990. Structure and function of lipopolysacc hari-de binding protein. Science. 249 : 1429).
이들 두 단백질의 구조적 유사성에도 불구하고, BPI와 LBP는 길항적으로 작용한다. LBP-내독소 착체는 호중구를 자극하여 FMLP에 대한 산화성의 급격한 반응을 유발시키며 시험관내에서 단구에 의한 TNF 생산을 촉진 및 증가시킨다(Vosbeeck. K., L. Sklar, M. Muller, C. Lundberg, C. Hanson, K. Arfors, R. Ulevitch, and P. Tobias. 1988. Modulation of lipopolysaccharide(LPS) induced neutrophil priming by an acute phase reactant, lipopolysaccharide-binding protein, LBP. Eur. J. Clim. invest. 18 A50)(Wright. S. D., R.A. Ramos, P. S. Tobias, R. J. Ulevitch, and J. C. Mathison. CD 14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide(LPS) and LPS binding protein. Science. 249 : 1931)(Tobias, P. S. J. C. Math-ison and R. J. Ulevitch, 1988. A family of lipopolysaccharide binding protei-ns involved in responses to Gram-negative sepsis. J. Biol. Chem. 263 : 13149).
반면, BPI는 LPS의 중개에 의해 호중구(Marra, N. N. C. G. Wilde, J. E. Griffith, J. L. Snable and R. W. Scott. 1990. Bactericidal/permeability increasing protein has endotoxin-neutralizing activity. J. Immunol. 144 : 662) 및 대식구가 시험관내에서 자극되는 것을 모두 차단한다.
BPI-내독소 착체가 시험관내에서 염증 세포를 자극하지 않기 때문에, 이러한 착체가 생체내 투여되었을때 발열원성 반응을 유발하지 않을 것으로 예측된다.
소량의 내독소 단독은 RNF, IL-1 및 감마 TFN 같은 내재성 발열원을 방출시키므로써 강한 발열원성 반응을 유도한다(Farley, M. M., W. M. Shafer, and J. K. Spit-znagel. 1988. Lipopolysaccharide structure determines ionic and hydrophobic binding of a cationic antimicrobial neutrophil granule protein. Infect. Immun. 56 : 1589).
토끼는 미량의 내독소에 대해 매우 민감하며, 용량 의존적인 재현 가능한 코어 온도의 상승에 대해 반응한다.
BPI와 착체를 이루면, 내독소는 토끼에 있어서 발열원성 반응을 자극할 수 없게된다.
즉, BPI는 아마도 내독소-중개 사이토킨 분비를 차단하는 결과로서 생체내에서 효과적인 내독소 억제인자이다.
시험관내에서의 BPI의 살균 작용 및 투과성 증가 작용은 LBP와 매우 큰 상동성을 갖는 분자의 N-말단쪽의 반과 관련되어 있다(Schuman, R. R., S. R. Leong. G. W. Flaggs, P. W. Gray. S. D. Wright. J. C. Mathison P. S. Tobias, and R. J. Ulevitch. 1990. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science, 249 : 1429).
막에 걸쳐있는 도메인을 제외하고는 카복시-말단 영역은 작용이 관찰되고 있지 않다.
그래이와 그의 동료들(Gary. P. W., G. Flaggs, S. R. Leong, R. J. Gumina. J. Weiss, C. E. Ooi, and P.Elsbach. 1989. Cloning of the cDNA of a human neutrophil bactericidal protein. Structural and functional correlations. J. Biol. C-hem. 264 : 9505)은 BPI의 카복시-말단 반쪽이 아주르호성 과립막과 관련되어 있다고 제안하였다.
그들의 모델에 따르면, 호중구가 자극되면 엘라스타제 같은 단백질 분해 효소가 분자를 절단하여 활성을 갖는 살균성 N-말단 반쪽을 파고리소좀으로 방출한다.
그러나 일련의 증거는 BPI가 막내 단백질이라는 것에 이의를 제기한다.
BPI는 세정제 없이도 분리된 아주르호성 과립으로 부터 추출해낼 수 있다. BPI는 수용액에 용해되며, 가용성 BPI는 내독소 결합 및 억제 시험 모두에 있어서 활성을 갖는다.
또한, BPI는 FMLP/시토칼라신 B 자극된 호중구(총 세포성 BPI의 71%)에 의해서 풀-랭쓰 단백질로서 방출되는데, 이는 탈과립화에 의해 호중구 프로테아제에 의해 N-말단이 방출된다는 것에 이의를 제기하는 것이다.
생체내에서, BPI는 내독소 독성을 억압하며 살균성 단백질이 아닌 것으로 작용하는 것 같다.
LBP 및 BPI같은 내독소와 단백질류는 각각 수용체/수용체-길항물질 시스템으로 작용하여 내독소에 대한 숙주의 반응을 조절하는 기능을 할 수 있다(제22도).
LBP는 내독소에 대한 가용성 수용체로 작용하며, 호중구 및 대식구에 대한 내독소의 작용을 증폭시킨다.
내독소에 대한 숙주의 반응을 제한할 수 있는 BPI의 능력은 BPI가 생체내에서 내독소의 치사 효과를 차단하는데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 동물에서의 예비적 결과(실시예 4 참조)는 재조합 BPI로 처치하면 내독소-유도 치사율이 현저하게 감소되는 것을 보여준다.
즉, 내독소를 중화시키기 위한 BPI를 세균 생육을 억제하기 위한 통상의 항생물질과 함께 사용하는 것은 내독소 쇼크를 치료하기 위한 유용한 요법이 될 수 있다.
[실시예 2]
[BPI 단백질의 발현 및 BPI-절단 형태]
A. 유전공학 처리된 포유동물 세포는 BPI를 발현한다.
포유동물 세포내에서 BPI 단백질 및/또는 BPI 단백질 변형체를 생산하기 위하여는, 적절한 플라스미드 벡터내에 cDNA 서열을 삽입하여야만 한다.
이러한 용도를 위한 적절한 벡터는 복제 오리진 및 SV40의 초기 및 후기 프로모터, 그리고 복수개의 삽입물 클로닝 부위 및 간염 B 표면 항원 유전자에게 얻은 종결 서열이 차례로 포함되어 있는 pSV-1이다.
플라스미드내에는 또한 세균성 DNA 복제 오리진 및 암피실린 내성과 디히드로폴레이트 환원효소를 코딩하는 유전자가 포함되어 있다.
다른 외래 유전자를 발현하기 위해 비슷한 벡터들이 사용되어 왔다(McGrogam, et al. Biotechnology 6, 172∼177).
벡터 DNA는 BPI 단백질 cDNA 서열을 받아들일 수 있도록 Hind Ⅲ 및 Bam H I으로 소화되고, 알칼리성 포스파타제에 의해 탈인산화된다.
pSV-1에 삽입하기 위해 여러개의 BPI 단백질 cDNA-함유 삽입물을 제조한다.
먼저, 모(母) 플라스미드를 적절한 제한 효소, 예를들면 EcoRI 및 Bg1Ⅱ로 소화시켜 BPI 단백질 코딩 서열 일부를 포함하는 두개의 DNA 단편을 수득하므로써 풀-랭쓰 BPI 단백질을 코딩하는 삽입물을 제조한다.
이들 두 단편을 SV-1에 함께 연결시키고, 얻어진 재조합 클론을 제한 효소 소화법으로 처리하여 적합한 방향으로 삽입된 두개의 삽입물의 존재를 선별한다.
모 BPI 단백질 삽입물 DNA의 올리고누클레오티드-특이적 DNA 증폭법을 이용하여 절단된(truncated) 형태의 BPI 단백질을 코딩하는 두개의 cDNA를 얻는다.
증폭용 올리고누클레오티드는 BamH I 클로닝 부위(제5도)에 덧붙여, 종결 코돈과 함께 코돈 212(올리고 459)(제7도) 및 337(제8도)을 치환하도록 설계한다.
두 제작물의 5′-말단에서 증폭과정에서 올리고 458을 사용하여 해독 개시 코돈 ATG의 바로 상류에 HindⅢ 부위를 창출한다(제8도).
즉 각각 55kDa, 38kDa 및 25kDa 형태의 BPI를 코딩하는 세종류의 BPI-코딩 삽입물을 만들어내고, 각각을 별도로 벡터 DNA에 연결시킨다.
제한 소화 분석에 의해 세 제작물을 확인한후, CHO 세포주 DUXB11 세포로 형질 감염시키기에 충분한 양을 제조한다.
형질 감염을 리포펙틴을 이용하여 수행하고, 표준 프로토콜을 이용하여 메토트렉세이트의 양을 늘려가면서 생성된 형질 전환 세포를 선택한다(제3도).
형질 감염체 풀 또는 풀에서 유래된 클론으로 부터 얻은 상층액에 대해 TNr 방출 억제에 의해 내독소 결합 활성이 존재하는지를 분석한다. 대부분의 선택된 세포주에 있어서 BPI는 무시할만하였다.
본 발명은 50nM 메토트렉세이트 벌크 증폭법으로 부터 확립한 세포주만이 상업적으로 합리적인 양의 BPI를 생산하는 것을 발견하였다. 이러한 두개의 세포주를 3A1 및 406로 명명하였다.
벌크 증폭법만이 이러한 세포주를 만들어낸다는 것은 예측 못했던 일이다.
B. 곤충 세포에서의 rBPI의 바큘로비루스 발현
플라스미드 발현 벡터의 제작 : 곤충 세포내에서 BPI 단백질 및/또는 BPI 단백질 변형체를 생산하기 위해서는, 먼저 cDNA 서열을 pAC373(제10도) 같은 적절한 플라스미드 발현 벡터내에 삽입해야만 한다.
이런 삽입을 위한 적절한 제한 부위는 표준 부위-특이적 변이 발생법에 의해 창출하였다. 적합한 발현 벡터의 필수적인 특성에는 pAC373의 폴리헤드론 유전자 프로모터같은 전사 프로모터 및 재조합 서열을 바큘로비루스 게놈에 도입하기 위한 측면 상동 서열이 포함된다.
이러한 플라스미드 벡터내에 존재하는 폴리헤드론 유전자에 있는 것과 같은 폴리아데보화 시그널은 재조합 유전자의 발현에 필요하거나 또는 필요하지 않을 수 있다. 전사 프로모터 및 경우에 따라 폴리아데보화 시그널을 포함하는 조절 서열과 나란히 있는 이.콜리의 베타-갈락토시다제 유전자 같은 마커 유전자가 벡터내에 포함되어 있을 수 있지만, 이것이 BPI 단백질의 발현에 있어 필수적인 것은 아니다.
이러한 목적을 위한 전형적인 벡터는 pAC373이 제10도에 나타나 있다. 재조합 바큘로비루스의 제작 : BPI 단백질 표적 유전자(또는 A란에 기술한 것과 같은 방법으로 유도된 그의 절단물)을 포함하는 발현 플라스미드와 야생형 바큘로비루스 DNA 사이의 상동성 재조합에 의해 키메라 바큘로비루스를 창출한다.
플라스미드와 야생형 바큘로비루스 DNA를 인산칼륨 기술에 의해 공동 침전시키고, 미감염된 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda(sf9)) 곤충 세포에 첨가한다.
형질 감염시키고 4∼7일 후에, 세포는 세포 병리적 형태를 나타내며 비루스 감염에 의해 전형적으로 생성되는 핵 교합체를 포함하게 된다. 야생형과 재조합 비루스 모두를 포함하는 무세포 배양 배지를 수확하고 BPI 활성을 분석하였다.
키메라 바큘로비루스의 동정및 분리 : 아가로스 층으로 덮인 sf9 세포 단층상에서 플라크 정제법을 실시하여 상기 공동 형질 감염액으로 부터 클론성 비루스 분리물을 얻는다.
교합체를 갖지 않는 플라크 형태로 부터 분석을 위한 플라크를 동정한다. 발현 플라스미드가 베타 갈락토시다제 같은 마커 유전자를 포함하며, 아가로스 플레이팅 배지중에서 5-브로모-4-클로릴-3-인돌릴-β-D-갈라토피라모시드(X-gal)같은 발색성 기질로 부터 만들어진 청색에 의해 재조합 플라크가 표시난다. 얻어진 플라크는 멀티웰 디쉬중에서 세포 감염에 사용된다.
얻어진 세포 분해물 및 감염 세포 상층액에 대해 표준 활성 또는 면역학적 분석법을 이용하여 재조합 BPI의 발현을 평가할 수 있다.
양성을 나타내는 웰에는 플라스 정제를 더 실시하여 야생형 오염물질을 함유하지 않는 순수한 재조합 비루스액을 얻을 수 있다.
BPI의 배치 생산 : sf9 세포를 ExCell(제이. 알. 사이언티틱)같은 무혈청 저단백질 배지에서 성장하도록 적응시킨다.
약한 원심분리에 의해 상층 배양액으로부터 세포를 수집하고, 매 세포당 하나의 비루스 플라스 형성 단위의 감염이 이루어지도록 10×106세포/ml의 농도로 비루스 접종물을 함유하는 신선한 배지에 재현탁시킨다.
2시간후에, 신선한 배지로 배양액을 5배 희석하고 2∼3일간 보온한다. 이 기간의 말기에, 원심 분리하여 세포를 펠릿화하고, 조정화 배지를 수확한다. 표준 바업에 의해 무세포 상층액으로 부터 BPI 단백질을 정제한다.
곤충세포에서 유래된 BPI의 특성지적 : 바큘로비루스 발현계를 이용하여 곤충 세포내에서 생성시킨 BPI 단백질은 분자량이 대략 55,000kd인 글리코실화 단백질이다. N-말단 아미노산 서열은 성숙한 포유동물 세포의 BPI의 것과 동일한데, 이는 시그널 서열이 옳게 가공된 것을 시사한다.
재조합 단백질의 내독소 결합의 비활성은 BPI와 구분되지 않는다.
pT7BPI 단백질 플라스미드의 제작 : 올리고누클레오티드 특이적 DNA 증폭에 사용하기 위해 어플라이드 바이오시스템스 380B DNA 신테사이저를 이용하여 올리고누클레오티드를 제조한다.
이 올리고누클레오티드는 BPI 단백질 DNA의 5′ 및 3′ 말단에 각각 Nde I 및 BamH I 제한 부위를 만든다. 또한, BPI 단백질 DNA의 프롤린-212 절단체를 창출하기 위해 BamHI 제한부위를 갖는 또 다른 올리고누클레오티드를 사용한다.
증폭 반응에 이어서, 단편을 정제하고 NdeI 및 BamHI으로 소화시킨다. 제작용 벡터로는 플라스미드 pGEMEX-1(프로게마)을 선택한다.
pGEMEX-1은 적절한 숙주내에 들어갔을때 하루 서열의 발현을 위하여 사용할 수 있는 T7 프로모터를 함유한다.
벡터를 BamH I으로 절단하고, 정제한 후, Nde I으로 부분 소화시켜 하나의 Nde I 부위와 하나의 BamH I 부위를 갖는 벡터를 만든다.
단편들을 연결하고, 하나한(Hanahan)형질 절환 프로토콜(DNA Cloning Volume I, A Practical Approach, Edited by D.M. Glover, IRL Press)을 이용하여 이.콜리 JM 101주내로 형질 전환시킨다. 형질전환 세균을 카르바미실린-함유 LB 플레이트에 도포하고 37℃에서 밤새 보온한다.
내성 콜로니를 선택하고, 미니-플라스미드 제제를 제제하고 적절한 제한 효소로 소화시키므로써 분석한다.
소화물을 1% 아가롯 겔 및 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석한다.
1μl의 미니-플라스미드 제제 및 하나한 형질 전환 프로토콜을 이용하여 발현 숙주 이.콜리 JM 109(DE3)주를 형질 전환시킨다.
JM 109(DE3)는 IPTG에 의해 유도될 수 있는 T7 RNA 폴리머라제 유전자의 염색체 복사체를 포함한다. 형질전환 세포를 카르바미실린-함유 LB 플레이트에 도포하고 37℃에서 밤새 보온한다.
결과를 제1(a)도∼제1(e)도에 나타내었다.
시그널 펩티드를 함유한 풀-랭쓰 BPI 및 프롤린-212 절단형 모두가 콜로니를 형성하지 않는 반면 시그널 펩티드를 함유하지 않는 상기 BPI 형태들은 콜로니를 형성하기 때문에, BPI 단백질은 활성형으로 발현되며, 옳게 가공되어 살균 활성이 세포를 죽이는 세균의 외질 공간(시그널 펩티드를 갖는 단백질이 보내지는 세균내 위치)으로 보내어진다.
이는 또한 풀-랭쓰 형태와 프롤린-212 절단형태 모두가 활성을 갖고 살균 작용을 가질 수 있다는 것을 암시한다.
시그널 펩티드를 포함하지 않는 형태의 BPI 단백질이 활성을 갖는지 또는 세포내에서 격리되어(또는 봉합체를 형성하거나 또는 시그널 펩티드가 없음으로 해서 혈장막에 접근하지 못하여)살균 활성을 나타내지 못하는지의 여부는 미지이다.
rBPI는 다음과 같이 정제한다 : CM-세파로스상에서 1단계로 재조합 BPI(rBPI)-함유 조정배지를 95% 균질도로 정제한다.
먼저 CM-세파로스 컬럼(파마시아, 피스카타웨이, N. J.)을 컬럼 부피의 5배 부피의 0.5M NaOH로 세척하고, 무발열원 완충액 또는 물로 리물루스 아메보사이트 라이세이트 분석(휘타커, 워커스빌, MD)에 의해 발열원이 검출되지 않을때까지 헹구어준다.
이어 컬럼을 50mM 트리스 pH 7.4로 평형화한다.
이어 조정배지를 로딩하고, 결합 단백질을 50mM 트리스 1M NaCl pH 7.4로 용출시킨다.
rBPI를 농축하고, 다시 50mM 트리스 pH 7.4로 평형화한 두번째 CM-세파로스 컬럼에 BPI는 대략 0.75M NaCl에서 용출된다.
이렇게 정제된 rBPI는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 단일 밴드로 나타나며, 역상 HPLC에서 단일 피크를 나타낸다.
[실시예 3]
[BPI에 의한 내독소-유도 TNF 생산의 억제]
피콜-파크(파마시아)구배상에서 인간의 말초 혈액 단핵 세포류를 분리하여, 무발열원 HBSS(하젤톤)으로 2회 세척하고, 무혈청 RPMI(기브코)배지에 5×106/ml로 재현탁한다.
이 세포 현탁액 200μl를 평면 바닥 96웰 조직배양 디쉬(코스타르)의 각 웰에서 37℃에서 2시간동안 보온한다.
RPMI+10% 원위치 열 불활성화 혈청으로 2회 세척하여 미부착 세포를 제거한다. 부착 단핵 세포는 미리 완충액, BPI 단백질 또는 폴리믹신 B(기브코 : 7900U/ml)와 함께 37℃에서 30분간 예비 보온한 이.콜리 0111 : B4 내독소를 이용하여 자극한다.
내독소 혼합물을 첨가하고 4시간후에 상층액을 수확한다.
ELISA(엔도겔)에 의해 TNFα 분비를 정량화하고 결과를 표 3에 나타내었다.
CHO 세포에서 유래된 재조합 BPI 및 천연 BPI에 대해서 시험하였다.
[표 3]
그람 음성균 감염의 병생리학적 결과는 주로 세균내독소(LPS)의 방출에 의해 매개된다.
BPI 단백질은 시험과내에서 내독소 중화작용을 갖기 때문에, 내독소 쇼크 실험 모델을 이용하여 생체내의 BPI 단백질의 효과를 연구하였다.
구체적으로, 한 실험에서는 8마리의 쥐(스프래그 다울리 쥐)로 이루어진 1군에게 시그마에서 구입한 0111 : B4 내독소를 0.5mg/kg 체중의 양으로 1회 정맥내 투여하기 4시간전에 체중 1kg단 1mg의 BPI 단백질을 1회 덩어리 주입한다.
동일한 실험에서, 8마리 쥐의 다른 군에는 0111 : B4 LPS를 0.5mg/kg 체중의 양으로 1회 정맥내 투여하는 것과 동시에 체중 1kg당 1mg의 BPI 단백질을 1회 덩어리 주입한다.
또 세번째 군의 5마리 쥐에게는 0.5mg/kg 체중의 0111 : B4 LPS를 1회 정맥내 덩어리 주입하고 4시간후에 1mg BPI 단백질/kg 체중을 1회 덩어리 주입한다. 마지막으로 네번째 군의 10마리 쥐에게는 내독소만을 주입한다.
48시간 동안 쥐를 관찰하고, 각 군에 있어서 생존한 쥐의 수를 기록한다. 이 실험의 결과를 표 4에 나타내었다.
내독소만을 투여한 쥐는 80%의 취사율을 나타내었다. BPI 단백질과 내독소를 모두 투여받은 쥐는 취사율이 현저하게 감소되었다. 표 4에 나타낸 결과는 BPI 단백질이 내독소와 관련된 장해를 예방 및 치료하는데 있어 두 경우 모두 생체내에서 유용하다는 것을 입증한다.
고용량의 BPI 단백질 독성 연구에 의하여 동물을 7일째에 희생시킨 경우에 독성의 증거를 나타내지 않는다.
본 발명자들은 BPI가 LPS에 결합하며, TNF의 방출을 억제하고, 내독소 및 GNB 실험 패혈증 모델에 있어서 모두 치사율을 감소시키는(제17도) 무독성의 천연 단백질이라고 결론을 맺는다.
우리는 BPI 단백질이 패혈증 쇼크를 처치하기 위한 새로운 면역 요법적 접근방법을 제공한다고 믿는다.
[표 4]
또한, 살균성/투과성 증가 단백질(BPI)을 이용한 두번째 실험에서는, 호중구감소의 시기동안에 호중구 결핍증 쥐에게 슈도 모나스(PA1244)를 투여한다. 한군의 쥐는 5일째 발열이 시작될때 10mg BPI/kg 체중을 정맥내 처리하고 11일째까지 관찰한다.
두번째 군의 쥐에게는 5일째 발열이 시작될때 식염수-함유 완충액을 투여하고 11일째까지 관찰한다. 제8일후에, 완충액으로 처리한 군의 쥐는 사망하지만, BPI 단백질로 처리한 군의 쥐는 60%의 생존울을 보인다.
이들 쥐를 제11일에 관찰하고 각 군의 생존 쥐의 수를 기록한다. 제11일째에 BPI를 처리한 군에 있어서, 쥐들은 더이상 죽지 않는다. 이 실험의 결과는 제15도에 나타나있다.
제15도는 (1) 제8일까지 및 그후에 완충액 처군의 쥐가 100% 사망율을 보이고, (2) 제7일까지 및 그 후에 BPI 단백질 처리군의 쥐가 약 40% 사망율을 보이는 것을 나타낸다.
BPI 단백질을 투여받은 쥐는 현저히 감소된 사망율을 보인다.
이계(異系)교배된 CD-1 생쥐 또는 스프래규-다음리 쥐에 있어서 10mg/kg까지의 인간 BPI 단백질을 정맥내(IV) 투여해도 급성의 혈액학적, 생화학적 또는 병리학적 이상을 일으키지 않는다(표 5).
여서마리의 CD-1 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소 1mg/kg을 정맥내 주입하면 대조 CD-1 생쥐에서 100%(6/6) 생존율을 나타낸다.
1mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 1kg/mg의 BPI 단백질, 2kg/mg BPI 단백질 및 10kg/mg BPI 단백질을 각각 정맥내 주입하여 처리하였을때의 생존율은 각각 100%(4/4), 100%(4/4) 및 100%(5/5)이었다.
6마리의 CD-1 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소 10mg/kg을 정맥내 주입하면 대조 CD-1 생쥐에서 17%(1/6)의 생존율을 나타낸다. 1mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 1mg/kg BPI 단백질, 2mg/kg BPI 단백질 및 10mg/kg BPI 단백질을 각각 정맥내 주입하여 처리하였을때의 생존율은 각각 50%(2/4), 100%(4/4) 및 100%(5/5)이었다.
[표 5]
6마리의 CD-1 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소 50mg/kg을 정맥내 주입하면 대조 CD-1 생쥐에서 0%(0/6)의 생존율을 나타낸다.
1mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 1mg/kg BPI 단백질, 2mg/kg BPI 단백질 및 10mg/kg BPI 단백질을 각각 정맥내 주입하여 처리하였을때의 생존율은 각각 25%(1/4), 25%(1/4) 및 25%(5/5)이었다.
6마리의 CD-1 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소 100mg/kg을 정맥내 주입하면 대조 VD-생쥐군에서의 생존율은 0%(0/6)이다.
1mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 1mg/kg BPI 단백질, 2mg/kg BPI 단백질 및 10mg/kg BPI 단백질을 각각 정맥내 주입하여 처리하였을때의 생존율은 각각 0%(0/4), 0%(0/4) 및 80%(4/5)이었다.
6마리의 CD-1 생쥐에게 이.콜리 0111 : B4 내독소 200mg/kg을 정맥내 주입하면 대조 CD-1 생쥐군에서의 생존율은 0%(0/6)이다.
1mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 1mg/kg BPI 단백질, 2mg/kg BPI 단백질 및 10mg/kg BPI 단백질을 각각 정맥내 주입하여 처리하였을때의 생존율은 각각 0%(0/4), 0%(0/4) 및 20%(1/5)이었다.
결론적으로, 표 5는 BPI 단백질이 실험 동물에 있어서 독성을 나타내지 않으며 내독소 공격후에 이어지는 치사성으로 부터 현저하게 동물을 보호해준다는 것을 입증한다(제16도).
이 천연의 호중구-유래 항미생물 단백질은 패혈증 쇼크의 처치에 있어서 새로운 치료 전력을 제공한다.
이계 교배된 CD-1 생쥐에 있어서, 인간의 BPI 단백질을 10mg/kg의 용량까지 정맥내(Ⅳ) 투여해도 혈액학적, 생화학적 또는 병리학적 이상을 일으키지 않는다(표 6). CD-1 생쥐를 이용하여, 10마리의 생쥐에게 50mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 투여함으로써 내독소에 대한 BPI 단백질의 생체내 효능을 검사한 결과 대조 CD-1 생쥐에서는 100%(0/10)의 생존율을 나타내었다.
50mg/kg의 이.콜리 0111 : B4 내독소를 정맥내 주입한 생쥐를 10mg/kg의 BPI 단백질로 처리했을때 생존율은 0%(0/10)이었다.
P값은 P〈0.001이다.
또한, 5마리의 생쥐에게 50mg/kg의 055로 정맥내 주입하면(대조군) 생존율은 0%(0/5)이다.
50mg/kg의 055를 정맥내 주입한 생쥐를 10mg/kg의 BPI 단백질로 정맥내 처리했을때 생존율은 100%(5/5)이었다.
P값은 P〈0.01이다.
또한 5마리의 생쥐에게 25mg/kg의 RC 조면 변이주(rough mutant)(코어 당지질)을 정맥내 주입하면(대조군) 생존율은 0%(0/5)이다.
25mg/kg의 RC 조면 변이주(코어 당지질)를 정맥내 주입한 생쥐를 10mg/kg BPI 단백질로 정맥내 처리했을때 생존율은 100%(5/5)이었다.
P값은 P〈0.01이다.
또, 4마리의 생쥐에게 25mg/kg의 지질 A를 정맥내 주입하면(대조군) 생존율은 0%(0/4)이다.
25mg/kg의 지질 A를 정맥내 주입한 생쥐를 10mg/kg BPI 단백질로 정맥내 처리했을때 생존율은 100%(5/5)이다.
P값은 P〈0.05이다.
BPI는 내독소 중화작용을 가지며, 내독소 패혈증과 균혈증 모델 모두에 있어서 치사율을 감소시키는 천연의 무독성 단백질이며, 패혈증 쇼크를 처치하기 위한 유용한 면역 요법적 접근 방법을 제공할 수 있다.
[표 6]
비글리코실화 형태의 BPI 분자를 제조하기 위하여, 정상적으로는 글리코실화 재조합 단백질을 발현하는 CHO 세포주(클론 3A1)를 7.5% 투석 소 혈청(기브코)+3μg/ml 튜니카마이신(뵈링거만하임, 인디애나폴리스, IN)을 함유하는 롤러병(코스타르, 캠브리지 M4)에서 바닥이 모두 덮일때까지 생육시킨다.
제24시간후에, 배지를 버리고, 2μ/ml 튜니카마인신을 함유하는 새로운 완전 배지로 치환한다.
조정 배지를 모으고, 3일간 24시간마다 교환한다.
상기 실시예 3에서 재조합 BPI 단백질에 대한 기술한대로 비글리코실화 재조합 BPI 단백질을 정제하고, 수퍼로스 12(파마시아) 크기배제 크로마토그래피상에서 20mM 글리신+100mM NaCl을 이용하여 pH 2에서 잔류 글리코실화 재조합 BPI 단백질로부터 분리해낸다.
비글리코실화 BPI 단백질(폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 동정)을 함유하는 분획을 풀링한다.
글리코실화 또는 비글리코실화 재조합 BPI 단백질을 10mg/kg의 농돌 생쥐에게 주사한다. 안과 두쪽의 신경총을 통하여 소정 시간마다 혈액을 채집한다. 혈액 시료를 방치하여 응고시키고, 원심 분리하여 피브린 응괴를 제거하고, ELISA법에 의해 재조합 BPI 단백질 농도를 측정하였다(결과는 제18도에 나타내었다).
ELISA 분석법
장치
임뮬론-2 96웰 플레이트(다이나텍크)
12-채널 50-200μl 피펫
P20, P200, P1000 피펫
시약 저장조(코스타르)
선반에 걸린 1ml 튜브(바이오래드)
프로필렌제 15ml 원추형 튜브
시약
용액
25Mm 붕산염 pH 9.5
보호용액=PBS에 용해시킨 5% BSA(시그마 분획 V2저농도 내독소)
BPI 표준물질(대략 -70℃에서 보관한 부분 표본)
주 : BPI 표준물질과 시료는 폴리프로필렌내에서 희석하여야 한다.
표준물질 및 시료 희석액=적절한 용액(예를들면, 조직 배양 상층액을 시험하는 경우에는 REM+7.5% dFBS사용)
PNPP 기질 정제(5mg/WJD : 시그마)
항생물질
포획(제1)항체 (100l/웰)
A. INVN 1-2(토끼 다클론성 항-인간 BPI 단백질) IgG 1μg/ml, 또는
B. ML-L(토끼 항 N-말단 20아미노산 BPI 펩티드) 3μg/ml
레포터(제2)항체
A. INVN 1-2-비오틴(대략 1 : 1000으로 사용)
B. PIGB(BPI가 세균에 결합하는 것을 차단하는 생쥐의 단클론성 항-BPI)
제3(전개용)시약
A. 스트렙트아비딘/알칼리성 포스파타제(바이오래드)(대략 1 : 2000으로 사용)
b. 염소 항-생쥐 iG/알칼리성 포스파타제 접합체(바이오래드)(대략 1 : 2000으로 사용)
방법
1. 플레이트의 피복
주 : 플레이트는 1달전에 미리 피복하여 사용시까지 4℃에서 보관한다.
25mM Na붕산염 pH 9.5으로 포획 항체를 희석한다(10ml/플레이트).
96웰 플레이트(임뮬론-2)의 각 웰에 100μl 첨가.
37℃에서 밤새 보온. 사용시까지 냉장 보관.
2. 보호
플레이트를 톡톡쳐서 항체를 피복한다.
PBS에 용해시킨 5% BSA 200μl을 각 웰에 첨가한다.
37℃에서 2∼4시간, 또는 4℃에서 밤새 보온한다.
세척액으로 부터 4회 세척하고 종이 타월에 블롯팅한다.
3. BPI 표준물질 및 미지물질
표준물질
새로운 표준물질 부분 표본(0.5ml, 약 1mg/ml)을 2개월마다 해동한다.
1. 정제된 원액 1ml를 만들거나 100ng/ml의 BPI로 만든다.
2. 다음 농도의 표준물질 500μl를 다음과 같이 제조한다.
100μl의 표준물질(미지물질)/웰을 첨가하고 실온에서 2∼4시간, 또는 4℃에서 밤새 보온한다. 4회 세척한다.
제2항체
최종 세척후에 플레이트를 격렬하게 블롯팅하고, 각 웰마다 INVN 1-2-비오티닐화(대략 1 : 1000)100μl(이것은 10ml의 세척액/시료 완충액중 10μl에 해당)를 첨가한다.
37℃에서 1시간동안 보온. 4회 세척한다.
제3항체
최종 세척후에, 플레이트를 격렬하게 블롯팅하고 각 웰마다 100μl 전개시약을 첨가한다.
37℃에서 30분간 보온한다. 4회 세척한다.
기질
주 : 플레이트에 넣기 직전에 기질 정제를 기질 완충액에 첨가한다.
최종 세척후에, 플레이트를 격렬하게 블롯팅하고, 100μl의 기질용액(2×5mg PNPP 기질 정제/10ml 기질 완충액)을 첨가한다.
405nm에서 플레이트의 흡광도를 측정한다. 흡광도 판독 도중에 플레이트는 암소에 보관한다.
생물학적으로 활성인 BPI 변형체 : 많은 종류의 BPI 변형체를 제작하여 원래의 분자의 여러 특성중 일부를 변환시킨다.
첫번째 종류의 제작물에 있어서, 변형체는 혈청중에서의 분자 반감기가 연장되도록 설계한다.
이러한 제작물중 하나에 있어서는, 1175 위치에 단일 염기쌍 변화를 일으켜(제12도) Ser 351의 단일 글리코실화 부위를 변화시키므로써 그 위치가 Ala을 코딩하게 되고 N-글리코실화가 일어나지 않도록 한다(즉, 표 7에서 Ser 351→AlaBPI(비글리코실화).
이러한 변화는 원하는 서열을 함유하는 앰플라이머를 이용하는 PCR에 의해 분자의 특정 절편을 증폭한후, 편리한 제한부위(이 경우에는 염기 1202에 SphI 부위)에 의하여 원래의 절편과 보정된 절편을 교환하여 만들 수 있다.
이러한 분자는 BPI와 유사한 특성을 갖지만, 간세포의 제거(clearance)수용체에 의해 인지되는 만노스 잔기가 결여되어 있기 때문에 간에서 덜 빠르게 제거될 것으로 기대된다.
다른 제작 물들은 LBP의 높은 안정성, BPI의 상동성의 장점을 취하도록 설계되었다.
예를들면, LBP의 아미노-말단 25kDa 절편(아마도 내독소-결합 도메인)을 BPI의 카복시-말단 30kDa부분과 합하여, 보다 길어진 혈청 반감기를 갖지만 BPI의 기능을 보유하는 키메라 분자(즉, 표 7에 나타낸 LBP 25K/BPI 30K 키메라)를 창출한다. 세번째 형태의 제작물은 면역 글로불린의 매우 높은 혈정 안정성을 이용하여 BPI의 안정성을 향상시킨 것이다.
BPI의 아미노-말단 25kDa(LPS-결합) 부분을 IgG1의 일정 도메인을 코딩하는cDNA와 연결시킨다.
생성된 키메라 분자는 내독소에 결합하고 현재 개발중에 있는 항-내독소 항체처럼 내독소를 불활성화시킬 것으로 기대된다.
두번째 종류의 분자들은 BPI 단백질의 치료 지수를 향상시키도록 설계되었다. 예를들면, BPI 단백질의 아미노 말단 도메인은 매우 높은 비율의 양전하 잔기(대략 14%)를 함유한다.
몇몇 변형체에 있어서, 후술하는 방법에 의해 아미노 말단의 양이온성 잔기중 하나 또는 그 이상을 중성 또는 음이온성 잔기로 바꾸었다.
이러한 재설계된 분자는 생물학적막에 대하여 덜 파괴적이며 따라서 덜 양이온성을 띤다.
또, 후술하는 LBP/BPI 단백질 키메라 분자(즉, 표 7의 LBP 25K/BP 130K 키메라)는 LBP 아미노 말단 도메인의 야잉온성이 감소되었기 때문에 BPI에 비해 독성이 낮다. 세번째 종류의 변형체들은 BPI에 결합하는 내독소의 친화성, 특이성 및/또는 원자가를 증가시키기 위한 것이다.
예를들면, 25KDA 부위내에 단일 염기쌍 변화가 있는 재조합 BPI 단백질을 생산하고 시험관내에서 내독소에 결합하는 능력을 시험하였다.
특정 중요 아미노산, 특히 양이온성 잔기를 바꾸므로써 BPI 단백질이 그의 리간드, 즉 내독소에 결합하는 친화성을 증강시킬 수 있다.
또 LBP 25K/BPI 30K 키메라로 명명된 LBP/BPI 단백질 키메라 분자는 내독소에 대한 LBP의 친화성을 갖는 한편 BPI의 기능을 보유한다.
다른 제작물들은 BPI 단백질당 두배량의 내독소에 결합할 수 있을 것이라는 기대하에 BPI에 두번째 내독소-결합 도메인이 첨자된 것이다.
네번째 종류의 변형체는 상호 작용하여 BPI가 대식구 활성화를 하향 조정하게 하는 수용체에 대한 BPI 및/또는 BPI/내독소 착체의 결합 친화력을 변화시키기 위해 설계된 것이다.
이러한 변형체의 예에는 후술하는 대로 시험관내 변이 발생에 의해 창출한, BPI의 30kDa 부위내에 단일 아미노산이 변화된 BPI 단백질을 포함한다.
BPI 25K/DP/BPI 30K(표 7)로 명명된 이러한 변형체는 그의 고유한 25kDa 도메인을 포름산 처리에 의해 격리시킬 수 있는 변형체이다.
생물학적으로 활성인 BPI 변형체를 창출하기 위해 사용되는 방법은 당업계에서 통상 실시되는 표준 방법이다.
주요 분자의 관련 부분을 통상의 방법으로 재결합하여 키메라 분자를 형성시킨다. 예를들면, LBP의 아미노-말단 25kDa 부위를 제26도에 나타낸 것과 같이, 코딩 서열내에 있는 처리된 ClaI 부위에 의해 BPI 단백질의 카복시-말단 부위에 연결시킨다.
표적 cDNA(25 염기)의 양말단까지 뻗치도록 가수 분해시키기에 충분한 DNA 절편 뿐만아니라 클로닝 부위를 포함하는 올리고누클레오티드를 표준 방법에 의해 화학적으로 합성한다.
이들 프라이머는 폴리머라제 사슬 반응(Polymerase Chain Reaction)에 의해 목적 유전자 절편을 증폭하는데 사용할 수 있다.
생성된 새로운 유전자 절편은 표준 조건하에 대응 제한 효소로 소화시키고, 겔 전기 영동에 의해 분리한다. 또는 적절한 제한 효소로 cDNA 자체를 소화시켜 유사한 유전자 절편을 생산한후 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드를 이용하여 빠져있는 유전자 절편을 메꿀 수 있다.
이들 코딩 서열의 절편들을 서로 연결시키고 코딩 서열의 재조합체 생산을 가능케 하는 적절한 발현 벡터내로 콜로닝시킨다.
이러한 키메라 분자를 위한 관련 발현계에는 CHO같은 포유동물세포, 효모같은 진균, 바큘로비루스같은 곤충비루스 및 이.콜리 같은 세균이 포함되지만 이들에만 국한되는 것은 아니다.
이들 계를 위하여, 유용한 발현 벡터는 암피실린 같은 항생제 내성 유전자를 포함하여 재조합체 클론의 선택을 가능케하고, 숙주 세포의 선택을 가능케하는, 네오마이신 같은 제2항생물질 내성 유전자를 포함하며, 유전자 삽입 부위의 상류에 CHO 세포의 경우에는 MMTV, SV40 또는 메탈로티오닌 프로모터를, 세균 숙주의 경우에는 trp, lac, tac 또는 T7 프로모터를, 또는 효모의 경우에는 알파 인자, gal 또는 PG DH 프로모터를 포함하고, 포유동물 숙주의 경우에는 RSV 인헨서 같은 전사 인헨서를 포함하며, cDNA 서열내에 존재하지 않는 폴리아데닐화 부위 AATAAA를 포함한다. 일단 표준 배양법을 통하여 균질한 재조합 세포 배양액이 얻어지면, 다량의 재조합 키메라 분자를 회수하고 표준 크로마토그래피법을 통하여 조정 배지로 부터 분석한다.
예로서, 상술한 세가지 제작물을 시판 발현 벡터(클론텍크, 마운틴 뷰, CA)인 pMam Neo 벡터내에서 제작하고, 포유동물 세포 숙주 DUXB11을 형질 전환시키는데 이용한다.
시판되는 시약인 리모펙티(BRL/기브코, 게이터스버그. MD)을 이용한 형질 전환후에 세포를 표준 조직 배양 배지중에서 배양하여 회수 및 네오마이신 내성의 표현형 발현을 실시한다.
회수하고 24시간후에, 선택 시약 G148을 배질에 가하여 도입 유전자를 발현하는 세포를 선택한다.
선택 배지중에서 3주간 배양한후, 약제 내성 세포 풀을 얻고 배양기 바닥에 가득 덮힐 정도로 생육시킨다.
이 시점에서, 배지를 제거하여, ELISA에 의해 항-BPI 단백질에 대한 면역 반응성의 존재를 분석하고 멀티웰 프렐이트에 미리 결합시킨 내독소에 결합하는지 분석한다.
특정 경우에 있어서는, 벡터가 프로모터 영역에 글루코코르티코이드 결합 부위를 포함하고 있기 때문에 160nM 덱사메타손을 배지에 가하여 발현을 증가시킨다.
생성된 BPI 단백질량을 각 상층액 시료에 대하여 검출하고, 대표적인 데이타를 다음에 표 7로 나타내었다.
[표 7]
따라서, 이들 생물학적으로 활성인 BPI 변형체 또는 유사체를 CHO 숙주내에서 생산할 수 있다는 것이 입증되었으며, 이들은 항-BPI 항체와 면역학적으로 교차 반응할 수 있으며 BPI와 비슷한 수중으로 내독소에 결합할 수 있다.
동일한 벡터를 다른 숙주 세포주에 형질 감염시켜 향상된 수준의 변형체를 생산할 수 있다.
다량의 재조합 단백질을 얻고자 하는 제작물을 디히드로폴레이트 환원효소-코딩 유전자를 함유하는, pSE같은 증폭 가능한 벡터에 재클론할 수 있다.

Claims (32)

  1. BPI 단백질 및, 단백질, 프로테오글리칸 또는 합성 중합체인 음이온성 화합물을 함유하고 (1) 살균작용을 나타내지 않으며 (2) 내독소 중화작용을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 음이온성 화합물이 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. (1) 내독소에 특이적으로 결합하고, (2) 내독소와의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하며 (3) 내독소 유발 치사를 억제하며, 제23도, 제24도 또는 제25도에 나타내어진 서열로 구성됨을 특징으로 하는 생물학적으로 활성인 BPI 유사체 또는 변형체.
  4. 내독소-BPI 단백질 착체가 형성되는 조건하에서 피험자에게서 채취한 혈청, 뇨, 혈액 또는 객담으로 이루어진 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고, 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하여 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 하는 피험자 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법.
  5. (a) 내독소가 결합될 수 있는 모든 내독소 결합 단백질이 변성되도록 혈청, 뇨, 혈액 또는 객담으로 이루어진 시료를 처리하여 미결합 내독소를 얻고, (b) BPI 단백질이 단계 (a)의 미결합 내독소에 결합될 수 있는 조건하에 처리 시료를 BPI 단백질과 접촉시켜 내독소-BPI 단백질 착체를 형성하며, (c) 이렇게 형성시킨 착체의 양을 검출하여 시료중의 내독소의 양을 측정함을 특징으로 하는, 피험자에게서 채취한 결합 및 미결합 내독소-함유 시료중의 내독소의 양을 측정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 (a)에서 변성 반응은 고온을 이용하여 실시함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 고온은 95℃임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 단계 (a)에서 변성은 산을 이용하여 실시함을 특징으로 하는 방법.
  9. 내독소가 BPI 단백질에 결합하여 착체를 형성할 수 있는 조건하에 혈청, 뇨, 혈액 또는 객담으로 이루어진 시료를 BPI 단백질과 접촉시키고, 이러한 착체를 검출함을 특징으로 하는 시료중의 내독소의 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 내독소를 함유하는 시료를 검출 가능한 표지로 표지화한 BPI 단백질과 접촉시키기에 앞서 시료중의 내독소가 지지체에 부착되는 조건하에서 적절한 지지체에 내독소-함유 시료를 옮기는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 내독소가 BPI 단백질에 결합하여 착체를 형성하고, 이러한 착체의 검출을 통하여 피험자로부터 채취된 생물학적 유체 시료중의 내독소를 검출함으로써 피험자의 내독혈증을 진단하는 데 유효한 양의 BPI 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 내독혈증의 진단에 사용되는 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 시료는 세포성 시료임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 시료는 생물학적 유체 시료임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 표지는 형광성 표지이고, 검출은 형광측정계에 의해 실시함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 표지는 방사성 표지이고, 검출은 방사선 사진에 의해 실시함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 표지는 효소이고, 검출은 분광계를 이용하여 실시함을 특징으로 하는 방법.
  17. 그 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 설계되어 있는 외과용 기구의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는, BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루게 하기 위하여 외과용 기구를 BPI 단백질로 피복하는 방법.
  18. 그 표면이 생물학적 시료와 접촉하도록 되어있는 매립식 침입성 장치의 표면에 BPI 단백질을 부착시킴을 특징으로 하는, BPI 단백질이 내독소와 착체를 이루게 하기 위하여 매립식 침입성 장치를 BPI 단백질로 피복하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 생물학적 시료는 조직 시료임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 생물학적 시료는 근육 시료임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 생물학적 시료는 연골 조직임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 생물학적 시료는 뼈임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 외과용 기구는 카테테르 튜브임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제17항에 있어서, 외과용 기구는 외과용 스태플임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제17항에 있어서, 장치는 외과용 이식물임을 특징으로 하는 방법.
  27. 내독소가 BPI 단백질과 착체를 형성하는 조건하에서 피투여자에게 투여전에 혈액, 혈장, 혈액 혈청, 등장액, 의약 또는 세포 배양 시약으로 이루어진 내독소-함유 유체를 BPI 단백질과 접촉시켜 유체를 오염 제거함을 특징으로 하는, 내독소-함유 유체를 피투여자에게 투여하기 전에 오염제거 하는 방법.
  28. 내독소와 결합하여 피투여자의 내독혈증을 예방하는데 유효한 양의 BPI 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 피투여자에게 투여하여 내독혈증의 예방에 사용되는 약학적 조성물.
  29. 내독소와 결합하여 내독혈증으로 고통받는 피투여자를 치료하는데 유효한 양의 BPI 단백질을 포함함을 특징으로 하는, 피투여자에게 투여하여 내독혈증으로 고통받는 피투여자를 치료하는 데 사용되는 약학적 조성물.
  30. 제3항에 있어서, 상기 유사체 또는 변형체는 BPI보다 긴 혈청내 분자 반감기를 가짐을 특징으로 하는 유사체 또는 변형체.
  31. 제3항 또는 제30항에 있어서, 상기 유사체 또는 변형체는 의료술로써 치료방법에 사용됨을 특징으로 하는 유사체 또는 변형체.
  32. 제3항 또는 제30항의 유사체 또는 변형체를 포함함을 특징으로 하는, 내독혈증을 치료하기 위한 약학적 조성물.
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