KR100274424B1 - 생물학적 유체 시료중의 bpi 단백질의 존재 또는 양을 결정하기 위한 키트 - Google Patents

생물학적 유체 시료중의 bpi 단백질의 존재 또는 양을 결정하기 위한 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BPI 단백질 및 음이온성 화합물을 함유하고, (1)살균작용을 나타내지 않으며 (2)내독소 중화작용을 갖는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 BPI 단백질의 이용 방법을 제공한다.

Description

생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 존재 또는 양을 결정하기 위한 키트{A KIT FOR DETERMINING THE PRESENCE OR THE AMOUNT OF BPI PROTEIN IN A BIOLOGICAL FLUID SAMPLE}
재조합 BPI 단백질, BPI 단백질의 용도 및 그의 제조방법
본 출원은 1990년 8월 13일자 출원된 미국 특허출원 제 567,016호 및 1991년 4월 5일자 출원된 미국 특허출원 제681,551호의 일부 계속 출원이다.
1991년 4월 5일자 출원된 미국 특허출원 제 681,551호는 1990년 1월 22일자 출원된 미국 특허출원 제 468,696호의 일부 계속 출원인 1990년 8월 13일자 출원된미국 특허출원 제 567,016호의 일부 계속 출원이며, 미국 특허출원 제 468,696호는 1989년 2월 14일자 출원된 미국 특허출원 제 310,842호의 일부 계속출원이다.
상기 특허출원의 내용은 모두 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다.
발명의 배경
그람 음성균 감염은 특히 입원환자 및 면역손상 환자에 있어서의 이환율 및 치사율을 유발하는 가장 중요한 원인이다.[Duma, R, T., Am. J. of Med., 78(Suppl. 6A): 154-164(1985); 및 Kreger B.E., D.E. Craven and W.R. McCabe, Am. J. Med., 68 : 344∼355(1980)].
현재 입수 가능한 항생 물질들이 일반적으로 감염 치료에 효과가 있기는 하지만, 이들 물질은 지질다당류(LPS)와 연관된 병리생리학적 작용을 중화시키지는 못한다.
LPS는 그람 음성균의 외막의 주요 성분으로서 생명체가 용해될 때 방출된다[Shenep, J. L. and K. A. Morgan, J. Infect. Dis., 150(3) : 380-388(1984)].
항생 물질에 의한 치료중에 방출되는 LPS는 염증 반응을 일으키는 강력한 자극제이다.
생체내에서의 LPS에 의한 많은 유해한 작용은 염증 세포에 의해 방출되는 가용성 매개 물질에 의한 것이다[Morrison D. C. and R. J. Ulevich, Am. J. Pathol., 93(2) : 527∼617(1978)].
LPS는 숙주의 염증 세포에 의한 매개 물질의 방출을 유발하는데, 이는 궁극적으로 파종성 혈관내 응고(DIC), 성인 호흡 장해 증후군(ARDS), 심기능 부전증, 기관 부전증, 간 부전증(간담즙 부전증), 뇌 부전증(CNS 부전증), 신 부전증, 다기관 부전증 및 쇼크를 유발할 수 있다.
가용성 LPS는 호중구 화학 주성의 감소, 부착력의 증가, 육탄단 모노포스페이트측로 활성의 증가, O2라디칼 생성의 증가, 보체에 대한 표면 수용체의 과도 조절 및 과립 단백질의 주위 매질로의 방출 등을 유발한다[Morrison and Ulevich(1978)].
내독혈증은 혈류중에 내독소, 즉 열안정성 세균 독소가 존재하는 것과 관련되어 있는 증세이다.
내독소는 감염 반응을 촉발하는데 이는 감염에 대항하는 유의한 작용이지만, 그것이 통제되지 않는 경우에는 숙주에 손상을 입힐수 있다.
내독혈증은 간에 내독소 결합 단백질의 생산을 유도하고, 백혈구로부터 살균성 단백질의 방출을 유발한다.
본 발명자들의 연구에 따르면, 이들 백혈구 단백질중 하나, 즉 BPI는 전에는 그의 시험관내 살균 활성만이 알려져 있었지만, 시험관내에서 호중구와 단핵세포를 자극하는 내독소의 작용을 억제하고 생체내에 투여하면 내독소 또는 세균 침입에 의한 사망을 감소시킬수 있다는 것이 밝혀졌다.
나아가, BPI는 항생 작용은 나타내지만 숙구 세포에 대해서는 세포 독성 기능을 갖지 않는 것으로 밝혀져 있다.
단핵세포와 호중 과립구는 세균 감염에 대항하는 숙주의 방어계에 있어서 중요한 역할을 담당하고, 내독혈증의 병리학에도 관여한다.
이들 세포는 미생물을 삼켜서 세포내에서 죽이며, 생체내 및 생체외에서 가용성 단백질을 방출시켜 내독소에 대해 반응을 나타내는데, 가용성 단백질은 살균, 단백질 분해, 옵소닌, 발열, 보체 활성화 및 조직 손상 작용을 나타낸다.
내독소에 의해 자극된 단핵세포에 의해 방출되는 사이토킨의 일종인 종양 괴사인자(TNF)는 내독소의 생체내 독성 작용을 어느 정도 모방한다.
동물에 TNF를 주입하면, 발열, 쇼크 및 글루코스 대사의 변화 등이 일어난다.
TNF는 또한 호중구의 강력한 자극물질이다.
IL-1, IL-6 및 IL-8같은 다른 사이토킨류도 LPS의 병리생리학적 작용을 매개한다. 항생물질 치료에 있어서의 발전에도 불구하고, 내독혈증과 관련된 이환율과 치사율은 아직도 높다.
항생물질 단독으로는 LPS의 독성 작용을 중화시키는데 있어서 효과를 나타내지 못한다.
따라서, 직접적으로 내독소 중화효과를 갖는 치료법에 대한 요구가 있어왔다. 현재 채택되고 있는 내독혈증의 처치법에서는 항생물질과 지지요법이 이용되고 있다.
현재 적용 가능한 대부분의 보조 요법은 저혈압과 발열같은 내독소 쇼크 증세를 치료하긴 하지만 내독소를 불활성화시키지는 못한다.
다른 치료법들은 LPS에 대한 숙주의 염증성 반응을 억제한다.
후술하는대로, 현행 치료법들은 독성, 면역원성 또는 동물 모델과 인체 임상 실험사이에서 그 효능이 재현되지 않는 점등때문에 그 제한이 크다.
폴리믹신 B(PMB)는 내독소의 성분중 가장 독성이 크고 생물학적으로 활성을 갖는 성분인 지질 A에 결합하여 구조적으로 파괴하는 것으로 밝혀진 염기성 폴리펩티드 항생물질이다.
PMB는 시험관내에서 내독소가 호중구 과립의 방출을 활성화하는 것을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 인체내에서 그람 음성균의 감염을 처치할 수 있는 잠재적인 치료약물이다.
그러나, 전신 독성을 나타내기 때문에 국소용 약제로 사용되는 경우를 제외하고는 사용에 제한이 있다.
항생물질과 다량의 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(MPSS)를 함께 사용하는 병용 요법은 개를 이용한 그람 음성균 패혈증의 실험 모델에 있어서 사망을 예방하는 것으로 알려져 있다.
전신 패혈증의 임상학적 징후가 있는 223명의 환자를 대상으로 한, 다중심, 이중맹안, 플라세보-조절된 임상 실험에 있어서 MPSS와 항생물질을 이용한 또 다른 연구는 치료 그룹과 플라세보 그룹간에 있어서 치사율이 유의할만한 차이를 나타내지 않는다는 결론을 내리고 있다.
나아가, 연구자들은 플라세보 그룹에 있어서 14일 이내에 발생하는 이차 감염의 해소율이 훨씬 높은 것을 발견하고 있다.
내독혈증을 처치하기 위한 비교적 새로운 접근 방법은 내독소 중화 항체를 이용하여 수동 면역화하는 것이다.
이.콜리. J5에 대한 과면역 인간 면역글로불린이 그람 음성균 세균혈증을 갖는 환자의 치사율 및 쇼크를 50% 감소시킨다는 것이 알려져 있다.
다른 연구 그룹에서는 생쥐 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체 및 인간 단클론성 항체를 이용한 동물 모델에 있어서의 유망한 결과를 밝히고 있다.
단클론성 항체는 과면역 혈청에 비하여 예를들면 보다 일정한 약제 역가 및 인간 병원성물질의 전파가 감소되었다는 점에서 유리하기는 하지만, LPS를 중화시키기위해 면역글로불린을 투여하는 것과 관련하여 아직 많은 문제점들이 남아있다.
면역글로불린 자체에 대한 숙주의 반응에 의하여 과민감성이 유발될 수 있다.
보체 활성화 및 면역 착체의 침전에 뒤따르는 조직 손상도 패혈증 환자에게 항-내독소 항체를 사용한 치료법을 적용시키는데 있어서 관련된 또 다른 문제점이다.
BPI는 1975년에 처음으로 발견된 호중구 과립 단백질이다[Weiss, J., R. C. Frans-on, S, Becherdite, K, Schmeidler, and P. Elsbach J. Clim, Invest., 55 : 33(1975)].
BPI는 1978년에 인간 호중구로부터 고도로 정제된 형태로 얻어졌으며, 세포막의 투과성을 증가시키고 시험관내에서 인산염 완충 식염수중에서 분석했을때 그람 음성균에 대하여 살균 작용을 갖는 것으로 밝혀져 있다[Weiss, J. et al. J. Biol. chem, 253(8) : 2664∼2672(1978)].
나아가, 바이스(Weiss) 등은 BPI가 포스포리파제 A2의 활성을 증가시키는 것을 밝혀내고, BPI가 시험관내 살균 활성뿐만아니라 전(前)염증 작용도 갖는다는 것을 시사하였다.
토끼의 BPI는 1979년에 정제되었으며[Elsbach et al. J. Biol. Chem 254(21) : 11000∼11009] 인간에서 분리된 BPI와 동일한 살균 및 투과성 증가 활성을 갖는 것으로 밝혀지므로써, 연구에 사용할 수 있는 또 다른 재료를 제공하였다.
토끼와 인간에게서 얻어진 BPI는 모두 시험관내에서 K1- 캡슐화 이.콜리를 비롯한 각종 그람 음성균에 대하여 효과적인 것으로 밝혀져 있다[Weiss et al., Infection and Immunity 38(3) : 1149∼1153(1982)].
바이스(Weiss)등은 1984년에 BPI의 시험관내 살균 작용에 있어서의 리포다당류의 역할을 제안하였다[J. Immunol. 132(6) : 3109∼3115(1984)].
이들 연구자들은 BPI가 그람 음성균의 외막에 결합하여 LPS의 세포외 방출을 일으키고, LPS 생합성을 선택적으로 자극한다는 것을 입증하였다.
1984년에, 비슷한 특성을 갖는 단백질이 인간 호중구로부터 분리되어 양이온성 항미생물 단백질 57(CAP 57)로 명명되었다[Shafer, W. M., C. E. Martin and J. K. Spitznagel, Infect. Immun., 45 : 29(1984)].
이 단백질은 N-말단 아미노서열, 아미노산 조성, 분자량 및 출처에 의해 결정하였을때 BPI와 동일하다[Spitznagel et al., Blood 76 : 825∼834, 1990].
또 다른 연구 그룹에서 호브데(Hovde)와 그레이(Gray)는 1986년에 BPI와 실질적으로 동일한 특성을 갖는 살균성 당단백질을 보고한 바있다[Hovde and Gray, Infect-ion and Immunity 54(1) : 142∼148(1986)].
1985년 오오이(0oi)등은 BPI가 호중구 프로테아제에 의해 절단된 후에도 시험관내 살균작용을 유지하는 것을 보고하면서 단백질 단편이 그의 활성을 계속 보유한다는 것을 시사하였다[Ooi and Elsbach, Clinical Research 33(2) : 567A(1985)].
BPI의 시험관내 살균 활성 및 투과성 증가 활성은 모두 이 단백질의 N-말단 25KD 단편내에 존재한다[Ooi, C.E., et al. J. Biol. Chem. 262 : 14891(1987)].
BPI가 세균의 외막에 있는 내독소와 관련된 구조에 결합한다는 증거는 다음과 같다.
(1)BPI의 투과성 증가 활성에 대하여 표면이 매끄러운 이.콜리 균주보다 표면이 거친 이.콜리 균주가 보다 증가된 민감성을 나타낸다[Weiss, J. et al. Infect. Imm-un. 51 : 594(1986)].
(2)내독소의 구조를 변화시키는 Prm A 돌연변이에 의해 폴리미진 비. 및 BPI 모두에 대한 결합이 감소된다[Farley, M.M. et al. Infect. Immun. 56 : 1536-1539(1987) 및 Farley et al. Infect. Immun. 58 : 1589∼1592(1988)];
(3)폴리믹신 B(PMB)는 에스. 티피무리움(S. typhimurium)에 결합하기 위해 BPI를 보체로서 필요로 한다[Farley 1988]; 및
(4)BPI는 또 다른 내독소 결합 단백질인 리포다당류 결합단백질(LBP)과 아미노산서열 상동성을 나타내며 면역 교차 반응성을 나타낸다[Tobias et al., J. Biol. C-hem. 263(27) : 13479∼13481(1988)].
LBP-LPS 착체는 단핵세포상의 세포 표면 수용체(CD 14)에 결합하여 염증성 사이 토킨 종양 괴사 인자(TNF)의 합성 및 방출을 증가시킨다[Schumann et al. Suence 249 : 1429∼1431].
즉, LBP는 LPS의 면역 자극 활성을 촉진시킨다.
BPI는 LBP와 정반대의 작용을 나타낸다.
BPI는 LPS에 결합하고, 호중구와 단핵세포 활성화를 억제한다[Marra ey al., J. I-mmunol. 144 : 662∼666(1990); Marra and Scott, WO 90/09183, 공개일 1990년 8월 23일; C. J. Fisher et al. Circulatory Shock 34 : 120(1991)].
BPI를 코딩하는 cDNA가 그레이(Gary)등에 의해 얻어져서 서열이 밝혀져 있다[Gray et al. Clim. Res 36 : 620A(1988) 및 Gray et al. J. Biol. Chem. 264(16) : 9505∼9506(1989)].
이들은 BPI가 25KDa단편의 가용성 형태로 절단 및 방출될 수 있는 막 단백질이라고 보고하였다.
원래는 그람 음성균에 BPI가 결합하면 LPS 구조를 파괴하고, 작은 소수성 분자에 대한 미생물의 투과성을 변화시켜서 세포를 죽게한다고 보고되어 있었다(Weiss, etal., 1978).
보다 최근에 상기 저자들은 이러한 효과가 혈청 알부민의 부재하에서만 발생한다는 것을 입증하였다.
BPI는 혈청 알부민의 존재하에 배양된 세균에 첨가된 경우에는 살균 작용을 나타내지 않으며, 이것은 알부민이 널리 퍼져있는 생체내에서는 세균을 죽이지 않는다는 것을 시사하는 것이다[Mannion et al. J. Clim. Invest. 85 : 853∼860(1990) 및 Mannion et al. J. Clim. Invest. 86 : 631∼641)].
즉, 종래 문헌에서는 BPI의 유익한 효과가 시험관내 살균 작용에만 한정되어 있는 것으로 이해되고 있었던 것이다.
본 발명에서 본 발명자들은 BPI가 LBP같은 다른 공지된 내독소 결합 단백질과는 달리 혈청과 혈장의 존재하에서 내독소에 결합하며, BPI가 시험관내 및 생체내에서 각각 내독소의 면역 자극 활성 및 독성 작용을 억제한다는 것을 밝히는 바이다.
즉, BPI는 내독혈증 및 내독소 쇼크를 비롯한 내독소-관련 장해의 치료 및 예방에 있어서 신규하고 독특한 용도를 갖는다.
나아가, BPI는 그레이(Gray) 등에 의해 호중구 과립막으로부터 가용성 형태로 방출되기 위해서는 25kDa 단편으로 절단되어야만 하는 막단백질인 것으로 보고되었다[J, Biol. Chem. 264(16) : 9505∼9509(1989)].
제1도 : T7 프로모터/BPI 단백질 플라스미드 제작물로 형질 전환시킨 JM109(DE)플레이트의 사진. 사진은 1125초 노출에 f8에서 찍은 것이다.
A. pT7BPI-F(+)는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 풀-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열 포함)을 포함한다.
B. pT7BPI-F(-)는 T7 프로모터 하류에 그릇된 방향으로 위치한 풀-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열 포함)을 포함된다(생성된 단백질은 T7 유전자 10의 260 아미노산 리더 펩티드와의 융합 단백질이다).
C. pT7BPI-S는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 풀-랭쓰 BPI 단백질 서열(시그널 서열을 포함하지 않음)을 포함한다.
D. pT7212-F는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 프롤린-212 절단된 BPI 단백질서열(시그널 서열 포함)을 포함한다.
E. pT7212-S는 형질발현을 위하여 T7 프로모터 하류에 옳은 방향으로 위치한 프롤린-212 절단된 BPI 단백질 서열(시그널 서열을 포함하지 않음)을 포함한다.
제2도 : pT7BPI 단백질 플라스미드 제작물의 도식도
제3도 : ELISA 분석에 있어서 BPI 단백질 활성을 나타내는 표준곡선
제4도 : BPI 단백질 샌드위치 ELISA ± 내독소 ± 폴리믹신 B. 프로토콜은 다음과 같다 : PBS + 1% BSA를 희석액으로 사용하여 1㎍/ml의 폴리믹신 B 설페이트의 존재 및 부재하, 그리고 1㎍/ml의 이.콜리 0111B4 내독소의 존재 및 부재하에 BPI 단백질을 형성시킨다.
제5도 : BPI를 코딩하는 cDNA의 도식도
제6도 : BPI 단백질의 C-말단을 절단하여 얻은 BPI 단백질 변이유발성 프라이머 25kDa Pro 212 TGA의 누클레오티드 및 아미노산 서열
제7도 : BPI 단백질의 C-말단을 절단하여 얻은 BPI 단백질 변이유발성 프라이머 38kDa Pro 337 TGA의 누클레오티드 및 아미노산 서열
제8도 : BPI 단백질 변이유발성 프라이머의 누클레오티드 및 아미노산 서열:바람직하게는 BPI 단백질의 C-말단의 절단부인 ATG 5' HindⅢ.
제9도 : pSVBPIMDH의 도식도
제10도 : pAc373의 도식도
제11도 : (1)nBPI 단백질(롯트번호 # 148104), (2) rBPI 단백질(롯트번호 # 148159) 및 (3) rBPI 단백질(롯트번호 # 148179)의 SDS-PAGE 분석
제12도 : BPI의 cDNA 서열
제13도 : p337의 단백질 서열
제14도 : p212의 단백질 서열
제15도 : 호중구감소증 쥐 모델을 이용한 BPI의 효능을 보여주는 선그래프
제16도 : 생체내에서의 BPI 효능을 보여주는 막대 그래프
제17도 : BPI 효능을 보여주는 막대그래프
제18도 : BPI 혈청 반감기를 보여주는 선그래프
제19도 : BPI가 내독소에 결합하는 것을 보여주는 선그래프
BPI 결합은 각종 농도의 폴리믹신 B 설페이트로 처리한 내독소-피복 웰상에서 분석하였다.
결과는 완충액 대조(-●-), 10㎍/ml 폴리믹신 B(-○-), 1O0㎍/ml 폴리믹신 B(-▲-) 및 1mg/ml 폴리믹신 B(-△-)의 흡광도(0.D. 405)를 나타낸다.
데이타는 4회 반복 실험치의 평균 ±SK이다.
제20도 : BPI 내독소 결합을 나타내는 선그래프.
BPI는 완충액으로 희석하거나(-●-) 또는 순수한 혈장((-○-)으로 희석하고 내독소 결합에 대하여 분석하였다.
제21도 : BPI 내독소 결합을 나타내는 선그래프
BPI는 NaCl(-●-), MgCl2(-○-) 또는 CaCl2(-▲-)의 농도(이온강도 mμ로 표시)를 증가시키면서 희석한후 설명된대로 내독소 결합을 분석하였다.
제22도 : 내독소 활성의 조절에 있어서 BPI와 LBP의 역할을 나타내는 도식도
제23도 : LBP/BPI 키메라로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체.
제24도 : CHO-BPI로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체
제25도 : BPI(DP 결합)로 명명된 생물학적으로 활성인 변형체.
제26도 : BPI의 생물학적으로 활성인 변형체를 제조하기 위한 제작물
본 발명은 내독소혈증의 예방과 치료에 유용한 BPI 단백질의 제조와 상기 단백질의 존재 및 그 양을 검출하는 키트를 제공한다.

Claims (2)

  1. (a)미결합 내독소 분자와 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액;(b)(1)활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2)내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 상기 분석용 완충액을 포함하는 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c)(1)BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항제와 경쟁하지 않으며 (2)내독소 결합 부위 또는 그 부근에서 BPI 단백질과 특이적으로 결합하는, 검출가능한 부분으로 표지된 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1항체 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 함유되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1항체 및 제2항체에 의해 결합되어 제1항체-BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고, 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질을 검출할 수 있는 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 존재를 검출하기 위한 키트.
  2. (a)미결합 내독소 분자에 결합하는 폴리믹신 B를 함유하는 분석용 완충액;
    (b)(1)활성 BPI 단백질의 일부에 결합하고 (2)내독소 결합 도메인과의 결합에 있어서 BPI 단백질과 경쟁하지 않는 항체로서 상기 분석용 완충액을 함유하는 표면에 부착시킨 제1항체; 및 (c)(1) BPI 단백질과의 결합에 있어서 제1항체와 경쟁하지 않으며 (2)내독소 결합 부위 또는 그 근처에서 BPI 단백질에 특이적으로 결합하는, 검출가능한 부분으로 표지된 제2항체를 함유하여, 생물학적 유체 시료를 분석용 완충액내에서 제1항체 및 제2항체와 접촉시키면 생물학적 유체 시료중에 포함되어 있는 활성 BPI 단백질이 제1항체 및 제2항체와 결합하여 제1항체-BPI 단백질-제2항체 착체를 형성하고, 이러한 착체를 검출하면 생물학적 유체 시료중의 활성 BPI 단백질의 양을 측정할 수 있는 생물학적 유체 시료중의 BPI 단백질의 양을 측정하기 위한 키트.
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