JPH06504267A - 組換えｂｐｉタンパク、ｂｐｉタンパクの使用および該タンパクの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、１９９０年８月１３日に出願された米国特許出願第５６７、０１６ 号、および１９９１年４月５日に出願された米国特許出願第６８１．５５１号の 一部継続出願である。この１９９１年４月５日に出願された米国特許出願第６８ １，５５１号は、１９９０年８月１３日に出願された米国特許出願第５６７、０ １６号の一部継続出願であり、この親出願は１９９０年１月２２日に出願された 米国特許出願第４６８．６９５号の一部係属出願であり、またこの親出願は１９ ８９年２月１４０に出願された米国特許出願第３１０．８４２号の一部継続出願 である。これら全ての先の出願の内容は、参照としてこの明細書中に組み込まれ る。

〔発明の背景〕

グラム陰性閑による感染は、特に免疫的無防備状態の入院患者において、病的状 態および死亡の主な原因である［ｐｕｍａ、Ｒ，Ｊ、、　＾ｍ、　ｌ、　ｏｆ　 Ｍｅｄ、　、　７８　（Ｓｕｐｐｌ、　６＾）：１５４−１６４　；　Ｋ＋ｅｇ ｅｒ　Ｂ、　Ｅ、。

Ｄ、　Ｅ、　Ｃｒａｖｅｎ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｒ，ＭｃＣａｂｅ、＾ｍ、　Ｊ、　 Ｍｅｄ、　、　６８＋３４４−３５５　（１９８０）　］　B 人千１−４Ｊ能な抗生物質は、一般に、該感染の抑制に効果的であるが、これら はリポ多糖類（Ｌ　Ｐ　Ｓ）に付随する病理学的影響を同等中和するものではな い。

ＬＰＳはグラム陰性菌の外層膜の主成分であり、該微生物か溶菌されたときに放 出される［５ｈｅｎｅｐ、Ｊ、Ｌ、ａｎｄ　Ｋ、Ａ、Ｍｏｒｇａｎ、Ｊ、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５０Ｄ）　：３８０−３８８（１９８４）］。

抗生物質療法を行っている間に放出されるＬＰＳは、炎症反応の強力な刺激因子 である。イン・ビボにおけるＬＰＳの多くの有害な効果は、炎症細胞から放出さ れる可溶性媒介物質によってもたらされる［Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　Ｄ、Ｃ，ａｎｄ 　Ｒ，１，Ｕｌｅｖｉｃｈ。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｊｈｏｌ、、　９３（２）　：５２７−６１７（１９７８） 　］　。Ｌ　Ｐ　Ｓはホスト炎症細胞による媒介物質の放出を誘導し、最終的に は汎発性血管向凝固（Ｄ　Ｉ　Ｃ）　、成人呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、心 臓機能障害、器官不全、肝不全（肝機能障害）、脳不全（ＣＮＳ機能障害）、腎 不全、多器官不全およびショックをもたらす。

可溶性ＬＰＳは、好中球走化性の減少、接着性の増大、ヘキソース−リン酸経路 の活性増大および０２ラジカル生成の増大を惹き起こし、補体のための表面受容 体を活性化するように調節し、また周囲の媒質中へ顆粒タンパクをの放出する［ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｕｌｅｖｉｃ　（１９７８）］。

内内毒素症は、内毒素、即ち熱安定性のバクテリア毒素が血中に存在することに 伴う症状である。内毒素は炎症反応を誘発する。この炎症反応は感染と戦うには 有利であるが、もし制御されないと、ホストに対してダメージを与え得る。内毒 素血症は、肝臓からの内毒素結合性タンパクの産生を誘導し、白血球から殺菌性 タンパクを放出させる。我々の研究は、これら白血球タンパクの−っであるＢＰ Ｉが（従来はイン・ビトロでの殺菌活性のみが知られている）、イン争ビトロに おいて、好中球および単球を刺激する内毒素の能力を阻害１５、これをイン・ビ ボで投与すれば内毒素またはバクテリアによる死亡か減少することを示１７てい る。更に、ＢＰＩは抗菌作用を１するか、ホスト細胞に対する細胞障害性はもた ないことか示されている。

単球および好中球性顆粒球は、バクテリア感染に対するホストの防御に重要な役 割を果たし、また内毒素血症の病理学にも関与する。これらの細胞は、微生物を 細胞内に取り込んで殺滅し、また殺菌性、タンパク分解性、オプソニン性、発熱 原性、補体活性化および組織損傷効果を有する可溶性タン・くりを放出すること によって、イン・ビボ及びイン・ビトロで内毒素に反応する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、内毒素で刺激された単球によって放出されるサイ１ 〜カインは、イン・ビボにおける内毒素の幾つかの毒作用に似た作用を有する。

動物にＴＮＦを注射すると、発熱、ショック及びクルコース代謝変化を生じる。

また、ＴＮＦは好中球の有力な刺激剤である。Ｉ　Ｌ−１，Ｉ　Ｌ−６及びＩＬ −８のような他のサイ１カイン類もまた、ＬＰＳの幾一つかの病態生理学的作用 を媒介する。

抗生物質療法の改良にもかかわらず、内毒素血症に伴う病的状態および死亡の発 生率は未だに高い。抗生物質のみでは、ＬＰＳの毒作用を中和する上で有効では ない。従って、直接的な内毒素中＋Ｄ活性をちった治療法に対する必要性が生じ ている。内毒素血症の治療のための現在の方法では、抗生物質および支援医療か 用いられる。最も多く採用される補助療法は、低血圧および発熱のような内毒素 ショックの症状を治療するが、内毒素を不活性化するものではない。他の療法で は、ＬＰＳに対するホストの炎症性応答を阻害する。現在の治療には、以下に示 すように毒性、免疫原性、或いは動物試験とヒト試験との間での効能の非再現性 に起因した主な制限がある。

ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）は塩基性のポリペプチド抗生物質であり、内毒素で あるリビドＡの最も毒性が強く且つ生物学的に活性な成分と結合し、これを構造 的に崩壊させる。ＰＭＢは、イン・ビトロにおいて好中球性顆粒放出の内毒素活 性化を阻害し、ヒトのグラム陰性菌感染に対する強力な治療剤であることが示さ れている。しかしながら、その全身性の毒性のために、この薬剤は局所治療剤と しての用途に限定されている。

抗生物質および高投与普のコハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム（ＭＰＳＳ ）を用いた組み合わせ療法は、イヌを用いたグラム陰性菌敗血症の実験的モデル において、死亡を防止することが示されている。全身性敗血症の臨床症状を呈す る２２３人の患者について行われた多施設でのプラセボ対照による二重冒険臨床 試験において、抗生物質と共にＭＰＳＳを用いた他の研究によれば、治療群とプ ラセボ群との間では死亡率か有意に異ならないとの結論か出されている。更に、 この研究者は、１４日以内の二次感染の緩解かプラセボ群において何色に高いこ とを見出している。

内毒素血症の治療のため比較的新しいアプローチは、内毒素を中和する抗体を使 用しての受動免疫である。Ｅ、Ｃｏ１１１５に対する高度免疫ヒト免疫グロブリ ン（ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ　ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）によ って、グラム陰性菌血症患者の死亡率およびショックが５０％低下されることが 示されている。マウス、キメラヒトモノクローナル抗体を用いた動物モデルにお いて、他のグループは有望な結果を示している。モノクロ−六ル抗体は高度免疫 血清を凌ぐ利点（例えば、堅実な薬方およびヒト病原の低い伝染性）を有してい るが、未だ、ＬＰＳを中和するための免疫グロブリンの投与に関連した多くの問 題が存在する。

免疫グロブリン自体に対するホストの反応は過敏性をもたらし得る。敗血症患者 に対して杭内毒素抗体を含む治療法を用いるときのもう一つの懸念は、補体活性 化および免疫複合体の沈着に続く組＊ｔｉｉ傷である。

ＢＰＩは、１９７５年に勇めて発見された好中球性顆粒タンパクである［Ｗｅｉ ｓｓ、Ｊ、、　Ｒ，Ｃ，Ｆｒａｎｓｏｎ、Ｓ、Ｂｅｅｈｅ＋ｄｉｆｅ、　Ｋ、Ｓ ｃｈｍｅｉｄｌｅｒ、ａｎｄ　Ｐ、ＥＩｓｂａｃｈ：　１．Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅ ｓ１．．５５：３３（１９７５）］　ｏ　ＢＰＩは、１９７８年にヒト好中球か ら高度に精製された形態で得られ、またこの物質は膜透過性を増大し、イン・ビ トロでのリン酸緩衝生理食塩水中で試験したときにグラム陰性菌に対［２て殺菌 活性を有することが示された［Ｗｅｉｓｓ、Ｊ、、ｅＩａｌ、。

１、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５３（８）　＋２６６４−２６７２（１９７８ １］　。Ｗｅ口ｓ　ｅｌ　ａｔ。

（，１，Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４（２１１：１１００１０−１１０１４（ １９７９）には、更に、ＢＰＩかホスホリパーゼＡ２活性を増大することか示さ れ、ＢＰＩはそのイン・ビトロでの殺菌活性に加えて、前炎症活性（ｐ＋ｏｉｎ ｌｌａｍｍａｊｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有することを示唆した。

１９７９年にウサギＢＰＩが精製され［Ｅｉｓｂｉｃｈ　ｅｌ　ｉｆ、、　Ｊ、 Ｂｉ。

１、　Ｃｂｚｍ、　、　２５４　（２１）　：　１１０００−１１００９　］　 、ヒト由来のＢＰＩと同じ殺菌性および透過増大性を有することが示さた。これ により、研究のための更なる物質源が提供されることになった。ウサギおよびヒ ト由来のＢＰＩは、両者共に、イン・ビトロにおいて、Ｋｌ−被覆Ｅ、Ｃｏ１１ を含む種々のグラム陰性菌に対して有効であることが示された［Ｗｅｉｓｓ　ｅ ｌ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ　３８（３）　：１ １４９−１１５３．　（１９８２）　］。

イン・ビトロでのＢＰＩの殺菌作用におけるリポ多糖の役割が、１９８４年にＷ ｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、によって提案された［Ｊ、　１ｍｍｕｎ。

１、　、　＋３２　（６）　＋３１０９−３１１５．　（１９８４）　］。これ らの研究者は、ＢＰＩがグラム陰性菌の外層膜に結合してＬＰＳの細胞該への放 出を起こさせ、またＬＰＳの生合成を選択的に刺激することを示した。１９８４ 年に、同様の性質を有するタンパクがヒト好中球から単離され、陽イオン性抗菌 タンパク５７（ＣＡＰ５７）と命名された［５ｈａｆｅｒ、Ｗ、Ｍ、、Ｃ，Ｅ、 Ｍａｒｆｉｎ　ａｎｄ　Ｊ、に、Ｓｐｉｌｘｎａｇｅ！、１ｎｌｅｃｆ、　１ｍ ｍｕｎ、、４５：２９（１９８４）　］　、　］Ｎ−末端アミノ酸配列アミノ酸 組成、分子量および起源から判断して、このタンパクはＢＰＩと同一である［Ｓ ｐｉｌｘｎａｇｅｌ　ｅｆ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　７６：８２５−８３４．１９ ９０　］　、別のグループ（Ｈｏｖｄｅ　ａｎｄ　ＧｒａＹ）は、１９８６年に 、ＢＰＩと実質的に同じ性質を有する殺菌性の糖タンパクを報告した［Ｂｏｖｄ ｅ　ａｎｄ　Ｇ＋Ｂ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｍｍｕｎロア　５４（１ ）・１４２−１４８（１９８６）　］。

１９８５年にＯｏｉ　ｔｌ　ａｔ、は、ＢＰＩが、好中球プロテアーゼで開裂さ れた後にも殺菌活性を保持することを報告し、該分子のフラグメントが活性を保 持することを示唆した［Ｏｏｉ　ａｎｄＥｌｓｂａｃｈ、　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３３（２）＋５６７Ａｆ１９８５）　］　。イン・ビトロに おけるＢＰＩの殺菌活性および透過性増大活性は全て、該タンパクの２５　ｋＤ のＮ末端フラグメント中に存在する［Ｏｏｉ、　Ｃ，Ｅ、　、　ｅｔ　ａ　ｌ、 　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６２：１４８９１　（１９８７） 　］。

ＢＰＩか、バクテリアの外層膜上の内毒素に関連した構造に結合することの証拠 は次の通りである＝（１）ラフ株（ｒｏｕｇｈｓｔｒａｉｎ）のＥ、Ｃｏ１１は 、スムース株（ｓｍｏｏｔｈ　５ｔｒａｉｎ）に比較して、ＢＰＩの透過性増大 活性に対する感受性が高い［Ｗｅ　ｉ　ｓ　ｓ。

Ｊ、ｅｌ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｅｔｉｍｍｕｎ、５１：５９５（１９８６）］　； 　（＋２内毒素構造の変化をもたらすＰｒｍＡ変異株は、ポリミキシンＢ及びＢ ＰＩの両者の結合性低下をもたらす；（３）ポリミキシンＢ　（ＰＭＢ）は、Ｓ 、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対する結合に関してＢＰＩと競合する［Ｆａｒｌ ｅｙ　１９８８　］　；また（＋４ＢＰＩは、リポ多糖結合性タンパク（Ｌ　Ｂ 　Ｐ）と称される他の内毒素に対する相同性のアミノ酸配列と、交差反応性とを 何している［Ｔｏｂｉａｓ　ｅｌａ　１．　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６３　（２７）　：　１３４７９−１３４８１　（１９８８）　］。

ＬＢＰ−ＬＰＳ複合体は単球上の細胞表面受容体（ＣＤ　＋４）に結合し、炎症 性サイトカイニン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の合成および放出を増大する［Ｓｃｈ ｕｍａｎｎ　ｅｌ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：＋４２９−＋４３］　］ 。こうして、ＬＢＰはＬＰＳの免疫刺激活性を促進する。ＢＰＩは、ＬＢＰの作 用とは正反対の作用を有する。ＢＰＩはＬＰＳに結合し、好中球および単球の活 性化を阻害する［Ｍａｒｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４７ ：　６６２−６６６（１９９０）　；１９９０年８７−１２３日に発行されたＭ ａｕａ　ａｎｄ　５ｃｏｆｆのＷＯ９０１０９１８３；Ｃ，１，Ｆｉｓｈｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１ｒｃｕｌａｌｏ＋ｙ　５ｈｏｃｋ　３４：１２０（１９９１ ）　コ　。

ＢＰＩをコードするｃＤＮＡがＧｒａｙ　ｅｆ　ａｌ、によって得られ、配列が 決定された［Ｇｒ＋＋ｙ　ｅｆ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ、Ｒｃｓｊ６：６２０＾（１ ９８８）　；　Ｇｒａｙ　ｅｌ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、 　２６４　（１６）　：９５０５−９５０６　（１９８９）　］B 彼等は、ＢＰＩは、開裂して２５　ｋＤａの可溶性フラグメントとして放出され 得る膜タンパクであると報告している。

当初、グラム陰性菌に対するＢＰＩの結合はＬＰＳ構造を崩壊し、小さい疎水性 分子に対する微生物透過性を変化させ、細胞死を起こすと報告された［Ｗｅｉｓ ｓ、ｅｌ　ａｌ、、１９７８］。最近になって、これと同じ著者が、このような 効果は血清アルブミンの不存在下でのみ生じることを示している。ＢＰＩは、血 清アルブミンの存在下で培養されたバクテリアに添加されたときは殺菌活性をも たず、これによって、ＢＰＩはアルブミンが遍在するイン・ビボではバクテリア を殺滅しないことが示唆される［Ｍａ＋＋ｎ１ｏｎ　ｅｆ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８５：８５３−８６０（１９９０１；Ｍ＠ｎｎ１ｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、、１．ｃｌｉｎ、１ｎｖｅｓｔ、　８６：６３１−６４１１　ｏ 従って、当該技術分野においては従来、ＢＰＩの有益な効果はイン・ビトロでの 殺菌効果に限定されるものと理解されていた。

我々はここに、ＢＰＩか血清および血症の存在下で内毒素に結合すること、また ＢＰＩはＬＢＳのような他の公知の内毒素結合性タンパクとは異なり、イン・ビ トロ及びイン・ビボの両者において、内毒素の免疫刺激活性および前活性を阻害 することを示す。従ってＢＰＩは、エンドトキシン血症および内毒素ショックを 含む内毒素関連疾患の治療および予防処置において、新規かつ独特の用途を有す る。

更に、Ｇｒａ７　ｅｌ　ａｌ、　は、ＢＰＩが、好中球性顆粒膜から可溶性の形 で放出されるためには２５　ｋＤａのフラグメントに開裂されなければならない 膜タンパクであると説明している［１゜Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４　（１ ６）　：９５０５−９５０９　（１９８９）　］　。本発明は、活性な形で完全 な長さの可溶性ＢＰＩを製造する方法を提供する。

更に本発明は、Ｇｒａｙ　ｅｌ　ａｌ、によっては明確には区別されなかった二 つの分子を初めて分離し、これによりグリコジル化された形の分子およびグリコ ジル化されない形の分子を示す。

これらは、イン・ビボにおいて異なった血清半減期を有し、従って異なった治療 的能力を有するように見える。好中球から得られるＢＰＩは、グリコジル化形お よび非グリコジル化形の混合物である。

〔発明の概要〕

本発明は、ＢＰＩタンパクおよび陰イオン性化合物を含有し、（１）殺菌活性を 示さず且つ　（２）内毒素中和活性を示す組成物を提供する。

この発明はまた、（１）内毒素に特異的に結合し、（２）内毒素への結合に関し てＢＰＩタンパクと競合し、（３）内毒素に誘発された死亡を阻害する、生物学 的に活性なりＰＩの変種を提供する。

本発明は史に、組換えＢＰＩタンパクを細胞内で産生じ、細胞から分泌させる方 法を提供する。この方法は、（ａ）ＢＰＩタンパクをコードするＤＮＡを有する ベクターを構築することと、（ｂ）該ベクターで細胞を形質転換することと、（ Ｃ）こうして形質転換された細胞を、組換えＢＰＩタンパクか分泌されるような 条件下に培地中で培養することとを具備する。

また本発明は、バクテリア細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法を提供 する。この方法は、（ａ）　シグナル配列をもたず、ＢＰＩタンパクをコードす るＤＮＡを有するベクターを構築することと、（ｂ）該ベクターでバクテリア細 胞を形質転換することと、（ｃ）こうして形質転換されたバクテリア細胞を、組 換えＢＰＩタンパクが産生されるような条件下に培地中で培養することとを具備 する。

本発明は更に、昆虫細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法を提供する。

この方法は、（ｉ）ＢＰＩタンパクをコードするＤＮＡを有するベクターを構築 することと、（ｂ）該ベクターで昆虫細胞を形質転換することと、（ｃ）　こう して形質転換された昆虫細胞を、組換えＢＰＩタンパクが産生されるような条件 下に培地中で培養することとを具備する。

また、本発明は、対象から得たサンプル中の内毒素のｉを／ｌ！１定する方法で あって、内毒素−ＢＰＩタンパク複合体か形成されるような条件下に、該サンプ ルをＢＰＩタンパクと接触させることと、こうして形成された複合体の墓を測定 することにより、サンプル中の内毒素の墓を決定することとを具備した方法を提 供する。

或いは、本発明は対象から得た、既結合内毒素及び未結合内毒素を含有するサン プル中の内毒素の墓をＭ１定する方法を提供する。この方法は、（ａ）前記内毒 素か結合しているかもしれない内毒素結合性タンパクを変性し、で、未結合内毒 素を１するように、ｉ″Ｉ’Ｊ　記サンプルを処理することと、（ｂ）　この処 理されたサンプルを、ＢＰＩタンパクか前記ステップｉ）の未結合内毒素に結合 して、内毒素−ＢＰＩタンパク複合体が形成されるような条件下に、ＢＰＩタン パクと接触させることと、（ｃ）　こうして形成された複合体の量を７１ＪＩｊ 定することにより、サンプル中の内毒素の墓を決定することとを具備した方法を 提供する。

本発明はまた、サンプル中の内毒素を検出する方法であって、前記内毒素がＢＰ Ｉタンパクと結合して両者間の複合体を形成するように、該サンプルをＢＰＩタ ンパクと接触させることと、この複合体を検出することとを具備する。

本発明は更に、ＢＰＩタンパクが内毒素と複合体を形成するように、外科用具を ＢＰＩタンパクでコーティングする方法であって、前記外科用具の生物学的サン プルと接触するように設５１された表面に、ＢＰＩタンパクを付着させることを 具備した方法を提供する。

また、この発明は、ＢＰＩタンパクが内毒素との複合体を形成するように、埋込 み可能な侵襲的デバイスをＢＰＩタンパクでコーチ、インクする方法であって、 前記デバイスの生物学的サンプルと接触するように設計された表面に、ＢＰＩタ ンパクを付着させることを具備した方法を提供する。

本発明は更に、内毒素を自白゛する流体から、これを対象に投４ｊする前に汚染 物を除去する方法であって、投与に先立って、内毒素かＢＰＩタンパクと複合体 を形成するような条件下で前記流体をＢＰＩタンパクと接触させ、これにより前 記流体から汚染物を除去することを具備した方法を提供する。

前記流体は、血液、血漿、血清、等張溶液、薬学的製剤、細胞培養剤または骨髄 であり得る。

この発明はまた、生物学的流体サンプル中のＢＰＩタンパクの存在を検出するた めのキットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合するポリミキシンＢを含 有した検査用緩衝液と、（ｂ）　（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し、且 つ（２）内毒素結合ドメインについてＢＰＩタンパクと競合しない、表面に付着 された第一抗体と、（ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの結合について前記第一の抗 体と競合せず、且つ（２）内毒素結合部位またはその近傍でＢＰＩタンパクと特 異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第二抗体とを具備し、前記生物 学的流体サンプルが検査用緩衝液中で前記第一抗体および第二抗体と接触したと きに、前記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタンパクが前記第一抗 体および第二抗体によって捕捉され、第一抗体／ＢＰＩタンパク／第二抗体の複 合体が形成され、この複合体を検出することによって前記生物学的流体サンプル 中のＢＰＩタンパクを検出するキットを提供する。

また、本発明は生物学的流体サンプル中のＢＰＰ　Ｉタンパクの量を／Ｉｌｌ定 するためのキットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合するポリミキシン Ｂを含有した検査用緩衝液と、（ｂ）（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し 且つ（２）内毒素結合ドメインに対してＢＰＩタンパクと競合しない、表面に付 着された第一抗体と、（ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの結合について前記第一の 抗体と競合せず、且つ（２）内毒素結合部位またはその近傍でＤＰＩタンパクと 特異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第二抗体とを具備し、前記生 物学的流体サンプルが検査用緩衝液中で前記第一抗体および第二抗体と接触した ときに、前記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタンパクが前記第一 抗体および第二抗体によって捕捉され、第一抗体／活性ＢＰＩタンパク／第二抗 体の複合体が形成され、この複合体を検出して、前記生物学的流体サンプル中の 活性ＢＰＩタンパクの墓を測定するキットを提供する。

加えて、本発明は対象における内毒素血症を防止する方法であって、対象に対し て、内毒素に結合して対象における内毒素血症を防止するために１効な墓のＢＰ Ｉタンパクを投与することを具備した方法を提供する。

本発明は、内毒素血症にかかった対象を治療する方法であっｒ、ｌ＝ｊ家にχ・ Ｉして、内毒素に結合し７て内毒素血症にかかったに、ｌ象を治療するためにＵ 効な墓のＢＰＩタンパクを投与することを具備した方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図にＴ７ブロモータ／ＢＰＩタンパクプラスミド構造で形質変換されたＪＭ］０ ９　（ＤＥ３）の、形質変換プレートを示す写真。これらの写真はＩ／＋２５の 第二露出におけるｆ８て撮られた。

Ａ、　ｐＴ７ＢＰＩ−Ｆ（＋１　は、発現のためのＴ７ブロモータの後に正しい 向きで配置された完全な長さのＢＰＩタンパクの配列（シグナル配列を含む）を 含んでいる。

Ｂ、ｐＴ７ＢＰｌ−Ｆ（−）は、発現のためのＴ７プロモータの後に正しくない 向きで配置された完全な長さのＢＰＩタンパクの配列（シグナル配列を含む）を 含んでいる（得られるタンパクは、Ｔ７遺伝子ｌＯの２６０アミノ酸リーダーペ プチドとの融合タンパクである）。

Ｃ，ｐＴ７ＢＰｌ−３は、発現のためのＴ７ブロモータの後に正しい向きで配置 された完全な長さのＢＰＩタンパクの配列（シグナル配列を含む）を含んでいる 。

Ｄ、　ｐＴ７２１２−Ｆは、発現のためのＴ７ブロモータの後に正しい向きで配 置された、プロリン−２１２を切除したＢＰＩタンパクの配列（シグナル配列を 含む）を含んでいる。

Ｅ、　ｐＴ７２１２−３は、発現のためのＴ７プロモータの後に正しい向きで配 置された、プロリン−２１２を切除したＢＰＩタンパクの配列（シグナル配列を 含まない）を含んでいる。

図２　：　ｐＴ７８ＰＩタンパクのプラスミドの構築を示す図。

図３　：　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験におけるＢＰＩタンパク活性を示す標準曲線。

図４：ＢＰＩタンパクのサンドイッチＥＬＩＳＡ（士内毒素士ポリミキシンＢ） 。プロトコールは次の通り；稀釈剤としてＰＢＳ＋１％ＢＳＡを用い、１μｇ／ ｍｌの硫酸ポリミキシンＢの存在下または非存在下、並びに１μｇ／ｍＩのＥ、 Ｃｏ１１０１１１８４内毒素の存在下または非存在下で、ＢＰＩタンノくりの試 験を行った。

図５　：　ＢＰ　ＩをコードするｃＤＮＡの模式図。

図６　：　ＢＰ　Ｉタンパクの突然変異プライマーである２５　ｋＤａＰｒｏ　 ２１２　ＴＧＡの核酸配列およびアミノ酸配列（これはＢＰＩタンパクのＣ末端 切片である）。

図７：ＢＰＩタンパクの突然変異プライマーである３８　ｋＤａＰ＋ｏ　３３７ 　ＴＧＡの核酸配列およびアミノ酸配列（これはＢＰＩタンパクのＣ末端切片で ある）。

図８・ＢＰＩタンパクの突然変異プライマー：好ましくは＾ＴＧ　５’　Ｂｉｎ ｄｌｌｌの核酸配列およびアミノ酸配列（これはＢＰＩタンパクのＣ末端切片で ある）。

図９・ＰＳＶＢＰＩＭＤ日の模式図。

図１０　＋　ｐＡｃ３７３の模式図。

図１１＋（１）ｎＢＰＩタンパク（口・ノド番号Ｎｏ、　［４８１０７）、（２ ）ｒＢＰＩタンパク（口・ノド番号Ｎｏ、　［４８１５９）および　（３）ｒＢ ＰＩタンパク（ロット番号Ｎｏ、　１１４８］７９）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

図１２・ＢＰＩのｃＤＮＡ配列。

図１−３　：　ｐ　’３３７：’ｉ、ｊ応するタンパクのアミノ酸配列。

図１４　：　ｐ３３７に対応するタンパクのアミノ酸配列。

図１５：好中球減少ラットモデルを用いたＢＰＩの有効性を示す線図。

図１６：イン・ビボでのＢＰＩのａ動性を示す棒グラフ。

図１７：ＢＰＩの１効性を示す棒グラフ。

図１８：ＢＰｌの血清半減期を示す線グラフ。

図１９・内毒素へのＢＰＩの結合を示す線グラフ。ＢＰＩの結合は、エンドトキ シンをコーティングし、種々の濃度の硫酸ポリミキシンＢで処理されたウェルで 試験された。これらの結果は、対照緩衝液（黒丸）、１０μｇ／ｍ１のポリミキ シンＢ（白丸）　、１００　ｔｌ　ｇ／ｍｌのポリミキシンＢ　（黒三角）、１ ｍｇ／ｍｌのポリミキシンＢ（白三角）についての吸光度（０゜Ｄ、４０５）を 示している。データは、４倍値の平均±ＳＫとして表わされている。

図２０　：　ＢＰ　Ｉ内毒素結合を示す線グラフ。ＢＰＩは緩衝液（黒丸）また はニート血漿（ｎｅａｔ　ｐｌａｓｍａ）　（白丸）で稀釈され、エンドトキシ ン結合を試験された。

図２１：ＢＰＩ内毒素結合を示す線グラフ。ＢＰＩはＮａＣＩ（黒丸）、ＭｇＣ １（白丸）又はＣａＣｌ２　（黒三角）の増大する濃度（イオン強度ｍｕとして 表わしたもの）で稀釈され、記述したようにしてエンドトキシン結合を試験され た。

図２２：内毒素活性の調節におけるＢＰＩおよびＬＢＰの役割を模式的に示すダ イアグラム。

図２３：ＬＢＰ／ＢＰＩキメラと命名された生物学的に活性な変種。

図２４　：　ＣＨＯ−ＢＰ　Ｉと命名された生物学的に活性な変種。

図２５＋ＢＰＩ　（ＤＰリンケージ）と命名された生物学的に活性な変種。

図２６　：　ＢＰ　Ｉの生物学的に活性な変種を製造するためのコンストラクト 。

〔発明の詳細な説明〕

この出願で用いられるとき、以下の語句はここに特定した意味を有する。

ここで用いるｒＢＰＩＪは、天然の又は天然に存在する生物学的に活性な、感受 性のグラム陰性菌の外層膜に結合するヒト５７ｋＤタンパクを意味する。

ここで用いられる「生物学的に活性な、ＢＰＩのポリペプチドフラグメント」は 、ＢＰＩの生物学的活性を有し且つＢＩＰ内のアミノ酸配列をもった、分子量が ５７　ｋＤ未満のポリペプチドを意味する。

ここで用いる「生物学的に活性な、ＢＰＩのポリペプチド類縁体」とは、ＢＰＩ と実質的に同じアミノ酸配列および生物学的活性を有するポリペプチドを意味す る。この生物学的に活性なりＰＩのポリペプチド類縁体には、ＢＰＩ配列内で変 化したアミノ酸（例えば突然変異）、またはＢＰＩのアミノ末端もしくはカルボ キシ末端での一以上のアミノ酸の追加、或いはその両者によって、アミノ酸配列 がＢＰＩの配列から変化したペプチドか含まれる。

ここで用いられる「生物学的に活性な、ＢＰＩの変種」とは、（１）ＢＰＩに存 在するアミノ酸配列の一部およびＢＰＩに存在しないアミノ酸配列を含むポリペ プチドと、（２）ＢＰｌと同様の生物学的活性、即ち、内毒素中和活性を有する ポリペプチドとを意味する。

ここで用いられる「組換え体」は、遺伝子工学的方法によって製造されたポリペ プチドを意味する。従って、ＢＰＩ。

生物学的に活性なりＰＩのポリペプチドフラグメント、生物学的に活性なりＰＩ のポリペプチド類縁体、および生物学的に活性なりＰＩの変種の夫々が、組換え 体であり得る。しかしながら、この出願の内容において、ＢＰＩは組換えＢＰＩ と同じではなく、後者は幾つかの分子的特徴（例えばグリコジル化パターン）に おいて、天然のまたは天然に存在するポリペプチドとは異なっている。

ここで用いるｒＢＰＩタンパク」は、（１）　ＢＰ　Ｉ、　（２）生物学的に活 性なりＰＩのフラグメント、（３）生物学的に活性なりＰＩのポリペプチド類縁 体、または（４）生物学的に活性なりＰＩの変種を意味し、これらは夫々組換え 体もしくは非組換え体の何れであってもよい。

本発明は、ＢＰＩタンパクおよび陰イオン性化合物を含有し、（１）殺菌活性を 示さず且つ　（２）内毒素中和活性を示す組成物を提供する。

この発明の実施に従えば、この陰イオン性化合物はタンパク、プロテオグリカン （例えばヘパリン）または合成ポリマー（例えばデキストラン硫酸もしくはポリ グルタミン酸）であり得る。好ましくは、この陰イオン性化合物は血清アルブミ ンのようなタンパクである。

本発明はまた、（１）内毒素に対して特異的に結合し、（２）内毒素への結合に 関してＢＰＩタンパクと競合し、（３）内毒素に誘発された死亡を阻害する、生 物学的に活性なりＰＩの変種を提供する。

この出願で用いられる「内毒素」の語は、発熱原性のノくクチリア毒素を意味す る。

生物学的に活性なりＰＩフラグメントの一例が、図１３に示されている。生物学 的に活性なりＰＩフラグメントの他の例が、図１４に示されている。

加えて、生物学的に活性なりＰＩ変種の例は図２３に示されている。生物学的に 活性なりＰＩ変種の他の例は、図２４に示されている。更に、生物学的に活性な りＰＩ変種の別の例か図２５に示されている。

本発明は史に、組換えＢＰＩタンパクを細胞内で産生し、細胞から分泌させる方 法を提供する。この方法は、（ａ）ＢＰ■タンパクをコードするＤＮＡを有する ベクターを構築することと、（ｂ）該ベクターで細胞を形質転換することと、（ Ｃ）こうして形質転換された細胞を、組換えＢＰＩタンパクが分泌されるような 条件下に培地中で培養することとを具備する。

この発明に従えは、該ベクターは、更にシグナル配列を具備する。

二〇ツノ′法にｉ逆えば、吐乳動物細胞が好ましい。吐乳動物細胞の例には、Ｈ ｅＬａ細胞、ＣＩ（０細胞、ＤＵＸ　Ｂｌｌ細胞、５ｐ２１０細胞、Ｗ＋　３８ 細胞、ＤＩＩＫ細胞、１ｌＥＰＧ２細胞およびＣＯ５−１細胞が含まれるが、こ れらに限定されるものではない。

本発明はまた、上記の方法で製造されたＢＰＩタンパクを提供する。一実施例に おいて、このＢＰＩタンパクは図１１に示される　１４８１５９　＋ＢＰｌと命 名された組換えＢＰＩタンツクつてある。加えて、本発明は、図１１に示される １４８１７９　＋ＢＰＩタンペクと命名された組換えＢＰＩタンパクを提供する 。

興味深いことに、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物 細胞中で産生された組換えＢＰＩタンパクは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での若干変化した移動パターンを 示す。これは、哺乳類細胞においては、該分子もまた好中球またはＨＬ６０細胞 におけるのとは異なったプロセッシングを受け得ることを示している。このよう なプロセッシングか生じるのは、該分子が顆粒膜中に内包されずに分泌されるこ とによるものか、或いはその結果である。

本発明はまた、グリコジル化されたＢＰＩタンパクを提供する。

上記の方法に従えば、分泌されるＢＰＩタンパクは、完全な長さの可溶性ＰＢＩ タンパクであり得る。

また本発明は、バクテリア細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法を提供 する。この方法は、（ａｌ　シグナル配列をもたず、ＢＰＩタンパクをコードす るＤＮＡを有するベクターを構築することと、（ｂ）該ベクターでバクテリア細 胞を形質転換することと、（ｃ）　こうして形質転換されたバクテリア細胞を、 組換えＢＰＩタンパクが産生されるような条件下において培地中で培養すること とを具備する。バクテリア細胞の例にはＥ、ｃｏｌｉか含まれるが、これに限定 されるものではない。

ＢＰＩタンパクは、バクテリアに対して毒性であることか示されている。しかし 、こうして産生されるＢＰＩタンパクのバクテリアに対する毒効果は、ＢＰＩタ ンパクｃＤＮＡを具備したベクター中の正常なリーダー配列を除去することによ って克服され得る。

完全な長さのクローン中に与えられるように、またＧｒａｙｅｆ　ａｌ、によっ て報告されたように（１９８９）　Ｉｏｕ＋ｎ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ６，２６４：９５０５）　、シグナル配列が発現プラスミド中に含まれ るときは明らかにバクテリアのコロニーは全く得られないが、シグナル配列か除 去されると多くのコロニーが得られる。

川に、上記に記載した方法は、非グリコジル化形態で且つ完全な長さのＢＰＩタ ンパクの発現を提供する。この発明は更に、グリコリル化されたＢＰＩタンパク を含まない、非グリコジル化形態のＢＩ）！タンパクを提供する。

本発明は史に、昆虫細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法を提供する。

この方法は、（ａ）　シグナル配列をもたず、ＢＰＩ／ｙンバクをコードするＤ ＮＡを何するベクターを構築することと、（ｂ）該ベクターで昆虫細胞を形質転 換することと、（ｃ）　こうして形質転換された昆虫細胞を、組換えＢＰＩタン パクが分泌されるような条件下において培地中で培養することとを具備する。

上記方法の一例において、昆虫細胞は、ＢＰＩタンパクをコードする配列を含ん だバキュロウィルスベクターのためのホストとして機能する。また、昆虫細胞か ら誘導されたＢＰ■タンパクは、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、哺乳動物細胞から 誘導されたＢＰＩタンパクまたは好中球に天然に存在するＢＰＩタンパクとは異 なった移動パターンを示す。従って本発明は、バキュロウィルスに感染した昆虫 細胞によってプロセッシングされた、ＢＰＩタンパクの新規な分子種を提供する 。

更に、本発明は上記方法によって製造される、生物学的に活性なりＰＩの変種を 提供する。

また、本発明は、対象から得たサンプル中の内毒素の墓を１１定する方法であっ て、内毒素−ＢＰＩタンパク１夏合鉢合体成されるような条件下に、該サンプル をＢＰＩタンパクと接触させることと、こうして形成された複合体の墓を測定す ることにより、サンプル中の内毒素の墓を決定することとを具備した方法を提供 する。

加えて、本発明は対象から得た、既結合内毒素及び未結合型内毒素をａｌ了する サンプル中の内毒素の墓を測定する方法を提供する。この方法は、（ａ）前記内 毒素が結合しているがもしれない内毒素結合性タンパクを変性して、未結合内毒 素を１するように、前記サンプルを処理することと、（ｂ）この処理されたサン プルを、ＢＰＩタンパクが前記ステップ（ａｌの未結合内毒素に結合して、内毒 素−ＢＰＩタンパク複合体が形成されるような条件下に、ＢＰＩタンパクと接触 させることと、（ｃ）　こうし、て形成された複合体の墓をＭｊ定することによ り、サンプル中の内毒素の量を決定することとを具備した方法を提供する。

本発明に従えば、ステップ（ａ）の変性は、温度を上昇することにより行ない得 る。例えば、この温度は９５℃であり１する。

或いは、該変性は酸を用いて行なってもよい。

本発明はまた、サンプル中の内毒素を検出する方法であって、前記内毒素がＢＰ Ｉタンパクと結合して両者間の複合体を形成するように、該サンプルをＢＰＩタ ンパクと接触させることと、この複合体を検出することとを具備する。

本発明の一実施例においては、サンプルを検出可能な成分でラベルされたＢＰＩ タンパクと接触させるに先立って、サンプル中の内毒素が支持体に付着されるよ うな条件下で、内毒素をａ何するサンプルは適切な支持体上に移される。

本発明は更に、対象における内毒素血症を診断するための方法であって、該対象 から生物学的流体サンプルを得ることと、上記の方法を用いてこのようなサンプ ル中の内毒素を検出することにより、該疾患を診断することとを具備する。この サンプルは細胞性サンプルであり得る。或いは、このサンプルは血清、尿、血液 、組織抽出物または唾液のような生物学的流体サンプルであってもよい。

本発明の実施に従えは、ＢＰＩタンパクは蛍光性ラベルで標識され得、検出はフ ルオロメータで行ない得る。或いは、ＢＰＩタンパクは放射能ラベルで標識され 得、検出はラジオクラブで行ない１する。更に、ＢＰＩタンパクは酵素で標識さ れ１（１１険出はスペクトロ）十トメータで行ない得る。

本発明は更に、ＢＰＩタンパクが内毒素と複合体を形成するように、外科用具を ＢＰＩタンパクでコーティングする方法であって、生物学的サンプルと接触する ように設工１された前記外科用具の表面にＢＰＩタンパクを付着させることを具 備したノｊ法を提供する。

また、この発明は、ＢＰＩタンパクが内毒素との複合体を形成するように、埋込 み可能な侵襲的デバイスをＢＰＩタンパクでコーティングする方法であって、生 物学的サンプルと接触するように設計された前記デバイスの表面にＢＰＩタンパ クを付着させることを具備した方法を提供する。

本発明の実施に従えば、この生物学的サンプルは血液であり得る。或いは、この 生物学的サンプルは組織サンプルであり１）る。更に、この生物学的サンプルは 筋肉サンプルであり得る。また、この生物学的サンプルは軟骨であり得る。加え て、この生物学的サンプルは骨であり得る。

また、本発明の実施に従えば、前記外科用具はカテーテル管であり得る。或いは 、この外科用具は外科用ステーブルであり得る。

更に、本発明の実施に従えば、前記デバイスは外科用インブラントであり得る。

本発明は更に、内毒素を含有する流体から、これを対象に投与する前に汚染物を 除去する方法であって、投与に先立って、内毒素かＢＰＩタンパクと複合体を形 成するような条件下で前記流体をＢＰＩタンパクと接触させ、これにより前記流 体から汚染物を除去することを具備した方法を提供する。

この流体は、血液、血漿、血清、等張溶液、薬学的製剤、細胞培養剤または骨髄 であり得る。

本発明はまた、生物学的流体サンプル中のＢＰＩタンパクの存在を検出するため のキットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合する、検査用緩衝液中のポ リミキシンＢと、（ｂ）　（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し、１１つ（ ２）内毒素結合ドメインについてＢＰＩタンパクと競合しない、検査用緩衝液を 含む表面に付着された第一抗体と、（Ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの結合につい て前記第一の抗体と競合せず、■１つ（２）内毒素結合部位またはその近傍でＢ ＰＩタンノ々りと特異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第二抗体と を具備し、前記生物学的流体サンプルが前記第一抗体および第二抗体と接触した ときに、前記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタンパクが前記第一 抗体および第二抗体によって捕捉され、第一抗体／ＢＰＩタンパク／第二抗体の 複合体が形成され、この複合体を検出することによって前記生物学的流体サンプ ル中のＢＰＩタンパクを検出するキ・ソトを提供する。

また、本発明は生物学的流体サンプル中のＢＰＰ　Ｉタンノ々りの墓をＭ１定す るためのキットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合する、検査用緩衝液 中のポリミキシンＢと、（ｂ）　（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し、且 つ（２）内毒素結合ドメインについてＢＰＩタンパクと競合しない、前記検査用 緩衝液を含んだ表面に付着された第一抗体と、（ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの 結合について前記第一の抗体と競合せず、１１つ（２）内毒素結合部位またはそ の近傍でＢＰＩタンパクと特異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第 二抗体とを具備し、ｌｌ’ｊｇＱ生物学的流体サンプルが前記第一抗体および第 二抗体と接触したときに、前記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタ ンパクが前記第一抗体および第二抗体によって捕捉され、第一抗体／活性ＢＰＩ タンノくり／第二抗体の複合体が形成され、この複合体を検出して、前記生物学 的流体サンプル中の活性ＢＰＩタンパクの量を測定するキットを提供する。

加えて、本発明は対象における内毒素血症を防止する方法であって、対象に対し て、内毒素に結合して対象における内毒素血症を防止するために有効な量のＢＰ Ｉタンパクを投与することを具備した方法を提供する。

本発明は、内毒素血症にかかった対象を治療する方法であって、対象に対して、 内毒素に結合して内毒素血症にかかった対象を治療するために有効な量のＢＰＩ タンパクを投与することを具備した方法を提供する。

本発明の実施に従えば、内毒素血症を防止するための、または内毒素血症にかか った対象を治療するためのＢＰＩタンパクの有効量は、該対象の体重１ｋｇ当り で、約０．　ｌ　ｍｇ〜約ｌＯＢであり得る。また、この有効量は対象の体重１ ｋｇ当り、約１ｍｇ〜約１０　ｍｇであり得る。

以下の詳細な実験の部に本発明を例示する。この実験の部の記述は本発明の理解 を助けるためのものであって、如何なる意味においても、後記の特許請求の範囲 に記載される発明を限定することを意図したものではなく、またそのように解釈 されてはならない。

〔実験の詳細〕

例　１ 材料および方法 試某および溶液。

大腸菌０１１１：Ｂおよびネズミチフス菌ＲＥ突然変異体（Ｓ。

ｌｙｐｈｉｍｕ＋ｉｍ　ＲＥ　ｍｕｆｇｎｌ）由来の内毒素は、ＲＩＢ＋イムノ ジエンＯリザーチ社（ＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ ｃ、、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ。

ＭＴ、　ＦＭＬＰ）から購入した。また、サイトカラシンＢ及び硫酸ポリミキシ ンＢ　（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ　５ｕｌｆａｔｅ）　（７９００Ｕ／ｍｇ）は、 シグマ−’ｒミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ、 、Ｓｔ、、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。天然ヒト腫瘍壊死因子は、エンド ジエン社（Ｅｎｄｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、、Ｂｏｓｔｏｎ　ＭＡ、）から購入した。

カルシウムおよびマグネシウムを合釘しないＨＢＳＳおよびＲＰＭＩ　１６４０ は、ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｇ「ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｎ、Ｙ 、）から購入した。

ＢＰＩの精製： ＢＰＩは、発熱因子を含まない新しいカラムおよび発熱因ｆを除去した緩衝液を 用いた厳格な無発熱因子の状態で行なった点を除き、上述したようにして（Ｍａ ｕａ　Ｍ、Ｎ、ｅｌ　ａｔ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４４：　６６２．　１９９０　）　、好中球顆粒プレパ レーシ３ンから精製された。緩衝ｉ（ｋは、パイロサートフィルター（Ｐｙ＋ｏ ｓａ＋ｌ　ｆｉｌｔｅｒ：５ａｒｌｏ＋＋ｕ　Ｆｉｌｔｅｒｓ、　ＩＩａｙｗａ ＋ｄ、Ｃ＾）を用いて発熱因子を除去された。これらの条件下で精製することに よって、ＢＰＩは、内毒素に媒介された好中球刺激を中和する活性について、先 に報告されたもの（Ｍａｕａ　Ｍ、Ｎ、ｅｌ　ａｔ、１　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４ ４：６６２．１９９０）の約４（Δの活性を示すようになった。

ＢＰＩ分子のＮ末端のアミノ酸２０個に対応する、２０個のアミノ酸のペプチド （ＢＰＩペプチドｌ−２０）で免疫化した兎から血清を収集した。プールされた 血清のＩｇＧ画分を、プロティンＡセファ０−ス（ファーマシア社、Ｐｉｓｃａ ｆｗａｙ　Ｎ、　Ｊ、　）を使用して精製した。活性化したＣＮＢｒセファロー ス（ファマシア社）に結合されたＢＰＩペプチド１−２０を使用して、上記画分 から特異的な抗タンパクＩｇＧを精製した。結合したＩｇＧを回収し、プールし た。また、こうして吸着処理されたＩｇＧを上記ペプチドカラムに更に３回通す ことにより、前記ＩｇＧ中に残留した特異的抗体を更に取り除き、免疫吸着処理 されたネガティブ対照を調製した。抗体の濃度は２８０ｎｍの光学密度で測定し た。これらイムノアフィニティー精製されたＩｇＧおよび吸着処理されたＩｇＧ をウェスタンプロティングに供し、特異性をテストした。免疫吸着処理された対 照１ｇＧは、イムアフィニティー精製された抗体に用いた濃度の千倍の濃度でさ えも活性を示さなかった。

内毒素結合分析： Ｔｏｂｉａｓ　Ｐ、Ｓ、ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２ ６４：１０８６７、１９８９　）に記載されている改変方法を使用して、マイク ロタイタープレートに固定された内毒素に対するＢＰＩの結合が行なわれた。概 略を説明すると、９６穴のマイクロタイタープレートであるイムロン２　（Ｄｙ ｎａｌｅｃｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｃｈａｎｌ ｉ＋＋ｙ、Ｖ＾）を、５０ｍＭのホウ酸塩（ｐＨ９）および２０ｍＭのＥＤＴＡ 中において、ネズミチフス菌ＲＥ突然変異体がら得た糖脂質（４μｇ／ウェル） を用いて３７℃で一晩コーティングした。

次いで、プレートを蒸留脱イオン水で広範に流水洗浄し、３７℃で乾燥させた。

分析プレートを抗体ブロックするために、発熱因子を含まないＰＢＳで調製され た５　ｍｇ／　ｍｌの低毒性の自前ＸＢ　Ｓ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、　ＭＯ）を用いて３７℃で３０分処理された。プレートを水切りし、 実験によってはポリミキシンＢを夫々のウェルに加え、さらに３７℃で３０分イ ンキュベー１−　Ｌだ。ブＬ／−１−を再び水切りし、ＢＰＩサンプルを加えた 。ＢＰｉまたはポリミキシンＢを含む全ての緩衝液は、発熱因子−を含まないＰ ＢＳで調製された。発熱因子を含まない緩衝液で稀釈され、或いは実験によって は正常人志願者からの血清または血漿で希釈されたＢＰＩ試料を、３７℃で振盪 しなから′３時間インギコ、ベートした。上記プレートを、発熱囚−「を含まな いｌｎｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。

次いて、兎ボリク１−Ｊ−ナル抗ＢＰＩペプヂドＩｇＧ抗体と、これに続いて山 η抗兎１ｇＧ−アルカリフナスファターセ複合体（ギブコーＢＲＩ−ライフテク ノロジー社、Ｇ＋ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、）を用いて発色させた。４０ ５　ｎｍての吸光度を、Ｖｍａｘ力・イネチソ１７マイクロプレートリーダー（ Ｖｍａｘ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍ１ｃｒ。

ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅ「：モレキ」ラー・デバイス社、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ 、ＣＡ）酸性クエン酸デキストロース（ａｃｉｄ　ｃｉｌｒａｌｅｄｅｘｔｒｏ ｓｅ）を収容したヴアキュティナー管（ｖａｃｕｌａｉｎｅｒ　ｔｕｂｅ；　バ クトン・デキンソン（Ｂｅｃｆｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｒｕｔｈｅｒｆｏ ｒｄ、　Ｎ、Ｊ、））中に採取された血液を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まな いハンクスの平衡塩溶液（ＩＩＢｓｓ）で希釈した。フィコール−バク−（Ｆｉ ｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ＋ファーマシア社、Ｐｉｓｃａｌａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）を用 いて、単核細胞を分離し、回収してＨＢＳＳで３回洗浄し、単核細胞の比率を顕 微鏡検査により推定した。この細胞を、グルタミンおよび抗生物質を含ａし且つ 血清を含有しない適当墓のＲＰＭｌ　１６４０中に取り、約１．Ｘ１０６単核／ ｍｌとした。上記の細胞を、２００１１１／ウエルとなるように９６ウエルの平 底組織培養プレート（コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ ）に分注し、３７°Ｃで２時間、７％の酸素を含む湿気を与えたに８養器中で培 養した。次に、血清を含まない加温したＲＰＭＩ　１６４０を用いて細胞を３回 洗浄した。最終洗浄液を吸引排出した後、熱で不活性化された１０％の自己血清 を含有するＲＰＭＩ　１６４０を２００μｍ７／ウエルたけ添加した。次いで夫 々のウェルに、緩衝液中、ポリミキシンＢ中またはＢＰＩ中で予めインキュベー トされた大腸菌内毒素の１０倍稀釈溶液を２２μｍ加えた。細胞を内毒素混合液 中で４時間、３７°Ｃで培養し、上澄液を回収し、ＥＬＩＳ＾（Ｅｎｄｏｇｅｎ 　Ｉｎｃ、、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）でＴＮＦａ抗原を分析した。

ネスミの気管支肺胞マクロファージにおけるエンドトキシン誘発ＴＮＦαの分泌 阻害： 通常麻酔を施したスイスウェブスターマウスに対して、１０ｎＨの大腸菌０１１ １：　Ｂ４内毒素（リスト社Ｃａｍｐｂｅ　ｌ　ｌ、　ＣＡ）を肺腔経路を通し て投与した。投与２０分前に、麻酔ネズミに対して５０μｍの生理食塩水、ＢＰ ＩまたはポリミキシンＢを鼻腔経路で投与した。内毒素投与の１時間後にネズミ を再麻酔し、１％のヒト血清アルブミンを含有する０、７ｍｌの生理食塩水を気 管を通して肺に加えた。肺は穏やかに揉まれた。０．５ｍｌの気管支肺胞洗浄（ ＢＡＬ）の液体を吸引し、遠心分離機により細胞をペレット状にして、ＢＡＬサ ンプルを一７０℃で保存した。

ＢＡＩ、液中のＴＮＦαの濃度を、ＷＥＨＩクローン１３マウス線維肉腫細胞に 対する細胞毒性を＃ｊ定することによって定量した。

ヒトｒＴＮＦａ　（Ｃｂｉ＋ｏｎ、ＥｍｅＢｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）を標準として 使用した。

ＢＰＩか内毒素に結合することは、上記「方法」に記載したように、改変ＥＬＩ ＳＡ法プロトコルを用いて、固定されたネスミチフス菌Ｒｅ内毒素に結合したＢ ＰＩを検出することによって実証された。ＢＰＩは濃度に依存して結合内毒素を ｆｆＬ、また該結合かポリミキシンＢによって阻害されたことは、ＢＰＩがリピ ソドＡに若しくはリピッドＡの近傍に結合することを示唆している（図１９）。

血漿または血清の存在Ｆても、内毒素に対するＢＰＩの有意な結合か保持される ことは（図２０）、生理食塩のみならず、血液タンパクの存在下て１）ＢＰＩが 内毒素と結合することを示している。このデーターは、ＢＰＩは血清アルブミン の存在下では殺菌性ではないか、かかる条件下でもバクテリアと結合するという Ｍａｎｎｉｏｎ、Ｂ、　＾、らの見解（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８６： ６３１，１９９０）と一致している。また、ＢＰＩと内毒素の結合は、ＢＰＩ（ ２０−８０ｍＭ）の致死作用からバクテリアを守りｉカるＣａ２＋、Ｍｇ２＋の 濃度によって著しく低下されることはない（図２１参照）。

ｉｎ　ｖｉｖｏでの内毒素に応答したＴＮＦの分泌は、内毒素ショックの病原論 において重要な役割を果たし得る。内毒素に媒介されたＴＮＦ分泌の調節におけ るＢＰＩの役割を調査するために、内毒素およびＢＰＩで予備インキュベートさ れた内毒素に応答して、ヒト付着性末梢血液単核細胞から分泌されたＴＮＦを測 定した（表１参照）。ＢＰＩは、内毒素刺激による上記の細胞からのＴＮＦ分泌 を、濃度に依存した形で特異的に阻害した。加えて、ＢＰＩによる阻害は、大量 の内毒素（１００−１０００ｎｇ／ｍｌ）によって、或いは０．１％の死滅した Ｓ、　ａｕｒｅｕｓによって克服され得る。このことは、ＢＰＩか単球の機能を 阻止しないが、内毒素による単球の特異的活性化を阻止することを示している。

表１ 内毒素に誘発されたＴＮＦ生産のＢＰＩによる阻害ＴＮＦ　（ｐｇ／ｍｌ） 内毒素　緩衝液　ポリミキシン　ＢＰＩ　ＢＰＩｎ　ｇ／ｍ　Ｉ　対照　１．０ 　μｇ／ｍｌ　０．４　μｇ／ｍｌ　Ｏ，１μｇ／ｍｌ＋００　８２３±６７　 ４００±１４８　５３０±１６　７４６±４８＋０　７５６±１１６　７６±２ ５６０±９１８２±４２１５９８±８９　０　０　０ 緩衝液、ＢＰＩまたはポリミキシンＢと共に３７℃で３０分間ｊ′−めインキュ ベートされた大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素によって、ヒト末梢血液単核細胞を刺 激した。内毒素混合液を添加した、１時間後に上澄液を回収し、ＴＮＦαをＥＬ ＩＳＡ法によって定実験的内毒素注入に応答して分泌されるサイトカイニンは、 発熱誘発を含む生理学的変化を惹き起こす。内毒素またはＢＰＩて予めインキュ ベートした内毒素を兎に注入することによって、内毒素の発熱原性に与えるＢＰ Ｉの影響につい−Ｃ研究した。注入後の温度変化を注入後１時間毎に３回チェッ クした。その最大の温度上昇を、各グループにおける３匹の動物テストのΣΔＴ を計算するために使用された。１．４℃以」二の値は発熱原性ありとみなされた （Ｕ、Ｓ、Ｐｈａ＋ｍａｃｏｐｅａｌＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｃ、、１９９ ０．　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、　Ｔｅ５ｔ、１５１．　ｐ１５１５　）。

食品医薬品局標準規格４００　ＥＵの内毒素のみを注入したグループでは３．９ ℃の合計温度上昇か観察されたが、２μｇのＢＰＩで予め処理された内毒素は金 言１の温度上昇が１．ｌ’ｃにすぎず、発熱原性はなかった。緩衝液で処理した 対照動物またはＢＰＩ処理した動物では、何の反応も見られなかった。

ＢＰＩがｉｎ　ｖｉｖｏでの内毒素に媒介されたＴＮＦ分泌を阻害するか否かを 決定するために、マウスの肺において、ＢＰＩによる内毒素の中和をテストした 。内毒素を投与する２０分前にＢＰＩを肺に投与すると、マクロファージによっ て気管支肺胞洗浄液中に分泌されるＴＮＦの量が苦しく減少する（表２参照）。

５匹の生理食塩水によって処理したマウスのうち４匹で、ＴＮＦα濃度は１，０ ００　ｐｇ／ｍｌを超えた。これに対してＢＰＩで処理したものでは、ＴＮＦα 濃度が１．ＯＯＯｐｇ／ｍｌを超えたのは５匹のうち１匹であった。全体的にみ て、ＢＰＩは、肺胞のマクロファージによる内毒素に媒介されたＴＮＦα分泌を ８．２倍低下させる。スチューデントのｔ検定を用いたとき、ＢＰＩによるＴＮ Ｆ分泌の減少は、生理食塩水による対照と比較してｐ＜Ｑ、０５のレベルで有意 であった。

（幾何学的平均±ＳＤ、生理食塩水＝３．３６４±０．４０２　、ＢＰ　Ｉ処理 グループ＝　２．１０９　、０２±０．７６４）。ポリミキシンＢ（その投与量 はモルベースでＢＰＩで用いた投与量の５０倍と高いものではあるカリは、生理 食塩水の対照と比較して、ＴＮＦα分泌の減少に若干効果があった（ｐ＜　０． ０２）。これらのデータは、可溶性ＢＰＩがｉｎ　ｖｉｖｏにおいて内毒素を中 和することを示している。

マウス　生理食塩水　ＢＰＩ　ポリミキシンＢ対照　０．８６μｇ　１．０μｇ （１５ｐｍｏｌ）　（７ｇ２　ｐｍｏｌ）３　５５６０　４２５　＋３２ Ｍｅａｎ　＋　ＳＤ　３０９７±２２５０　３７６±５４７　２５３±２５１通 常麻酔を施したマウスに、１０ｎｇの大腸菌０１１１：　Ｂ４内毒素を鼻腔経路 を通して投与した。投与２０分前に、鼻腔経路を通じて５０μｍの生理食塩水、 ＢＰＩまたはポリミキシンＢで麻酔ネズミを処理した。気管支肺胞洗浄液のＴＮ Ｆαを、クローン１３マウス線維肉種細胞であるＷＥ旧に対する細胞毒性を測定 することによって分ｔｒｉした。

我々のデータは、　ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＢＰＩがその濃度に依存して、内毒素に 刺激されたヒト付着性単核細胞によるＴＮＦ分泌を特異的に阻止することを示し ている。内毒素に誘発されたＴＮＦ分泌を阻害することによって、ＢＰＩはＬＢ Ｐから区別される。ＬＢＰは肝細胞によって合成される６０ｋＤａの急性タンパ クであり、アミノ酸配列の４４％においてＢＰＩと相同性をもち、ｉｎ　ｖｉｖ ｏおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏで内毒素と結合する（Ｔｏｂｉａｓ、Ｐ、Ｓ、、　Ｋ 、Ｓｏｌ＋Ｉａｕ　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｕｌｅｖｉｌｃｈ、１９８６．　ｒ兎の 血清から急性反応物と結合するリポ多糖類の分離Ｊ　Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１６４ニア７７　；Ｓｃｈｕｍａｎ、Ｒ，Ｒ，、Ｓ、Ｒ，Ｌｅｏｎｇ 、　Ｇ、Ｗ、Ｆｌａｇｇｓ。

Ｐ、Ｇｒａｙ、Ｓ、Ｄ、Ｗｒｉｇｈｌ、Ｊ、Ｃ，Ｍａｆｈｉｓｏｎ、　Ｐ、Ｓ、 Ｔｏｂｉａｓ　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ。

Ｕｌｅｖｉｌｃｈ、ｌ９９０、［リポ多糖類結合タンパクの構造および作用Ｊ　 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：１４２９　）　。その構造的類似性に拘らず、ＢＰＩ とＬＢＰは機能的には相反している。ＬＢＰ−内毒素複合体は、ＦＭＬＰに対し て酸化的バースト応答をするように好中球をプライミングし、単核細胞によるｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでのＴＮＦ生産を加速、増大させる（Ｖｏｓｂｅｅｅｋ、に、、 　Ｌ、５ｋｌａｒ、　Ｈ，Ｍｕｌｌｅｒ、Ｃ，Ｌｕｎｄｂｅｒｇ、Ｃ，Ｈ＋＋ｎ ５ｏｎ、Ｋ、Ａｒｆｏｒｓ、Ｒ，Ｕｌｅｖｉｌｃｈ、ａｎｄ　Ｐ、Ｔ。

ｂｉａｓ、１９８８．　ｒ急性反応物、リポ多糖類結合タンパク、ＬＢＰによる リポ多糖類誘発好中球プライミングの調節Ｊ、Ｅｕ＋。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　１８＾５０　）　（Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓ 、Ｄ、、　Ｒ，＾、Ｒａｍｏｓ、Ｐ、Ｓ。

丁ｏｂｉａｓ、、　Ｒ１，旧ｅｖｉｔｃｈ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｃ，Ｍａｌｈｉｓｏ ｎ、、ｒｃＤ１４、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびＬＰＳ結合タンパクの複合体に 対するレセプターＪ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：１９３１）　（Ｔｏｂｉａｓ、 Ｐ、Ｓ、、Ｊ、Ｃ，Ｍａｌｈｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｕｌｅｖｉｌｃｈ、 　１９８８．　ｒグラム陰性菌敗血症に対する応答に含まれるリポ多糖類結合タ ンパクのファミリー」、１．８ｉｏ！、Ｃｈｅｍ、、２６３：１３４７９　）　 。これとは反対に、ＢＰＩは１ｎｖｉｔｒｏにおいて、好中球およびマクロファ ージの両者のＬＰＳ媒介性刺激を阻害する（Ｍａｕａ、Ｍ、Ｎ、、　Ｃ，Ｇ、Ｗ ｉｌｄｅ、Ｊ、Ｅ、Ｇｒｉｌｌｉｌｈ、Ｊ、Ｌ、５ｎａｂｌｅ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ 、５ｃｏＮ、１９９０．　［殺菌性で浸透性を増進するタンパクは内置性中和活 性を何するＪ　、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

１、．１４４＋６６２）　、　ＢＰＩ−内毒素複合体はｉｎ　ｖｉｔｒｏで炎症 性細胞を刺激しないので、ｉｎ　ｖｉｖｏでＢＰＩ−内毒素複合体を投与したと きに発熱反応が誘発されることは期待されない。少量の内毒素たけで、ＴＮＦ、 ＩＬ−１及びガンマＩＦＮ等の内因性発熱因子が分泌される結果、強力な発熱反 応が誘導される（Ｆ＋ｒｌｅ７．Ｍ、Ｍ、、Ｗ、Ｍ、５ｈａｌｅｒ、ａｎｄ　Ｊ 、に、Ｓｐｉｌｘｎｘｇｅｌ、、１９８８．　ｒリポ多糖類の構造は、陽イオン 性の抗菌性好中球顆粒タンパクのイオン性結合および疎水性結合を決定するＪ　 、　１ｎｌｅｒｔ、　１ｍｍｕｎ。

５６：１５８９　）。兎は微量な内毒素に対して非常に敏感で、投与墓に依存［ ７て反応し、再現性のあるコア温度（ｃｏｒｅ　ｔｅｎ＋ｐｅｒａｔｕｓｅ）の 上昇をきたす。ＢＰＩとの複合体では、内毒素は兎の発熱反応を刺激することは できない。このように、ＢＰＩはｉｎ　ｖｉｖｏての効果的な内毒素阻害剤であ り、これはおそらくＢＩＰが内毒素によるサイ１〜力イン分泌を阻害する結果で ある。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＢＰＩの殺菌性および浸透性増大活性は、ＬＢＳとの 著しい相同性を有するＢＰＩ分子のＮ末端側半分に関係する（Ｓｃｈｕｍａｎ、 Ｒ，Ｒ，、Ｓ、Ｒ，Ｌｅｏｎｇ、　Ｇ、Ｗ、Ｆｌａｇｇｓ、　Ｐ、Ｗ、Ｇｔａｙ 、Ｓ、Ｄ、Ｗｒｉｇｈｔ、Ｊ、Ｃ，に４＋＋ｔｈｉｓｏｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔｏｂｉｘ ｓ、ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、旧ｅｗｉｔｃｈ、１９９０．　ｒリポ多糖類結合タンパク の構造と機能」、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４’１ｌ１４２９）　。膜連結領域（ｍ ｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｄｏｍｅｉｎ）という以外は、ＢＰＩカル ボキシル基末端末端領域因する何の作用ら知られていない。グレイとその共同研 究者らは、ＢＰＩのカルボキシル末端側半分はアズール好性顆粒膜と関係してい ると示唆している（Ｇｒａｙ　Ｐ、Ｗ、、Ｇ、Ｆｌａｇｇｓ、Ｓ、Ｒ，Ｌｅｏｎ ｇ、Ｒ，Ｊ、Ｇｕｍｉｎａ、Ｊ、Ｗｅｉｓｓ、Ｃ，Ｅ、Ｏｏｉ　ａｎｄ　Ｐ、Ｅ Ｉｓｂａｃｈ、１９８９．　「ヒト好中球殺菌タンパクのｃＤＮＡのクローニン グ；構造的機能的相関関係」、１、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６４：９５ ０５）　、そのモデルにおいて、好中球が刺激されるとエラスターゼ等のタンパ ク分解酵素が分子を分解し、活性な殺菌性のＮ末端側半分を食胞融解小体中に分 泌する。しかしながら、ＢＰＩが一体的な膜タンパクであるということに対して は、これに反論する幾つかの証拠がある。ＢＰＩは、洗浄剤（＋］ｅｔｅｒｇｅ ｎｊ）を使用せずに、分離されたアズール好性顆粒から抽出され得る。ＢＰＩは 水溶液中に可溶であり、可溶性のＢＰＩは内毒素結合および阻害の両方のテスト において活性である。また、ＢＰＩは完全な長さのタンパクとして、ＦＭＬＰ／ サイトカラシンで刺激された好中球（全細胞性ＢＰＩの７１％）によって分泌さ れ、このことはＮ末端か脱顆粒化（ｄｅｇｒａｎｕｌａｆｉｏｎ）の際に好中球 プロテアーゼによって放出されること反論する。

ｉｎ　ｖｉｖｏで、ＢＰＩは内毒素の毒性を抑制するように作用し、殺性剤タン パクとしては作用しない。ＬＢＰおよびＢＰＩ等の内毒素結合性タンパクは夫々 、受容体／受容体−拮抗剤システムとして機能し、内毒素に対する宿主の反応を 調節する（図２２参照）。ＬＢＰは内毒素の可溶性受容体として作用し、好中球 およびマクロファージの両者に対する内毒素の効果を増幅する。ＢＰＩが内毒素 に対する宿主の反応を制限できることは、ＢＰＩがｉｎ　ｖｉｖｏで内毒素の致 命的効果を阻害するにあたって重要な役割を有することを示している。

動物における予備実験の結果は、組換えＢＰＩによる処理によって、内毒素で誘 発される致死が著しく低減されることを示している（実施例４参照）。このよう に、バクテリアの成育を制限する公知の抗生物質と共同して、内毒素を中和する ＢＰＩを使用することは、内毒素ショックに対する有用な治療法になる得る。

例２ ＢＰＩタンパクおよび先端切除型ＢＰＩの発現Ａ、遺伝了加工された哺乳類細胞 はＢＰＩを発現する１Ｎ＋ｌｉ乳類細胞中でＢＰＩタンパクおよび／またはＢＰ Ｉタンパク変種を産生するためには％　ＣＤ　Ｎ　Ａ配列を適切なプラスミドに 挿入しなけれはならない。このような適用に適する・ベクターはｐ　Ｓ　Ｖ　− １で、これは複製開始点ならびに５Ｖ４Ｑの初期および後明ブ「スモーク−と、 これに続く多重挿入クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　１ｎｓｅｃｔ　ｃｌ ｏｎｉｎｇ　５ｉｔｅｓ）　と、これに続くＢＩＩ−リ肝炎表面抗原遺伝ｊ″− 由来の停止配列とを含む。さらに該プラスミドには、バクテリアＤＮＡの複製開 始点、アンピシリン耐性およびジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子が含ま れている。他の外来遺伝子を発現するために、類似のベクターが使用されてきた （ＭｃＧｒｏｇａｎ、ｅｔ　ａｔ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、　７２ −１７７）　。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＢａｍ旧による消化、並びにアルカリフ 十スフ十ターゼ゛を用いた脱リン酸化によって、ＢＰＩタンパクｃＤＮＡ配列を 受けいれるためのベクターＤＮＡが調製された。

ｐＳＶ−１に挿入するために、ＢＰＩタンパクｃＤＮ＾を含む幾つかの挿入物を 調製した。ます、ＥｃｏＲｌおよびＢｇｌｌ＋等の適切な制限酵素で親プラスミ ドを消化することによって、ＢＰＩタンパクの全長をコードする挿入物を調製し 、ＢＰＩタンパクのコード配列部分を含む２個のＤＮＡ断片を生成した。これら ２つのＤＮＡ断片を一緒に、調製された５Ｖ−１に挿入した。得られた組換クロ ーンは、２つの挿入物が適切な向きで存在することを確認するために、制限酵素 消化によってスクリーンニングされた。親ＢＰＩタンパク挿入ＤＮＡのオリゴヌ クレオチド指向性ＤＮＡ増幅法を使用して、先端切除型のＢＰＩタンパクをコー ドする２つのｃＤＮＡを作成した。オリゴヌクレオチド増幅は、ＢａｍＤＩ　ク ローニング部位（図５）に加えて、コドン２１２（オリゴ４５９９図７）、コド ン３３７（オリゴ４５８１図８）がストップコドンで置換されるように設計され た。両構築物の５−末端で、オリゴ４５８を使用して増幅をおこない（図８）、 転写開始コドンＡＴＧのすぐ上流に旧ｎｄ　Ｉ！１部位を構築した。

このようにして、夫々５５ｋＤａ、　３８ｋＤａ、および２５ｋＤａの３−）　 （７）　ＢＰＩをコードする挿入物を構築し１用意されたベクターＤＮＡにそれ ぞれ連結した。

３つの構築物を制限酵素分解で確かめ、次いでＣＨＯ細胞系のＤυＸＢＩＩ細胞 にトランスフェクトするために十分な量で調製した。トランスフェクションはり ポフェクチン（Ｉ　１ｐｏｆｅｃｔｉｎ）を使用して行われ、標準プロトコルを 用い、メトトレキセートを僧門しながら形質転換細胞を選択した（図３参照）。

形質転換物プールまたは該プール由来のクローンの上澄液について、内毒素結合 活性のａ無を、ＴＮｒ放出阻害によって分析した。選択した細胞系の殆どにおい て、ＢＰＩは無視し１するものであ−った。５００ｎＭのメトトキセートの大音 増幅から樹立された細胞系のみから、商業的に入手可能な墓のＢＰＩが生産され ることか見出された。、：わらの二つ細胞系は、３ＡＩおよび４Ｄ６と命名され ている。大音増幅のみがこれらの細胞系をもたらすことは、予期し得ないもので あった。

ＢＰＩタンパクまたＢＰＩタンパクの変種を昆虫細胞で生産するためには、その ｃＤＮＡ配列をまずｐＡＣ３７３等（図１０参照）の適切なプラスミド発現ベク ターに挿入しなけらばならない。その挿入のための適切な制限酵素認識部位を、 標準の部位ｊ％Ｊ意的突然変異誘発手法によって作成する。適切な発現ベクター として不可欠の特質には、ｐＡＣ３７３のポリへドロン遺伝子プロモーター等の 転写プロモーター、およびバクロウィルスケツムに直接的に組換を行うための隣 接する相同配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）か含まれる。ポリアデニレーンヨン化号（例えば、プラスミドベクターに存在 するポリへドロン遺伝子に由来するもの）は、組換遺伝子の発現のためにはあっ てもなくてもよい。転写プロモーター（および任αのポリアゾニレ−ジョンシグ ナル）を含む調節遺伝子に並置された、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の ようなマーカー遺伝子がベクター中に含まれ得るか、これはＢＰＩタンペクの発 現に必要不可欠なものではない。上記目的の典型的ベクター、Ｔ）　Ａ　Ｃ３７ ３を図１０に示す。

組換えバクロウィルスの構築： ＢＰＩタンパクの目的遺伝子（またはセクションＡに記載のように誘導されたそ の先端切除体）を含む発現ベクターと、野生型バクロウィルスＤＮＡとの相同的 組換によって、キメラバクロウィルスを構築した。プラスミドとバクロウィルス ＤＮＡとをリン酸カルシウム技術によって共沈殿させ、未感染の昆虫細胞である ５ｐｏｄｏｐｌｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｓｉ２）に加えた。形質転換 後４日から７日すると、細胞は変性細胞形態を示し、またウィルス感染により典 型的に形成される核吸蔵体を細胞中に含有するに至った。野生型および組変ウィ ルスを含むみ且つ細胞を含まない培地が回収され、ＢＰＩ活性かアガロースでオ ーバーレイされた単層Ｓｆ９細胞をプラーク精製することにより、上記の共形質 転換体ストックからウィルスの単離クローンを得た。分析に供されるプラークは 、プラーク形態によって同定され、核内蔵体を担持するものが陰性とされる。も し、発現プラスミドがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなマーカー遺伝子を含 んでいるならば、組換プラークは、アガロースプレート培地において、５−ブロ モ−４クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトロピラノシド（Ｘ−ｇａｌ） 等の発色源物質から生じる青色で示されるであろう。釣菌されたプラークは、多 つェル皿での細胞培養に用いられる。その結果得られる細胞溶解物と感染細胞の 上澄液は、標準活性分析または免疫学的分析を用いることにより、組換ＢＰＩの 発現について評価される。陽性を示したウェル内の内容物については、野生種が 混在しない純粋な組換ウィルスのストックを１するために、もう一度一連のプラ ーク精製を行う。

ＢＰＩのバッチ生産： Ｓｆ９細胞を、Ｅｘｃｅｌｌ　（Ｊ、　Ｒ，ｊｃｉｅｎｌｉｌｉｃ社）のような 無血清の低タンパク培地で成育させる。懸濁した培地から弱遠心分離によって細 胞を回収し、１細胞当たり１ウイルスプラ一ク形成単位の感染を多数回用いて、 ！０００万細胞／ｍｌの濃度のウィルス接種物を含むように、新鮮な培地に再度 懸濁した。２時間後、上記培地は新培地により５倍に希釈され、２日ないし３日 培養された。培養の最後に、細胞を遠心分離でぺし・ット化し、ならし培地を回 収した。ＤＰＩタンパクは、準手段により無細胞の上澄液から精製された。

昆虫細胞由来ＢＰＩの特徴： バクロウィルス発現系を用いて昆虫細胞で生産されたＢＰＩタンパクは、分子間 約５５．０００ｋｄのグリコジル化タンパクである。Ｎ−末端のアミノ酸配列は 成熟した哺乳類細胞のＢＰＩと同一であり、これはシグナル配列の正しいブロモ ・ノンングか行われたことを示している。組換タンパクの特異的内毒素結合活性 は、ＢＰＩの場合と区別できなかった。

ｐＴ７ＢＰＩタンパクプラスミドの構築；ＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ社、３８０Ｂで）を用いて、オリゴヌクレオチド指向性ＤＮＡ増 幅に使用するためのオリゴヌクレオチドを調整した。このオリゴヌクレオチドに よ・って、ＢＰＩタンパクＤＮＡの５′末端および３′末端に、夫々Ｎｄｅｌお よびＢａ＋ｎＨＩの制限酵素部位が形成された。また、ＢＰＩタンパクＤＮＡの 先端切除プロリン−２１２型を生成するために、Ｂａｍ）ＩＩ制限酵素部位を含 むオリゴヌクレオチドか使用された。

増幅反応に続いて、遺伝子断片が精製され、ＮｃｌｅｌおよびＢａｍＢＩで消化 された。プラスミドｐ　ＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａより入手）を構築用ベ クターとして選択した。ｐ　ＧＥＭＥＸ−１は、適当な宿主に挿入したとき、そ の下流側の配列を発現するために使用されるＴ７プロモーターを含んでいる。ベ クターをＢａｍＲ１で切断し、精製した後にＮｄｅｌで部分的に分解し、一箇所 のＮｄｅ１部位および一箇所のＢａｍ８１部位を有すベクターを作成した。遺伝 子断片を連結し、Ｈａｎａｈａａ形質転換プロトコル（ＤＮＡクローニング、第 １巻、「実践的アプローチＪ　、Ｄ、　Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ編集、ＩＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ発行）を使用して、大腸菌３Ｍ１０１株中に形質転換した。この形質転換さ れたバクテリアを、カルバミシリン（Ｃａｒｔ＋ａｍｉｃｉｌｌｉｎ）を含有す るＬＢプレートに植菌し、３７℃で一晩培養した。カルバミシリン耐性コロニー か選別され、ミニプラスミドプレバレージョンの調製および制限酵素での消化に より分析された。この消化による分解物を、１％のアガロースゲル及び５％のポ リアクリルアマイドゲルの両方で分析した。

発現宿主である大腸菌１旧０９（ＤＥ３）株を、１μｍのミニプラスミドプレバ レージョン及びＨａｎａｈａｎ形質転換プロトコルを用いて形質転換した。ＩＭ ＩＯ９（ＤＥ３１株は、ＩＰＴＧで誘導され肖るＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝 子の染色体コピーをａする。形質転換されたバクテリアは、カルバミシリンを含 ＨするＬＢプレートに植菌され、３７°Ｃで一晩培養された。結果を図１．　Ａ 　−ＩＥに示す。

シグナルペプチドを含まないＢＰＩはコロニーを形成するのに対して、シグナル ペプチドを有する完全な長さのＢＰＩおよびプロリン−２１２先端切除型ＢＰＩ はコロニーを形成しないから、ＢＰＩタンパクは活性状態で発現され、正しくプ ロセッシングされ、バクテリアのペリプラズム空間（シグナルペプチドを何する タンパクが送られて行くバクテリア内の場所）へと送出され、その場所での殺菌 活性により細胞は死滅する。ことはまた、完全な長さのＢＰＩおよびプロリン− ２１２短縮型ＢＰＩの両者が共に４−性で、殺菌活性かあることを示唆する。

シグナルペプチドを含ｆＴ　ｔ、ないＢＰＩタンパクが活性であるか、或いは細 胞に封鎖隔離されること（核内繊体を形成すること、シグナルペプチドがないた め原形質膜に接近できないこと、或いはその両方により）によってその殺菌活性 を示すことか妨げられるかについては知られていない。

組換えＢＰＩは次の様に精製される： ＣＭ−Ｃツーロースを用いた一段解プロセスで、組換えＢＰＩ　（ｒＢＰりを含 ａするならし培地は、９５％の均一性を何するまでに精製された。ＣＭ−セファ ロースカラム（ファーマシア社、Ｐｉｓｃａｌａｗａｙ、Ｎ、Ｊ、）は、最初に ５倍のカラム８墓の０．５Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄された後、リムル・アメー バ細胞溶解テスト（Ｌｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ　Ｌｙｓａｌｅ　Ａｓ ５ａｙ　；　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅ＋５ｖｉｌｌｅ、ＭＤ　）で発熱 因子が検出されなくなるまで、発熱因子を含まない緩衝液または水で濯いだ。次 いで、カラムを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐ旧で平衡化した。上記ならし培地をこの ＣＭ−セファロースカラムにかけ、結合されたタンパクを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　 １Ｍ％塩化ナトリウムｐＨ７，４で溶出させた。ｒＢＰＩを濃縮し、これを５０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＩＭ、塩化ナトリウムｐＨ７，４で平衡化した第二のＣＭ−セ ファロースカラムに通し、０．０−１．０　Ｍ勾配の塩化ナトリウム溶液で溶出 さることによって更に精製した。ＢＰＩは約０．７５Ｍの塩化ナトリウムで溶出 した。このようにして精製されたｒＢＰｌは、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動で単一のバンドとして現れ、逆相ＨＰＬＣで単ヒト末梢血液単核細胞を フィコール−バク−（Ｆｉｃｏｌｌ　−Ｐａｑｕｅ、ファーマシア社）勾配で単 離し、発熱因子を含まない２倍容量のＨＢ　Ｓ　Ｓ　（Ｈａｚｅｌｌｏｎ）で洗 浄し、血清を含まないＰ　ＲＭ　ｌ培地（ギブコ社）中に５　Ｘ　１０６／ｍｌ で再懸濁させた。

この懸濁細胞２００μｍを、９６ウエルの平底組織培養皿（ｃｏｓｔｅｒ社）の 各ウェル中で、３７℃で２時間インキュベートした。

ＲＰ旧および熱で不活性化した１０％の自己血清を用いて洗浄し、未付着細胞を 除去した。緩衝液、ＢＰＩタンパクまたはポリミキシンＢ（ギブコ社；　７９０ ０　Ｕ／ｚｌ）と共に予め３７℃で３０分間インキュベートした大腸菌０１１１ ：Ｂ４内毒素を用いて、付着単核細胞を刺激した。内毒素混合物を添加した４時 間後に、上澄液を回収した。ＴＮＦαの分泌をＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｄｏｇｒｎ） で定量した（結果を表３に示す）。ＣＨＯ細胞由来の天然および組換えＢＰＩの 数ロットをテストした。

表３ 内毒素投与 １０　ｎｇ／ｍｌ　］　ｎｇ／ｍｌ　ｎｇ／ｍｌＢＰＩ（ｎＭ）　０　７１　０ ．４　０．３　０　７．３　１．４　０ｊ　０８０３８ｎ　−１２９１５９２０ ３−１５３１８７１６５１４８１０４ｎ　−９８１０４１６２−９８１１９１６ ２１４８１１３ｎ　−９２１１４１５］　−７１１２９１５５１４８１５９＋　 −８２１５８１５５−８７１３６１４７１４８１６５ｒ　−１２４１２８１３８ −１１６１２９１４６１４８］７９ｒ　−８５１３９１３４−９３１月　１６６ □□−□−−□−−−−−−−−−−−−−−一一一一一二−ｎ＝人然型 ｒ・組換体 例４ グラム陰性菌による敗血症の病態生理学的結果は、基本的にはバクテリア内毒素 （ＬＰＳ）の分泌によって引き起こされる。ＢＰＩタンパクはｉｎ　ｖｉｌｒｏ で内毒素中和活性を有するので、内毒素ショックの実験モデルにおいて、ＢＰＩ タンハク（７）ｉｎ　ｖｉｖｏでの影響を研究した。

詳細に説明すると、一つの実験においては、８匹のラット（スプラーグ・ドーリ −系ラット）からなる１グループに対して、シグマ社から人手した大腸菌０１１ １：Ｂ４内毒素０．５ｍｇ／ｋｇ体重を一回に静脈瞬時注入する４時間前に、１ ｍｇ／ｋｇ体重のＢＰＩタンパクを一回の瞬時注入で投与した。同じ実験におい て、８匹のラットからなる第２のグループに対しては、大腸菌０１１１：Ｂ４　 ｔｐｓの０．５町／ｋｇ体重を一回に静脈瞬時注入すると同時に、Ｉｍｇ／ｋｇ 体重のＢＰＩタンパクを一回の瞬時注入で投与した。更に、５匹のラットからな る第３グループに対しては、大腸菌０１１１；８４　Ｌ　Ｐ　５（７）０．５　 ｍｇ／ｋｇ体重を一回に静脈瞬時注入した４時間後に、Ｉｍｇ／ｋｇ体重のＢＰ Ｉタンパクを一回で瞬時注入した。最後に、１０匹のラットからなる第４グルー プにχ１しては、内毒素単独の処理を施した。

ラットを４８時間観察し、各グループにつき生存を記録した。

この実験結果を表４に示す。内毒素を単独投与されたラットは、死亡率８０％を 示した。ＢＰＩタンパクおよび内毒素の両方を投与したラットは、死亡率の著し い減少を示した。表４に示す結果によって、ＢＰＩタンパクは内毒素の存在に伴 う疾病をｉｎ　ｖｉｖｏで予防し且つ治療するのに有用であることが立証された 。ＢＰＩタンパクを多量投与し、て行った毒性ｂＪｔ究では、゛７７日目動物を 致死せしめたときに、毒性を示す証拠は示されなかった。我々は、ＢＰＩがＬＰ Ｓと結合する無毒性の天然に存在するタンパクであり、ＴＮＦの分泌を阻害し、 内毒素およびＧＮＢ実験敗血症モデルの両方において死亡率を減少させると結論 する。ＢＰＩタンパクは、敗血症ショックを治療する新規免疫学的方法を提供す るものであると確信される。

表４ 内毒素　ＢＰＩ蛋白　ＢＰＩ蛋白 ０、５ｍｇ／ｋｇ　ｌ　ｍｇ／ｋｇ　４時間面注入　５ｔ６／８） ０、５ｍｇ／ｋｇ　ｌ　ｍｇ／ｋｇ　同時注入　６０、５ｍｇ／ｋｇ　ｌ　ｍｇ ／ｋｇ　４時間段注入　８更に、殺菌性／浸透性増加タンパク（ＤＰＩ）を用い た第二の実験においては、好中球減少症ラットに対して、その好中球減少期間中 にシュードモナス菌（ＰＡ１２４４）を感染させた。

第１グループのラットに対しては、５日目の発熱開始時にＢＰ　Ｉ　１０　ｍｇ ／ｋｇ　（体重）を静脈内投与し、１１−０目まで観察した。第２番目のグルー プに対しては、５日目の発熱開始時に生理食塩水を含有した緩衝液による処理を 施ｔ７．１１１日目で観察した。８日日以降、緩衝液で処理したラットグループ は死亡したが、ＢＰＩで処理したラットグループは６０％の生存率を示した。ラ ットを１１０間観察し、各グループの生存を記録した。１１１日目は、ＢＰＩで 処理したグループではそれ以上の死亡は発生じなかった。上記実験の結果を図１ ５に示す。図１−５は線グラフで、（１）緩衝液で処理したラットの死亡率は、 ８日目およびそれ以後で１００％になることと、（２）ＢＰＩで処理したラット の死亡率は、７日目およびそれ以後で４０％になることを示している。ＢＰＩタ ンパクを与えられたラットは死亡率の著しい低下を示した。

異系交配のＣＤ−１マウスまたはスプラーグ・ドーリ−系ラットにおいて、ヒト ＢＰＩタンパクを静脈内投与ｆｌＶ）で最高１０ｍｇ／ｋｇまで投与したとき、 急性の血液学的、生化学的または病理学的異常は生じなかった（表５）。対照の ＣＤ−１マウスにおいて、大腸菌旧１１８４内毒素１　ｍｇ／ｋｇを静脈内投与 した６匹のＣＤ−１マウスは、１００％の生存率（６／６）を示した。ＢＰＩタ ンパクの１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ及びｌ０ｍｇ／ｋｇを静脈内注入したＢＰ Ｉタンパク処理マウスに対し、大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素の１ｍｇ／ｋｇを静 脈内注入したときの生存率は、夫々１００％（４／４）、　１００へ（４／４） 、　１００％（５１５）であった。

対照のＣＤ−１マウスにおいて、大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素の１０ｍｇ／ｋｇ を静脈内注入した６匹のＣＤ−１マウスの生存率は１７％であった。ＢＰＩタン パク　１ｍｇ／ｋｇ、　２ｍｇ／ｋｇ及びｌ０ｍｇ／ｋｇを静脈注入したＢＰＩ タンパク処理マウスに対して、大腸菌０１１１＋８４内毒素のＩｍｇ／ｋｇを静 脈内注入したときの生存率は、夫々５０％（２／４）、１００％（４／４）およ び１００％（５１５）であった。

対照のＣＤ−１マウスにおいて、大腸菌０１１１＋Ｂ４内毒素の５０　Ｂ／ｋｇ を静脈内注入した６匹のＣＤ−１マウスの生存率は０％（０／６）であった。Ｂ ＰＩタンパクのｌ　ｍｇ／ｋｇ　、　２　ｒｎｇ／ｋｇおよび１０　ｍｇ／ｋｇ を静脈内注入したＢＰＩタンパク処理マウスに対して、大腸菌０１１１：Ｂ４内 毒素のｌ　ｍｇ／ｋｇを静脈内注入したときの生存率は、夫々２５％（１／４） 、　２５％（１／４）及び２５％（５１５）であった。

々・Ｉ照のＣＤ−１マウスにおいて、大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素の１００　ｍ ｇ／ｋｇを静脈内注入した６匹のＣＤ−１マウスの生存率はＯＮ　（０／６）で あった。ＢＰＩタンパク　Ｉ　１１１ｇ／ｋｇ、　２　ｍｇ／ｋｇおよびｔｏ　 ｍｇ／ｋｇを静脈注入したＢＰＩタンパク処理マウスに対して、大腸菌０１１１ ：８４内毒素のＩ　ｍｇ／ｋｇを静脈内注入したときの生存率は夫々０％（０／ ４）、　０％（０／４）および８０％（４１５）であった。

対照のＣＤ−１マウスにおいて、大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素の２００　ｍｇ／ ｋｇを６匹のＣＤ−１マウスに注入すると、生存率は０〜（０／６）であった。

ＢＰＩタンパクのＩ　ｍｇ／ｋｇ　、　２　ｍｇ／ｋｇおよび１０　ｍｇ／ｋｇ を静脈内注入したＢＰＩ処理マウスに対して、大腸菌０１１１：Ｂ４内毒素１　 ｍｇ／ｋｇを静脈内注入したときの生存率は、夫々０％（０／４）、　０％（０ ／４）および２０％（１１５）であった。

表５ ＢＰＩタンパクは内毒素ショック（ＣＤ−１マウス）による死亡を防ぐ。

生存率％（生存数／テスト動物数） 内毒素投与 （大腸菌　対照（生　ＢＰＩ　ＢＰＩ　ＢＰ（ｌＩｌ］＋８４　）　即食塩水） 　１ｍｇ／ｋｇｌＶ　２ｍｇ／ｋｇｌＶ　］Ｏｍｇ／ｋｇｌＶ１ｍｇ／ｋｇｌＶ 　１００（６／６）　１００（４／４）　１００（４／４）　１００（５１５） １０　ｍｇ／ｋｇｌＶ　１７　（６／６）　５０　（２／４）　１００　（４／ ４）　１００　（５１５）５０　ｍｇ／ｋｇｌＶ　Ｏ（０／６）　２５　（１／ ４）　２５　（１／４）　１００　（５１５）１００　ｌｌ１ｇ／ｋｇｌＶ　Ｏ （０／６）　０　（０／４１　０（０／４１　８０（４１５）２００　ｍｇ／ｋ ｇｌＶ　Ｏ（０／６）　０　（０／４）　Ｏ（０／４）　２０（１１５）結論と して、表５はＢＰＩタンパクがテスト動物においては無毒性であり１．毒素投与 に続く死亡に対する顕著な防御力を提供する（図１６）ことを示している。この 天然に存在する好中球由来の抗菌性タンパクは、敗血症ショックの処置における 新規な治療戦略を提供する。

ヒトＢＰＩタンパクは、異系交配のＣＤ−１マウスにおいて、静脈内投与（！Ｖ ）で最高１０ｍｇ／ｋｇまでは急性の血液学的、生化学的または病理学的異常を 生じなかった（表６）。ＣＤ−１マウスを用い、大腸菌旧１１：Ｂ４内毒素の５ ０ｍｇ／ｋｇを１０匹に静脈内注入することにより、ｉｎ　ｖｉｖｏでの内毒素 に対するのＢＰＩタンパク有効性を試験した結果、対照のＣＤ−１マウスにおけ る生存率は０％　（０／１０）となった。ＢＰＩタンパクの１０ｍｇ／ｋｇを静 脈注入したＢＰＩ処理マウスに対して、０１１１１８４内毒素５０ｍｇ／ｋｇを 静脈内注入したとき、ＢＰＩタンパク処理マウスの生存率は１００％ｆｌ（１／ １０）であった。Ｐ値はｐく鉤００１である。更に、対照の５匹のマウスに５０ 　ｍｇ／ｋｇの０５５を静脈内注入したところ、生存率は０％（０１５）であっ た。

ＢＰＩタンパク１０ｍｇ／ｋｇを静脈内注入したＢＰＩ処理マウスに対して、５ ０　ｍｇ／ｋｇの０５５を静脈内注入した結果、ＢＰＩ処理マウスの生存率は１ ００％（５１５）であった。Ｐ値はｐ＜０．０１１１である。史に、対照の５匹 のマウスに対して、２５　ｍｇ／ｋｇのＲＣラフ（Ｒｃ　ｒｏｕｇｈ）突然変異 体（コア糖脂質）を静脈注入した結果、生存率は０％（０１５）であった。ＢＰ Ｉタンパク１０ｍｇ／ｋｇを静脈注入したマウスに対し、５　ｍｇ／ｋｇのＲｃ ラフ突然変異体（コア糖脂質）を静脈注入した結果、生存率は１００％（５１５ ）であった。Ｐ値はｐ＜０．０１である。また、対照の４匹のマウスに対して、 ２５　ｍｇ／ｋｇのリピドＡを静脈注入したときの生存率は０％（０／４）であ った。ＢＰＩタンパクｌ０ｍｇ／ｋｇを静脈注入したＢＰＩ処理マウスに対して 、２５　ｍｇ／ｋｇのリピドＡを注入した結果、ＤＰＩ処理マウスの生存率は１ ００％（５１５）であった。

Ｐ値はｐ＜０．０５である。

ＢＰＩは毒性のない天然に存在するタンパクであり、内毒素血症および敗血症症 候群の両者における死亡率を低下させる内毒素中和活性を阿しているから、敗血 症ショックを処置す−るための０用な免疫治療法となり得る。

表６ 種々の型の内毒素の致死率における ＢＰＩタンパクの効果 生存率％（生存数／テスト動物数） 内毒素　ＢＰＩ ５０ｍｇ／ｋｇ　１００（１０／ＩＱ）　０　（１／１０）　ｐ　＜　０．００ １＊０５５ ５０ｍｇ／ｋｇ　１００（５１５）　０　（０１５）　ｐ　＝　０．０１＊ＲＣ ラフ突然変異 体（コア糖脂質） ２５ｍｇ／ｋｇ　１００（５１５）　０　（０１５）　ｐ　＝　０．０１非グリ コジル型ＢＰＩ分子を作成するために、グリコジル化された組換ＢＰＩタンパク （クローン３Ａ１）を正常に発現するＣＨＯ細胞系を、回転瓶（Ｃｏｓｔａｒ社 、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）内において、７．５％の透析子牛血清（ギブ コ社）＋　ｂＢ／ｍｌツニカマイシン（ベーリンガーマンハイム社、Ｉｎｄｉａ ｎａｐｏｌｉｓ。

ＩＮ）を含有するＲＥＭ　０２０培地（ベーゼルトン（ｌｌａｚｅｌｌｏｎ　Ｉ ｐｃ。

、　Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｐ＾）中で集密状態にまで生育させた。２４時間後、上記 培地を捨て、２μｇ／ｍｌのツニカマイシンを含有する新鮮な完全培地と交換し た。ならし培地を回収し、３日間２４時間毎に交換した。非グリコジル化型組換 えＢＰＩタンパクを、上記実施例３のＢＰＩタンパクについて記載したように精 製した。さらに、２０ｍＭグリシン＋１００　ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ２中の スーパーローズ１２　Ｃ３ｕｐｅｒｏｓｅ１２．　ファーマシア社）サイズ除外 クロマトグラフを用いて、残りのグリコジル化された組換ＢＰＩタンパクから分 離し、非グリコジル化型ＢＰＩタンパクをａａする両分（ポリアクリルアミドゲ ル電機泳動で同定）をプールした。

グリコジル化型または非グリコジル化型の組換ＢＰＩタンパク１０ｍｇ／ｋｇを マウスに注入し、眼窩後の網状血管を通して指示された回数たけ血液を採取した 。血液サンプルを凝集させ、遠心分離によってフィブリン凝集を除去し、組換Ｂ ＰＩタンパクの濃度をＥＬＩＳ八分析へより定量した（結果は図１８に示す）。

イムロン−２９６ウエルプレート（Ｄｙｎａｌｅｃｈ）１２チヤンネルの５０− ２００μｍ　ピペットＰ２０．　Ｐ２Ｏ０，Ｐ１００Ｏピペット試薬貯蔵器（Ｃ ０５１２１社） ラック入り１ｍｌチューブ（ＢｉｏｌａＤ社）ポリプロピレン製１５ｍ１円錐チ ューブ試薬 ・溶液 ２５Ｍｍホウ酸塩　ｐｌ！９．５ ブロツキング溶１　＝　ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ（ジグｖＦＲＡｃＴＩＯＮ　Ｖ、 低内毒素）洗浄／試薬緩衝液：　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＢ７．４５００ｍＭ塩 化ナトリウム Ｉ　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ Ｏ１０５％トウィーン系界面活性剤２ｃｌμ／ｍｌポリミキシンＢ活性剤 （ギブコ／　Ｂ　ＲＬ、７９００　Ｕ／ｍｇ）ＢＰＩ標準（試料を小分けして、 −７０’Ｃで貯蔵）注：ＢＰＩ標準および試料はプロピレンで希釈しなけれはな らない 標準および試料の希釈 ＝未知の試料用の適切な溶液 （例えば、組織培養上澄液テストの場合は、ＲＥＭ　＋７．　！Ｊ　ｄＦＢｓｗ ｏ使用すること）基質緩衝液：　（５（１（ｌ　ｍｌを作成）２４．５ｍｇ　塩 化マグネシウム ４８ｍ１エタノールアミン ｌａｂ　Ｖ水で４００　ｍｌにメスアップｐＨを９．８の調整 Ｉａｂ　Ｖ水で５００　ｍｌにメスアップＰＮＰＰ基質錠剤（５ｍｇ／錠剤：シ グマ社）・抗体 捕捉（第一）抗体（１００μｌ／穴） Ａ、ＩＮＶＮ　］−２（ウサギポリクローナル抗ｔ：　トＢＰ　１タンパク）　 ＩｇＧ　１μｇ／ｍｌ、　またはＢ、　ＭＭ−１（兎抗Ｎ−末端２ｏアミノ酸Ｂ ＰＩペプチド）３　μｌ／ｍｌ。

レポーター（第２）抗体 Ａ、ＩＮＶＮ　ｌ　−２−ビオチン（１：１０００で使用）Ｂ、ＰＩＧ８（ＢＰ 　１のバクテリアを結合を阻止するマウスモノクローナル抗ＢＰＩ抗体） 第３（展開）試薬 Ａ、ストレプトアビジン （ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ（ＢｉｏＲａｄ社）　、　（ ］：２０００で使用）Ｂ、山羊抗つサギＩｇ／アルカリフォスファターゼ胞合体 （ＢｉｏＲａｄ社　）、（１：２０００を使用）注、少なくとも１力月前にプレ ートを彼覆し、必要吉なるまでプレートを４℃に貯蔵する。

説明したように、捕捉抗体を２５ｍＭ　ホウ酸ナトリウムｐＨ９，５（ｉ（ｌ　 ｍｌ／プレート）中に希釈する。

１００μｌを９６穴プレート（１ｍｍｕｌｏｎ−２）の各ウェルに加え、３７℃ で一晩インキュベートスる。

使用するまで冷蔵する。

２、ブロッキング コーティング用抗体をプレート外に排出する。

２００μｍの５％８ＳＡ配合ＰＢＳを各ウェルに加える。

３７℃で２−４時間または４℃で一晩インキユベートする。

洗浄液で４回洗浄し、ペーパータオルで水きりをする。

３、ＢＰＩ標準および未知標準 ２ケ月毎に、小分けした新しい標準試薬を解凍するＣ０．５　ｍｌ、１ｍｇ／ｍ ｌ）。

１、精製したＢＰＩまたはＩ００ｎｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｐ　Ｉの１ｍｌのストック溶 液を作成する。

２、下記の各標準濃度に従かう溶液５００μｍを作成する。

ｕ　Ｉ　１００　ｎｇ／ｍｌ　ＢＰＩ　ｕ希釈　最終［ＢＰＩコｎｇ５０　４５ ０　！０ １００μｍの標／＄（未知）を各穴に加え、室温にて、２−４時間あるいは、４ ℃にて一晩培養し、４回洗浄する。

４、第２抗体 最終洗浄後、プレートの水きりをしっがりして、１００μｌ　（７）ＩＮＶＮ　 １−２−　ヒオｆ　ンを１：１０００（７）割合（１０μｌを１０ｍ１の洗浄／ 試料緩衝液中にいれる）で各穴に加え、３７℃で１時間培養し、４回洗浄する。

５、第３抗体 最終洗浄後、プレートの水きりをしっかりして、１００μｍの展開試薬を各穴に 加え、３７℃で３０分培養し、４回洗浄する。

６、基質 注ニブレートに加える直前に、全基質錠剤を基質緩衝液に加える。

殻終洗Ｒｔ＆、プレートの水きりをしっかりして、１０（１μｍ０基質溶／ｉｋ 　（２（３の５ｍｇＰＮＰＰ基質錠剤／ｌ０ｍ１基質緩衝岐）を加える。

波長４０５　ｎｍで、プレートを測定する。測定とＭｊ定の間、ブし・−トを暗 所に保管する。

天然のＢＰＩ分子の幾つかの異なった性質を変えるために、幾一つかのクラスの ＢＰＩ変種を構築した。最初の構築物では、血清中でのＤＰＩ分子の半減期を延 長するように設計された。このような構築物のうちの一つにおいては、セリン３ ５１ての一つのグリコジル化部位が、１１７５位（図１２参照）の塩基々Ｊを変 える二吉によって、アラニンをコードしてＮ−り“リコシル化を支持しないよう に変えられた（即ち、表７におけるＳ　ｅ　ｒ３５１−Ａ　１　ａ　ＢＰＩ　（ 非グリコジル化））。上記塩基対の変換は、所望の配列を含むアンプライマーを 用いて、ＰＣＲ法により該分子のこの特定のセグメントを増幅し、適宜な制限酵 素部位（この場合、塩基１２０２の５ｐｈ１部分）によってＢＰ１本来のセグメ ントを修正セグメントで置換することによって達成される。このような分子はＢ ＰＩに類似した性質を有すると期待されるが、肝臓排除レセプターによって認識 されるマンノース残基を欠いているので、肝臓によって急速に除去されることは ない。他の構築物は、ＢＰＩの相同体であるＬＢＰの優れた安定性という利点が 得られるように設計された。例えば、ＬＢＰのアミノ末端の２５ｋＤａセグメン ト（内毒素結合部分と思われる）を、ＢＰＩのカルボキシル末端の３（ｌｋＤａ セグメントと結合して、ＬＢＰの大きい血清′″１を減期を有し且つＢＰＩの機 能を有するキメラ分子（即ち、表７のＬ　Ｂ　Ｐ２５Ｋ　／Ｂ　Ｐ　Ｉ　１３（ ＩＮキメラ）を構築した。

第３のタイプの構築物では、ＢＰＩの安定性を増すために、免疫グロブリンの優 れた血清安定性を利用した。ＢＰＩのアミノ末端の２５ｋＤａセグメント（ＬＰ Ｓ結合性）を、ＩｇＧの定常ドメインをコードするｃＤＮＡと結合させた。その 結果得られたキメラ分子は、現在開発中の杭内毒素抗体と同様に、内毒素と結合 してこれを不活性化することか予想される。

第２クラスの分子は、ＢＰＩタンパクの治療指標を高めるように設計された。例 えば、ＢＰＩタンパクのアミノ末端ドメインは、陽性に帯電した残基を高い比率 で（約１４％）含んでいる。幾つかの変種においては、一つ以上のアミノ末端の 陽イオン残基か、下記の方法によって中性または陰性に帯電した残基に変えられ た。このように再構築された分子は生物膜を破壊し難いことを示すので、この再 構築分子は弱陽イオン性である。また、下記に述べるＬＢＰ／ＢＰＩキメラタン パク分子（即ち、表７のＬ　Ｂ　Ｐ　２５に、　Ｂ　Ｐ　１３０にキメラタンパ ク）は、ＢＰＩに比較して、ＬＢＰのアミノ末端領域の陽イオン度が減少するた め、より低い毒性を示し得る。

第３クラスの変種では、ＢＰＩに結合する内毒素の親和性、特異性および／また は原子価を上げることが意図された。例えば、２５ｋＤａの部分内で単一の塩基 対が変化した組替えＢＰＩタンパクが製造され、ｉｎ　ｖｉｌｒｏでの内毒素と の結合能力がテストされた。鍵となる重要なアミノ酸、特に陽イオン残基の変化 は、ＢＰＩタンパクとそのリガンド、例えば内毒素との親和性を高める。また、 Ｌ　Ｂ　Ｐ２５に、／Ｂ　Ｐ　Ｉ　３０にキメラと命名されたＬＢＰ／ＢＰＩキ メラタンパク分子は、ＢＰＩの機能をもちながら、ＬＢＰの内毒素に対する親和 性をｋ　シｆｌる。他の構築物では、ＢＰＩタンパク当たり２倍量の内毒素に結 合することを期待して、第２の内毒素結合ドメインかＢＰＩに加えられた。

第４クラスの突然変異体は、ＢＰＩおよび／またはＢＰＩ／内毒素複合体と、通 常はマクロファージ活性化をダウンレギュレートするレセプターとの間の結合親 和性を変えるようにように設計された。この例には、下記に記述したｉｎ　ｖｉ ｌｒ。

突然変異によって、３０ｋＤａの部分内に単一の塩基対変化を創出された組換え ＢＰＩタンパクが包含される。ＢＰＩ２５に、／ＤＰ／ＢＰ１３０Ｋ　（表７参 照）と命名されたこの種の突然変異体の一つは、ギ酸処理によって完全な２５ｋ Ｄａ　ドメインを遊離できる変種を生み出した。

生物学的に活性なりＰＩ変種を創出するために用いられた方法は、従来技術で実 践されている標準法であった。キメラ分子を形成するために、鍵となる重要分子 に関係する部分が通常用いられる方法によって組換えられた。例えば図２６に示 すように、ＬＢＰのアミノ末端２５ｋＤａ部分が、遺伝子加工で作成されたコー ド領域内のＣ１ａ　１部位を用いて、ＢＰＩタンパクカルボキシル末端部分に結 合された。標的ｃＤＮＡの両端にハイブリダヂズして延長するに十分なりＮＡ部 分とクローニング部位とを含む、オリゴヌケレオチドアンプライマー（２５塩基 ）を標準法で化学的に合成した。次いで、これらプライマーは、ポリメラーゼ連 鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）によって所望の 遺伝子セグメントを増幅するために用いられた。この結果得られた新遺伝子セグ メントは、標準条件のもとで対応する制限酵素で消化され、ゲル電気泳動によっ て単離された。別法として、ｃＤＮＡ自身を適切な制限酵素で消化し、脱落した 遺伝子セグメントを化学合成さねたオリゴヌクレオチドで補充丈ることにより、 類似の遺伝子セグメントが製造された。これらコードディング配列セグメントを 一緒に繋ぎ合わせ、これを、コードされた配列の組換え体の製造を可能とする適 切な発現ベクター中にクローニングし７た。このようなキメラ分子の適切な発現 システムとじては、ＣＨＯ等の哺乳類細胞、酵母等の菌類、バキュロウィルス等 の昆虫ウィルス、大腸菌等のバクテリアが含まれるが、これらに限定されるもの ではない。これら夫々のシステムについて、もしｃＤＮＡ配列の中に下記の要素 が存在しなければ、それらを含む発現ベクターが有用である：即ち、その要素は 、組換クローンの選択を可能にするアンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子；ネオ マイシン耐性のような、宿主細胞での選択を可能にする第２の抗生物質耐性遺伝 子；バクテリア内での繁殖を可能にするバクテリアの複製起源；遺伝子挿入部位 の上流にある高レベルプロモータ、例えばＣＨＯ細胞のためのＭＭＴＶ、ＳＶ４ ０またはメタロチオネインプリモーター、バクテリア宿主のためのｔｒｐ、ｌａ ｃ、ｔａｃまたはＴ７のプロモーター、あるいは酵母におけるアルファー因子、 ｇａｌまたはＰＧＤＨプロモーター；Ｒ８Ｖエンハンサ−等の補乳類宿主のため の転写エンハンサ−；およびポリアゾニレ−ジョン部位のＡＡＴＡＡである。標 準培養法によって組換え細胞の均一な培養を１）だ後に、大量の組換キメラ分子 をならしｔｇ地から回収し、標準クロマトグラフ法で分析した。

例えは、上記構築物のうちの３つの構築物を、商業的に入手可能なベクターであ るｐＭａｍＮｅｏ　（Ｃ１ｏｎｌｅｃｈ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｖ、（＾ ）に組み込み、哺乳類細胞の宿主であるＤυＸＢＩの形質転換に使用した。商業 的に入手可能な試薬であるリポフエクチン（ＢＲギブコ社、Ｇａ１ｌｈｅ＋ｓｂ ｅ＋ｇ、　ＭＤ）を使用して形質転換した後に、該細胞を、ネオマイシン耐性細 胞か発現し且つ回収可能な標準組織培養培地で培養した。回収して２４時間後に 、導入遺伝子を発現している細胞を選択するために、選択剤Ｇ４１８を培地の中 に加えた。選択培地で３週間培養することによって薬物耐性の細胞プールが得ら れ、これを集密的になるまで成育させた。この時点で培地を除去し、ＥＬＩＳＡ 法によって抗ＢＰＩタンパクに対する免疫反応性の存在について試験し、また多 穴プレートにあらかじめ結合させたおいた内毒素への結合性について試験した。

ベクターもそのプロモーター領域にグルココルチコイド結合部位を含んでいるの で、幾つかの場合には、１６０ｎｍのデキサメタシンを培地に加えて発現を高め た。採取した夫々の上澄みにおけるＢＰＩタンパクの濃度を調べた。データを下 記に示す。

Ａ、　ＬＢＰ２５に／ＢＰ１３０にキメラ　４．３　７．８Ｂ、　Ｓｅ＋１３２ −　＞＾１ａＢＰｌ非糖鎖　８ｊ　１０．８Ｃ，ＢＰＩ２５に／ＤＰ／ＢＰＩ　 ３０Ｋ　３．９　３．７従って、これら３つの生物学的に活性なりＰＩ変種は、 ＣＨＯホスト中で産生きれることが示され、免疫学的には抗ＢＰＩ抗体対して交 差反応し、ＢＰＩと同様の濃度で内毒素に結合することが可能であった。濃度の 改善が得られるかを観察するために、同じベクターを別の宿主細胞系にトランス フエクトした。また、大量の組換タンパクが望まれる構築物については、これを 、ジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする遺伝子を含んたｐＳＥ等の増幅ベクタ ー中に再クローンした。

ＦＩＧＵＲＥＩＡ ＦＩＧＵＲＥＩＢ ＦＩＧＵＲε１Ｃ ＦＩＧＵＲＥＩＤ ＦＩＧＵＲＥＩＥ ＦＩＧＵＲＥ２ ＦＪＧＬｆＲε３ ｎｇ／ｍｌのリニアスケール ＦＩＧＵＲＥ　４ ＢＰＩサンドイッチＥＬＩＳＡ＋ＬＰＳ±ポリミキシンＢＰＩ □ツ　・　内毒素　−ＰＭＢ ＋　内毒素　−ＰＭＢ −一一（−−内毒素　＋ＰＭＢ ｏ−十　内毒素　＋ＰＭＢ ＦＩＧＵＲＥ５ ＦＩＧｔＪＲＥ　６ ２５ｘｌ旦脱１ｔビに込 ＡＡ、２０５　２１０　２１２ Ｉｔｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔａｒ旧 ａｍ　Ｈ２Ｓ“　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＣＡＣＣＧＴ　ＧＧＡＡＣＴ　ＣＣＴ ＡＧＧＣＧＣ５”０ＬＪＧＯ４５９： ５’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＡＴＡ　 ３’ＦＩＧＵＲＥ　７ 突然変異性プライマー ＢＰＩのＣ末端切除 凹ム店已史ηＺｕ込 ＣＯＭＰ： ３’　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＴＡＧ ＧＣＧＣ５゜０ＬＩＧＯ４８０： ５’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　 ＧＣＣ３’ＦＩＧＵＲＥ　８ 突然変異性プライマー ＢＰＩのＣ末端切除 好ましい　゛　１１１１・ ＡＡ、　−３１−２８ ０ＵＧＯ４５８： ５’　ＣＣＣＡＡＧＣＴｒ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＴ Ｇ　ＧＣＣ３’ＦＩＧＵＲＥ９ ＦＩＧＵＲＥｌｏ ＦＩＧＵＲＥ　１０　ｒｃｏｎｔ’ｄ）−１６−８−＋４７１　４４７６ 、λｖａ：ｘ５ｏ２５ｓ；２　Ｂａｅ三工三位部位　：　Ｓｍａｌ、　Ｐｓｉ、 　ＢｇｌｒＩ、　ＸｂａＪ、　Ｓｓｔ工上記の核酸配列は、Ｖ、Ａ、Ｌｕｃｋｏ ｗによって決定された。

ＦＩＧＬＪＲε１１ ＦＩＧＵＲε１２ ＦＩＧＵＲＥ　１２　（ｃｏｎｔ’ｄ）（−ａ：＜：Ｊ−１の一一騙）１．００ ＠　ＬＬＩ　−Ｃ／）　＊　！１１：　）　（５ＣＬ　Ｊ　ｗ　＞　ＦＩＧＵＲ ε１３〉×ローーψ％ｔ＞１ロ１ψ くＯゴ！ローｔＵＺ親く輩 上−の−く工（Ｊ−Ｚ）−←＝ 口＜＞２φ〉〉ローＺｌ−こ −（１く一工Ｏ＜工Ｌ　Ｊ　し くトω２の〉の＞　ｚ　ＬＬ　Ｏ：Ｉ−〉Ｃ５＞の：Ｉの２ψ騙洲１の 一〇＝−Φ２ス０φ０％ｔ（ 〉ａＱψ騙−ソー＞ψφの ：ＩＯ５輩Ｌ−＝Ｚ’を一一一〉 −くΦｙｃ＋５０ご一一〇×＝ Ｃｌ５　＞　Ｊ−一〇−〕Φ−シー ）　Ｏｘ　（Ｃｌ　Ｏ（Ｊ　＜　＞　％ｔ＞　−。

（−ソ＞ｕ＋ψｒＡ九ｊ〉ゴー Ｉ：ｅローｚｚｃａｗ−０２ｏｘ −×！工Φ（Ｊ　−＋　）　Ｃｍ口） ＜Ｏｕ、、＞（１５＋−＊ｃｏｏａ：ｚ２ψ’／）ｘ：ｉ−輩ＬＬ　ｕ　ニー（ Ｌローロの×ト−（←く←１ ら＝の一一九騙龜田くゴＸ ｅｌ　＞　＞　ＯＬ　％ｔｗ　Ｏ＜　ＣＬ　＊　＊　Ｌ＝〉口ｔＡｃｅ（！ｌσ −）−ＬＬ　−＜　＞く〉龜の輩ψ−％ｔヒ田〉〉１ ：ＩＣ−Ｌ　Ｏ）−一のく：ＩΦ−− ＺＩＬソーく良沸ψ−〉く九− ＬＬＩ　２−０　＊　Ｚ　（ｊ　＞　（Ｌ　（Ｌ　ｕｌ　−ＣＤａ：　＞　ｅｅ 　ＬＬ　３の〉の（ＣＬ　ＯＬＬ　＋−ゴ＜７ｕｕソＯ輩Ｚ＞（）−１−（Ｌ く−工（ｊ　−ＶＪ　１−− ＞　、　。＋　＋１　、　、　＞ＦＩＧＵＲＥ　１４（ａ；！ローＬＬＩｚ （ｊ＜）−２（１）））（ｊ −（電く一工ａく くトリ２の〉の〉 ＞ａ＞ｃｎｌｕ”ｒｚｕ） −Ｏｚ　−（ｘｌ　Ｚ　：ｉ口 〉ｏＱの一一×− ：ＩＶＪ　ｚ　Ｌ−工２！ Ｊ　＜　Ｃ５ｚのＣｎ匡← ＣｆＪ　＞　−Ｊ−の−ゴ 〉口：Ｃ５００＜＞ １−Ｗ）ＬのＣｆ）こ Ｃ！＋！％ｔＩＬロローー ＜ＯＬ）ψトｘＯ ２φす：Ｉ：Ｉ−％ｔ１ Ｑ−ロのｘｌ−ニジ （Ｌ！：の−１龜１賑 口＞　＞　Ｏｗ　ｇ−〇 匡〉口のａ：ＣＪσ− ＜〉Ｑ＋ψＸのｍ× ：Ｉローー０トーφ ２１に−＜　（Ｌ　Ｂψ ｗｚ−Ｏｘｚ（ｊ＞ｃｃ （！：　：）　Ｑ：　Ｌ　３φ〉のく ス（′ｔｕ＋７Φ！２〉 ＦＩＧＵＲＥ１５ ＦＩＧＬＩＲＥ１６ 鑵曙１５Ｗ）目：　［Ｌ　Ｌ　ＯＮ！（転）ＦＩＧＵＲＥ１７ ×　州　律 ＦＩＧＵＲＥ　１８ ＢＰＩ　血清半減期 ＦＩＧＵＲＥ１９ ＦＩＧＵＲＥ　２０ ＦＩＧＵＲＥ　２１ ｍμ ＦＩＧＵＲＥ２２ ＦＩＧＵＲＥ２３ ＦＩＧＵＲＥ　２４ ＦＩＧＵＲＥ２５ ＦＩＧＵＲε２６ ５Ｗｆ１１　市市市　ｔｌぎ　詩　ゴ　ロ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８ ４条の８）平成５年２月１５日

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．ＢＰＩタンパクおよび陰イオン性化合物を含有する組成物であって、（１） 殺菌活性を示さず、且つ（２）内毒素中和活性を示す組成物。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の組成物であって、前記陰イオン性化合物が血清ア ルブミンである化合物。
3. ３．生物学的に活性なＢＰＩの変種であって、（１）内毒素に対して特異的に結 合し、（２）内毒素への結合に関してＢＰＩタンパクと競合し、（３）内毒素に 誘発された死亡を阻害するＢＰＩ変種。
4. ４．請求の範囲第５項に記載の生物学的に活性なＢＰＩの変種であって、図２３ に示されるＢＰＩ変種。
5. ５．請求の範囲第５項に記載の生物学的に活性なＢＰＩの変種であって、図２４ に示されるＢＰＩ変種。
6. ６．組換えＢＰＩタンパクを細胞内で産生し、細胞から分泌させる方法であって 、（ａ）ＢＰＩタンパクをコードするＤＮＡを有するベクターを構築することと 、（ｂ）該ベクターで細胞を形質転換することと、（ｃ）こうして形質転換され た細胞を、組換えＢＰＩタンパクが分泌されるような条件下に培地中で培養する こととを具備する方法。 この発明に従えば、該ベクターは、更にシグナル配列を具備する。
7. ７．バクテリア細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法であって、（ａ） シグナル配列をもたず、且つＢＰＩタンパクをコードするＤＮＡを有するベクタ ーを構築することと、（ｂ）該ベクターでバクテリア細胞を形質転換することと 、（ｃ）こうして形質転換されたバクテリア細胞を、組換えＢＰＩタンパクが産 生されるような条件下において培地中で培養することとを具備する方法。
8. ８．昆虫細胞から組換えＢＰＩタンパクを製造する方法であって、（ａ）ＢＰＩ タンパクをコードするＤＮＡを有するベクターを構築することと、（ｂ）該ベク ターで昆虫細胞を形質転換することと、（ｃ）こうして形質転換された昆虫細胞 を、組換えＢＰＩタンパクが分泌されるような条件下において培地中で培養する こととを具備する方法。
9. ９．請求の範囲第６項、第７項または第８項に記載の方法によって製造された組 換えＢＰＩタンパク。
10. １０．グリコシル化されている、請求の範囲第６項に記載の組換えＢＰＩタンパ ク。
11. １１．グリコシル化されていない、請求の範囲第７項に記載の組換えＢＰＩタン パク。
12. １２．対象から得たサンプル中の内毒素の量を測定する方法であって、内毒素− ＢＰＩタンパク複合体が形成されるような条件下に、該サンプルをＢＰＩタンパ クと接触させることと、こうして形成された複合体の量を測定することにより、 サンプル中の内毒素の量を決定することとを具備した方法。
13. １３．対象から得た、既結合内毒素及び未結合型内毒素を含有するサンプル中の 内毒素の量を測定する方法であって、（ａ）前記内毒素が結合しているかもしれ ない内毒素結合性タンパクを変性して、未結合内毒素を得るように前記サンプル を処理することと、（ｂ）この処理されたサンプルを、ＢＰＩタンパクが前記ス テップ（ａ）の未結合内毒素に結合して、内毒素−ＢＰＩタンパク複合体が形成 されるような条件下に、ＢＰＩタンパクと接触させることと、（ｃ）こうして形 成された複合体の量を測定することにより、サンプル中の内毒素の量を決定する こととを具備した方法。
14. １４．請求の範囲第１３項に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）の変性が 、温度を上昇することによって行なわれる方法。
15. １５．請求の範囲第１３項に記載の方法であって、前記上昇された温度が９５℃ である方法。
16. １６．請求の範囲第１３項に記載の方法であって、前記ステップ（ａ）の変性が 酸を用いて行なわれる方法。
17. １７．サンプル中の内毒素を検出する方法であって、前記内毒素がＢＰＩタンパ クと結合して両者間の複合体を形成するように、該サンプルをＢＰＩタンパクと 接触させることと、この複合体を検出することとを具備する方法。
18. １８．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、サンプルを検出可能なラベル 成分でラベルされたＢＰＩタンパクと接触させるに先立って、サンプル中の内毒 素が支持体に付着されるような条件下で、内毒素を含有するサンプルが適切な支 持体上に移される方法。
19. １９．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記サンプルが、血清、尿、 血液、組織抽出物または唾液である方法。
20. ２０．対象における内毒素血症を診断するための方法であって、該対象から生物 学的流体サンプルを得ることと、請求の範囲第１７項に記載の方法を用いてこの ようなサンプル中の内毒素を検出することにより、該疾患を診断することとを具 備する方法。
21. ２１．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記サンプルが細胞性サンプ ルである方法。
22. ２２．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記サンプルが生物学的流体 サンプルである方法。
23. ２３．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記ラベル成分が蛍光ラベル であり、検出がフルオロメータによって行なわれる方法。
24. ２４．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記ラベル成分が放射性ラベ ルであり、検出がラジオグラフによって行なわれる方法。
25. ２５．請求の範囲第１７項に記載の方法であって、前記ラベル成分が酵素であり 、検出がスペクトロフォトメータによって行なわれる方法。
26. ２６．ＢＰＩタンパクが内毒素と複合体を形成するように、外科用具をＢＰＩタ ンパクでコーティングする方法であって、ＢＰＩタンパクを、生物学的サンプル と接触するように設計された前記外科用具の表面に付着させることを具備した方 法。
27. ２７．ＢＰＩタンパクが内毒素との複合体を形成するように、埋込み可能な侵襲 的デバイスをＢＰＩタンパクでコーテイングする方法であって、ＢＰＩタンパク を、生物学的サンプルと接触するように設計された前記デバイスの表面に付着さ せることを具備した方法。
28. ２８．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが血液 である方法。
29. ２９．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが組織 サンプルである方法。
30. ３０．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが筋肉 サンプルである方法。
31. ３１．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが軟骨 である方法。
32. ３２．請求の範囲第２７項に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが骨で ある方法。
33. ３３．請求の範囲第２６項に記載の方法であって、前記外科用具がカテーテル管 である方法。
34. ３４．請求の範囲第２６項に記載の方法であって、前記外科用具が外科用ステー ブルである方法。
35. ３５．請求の範囲第２６項に記載の方法であって、前記デバイスが外科用インプ ラントである方法。
36. ３６．内毒素を含有する流体から、これを対象に投与する前に汚染物を除去する 方法であって、投与に先立って、内毒素がＢＰＩタンパクと複合体を形成するよ うな条件下で前記流体をＢＰＩタンパクと接触させ、これにより前記流体から汚 染物を除去することを具備した方法。
37. ３７．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が血液である方法。
38. ３８．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が血漿である方法。
39. ３９．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が血清である方法。
40. ４０．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が等張溶液である方 法。
41. ４１．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が薬学的製剤である 方法。
42. ４２．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が細胞培養剤である 方法。
43. ４３．請求の範囲第３６項に記載の方法であって、前記流体が骨髄である方法。
44. ４４．生物学的流体サンプル中におけるＢＰＩタンパクの存在を検出するための キットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合する、検査用緩衝液中のポリ ミキシンＢと、（ｂ）（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し、且つ（２）内 毒素結合ドメインについてＢＰＩタンパクと競合しない、検査用緩衝液を含む表 面に付着された第一抗体と、（ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの結合について前記 第一の抗体と競合せず、且つ（２）内毒素結合部位またはその近傍でＢＰＩタン パクと特異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第二抗体とを具備し、 前記生物学的流体サンプルが前記第一抗体および第二抗体と接触したときに、前 記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタンパクが前記第一抗体および 第二抗体によって捕捉され、第一抗体／ＢＰＩタンパク／第二抗体の複合体が形 成され、この複合体を検出することによって前記生物学的流体サンプル中のＢＰ Ｉタンパクを検出するキット。
45. ４５．生物学的流体サンプル中におけるＢＰＰＩタンパクの量を測定するための キットであって、（ａ）未結合の内毒素分子に結合するポリミキシンＢを含有す る検査用緩衝液と、（ｂ）（１）活性ＢＰＩタンパクの一部に結合し、且つ（２ ）内毒素結合ドメインについてＢＰＩタンパクと競合しない、前記検査用緩衝液 を含んだ表面に付着された第一抗体と、（ｃ）（１）ＢＰＩタンパクとの結合に ついて前記第一の抗体と競合せず、且つ（２）内毒素結合部位またはその近傍で ＢＰＩタンパクと特異的に結合する、検出可能な成分でラベルされた第二抗体と を具備し、前記生物学的流体サンプルが前記第一抗体および第二抗体と接触した ときに、前記生物学的流体サンプル中に含まれる活性ＢＰＩタンパクが前記第一 抗体および第二抗体によって捕捉され、第一抗体／活性ＢＰＩタンパク／第二抗 体の複合体が形成され、この複合体を検出して、前記生物学的流体サンプル中の 活性ＢＰＩタンパクの量を測定するキット。
46. ４６．対象における内毒素血症を防止する方法であって、対象に対して、内毒素 に結合して対象における内毒素血症を防止するために有効な量のＢＰＩタンパク を投与することを具備した方法。
47. ４７．請求の範囲第４６項に記載の方法であって、前記ＢＰＩの有効量が、前記 対象の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１０ｍｇである方法。
48. ４８．請求の範囲第４７項に記載の方法であって、前記有効量が、前記対象の体 重１ｋｇ当たり、約１〜約１０ｍｇである方法。
49. ４９．内毒素血症にかかった対象を治療する方法であって、対象に対して、内毒 素に結合して内毒素血症にかかった対象を治療するために有効な量のＢＰＩタン パクを投与することを具備した方法を。
50. ５０．請求の範囲第４９項に記載の方法であって、前記ＢＰＩの有効量が、前記 対象の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１０ｍｇである方法。
51. ５１．請求の範囲第５０項に記載の方法であって、前記有効量が、前記対象の体 重１ｋｇ当たり、約１〜約１０ｍｇである方法。
52. ５２．請求の範囲第５項に記載の生物学的に活性な変種であって、図２５に示す 変種。