DE3856588T2

DE3856588T2 - Biologisch-aktive Bakterizide/permeabilitätserhöhende Proteinbruchstücke

Info

Publication number: DE3856588T2
Application number: DE3856588T
Authority: DE
Inventors: Peter New York Elsbach; Jerrold New York Weiss
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1987-08-11
Filing date: 1988-08-09
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2008-08-10
Also published as: JP2000139484A; EP0375724A4; CA1341525C; EP0375724B1; EP1659132A1; ATE312844T1; ATE123291T1; EP0375724A1; US5980897A; DE3853918T2; WO1989001486A1; EP0652230B1; DE3853918D1; EP0652230A1; DE3856588D1; JP3086685B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung ist eine continuation-in-part Anmeldung der parallel anhängigen gemeinschaftlich übertragenen US-Patentanmeldung Serien Nr. 084.335, eingereicht am 6. August 1987 durch Peter Elsbach und Jerrold Weiss.
Die Regierung der Vereinigten Staaten hält Rechte an dieser Erfindung aufgrund des Forschungsstipendiums mit den Nummern DK-05472 und AI-18571 des National Institute of Health inne.
Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch aktive Polypeptidfragmente von bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Säuger-Proteinen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Fragmente.
Das bakterizide/pemeahilitätserhöhende Protein (BPI) ist ein Protein von 50 bis 60 kDa, das aus den Granulae von polymorphkernigen Leukozyten (PMN) von Säugern isoliert wurde, die für die Abwehr von eindringenden Mikroorganismen in Säugern essentielle Blutzellen sind, BPI kommt nur in Zellen der myeloischen Reihe von Blutzellen vor, wird im promyelocytischen/myelocytischen Differenzierungsstadium produziert und ist in den primären Granulae in diesen Zellen vorhanden.
BPI ist ein stark wirksamer bakterizider Wirkstoff, der gegen ein breites Spektrum von Gramnegativen bakteriellen Arten aktiv ist. Es zeigt einen hohen Grad an Spezifität in seiner zytotoxischen Wirkung, d.h. da5 10–40 nM (0.5–2.0 Mikrogramm) mehr als 90% von 107 sensitiven Bakterien abtöten, wogegen eine 100-fach höhere Konzentration von BPI für andere Mikroorganismen und eukaryontische Zellen nicht toxisch ist. Alle verfügbaren Hinweise legen nahe, dass in intakten PMN und in Leukozyten-Rohfraktionen BPI der wichtigste Sauerstoffunabhängige Wirkstoff ist, der gegen BPI-sensitive Bakterien aktiv ist Sowohl von menschlichen als auch Kaninchen-PMH isoliertes BPI wurde bis zur Homogenität gereinigt. Das Molekulargewicht von menschlichem BPI ist annähernd 58,000 Dalton (58 kDa), und das Kaninchen-BPI ist annähernd 50 kDa. Die Aminosäurezusammensetzung dieser zwei Proteine ist sehr ähnlich, wie auch die Aminosäuresequenz ihrer ersten 15 NH₂-terminalen Aminosäurereste. Beide Proteine sind stark basisch, mit einem isoelektrischen Punkt, der größer als 9,6 ist.
Die biologischen Wirkungen von BPI erfordern die Anlagerung des Proteins an die Oberfläche von empfänglichen gram-negativen Bakterien. Die anfängliche Bindung von BPI an Zielzellen schließt elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem basischen Protein und den negativ geladenen Stellen der Lipopolysaccharide (LPS) auf der bakteriellen äußeren Membran ein und führt zu einer Aktivierung von bakteriellen Enzymen, die Phospholipide und Peptidoglykane abbauen. Das endgültige Stadium der Wirkung ist das eigentliche Abtöten der Bakterien durch einen bis jetzt unbekannten Mechanismus. Die sehr ähnliche Aminosäurezusammensetzung und die nahezu identischen bakteriziden und Membran-zerstörenden Eigenschaften von BPI, das von menschlichen und Kaninchen-PMN gereinigt wurde, legen nahe, daß dieses Protein wahrend der Evolution hochkonserviert worden ist und ein wichtiges Mitglied des anti-bakteriellen Arsenals von Säuger-PMN ist.
Aufgrund seiner starken bakteriziden Wirkung gegenüber gram-negativen Bakterien und dem Mangel an Zytotoxizität gegenüber anderen Mikroorganismen und eukaryotischen Zellen, wird in Betracht gezogen, BPI als chemotherapeutischen Wirkstoff und/oder als ein Modell für den Entwurf von neuen antibiotischen Wirkstoffen zu verwenden. Jedoch wurden sowohl die Sequenzierung wie auch die Bestimmung der strukturellen Organisation von BPI (nachstehend wird das vollständige BPI-Molekül als Holoprotein bezeichnet) aufgrund seines großen Molekulargewichtes (58 kDa für das menschliche Holoprotein) behindert. Es wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, daß BPI, wie im Falle anderer zytotoxischer Proteine, eine strukturelle Organisation besitzt, bei der sich die verschiedenen Funktionen, namentlich die Bindung, die Hüllenveränderung und das Abtöten, in verschiedenen Domänen innerhalb des BPI-Moleküls befinden. Obwohl BPI-Fragmente, die durch Spaltung des Holoproteins mit dem proteolytischen Enzym Elastase erhalten wurden, offenbart wurden [Weiss, J., et al., clin. Res. 34 (1986), 537A), blieben die untersuchten Fragmente unter den angewendeten nichtdenaturierenden Bedingungen verbunden. Keines der isolierten Fragmente wies biologische Aktivität auf. Überdies erkannten gegen das Holoprotein gerichtete Antikörper diese Frag mente unter denaturierenden Bedingungen nicht, wenn sie unter Verwendung des gut bekannten Western-Blot-Verfahrens analysiert wurden.
Deswegen besteht angesichts des vorstehend Genannten auf dem Fachgebiet ein Bedarf an biologisch aktiven Peptidfragmenten von BPI für die Verwendung als bakterizide/permeabilitätserhöhende Wirkstoffe sowie als therapeutische Wirkstoffe. Solche Fragmente werden auch benötigt, um Sequenzinformationen über BPI bereitzustellen, um den Entwurf von zukünftigen Generationen von antimikrobiellen Wirkstoffen zu lenken, die spezifisch für gram-negative Bakterien sind, und um als Sonden für die molekulare Organisation der Holoproteine verwendet zu werden.
Aufgaben der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, biologisch aktive Peptidfragmente von Säuger-BPI bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, biologisch aktive Peptidfragmente von Säuger-BPX mit verbesserter antimikrobieller Wirksamkeit bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung von biologisch aktiven Peptidfragmenten von Säuger-BPI bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Behandlung von Säugern vorzusehen, die an durch gram-negative Bakterien verursachten Infektionen leiden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Erhöhung der Permeabilität von gram negativen Bakterien bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Wirksamkeit von gegen gram-negative Bakterien gerichteten Wirkstoffen zu erhöhen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann angesichts der vorliegenden Beschreibung, der begleitenden Ansprüche und der beigefügten Abbildungen augenscheinlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben unerwarteterweise biologisch aktive Fragmente von Säuger-BPI entdeckt, die wesentlich kürzer in der Länge als das native BPI-Protein sind. Obwohl diese Fragmente wesentlich kleiner als das native Molekül sind, behalten sie, zumindest im wesentlichen, alle bakteriziden und permeabilitätserhöhenden Eigenschaften des intakten Proteins.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine gereinigte isolierte DNA-Sequenz bereitgestellt, die für ein Polypeptid kodiert, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichtes des bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Proteins (BPI) aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins stammt, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI behält. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die DNA-Sequenz wie in 5 gezeigt das Polypeptid vom Aminosäurerest 1 bis 210–220, und in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz der Erfindung ausgewählt aus (a) einer DNA-Sequenz, die, wie in 5 gezeigt, die Sequenz vom Nukleotid 123 bis 759–780 aufweist, oder (b) dem Komplement der DNA-Sequenz von (a), oder (c) einer DNA-Sequenz, die an die DNA-Sequenz von (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch ein Expressionsvektor bereitgestellt, der eine darin inserierte DNA-Sequenz der Erfindung aufweist und eine Zelle, die mit dem Vektor transformiert oder transfiziert wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichtes des BPI aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins stammt, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI behält, und wobei das Verfahren die Schritte von Inserieren einer DNA der Erfindung in einen Expressionsvektor und Transformieren oder Transfizieren einer Zelle mit dem Expressionsvektor umfasst, um das Polypeptid herzustellen.
Gemäß einem weiteren Gesichtpunkts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereitgestellt, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichtes des BPI aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins stammt, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI behält, und wobei das Verfahren die Schritte von Spalten durch Inkubieren des BPI-Holoproteins in Anwesenheit von Serinproteasen und Zurückerhalten des Polypeptids umfasst, wobei das BPI-Holoprotein bei einem pH-Wert im Bereich zwischen etwa 6.0 und etwa 8.0 und bei einer Temperatur zwischen etwa 20°C und etwa 37°C für einen Zeitraum von etwa 16 bis 24 Stunden inkubiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das, wie in 5 gezeigt, die Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 210–220 aufweist.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zur Behandlung von Säugern offenbart, die an von gram-negativen Bakterien verursachten Infektionen leiden, wobei es das Verabreichen einer gegen gram-negative Bakterien gerichteten bakterizid wirksamen Menge von mindestens einem der vorstehend erwähnten biologisch aktiven BPI-Fragmente an Säuger, die eine solche Behandlung benötigen, umfasst. Gemäß dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit bereitgestellt, die durch gram-negative Bakterien im Säuger hervorgerufen wird.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Formulierungen für die Behandlung von durch gram-negative Bakterien verursachten Infektionen bei Säugern bereit, umfassend ein Polypeptid der Erfindung oder ein pharmazeutischakzeptables Salz davon und ein pharmazeutisch akzeptables Lösungsmittel oder Träger.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein in vitro Verfahren zur Erhöhung der Permeabilität von gram-negativen Bakterien bereit, das die Inkubation der Bakterien mit einem Polypeptid der Erfindung umfasst.
Unter noch einem weiterem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein in vitro Verfahren zur Abtötung von gram-negativen Bakterien bereit, das den Kontakt der gramnegantiven Bakterien mit einem Polypeptid der Erfindung umfasst.
Auch offenbart ist ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit von gram-negativen bakteriziden Wirkstoffen in Säuger, die solche Behandlungen benötigen, das die gleichzeitige Verabreichung solcher Wirkstoffe mit biologisch aktiven Fragmenten von BPI umfasst.
Gemäß diesem Gesichtspunkt wird die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung bereitgestellt, zur Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen Behandlung einer durch gramnegativen Bakterien hervorgerufenen Erkrankung im Säuger, mit einem anderem anti-gramnegativen bakteriziden Wirkstoff, der aus einem Antibiotika, Immunsystem-Zelle oder Faktor, wie zum Beispiel T-Zelle oder Interleukin-2, einem zytotoxischen Wirkstoff oder einer Mischung davon ausgewählt ist.
Gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung wird weiterhin die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung bereitgestellt, zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Antibiotikums zur Behandlung einer durch gram-negative Bakterien hervorgerufenen Krankheit.
Gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung wird außerdem die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung bereitgestellt, zur Herstellung eines Medikaments zur Abnahme der Resistenz von gram-negativen Bakterien gegen Antibiotikum.
Es wird eine gereinigte, isolierte DNA-Sequenz offenbart, die die in 5 dargestellte Sequenz oder ihren komplementären Strang und DNA-Sequenzen aufweist, die unter stringenten Bedingungen mit diesen DNA-Sequenzen hybridisieren. Die DNA-Sequenz kodiert für menschliches bakterizides/permeabilitätserhöhendes Protein.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 stellt eine Photographie eines gefärbten SDS-PAGE Gels dar, das die Herstellung und Reinigung des menschlichen BPI-Fragmentes von Beispiel 2 zeigt.
2 stellt ein Diagramm dar, das das chromatographische Verhalten von menschlichem BPI-Holoprotein (a) und des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragments von Beispiel 2 (b) in Umkehrphasen-HPLC zeigt.
3 umfasst eine Reihe von Diagrammen, die die biologischen Aktivitäten des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragmentes von Beispiel 2 und des Holoproteins gegenüber E. coli J5 ver gleicht. (A) bakterizide Aktivität; (B) Wirkung auf die bakterielle Proteinsynthese; (C) Permeabilitätserhöhende Aktivität; und (D) Phospholipase-Aktivierung.
4 stellt ein Diaqram dar, das die bakterizide Wirkung des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragmentes von Beispiel 2 und des Holoproteins auf E. coli 0111:B4 vergleicht.
5, untere Zeile, zeigt die Sequenz der cDNA, die menschliches BPI kodiert, wogegen darüber die entsprechende Aminosäuresequenz gedruckt ist. Die zwei möglichen Glycosylierungsstellen sind mit einem Strich gekennzeichnet.
6 stellt ein Autoradiogramm einer Northern-Blot-Analyse von menschlicher BPI-mRNA dar.
7 stellt ein Autoradiogramm einer Southern-Blot-Analyse von menschlicher genomischer DNA unter Verwendung einer BPI-cDNA-Sonde dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die hier genannten Erfinder haben unerwarteterweise, biologisch aktive, aus Säuger-PMN isolierte Fragmente von BPI entdeckt. Eine NH₂-terminale Aminosäuresequenz-Analyse zeigte, daß im Falle von menschlichem BPI das Fragment einen Teil des BPI-Moleküls darstellt, das dem NH₂-Terminus nächstgelegen ist, wie in Beispiel 3 nachstehend gezeigt. Das Fragment besitzt alle antibakteriellen und Membranpermeabilitätserhöhenden Funktionen, die in dem vollständigen Molekül enthalten sind, ist aber wesentlich kleiner (d.h. hat ein geringeres Molekulargewicht) als das Holoprotein. „Wesentlich kleiner" wird hier so definiert, daß es etwa die Hälfte der Größe des Holoproteins besitzt. Dies ist eine äußerst überraschende Entdeckung, da im Falle von anderen, zellulären Toxinen und Proteinen das vollständige Molekül notwendig ist, um ihre biologischen Wirkungen vollständig zu zeigen. Untersuchungen einer großen Vielfalt von bakteriellen und Pflanzenzytotoxinen, wie Diphterietoxin, Choleratoxin und Ricin (Toxine, die nicht die einzigartige Spezifität des BPI-Holoproteins zeigen), haben zum Beispiel ergeben, daß individuelle Funktionen, wie die Bindungs- oder katalytische Aktivität, durch isolierte Fragmente gezeigt werden können, aber daß die Zytotoxizität (die sowohl die Bindung an die Zellmembran wie auch die intrazelluläre toxische Aktivität umfasst) im wesentlichen das vollständige Molekül erfordert.
Die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, sind so wirksam gegenüber rauen E. coli wie das Holoprotein, wirksamer als das Holoprotein gegenüber den allgemein resistenteren glatten E. coli (auf molarer Basis) und behalten die Spezifität des Holoproteins gegenüber gram-negativen Bakterien bei. Dies ist eine besonders wichtige Entdeckung, da gram-negative glatte Bakterien (die Glätte ist auf die Gegenwart von längeren LPS-Ketten in der bakteriellen Zellmembran zurückzuführen) im allgemeinen pathogener als ihre entsprechenden rauhen Gegenstücke sind.
Die unterschiedliche Größe, das chromatographische Verhalten (1 und 2 nachstehend), die Aminosäurezusammensetzung (Tabelle 1 nachstehend) und die Wirksamkeit (vgl. Beidpiel 4 nachstehend) legen deutlich fest, dass das hier offenbarte BPI-Fragment eine molekulare Einheit ist, die sich von dem Holoprotein unterscheidet.
Nicht-begrenzende Beispiele der BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, umfassen annähernd 25 kDa für menschliches und Kaninchen-BPI. Das hier offenbarte menschliche 25 kDa-Fragment wurde anfänglich nach Langzeitlagerung (z.B. zwei Monate) des gereinigten Holoproteins in einem schwach sauren Puffer (10 mM Ammoniumacetat, pH 4.6) isoliert, und kann so hergestellt werden. Jedoch ist es vorzuziehen, die BPI-Fragmente durch Inkubation des Holoproteins in einem geeigneten Puffer herzustellen, d.h. einem Puffer, der eine genügend große Pufferkapazität bei Konzentrationen zwischen etwa 10 und 150 mM bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6.0 bis etwa 8.0 aufweist, wie Tris/HCl, Phosphat und vorzugsweise HEPES/NaOH (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) oder Gemischen davon. Der bevorzugte pH-Wert ist 7.4. Die Inkubationen können innerhalb eines größeren Zeitraumes im Bereich von etwas 16 bis 24 Stunden und vorzugsweise 18 Stunden bei einer Temperatur m Bereich von etwa 20°C bis etwa 37°C und vorzugsweise 37°C durchgeführt werden. Eine besonders bevorzugte Bedingung umfaßt die Inkubation in 0.1 M HEPES/NaOH-Puffer, pH 7.4 für 18 Stunden bei 37°C. Dies hat zur Umwandlung von etwa 50% des Holoproteins in die biologisch aktiven Fragmente geführt. Reinkubation des gewonnenen Holoproteins unter diesen Bedingungen führt wiederum zur Bildung des 25 kDa-Fragmentes.
Die BPI-Holoproteine, die als Ausgangssubstanzen für die Herstellung von biologisch aktiven Fragmenten verwendet wurden, können aus Säugerzellen der myeloischen Reihe der Blutzel len, wie PMN, erhalten werden. Obwohl die Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, nicht auf spezielle Säugerarten begrenzt sind, werden vorzugsweise solche Fragmente verwendet, die von homologen Säugerarten isoliert wurden, wenn bakterielle, durch gram-negative Bakterien verursachte Infektionen behandelt werden.
Zusätzlich können das BPI-Holoprotein und/oder die biologisch aktiven Fragmente unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken erhalten werden, wobei die Sequenzinformation verwendet wird, die nachstehend in Beispiel 3 dargestellt ist, um DNA-Sonden für die Entdeckung von BPI-kodierenden DNA-Sequenzen in komplementärer DNA oder genomischen Genbanken unter Verwendung auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren zu synthetisieren. Das Gen, das das BPI-Holoprotein kodiert oder ein Teil des Gens, das das erfindungsgemäße 25 kDa-Fragment (und gegebenenfalls kleinere biologisch aktive Fragmente davon) kodiert, kann in einen für die Herstellung biologisch aktiver Polypeptide geeigneten Expressionsvektor inseriert werden.
In einer Ausführungsform kann menschliches BPI-Holoprotein aus PMN, isoliert aus normalen Blutzellen oder aus dem Blut von Patienten mit chronischer myelocytischer Leukämie, wie in Beispiel 1 nachstehend ausführlich erläutert, erhalten werden. Alternativ kann menschliches BPI aus der menschlichen Leukämiezellinie HL-60 (erhältlich als ATCC CCL 240, American Type Culture Collection, Rockville, MD) extrahiert werden. Bei der letzteren wurde gefunden, dass sie annähernd 10 Mikrogramm BPI-Holoprotein in 10⁸ Zellen enthält. Reife PMN von entweder normalen oder leukämischen Ursprung enthalten annähernd 60 Mikrogramm BPI-Holoprotein in 10⁸ Zellen und sind deswegen das bevorzugte Ausgangsmaterial.
Sobald erhalten können die Säuger-PMN zum Beispiel unter der Verwendung von Verfahren, die nachstehend in Beispiel 1 ausführlich erläutert werden, fraktioniert werden, um primäre Granulae zu erhalten (oder alternativ durch Extraktion der Gesamtzellen mit 0.16 N Schwefelsäure, wie in Elsbach, P., et al., J. Biol. Chem. 254 (1979), 11000, beschrieben). Solche primären, von PMN oder leukämischen Zellinien isolierten Granulae enthalten die Hauptmenge an BPI-Holoprotein-Aktivität. Das BPI-Holoprotein kann dann unter Verwendung jeder beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten Technik, die ein biologisch aktives Holoprotein ergibt, extrahiert und gereinigt werden. Obwohl die von solchen primären Granulae erhaltenen Rohextrakte als Ausgangsmaterial für die Herstellung von BPI-Fragmenten verwendet werden können, wird das Holoprotein vorzugsweise vor Herstellung der Fragmente gereinigt.
Bevorzugte Extraktions- und Reinigungstechniken für menschliche und Kaninchen-BPI-Holoproteine sind in Beispiel 1 nachstehend beschrieben.
Die Mengen an anfänglichem gereinigten BPI-Holoprotein, die für die erfindungsgemäße Anwendung verwendet werden sollen, sollten vorzugsweise wenigstens 200 Mikrogramm gereinigten Holoproteins betragen. Obwohl es möglich ist, kleinere Mengen an Material zu verwenden, kann das aufgrund nicht-spezifischer Verluste die Gewinnung von biologisch aktiven Fragmenten behindern, wie das für viele andere biologisch aktive Proteine, wie Interferone gilt.
Obwohl eine Bindung an irgendeine Theorie des Ablaufs der vorliegenden Efindung nicht gewünscht ist, nimmt man an, dass die Spaltung des Holoproteins zur Herstellung der biologisch aktiven Fragmente auf die Gegenwart von Serinproteasen zurückzuführen ist.
Die Spaltbedingungen für das Protein, die für die Herstellung von biologisch aktiven BPI-Fragmenten notwendig sind, liegen innerhalb der pH-, der Temperatur- und der Zeitoptima solcher Serinproteasen, d.h, pH-Wert 6.0–8.0, 20°C–37°C, 16–24 Stunden. Eine solche Inkubation des BPI-Haloproteins führt zu einer Spaltung bei etwa 25 kDa vom NH₂-Terminus des Holoproteins.
Die biologisch aktiven BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, können für die Behandlung von Säugern verwendet werden, die an von gramnegativen Bakterien verursachten Krankheiten, wie Bakteriämie oder Sepsis, leiden. Ihrer außergewöhnlichen Selektivität und dem Fehlen von Zytotoxizität gegenüber Zellen, die keine gram-negativen Bakterien sind, ist es zuzuschreiben, dass die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, als spezifische therapeutische Wirkstoffe besonders wertvoll sind. Gegenwärtig werden durch gram-negative Bakterien verursachte Infektionen, wie solche, die von Escherichia coli, verschiedenen Arten von Salmonella, Klebsiella oder Pseudomonas verursacht werden, mit Antibiotika, wie Penicillin-Abkömmlingen, Aminoglycosiden und Chloramphenicol behandelt. Die Wirksamkeit der Antibiotika ist aufgrund der Tatsache beschränkt, dass gram-negative Bazillen dazu neigen, eine bedeutende natürliche Resistenz gegenüber vielen, gegenwärtig verfügbaren Antibiotika zu zeigen und leicht weitere Resistenz aufgrund des Erwerbs von Resistenz-Plasmidfaktoren zu entwickeln. Es ist bekannt, daß unter geeigneten selektiven Bedingungen eine schnelle Verbreitung von mehrfachen antibiotischen Resistenzen unter einer großen Vielfalt von gram-negativen Pathogenen vorkommt.
Wenn die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, zur Behandlung einer Bakteriämie (d.h. Gegenwart von Bakterien im Blutstrom) oder einer Sepsis (bakterieller Befall von Körperflüssigkeiten), die durch gram-negative Bakterien verursacht werden, eingesetzt werden, werden sie vorzugsweise parenteral und besonders bevorzugt intravenös in Mengen verabreicht, die in einem Bereich von etwa 1 Mikrogramm bis 1000 Mikrogram und vorzugsweise zwischen 10 und etwa 250 Mikrogram pro Behandlung liegen. Die Dauer und die Anzahl der Behandlungen kann von Individuum zu Individuum, in Abhängigkeit von der schwere der Krankheit, schwanken. Eine typische Behandlungsform kann eine intravenöse Verabreichung von etwa 100 Mikrogramm an BPI-Fragmenten dreimal täglich umfassen. Um eine rasche Inaktivierung der BPI-Fragmente (und tatsächlich der Holoproteine) vermeiden zu helfen, was in vitro nach Inkubation mit dem Serum beobachtet worden war, können die BPI-Fragmente mit physiologisch geeigneten Trägermaterialien, wie normal vorkommenden Serumproteinen (z.B- Albumin oder Lysozym), gekoppelt werden. Die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, könnten auch topisch angewendet werden, um Säuger zu behandeln, die an durch empfängliche gramnegative Bakterien verursachten Hautinfektionen leiden, die bei bettlägerigen Patienten, die an Dekubitusgeschwüren (wund gelegenen Stellen) leiden, oder bei Verbrennungspatienten auftreten. Wenn die BPI-Fragmente als topischer antibakterieller Wirkstoff angewendet werden, können sie in den gleichen Dosierungen und in der gleichen Häufigkeit verabreicht werden, wie es für die vorstehende parenterale Verabreichung beschrieben ist.
Die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, können in pharmazeutische Formulierungen eingebracht werden, die bei der Behandlung von Säugern verwendet werden, die an von gram-negativen Bakterien verursachten Infektionen leiden. Pharmazeutische Formulierungen, die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, (oder physiologisch geeignete Salze davon) als zumindest einen der Wirkstoffe umfassen, enthalten zusätzlich pharmazeutisch geeignete Trägermaterialien, Verdünnungsmittel, Füllmaterialien, Salze und andere Stoffe, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform. Bevorzugte parenterale Dosierungsformen umfassen zum Beispiel eine sterile isotonische Kochsalz-Lösung und können zwischen etwa 1 Mikrogramm und 1000 Mikrogramm an BPI-Fragmenten, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, umfassen, die kovalent an geeignete, physiologisch verträgliche Trägermaterialien, wie normal vorkommende Serumproteine, zum Beispiel Lysozym oder Albumin, gekoppelt sind, um ihre Inaktivierung zu verhindern. Für die Verwendung zur Behandlung von Säugern mit durch gram-negative Bakterien verursachten Infektionen in Körperflüssigkeiten, die praktisch keine (Lipo-) Proteine aufweisen, wie Urin, können pharmazeutische Formulierungen die vorstehenden Mengen an BPI-Fragmenten, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, und sterile isotonische Kochsalz-Lösungen für die Spülung des Harntraktes umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, in Mengen, die in einem Bereich von 1 Mikrogramm bis 1000 Mikrogramm pro Dosis liegen, mit Antibiotika gemischt werden, und sie können in dergleichen Art von Präparationen. die in antibiotischen Cremen verwendet werden (wie Silvadene, Marion Laboratories, Kansas City, BIO, Terramycin, Pfipharmecs, New York, New York oder Achromycin, Lederle Laboratories, Pearl River, New York), die auf dem Fachgebiet für die lokale Verabreichung bekannt sind, formuliert werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können pharmazeutische Formulierungen zur Behandlung von Säugern, die an durch gram-negakive Bakterien verursachten Infektionen leiden, die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, zusätzlich zu den Standard-Mengen (auf dem Fachgebiet gut bekannt) von Antibiotika, wie Penicillin-G (verfügbar von E. R. Squibb and Sons , Inc., Princeton, New Jersey) oder Cephalosporinen (erhältlich von Eli Lily & Co., Indianapolis, IN) enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, mit hydrophoben Antibiotika, wie Rifampicin (erhältlich als RIFAMPIN, CIBA Pharmaceutical CO., Summit, New Jersey), und hydrophoben Penicillinen, wie Penicillin-V-Benzathin (Lederle-Labs, Pearl River, NY), gemischt werden. Man nimmt an, daß die erhöhte Permeabilität der gram-negativen Bakterien nach BPI-Behandlung die Wirksamkeit solcher Antibiotika erhöht, die nicht leicht in nicht-permeabilisierte Bakterien gelangen können.
Man nimmt an, dass die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, die gleichzeitige Behandlung mit beliebigen Antibiotika, Zellen des Immunsystems oder Faktoren wie T-Zellen oder Interleukin-2, zytotoxischen Wirkstoffen oder ähnli chem, das gegen gram-negative Bakterien wirksam ist, ideal geeignet sind. Wegen der erhöhten Sensitivität der pathogeneren, glatten gram-negativen Bakterien gegenüber den Fragmenten nimmt man an, daß die BPI-Fragmente, die durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert werden, die Resistenz solcher Bakterien gegenüber solchen Faktoren erniedrigen. Eine praktisch gleichzeitige Verabreichung der Fragmente und der Antibiotika der Wahl ist bevorzugt.
Ein Beispiel der vorstehend erwähnten Ausführungsform wird in Beispiel 4 nachstehend gezeigt, wobei Actinomycin D (welches normalerweise aufgrund seiner hydrophoben Eigenschaften nicht in gram-negative Bakterien gelangen und diese beeinträchtigen kann) die RNA- und Proteinsynthese nur in BPI-behandelten E. coli in bedeutendem Ausmaß hemmte.
Zusätzlich haben die hier genannten Erfinder das Gen isoliert, das das menschliche BPI-Holoprotein kodiert, und sie haben die aus menschlichen promyelocytischen Leukämiezellen (HL-60) isolierte BPI-cDNA identifiziert und sequenziert. Die Nucleotidsequenz der cDNA und die entsprechende Aminosäuresequenz des Holoproteins sind in 5 dargelegt.
Die in 5 enthaltene Sequenzinformation kann verwendet werden, um das biologisch aktive 25 kDa-Fragment von BPI zu synthetisieren. In diesem Fall kann ein Vektor, der die DNA-Reste 123 bis etwa 759–780 (oder die Aminosäurereste 1 bis etwa 210–220) der 5 umfasst, unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zusätzlich können kleinere Sub-Fragmente der cDNA der 5 hergestellt werden, wobei zum Beispiel eine begrenzte BaI31-Nucleasespaltung der gesamten cDNA verwendet wird, um mit Sonden nach den kleinsten Sequenzen zu suchen, die für die vorstehend erwähnten biologischen Aktivitäten von BPI notwendig sind.
Alternativ kann das BPI-Holoprotein nach Synthese durch geeignet transfizierte oder transformierte eukaryotischen (Säuger oder Hefe) oder prokaryotischen Zellen erhalten werden, und die vorstehend erwähnten, biologisch aktiven 25 kDa-Fragmente können unter Verwendung der Techniken erhalten werden, die in Beispiel 2 nachstehend beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in spezifischen Beispielen weiter beschrieben, die zur Erläuterung dienen, ohne ihren Umfang zu begrenzen.
Beispiel 1: Isolierung und Reinigung von menschlichem BPI
Menschliche Leukozyten wurden aus Heparin-behandeltem (100–200 U.S.P.-Einheiten/10 ml) peripherem Blut erhalten, das durch Venenpunktur von gesunden Spendern und von Patienten mit chronischer myelocytischer Leukämie gesammelt wurde.
Populationen von menschlichen PMN wurden auf zwei Wegen erhalten.

(1) PMN's wurden durch das Dexkran-Sedimentations-Verfahren isoliert, gefolgt von einer Zentrifugation in einem Isopaque-Ficoll-Gradienten (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) wie beschrieben (Boyum, A. J., J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97 (1968), 77–89, durch Bezugnahme eingeschlossen). Das Leukocyten-reiche Plasma von gesunden Spendern wurde zuerst mit isotonischem Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (pH 7.4) auf eine Konzentration von 10,000 bis 20,000 Zellen/Mikroliter verdünnt, bevor es auf das Isopaque-Ficoll-Gemisch aufgeschichtet wurde. Die Zellen wurden vor ihrer Verwendung zweimal in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer gewaschen.
(2) In einer anderen Ausführungsform wurde Leukozyten-reiches Plasma, das durch Leukophorese (unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren) von 400 mL venösem Blut von einem Patienten mit chronischer myelocytischer Leukämie erhalten wurde, direkt bei 1000 × g für fünf Minuten sedimentiert, was 3.5 × 10¹⁰ Leukozyten ergab, wobei im wesentlichen alle davon PMN waren. Diese Zellen wurden vor der Homogenisierung zweimal mit Krebs-Ringer-Phosphatpuffer gewaschen.

Für die Extraktion von menschlichem BPI-Holoprotein wurden die PMN zuerst auf einem von zwei Wegen aufgebrochen: 1) Granulae-reiche Fraktionen, die die Hauptmenge an BPI-Aktivität enthielten, wurden durch Homogenisierung von PMN bei 0°C erhalten, die in 0.34 M Saccharose (2 X log Zellen/ml), wie in Weiss, J., et al., J. Biol. Chem. 253, 2664–2672, 1978 durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben, suspendiert waren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 × g für 10 Minuten und bei 20,000 × g für 30 Minuten bei 4°C. Der Granulae-reiche Niederschlag wurde mit annähernd 10 Volumina 0.2 M Natriumacetat (pH 4.0) über Nacht bei 4°C unter fortlaufendem Rühren extrahiert. Der Extrakt wurde als Überstand durch Zentrifugation des Extraktes bei 20,000 × g für 30 Minuten gesammelt.
2) In einer anderen Ausführungsform wurden PMN(2–3 × 10⁸ Zellen/ml) in destilliertem Wasser bei 0°C mit einem Potter-Elvejhem-Glashomogenisator und einem Motor-getriebenen Teflonpistill (Kontes; Tochtergesellschaft von Kimble Div., Owens, IL) aufgebrochen und bei 0°C für 30 Minuten mit 0.16 N Schwefelsäure extrahiert, um das BPI-Holoprotein zu solubilisieren. Nach Zentrifugation bei 23,000 × g für 20 Minuten bei 4°C, um unlösliches Material zu sedimentieren, wurde der Extrakt gegen 200 mM Natriumacetat/Essigsäurepuffer (pH 4.0) dialysiert. Das BPI in diesen Extrakten wurde durch Gelfiltrationschromatographie an einer Molekularsiebsäule (SEPHADEX G-75, superfine, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) bei 4°C gereinigt. Die Perlen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers behandelt und in 0.2 M Natriumacetat (pH 4.0) äquilibriert. Unter Anwendung dieser Technik wurde im wesentlichen die gesamte BPI-Holoprotein-Aktivität als ein einzelner Peak (Fraktionen 35–39) eluiert, was einem einzelnen Proteinpeak (5–6% des gesamten aufgetragenen Proteins) direkt nach dem Leervolumen entspricht.
Die chromatographische, menschliches BPI-Holoprotein enthaltende Fraktion wurde einer weiteren Chromatographie an einem Ionenaustauscherharz (SP-SEPHADEX, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) unterworfen. Das Protein wurde auf die Säule, die in 0.1 N NaCl-0.2 M. Natriumacetat/Essigsäurepuffer (pH 4.6) äquilibriert war, aufgetragen und mit einem stufenweisen Gradienten von gepuffertem NaCl (0.3, 0.5 und 0.75 M) eluiert. Menschliches BPI-Holoprotein wurde im letzten Schritt eluiert.
Gereinigtes menschliches BPI-Holoprotein wurde dann in einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) auf einer Umkehrphasen-C-4-(Vydac)-Säule (Sota Chromatography, Crompand, NY) unter Verwendung eines HPLC-Systems (Model 332, Beckman Instruments, Fullerton, CA) isoliert. Die Säule verwendete einen linearen Gradienten von Acetonitril (0–95% Volumen/Volumen, J. T. Baker Chemical Co., Philipsburg, NJ) in 0.1%iger Trifluoressigsäure (TFA , Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Menschliches BPI wurde bei etwa 70% Acetonitril eluiert und gegen annähernd 50 Volumina 10 mM Ammoniumacetat/Essigsäurepuffer (pH 4.6) dialysiert. Gereinigtes BPI wurde entweder in 0.2 M Natriumacetat/Essigsäurepuffer (pH 4.0) oder in 10 mM Ammoniumacetat/Essigsäurepuffer (pH 4.0) bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 2: Herstellung von menschlichen BPI-Fragmenten
Gereinigtes menschliches BPI-Holoprotein wurde in 0.1 M HEPES-NaOH-Puffer, pH 7.4, für 18 Stunden inkubiert, und dann durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) in 12%igen Polyacrylamidgelen unter Verwendung. eines 0.375 M Tris/HCl und 0.1 % SDS enthaltenden Puffersystems von Lämmli, U.K., Nature 227 (1970), 680–685, analysiert. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. In 1 wurden die Spuren A–E unter Verwendung der gut bekannten Commassie-Blau-Technik gefärbt und die Spuren F und G wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Bio-Rad, Bio-Rad-Labs, Richmond, CA) mit Silber gefärbt.
Nach Inkubation in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 4.6) bei 4°C für 2 Monate fragmentierten 10 Mikrogramm des gereinigten menschlichen Proteins (1, Spur A) in zwei Arten von annähernd 35 und 25 kDa (1, Spur 3). Inkubation des gereinigten menschlichen BPI-Holoproteins (10 Mikrogramm) für 24 Stunden bei 37°C in 0.1 M HEPES/NaOH-Puffer, pH 7.4, erhöhte die Anhäufung der zwei Arten, besonders der 25 kDa-Art, mit einem gleichzeitigem Verlust des Holoproteins (1, Spur C). Die Umkehrphasen-HPLC dieses inkubierten Gemisches, die, wie vorstehend für das Holoprotein beschrieben, durchgeführt wurde, ergab zwei Hauptproteinpeaks, einer, der mit dem nativen menschlichen BPI-Holoprotein gleichzeitig eluierte und der andere, der geringfügig früher eluierte (2). Das Protein des späteren Peaks wanderte im SDS-PAGE als eine einzelne 60 kDa-Art, und das Protein des früheren Peaks wanderte als eine einzelne 25 kDa-Art (1, Spuren D bzw. E). Die Fragmentation des menschlichen BPI-Holoproteins und die Isolierung des 25 kDa-Fragments konnten mit dem gewonnenen menschlichen Holoprotein bei Wiederholung dieses Verfahrens wiederholt werden, was bestätigt, daß das 25 kDa-Fragment von menschlichem BPI stammte.
In ähnlicher Weise wurde Kaninchen BPI-Holoprotein, das, wie in Beispiel 1 vorstehend (500 ng, 1, Spur F) gereinigt wurde, nach Inkubation für 18 Stunden bei 37°C in 0.1 M HEPES-NaOH (pH 7.4) in eine 25 kDa-Art (1, Spur G) fragmentiert.
Beispiel 3: NH₂-terminale Aminosäurezusammensetzung und Sequenzanalyse von BPI-Fragmenten
Das menschliche 25 kDa-BPI-Fragment von Beispiel 2 wurde einer Aminosäureanalyse unterworfen, und die Ergebnisse wurden mit der Aminosäureanalyse von gereinigtem menschlichem 60 kDa-Holoprotein verglichen. Die Aminosäurezusammensetzungen wurden unter Verwendung eines Waters Pico-Tag-Aminosäureanalysators (Waters Associates, Milford, NA), wie beschrieben (Bidlingmyer, B. A. et al., J. Chrom. 226 (1984) 93–104, durch Bezugnahe eingeschlossen), bestimmt. Die Proben wurden im Vakuum für 24 Stunden bei 110°C mit 5.7 N HCl und 0.05% Phenol vorbehandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Aminosäurezusamnensetzung des 25 kDa-Fragmentes und des menschlichen BPI-Holoproteins Tabelle 1
Die vorstehend gezeigten Werte stellen den molaren Anteil (%) jeder Aminosäure dar und sind der Durchschnitt von drei unabhängigen Bestimmungen. "Asx" steht für Asparagin und/oder Asparaginsäure und "Glx" steht für Glutamin oder Glutaminsäure.
Die Aminosäureanalyse zeigte, daß das menschliche 25 kDa-Fragment mit Lysin und Serin angereichert war und im Vergleich zu dem Holoprotein (Tabelle 1) wenig nicht-polare Reste enthielt.
Die NH₂-terminale Sequenzanalyse des menschlichen BPI-Fragmentes und des Holoproteins wurden unter Verwendung der gut bekannten sequentiellen Edman-Abbautechnik (Edman, P., Eur, J. Biochem. 1 (1967), 80–91, durch Bezugnahme eingeschlossen) durchgeführt, wobei ein Aminosäure-Sequenzautomat/Beckman, Modell 890C, Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA) für das Holoprotein oder ein Gasphasen-Sequenzautomat (Applied Biosystems, Modell 470A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) für das Fragment verwendet wurde. Phenylthiohydantoin-Derivate von Aminosäuren, die nacheinander durch das Edman-Abbauverfahren freigesetzt wurden, wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 150 mm C-18-Säule für menschliches BPI (IBM Instruments Inc., Willingford, CT) oder einer ODS-Säule für das erfindungsgemäße Fragment (Dupont Zorbax ODS-Säule, E.I. Dupont de Nemours, Wilmington, DE) analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 nachstehend gezeigt. Tabelle 2

Holoprotein V N P G V V V R I S Q K G L D Y A S Q Q

25kDa-Fragment V N P G V V V R I S Q K G L D Y A S Q Q

V = Val, N = Asn, P = Pro, G = Gly, R = Arg, I = Ile, Q = Gln, K = Lys, L = Leu, A = Ala, S = Ser

Wie aus den Daten in Tabelle 2 ersichtlich ist, waren die NH₂-terminale Aminosäuresequenz des menschlichen 25 kDa-Fragmentes und des von menschlichen PMN stammenden Holoproteins in den ersten 20 Aminosäureresten identisch, was besagte, daß das Fragment den NH₂-terminalen Bereich des menschlichen Holoproteins darstellte.
Beispiel 4: Biologische Eigenschaften des BPI-Fragmentes von Beispiel 2
Die antibakteriellen Wirkungen des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragments aus Beispiel 2 wurden mit den bekannten Wirkungen des Holoproteins verglichen. E. coli J5 (von Dr. L. Leive, NIH Bethesda, MD erhalten), der kurzkettige Lipopolysaccharide (LPS) in Galactose-freiem Kulturmedium produziert, wurde über Nacht angezogen und dann bei 37°C in Triethanola min-gepufferten Medien, wie in Simon, E.G., et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 51 (1964), 877) beschrieben, gezüchtet. 5 × 10⁶ E. coli J5 wurden in einem Volumen von 250 Mikrolitern mit steigenden Mengen von entweder menschlichem Holoprotein oder des menschlichen 25 kDa-Fragmentes inkubiert.
Die Wirkungen auf die bakterielle Lebensfähigkeit wurden bestimmt entweder durch (1) Verdünnen eines Aliquots (5 × 10⁵ Bakterien) des Inkubationsgemisches in 2 ml Nährbouillon (Difco Laboratories, Detroit, MI) und Messung des bakteriellen Wachstums (Absorption bei 550 nm unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers nach annähernd 4 Stunden bei 37°C); oder (2) durch Ausplattieren von verdünnten Proben auf Nähragar und Auszählen der bakteriellen Kolonien nach Über-Nacht-Inkubation bei 37°C. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. In 3 stellen nicht ausgefüllte Kreise mit BPI-Holoprotein behandelte Bakterien dar, und ausgefüllte Kreise stellen Bakterien dar, die mit dem menschlichen 25 kDa-Fragment behandelt wurden.
3A zeigt, daß das isolierte 25 kDa-Fragment E. coli J5, einen gegen das Holoprotein sehr sensitiven Bakterienstamm, in einer dosisabhängigen Weise abtötet. Eine lineare Regressionsanalyse der in 3A dargestellten Daten zeigte weiter, daß das Fragment in etwa zweimal so aktiv wie das Holoprotein, bezogen auf das Gewicht, war, was bedeutet, daß es in etwa gleich aktiv auf molarer Basis ist, da das Fragment etwa die Hälfte der Größe des Holoproteins besitzt (3A).
Das Abtöten von E. coli durch Sänger-BPI wird anfangs von einzelnen Veränderungen der äußeren Hülle begleitet, ohne daß irgendein offensichtlicher Schaden an der bakteriellen Biosynthesemaschinerie verursacht wird. 3B zeigt, daß sowohl das menschliche Holoprotein wie auch das menschliche 25 kDa-Fragment sogar bei fast vollständig tödlichen Dosen nur eine geringe Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese verursachte. Im Gegensatz dazu verursachten sowohl das Fragment wie das Holoprotein eine fast vollständige Hemmung der E. coli J5-Proteinsynthese, wenn sie in Gegenwart von 50 Mikrogramm/ml des Antibiotikums Actinomycin D (Merck, Sharp and Dohme, St. Louis, HO, 3C) verabreicht wurden. Diese Wirkung des Actinomycins D spiegelt eine erhöhte Permeabilität der äußeren Membran der Bakterien wieder, was den Eintritt des normalerweise nicht eindringenden Actinomycins D in die Zelle erlaubt, wo es die RNA- und folglich die Proteinsynthese hemmte. Die Dosisabhängigkeit der permeabilitätserhöhenden Wirkung des Fragmentes und des Holoproteins war die gleiche, wie sie für die vorstehende bakterizide Aktivität gezeigt wurde und zeigte, daß in dieser Einsicht auch das Fragment zweimal so aktiv, bezogen auf das Gewicht, wie das Holoprotein war.
Um die Wirkungen des Fragmentes mit dem Holoprotein auf bakterielle Phospholipide zu vergleichen, wurden die Bakterien während des Wachstums mit (1-¹⁴C)-Ölsäure (New England Nuclear, Boston, MA) vormarkiert, wie in Elsbach, P., et al., J. Biol. Chem. 254 (1979), 11000–13009, beschrieben. Die Inkubationsgemische wurden mit 0,4%igem Rinderserumalbumin (w/v) versetzt, um die Phospholipid-Abbauprodukte (¹⁴C-freie Fettsäuren und ¹⁴C-Lyso-Verbindungen) zu gewinnen, was ihre Trennung von unhydrolysierten bakteriellen ¹⁴C-Phospholipiden durch Filtration über einen Membranfilter (Millipore HAWP, Millipore Corp., Bedford, ISA) erlaubt, um den Phospholipid-Abbau zu messen. Die Ergebnisse sind in 3D gezeigt.
Wie in 3D gezeigt, wurde die dosisabhängige Aktivierung der bakteriellen Phospholipid-Abbauenzyme durch das Holoprotein auch durch das 25 kDa-Fragment erzeugt, wobei wieder nur die Hälfte des Gewichtes des Proteins für eine vergleichbare Wirkung erforderlich war.
Die Wirkung des BPI-Holoproteins auf E. coli wird durch die Gegenwart von Lipopolysacchariden mit langen Polysaccharidketten in der bakteriellen äußeren Membran ("glatte Stämme") behindert:. Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen 25 kDa-Fragmentes gegenüber einem glatten E. coli-Stamm (0111:B4) wurde mit der des Holoproteins verglichen. E. coli 0111:B4 ist ein glatter Stamm, der längere Polysaccharidketten als E. coli J5 trägt. Bakterien (1 × 10⁶) wurden in Gemischen von 125 Mikroliter mit erhöhten Mengen des BPI-Holoproteins oder des 25 kDa-Fragmentes inkubiert. Die bakterielle Lebensfähigkeit wurde wie vorstehend gemessen und ist in Prozent der Lebensfähigkeit der Bakterien ausgedrückt, die alleine (ohne jede Zusätze) inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Wie aus 4 ersichtlich, war das 25 kDa-Fragment (ausgefüllte Kreise) gegenüber E. coli 0111:B4 etwa fünfmal aktiver als das Holoprotein (nicht ausgefüllte Kreise). Die fünffache Erhöhung der Aktivität des 25 kDa-Fragmentes im Einblick auf das Holoprotein legt nahe, daß die kleinere Größe des Fragmentes ein Faktor ist, der den Zugang des Fragmentes zu den Bindungsstellen an der Basis der LPS-Polysaccharidkette erleichtert.
Um festzustellen, ob das menschliche 25 kDa-Fragment die gleiche cytotoxische Spezifität gegenüber gram-negativen Bakterien wie das Holoprotein behalten hat, wurden die Aktivitäten des 25 kDa-Fragmentes und des Holoproteins gegenüber einem gram-positiven Bakterium, Micrococcus lysodeikticus (von Dr. M Salton, New York University, New York, New York erhalten), verglichen. Die Bakterien wurden in einer Hirn-Herz-Infusions-Bouillon (Difco Laboratories, Detroit,.MI) bei 37°C angezogen. Die bakterielle Lebensfähigkeit wurde wie vorstehend für E. coli gemessen.
Weder das menschliche 25 kDa-Fragment (5–10 Mikrogramm) noch das Holoprotein (10–20 Mikrogramm) hatten irgendeine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Micrococcus lysodeikticus, sogar bei Dosen, die 20-fach höher als die Dosen waren, die vollständig tödlich für den gram-negativen E. coli J5 waren.
Die vorstehend dargestellten Daten zeigen, daß der Wirkungsbereich und die Stärke der antibakteriellen Aktivitäten des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragmentes zumindest gleich mit und manchmal wesentlich größer als die des Holoproteins sind. Die Daten deuten darauf hin, daß alle molekularen entscheidenden Faktoren, die für die BPI-Zytotoxizität erforderlich sind, innerhalb des Bereiches des BPI-Moleküls liegen, der von dem Fragment umfaßt wird.
Beispiel 5: Klonierung der cDNA von menschlichem BPI und Identifizierung der Aminosäuresequenz
Zwei synthetische Oligonucleotide wurden entworfen, die die 33 aminoterminalen Reste von menschlichem BPI codieren. Die Sonden
BPI-1
(GTCAATCCTGGTGTTGTGGTCAGGATCTCTCAGAAGGGCCTGGATTATGCCTCCC A)
und
BPI-2
(GCAAGGCACAGCTGCCCTGCAGAAGGAGCTGAAGAGGATCAAGATTCCTGACTA T),
die die Hälfte der teilweise bekannten menschlichen BPI-Sequenz kodieren, wurden jede entworfen, wie vorher in Ooi, C.E., et al. (J. Biol. Chem. 262 (1987), 14891–14894), offenbart.
Die Sonden wurde mit Kinase mit ³²P unter Verwendung von Standard-Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, markiert und verwendet, um unabhängig voneinander eine menschliche genomische Leber-Genbank abzusuchen, wie in Lawn R.M., et al. (Cell 15 (1978), 1157–3174), offenbart. Sechs Klone wurden unter 500,000 Plaques identifiziert, die unabhängig voneinander mit jeder Sonde hybridisierten. Der hybridisierende Bereich einer dieser Klone wurde sequenziert und kodierte eindeutig das aminoterminale Ende von menschlichem BPI. Diese Sequenz wurde von einem Intron oder dazwischenliegender Sequenz unterbrochen, sagte aber nichtsdestoweniger zusätzliche 22 Aminosäurereste vorher, die dem nächsten Intron vorausgingen.
Basierend auf der Gensequenz wurde dann eine neue DNA-Sonde synthetisiert, die genau den codierten 55 aminoterminalen Aminosäureresten entsprach. Diese Sonde wurde verwendet, um eine kleine cDNA-Genbank abzusuchen, die aus menschlichen, mit Dimethylsulfoxid, DMSO, induzierten HL-60-Zellen (erhältlich von ATCC CCL 240, American Type Culture Collection, Rockville, MD) hergestellt wurde. In der Genbank von 300,000 Plaques wurden 4 Klone isoliert, die mit der genauen Sonde hybridisierten. Die DNA der Klone wurde isoliert und die hybridisierenden Bereiche wurden nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Technik von Smith, A.J.H. (Meth.Enzym. 65 (1980), 560–5801, sequenziert. Die Sequenz des längsten Klones ist in 5 dargestellt.
Wie in 5 gezeigt, sagt die Sequenz ein 31 Aminosäuren umfassendes Signalpeptid voraus, das von einem 456 Reste umfassenden reifen Protein gefolgt wird. Die aminoterminale Sequenz, die durch Proteinsequenzierung von menschlichem BPI bestimmt wurde, stimmt mit der kodierenden cDNA genau überein. Weiterhin entspricht die abgeleitete Aminosäurezusamensetzung des kodierten Proteins genau der Aminosäurezusamensetzung, die für gereinigtes menschliches BPI bestimmt wurde, wie in Ooi, C. E., et al., a.a.O., offenbart. Die kodierte Sequenz sagt ein Protein von 50,6 kDa voraus; die bestimmte Molekülgröße des gereinigten menschlichen BPI ist annähernd 58 kDa. Dieser Unterschied in der relativen Große könnte die Gegenwart von zwei möglichen N-gebundenen Glycosylierungsstellen an den Positionen 122 und 249 des Proteins (durch Striche in 5 angedeutet) widerspiegeln.
Um weiter zu zeigen, daß diese cDNA menschliches BPI kodiert, wurde seine Expression in Säugerzellen gentechnologisch durchgeführt. Die gesamte cDNA wurde in einen Säugerzellen-Expressionsvektor (Wood, W. T, et al., Nature 312 (1984), 330–337) subkloniert und dann in eine menschliche Nierenzellinie transfiziert. Kleine Mengen des rekombinanten BPI wurden transient produziert und durch Western-Blot-Techniken charakterisiert, wobei sie eine immunreaktive Bande mit einer Mobilität, die mit der des nativen menschlichen BPI identisch war, zeigten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die natürliche Expression von BPI in verschiedenen menschlichen Geweben wurde dann durch Northern-Blot-Hybridisierung analysiert. RNA wurde aus verschiedenen Geweben hergestellt (Chirgwin, J. M., et al., Biochem. 24 (1979), 5294–5299), über Oligo-dT-Cellulose gegeben und in einem Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt (Dobner, P.R., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2230–2234). Das Gel wurde auf Nitrocellulose, wie beschrieben (Thomas, P. S., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77 (1980), 5201–5205), transferiert und unter stringenten Bedingungen mit BPI-cDNA hybridisiert.
Wie in 6 gezeigt, hybridisierte die BPI-cDNA-Sonde gut mit mRNA, die aus Milz von einem Patienten mit chronischer myelocytischer Leukämie hergestellt worden war. Die Milz war stark mit unreifen myeloischen Zellen infiltriert. Die Größe des hybridisierenden Signals lag bei annähernd 2,000 Basen in der Länge, was nahelegt, daß die in 5 dargestellte cDNA-Sequenz in vollständiger Länge vorlag. Die BPI-Sonde hybridisierte nicht mit mRNA von normaler Milz, reifen peripheren Blutleukozyten, Leber, Niere oder Gehirn (6). Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Beobachtungen über das Vorkommen von BPI in verschiedenen Zelltypen und Geweben; es war kürzlich gezeigt worden, daß die Gegenwart von BPI auf Zellen der myeloischen Reihe beschränkt ist. Die BPI-cDNA wurde auch als Sonde in Southern-Hybridisierungen von menschlicher genomischer DANN verwendet. DNA wurde aus menschlichen peripheren Blutleukozyten isoliert, wie in Blin, N., et: al. (Nuc. Acids Res. 3 (1976), 2303–2308), beschrieben, mit den Restriktionsendonucleasen Eco RI, BamHI und HindIII gespalten und in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nitrocellulose transferiert (wie in Southern, E.M., J. Molec. Biol. 98 (1975). 503–517, beschrieben) und mit einem 5'-Endfragment der BPI-cDNA-Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert (wie in Maniatis et al., Molecular Cloning, a laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY (1982), 387–389, beschrieben.
Wie in 7 gezeigt, wurde eine einzige hybridisierende Bande bei den Restriktionsspaltungen mit EcoRI und BamHI beobachtet, wenn das 5'-Ende der BPI-cDNA als eine Sonde verwendet wurde. Dies legt nahe, daß BPI von einem einzigen Gen kodiert wird.
Die Primärstruktur der menschlichen BPI-Proteinsequenz offenbart mehrere Merkmale, die entscheidend für seine Funktion sein können. Wie vorstehend erwähnt, enthält ein aminoterminales 25 kDa-Fragment alle bakteriziden Aktivitäten des Holoproteins. Eine deutliche Ladungsasymmetrie kann beobachtet werden, wenn das aminoterminale 25 kDa-Fragment mit dem Holoprotein verglichen wird. Das aminoterminale Ende enthält mehr basische als saure Reste, nämlich 16 (28 Lysine/Arginine gegenüber 12 Aspartaten/Glutamaten), während das carboxyterminale Ende leicht sauer ist (20 basische gegenüber 22 sauren Resten). Die außerordentlich basische Natur des aminoterminalen Bereiches kann eine elektrostatische Wechselwirkung von BPI mit den negativ geladenen LPS auf der bakteriellen Hülle fördern.
Papierbeispiel I: Gemeinsame Behandlung von gram-negativen Bakterien mit den menschlichen BPI-Fragmenten und Penicillinen
Das erfindungsgemäße menschliche BPI-Fragment wird verwendet werden, um die Wirksamkeit von Mitteln zu testen, die die Fragmente und Penicillin-G oder ein hydrophobes Derivat, Penicillin-V, enthalten. Sowohl glatte (E. coli 0111:B4) wie auch rauhe (E. coli J5) gramnegative Bakterien werden, wie in Beispiel 3 vorstehend beschrieben, mit zweifachen Reihenverdünnungen angeimpft und inkubiert werden, die enthalten: das erfindungsgemäße menschliche 25 kDa-BPI-Fragment (1 Mikrogramm–1000 Mikrogramm) allein, Penicillin-G (3000–300,000 Einheiten) allein, Penicillin-V-Benzathin (3000–300,000 Einheiten) allein und Zusammensetzungen, die die gleichen Konzentrationen der vorstehenden Stoffe als Gemische enthalten, d.h. das BPI-Fragment plus Penicillin-G und das BPI-Fragment plus Penicillin-V. Die bakterielle Lebensfähigkeit wird, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben, überwacht.
Es wird erwartet, das geringere Mengen von beiden Penicillinen im Abtöten sowohl von glatten wie auch rauhen E. coli-Stämmen in Gegenwart des menschlichen 25 kDa-BPI-Fragmentes wirksam sind, was die Wirksamkeit dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt.

Claims

Gereinigte, isolierte DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichts von bakterizidem/Permeabilität-erhöhenden Protein (BPI) aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins abgeleitet ist, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI beibehält.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das kodierte Polypeptid ein ersichtliches Molekulargewicht von ungefähr 25.000 aufweist, wie durch SDS-PAGE bestimmt.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei das kodierte Polypeptid die Aminoterminale Sequenz V-N-P-G-V-V-V-R-I-S-Q-K-G-L-D-Y-A-S-Q-Q aufweist.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die für das Polypeptid von Aminosäurerest 1 bis 210–220, wie in 5 angegeben, kodiert.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ausgewählt aus (a) einer DNA-Sequenz, die die Sequenz von Nukleotid 123 bis 759–780, wie in 5 angegeben, aufweist; oder (b) das Komplement der DNA-Sequenz von (a); oder (c) eine DNA-Sequenz, die an die DNA-Sequenz von (a) oder (b) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.
cDNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Genomische DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Expressionsvektor zur Herstellung eines Polypeptids, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichts von BPI aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins abgeleitet ist, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI beibehält, wobei der Expressionsvektor darin eingeführt eine DNA nach einem der voranstehenden Ansprüche aufweist.
Zelle, transformiert oder transfiziert mit einem Vektor nach Anspruch 8.
Eukaryontische Zelle nach Anspruch 9.
Säuger- oder Hefezelle nach Anspruch 10.
Prokaryontische Zelle nach Anspruch 9.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichts von BPI aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins abgeleitet ist, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI beibehält, wobei das Verfahren die Schritte von Einführen einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einen Expressionsvektor und Transformieren oder Transfizieren einer Zelle mit dem Expressionsvektor, um so das Polypeptid zu produzieren, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das weniger als die Hälfte des Molekulargewichts von BPI aufweist und von der NH₂-terminalen Domäne des Proteins abgeleitet ist, wobei das Polypeptid die biologische Aktivität von BPI beibehält, wobei das Verfahren die Schritte von Spalten von BPI-Holoprotein durch Inkubieren in Anwesenheit von Serinprotease und Zurückerhalten des Polypeptids umfaßt, wobei das BPI-Holoprotein bei einem pH in einem Bereich von zwischen 6,0 und 8,0 bei einer Temperatur zwischen 20°C und 37°C für eine Zeit im Bereich von zwischen 16 und 24 Stunden inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das BPI-Holoprotein in 0,1 M HEPES/NaOH-Puffer, pH 7,4 für 18 Stunden bei 37°C inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 15, wobei das BPI-Holoprotein gereinigtes BPI-Holoprotein ist.
Gereinigtes, isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von Aminosäurerest 1 bis Aminosäurerest 210–220, wie in 5 angegeben, aufweist.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend ein Polypeptid, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, ein Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder ein Polypeptid nach Anspruch 17 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel oder Träger.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 18 zur Verwendung in der Behandlung von Säugern, die an Gram-negativen bakteriellen Infektionen leiden.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, in parenteraler Dosierungsform.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 20, das eine sterile isotonische Kochsalzlösung umfaßt.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 18 oder 19 in topischer Dosierungsform.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, das zwischen 1 und 1000 Mikrogramm des Polypeptids pro Dosis enthält.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 23, das zwischen 10 und 250 Mikrogramm pro Dosis enthält.
Pharmazeutische Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, weiter umfassend ein weiteres anti-Gram-negatives bakterielles Mittel, ausgewählt aus einem Antibiotikum, einer Immunsystemzelle oder -Faktor, wie zum Beispiel einer T-Zelle oder Interleukin-2, ein zytotoxisches Mittel oder ein Gemisch davon.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 25, wobei das Antibiotikum ausgewählt ist aus einem Penicillin, einem Cephalosporin, Rifampicin oder Actinomycin D.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 19, wobei die Gram-negativen Bakterien glatte Gram-negative Bakterien sind.
Verwendung eines Polypeptids, das durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, ein Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder ein Polypeptid nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch Gram-negative Bakterien in Säugetieren verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Erkrankung Sepsis ist.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Erkrankung Bakteriämie ist.
Verwendung eines Polypeptids, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, ein Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder ein Polypeptid nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Co-Behandlung mit einem anderen anti-Gram-negativen bakteriellen Mittel von einer Erkrankung, die durch Gram-negative Bakterien in Säugetieren verursacht wird, wobei das andere anti-Gram-negative bakterielle Mittel ausgewählt ist aus einem Antibiotikum, Immunsystemzelle oder -Faktor, wie zum Beispiel einer T-Zelle oder Interleukin-2, einem zytotoxischen Mittel oder einem Gemisch davon.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei das Antibiotikum ein Penicillin, Cephalosporin, Rifampicin oder Actinomycin D ist.
Verwendung eines Polypeptids, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, einem Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder ein Polypeptid nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Effektivität eines Antibiotikums bei der Behandlung einer Erkrankung, die durch Gram-negative bakterielle Infektion verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei das Antibiotikum ein Penicillin, ein Cephalosporin oder Rifampicin ist.
Verwendung eines Polypeptids, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, ein Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder ein Polypeptid nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Verringerung der Resistenz von Gram-negativen Bakterien gegenüber einem Antibiotikum.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Antibiotikum Actinomycin D ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 36, wobei das Medikament für die parenterale Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei das Medikament für die intravenöse Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 36, wobei das Medikament für die topische Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei das Medikament zur Verabreichung mit einer Menge von zwischen 1 und 1000 Mikrogramm pro Dosis vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei das Medikament zur Verabreichung in einer Menge von zwischen 10 und 250 Mikrogramm pro Dosis vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Medikament zur Verabreichung in einer Menge von 100 Mikrogramm dreimal pro Tag vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 28 bis 42, wobei die Gram-negativen Bakterien glatte Gram-negative Bakterien sind.
In vitro-Verfahren zur Abtötung von Gram-negativen Bakterien, umfassend in Kontakt bringen der Gram-negativen Bakterien mit einem Polypeptid, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, einem Polypeptid, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder einem Polypeptid nach Anspruch 17.
In vitro-Verfahren zur Erhöhung der Permeabilität von Gram-negativen Bakterien, umfassend Inkubieren der Gram-negativen Bakterien mit einem Polypeptid, das durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert wird, einem durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16 hergestellten Polypeptid oder einem Polypeptid nach Anspruch 17.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei die Gram-negativen Bakterien glatte Gram-negative Bakterien sind.