SE468516B - Nya polypeptider vilka kan utvinnas fraan tunntarmen och deras anvaendning - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 2 under det att cekropiner och magaininer är cysteinfria.

Föreliggande uppfinning har till ändamål att åstad- komma nya baktericida polypeptider med förmåga att inhibe- . ra bakteriell tillväxt, speciellt tillväxten av gramnega- tiva bakterier. I denna framställning innefattar begreppet ¿ "inhibera" även avdödningen av bakterier.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma kompositioner innehållande som aktiv beståndsdel sådana polypeptider. Ännu ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett behandlingsförfarande riktat mot inhibering av bakte- riell tillväxt på djur, speciellt däggdjur innefattande människan.

För dessa och andra ändamål som kommer att framgå av följande beskrivning åstadkommes genom uppfinningen en po- lypeptid med aminosyrasekvensen: Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg- Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro- Pro-Gly-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro, och uppfinningen innefattar även funktionella deri- vat, såsom några få konserverade aminosyrautbyten och den C-terminala amiden.

Polypeptiden enligt föreliggande uppfinning och dess funktionella derivat är alla terapeutiskt användbara, spe- ciellt som antibakteriella ämnen. De har sålunda förmåga att inhibera tillväxt av bakterier eller att döda bakte- rier, speciellt gramnegativa bakterier, vilket gör dem an- vändbara för olika terapeutiska ändamål. Detta illustreras ytterligare genom de konkreta exempel som återges nedan.

Den aktiva polypeptiden enligt föreliggande uppfin- ning kan formuleras för användning i human- eller veteri- närmedicin för terapeutisk eller profylaktisk användning.

De aktiva beredningarna administreras normalt oralt, rek- talt eller parenteralt, såsom genom injektion i form av en farmaceutisk beredning eller komposition innehållande de aktiva beståndsdelarna i kombination med en farmaceutiskt acceptabel bärare, som kan vara fast, halvfast eller fly- 10 15 20 25 30 35 3 tande, eller innehållas i en kapsel, såsom vid oral ad- ministration. Administrationen kan även ta formen av lokal applikation. Som exempel på farmaceutiska beredningar kan nämnas tabletter, droppar, lösningar och suppositorier.

Vanligen utgör den aktiva beståndsdelen den mindre delen av beredningen, såsom från cirka 0,1 till cirka 50% därav räknat på vikten.

För framställning av farmaceutiska kompositioner i form av dosenheter peroral applikation kan polypeptiden enligt uppfinningen blandas med en fast, pulverformig eller annan bärare, exempelvis laktos, sackaros, sorbitol, mannitol, stärkelse, såsom potatisstärkelse, majsstär- kelse, millopektin, cellulosaderivat eller gelatin, och kan även innefatta smörjmedel, såsom magnesium- eller kalciumstearat, eller polyetylenglykolvaxer komprimerade till bildning av tabletter eller kroppar för dragéer. Dos- enheterna kan även presenteras i en överdragen form av enterisk typ.

Genom användning av ett flertal skikt av bäraren eller diluenten kan tabletter arbetande med långsam fri- göring framställas.

Flytande beredningar för oral applikation eller för injektion kan göras i form av elexir, sirup eller suspen- sioner, exempelvis lösningar innehållande från 0,1 till 20 viktprocent aktiv substans, socker och en blandning av etanol, vatten, glycerol, propylenglykol och eventuellt andra tillsatser av konventionellt slag.

Den dos med vilken den aktiva beståndsdelen admini- streras kan variera inom vida gränser och beror på olika faktorer, såsom störningens allvarlighetsgrad, åldern och vikten hos patienten och kan justeras individuellt.

Uppfinningen innefattar även ett förfarande för tera- peutisk behandling av djur, såsom däggdjur innefattande människan, vilket förfarande innefattar administration av en polypeptid såsom beskrivits ovan eller ett funktionellt derivat i en mängd som förmår avdöda bakterier eller inhi- bera bakteriell tillväxt i nämnda djur. 468 516 10 15 20 25 30 35 4 Föreliggande uppfinning kommer nu att ytterligare exemplifieras genom konkreta exempel, vilka emellertid ej får uppfattas som inskränkande uppfinningens omfattning i annat avseende än enligt bilagda patentkrav.

EXEMPEL l Framställning av ett peptidkoncentrat Ett koncentrat av värmestabila intestinala peptider framställdes från svintunntarm i huvudsak såsom beskrivits pà annat ställe (Mutt, V. Arkiv Kemi lä, 69-74 (1959): Mutt, V. i Gut Hormones (ed. Bloom, S.R.) sid 21-27, (Churchill Livingstone, Edinburg, 1978).

I korthet nedsänktes den översta metern av tunntarmen under 8 1 1 minut i kokande vatten och kyldes sedan på is och frystes. Det frysta materialet finfördelades och extraherades vid 0-15°C med 0,5 M ättiksyra i 12 timmar, och blandningen filtrerades under sugning (med tillhjälp av "Hyflo Super-Cel", 30 gram per liter suspension). Pep- tiden adsorberades fràn filtratet till algininsyra och algininsyran uppbärande peptiderna tvättades i sin tur med 0,005 M HCl, 95% etanol (för avlägsnande av fetter) och 0,005 M HCl ånyo. Peptiderna eluerades med 0,2 M iskyld HCl, och eluatets pH bringades till 3,5 1 0,1 med natrium- acetat. Peptiderna utfälldes sedan genom mättning av elu- atetet med NaCl, och fällningen uppsamlades genom sug- ningsfiltrering. Viktmängden av fällningen (vátvikt) är cirka en tusendel av den för den kokade tunntarmsvävnaden.

Koncentratet upplöstes vid rumstemperatur till en 10% vikt/vol lösning i vatten. Två volymer om 95% etanol sat- tes till lösningen, och det (skenbara) pH (uppmätt med en glaselektrod) av lösningen bringades till 7,5 1 0,1 med Na0H (lM Na0H:Et0H 1:2). En fällning bildades och avlägs- nades genom filtrering. Till den klara lösningen sattes en volym 95% etanol förkyld till -20°C, och suspensionen hölls vid denna temperatur i 24 timmar, varpå den filtre- rades. Peptiderna tillvaratogs från filtratet i vattenlös- ning och utfälldes vid pH 3,5 t 0,1 genom mättnad av lös- FI 10 15 20 25 30 35 468 516 5 ningen med NaCl. Fällningen uppsamlad genom sugfiltrering vägde cirka 10% av det koncentrat som togs för dess fram- ställning. De upplöstes i 0,2 M AcOH och kromatograferades i detta lösningsmeel pà Sephadex G-25 fine. Den andra hal- va volymen av det peptidhaltiga eluatet från denna kroma- tografering mättades med NaCl, och fällningen uppsamlades genom sugfiltrering. Dess vikt var cirka 40% av den för den peptidfällning som togs för denna kromatografering.

Den upplöstes i vatten, lösningens pH justerades till 4 1 0,1, varpå peptiderna ånyo utfälldes med NaCl och fäll- ningen uppsamlades genom sugning (det förelåg ingen vä- sentlig skillnad i vikt av materialet före och efter àter- utfällningen). Det áterutfällda materialet extraherades med metanol (50 ml/g) och den MeOH-olösliga fraktionen uppsamlades genom sugfiltrering och tvättades på filtret med eter. Etern avdrevs i vakuum. Vikten av det torra ma- terialet var cirka 15% av den för den peptidfällning som togs för extraktion med Me0H.

EXEMPEL 2 Reninggav koncentrat Som ett utgångsmaterial för reningen användes kon- centratet som erhölls från Exempel 1. Koncentratet (1,5 gram) upplöstes i 80 ml ammoniumformiat, pH 6,4, och be- handlades med 30 ml DEAE Sepharose, satsvis.

Steg 1: Kromatografi pá CM-Sepharose CL-6B (56 ml kolonn, bringad i jämvikt med 0,1 M ammoniumformiat, pH 6,4). Elu- ering utfördes ursprungligen med 0,1 M ammoniumformat (cirka 2 100 ml) till låg extinktion, varefter gradient- eluering utfördes under användning av 0,1 till 0,85 M ammoniumacetat, pH 5,2 (300 + 300 ml). Aktiviteten lämnar som en hel topp med ett maximum vid 0,38 M, specifik ak- tivitet 30 till 40 enheter/pg. (1 enhet definieras som ak- tiviteten av 1 ng cekropin A.) Fraktionen uppvisande den högsta antibakteriella aktiviteten valdes för ytterligare rening. 468 536 10 15 20 25 30 35 Steg 2: Ytterligare rening_av pSCMC-fraktion PSCMC-fraktion upplöstes i 8 mg/ml H20. 50 pl som prov (0,4 mg) blandades med 450 ul 0,1% TFA i vatten och överfördes på en FPLC-kopplad Pep RPC HR5/5 (Pharmacia).

Kolonnen tvättades med 0,l% TFA i H20 i 10 minuter vid en strömningshastighet av 0,5 ml/minut. Därefter höjdes ace- tonitrilkoncentrationen till 27% under 5 minuter. Det ak- tiva materialet eluerades med en gradient av 27% till 32% acetonitril under 34 minuter. En alikvot del (50 ul eller 100 ul) av varje fraktion torkades i Speedvac och upplös- tes i 10 pl H assay. 20 och 3 ul användes i en antibakteriell Resultat: Det aktiva materialet eluerades vid 28,5% ace- tonitril under den valda gradientprofilen. På bilagda rit- ning visas ett diagram över antibakteriell aktivitet (§¿ gglil som en funktion av elueringstiden. Som ett testprov användes 0,4 mg av den renade aktiva fraktionen i 50 ul H20 blandat med 450 pl 0,l% TFA i H pà Pep RPC HR5/5 kopplat till var följande: 20. Provet applicerades FPLC. Elueringsprogrammet gig % acetonitril 0 0 10 0 15 27 49 32 âfi. íâ EXEMPEL 3 Antibakteriell assay Den antibakteriella aktiviteten av polypeptiden en- ligt föreliggande uppfinning bestämdes genom inhiberings- zonassay sàsom beskrives av Hultmark et al (Hultmark, D., Engström, A., Anderson, K., Steiner, H., Bennich, H. och 10 15 20 25 30 35 468 516 7 Boman, H.G. (1983) Insect immunity. Attacins, a family of antibacterial proteins from Hyalophora cecropia. EMBO J. 2, 571-576).

Log-fasbakterier odlades till en densitet av 100 en- heter pá en Klett-summerson fotoelektrisk kolorimeter. De utspäddes 50 gånger med LB-medium, och 50 pl av bakterie- suspensionen blandades med 6 ml l,0% agaros i LB-medium (vikt/vol) och hälldes på petriskálar (Falcon 1001 Opti- lux) med en innerdiameter av 8,65 cm. För E. coli ger den- 5 bakterier per platta. na procedur cirka 2x1O Plattorna fick stå i 1 timme vid rumstemperatur, och hål med 3 mm diameter gjordes i den stelnade agarosen. 100 pl fraktioner torkades i en speedvac och upplöstes i 10 pl H20, varav 3 pl applicerades i hålen. Efter 30 minuter diffusionstid inkuberades plattorna vid 30°C över natten.

Diametern för inhiberingszonerna uppmättes och den rela- tiva enhetsaktiviteten beräknades från en standardkurva, som konstruerats från varierande mängder cekropin A mot aktivitet. Ett mikrogram cekropin A motsvarar 1 000 en- heter aktivitet.

Anti-E.coli-aktivitet av PS CMS-fraktioner Fraktion nr Specifik aktivitet (enheter/pg) Ps cMc Fr. 1 0,5 Ps cmc Pr. 11 0,7 Ps cMc Pr. III 1,4 Ps cMc Pr. Iv 2,0 Ps cMc Pr. v 14,0 Ps cMc Fr. vi 84,0 Ps cmc Fr. V11 100,0 468 516 10 15 20 25 30 35 Anti-E.co1i-aktiviteten av fraktioner uppsamlade från kromatografi i revers fas av PS CMC Fr. VII pá en FPLC- -kopplad PepRPC HR5/5-kolonn Fraktion nr Fr.

Fr.

Fr.

Fr.

Fr.

Fr.

Fr.

Fr.

Fr. 1-8 9 10 11 12 13 Enhet aktivitet/fraktion aktivitet ej detekterbar 8400 28000 28000 13000 7300 3500 1100 aktivitet ej detekterbar kolonnen.

I denna test applicerades 400 pg PS CMC Fr. VII pá EXEMPEL 4 Exempel 3 upprepades under användning av Bacillus megaterium för mätning av den antibakteriella aktiviteten av föreliggande polypeptid. Försöket har visat att gg; cillus megaterium är känsligare än E.coli mot peptiden, varvid medelaktiviteten av polypeptiden var cirka 3 gånger högre än i förhållande till E.co1i. 10 15 20 25 30 35 Organism Escherichia coli K12 Escherichia coli Salmonella typhimurium Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Aeinetobacter calcoaceticus Bacillus megaterium Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes EXEMPEL 5 Inhibitionszonassay av PR-peptider på olika bakterier Stam D21 Bd222l/75 Ll2 Pvll OT97 Acll Bmll Bsll Cowan 1 Max zon (mm) 18,3 17,6 15,2 3,5 4,5 12,5 17,4 10,3 468 516 LV-värde (uM) 0,3 0,3 300 200 0,3 15 200 Maximikoncentrationen av PR-peptiden var 2,5 mM, 3 pl applicerades på varje brunn i tunna agarosplattor ympade med testbakterie. LV-värden erhålles från en utspädnings- serie och är den lägsta koncentrationen som ger avdödning (Hultmark et al., 1982).

Claims (6)

468 516 10 u, PATENTKRAV

1. Polypeptid innefattande följande aminosyra- sekvens: Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg- Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro- Pro-Gly-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro, och funktionella derivat därav.

2. Polypeptid enligt patentkravet 1 i en oderiva- tiserad form.

3. Polypeptid enligt patentkravet 1 eller 2 för terapeutiskt ändamål.

4. Polypeptid enligt patentkravet 3 för användning som antibakteriellt medel.

5. Farmaceutisk komposition innehållande som aktiv beståndsdel polypeptiden enligt patentkravet 1 eller 2 i en antibakteriellt effektiv mängd tillsammans med en farmaceutiskt acceptabel bärare eller diluent.

6. Farmaceutisk komposition enligt patentkravet 5, vari nämnda bärare eller diluent är acceptabel för oral, intramuskulär, intravenös eller subkutan administration.