WO2021200800A1

WO2021200800A1 - コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン

Info

Publication number: WO2021200800A1
Application number: PCT/JP2021/013237
Authority: WO
Inventors: 啓徳中神; 森下　竜一; 林　宏樹; 孝緒小松野
Original assignee: 国立大学法人大阪大学; アンジェス株式会社
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-10-07
Also published as: JPWO2021200800A1; TW202144574A

Abstract

本発明は、コロナウイルス感染およびコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療に用いるためのワクチンを提供する。

Description

コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン

　本発明は、コロナウイルスの特定の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターまたは前記部分アミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として含むコロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療用ワクチンに関する。

　コロナウイルスは、ニドウイルス目、コロナウイルス亜科、コロナウイルス科に分類され、形態が王冠(crown)に似ていることからギリシャ語で王冠を意味する“corona”という名前が付けられた。コロナウイルスは、直径約100nmの球形ウイルスであり、脂質二重膜のエンベロープの中にヌクレオカプシドタンパク質に巻きついた一本鎖(+)RNAのゲノムを有し、ウイルスゲノムの大きさはRNAウイルスの中では最大サイズの30kbである。エンベロープ表面にはスパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質が配置されている。

　ヒトに日常的に感染するコロナウイルス（Human Coronavirus：HCoV）は４種類知られており、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63およびHCoV-HKU1である。風邪の10～15％（流行期35％）はこれら4種のコロナウイルスが原因であり、冬季に流行のピークが見られ、ほとんどの子供は6歳までに感染を経験する。多くの感染者は軽症だが、高熱を引き起こすこともある。HCoV-229E、HCoV-OC43が最初に発見されたのは1960年代であり、HCoV-NL63とHCoV-HKU1は2000年代に入って新たに発見された。また、2002年に中国広東省で発生し、2002年11月から2003年7月の間に30を超える国や地域に拡大したSARS-CoVは、コウモリのコロナウイルスがヒトに感染して重症肺炎を引き起こす。比較的近年では、2012年にサウジアラビアで発見されたMERS-CoVは、ヒトコブラクダに風邪症状を引き起こすウイルスであるが、種の壁を超えてヒトに感染すると重症肺炎を引き起こす。

　2019年に中国武漢市付近で発生が初めて確認されたSARS-CoV-2は、急速な勢いで感染が拡大し、中国国内のみならず、日本を含むアジア、ヨーロッパ、北米、南米、中東、アフリカ、オセアニアなど他の国々にも拡大した。2020年3月11日にはSARS-CoV-2の世界的流行を受けて世界保健機関(WHO)はパンデミックを宣言し、2020年3月23日時点では全世界で30万人を超える感染者が確認された。SARS-CoV-2はヒトに対して病原性を有する7番目のコロナウイルスとして報告されている（非特許文献１）。SARS-CoV-2には2020年3月時点においては有効な治療薬がなくその開発が急がれているが、一般に医薬品の開発には数年から十数年の期間を要するため、現状では感染拡大を防ぐための予防的措置を講じることが重要となっている。ウイルス感染に対する代表的予防的手段としてはワクチンが挙げられ、一刻も早いSARS-CoV-2に対するワクチンの供給が望まれている。

Na Zhu et al., New England Journal of Medicine 382(8), 727-733, 2020

　本発明は、コロナウイルス感染およびコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療に用いるためのワクチンを提供することを課題とする。

　一般的には、ワクチンとして弱毒化したウイルスまたは不活性化したウイルスを対象に接種することによってウイルスに対する免疫（抗体、T細胞）を誘導することができる。しかし、弱毒化したウイルスまたは不活性化したウイルスの調製は鶏卵法でも5～8か月、細胞培養法でも4～7か月程度かかるため、一刻も早い供給が望まれるSARS-CoV-2に対するワクチンの調製には適していない。そこで本発明者らは、抗原としてウイルスを構成するタンパク質を対象内で一過性に発現させる方法(DNAワクチン)、またはタンパク質自体を直接対象に投与する方法(ペプチドワクチン)を検討した。SARS-CoV-2のエンベロープに存在するスパイクタンパク質の全長アミノ酸配列および部分アミノ酸配列をSARS-CoV-2の感染を阻害する抗体を誘導するための抗原候補として使用する。前記抗原候補をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターをマウス、ラットおよびサルに投与し、SARS-CoV-2に対する抗血清の誘導を確認する。
　発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］以下の（１）～（４）のいずれかを含む、コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン：
（１）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（３）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［２］以下の（１’）または（２’）を含む、［１］に記載のワクチン：
（１’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［３］配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクターが配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである、［１］または［２］に記載のワクチン。
［４］以下の（１’’）または（２’’）を含む、［１］に記載のワクチン：
（１’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［５］配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクターが配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである、［１］または［４］に記載のワクチン。
［６］ポリペプチドがキャリアタンパク質をさらに含む、［１］～［５］のいずれか１つに記載のワクチン。
［７］アジュバントをさらに含む、［１］～［６］のいずれか１つに記載のワクチン。
［８］コロナウイルス感染に伴う症状が、発熱、咳、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、筋肉痛、関節痛、気管支炎、下痢、味覚異常、嗅覚異常、肺炎および髄膜炎からなる群から選択される、［１］～［７］のいずれか１つに記載のワクチン。

　コロナウイルスのスパイクタンパク質の全長アミノ酸配列または部分アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターをDNAワクチンまたは前記全長アミノ酸配列または部分アミノ酸配列からなるペプチドをペプチドワクチンとして用いることにより、コロナウイルスの感染を阻害するまたは感染した細胞を殺傷する抗体およびT細胞を誘導し、それによってコロナウイルスの感染のみならず、コロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療を期待することができる。

１．コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン
　本発明は、コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン（以下、本発明のワクチン）を提供する。

　本発明のワクチンによって感染が予防または治療されるコロナウイルスは、ヒトに感染するコロナウイルスであれば特に制限されない。そのようなコロナウイルスとしては、Human Coronavirus(HCoV)-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus(SARS-CoV)、Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV)およびSARS-CoV-2、好ましくはSARS-CoV、SARS-CoV-2、最も好ましくはSARS-CoV-2が挙げられる。

　本発明のワクチンによって予防または治療されるコロナウイルス感染に伴う症状は、コロナウイルスの感染に起因して誘発される症状であれば特に制限されない。例えば、発熱、咳、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、筋肉痛、関節痛、気管支炎、下痢、味覚異常、嗅覚異常、肺炎および髄膜炎などが挙げられる。

　本発明のワクチンの投与対象は、コロナウイルスが感染し得る哺乳動物であれば特に制限されない。そのような哺乳動物としては、例えば、マウス等のげっ歯類、イヌ等のペット、ブタ、ウマ等の家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジー等の霊長類等が挙げられ、特にヒトが好ましい。

　本発明のワクチンは、以下の（１）～（４）：
（１）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（３）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
のいずれかを含む。
　本発明のワクチンは、好ましくは、以下の（１’）または（２’）：
（１’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、
以下の（１’’）または（２’’）：
（１’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
を含む。

　本発明のワクチンに含まれる上記（１）、（１’）および（１’’）の発現ベクターが発現するポリペプチドならびに上記（３）、（２’）および（２’’）のポリペプチド（以下、本発明のポリペプチド）は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質を構成するアミノ酸配列の全長配列または部分配列である。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質は、エンベロープ上で3量体を形成しており、各スパイクタンパク質はS1サブユニットとS2サブユニットから構成される。S1サブユニットおよびS2サブユニットは1分子のタンパク質として翻訳された後、2分子に切断されることによって生じる。S1サブユニットは、細胞表面の受容体を認識する受容体結合ドメイン(RBD)を有し、S2サブユニットは、膜融合に関与する機能ドメインを含む。本発明のポリペプチドのうち、配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、SARS-CoV-2のS1サブユニットおよびS2サブユニットからなるポリペプチドに相当する。配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によってコードされる。また、配列番号：４に示されるアミノ酸配列は、SARS-CoV-2のS1サブユニットからなるポリペプチドに相当する。また、配列番号：４に示されるアミノ酸配列は、例えば配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸によってコードされる。

　また、本発明のワクチンに含まれる上記（２）の発現ベクターが発現するポリペプチドまたは上記（４）のポリペプチドは、本発明のポリペプチドにおいて１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列である。そのようなポリペプチドとしては、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列も含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、(1)配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列に１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)上記(1)～(4)の変異が組み合わせられたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、１又は数個（好ましくは１～数（２～５）個））が含まれる。

　「アミノ酸残基の置換」としては、例えば保存的アミノ酸置換があげられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）があげられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などもあげることができる。

　「アミノ酸残基の欠失」としては、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列の中から、任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることがあげられる。

　「アミノ酸残基の挿入」または「アミノ酸残基の付加」としては、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列の内部、N末端側またはC末端側に、アミノ酸残基を挿入または付加させることがあげられる。ペプチドの水溶解性を増強するため、アミノ酸配列のN末端側またはC末端側に塩基性アミノ酸であるアルギニン（Arg）またはリジン（Lys）を１ないし２残基付加してもよい。

　本発明のポリペプチドは、付加的なアミノ酸をさらに含んでいてもよい。このようなアミノ酸付加は、該ポリペプチドがコロナウイルスに対する特異的免疫反応の誘導を阻害しない限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることが出来る。タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を例示することが出来る。アミノ酸配列が付加される位置は、本発明のポリペプチドのN末端及び／又はC末端である。

　本発明のポリペプチドに用いられるアミノ酸はL体、D体およびDL体を包含するものであるが、通常、L体であることが好ましい。これらのポリペプチドは、通常のポリペプチド合成法によって合成され本発明に供することが出来るが、本発明においては製造方法、合成方法、調達方法等については、特に限定されない。

　上記（１）、（２）、（１’）および（１’’）の発現ベクター（以下、本発明の発現ベクター）においては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNA又はRNA、好ましくはDNA）が、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に機能的に連結されている。即ち、本発明の発現ベクターは、プロモーターの制御下で、翻訳産物として本発明のポリペプチドを産生する。本発明の発現ベクターを哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物の体内において本発明のポリペプチドが産生され、該哺乳動物に本発明のポリペプチドに対する特異的免疫反応が誘導される。
　使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β－アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーター等が用いられる。

　本発明の発現ベクターは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）を含有することもできる。

　また、本発明の発現ベクターは、シグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、本発明のポリぺプチドをコードする塩基配列からなる核酸の5’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。使用されるシグナル配列としては、例えば、インスリンシグナル配列、α-インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが用いられる。

　本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を挙げることが出来る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等が挙げられる。製造及び取り扱いの容易性や経済性を考慮すると、プラスミドベクターが好ましく用いられる。

　本発明のワクチンは、本発明のポリペプチドの免疫原性を高めるために、キャリアタンパク質をさらに含んでもよい。キャリアタンパク質は、一般には、分子量が小さいために免疫原性を有さない分子（ハプテン）に結合して免疫原性を付与する物質であり、当技術分野で公知である。キャリアタンパク質の例としては、牛血清アルブミン（BSA）、ウサギ血清アルブミン（RSA）、オボアルブミン（OVA）、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）、チログロブリン（TG）、免疫グロブリン等などが好ましく挙げられる。本発明のワクチンがポリペプチドである場合は、キャリアタンパク質は本発明のポリペプチドのＮ末端またはC末端にコンジュゲートされてよい。コンジュゲートする方法としては、本発明のポリペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるSH基を介してキャリアタンパク質のアミノ基と結合させることによってコンジュゲートすることができる（MBS法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることによってもコンジュゲートすることができる（グルタルアルデヒド法）。本発明のワクチンが発現ベクターである場合は、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列からなる核酸の5’側または3’側に、該キャリアタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸が連結されてよい。

　本発明のワクチンはまた、製薬上許容可能で且つ活性成分と相溶性であるアジュバントをさらに含有することが好ましい。アジュバントは、一般には、宿主の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、多数のアジュバントが当技術分野で公知である。本発明のワクチンに使用されるアジュバントは、免疫応答を非特異的に増強することができる限り特に限定されないが、例えば、ミョウバン、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、dsRNA、モンタナイド、サーバリックス等が挙げられる。

　本発明のワクチンは、本発明のポリペプチド又は本発明の発現ベクターに加えて、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。

　医薬上許容される担体は、剤形によって適宜選択されてよく、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

　さらに、本発明のワクチンが本発明の発現ベクターの場合、該発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明のワクチンは更に核酸導入用試薬を含むことができる。発現ベクターとしてウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、フィブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、発現ベクターとしてプラスミドベクターを使用する場合には、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。

　本発明のワクチンは、経口又は非経口的に哺乳動物に対して投与することが出来る。ポリペプチドや発現ベクターは、胃の中で分解され得るので、非経口的に投与することが好ましい。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。

　医薬組成物中の有効成分の含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1～100重量％、好ましくは約1～99重量％、さらに好ましくは約10～90重量％程度である。
　本発明のワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、有効成分が本発明のポリペプチドの場合は、通常成人１人当たりポリペプチドを、一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常４週間から１２週間に亘って、２回から３回投与し、抗体価が低下した場合にはその都度１回追加投与する。有効成分が本発明の発現ベクターの場合は、通常成人１人当たり発現ベクターを、一回当たり1μg～1000μgの範囲、好ましくは20μg～100μgの範囲で、通常４週間から１２週間に亘って、２回から３回投与し、抗体価が低下した場合にはその都度１回追加投与する。

　本発明のワクチンを哺乳動物へ投与することにより、コロナウイルスに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が誘導され、該哺乳動物がコロナウイルスに対する中和抗体を獲得し、哺乳動物内に侵入したコロナウイルスの感染が阻害される。従って、本発明のワクチンによってコロナウイルスの感染が阻害される結果、コロナウイルス感染に伴う症状に対する予防または治療効果が発揮される。

　また本発明は、本発明のワクチンの１または２以上の成分を包含する、１または２以上の容器からなるキットを提供する。本発明のキットを用いることによっても、コロナウイルス感染に伴う症状を予防することができ、またはその症状を治療もしくは軽減することができる。

　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

DNAワクチン設計
　SARS-CoV-2のS1サブユニットおよびS2サブユニットからなるポリペプチド（配列番号２）およびS1サブユニットのみからなるポリペプチド（配列番号４）を選択し、当該ポリペプチドをコードする塩基配列（配列番号１、３）をそれぞれ合成し、それぞれ発現ベクターpVAX1に発現可能に連結し、DNAワクチンS1+S2およびDNAワクチンS1として調製した(2mg/ml)。

実施例１　DNAワクチンのマウスへの投与
　8週齢のBALB/c雄マウス（N=6）の背中の左右4箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所20μL（160μg/80μL）を注射器（ダイセル社）を用いて2週間毎に3回皮内投与する。
　また、8週齢のBALB/c雄マウス（N=6）の肢の左右2箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所50μL（200μg/100μL）をアラムアジュバント（水酸化アルミニウム）とともに2週間毎に3回筋肉内投与する。
　前記の皮内投与および筋肉内投与したマウスから初回投与前、初回投与後2週目、4週目、6週目、8週目および12週目に血清を取得し、抗体価の測定およびElispot assayを実施する。

実施例２　DNAワクチンのラットへの投与
　8週齢のSD雄雌ラット（各N=6）の背中の左右4箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所30μL（240μg/120μL）を注射器（ダイセル社）を用いて2週間毎に3回皮内投与する。
　また、8週齢のSD雄雌ラット（各N=6）の背中の左右2箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所50μL（200μg/100μL）を注射器（インジェックス社）を用いて2週間毎に3回皮下投与する。
　また、8週齢のSD雄雌ラット（各N=6）の肢の左右2箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所100μL（400μg/200μL）をアラムアジュバント（水酸化アルミニウム）とともに2週間毎に3回筋肉内投与する。
　前記の皮内投与、皮下投与および筋肉内投与したラットから初回投与前、初回投与後2週目、4週目および6週目に血清を取得し、抗体価の測定を実施する。
　また、DNAワクチンの毒性評価として以下の項目を観察、測定または検査する。
（１）一般状態観察（1回/日）
（２）体重測定（1回/週）
（３）摂餌量測定（1回/週）
（４）眼科学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（５）尿検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（６）血液学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（７）血液生化学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（８）剖検
（９）器官重量測定
（１０）病理組織学的検査

実施例３　DNAワクチンのサルへの投与
　カニクイザル（N=3）の背中の左右8箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所50μL（800μg/400μL）を注射器（ダイセル社）を用いて2週間毎に3回皮内投与する。
　同様に、カニクイザル（N=3）の背中の左右4箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1をそれぞれ1箇所100μL（800μg/400μL）を注射器（インジェックス社）を用いて2週間毎に3回皮下投与する。
　また同様に、カニクイザル（N=3）の脚の左右2箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所500μL（2000μg/1000μL）をアラムアジュバント（水酸化アルミニウム）とともに2週間毎に3回筋肉内投与する。
　初回投与前、初回投与後2週目、4週目および6週目に血清を取得し、抗体価の測定を実施する。

　カニクイザル（N=3）の背中の左右8箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所50μL（800μg/400μL）を注射器（ダイセル社）を用いて2週間毎に3回皮内投与する。
　同様に、カニクイザル（N=3）の背中の左右4箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1をそれぞれ1箇所100μL（800μg/400μL）を注射器（インジェックス社）を用いて2週間毎に3回皮下投与する。
　また同様に、カニクイザル（N=3）の脚の左右2箇所にDNAワクチンS1+S2、DNAワクチンS1または発現ベクターpVAX1をそれぞれ1箇所500μL（2000μg/1000μL）をアラムアジュバント（水酸化アルミニウム）とともに2週間毎に3回筋肉内投与する。
　馴化中1回、投与期間中2回にDNAワクチンの安全性薬理評価として以下の項目を測定または検査する。
（１）循環系：ホルタ―心電計による心電図測定、拘束条件下での血圧測定
（２）呼吸系：目視による呼吸数測定、血液ガス測定
（３）中枢系：FOB検査、体温測定
　また、DNAワクチンの毒性評価として以下の項目を観察、測定または検査する。
（１）一般状態観察（1回/日）
（２）体重測定（1回/週）
（３）摂餌量測定（1回/週）
（４）眼科学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（５）尿検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（６）血液学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（７）血液生化学的検査（投与前および投与期間中1回づつ）
（８）剖検
（９）器官重量測定
（１０）病理組織学的検査

　本発明の発現ベクターをDNAワクチンまたは本発明のペプチドをペプチドワクチンとして用いることにより、コロナウイルスの感染を阻害する抗体を誘導し、それによってコロナウイルスの感染を阻害するまたは感染した細胞を殺傷する抗体またはT細胞を誘導し、それによってコロナウイルスの感染のみならず、コロナウイルスに伴う症状の予防または治療を期待することができる。本発明によればコロナウイルスを直接操作する必要性がないためワクチンの製造工程が安全である。また、ウイルスの製造を伴わないため、短期間でワクチンを提供することができる。本出願は、日本で出願された特願2020-061369（出願日：令和2年3月30日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims

　以下の（１）～（４）のいずれかを含む、コロナウイルス感染またはコロナウイルス感染に伴う症状の予防または治療ワクチン：
（１）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（３）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（４）配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　以下の（１’）または（２’）を含む、請求項１に記載のワクチン：
（１’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクターが配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである、請求項１または２に記載のワクチン。
　以下の（１’’）または（２’’）を含む、請求項１に記載のワクチン：
（１’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクター、
（２’’）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現する発現ベクターが配列番号：３に示される塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターである、請求項１または４に記載のワクチン。
　ポリペプチドがキャリアタンパク質をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン。
　アジュバントをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のワクチン。
　コロナウイルス感染に伴う症状が、発熱、咳、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、筋肉痛、関節痛、気管支炎、下痢、味覚異常、嗅覚異常、肺炎および髄膜炎からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン。