CN118043451A - 疫苗抗原 - Google Patents

疫苗抗原 Download PDF

Info

Publication number
CN118043451A
CN118043451A CN202280061029.3A CN202280061029A CN118043451A CN 118043451 A CN118043451 A CN 118043451A CN 202280061029 A CN202280061029 A CN 202280061029A CN 118043451 A CN118043451 A CN 118043451A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cov
vaccine
protein
coronavirus
trimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280061029.3A
Other languages
English (en)
Inventor
潘泰利斯·蓬布里奥斯
海迪·德鲁默尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Original Assignee
Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2021902500A external-priority patent/AU2021902500A0/en
Application filed by Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd filed Critical Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Publication of CN118043451A publication Critical patent/CN118043451A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本说明书的领域广泛涉及SARS‑CoV‑2疫苗刺突蛋白抗原以及使用和制备这些抗原的方法。本发明还涉及编码SARS‑CoV‑2疫苗抗原的载体和多核苷酸以及包括冠状病毒疫苗抗原的疫苗、试剂盒、装置和条带。来自SARS‑CoV‑2的刺突蛋白具有在位置986、987(2P或S‑2P)处取代的脯氨酸，以及在位置A1016和A1020处的另外的丙氨酸腔填充突变。

Description

疫苗抗原
技术领域
本说明书的领域广泛涉及冠状病毒疫苗抗原以及使用和制备冠状病毒疫苗抗原的方法。本发明还涉及编码冠状病毒疫苗抗原的载体和多核苷酸以及包括冠状病毒疫苗抗原的疫苗、试剂盒、装置和条带。
背景技术
本说明书的结尾还列出了本说明书中的参考文献的书目详细信息。
本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为承认或以任何形式暗示此现有技术形成任何国家的公知常识的一部分。
SARS-CoV-2已导致全球超过400万人死亡，其具有强烈的年龄相关感染致死率。提供用于体内表达和中和抗体(NAb)诱导的SARS-CoV-2源性病毒刺突糖蛋白(S)序列的第一代疫苗已被证明在预防有症状和严重的COVID-19方面非常有效，并且已经在全球推广。高效S疫苗平台包含mRNA(辉瑞生物科技公司(Pfizer-BioNTech)，BNT162b2；莫德纳公司(Moderna)mRNA-1273)(Baden等人,2021；Polack等人,2020)、腺病毒26和腺病毒5(Ad26，Ad5)(Sputnik V；强生公司(Janssen)COVID-19)(Logunov等人,2021；Sadoff等人,2021)和黑猩猩腺病毒(阿斯利康/牛津(Astrazeneca/Oxford)，ChAdOx1 nCoV-19)(Emary等人,2021；Madhi等人,2021；Voysey等人,2021)。通过从COVID-19患者中分离单克隆中和抗体(NAb)，显示出S内对NAb的脆弱性位点。S的ACE2受体结合结构域(RBD)是自然感染中的免疫显性抗体靶标，并且引导到RBD的高效NAb可以通过ACE2受体模拟(例如B38)或通过ACE2结合的空间阻断(例如H4)或通过与2个RBD单体形成的四元表位结合(例如2-43)来阻断感染。S1的N末端结构域(NTD)已被鉴定为脆弱性的超位点，并且包括多个抗原位点(Andreano等人,2020；Cerutti等人,2021；Liu等人,2020；McCallum等人,2021)。此区表现出高度的可塑性，可通过缺失、插入和聚糖添加来躲避抗体。在S1和S2内也观察到了未定义的中和表位(Brouwer等人,2020；Jennewein等人,2021)。
对SARS-CoV-2的自然获得性免疫被认为是导致相关变体(VOC)出现的原因，其中RBD和NTD中的突变降低了康复期和疫苗诱导的免疫血清以及人单克隆NAb的中和效力(Plante等人,2021)。在VOC的RBD中观察到的关键突变包含K417T/N、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K/Q和N501Y，而在NTD中，已经观察到氨基酸69-70、156-157和242-245的缺失。疫苗功效也可能因VOC而异，这取决于病毒S序列和疫苗形式。因此，在α/B.1.1.7分离株的情况下，ChAdOx1-nCOV-19疫苗功效从81.5％降低到70.4％(Emary等人,2021)，而β/B.1.351分离株的功效降低到10.4％(Madhi等人,2021)。ChAdOx1 nCOV-19对这些VOC的降低的功效似乎与疫苗血清对VOC的降低的体外中和效力有关(Dejnirattisai等人,2021；Supasa等人,2021)。mRNA疫苗接种者血清对VOC的中和效力也降低(Alter等人,2021；Dejnirattisai等人,2021；Garcia-Beltran等人,2021，Liu等人,2021；Supasa等人,2021；Tada等人,2021)。然而，用BNT162b2完全接种疫苗提供了高水平的保护，防止由α和β变体引起的感染和疾病(Abu-Raddad等人,2021)，尽管在发生突破性感染的地方，已经发现这些感染与VOC有关(Kustin等人,2021)。尽管目前的疫苗迄今为止对大多数VOC保持了显著的功效，但随着大流行在部分免疫的人群体中的发展，可能需要使用与VOC匹配的疫苗来维持对新出现的病毒变体的免疫力。
因此，需要改进的抗原来引发对冠状病毒的免疫应答。具体地，需要改进的抗原来引发对冠状病毒VOC的免疫应答。
发明内容
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两个含义或任一含义提供明确支持。如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语“约”是指特指值的+/-10％，更优选地+/-5％，甚至更优选地+/-1％。
贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。
如本文所使用的，除非上下文另外指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含单数和复数个指示物。除非另外明确地说明，否则本说明书中的每个实施例在进行必要的修改后适用于所有其它实施例。
核苷酸和氨基酸序列由序列标识符编号(SEQ ID NO:)指示。SEQ ID NO:在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等。序列表在权利要求之后提供。
一方面，本发明提供一种冠状病毒疫苗抗原，其包括冠状病毒S蛋白三聚体，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小所述S蛋白三聚体的卷曲盘绕区内的丙氨酸腔的大小，并且其中所述S蛋白三聚体引发中和抗体应答。
一方面，本发明提供一种冠状病毒疫苗抗原，其包括冠状病毒S蛋白三聚体，其中在形成所述S蛋白三聚体的所述卷曲盘绕的S蛋白单体的区中的至少一个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。
一方面，本发明提供了一种载体或多核苷酸，所述载体或多核苷酸编码如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的所述S蛋白单体。在一个实施例中，多核苷酸是针对在宿主细胞或疫苗受体细胞中表达而优化的密码子。
在一个实施例中，本发明提供了一种所述多核苷酸的多核苷酸补体，所述多核苷酸编码如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的所述S蛋白单体。
一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如本文所描述的载体或多核苷酸。在一个实施例中，所述宿主细胞是用于体外表达的宿主细胞，而不是疫苗受体细胞。
一方面，本发明提供一种产生如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的方法，所述方法包括在培养基中培养如本文所描述的宿主细胞。
一方面，本发明提供了一种蛋白质纳米颗粒，所述蛋白质纳米颗粒包括如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
一方面，本发明提供了一种病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
一方面，本发明提供了一种小瓶或固体或半固体表面，所述小瓶或固体或半固体表面含有如本文所描述的载体或多核苷酸、抗原、蛋白质纳米颗粒或VLP。
一方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原、或如本文所描述的载体或多核苷酸、或如本文所描述的蛋白质纳米颗粒、或如本文所描述的病毒样颗粒。
一方面，本发明提供了一种在受试者体内诱导对冠状病毒(CoV)的免疫应答的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种在受试者体内增强对冠状病毒(CoV)的所述免疫应答的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种预防或降低受试者的冠状病毒(CoV)感染的可能性的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种预防或降低受试者的冠状病毒(CoV)感染的症状的可能性或严重程度的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种降低受试者的冠状病毒(CoV)感染的严重程度和/或持续时间的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种预防或降低感染冠状病毒(CoV)的人类个体的病毒脱落的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种如本文所描述的CoV疫苗抗原或如本文所描述的疫苗，其用于以下中一种或多种：i)预防受试者的CoV感染或降低其可能性；ii)预防受试者的CoV症状或降低其可能性或严重程度，iii)降低受试者的CoV感染的严重程度和/或持续时间；iv)预防或降低受试者的病毒脱落；以及v)治疗受试者的CoV感染。
一方面，本发明提供了一种试剂盒、装置、表面或条带，所述试剂盒、装置、表面或条带包括如本文所描述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
一方面，本发明提供了冠状病毒(CoV)疫苗抗原在制备用于以下中的一种或多种的药物中的用途：i)预防受试者的CoV感染或降低其可能性；ii)预防受试者的CoV症状或降低其可能性或严重程度，iii)降低受试者的CoV感染的严重程度和/或持续时间；iv)预防或降低受试者的病毒脱落；以及v)治疗受试者的CoV感染。
一方面，本发明提供了所述抗原或编码序列在制备用于治疗、预防或测试群体中的冠状病毒(CoV)感染的制剂中的用途。在一个实施例中，如本文所描述的稳定三聚体S蛋白用于制备中和抗体。
一方面，本发明提供了一种缺乏异源三聚化序列的可溶性S蛋白三聚体，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小所述S蛋白三聚体的卷曲盘绕区中的丙氨酸腔的大小，并且其中所述S蛋白三聚体引发中和抗体应答。
一方面，本说明书提供了一种冠状病毒S蛋白疫苗抗原三聚体，其特征在于以下特征中的一个或两个或更多个特征：
(i)形成为非二硫化物连接的三聚体；
(ii)形成为稳定的非二硫化物连接的三聚体；
(iii)形成在约58℃下热稳定的三聚体；
(iv)通过在25℃下用含有和不含有B2ME的0.8％w/v SDS处理，形成比对照(例如，S2P-FHA)更耐破坏的三聚体；
(v)通过与不含B2ME的0.8％w/v SDS一起煮沸形成比合适的对照(例如，S2P-FHA)更耐破坏的三聚体；
(vi)在没有异源三聚化模块的情况下形成稳定的可溶性三聚体。
在一个实施例中，经考虑本文所描述的经修饰的冠状病毒S抗原显示出降低的脱靶反应性，因为由所述经修饰的卷曲盘绕区诱导的结构变化增强了三聚体稳定性，并且避免了使用异源三聚化结构域来稳定表达的三聚体。
一方面，本说明书提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码受体细胞并且能够在所述受体细胞上表达的核苷酸的序列，至少如本文所描述的修饰的冠状病毒S蛋白抗原。在一个实施例中，与适当的对照相比，经修饰的抗原以分离株依赖性方式显示出宽中和表位的增强的暴露。
附图说明
图1A)表示用坐标PDB ID 6VSB绘制的SARS-CoV-2S胞外结构域的三维结构(Walls等人,2020)。RBM，具有受体相互作用氨基酸的ACE2受体结合基序，在结构的顶部处示出为灰色球体；RBD，受体结合结构域为结构的顶部处的黑色，β链示出为粗箭头；NTD，N末端结构域为灰色，其中β片表示为粗箭头。S2的中心卷曲盘绕以深灰色显示为3个竖直螺旋，其中Ala腔以浅灰色突出显示。B)3种β冠状病毒的卷曲盘绕序列内的七肽重复序列基序。C)融合前(PDB ID 6VSB(Walls等人,2020))和融合后(PDB 6XRA(Cai等人,2020))构象的中心卷曲盘绕的比较。HR1螺旋(在右侧结构中以白色示出)形成卷曲盘绕的延伸的基部，所述延伸在融合后构象中朝向细胞膜向上突出(Cai等人,2020)。D)融合前S的Ala腔在用疏水性氨基酸取代后可以如何被填充的说明。
图2展示了S2P-FHA的表达、结合特性和稳定性。A)经纯化的S2P-FHA三聚体的Superose 6尺寸排阻色谱法(SEC)。B)经纯化的S2P-FHA在还原条件下的SDS-PAGE。C)ELISA中的亲和素捕获的生物素化的S2P-FHA三聚体与ACE2-Fc和各种人单克隆抗体的结合。D)使用SYPRO Orange对经纯化的S2-FHA蛋白进行差示扫描荧光测定法。示出了荧光随时间变化的速率[-d(RFU)/dt]作为温度的函数。
图3示出了Ala腔突变体的表达和稳定性筛选。A)使用TALON二价阳离子亲和树脂从培养上清液中纯化的S2P-FHA突变体在还原条件下的SDS-PAGE。将10％聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝(Coomassie blue)染色。B)使用SYPRO Orange对经纯化的S蛋白进行差示扫描荧光测定法。示出了荧光随时间变化的速率[-d(RFU)/dt]作为温度的函数。
图4示出了所选Ala腔突变体的纯化和表征。A)从TALON树脂洗脱后，S2P-FHA的Superose 6SEC和选定的Ala腔突变体。校准标准品是甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)和IgG(150kDa)。B)冷冻(-80℃)-解冻循环后经纯化的三聚体的蔗糖6SEC。C)使用SYPRO Orange对经纯化的S蛋白进行差示扫描荧光测定法。示出了荧光随时间变化的速率[-d(RFU)/dt]作为温度的函数。至少两个独立实验的代表。D)经纯化的S2P-FHA变体三聚体在非还原(顶部)和还原(底部)条件下的SDS-PAGE。将10％聚丙烯酰胺凝胶用考马斯蓝染色。
图5示出了与Ala腔突变体结合的ACE2-Fc和人单克隆抗S2IgG的生物层干涉测量法测量。A)S2P-FHA、1016L和1016/20VI分析物与固定在抗人IgG捕获生物传感器上的S配体的结合。缔合300秒，随后解离300秒。S2P＝S2P-FHA。B)240秒的缔合后300nM S2P-FHA分析物与各种配体的相对结合如热图所示。
图6示出了Ala腔突变体的免疫原性。A)免疫方案。B)最终采血疫苗血清对板结合的RBD、S1单体和S2P-FHA三聚体的ELISA滴度。免疫原组如图下方所指示。终点被确定为在不存在一级抗体的情况下获得的背景OD的10倍。条是几何平均数。S2P＝S2P-FHA C)第16周疫苗血清的假病毒中和ID50。用于S-HIV假型测定的S基因型如下图所示。使用威尔科克森配对检验(Wilcoxon matched pairs test)来确定组间观察到的ID50的差异是否显著：ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；**，P<0.01。几何平均中和ID50和B.1.351相对于Hu-1假型的平均中和的倍数减少如下图所示。S2P＝S2P-FHA。D)血清对Hu-1 RBD和RBD-NKY(N417N/E484K/N501Y)突变体的结合滴度。终点被确定为在不存在一级抗体的情况下获得的背景OD的10倍。条是几何平均数。ns：不显著；克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal Wallis test)。S2P＝S2P-FHA。
图7示出了疫苗血清的祖先Hu-1 S假病毒中和ID50。ns：不显著；**，P<0.01，克鲁斯卡尔-沃利斯检验。
图8示出了突变体S假型的第16周疫苗血清的假病毒中和ID50。在S-HIV假型测定中使用的S基因型如下所示。使用弗里德曼检验(Friedman test)来确定组间观察到的ID50的差异是否显著：ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；***，P<0.0001。Hu-1＝祖先Hu-1。
图9通过竞争ELISA评估的引发的抗体的特异性。A)疫苗血清的竞争ID50。在与亲和素捕获的生物素化的S2P-FHA和Ala腔突变体一起温育之前，将0.5log10连续稀释的最终采血疫苗血清与恒定量的ACE2-Fc和人单克隆抗S-IgG混合。免疫原组如图下方所指示。A)使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验来确定组间观察到的ID50的差异是否显著：ns，不显著；**，P<0.01。B)S2P-FHA三聚体中抗体表位的位置。S2P＝S2P-FHA。B)ACE2-Fc和人单克隆抗S-IgG结合位点(表位)在S三聚体中的位置。
图10示出了SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
图11示出了S2P(SEQ ID NO:2)和S2P-FHA(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。
图12示出了S2P(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列。
图13示出了S2P-FHA(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列。
图14示出了与目前编码野生型病毒的常规疫苗相比，受试者突变体S抗原对野生型(Hu-1)病毒引发更强的免疫应答，以及对高抗性变体(β)的更强的免疫应答。突变体S假型的第16周疫苗血清的假病毒中和ID 50与使用常规疫苗在人中产生的疫苗应答。在S-HIV假型测定中使用的S基因型如图下方所指示。数据显示了与在人中接种两个剂量的常规疫苗(右侧为说明性常规疫苗(给予人的两个剂量的mRNA或腺病毒疫苗)后3周至5周获得的血清相比，接种含有1016/20VI的S2P-FHA蛋白三聚体(左侧Burnet VI刺突)的豚鼠对匹配的WT(Hu-1)病毒和高抗性相关变体(β变体)的中和抗体应答。使用威尔科克森配对检验来确定组间观察到的ID 50的差异是否显著：ns，不显著，p≥0.05；****P<0.0001。
图15示出了疫苗血清的ELISA结合滴度。A)疫苗血清对生物素化的RBD单体(与在亲和素涂覆的ELISA板上捕获的Hu-1、δ和奥密克戎BA.1变体(在x轴上指示)相对应)的ELISA结合滴度。免疫原组如变体名称下方所指示。终点被确定为在不存在一级抗体的情况下获得的背景OD的5倍。水平条是每个免疫原组的几何平均结合滴度。A)疫苗血清对S2P-FHA(与和ELISA板结合的Hu-1、δ和奥密克戎BA.1变体(在x轴上指示)相对应)的ELISA结合滴度。免疫原组如变体名称下方所指示。终点被确定为在不存在一级抗体的情况下获得的背景OD的5倍。水平条是每个免疫原组的几何平均结合滴度。*，相对于克鲁斯卡尔-沃利斯检验中确定的Hu-1糖蛋白，P<0.05。在未指示P值的情况下，滴度的差异在统计学上不显著。
图16示出了中和测定的结果。A)疫苗血清的假病毒中和ID50(ID50＝引起50％中和的血清的倒数稀释度)。用于S-HIV假型测定的S变体基因型如下方x轴所示。从中获得血清的免疫原组如图上方所指示。用来自个体动物的血清获得的ID50中和滴度用各种符号指示。条形图是每个免疫原组的几何平均ID50。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验来确定变体间观察到的ID50的差异是否显著：ns，不显著。B)在微量中和测定中，使用Hu-1、δ、奥密克戎BA.1和β真实传染性SARS-CoV-2病毒，以高通量形式对HAT-24细胞进行中和测定。所使用的SARS-CoV-2变体在x轴下方示出。从中获得血清的免疫原组如图上方所指示。用来自个体动物的血清获得的ID50中和滴度用各种符号指示。水平条是每个免疫原组的几何平均ID50。使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验来确定变体间观察到的ID50的差异是否显著：ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；***，P<0.0001。
图17示出了生物素RBD和S2P-FHAELISA结合滴度的几何平均值、中和ID50以及糖蛋白和病毒变体的平均滴度相对于Hu-1(来自图15和16中所呈现的数据)的平均倍数减少。
图18示出了将1016/20VI(VI)突变引入源自SARS-CoV-2奥密克戎BA.1相关变体(此处称为S2P.奥密克戎-FHA)的S2P-FHA赋予糖蛋白三聚体超稳定性。A)通过TALON亲和色谱法纯化后，在Expi-293F细胞中表达的S2P.奥密克戎-FHA、S2P.奥密克戎.VI-FHA和在293FS细胞中表达S2P-FHA(源自Hu-1)的Superose 6SEC曲线。分子量标志物甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)和醛缩酶(158kDa)的洗脱位置如图上方用箭头所指示的。虚线框指示汇集以获得如B所示的纯三聚体的级分。B)从A中所示的实验中获得的推测的S2P.奥密克戎-FHA、S2P.奥密克戎.VI-FHA和S2P-FHA三聚体的Superose 6SEC曲线。A中的虚线框指示在Superose 6柱中重新洗脱之前浓缩并经过冷冻(-80℃)-解冻循环以获得B的级分。分子量标志物甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)和醛缩酶(158kDa)的洗脱位置如图上方用箭头所指示的。C)使用SYPRO Orange对经纯化的S2P-FHA蛋白进行差示扫描荧光测定法以确定热展开的温度。至少两个独立实验的代表。D)S2P.奥密克戎-FHA和S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体在非还原和还原(1％v/vβ巯基乙醇)下的SDS-PAGE。在此实验中，样品在电泳之前没有被煮沸。m，标志物。E)S2P.奥密克戎-FHA和S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体在非还原和还原(1％v/vβ巯基乙醇)条件下的SDS-PAGE。在电泳之前将样品煮沸5分钟。S2P.奥密克戎.VI-FHA主带在各种条件下的位置用箭头指示。m，标志物。F)S2P.奥密克戎-FHA、S2P.奥密克戎.VI-FHA和S2P-FHA三聚体在非还原(左侧凝胶)和还原(1％v/vβ巯基乙醇)(右侧凝胶)条件下的SDS-PAGE。将含有SDS的样品缓冲液添加到含有和不含1％β巯基乙醇的样品中，并且在电泳前将样品在室温(25℃)下放置或煮沸(100℃)3分钟。已与1mM双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯化学交联的甲状腺球蛋白被包含在内，以标记S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体的预期的位置(669kDa)。推测的S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体带用箭头指示。注意，S2P.奥密克戎.VI-FHA只有在存在β巯基乙醇和SDS的情况下煮沸后才被破坏为其单体分子量。
图19示出了ELISA中人中和单克隆抗体与链霉亲和素捕获的生物素化的S2P.奥密克戎-FHA(左侧小图)和生物素化的S2P.奥密克戎.VI-FHA(右侧小图)三聚体的结合。单克隆的特异性如图例旁边所指示的。
图20示出了在不存在T4折叠子三聚化标签的情况下，1016/20VI(VI)突变能够使融合前稳定的S胞外结构域(残基16-1208)三聚化。A)从溶解的全长S获得的融合前S三聚体胞外结构域的Cryo-EM结构(Cai等人,2020)。受体结合结构域以黑色示出，S2的中心卷曲盘绕为灰色，具有丙氨酸腔(其中引入了1016/20VI突变)，以深灰色突出显示。三聚体底部的3个螺旋是在低温EM结构中可见的茎的部分。虚线矩形示出了在低温EM结构中不可见的茎的部分。为了说明目的，已经添加了孤立解决的折叠子结构域的晶体结构(Guthe等人,2004)。为了说明目的，还示出了通过核磁共振解决的脂质双层膜微胞中S2跨膜结构域(TMD)的残基1217-1237的结构(Fu和Chou,2021)。竖直线分别指示通过SEC、热荧光测定和SDS-PAGE在小图B-D中分析的构建体的程度。B)S2P-FHA、S2P-1208.H6和S2P.VI-1208.H6的尺寸排阻色谱法。第一小图：通过TALON亲和色谱法从293FS细胞纯化的S2P-FHA的Superose 6洗脱曲线。箭头示出了以下分子量标准品的洗脱位置：甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)和醛缩酶(158kDa)。第二小图：通过TALON亲和色谱法从293FS细胞纯化的S2P-1208.H6(缺乏折叠子结构域)的Superose 6洗脱曲线。第三小图：通过TALON亲和色谱法从293FS细胞纯化的S2P.VI-1208.H6(含有1016/20VI突变并缺乏折叠子结构域)的Superose6洗脱曲线。第四小图：通过hiTRAP亲和色谱法从Expi293F细胞纯化的S2P.VI-1208.H6(含有1016/20VI突变并缺乏折叠子结构域)的Superose 6洗脱曲线。C)在冷冻(-80℃)-解冻循环后，使用SYPROOrange对经纯化的S三聚体进行差示扫描荧光测定法以确定热展开的温度。至少两个独立实验的代表。D)在非还原和还原条件下纯化的蛋白质的SDS-PAGE。m，标志物。
图21A)示出了S2P-1273、S2P-FHA和S2P-1208.H6构建体的示意图。L，天然前导肽，NTD，S1的N末端结构域，RBD，受体结合结构域，(P)GSAS突变消融弗林蛋白酶(furin)位点，tPAL，组织纤溶酶原激活剂前导肽；TMD，跨膜结构域，FHA，折叠子-His8-avitag序列。B)示出了在293T细胞中表达的Hu-1、δ和奥密克戎BA.1S2P-1273以及S2P.VI-1273糖蛋白的SDS-PAGE蛋白质印迹。用兔抗S1多克隆抗体检测S蛋白。左侧的凝胶是10％聚丙烯酰胺凝胶。右侧的凝胶是4％至12％聚丙烯酰胺梯度凝胶。
图22示出了如通过FACS确定的ACE2-Fc和人单克隆NAb与转染的293T细胞的表面上表达的S2P-1273糖蛋白的结合。将转染的细胞轻轻地从培养板上分离，并且用ACE2-Fc和各种人单克隆NAb和AlexaFluor缀合的抗人免疫球蛋白对完整的细胞进行染色。用碘化丙啶对细胞进行复染，以将死细胞排除在分析之外。HC33.1是HCV特异性NAb，并且用作同种型(IgG1)对照。
图23A)未染色(nil)、中等(lo)荧光和高(hi)荧光S2P-1273表达细胞的门控。B)呈图形形式的用ACE2-Fc和5种NAb染色的表达S2P-1273的细胞的分布的代表性数据，所述NAb引导到nil、lo和hi门内的S中的各种表位。
图24：S2P.奥密克戎-FHA(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。
图25：S2P.奥密克戎-FHA(SEQ ID NO:7)的DNA序列。
图26：S2P-1208.H6(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。
图27：S2P-1208.H6(SEQ ID NO:9)的DNA序列。
图28：S2P-1273(SEQ ID NO:10)的蛋白质序列。
图29：S2P-1273(SEQ ID NO:11)的DNA序列。
图30：S2P.δ-1273(SEQ ID NO:12)的蛋白质序列。
图31：S2P.δ-1273(SEQ ID NO:13)的DNA序列。
图32：S2P.奥密克戎-1273(SEQ ID NO:14)的蛋白质序列。
图33：S2P.奥密克戎-1273(SEQ ID NO:15)的DNA序列。
图34：编码S2P-1208开放阅读框(SEQ ID NO:16)的mRNA疫苗序列的实例。此序列中的“U”指示假尿苷或1-甲基假尿苷。
图35：编码S2P.VI-1273开放阅读框(SEQ ID NO:17)的mRNA疫苗序列的实例。此序列中的“U”指示假尿苷或1-甲基假尿苷。
图36：编码S2P.δ.VI-1273开放阅读框(SEQ ID NO:18)的mRNA疫苗序列的实例。此序列中的“U”指示假尿苷或1-甲基假尿苷。
图37：编码S2P.奥密克戎.VI-1273开放阅读框(SEQ ID NO:19)的mRNA疫苗序列的实例。此序列中的“U”指示假尿苷或1-甲基假尿苷。
图38示出了在存在1.2％(w/v)SDS和0.25％(v/v)β巯基乙醇的情况下进行各种热处理后，源自转染的293T细胞裂解物的S2P-1273和S2P.奥密克戎-1273糖蛋白的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析。AA：在氨基酸位置1016和1020处含有Ala的构建体；VI：在氨基酸位置1016和1020处分别含有Val和Ile的构建体。包含在室温下用0.67％SDS处理5分钟的经纯化的S2P.奥密克戎-FHA三聚体的AA和VI版本，以分别指示S单体和三聚体的位置。将样品在5％SDS-PAGE凝胶上电泳，转移到硝化纤维素上并用兔抗S1和抗兔IRDye 800印迹。在LiCOROdyssey仪器中扫描印迹。
图39示出了在不存在T4折叠子三聚化标签的情况下，1016/20VI(VI)突变使融合前稳定的奥密克戎BA.1S胞外结构域(残基16-1208)的三聚化稳定。A)通过hiTRAP亲和色谱法从Expi293F细胞纯化的S2P.奥密克戎.BA.1-1208.H6(顶部)和S2P.奥密克戎.BA.1.VI-1208.H6(底部)的Superose 6尺寸排阻色谱法。B)冷冻(-80℃)-解冻循环后，在A中纯化的S2P.奥密克戎.BA.1-1208.H6(顶部)和S2P.奥密克戎.BA.1.VI-1208.H6(顶部)三聚体的Superose 6尺寸排阻色谱法。C)在冷冻(-80℃)-解冻循环后，使用SYPRO Orange对经纯化的S三聚体进行差示扫描荧光测定法以确定热展开的温度。D)在非还原条件下纯化的蛋白质的SDS-PAGE和考马斯蓝染色。WT：在氨基酸位置1016和1020处的Ala；VI：分别在氨基酸位置1016和1020处的Val和Ile。
图40示出了与Ala腔突变体结合的ACE2-Fc和人单克隆抗S IgG的生物层干涉测量法测量。A)源自Hu-1序列的S2P-FHA和S2P.VI-FHA分析物与固定在抗人IgG捕获生物传感器上的S配体的结合。B)源自奥密克戎.BA.1序列的S2P-FHA和S2P.VI-FHA分析物与固定在抗人IgG捕获生物传感器上的S配体的结合。缔合300秒，随后解离300秒。
图41：S2P.奥密克戎-1208(SEQ ID NO:25)的蛋白质序列。
图42：S2P.奥密克戎-1208(SEQ ID NO:26)的DNA序列的蛋白质序列。
序列表符号说明
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。与本文所描述的那些材料和方法类似或等效的任何材料和方法可以用于实践或测试本公开。从业者尤其致力于Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,增刊47,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,New York),1999；Colowick和Kaplan编辑,《酶学方法(Methods In Enzymology)》,学术出版社(Academic Press,Inc.)；Weir和Blackwell编辑,《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》,第I-IV卷,布莱克威尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications),1986；Kontermann和Dubel(编辑),《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第1-2卷,编辑,施普林格出版社(SpringerPress),2010对于本领域的定义和术语和本领域的技术人员已知的其它方法。
Wu,F.等人,《自然(Nature)》579(7798),265-269(2020)和NCBI参考序列YP_009724390.1描述了来自祖先Hu-1毒株的冠状病毒刺突(S)蛋白的序列。此毒株在本文中也称为“野生型”、“祖先”和“亲代”毒株。
如本文所使用的，“抗原”是指能够刺激免疫应答的物质。
如本文所使用的，“保护”是指对冠状病毒感染的免疫力或部分免疫力。
“丙氨酸腔”或“腔”在本文中是指由于不存在非极性侧链比丙氨酸或芳香族残基更粗大的氨基酸，在SARS-CoV S蛋白的卷曲盘绕内观察到的区和三聚体结构的单体之间的相互作用减少。在一个实施例中，丙氨酸腔包括如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中的任一者所示的A1016和A1020。
如本文所使用的，参考本发明的说明性实施例，除非特别指定，否则提及S2P包含具有和不具有FHA序列的实施例。
如本文所使用的，“三聚化序列”是指在S蛋白单体的C末端区处发现的促进S蛋白三聚体的三聚化的序列。在一些实施例中，三聚化结构域是在冠状病毒内未发现的异源序列。在一个实施例中，三聚化序列是异源序列，在SARS-COV2中未发现。在一些实施例中，三聚化序列是噬菌体T4纤维蛋白的三聚体折叠子结构域或其经修饰的版本(图20A)。在一些实施例中，三聚化序列是卷曲盘绕、人工卷曲盘绕或经修饰的卷曲盘绕。在一些实施例中，三聚化序列是从头设计的。在一些实施例中，三聚化序列是噬菌体T4纤维蛋白的三聚体折叠子结构域或其经修饰的版本。在一些实施例中，三聚化序列是天然CoV三聚化序列(在一些实施例中，这是天然跨膜结构域)。在一些实施例中，三聚化序列包括S蛋白单体的残基1209-1256或由其组成。在一些实施例中，三聚化序列包括S蛋白单体的残基1217-1237或由其组成。
冠状病毒
术语“冠状病毒科(Coronaviridae)”是指以常用名“冠状病毒”或“CoV”已知的病毒，这是一种包膜的、阳性意义的单链RNA病毒。冠状病毒科存在两个亚科，即勒托病毒亚科(Letovirinae)和正冠病毒科(Orthocoronavirinae)。在一个实施例中，CoV选自α冠状病毒属(Alphacoronavirus，αCoV)、β冠状病毒属(Betacoronavirus，βCoV)、γ冠状病毒属(Gammacoronavirus，γCoV)和δ冠状病毒属(Deltacoronavirus，δCoV)。在一个实施例中，αCoV选自冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、传播性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和犬冠状病毒(CCoV)。在一个实施例中，βCoV选自人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、严重急性呼吸系统综合症相关冠状病毒(SARS-CoV)、严重急性呼吸系统综合症相关冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)、鼠肝炎病毒(MHV)和/或牛冠状病毒(BCoV)。在一个实施例中，CoV能够感染人。在一个实施例中，能够感染人的CoV选自：SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63、SARS-CoV和MERS-CoV或其亚型或变体。
在一个实施例中，CoV为SARS-CoV-2或其亚型或变体。在一个实施例中，SARS-CoV-2是SARS-CoV-2hCoV-19/Australia/VIC01/2020。在一个实施例中，SARS-COV-2包括如NCBI参考序列中所描述的序列：NC_045512.2。在一个实施例中，SARS-CoV-2包括GenBank中所述的序列：MN908947.3或其变体。SARS-CoV-2变体的实例在例如以下中进行了描述：Shen等人,2020、Tang等人,2020、Phan等人,2020、Khan等人,2020、Foster等人,2020、Vasireddy等人,2021、Winger等人,2021和Sanyaolu等人,2021。
在一个实施例中，CoV变体与亲代序列至少90％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少92％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少93％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少94％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少95％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少96％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少97％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少98％相同。在一个实施例中，变体与亲代序列至少99％相同。在一个实施例中，亲代毒株(也称为祖先毒株)是Wu,F.等人,《自然》579(7798),265-269(2020)所描述的Hu-1毒株。在一些实施例中，亲代毒株是SARS-CoV-2hCoV-19/Australia/VIC01/2020。在一些实施例中，亲代毒株是βCoV/Ancestral/WIV04/2019。
在一个实施例中，CoV是“所关注的变体”，也称为“VOI”。如本文所使用的，VOI是与预测或已知会影响病毒特性(如传播性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断或治疗逃逸)的基因变化相关的冠状病毒的变体；并且被鉴定为引起重大社区传播或多个疾病簇(在SARS-CoV-2COVID19簇的情况下)，在多个国家，随着时间的推移，相对流行率不断增加，同时病例数量不断增加，或其它明显的流行病学影响，表明全球公共卫生新出现的风险。
在一个实施例中，CoV是“相关变体”，也称为“VOC”。如本文所使用的，VOC是冠状病毒的变体，其与以下一种或多种具有全球公共卫生意义的变化相关：传播性增加或流行病学的有害变化(在SARS-CoV-2的情况下，所述有害变化是COVID-19流行病学)；毒力增加或临床疾病表现的变化；或公共卫生和社会措施或可用诊断、疫苗、治疗剂的有效性降低。
在一个实施例中，CoV是如Vasireddy等人(2021)、Winger等人(2021)或Sanyaolu等人(2021)中所描述的VOC或VOI。在一个实施例中，CoV被卫生监管机构(例如，世界卫生组织(World Health Organisation，WHO)、美国疾病控制中心(United States Center ofDisease Control，CDC)、欧洲疾病预防和控制中心(European Centre for DiseasePrevention and Control，ECDC))或特定管辖区内的等效地方政府卫生监管机构分类为VOC、VOI或VHC。在一个实施例中，冠状病毒被WHO分类为VOC或VOI。在一个实施例中，冠状病毒被CDC分类为VOC、VOI或VHC。在一个实施例中，冠状病毒被ECDC分类为VOC或VOI。
在一个实施例中，CoV是“高后果的变体”，也称为“VHC”。在一个实施例中，VHC作为预防措施或医疗对策相对于先前循环的变体具有显著降低的有效性的明确证据。除了VOC的特性外，VHC还可能对医疗对策产生以下影响中的一种或多种影响：证明诊断测试靶标的失效；表明以下的证据：疫苗有效性显著降低，疫苗突破病例数量不成比例地高，或针对重度疾病的疫苗诱导的保护低；对多种紧急使用授权或批准的治疗剂的易感性显著降低，以及更严重的临床疾病和住院人数增加。
在一个实施例中，当CoV是SARS-CoV-2VOC时，VOC包括以下突变中的一种或多种突变：69del、70del、144del、E484K/Q、S494P、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、K1191N、D80A、D215G、241del、242del、243del、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V、T19R、V70F、T95I、G142D、E156-、F157-、R158G、A222V*、W258L*、K417N/T*、L452R、T478K、D614G、P681H/R、D950N、L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、E484K、H655Y A67V、del69-70、T95I、del142-144、Y145D、del211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一个实施例中，当CoV是SARS-CoV-2VOC时，VOC包括以下RBD突变中的一种或多种RBD突变：K417T/N、N439K、L452R、Y453F、S477N、T478K、E484K/Q和N501Y。在一个实施例中，VOC包括以下NTD突变中的一种或多种NTD突变：70del、156-157del和242-245del。
在一个实施例中，VOC是B.1.1.7或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.351或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.351.2或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.351.2或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.351.3或其变体。在一个实施例中，VOC是P1或其变体。在一个实施例中，VOC是P1.1或其变体。在一个实施例中，VOC是P1.2或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.617.2或其变体。在一个实施例中，VOC是AY.1或其变体。在一个实施例中，VOC是AY.2或其变体。在一个实施例中，VOC是AY.3或其变体。在一个实施例中，VOC是B.1.1.529或其变体。在一个实施例中，VOC是BA.1或其变体。在一个实施例中，VOC是BA.2或其变体。在一个实施例中，VOC是BA.3或其变体。在一个实施例中，VOC是BA.4或其变体。在一个实施例中，VOC是BA.5或其变体。
在一个实施例中，当CoV是SARS-CoV-2VOI时，VOI包括以下突变中的一种或多种突变：L452R、D614G、S13I、W152C、A67V、69del、70del、144del、E484K、Q677H、F888L、L5F、D80G、T95I、Y144、F157S、D253G、L452R、S477N、E484K、A701V、T859N、D950H和Q957R、N501Y、P681R、P681H、E484Q、P681R、S477N、L452Q和F490S。在一个实施例中，VOI是B.1.525或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.526或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.617.1或其变体。在一个实施例中，VOI是C37或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.427或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.429或其变体。在一个实施例中，VOI是P2或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.525或其变体。在一个实施例中，VOI是P3或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.620或其变体。在一个实施例中，VOI是B.1.621或其变体。在一个实施例中，VOI是C.37或其变体。
CoV感染病因可能导致不同动物物种的呼吸道、肠、肝和神经系统疾病，所述不同动物物种包含骆驼、牛、猫和蝙蝠。CoV可以通过病毒滴与黏膜接触而从一个个体传播到另一个个体。通常，病毒滴是空气传播的，并且通过呼吸道，包含鼻气道吸入。典型地，个体为人类个体。在一些实施例中，个体是活家畜或家养动物。通常，在感染期间，CoV可以存在于上呼吸道，例如鼻通道中。在一些实例中，CoV可以存在于下呼吸道，例如支气管和/或肺泡中。
在一实施例中，CoV感染导致一种或多种症状，所述一种或多种症状选自以下中的一种或多种：发烧、咳嗽、喉咙痛、呼吸短促、病毒脱落呼吸功能不全、流鼻涕、鼻塞、乏力、支气管炎、头痛、肌肉疼痛、呼吸困难、中度肺炎、重度肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一实施例中，ARDS选自轻度ARDS(被定义为200mmHg<PaO2/FiO2≤300mmHg)、中度ARDS(被定义为100mmHg<PaO2/FiO2≤200mmHg)和重度ARDS(被定义为PaO2/FiO2≤100mmHg)。在一实施例中，SARS-CoV-2感染可能导致一种或多种症状，所述一种或多种症状选自以下中的一种或多种：发烧、咳嗽、喉咙痛、呼吸短促、病毒脱落呼吸功能不全、流鼻涕、鼻塞、乏力、支气管炎、头痛、肌肉疼痛、呼吸困难、中度肺炎、重度肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。在一个实施例中，CoV感染是无症状的。
SARS-CoV-2
在一个实施例中，如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原引发对SARS-CoV-2的免疫应答。在一个实施例中，如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原包括SARS-CoV-2S蛋白三聚体。
SARS-CoV-2有四种主要结构蛋白：刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白以及核衣壳(N)蛋白。S、M和E包埋在病毒表面包膜中，并且N位于核糖核蛋白中。S蛋白识别宿主细胞受体以启动病毒进入。
病毒S糖蛋白介导受体附着和病毒细胞膜融合，并且是NAb的靶标(Duan等人,2020；Finkelstein等人,2021；Walls等人,2020；Hoffmann等人,2020)。成熟刺突包括2个功能亚基S1和S2，所述功能亚基源自多蛋白前体S，通过在其转运高尔基体时对寡碱性基序进行弗林蛋白酶切割。ACE2受体连接由大亚基S1内的RBD介导，而膜融合由含有融合肽的小亚基S2介导。S1和S2通过非共价相互作用形成异二聚体；形成S2的α-螺旋的卷曲盘绕(氨基酸986-1033；称为CH)形成三聚体的核(Wrapp等人,2020)(图1A)。S2的C末端的跨膜序列使三聚体稳定并将其锚定在病毒或细胞膜上(Fu等人,2021)。ACE2 RBD位于S1糖蛋白三聚体的顶部，并且以“向上”ACE2结合就绪和“向下”惰性定向存在(Ke等人,2020)。受体连接后，S2在细胞表面处被TMPRSS2蛋白酶切割以释放融合肽并完全融合激活。S糖蛋白通过I类机制介导膜融合，借此，激活触发器(通过S1的ACE2结合，S2的TMPRSS2切割)引起亚稳态融合前三聚体的S2亚基重折叠成发夹的稳定三聚体，将N末端融合肽和C末端跨膜序列结合在一起，使得其缔合的膜融合(Cai等人,2020)。
I类病毒融合糖蛋白，如β冠状病毒的S、逆转录病毒的Env、正粘病毒的HA含有中心卷曲盘绕，所述中心卷曲盘绕作为膜融合过程所需构象变化的支架起作用(Bullough等人,1994；Cai等人,2020；Chan等人,1997；Julien等人,2013；Walls等人,2017；Walls等人,2020；Weissenhorn等人,1997；Wilson等人,1981；Wrapp等人,2020)(图1A)。在SARS-CoV-2的情况下，融合前卷曲盘绕包括SEQ ID NO:1(NCBI参考序列YP_009724390.1)中所示的氨基酸氨基酸988至1031。图1B中示出了示例SARS-CoV-2毒株的此区。融合后，卷曲盘绕序列延伸，其包括SEQ ID NO:1(NCBI参考序列YP_009724390.1)中所示的氨基酸913至1031。在一些实施例中，残基986和987被修饰为脯氨酸(K986P；V987P)。
卷曲盘绕的向内的位置通常在3个至4个重复中被疏水性残基占据。在SARS-CoV和SARS-CoV-2S的情况下，这些位置大多被极性残基占据，所述极性残基在融合前三聚体中几乎不介导螺旋间接触(图1B)。在融合后三聚体中，卷曲盘绕的N末端2/3通过HR1螺旋的填充而聚集在一起，所述螺旋使卷曲盘绕在N末端方向上延伸在此构象中，向内的残基足够紧密以形成氢键(图1C)。Ile1013通过与I1013以及与L1012的螺旋间接触形成小疏水性核。这些相互作用在由A1016和A1020(其占据了卷曲盘绕的中心位置)形成的腔上方形成疏水性天花板(图1A-D)。
疫苗抗原
一方面，本发明提供一种冠状病毒疫苗抗原，其包括CoV S蛋白三聚体，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小所述S蛋白三聚体的卷曲盘绕中的丙氨酸腔的大小，并且其中所述S蛋白三聚体引发中和抗体应答。
一方面，结构修饰使S蛋白三聚体稳定。如本文所使用的，“稳定的”是指增加以下中的一种或多种：S蛋白三聚体的热稳定性、寿命、免疫原性和生产稳定性、产率或同质性以及变性稳定性。在一个实施例中，稳定性是增加的体外和/或体内稳定性。在一个实施例中，体内稳定性增加(当施用于受试者时或在受试者体内组装时，例如从核酸(如mRNA疫苗)翻译后)。在一个实施例中，稳定性在体外(例如在生产过程期间)增加。
在一个实施例中，结构修饰通过减小卷曲盘绕中的丙氨酸腔的大小来使S蛋白三聚体稳定。在一个实施例中，丙氨酸腔被部分填充或完全填充。在一个实施例中，丙氨酸腔在构象上发生改变。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或100％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少5％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少10％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少20％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少30％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少40％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少50％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少60％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少70％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少80％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了至少90％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了100％。
在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小约10％至100％、或约10％至约90％、或约20％至约90％、或约20％至约80％、或约30％至约80％、或约40％至约80％、或约50％至约80％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约10％至100％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约10％至90％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约20％至90％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约20％至80％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约30％至80％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约40％至80％。在一个实施例中，丙氨酸腔的大小减小了约50％至80％。
在一个实施例中，与缺乏结构修饰的S蛋白三聚体相比，结构修饰增加了S蛋白三聚体的稳定性。
在一个实施例中，与缺乏结构修饰的S蛋白三聚体相比，结构修饰提高了S蛋白三聚体降解的温度。在一个实施例中，降解(degrade)或降解(degradation)是指S蛋白三聚体的核处的疏水性残基的暴露。
在一个实施例中，与缺乏结构修饰的S蛋白三聚体相比，结构修饰提高了S蛋白三聚体的熔融温度。在一个实施例中，结构修饰增加了S蛋白三聚体的热稳定性。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约5℃至约25℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约5℃至约23℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约5℃至约23℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约10℃至约23℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约10℃至约20℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约5℃至约15℃。在一个实施例中，结构修饰将S蛋白三聚体的熔融温度提高约5℃至约10℃。
在一个实施例中，结构修饰增加了S蛋白三聚体对变性条件的稳定性。变性条件包含例如在存在洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠)的情况下煮沸，或在室温下用洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠)在具有和没有2β巯基乙醇的情况下进行处理。
在一个实施例中，本说明书能够提供一种提高冠状病毒S抗原的稳定性和/或表达的方法。
在一个实施例中，CoV疫苗抗原是可溶的。在一个实施例中，如本文所描述的CoV疫苗抗原不包括FHA序列。在一个实施例中，CoV疫苗抗原在融合前S蛋白三聚体证实中是稳定的。在一个实施例中，S蛋白三聚体的ACE2受体结合结构域(RBD)处于向下(非ACE2结合就绪)定向。在一个实施例中，当处于RBD向下定向时，除了RBD向上引导的中和抗体之外，还产生识别RBD向下构象中的S三聚体的中和抗体。
在一个实施例中，CoV疫苗抗原缺乏三聚化序列。在一个实施例中，CoV疫苗抗原缺乏跨膜结构域。在一个实施例中，CoV疫苗抗原缺乏折叠子序列/结构域。
在一个实施例中，当RBD处于向下定向时，其它非RBD表位处于产生另外的非RBD中和抗体的有利位置。
在一个实施例中，结构修饰是在卷曲盘绕区中。在一个实施例中，结构修饰使卷曲盘绕区稳定。
在一个实施例中，S2中的卷曲盘绕中的结构修饰对S1的免疫原性具有变构效应，其增强了针对如本文所描述的CoV变体的免疫应答。
在一个实施例中，CoV疫苗抗原适于皮内施用。在一个实施例中，CoV疫苗抗原适于口服施用。在一个实施例中，CoV疫苗抗原适于肺部施用。在一个实施例中，CoV疫苗抗原适于鼻腔施用。
冠状病毒疫苗抗原的S蛋白单体
在一个实施例中，S蛋白三聚体中的S蛋白单体可以是如本文所描述的祖先SARS-CoV-2序列(例如NCBI参考序列：YP_009724390.1)，或者可以是更近期的变体，如本文所描述的VOC、VOI或VHC(例如δ、β、奥密克戎)。在一个实施例中，S蛋白单体是祖先SARS-CoV-2序列，所述序列被修饰以包括如本文所描述的存在于VOC、VO1或VHC中的一个或多个突变。在一个实施例中，修饰选自以下中一个或：S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、A67V、delH69-V70、D80A、T95I、D138Y、G142D、delY144、W152C、E154K、E156del、F157del、R158G、R190S、D215G、del242-245、D253G、R246I、K417N/T、N439K、L452R/Q、Y453F、S477N、T478K、E484K/Q、N501Y、F565L、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681H/R、I692V、A701V、T716I、F888L、D950N、S982A、T1027I、Q1071H和D1118H；
在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的残基1-1208或与其至少90％相同的序列。在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:2的残基1-1208或与其至少90％相同的序列。在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的残基1-1208或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的残基1-1237或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的残基1-1237或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的残基1-1256或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的残基1-1256或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括编码冠状病毒的跨膜结构域的序列。在一个实施例中，S蛋白单体包括编码SARS-COV2的跨膜结构域的序列。在一个实施例中，跨膜结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的残基1217至1237或与其至少90％相同的序列。在一个实施例中，跨膜结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的残基1217至1237或与其至少90％相同的序列。在一个实施例中，跨膜结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的残基1209至1256或与其至少90％相同的序列。在一个实施例中，跨膜结构域包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的残基1209至1256或与其至少90％相同的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体不包括编码冠状病毒的跨膜结构域的序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括如本文所描述的2P突变。在一个实施例中，S蛋白单体不包括如本文所描述的2P突变。
在一个实施例中，S蛋白单体包括如本文所描述的VOC和/或VOI突变中的一个或多个突变的氨基酸序列。
在一个实施例中，S蛋白单体包括SARS-CoV-2VOC的S蛋白残基1-1208。在一个实施例中，S蛋白单体包括SARS-CoV-2VOI的S蛋白残基1-1208。在一个实施例中，S蛋白单体包括SARS-CoV-2VHC的S蛋白残基1-1208。
在一个实施例中，S蛋白单体不包括三聚化序列。在一个实施例中，S蛋白单体不包括跨膜结构域序列。在一个实施例中，S蛋白单体不包括折叠子序列。在一个实施例中，S蛋白单体不包括FHA。
结构修饰
丙氨酸腔的结构修饰使用以下中的一种或多种来实现：氨基酸取代、二硫键、氢键、π堆积(π-π堆积)、盐桥、范德华相互作用(van der Waals interactions)、疏水性残基取代或添加的使用，或S蛋白内的脯氨酸稳定化。在一个实施例中，对丙氨酸腔的结构修饰通过形成丙氨酸腔的一个或多个氨基酸的氨基酸取代来实现。在一个实施例中，结构修饰是一个或多个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，结构修饰是将卷曲盘绕区中的一个或多个氨基酸取代为更具疏水性的氨基酸。
在一个实施例中，S蛋白三聚体中的一个或两个或三种S蛋白单体包括将卷曲盘绕区中的一个或多个氨基酸取代为更具疏水性的氨基酸。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的一个S蛋白单体包括将卷曲盘绕区中的一个或多个氨基酸取代为更具疏水性的氨基酸。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的两个S蛋白单体包括将卷曲盘绕区中的一个或多个氨基酸取代为更具疏水性的氨基酸。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的三个S蛋白单体包括将卷曲盘绕区中的一个或多个氨基酸取代为更具疏水性的氨基酸。
丙氨酸腔中氨基酸的取代
在一个实施例中，结构修饰在卷曲盘绕区中产生人工疏水性核。在一个实施例中，结构修饰产生包括丙氨酸腔的残基的人工疏水性核。在一个实施例中，结构修饰在丙氨酸腔中产生人工疏水性核。在一个实施例中，位置1016和1020处的氨基酸有助于人工疏水性核的形成。
在一个实施例中，通过用更具疏水性的氨基酸取代卷曲盘绕区中的氨基酸来产生人工疏水性核。在一个实施例中，用更粗大的疏水性残基置换极性残基。
如本文所使用的，“更具疏水性的氨基酸”是指比被取代的冠状病毒毒株的位置中存在的氨基酸更具疏水性的氨基酸。例如，如果被修饰的/取代的氨基酸是丙氨酸，则其可以被更具疏水性的氨基酸(例如异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)取代。
疏水性指数是相对疏水性的度量，或者氨基酸在水中的可溶性，并且例如在Sereda等人,(1994)和Monera等人,(1995)中进行了描述。不同氨基酸在pH 2和pH 7下的疏水性进行了归一化，使得最具疏水性的残基以相对于甘氨酸(0值)为100的值给出，如下表所提供的。
氨基酸疏水性
/>
在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是疏水性氨基酸。在一个实施例中，疏水性氨基酸是脂肪族疏水性氨基酸。在一个实施例中，疏水性氨基酸是芳香族疏水性氨基酸。
在一个实施例中，S蛋白三聚体中的S蛋白单体的卷曲盘绕区中的至少一个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的至少一个S蛋白单体包括取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的至少两个S蛋白单体包括取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的三个S蛋白单体包括取代。
在一个实施例中，S蛋白三聚体中的S蛋白单体的卷曲盘绕区中的至少两个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的至少一个S蛋白单体包括取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的至少两个S蛋白单体包括取代。在一个实施例中，S蛋白三聚体中的三个S蛋白单体包括取代。
在一个实施例中，至少一个氨基酸或至少两个氨基酸位于S蛋白单体的卷曲盘绕区的七肽重复序列基序的位置a和/或d中。七肽重复序列基序中位置a和d的位置如图1B所示。对于SARS-COV-2，位置a和d与SEQ ID NO:1的氨基酸988、991、995、998、1002、1005、1009、1013、1016、1020、1023、1027、1031相对应。在一个实施例中，在位置1016处发生用更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，在位置1020处发生用更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，在位置1016和1020处发生用更具疏水性的氨基酸取代。在一个实施例中，A1016或A1020被亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸取代。在一个实施例中，A1016被亮氨酸(A1016L)、缬氨酸(A1016V)或异亮氨酸(A1016I)取代。在一个实施例中，A1020被异亮氨酸(A1020I)取代。在一个实施例中，A1016被亮氨酸(A1016L)或缬氨酸(A1016V)取代，并且A1020被异亮氨酸(A1020I)取代。在一个实施例中，A1016被亮氨酸(A1016L)取代。在一个实施例中，A1016被缬氨酸(A1016V)取代。在一个实施例中，A1020被异亮氨酸(A1020I)取代。在一个实施例中，A1020不被色氨酸(W)取代。在一个实施例中，A1016被缬氨酸取代，并且A1020被异亮氨酸取代(本文称为“A1016V/A1020I”或“1016/20VI”或“VI”)。
在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸包括以下特性中的一个或多个特性：i)大于丙氨酸的疏水性；ii)大于丙氨酸的疏水性氨基酸；ii)在pH为2时的疏水性大于47；iii)在pH为7时的疏水性大于41；以及iv)选自：异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸选自：异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是异亮氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是亮氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是缬氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是甲硫氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是苯丙氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是酪氨酸。在一个实施例中，所述氨基酸是色氨酸。
在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸包括大于丙氨酸的疏水性。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸大于丙氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸在pH为2时包括大于47的疏水性。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸在pH为7时包括大于41的疏水性。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸选自：异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是异亮氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是亮氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是甲硫氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是缬氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是苯丙氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是酪氨酸。在一个实施例中，更具疏水性的氨基酸是色氨酸。
为了避免疑问，在通过丙氨酸腔(包含A1016和A1020)的氨基酸取代实现最佳疏水性的情况下，可以对所述区进行进一步的保守氨基酸突变，而不会影响如本文所描述的刺突蛋白的期望的性能。保守氨基酸取代是本领域已知的。
进一步修饰/进一步稳定修饰
在一个实施例中，如本文所描述的CoV疫苗包括一种或多种进一步修饰，以增强S蛋白三聚体的稳定性、免疫原性、表达和纯化中的一种或多种。在疫苗是基于多核苷酸的疫苗的情况下，进一步修饰以增强包括S蛋白编码序列或其可溶性形式的多核苷酸的体内稳定性和表达。
在一个实施例中，对抗原或其编码分子的进一步修饰选自脯氨酸稳定化、弗林蛋白酶切割位点、三聚化序列、重复或间隔子，或编码其的核苷酸序列。
在一个实施例中，脯氨酸稳定化修饰是986P和/或987P。986P和987P两者在S蛋白三聚体中的存在被称为“2P”修饰。
在一个实施例中，进一步修饰是弗林蛋白酶切割位点的插入。在一个实施例中，引入突变PG682SAS以插入弗林蛋白酶切割位点(例如PG682SAS置换δ中的RR682RAR，以及PG682SAS置换奥密克戎中的HR682RAR)。在一个实施例中，进一步修饰是FHA的添加。在一个实施例中，进一步修饰是纯化标签的添加。
抗原组合
在一个实施例中，受试者修饰的S抗原引发针对其来源的毒株和在群落中循环的一种或多种其它毒株的广泛中和免疫应答。另一方面，包括抗原或编码序列的抗原或疫苗向受试者递送一种或多种所关注的抗原，并且诱导针对同源或异源毒株的有效功能性和多功能性免疫应答，包含例如T细胞和抗体应答。在一个实施例中，来自一种或多种毒株的冠状病毒抗原选自刺突蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白中的一种或两种或三种或四种。在一个实施例中，使用编码SARS-CoV蛋白N、M、E和S中的两个、三个或四个的氨基酸和/或核苷酸序列。在说明性实施例中，采用N、M、E和S。在一个实施例中，将SARS-CoV的一种或两种或更多种不同的变体组合。在一个实施例中，采用多种变体和多种抗原。在一个实施例中，用一个或多个B细胞和/或T细胞表位施用包括抗原或编码序列的抗原或疫苗。
本文设想能够表达本文所公开的修饰的S抗原以及一种或多种N、M、E抗原或其编码序列的细胞系。
受试者抗原与一种或多种N、M、E抗原或其一种或两种或多种所关注的/关注变体的编码序列的组合施用可以在相同或不同的组合物中同时或间隔开，任选地同时或顺序组合使用蛋白质和核酸施用方案。
仅刺突RBD的疫苗抗原(例如，319-545)也被设想呈蛋白质或核酸疫苗形式。在一个实施例中，将本经修饰的S抗原的施用与以蛋白质或核酸形式(例如，mRNA)代表冠状病毒的仅RBD部分的抗原组合。RBD结构域可以以单体、二聚体或多聚体形式施用，并且可以包含免疫增强元件，如人IgG的Fc片段。
在另一个实施例中，本经修饰的S抗原三聚体的经修饰的RBD以合适的疫苗形式作为仅RBD抗原产生或施用。具体地，对S2的卷曲盘绕的结构修饰有益地改变了S1RBD区的结构和免疫原性，并且因此设想基于由受试者修饰的S抗原产生的RBD形式产生或施用RBD形式。
在另一个实施例中，本经修饰的S抗原三聚体的经修饰的S1以合适的疫苗形式作为仅S1抗原产生或施用。具体地，对S2的卷曲盘绕的结构修饰改变了S1区的结构和免疫原性，并且因此设想基于由受试者修饰的S抗原产生的形式产生或施用S1形式。在一个实施例中，产生或施用S1区中不存在RBD的部分。S1结构域或S1减RBD结构域可以以单体、二聚体或多聚体形式施用，并且可以包含免疫增强元件，如人IgG的Fc片段。
抗体应答
S蛋白是COVID-19疫苗中用作靶抗原的主要蛋白。理论上，抗体可以靶向S蛋白以在病毒进入过程期间的多个阶段抑制病毒感染。RBD是干扰病毒受体结合的中和抗体(NAb)的主要靶标。迄今为止，大多数针对SARS-CoV-2型的强效NAb都靶向RBD。另外，据报道，在SARS-CoV-2和MERS-CoV感染中，靶向N末端结构域的NAb使其成为疫苗中的另一个潜在靶标。S2亚基也是中和抗体的潜在靶标，所述中和抗体干扰S蛋白的结构重排和病毒-宿主膜融合所需的融合蛋白的插入。
如本文所使用的，“广泛中和抗体”是指对至少一种但优选地多种冠状病毒变体(例如多种SARS-COV-2变体)提供交叉保护的抗体。在一个实施例中，至少一种变体是VOC或VOI或VHC。
NAb被称为功能性抗体，因为其具有功能性抗病毒作用。
疫苗引发针对异源毒株或新出现的相关变体的NAb或有效免疫应答的能力是影响成功推出针对SARS-CoV-2的疫苗计划的主要因素。
疫苗引发针对同源和异源毒株或新出现的相关变体的NAb或有效免疫应答的能力是影响成功推出针对SARS-CoV-2的疫苗计划的主要因素。本申请使得能够产生和使用如本文所描述的冠状病毒S抗原突变体，其引发对更广范围的变体的增强的免疫原性，所述变体包含祖先和天然存在的以及新出现的相关变体。
已经观察到针对相关变体的疫苗功效降低，并且可以例如通过在针对病毒的一种或多种毒株或变体的疫苗免疫的受试者中筛查NAb来进行评估。如本文所确定的，在一个实施例中，本文所启用的结构修饰的抗原能够在受试者中产生针对异源毒株的功能性抗体应答或中和抗体滴度，所述异源毒株包含至少与针对同源毒株的抗体滴度一样好的相关变体。
在一个实施例中，如本文所定义的抗原引发针对VOC的中和抗体滴度，其与针对一种或多种非变体毒株产生的中和抗体滴度处于相同或相似水平。
至少100％的同源抗体滴度。在一个实施例中，滴度是对应的同源滴度的70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以上或99％以上。
产生冠状病毒疫苗抗原的方法
如本文所描述的抗原可以通过本领域已知的重组或合成途径产生。
在一个实施例中，提供了包括如本文所描述的抗原的纳米颗粒，所述抗原与来自CPV或其它合适的病毒的多角体蛋白靶向肽融合。其它纳米颗粒是本领域已知的，并且包含SOR颗粒、鲁米嗪(luminazine)合酶颗粒、丙酮酸脱氢酶颗粒。
抗原可以与载剂或纳米颗粒连接以提高免疫原性。合适的载剂是本领域已知的。
病毒样颗粒提供了病毒表面蛋白对抗原的一些结构复杂性/优势，并且可以源自任何合适的病毒。如本文所使用的，“病毒样颗粒”是指包括病毒表面蛋白但缺乏病毒基因组和一种或多种结构蛋白的疫苗。人和肝炎病毒HBV就是很好的实例。包括抗原的VLP可以例如在蛋白质的重组表达时自发形成，并且可以使用常规技术进行表征。
涵盖呈脂质体形式的疫苗。本文的术语“脂质体”是指封闭水性内部的单层或多层脂质结构。能够形成脂质体的脂质包含所有具有脂肪或类脂肪特性的物质。动态激光散射是本领域技术人员公知的用于测量脂质体尺寸的方法。佐剂的广泛描述可以见于Cox和Coulter,“佐剂技术及应用进展(Advances in Adjuvant Technology andApplication)”,《利用生物技术控制动物寄生虫(Animal Parasite Control UtilizingBiotechnology)》,第4章,Young,W.K.编辑,CRC出版社(CRC Press)1992中，以及Cox和Coulter,《疫苗(Vaccine)》15(3):248-256,1997中。
抗原可以以病毒载体或非病毒载体的形式递送。如本文所使用的，术语“载体”包含至少插入了抗原编码序列的任何传递部分，包含质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体，如λ噬菌体、病毒样颗粒、病毒载体，如如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、甲病毒、黄病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、CMV、弹状病毒、逆转录病毒、慢病毒、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)、痘病毒和小核糖核酸病毒或杆状病毒载体，或人工染色体载体，如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或PI人工染色体(PAC)。载体包含表达以及克隆载体。在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是病毒载体疫苗。如本文所使用的，“病毒载体疫苗”使用病毒主链将SARS-CoV-2基因或其一部分插入宿主生物体中。这些疫苗将基因传递到靶细胞中，在所述靶细胞中表达基因，并且表达的基因可能会引发免疫应答。在一个实施例中，所述载体是复制载体。在一个实施例中，所述载体是非复制载体(不整合到宿主细胞中的载体)。在一个实施例中，载体选自腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和水疱性口炎病毒。
表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常含有在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中，或者在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的所需编码序列和适当的NA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某个期望的NA片段，并且可能缺少表达期望的DNA片段所需的功能性序列。
在一个实施例中，所述载体是病毒载体或非病毒载体。可用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒，以及其减毒形式，其中每一种都有如本领域已知的其自身的优点和缺点。病毒载体具体地包含但不限于腺病毒载体和痘病毒载体。通常，对于病毒载体，施用约5×107个至5×1012个病毒颗粒，通常约5×109个至5×1010个病毒颗粒。
可以将抗原编码序列插入任何合适的载体中。至少在一个实施例中，载体的目的是将编码核酸传输至宿主环境，以促进蛋白质表达和呈递给宿主免疫应答。载体可以是复制的或非复制的。
表达载体通常包含与编码抗原的核酸分子可操作地连接的转录和翻译调节核酸。本文中的“可操作地连接”是指以启动转录的方式，相对于抗原的编码序列定位转录和翻译调节DNA。通常，这意味着启动子和转录起始或开始序列位于蛋白质编码区的5'。转录和翻译调节核酸通常适用于用于表达外源蛋白的细胞；例如，转录和翻译来自哺乳动物细胞，并且具体地人的调节核酸序列优选地用于在哺乳动物和人中表达蛋白质。许多类型的适当的表达载体和合适的调节序列是本领域已知的。
病毒载体可以包括痘苗载体，如基于哥本哈根痘苗载体(Copenhagen vacciniavector)或经修饰的安卡拉痘苗(Modified Vaccinia Ankara，MVA)的合成经修饰的载体。当在初免增强方案中用作疫苗加强时，病毒载体可以包括MVA或本领域已知的哥本哈根衍生物(Copenhagen derivative)。病毒载体可以包括腺相关病毒(AAV)或慢病毒。病毒载体可以是减毒病毒载体。例如，复制所必需的基因可以缺失并插入免疫调节分子。
病毒载体可以维持在BAC中以便于操纵，并且编码抗原的DNA可以是线性的或环状的。
非病毒载体或附着物/缀合物包含脂质、碳水化合物、蛋白质、肽、纳米颗粒、脂质体、病毒样颗粒、病毒体、乳液。如脂质等两亲性剂可以以聚集物，如胶束、不溶性单层、液晶或层状层的形式存在于水溶液中。
抗原可以以其编码核酸的形式施用。如本文所描述的核酸分子可以以任何形式，如DNA、cDNA、基因组DNA或RNA，包含体外转录的RNA或合成RNA、mRNA或PNA或其混合物。核酸包含基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子以及其修饰形式。核酸分子可以是单链或双链，并且线性或共价闭合以形成圆。在一个实施例中，核酸是RNA。RNA可以通过稳定序列、封端和聚腺苷酸化进行修饰。RNA或DNA并且可以作为质粒递送以表达抗原并诱导免疫应答。可以对RNA进行修饰以增强通过脂质纳米颗粒的递送。可以对RNA进行修饰以增加RNA分子的稳定性。图35至37中提供了本发明RNA的实例。通常优选基于RNA的方法，并且这些方法可以包含扩增或非自扩增构造。核酸分子的长度通常为至少10个碱基，并且可以是单链或双链。“cDNA”是指与mRNA互补或相同的单链或双链形式的DNA。“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，如基因、cDNA或mRNA，用作合成其它多核苷酸或多肽的模板。
在一些实施例中，施用编码抗原的RNA。在一些实施例中，RNA编码包括如本文所描述的冠状病毒跨膜结构域的抗原。在一些实施例中，RNA编码缺乏如本文所描述的冠状病毒跨膜结构域的抗原。在一些实施例中，RNA编码包括如本文所描述的三聚化结构域的抗原。在一些实施例中，RNA编码缺乏如本文所描述的三聚化结构域的抗原。
在一些实施例中，通过瞬时体内转染施用的多核苷酸是经化学修饰的RNA，其中对至少一种类型的核苷酸(例如胞嘧啶)的比例(例如，10％、30％、50％或100％)进行化学修饰以增加其体内稳定性。例如，在一些情况下，经修饰的胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。此类多核苷酸具体地用于体内递送/转染到细胞，尤其当与转染/递送剂组合时。在一些情况下，经化学修饰的RNA是其中大部分(例如，所有)胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，并且其中大部分(例如，所有)尿嘧啶是假尿嘧啶的经化学修饰的RNA。在一些实施例中，非天然半胱氨酸被工程化以产生二硫键(例如通过重组基因技术)。例如，WO 2011/130624中描述了此类经修饰的RNA的合成和使用。DNA和RNA多核苷酸的体内转染方法在本领域是已知的，如，例如Liu等人,(2015)和Youn等人,(2015)中所概述的。
术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基基团的核苷酸。术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及经修饰的RNA，所述RNA通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。此类改变可以包含添加非核苷酸材料，如添加到RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。
因此，在一个实施例中，与其特定野生型编码序列(即未修饰的mRNA)的编码区的G/C含量相比，修饰了，具体地增加了，核酸编码区的编码区的G/C含量。与特定野生型mRNA的编码氨基酸序列相比，mRNA的编码氨基酸序列优选地未被修饰。
经优化的基于mRNA的组合物可以包括5'和3'非翻译区(5'-UTR，3'-UTR)，所述非翻译区优化如本领域所知的翻译效率和细胞内稳定性，以及编码S蛋白的开放阅读框。在一个实施例中，可以通过用磷酸酶处理RNA来去除未封端的5'三磷酸酯。RNA可以具有经修饰的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施例中，在RNA中，对于胞苷，5-甲基胞苷被部分或完全取代。可替代地或另外地，对于尿苷，假尿苷被部分或完全，优选地完全取代。这些修饰还可以减少可能阻碍RNA翻译的不加选择的免疫灭活。在一个实施例中，术语“修饰”涉及提供具有5'封端或5'封端类似物的RNA。术语“5'封端”是指在mRNA分子的5'端上发现的封端结构，并且通常由通过不寻常的5'到5'三磷酸酯连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施例中，此鸟苷在7-位置处被甲基化。术语“常规5'封端”是指天然存在的RNA 5'封端，优选地7-甲基鸟苷封端。术语“5'封端”包含类似于RNA封端结构的5'封端类似物，并且被修饰成具有稳定RNA和/或增强RNA翻译的能力。提供具有5'封端或5'封端类似物的RNA可以通过在所述5'封端或5'封端类似物的存在下对DNA模板进行体外转录来实现，其中所述5'封端共转录掺入产生的RNA链中，或者RNA可以例如通过体外转录产生，并且5'封端可以使用封端酶，例如，牛痘病毒的封端酶，在转录后连接到RNA。
RNA的进一步修饰可以是天然存在的UTR，如X区尾部的延伸或截断，或5'或3'非翻译区(UTR)的改变，如引入与所述RNA的编码区无关的UTR，例如，将现有的3'-UTR与源自珠蛋白基因，如α2-珠蛋白，α1-珠蛋白，β-珠蛋白的3'-UTR的一个或多个，优选地两个拷贝进行交换或插入所述拷贝。具有未经掩蔽的poly-A序列的RNA比具有经掩蔽的poly-A序列的RNA更有效地进行翻译。
术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”涉及可能位于RNA分子的3'-末端的腺苷(A)残基的序列，并且“未掩蔽的poly-A序列”是指位于RNA分子的3'末端的poly-A序列以poly-A序列的A结尾，并且随后没有位于poly-A序列的3'末端(即下游)的A以外的核苷酸。此外，约120个碱基对的长poly-A序列导致RNA的最佳转录稳定性和翻译效率。
因此，为了增加RNA的稳定性和/或表达，其可以被修饰以与异源poly-A序列一起存在，所述序列优选地具有10个至500个，更优选30个至300个，甚至更长优选65个至200个，并且尤其是100个至150个腺苷酸残基的长度。在特别优选的实施例中，poly-A序列具有大约120个腺苷酸残基的长度。为了进一步增加根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可以揭露poly-A序列。
另外，将3'-非翻译区(UTR)加入到RNA分子的3'-非翻译区可以导致提高翻译效率。可以通过结合两个或更多个这样的3'-非翻译区来实现协同效应。3'-非翻译区对于其被引入其中的RNA可以是自体的或异源的。在一个特定的实施例中，3'-非翻译区源自人β-珠蛋白基因。
上述修饰，即任选地加入poly-A序列、揭露poly-A序列和加入一个或多个3'-非翻译区的组合对于RNA的稳定性和增加翻译效率具有协同作用。
为了增加RNA的表达，可以在编码区内对其进行修饰，以增加GC含量，以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，并且因此增强细胞中的翻译。经修饰的mRNA可以酶促合成并包装到纳米颗粒，如脂质纳米颗粒中，并例如，肌内施用。自我复制RNA或鱼精蛋白复合RNA方法也已示出产生针对病毒感染的免疫应答。
核酸分子可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中、胶体药物递送系统(例如脂质体、微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。这些技术在本领域是已知的，并在《雷明顿：药学科学与实践(Remington,the Science and Practice ofPharmacy)》,第20版，Remington,J编辑(2000)中公开。
以纳米颗粒或胶体系统形式全身施用核酸的各种方法是已知的。在非病毒方法中，阳离子脂质体用于诱导DNA/RNA冷凝并促进细胞摄取。阳离子脂质体通常由阳离子脂质(如DOTAP)和一种或多种辅助脂质(如DOPE)组成。所谓的“脂质复合物”可以由阳离子(带正电)脂质体和阴离子(带负电)核酸形成。在最简单的情况下，通过使用特定混合方案将核酸与脂质体混合而自发形成脂质复合物，但是可以应用各种其它方案。在一个实施例中，纳米颗粒RNA配制物，如RNA脂质复合物被生产为具有确定的粒度，其中颗粒的净电荷接近于零或负电荷。例如，如WO2013/143683中所公开的，来自RNA和脂质体的电中性或带负电荷的脂质复合物在全身施用后导致脾或免疫细胞中大量的RNA表达。在一个实施例中，纳米颗粒包括至少一种脂质。在一个实施例中，纳米颗粒包括至少一种阳离子脂质。阳离子脂质可以是单阳离子的或聚阳离子的。任何阳离子两亲性分子，例如包括至少一个亲水性和亲脂性部分的分子是本发明的含义内的阳离子脂质。在一个实施例中，正电荷由至少一种阳离子脂质提供，并且负电荷由RNA提供。在一个实施例中，纳米颗粒包括至少一种辅助脂质。辅助脂质可以是中性或阴离子脂质。辅助脂质可以是天然脂质，如磷脂或天然脂质的类似物，或完全合成的脂质，或与天然脂质没有相似性的脂质样分子。在一个实施例中，阳离子脂质和/或辅助脂质是形成双层的脂质。
在一个实施例中，至少一种阳离子脂质包括1,2-二-0-十八烷基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，至少一种辅助脂质包括1,2-二-(9Z-十八烷酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其类似物或衍生物、胆固醇(Choi)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，至少一种阳离子脂质与至少一种辅助脂质的摩尔比为10:0至3:7，优选地9:1至3:7、4:1至1:2、4:1至2:3、7:3至1:1或2:1至1:1，优选地约1:1。在一个实施例中，在所述比率下，阳离子脂质的摩尔量由阳离子脂质的摩尔量乘以阳离子脂质中的正电荷数得出。在本文所述的纳米颗粒中，脂质可以与RNA形成复合物和/或可以包裹RNA。在一个实施例中，纳米颗粒包括脂质复合物或脂质体。在一个实施例中，脂质被包括在封装所述RNA的囊泡中。囊泡可以是多层囊泡、单层囊泡或其混合物。囊泡可以是脂质体。
脂质纳米颗粒(LNP)通常被称为由不同脂质的组合组成的纳米尺寸颗粒(水性体积由两亲性脂质双层包封，例如单个；单层或多个；多层)。LNP中可能包含许多不同类型的脂质。在一些实施例中，脂质可以是以下中的一种或多种：可电离脂质、磷脂、结构脂质、中性脂质和PEG脂质。例如，mRNA被包封在LNP中。在另一个实例中，mRNA与LNP结合。例如，mRNA在LNP上被吸收。
制备LNP的方法是本领域技术人员已知的，并且在例如Huang等人,(2021)和Schoenmaker等人,(2021)中进行了描述。如本文所使用的，术语“可电离脂质(ionisablelipid)”或“可电离脂质(ionisable lipids)”应指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质。例如，脂质在处于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH(例如处于或高于生理pH)下带中性电荷。在一个实施例中，脂质纳米颗粒包括如Schoenmaker等人(2021)的表1中所描述的可电离脂质。
合适的可电离脂质可以具有阴离子、阳离子或两性离子亲水性头基。用于本公开的示例性磷脂(阴离子或两性离子)包含例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。在一个实例中，所述脂质是阳离子脂质。示例性阳离子脂质包含但不限于二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、2,5-双((9z,12z)-十八碳-9,12,二烯-1-基氧基)苄基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(LKY750)。在一个实例中，磷脂是2,5-双((9z,12z)-十八碳-9,12,二烯-1-基氧基)苄基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(LKY750)。示例性两性离子脂质包含但不限于酰基两性离子脂质和醚两性离子脂质，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和十二烷基磷酸胆碱。脂质可以是饱和的或不饱和的。在一个实施例中，脂质纳米颗粒不包括阳离子脂质。
本领域技术人员将理解，提及PEG化脂质是已经用聚乙二醇修饰的脂质。示例性PEG化脂质包含但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油和PEG修饰的二烷基甘油。例如，PEG脂质包含PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE脂质以及其组合。
用于本公开的合适的中性或两性离子脂质对本领域技术人员来说是显而易见的，并且包含例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2-胆固醇半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16溶血PC)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二(二十六)碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二(二十二)碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。脂质可以是饱和的或不饱和的。
示例性结构脂质包含但不限于胆固醇粪甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、麦角甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸和α-生育酚。在一个实施例中，结构脂质是甾醇。在一个实施例中，结构脂质是胆固醇。在一个实施例中，结构脂质是菜油甾醇。
组合物、施用途径和剂量
本领域技术人员将理解，如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原或如本文所描述的编码冠状病毒疫苗抗原的载体或多核苷酸可以调配为药物组合物。在一个实施例中，所述药物组合物是疫苗组合物。
一方面，本说明书提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括多核苷酸，所述多核苷酸包括编码冠状病毒S蛋白三聚体抗原的核苷酸的序列，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小S蛋白三聚体的卷曲盘绕区中的丙氨酸腔的大小，如本文所描述的。
一方面，本说明书提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括多核苷酸，所述多核苷酸包括编码冠状病毒S蛋白三聚体抗原的核苷酸序列，其中在形成S蛋白三聚体的卷曲盘绕的S蛋白单体的区中的至少一个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代，如本文所描述的。
此类组合物可以包含如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原、载体或多核苷酸以及一种或多种药学上可接受的载剂。E.W.Martin,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Co.,Easton,Pa.),第19版,1995的《雷明顿氏药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》描述了适用于所公开的免疫原的药物递送的组合物和调配物。通常，载剂的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外调配物通常包括可注射流体，所述可注射流体包含药学上和生理学上可接受的载剂，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载剂可以包含例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载剂之外，要施用的药物组合物(如免疫原性组合物)可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲液等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在特定实施例中，适合于向受试者施用的载剂可以是无菌的、和/或悬浮的或以其它方式包含在单位剂型中，所述单位剂型含有一个或多个测量剂量的适合于诱导期望的免疫应答的组合物。所述载剂也可能伴随着用于其治疗目的的药物。单位剂型可以是，例如，包含无菌内容物的密封小瓶或用于注射到受试者中的注射器，或冻干以用于随后的溶解和施用，或者呈固体或受控释放剂量。
在一个实施例中，所述组合物包括如本文所描述的疫苗抗原。在一个实施例中，所述组合物包括如本文所描述的载体。在一个实施例中，所述组合物包括如本文所描述的多核苷酸。在一个实施例中，所述多核苷酸是DNA。在一个实施例中，所述多核苷酸是RNA。在一个实施例中，所述多核苷酸是mRNA。
在一个实施例中，所述组合物包括脂质纳米颗粒。在一个实施例中，脂质纳米颗粒包封如本文所描述的多核苷酸。
在一个实施例中，当组合物是疫苗组合物时，其可以包括一个或多个用于引发免疫应答的其它表位，例如B细胞和/或T细胞表位。
在一个实施例中，组合物被调配成与其预期的施用途径相容，例如局部或全身。施用途径的实例包含皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、鼻内、舌下、扁桃体、口服、肺、局部或其它肠胃外和粘膜途径。
在一个实施例中，组合物被调配成在冰箱温度下稳定。在一个实施例中，组合物被调配成适于在冰箱温度下运输和/或储存。在一个实施例中，冰箱温度是约3℃至约17℃，或约4℃至约10℃，或约4℃。在一个实施例中，组合物是在室温下稳定的调配物。在一个实施例中，室温是约18℃至约24℃，或约20℃至约23℃或约23℃。在一个实施例中，组合物被调配成适于非冷链运输和/或储存。在一个实施例中，组合物被调配成适于室温储存和/或蒸腾。在一个实施例中，组合物被调配成适在高于室温的温度下运输和/或储存，例如约25℃至40℃(对于没有冷链和低温储存和运输列车可用的国家)。
口服、鼻和肺部施用包含通过吸入和喷雾递送到上述部位的施用。用于肠胃外、皮内或皮下施涂的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调节pH。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射用途的组合物包含无菌水溶液(其中可溶于水)或分散、非水性溶液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载剂包含生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(新泽西州派西派尼的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。其应当在制备和储存条件下是稳定的并且抵抗如细菌和真菌等微生物的污染作用而保存。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现对微生物的作用的预防。等渗剂，例如糖、多元醇(如木糖醇、山梨醇)、氯化钠也可以包含在组合物中。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝或明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过将如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原、载体或多核苷酸以所需量掺入到适当的溶剂或缓冲液中，并且根据需要掺入以上列举的一种或多种成分的组合，随后进行过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将多核苷酸掺入到无菌媒剂中来制备，所述无菌媒剂含有基础分散培养基以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包含真空干燥和冷冻干燥，这样产生了活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望的成分的粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。出于口服治疗施用的目的，如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原、载体或多核苷酸可以与赋形剂结合，并且以喷雾剂、片剂、锭剂或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的液体载剂进行制备。可以包含药学上相容的粘结剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶等结合剂；如淀粉或乳糖等赋形剂、如海藻酸、PRIMOGEL或玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁或斯特罗斯(sterotes)等润滑剂；如胶态二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味调味剂。
适合通过鼻吸入施用的调配物包含载剂为固体的情况，包含粒度在例如约1微米至约500微米范围内的粗粉末，其通过喷雾器、雾化器、吸入器或鼻吸的方式施用。其中载剂是用于通过雾化器施用的液体的合适的调配物包含药剂的水溶液或油溶液。对于通过吸入施用，药剂也可以以液滴或气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂(例如，如二氧化碳等气体或雾化器)的加压容器或分配器中输送。此类方法包含在U.S.6,468,798中描述的那些方法。
适于通过口腔吸入施用的调配物包含载剂是固体的情况，包含粒度在例如约20微米至约500微米范围内的粗粉末，其通过从保持粉末的容器口腔吸入施用，所述容器保持在口腔附近，或者载剂是用于通过雾化器施用的液体的情况，其可以包含药剂的水溶液或油溶液。
全身施用还可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在调配物中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。所述渗透剂是所属领域中一般已知的，并且例如对于经粘膜施用，包含清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾、液滴或栓剂实现。对于经皮施用，将如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原、载体或多核苷酸调配成软膏、膏剂、凝胶或乳膏，如本领域中通常已知的。
通过针或无针方法进行的疫苗皮内递送在施用容易性方面提供了优势，并且设想了有效地靶向免疫活性细胞的皮内施用方法。液体调配物可以在预填充的或未预填充的注射器中提供，或者需要此类一次性注射器喷射注射器、安装在注射器上的中空微针以及适于皮内递送的针。带有单个ID针的预填充的注射器是可商购获得的。可替代地，可以采用固体或可生物降解的微针，其涂覆或浸渍有疫苗，如贴片或其它微型针/刺突装置，或由疫苗组成。这些被插入皮肤的真皮层，在那里疫苗涂层被溶解，或者微针本身在适当的位置溶解。疫苗抗原可以作为液体或半液体调配物、或作为固体或粉末调配物提供。喷射注射器通过产生高压流来工作，所述高压流将液体疫苗调配物冲洗到更深的皮肤层中。然而，以固体形式递送疫苗的方法也可能被证明是有希望的。一种此类方法是弹道方法，其中固体疫苗颗粒或疫苗涂覆的金颗粒通过无针装置朝向皮肤加速，使得颗粒沉积在皮肤的表皮和真皮层中。
肌内施用可以通过本领域技术人员已知的任何肌内方法，包含例如肌内注射。
组合物也可以制备成栓剂形式(例如，用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
组合物可以包含佐剂。如果作为与一种或多种佐剂的混合物进行施用，可以增强对抗原的免疫应答。免疫佐剂通常以以下中的一种或多种方式起作用：(1)免疫调节(2)增强呈递(3)CTL产生(4)靶向；和/或(5)库房产生。
可能或可能不包含的说明性佐剂包含：颗粒或非颗粒佐剂、完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant，CFA)、基于铝盐的佐剂、基于乳液的佐剂、TLR激动剂、ISCOMS、LPS衍生物，如MPL，及其衍生物，如3D-MPL以及GLA和AGP、源自分枝杆菌的蛋白质，如胞壁酰二肽或三肽，具体地来自皂树皂苷(Quillaja saponaria)的皂苷，如QS21、QS7和ISCOPREPTM皂苷、ISCOMATRIXTM佐剂，以及肽，如胸腺肽α1。除了皂苷组分之外，佐剂可以包括甾醇，如β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一些实施例中，佐剂以水包油乳液的形式存在，例如包括角鲨烯、α-生育酚和表面活性剂或以脂质体的形式存在。AddaVax是一种基于MF-59的调配物的基于角鲨烯的水包油纳米乳液，已被发现可用于流感疫苗。佐剂AS03、MF59和CpG 1018已经被用于许可的疫苗中。其它合适的佐剂包含卵磷脂和卡波姆均聚物、基质M、ASO1、ALFQ。设想了CpG基序和共刺激分子，包含TLR激动剂、B7、OX-40L、G-CSF。在Liang等人,《免疫学前沿(Front.Immunol.)》2020年11月6日中讨论了佐剂。
在一个实施例中，组合物包括佐剂，所述佐剂选自以下中的一种或多种：基于铝盐的佐剂、乳液佐剂或TLR激动剂。此类佐剂的实例在例如Liang等人,(2020)中进行了描述。
例如，用于静脉内施用病毒载体的合适剂量范围通常是约0.001微克至10微克核酸。用于鼻内施用的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至10mg/kg体重。可以根据源自体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线来外推有效剂量。栓剂通常含有范围为0.5重量％至10重量％的活性成分；口服组合物优选地含有10％至95％的活性成分。
受试者可以按预定的间隔接受一个剂量的组合物或两个或三个剂量的组合物。
针对受试者抗原产生的抗体可以用于疗法或用于筛查。抗体包含与抗原或其抗原片段特异性结合并对其进行识别的免疫球蛋白、抗原结合片段或其衍生物，或抗原的二聚体或多聚体。术语“抗体”以最广泛的含义在本文使用并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多(和双)特异性抗体和抗体片段。抗体片段的实例包含但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab').sub.2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段包含通过修饰整个抗体产生的或使用重组DNA方法从头合成的抗原结合片段(可以参考Kontermann和Dubel(编辑),《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第1-2卷,编辑,施普林格出版社,2010)。
术语表位是指分子上是抗原的特定肽序列，使得其引发特定的免疫应答。表位是B和/或T细胞对其作出响应的抗原的区。抗体可以与特定的抗原表位结合，所述抗原表位可以由连续氨基酸或非连续氨基酸两者形成。
预防和/或治疗的方法
一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗受试者的冠状病毒感染的方法。
如本文所使用的，术语“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”是指降低感染或出现感染或其症状的可能性。预防不一定是完全的，并且不意味着受试者最终不会感染或出现感染或其症状。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指至少部分地获得期望的治疗结果。在一个实施例中，治疗包括预防或延迟CoV感染的一种或多种症状的出现。在一个实施例中，治疗包括阻止或减少CoV感染的一种或多种症状的发展。
对“受试者(subject)”或“受试者(subjects)”的提及包含易受冠状病毒感染或处于暴露于冠状病毒风险下的受试者。受试者可能已感染或未感染，并且可能无症状或需要治疗。在一个实施例中，受试者易受SARS-CoV-2感染或处于暴露于所述感染的风险下。例如，受试者可以是哺乳动物、禽类、节肢动物、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性受试者包含但不限于人、灵长类动物、家畜(例如，羊、牛、鸡、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如，狐狸、鹿)、动物园动物(例如，狮子、老虎、熊)、储存动物(例如，蝙蝠、骆驼、穿山甲)。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，人是胎儿、婴儿、儿童、早期成人和成人。在一个实施例中，成人是年长成人。在一个实施例中，成人是以下中的一种或多种：年龄高于60岁、年龄高于65岁、年龄高于70岁、年龄高于75岁、年龄高于80岁、年龄高于85岁、年龄高于90岁。在一个实施例中，受试者先前患有冠状病毒感染。在一个实施例中，受试者先前患有SARS-CoV-2感染。在一个实施例中，受试者已经接受了如本文所描述的初级冠状病毒治疗方案。在一个实施例中，受试者已经接受了初级和次级冠状病毒治疗方案。在一个实施例中，受试者已经接受了初级冠状病毒治疗方案、次级冠状病毒治疗方案和三级冠状病毒治疗方案。在一个实施例中，受试者是免疫受损的。在一个实施例中，受试者患有呼吸系统病状。
一方面，本发明提供了一种在受试者体内诱导对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。一方面，本发明提供了一种在受试者体内增强对冠状病毒的所述免疫应答的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种预防或降低受试者的冠状病毒感染的可能性的方法，所述方法包括施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种预防或降低受试者的冠状病毒感染的症状的可能性或严重程度的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所描述的疫苗。
一方面，本发明提供了一种降低受试者的冠状病毒感染的严重程度和/或持续时间的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所描述的疫苗。如本文所使用的，短语“降低感染的严重程度”或类似短语包含在个体中降低以下中的一种或多种：病毒的滴度、病毒感染的持续时间、受试者的冠状病毒感染的一种或多种症状的严重度或持续时间。如本文所使用的，短语“冠状病毒感染的持续时间”是指个体患有CoV感染或由CoV感染引起的症状的时间。
一方面，本发明提供了一种预防或降低感染冠状病毒的人类个体的病毒脱落的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所描述的疫苗。
在一个实施例中，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗是初级疫苗方案。如本文所使用的，“初级疫苗方案”是向受试者施用以产生对特定病原体的应答的第一疫苗方案。在SARS-CoV-2的上下文中，初级疫苗是施用于受试者以产生对祖先毒株和/或其变体的免疫应答的第一疫苗方案。
在一个实施例中，本发明提供了一种加强剂疫苗，所述加强剂疫苗用于初级冠状病毒疫苗方案。在一个实施例中，本发明提供了一种加强剂疫苗，所述加强剂疫苗用于受试者已经接受了多于一种先前的冠状病毒疫苗方案的情况。在一个实施例中，加强剂通过增强由初级疫苗方案引发的免疫应答而起作用。在一个实施例中，加强剂通过增强对VOC或VOI或VHC(初级疫苗方案对其产生较少、几乎没有或没有保护性免疫应答)的免疫应答而起作用。在一个实施例中，在初级疫苗方案后至少6个月、或至少12个月、或至少18个月、或至少2年、或至少3年、或至少5年、或至少6年、或至少7年施用加强剂。在一个实施例中，加强剂顺序施用或与一种或多种其它加强剂疫苗组合施用。
初级疫苗方案
在一些实施例中，如本文所描述的疫苗在受试者已经接受初级冠状病毒疫苗方案之后施用。本领域技术人员将理解，初级冠状病毒疫苗方案可以是提供针对冠状病毒感染的保护的任何冠状病毒疫苗方案。在一个实施例中，冠状病毒疫苗是SARS-CoV-2冠状病毒疫苗。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案选自：a)单剂量疫苗方案；b)两剂量疫苗方案；c)单剂量的两剂量疫苗方案或d)其组合。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案选自：a)基于RNA的疫苗；b)基于DNA的疫苗；c)病毒载体疫苗；d)灭活疫苗；e)减毒活疫苗；以及f)蛋白质亚基疫苗。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是基于RNA的疫苗。如本文所使用的，“基于RNA的疫苗”通过RNA分子(如mRNA)在人细胞中传递冠状病毒抗原(例如S蛋白或其一部分)的表达的指令。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是基于DNA的疫苗。如本文所使用的，“基于DNA的疫苗”通过DNA分子在人细胞中传递冠状病毒抗原(例如S蛋白或其一部分)的表达的指令。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是病毒载体疫苗。在一个实施例中，载体选自腺病毒、痘病毒、麻疹病毒和水疱性口炎病毒。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是灭活病毒疫苗。灭活疫苗是通过用例如化学UV光和/或加热灭活病毒而产生的，这样其就不再具有传播性。此类疫苗通常是期望的，因为其提供了用于免疫识别和产生免疫应答的若干个表位。
在一个实施例中，初级冠状病毒疫苗方案是减毒活冠状病毒。如本文所使用的，“减毒活”是指
在一个实施例中，疫苗是基于蛋白质的疫苗，例如蛋白质亚基疫苗或病毒样制品。如本文所使用的，“蛋白质亚基疫苗”包括可以刺激宿主免疫应答的免疫原性抗原。在冠状病毒是SARS-CoV-2的情况下，蛋白质亚基疫苗可以包括S1蛋白或其一部分、RBD结构域、S2蛋白或其一部分。在一个实施例中，基于蛋白质的疫苗是病毒样颗粒或纳米颗粒。
组合治疗
如本文所描述的冠状病毒疫苗抗原或疫苗可以与一种或多种另外的疫苗抗原或疫苗组合施用于受试者。另外的疫苗抗原或疫苗可以产生针对感染性致病生物体(如流感、SARS-COV-2或其特定VOC、VOI或VHC)的免疫应答。施用可以是组合(同时)的或是按任意顺序的。
试剂盒、装置、表面或条带
将受试者冠状病毒抗原捕获在固体或半固体表面上用于测定目的，包含流行病学、诊断、纯化、药物筛选、疫苗筛选应用等。将抗原固定到表面的许多此类应用和方法在本领域中是众所周知的并且涵盖在内。
如本文所使用的，术语“补体”或“互补”是根据其简单和普通的含义使用的，并且是指能够与互补核苷酸或核苷酸序列碱基配对的核苷酸(例如，RNA核苷酸或DNA核苷酸)或核苷酸序列。如本文所描述的和本领域公知的，腺苷的互补(匹配)核苷酸是DNA或可替代地RNA中的胸苷，腺苷的互补(匹配)核苷酸是尿嘧啶，并且鸟嘌呤的互补(匹配)核苷酸是胞嘧啶。核苷酸也可以是非天然存在的或经修饰的碱基。因此，补体可以包含与第二核酸序列的对应互补核苷酸碱基配对的核苷酸序列。补体的核苷酸可以部分或完全匹配第二核酸序列的核苷酸。当补体的核苷酸与第二核酸序列中的每个核苷酸完全匹配时，补体与第二核酸序列中的每个核苷酸形成碱基对。当补体的核苷酸与第二核酸序列的核苷酸部分匹配时，补体中的仅一些核苷酸与第二核酸序列的核苷酸形成碱基对。互补序列的实例包含编码和非编码序列，其中非编码序列含有编码序列的互补核苷酸，并且因此形成编码序列的补体。互补序列的另外的实例是正义序列和反义序列，其中正义序列含有反义序列的互补核苷酸，并且因此形成反义序列的补体。含嘌呤核苷酸(例如，A或G)与含嘧啶核苷酸(例如，T或C)的配对被认为是补体。A-T和C-G配对的作用是在互补碱基上的胺与羰基之间形成双氢键或三氢键。序列的互补性可以是部分的，其中根据碱基配对，只有一些核酸匹配，或者是完全的，其中根据碱基配对，所有核酸匹配。因此，彼此互补的两个序列可以具有指定百分比的彼此形成补体的核苷酸(例如，在指定区内约60％，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的互补性)。在一个实施例中，当两个序列完全互补时，其是互补的，具有100％互补性。在一个实施例中，当两个序列在功能上互补时，即在适当条件下成功退火并且具有至少80％至99％或至少70％至95％的碱基配对时，其是互补的。
实例
实例1——材料
材料实例1至9
重组蛋白。编码SARS-CoV-2(Hu-1分离株)S胞外结构域的合成基因与Wrapp等人,2020描述的S2P蛋白对应，所述蛋白获得自GeneART-赛默飞世尔科技公司(GeneART-ThermoFisher Scientific)。基因编码S残基16-1208、弗林蛋白酶切割位点突变、R682RAR->G682SAS以及位置986和987处的di-Pro取代。S2P的C末端附加有折叠子(YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)(SEQ ID NO:20)、八-His和avitag(GLNDIFEAQKIEWHE)序列(统称为FHA或FHA标签SEQ ID NO:21)，每个由GSGS接头隔开。合成S2P基因通过NheI连接在pcDNA3(英杰公司(Invitrogen))内的编码组织纤溶酶原激活剂前导的DNA序列的下游。使用由GeneART-赛默飞世尔科技公司生产的编码突变的S2P亚片段的合成基因将突变引入S2P表达载体中。编码S1亚基(氨基酸16-682)和受体结合结构域(RBD；氨基酸332-532)的合成基因从GeneART-赛默飞世尔科技公司获得，并且通过pcDNA3中的NheI与组织纤溶酶原激活剂前导连接。两种蛋白质都编码C末端六-His标签和Avitag序列。hACE2-Fc是一种重组融合蛋白，其包括通过GS接头与人IgG1的Fc结构域连接的人ACE2胞外结构域的氨基酸19-615。从GeneART-赛默飞世尔科技公司获得编码hACE2-Fc的合成基因，并且通过pcDNA3中的NheI与组织纤溶酶原激活剂前导的下游连接。通过荧光桑格测序(BigDye，ABI)验证了S和hACE2克隆的DNA序列。
重组蛋白的表达和纯化。使用如制造商(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))推荐的293fectin将S2P表达载体转染到293Freestyle细胞中。细胞在34℃下培养5天，之后通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。然后使用TALON树脂(默克公司(Merck))通过二价阳离子亲和色谱法纯化S2P蛋白，随后使用与AKTApure仪器(思拓凡公司(Cytiva))连接的Superose 6Increase10/300柱进行尺寸排阻色谱法(SEC)。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，通过使用Expifectamine用合适的表达载体转染Expi293细胞来产生S1和RBD蛋白。在34℃下培养4天后，通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。使用TALON树脂(默克公司)通过二价阳离子亲和色谱法纯化S1和RBS蛋白，随后使用与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的Superdex 200 16/600柱进行SEC。与S1和RBD一样，在Expi293细胞中产生hACE2-Fc，并且使用蛋白G-琼脂(金斯瑞公司(Genscript))从澄清的培养物上清液中进行纯化。hACE2-Fc在与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的Superdex 200 16/600柱上通过SEC进一步纯化。使用Amicon离心过滤单元浓缩所有蛋白质。使用0.45μm硝化纤维素过滤器对蛋白质溶液进行过滤灭菌，并且将蛋白质等分试样储存在-80℃下。通过SDS-PAGE和SEC评估蛋白质纯度。
重组单克隆抗体(mAb)。使用由GeneART-赛默飞世尔科技公司生产的编码mAb重链和轻链可变区的合成基因片段，在内部产生含有SARS-CoV-2引导的mAb CR3022(Muelen,《公共科学图书馆医学(PloS-Med)》2006)、CB6(Shi,《自然》2020)、H4和B38(Wu等人,2020)、2-51(Liu等人,2020)、COVA2-15、COVA2-33、COVA1-25、COVA1-22、COVA2-14(Brouwer等人,2020)的可变区的基于pCDNA3的IgG1重链和重链表达载体(Center等人,2020)。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，通过使用Expifectamine用等量的匹配的重链和轻链载体转染Expi293细胞来产生mAb。在37℃下培养5天后，通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。使用蛋白G-琼脂糖(金斯瑞公司)通过亲和色谱法纯化IgG，并且将其交换到PBS中。使用Amicon离心过滤单元浓缩抗体。使用0.45μm硝化纤维素过滤器对IgG溶液进行过滤灭菌，并且将等分试样储存在-80℃下。
差示扫描荧光测定法。差示扫描荧光测定法用于评估蛋白质热稳定性(《尼森自然实验手册(Niesen Nature Protocols)》2007)。用5x浓度的SYPRO Orange蛋白凝胶毒株(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))将10μg的蛋白质稀释成25μL，一式两份。然后将样品在Mx3005P qPCR系统中以0.5℃的增量从25℃加热到95℃，每个增量持续1分钟。在每个增量结束时进行3次荧光测量。激发在492nm处，并且发射在610nm处。熔融温度被确定为熔融曲线的负一阶导数的最小值。
生物层干涉测量法。使用OctetRED系统(加利福尼亚州弗里蒙特的ForteBio公司(ForteBio,Fremont CA))确定基于BLI的测量(BLI)。抗体在动力学缓冲液中稀释到10μg/ml，并且固定到抗人IgG Fc捕获生物传感器(AHC，ForteBio公司)上。在30℃下，使用标准动力学采集速率设置(5.0Hz，平均20)，在1,000rpm的样品板振荡速度下进行动力学测定。动力学实验包含五个步骤：(a)基线(180秒)；(b)抗体负载(300秒)；(c)第二基线(180秒)；(d)抗原的缔合(300秒)和(e)抗原的解离(300秒)。使用ForteBio Data Analysis 10.0软件使用1:1结合模型构建拟合曲线，并且使用双参考减法进行校正。
免疫接种。在第0周、第4周和第14周，用30μg于PBS中的S2P蛋白与AddaVax佐剂(加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司(InvivoGen,San Diego,CA))以1:1(v/v)的混合物皮下免疫接种性别、体重和年龄匹配的豚鼠(远交三色)。阴性对照组如上所述用PBS和佐剂的1:1(v/v)混合物免疫接种。在第2次给药后2周通过隐静脉收集血液，并且在第3次给药后2周通过终末心脏穿刺收集血液，并且使其凝结用于血清制备。在用于免疫测定之前，血清在-80℃下储存，在56℃下加热灭活30分钟。动物被圈养，并且所有程序在澳大利亚吉勒斯平原的南澳大利亚健康与医学研究所(South Australian Health and Medical ResearchInstitute,Gilles Plains,Australia)的临床前、成像和研究实验室进行。所有动物实验均根据《澳大利亚科学目的动物的护理和使用规范(Australian Code for the Care andUse of Animals for Scientific Purposes)》第八版进行，并且经SAHMRI动物伦理委员会(SAHMRI Animal Ethics Committee)批准，项目编号SAM-20-030。
ELISA。Nunc maxisorp 96孔板在4℃下用S2P、S1和RBD蛋白溶液(2μg/ml，PBS)涂覆过夜。用PBS洗涤板，并且在室温下用BSA(10μg/ml，PBS)封闭1小时。再次洗涤板，并且然后在室温下与连续稀释的血清样品一起温育2小时至4小时。使用辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠抗体(丹麦格洛斯楚普的丹科公司(Dako,Glostrup,Denmark))和3,3',5,5'5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)四甲基联苯胺二盐酸盐(TMB)检测抗体结合。使用Prism版本9软件，通过用非线性回归拟合曲线来比较抗体与不同抗原的结合，并且通过插入为背景的光密度(OD)的10倍的光密度值来获得滴度，如通过与BSA的结合所定义的。
假型化病毒产生。根据Jackson等人,2020的方法制备S假型化HIV荧光素酶报告基因病毒。用于产生S-HIV假颗粒的质粒是NIH研究院疫苗研究中心的Doria Rose教授赠送的，并且包含携带密码子优化的全长S(Genbank编号MN908947.3)的WH-Human1_EPI_402119表达质粒、包装质粒pCMVΔR8.2和荧光素酶报告基因质粒pHR'CMV Luc(Naldini《美国国家科学院院刊(PNAS)》1996；93:11382)和TMPRSS2质粒(Bottcher《JVI》2006,80:9869)。将4个质粒共转染到HEK293T细胞中，并且在18小时温育后，用新鲜的Dulbecco改良的含有10％胎牛血清(DMF10)的最低必需培养基置换培养基，并且培养另外3天。通过0.45μm膜过滤器过滤含有逆转录病毒假型化病毒的澄清上清液。在相关变体中观察到的突变通过重叠延伸聚合酶链式反应引入WH-Human1_EPI_402119的S开放阅读框中。
中和测定。根据Jackson等人,2020的方法进行中和。将热灭活的血清(56℃，持续30分钟)在DMF10中连续稀释，并且每个稀释液与等体积的S假型化HIV荧光素酶报告基因病毒混合，并且在37℃下温育1小时，一式三份。前一天，将病毒-血清混合物以5,000个细胞/孔添加到293T-ACE2细胞单层中，所述细胞单层与涂覆有聚-L-赖氨酸的96孔板连接，并且在37℃下温育2小时，然后添加等体积的DMF10。3天后，去除组织培养流体，将单层用PBS洗涤一次，并且用细胞培养裂解试剂(普洛麦格公司(Promega))裂解，并且在Clariostar读板器(BMG实验室技术公司(BMG LabTechnologies))中使用荧光素酶底物(普洛麦格公司)测量荧光素酶。平均进入百分比计算为(RLU血浆+病毒)/(RLU培养基+病毒)*100。进入百分比针对Prism v8.3.1中血浆的倒数稀释度进行绘制，并且与单位点特异性结合Hill图进行曲线拟合。根据非线性回归线(ID50)计算了防止50％病毒进入所需的血浆的倒数稀释度。可检测到的最低量的中和性抗体的滴度为200。所有未达到50％中和的样品被指定为任意值100。
血清mAb交叉竞争ELISA。在293Expi-BirA细胞(稳定表达BirA的293Expi细胞)中产生生物素化的S2P蛋白，并且如上文针对S2P所描述的进行纯化。对于竞争ELISA，Nuncmaxisorp 96孔板在4℃下用链霉亲和素(西格玛公司(Sigma))(5μg/ml于50mM碳酸盐缓冲液中)涂覆过夜，之后在室温下将其用BSA(10mg/ml于PBS中)封闭1小时。2次洗涤后，将板与生物素化的S2P三聚体(2μg/ml于含有0.05％Tween20的5mg/ml BSA/PBS中)在室温下温育1小时。将连续稀释的疫苗血清与亚饱和量的hACE2-Fc和抗SARS-CoV-2S mAb混合，并且与链霉亲和素生物素化的S2P涂覆的板在室温下温育另外2小时。使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG F(ab')2(赛默飞世尔科技公司)或辣根过氧化物酶标记的抗人IgA、IgG、IgM(丹麦格洛斯楚普的丹科公司)检测mAb与hACE2-Fc的结合。底物是TMB。用Multiskan Ascent读板器(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默电子公司(Thermo Electron,Waltham,MA))测量颜色反应。使用Prism版本9软件通过用非线性回归拟合曲线比较抗体与不同抗原的结合，并且通过插值获得ID50。
统计方法。使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验和Prism 9中的邓恩多重比较(Dunn'smultiple comparisons)对数据进行统计比较。对于中和测定，使用弗里德曼检验来比较配对的样品。
材料实例10至11
重组蛋白。编码SARS-CoV-2Hu-1、δ(B.1.617.2)和奥密克戎BA.1(B.1.1.529)受体结合结构域(S残基332-532，根据Hu-1编号系统)的合成基因从GeneART-赛默飞世尔科技公司获得。RBD的C末端附加有GGSGS-八His-GSGS-avitag(GLNDIFEAQKIEWHE)序列。GSGSGS＝SEQ ID NO:22GSGS＝SEQ ID NO:23。合成RBD-His8-avitag基因通过NheI连接在pcDNA3(英杰公司)内的编码组织纤溶酶原激活剂前导的DNA序列的下游。编码SARS-CoV-2δ和奥密克戎BA.1分离株S胞外结构域的合成基因与Wrapp等人,2020描述的S2P蛋白对应，所述蛋白获得自GeneART-赛默飞世尔科技公司。基因编码S残基16-1208(根据Hu-1编号系统)、弗林蛋白酶切割位点突变、δ的R681RRAR->P681GSAS和奥密克戎BA.1的H681RRAR->P681GSAS，以及位置986和987处的di-Pro‘2P’取代。S2P的C末端附加有折叠子(YIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL；SEQ ID NO:20)、八-His和avitag(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQID NO:21)序列(统称为FHA或FHA标签)，每个由GSGS接头隔开。将编码Hu-1分离株的S残基16-1208、弗林蛋白酶切割位点突变R682RAR->G682SAS和位置986和987处的di-Pro取代的合成基因用编码GSGS接头和六-His标签的合成DNA序列附加在3'端处以得到S2P-1208.H6。合成S2P基因通过NheI连接在pcDNA3(英杰公司)内的编码组织纤溶酶原激活剂前导的DNA序列的下游。使用由GeneART-赛默飞世尔科技公司生产的编码突变的S2P亚片段的合成基因将突变引入S2P表达载体中。
重组蛋白的表达和纯化。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，通过使用Expifectamine用合适的表达载体转染Expi293-BirA细胞来产生生物素化的RBD和S2P-FHA蛋白。在34℃下培养4天后，通过离心并通过0.45m硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。使用TALON树脂(默克公司)通过二价阳离子亲和色谱法纯化RBD和S2P-FHA蛋白，随后使用分别与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的Superdex 200 16/600或Superose 6柱进行尺寸排阻色谱法。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，分别使用293Fectin或Expifectamine用合适的表达载体转染FreeStyleTM 293细胞(293Freestyle)细胞或Expi293FTM(Expi293F)细胞来产生非生物素化的S2P-FHA和S2P-1208.H6蛋白。细胞在34℃下培养5天，之后通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。然后使用TALON树脂(默克公司)通过二价阳离子亲和色谱法纯化S2P蛋白，随后使用与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的Superose 6Increase 10/300柱进行尺寸排阻色谱法。当需要时，将TALON亲和色谱法步骤置换为使用与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的HiTrap螯合HP固定化金属亲和柱(思拓凡公司)的色谱法步骤。在这种情况下，使用咪唑浓度梯度洗脱S2P蛋白。
重组单克隆抗体(mAb)。使用由GeneART-赛默飞世尔科技公司生产的编码mAb重链和轻链可变区的合成基因片段，在内部产生含有SARS-CoV-2引导的mAb COVOX222(Dejnirattisai等人,2021)、S2H97和S2E12(Starr等人,2021)、CV3-25(Jennewein等人,2021)和对照HCV导向的mAb HC33.1(Center等人,2020)的可变区的基于pCDNA3的IgG1重链和重链表达载体(Center等人,2020)。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，通过使用Expifectamine用等量的匹配的重链和轻链载体转染Expi293F细胞来产生mAb。在37℃下培养5天后，通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。使用蛋白G-琼脂糖(金斯瑞公司)通过亲和色谱法纯化IgG，并且将其交换到PBS中。使用Amicon离心过滤单元浓缩抗体。使用0.45μm硝化纤维素过滤器对IgG溶液进行过滤灭菌，并且将等分试样储存在-80℃下。
亲和素捕获ELISA。Nunc maxisorp 96孔板在4℃下用亲和素(洛克兰公司(Rockland))(5μg/ml于50mM碳酸盐缓冲液中)涂覆过夜，之后在室温下将其用BSA(10mg/ml于PBS中)封闭1小时。4次洗涤后，将板与生物素化的RBD蛋白(2μg/ml于含有0.05％Tween20的5mg/ml BSA/PBS中)在室温下温育1小时。将连续稀释的疫苗血清与抗生物素化的RBD涂覆的板在室温下温育另外2小时。使用辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG(丹科公司)检测抗体结合。底物是TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。用Multiskan Ascent读板器(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默电子公司)测量颜色反应。使用Prism版本9软件，通过用非线性回归拟合曲线比较抗体与不同抗原的结合，并且将终点滴度确定为在不存在一级抗体的情况下获得的背景OD的5倍。
链霉亲和素捕获ELISA。Nunc maxisorp 96孔板在4℃下用链霉亲和素(西格玛公司)(5μg/ml于50mM碳酸盐缓冲液中)涂覆过夜，之后在室温下将其用BSA(10mg/ml于PBS中)封闭1小时。2次洗涤后，将板与生物素化的S2P-FHA三聚体(2μg/ml于含有0.05％Tween 20的5mg/ml BSA/PBS中)在室温下温育1小时。将连续稀释的人mAb与链霉亲和素-生物素化的S2P-FHA涂覆的板在室温下温育另外2小时。使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG F(ab')2(赛默飞世尔科技公司)检测mAb结合。底物是TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。用Multiskan Ascent读板器(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默电子公司)测量颜色反应。
活病毒中和测定。Aggarwal等人,2021开发的具有HAT-24细胞的快速高含量SARS-CoV-2微中和测定(R-20测定)平台用于确定疫苗血清的活病毒中和ID50值。将HAT-24细胞用胰蛋白酶消化，以5％v/v重悬于具有Hoechst-33342活核染料(英杰公司，R37605)的DMEM-5％胎牛血清培养基中，并且以1.6×104个细胞/孔接种在384孔板(康宁公司(Corning)，CLS3985)中。豚鼠血清在DMEM-5％FBS中连续稀释(2倍)，并且与等体积的SARS-CoV-2病毒溶液以2x中值致死剂量(2xLD50)混合，一式两份。在37℃下病毒-血清温育1小时后，将40μL添加到等体积的预铺板的细胞中。然后在InCell Analyzer HS2500高含量荧光显微镜系统(思拓凡公司)上直接成像前将细胞板温育20小时。使用IN Carta自动化图像分析软件(思拓凡公司)获得细胞核计数，并且使用下式计算病毒中和的百分比：％N＝(D-(1-Q))×100/D，其中“Q”是孔的细胞核计数除以未感染的对照(定义为具有100％中和)的平均计数，并且D＝1-Q是阳性感染对照的平均计数(定义为具有0％中和)。用于确定稀释的血清样品的中和终点滴度的截止值设置为最后的连续稀释达到技术重复的平均值≥50％的中和。
化学交联。将甲状腺球蛋白(0.5mg/ml于PBS中，思拓凡公司)与PBS中的1mM双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(赛默飞世尔公司)在冰上化学交联1小时。用于PBS(pH 7.2)中的30mM甘氨酸在冰上淬灭反应30分钟。
S2P-1273表达载体的构建。编码Hu-1、δ和奥密克戎BA.1变体的S残基1-1273的合成基因由GeneART-赛默飞世尔公司生产。这些基因在5'端处(在ATG起始密码子之前)含有KpnI限制性位点，随后是TATCGCCACC(SEQ ID NO:24)序列，并且在3'端处含有XbaI位点(在TAA终止密码子之后)。合成基因编码弗林蛋白酶切割位点突变：Hu-1的R682RAR->G682SAS，δ的R681RRAR->P681GSAS和奥密克戎BA.1的H681RRAR->P681GSAS，以及位置986和987处的di-Pro‘2P’取代。将合成基因克隆到CMV启动子驱动的表达载体pSHUTTLE(安捷伦公司(Agilent))的KpnI-EcoRV位点中。
293T细胞中表达的S2P-1273糖蛋白的蛋白质印迹。根据制造商的说明书，使用FUGENE HD(普洛麦格公司)用S2P-1273表达载体转染293T细胞。转染后48小时，用冰冷的PBS洗涤细胞，在10,000rpm下离心90秒，并且将沉淀物在裂解缓冲液(在含有1mM乙二胺四乙酸的PBS中的1％Triton X100)中在冰上裂解30分钟。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟来澄清裂解物，并且在存在3％β巯基乙醇的情况下经历SDS-PAGE。使用iBLOT2系统(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到硝化纤维素上，并且用于PBS中的5％脱脂奶粉封闭膜。用兔抗S1多克隆抗体(义翘神州公司(Sino Biological))和抗兔IRDye800CW(奥得赛公司(Odyssey))探测过滤器。然后在LI-CORE成像仪中对过滤器进行扫描。
流式细胞术。根据制造商的说明书，使用FUGENE 6(普洛麦格公司)用S2P-1273表达载体转染293T细胞。转染后48小时，用PBS洗涤连接的细胞，并且然后使用versene溶液分离。将细胞重悬于800μl的FACS缓冲液(5％v/v胎牛血清于含有2mM乙二胺四乙酸的PBS中)中。将细胞添加到u形底96孔培养板中，并且在室温下与5μg/ml的人mAb在FACS缓冲液中温育1小时。通过以400xg离心5分钟，在冰冷的FACS缓冲液中将细胞洗涤两次。然后将细胞与AlexaFluor 647山羊抗人(H+L)(英杰公司)在室温下在黑暗中温育30分钟。通过以400xg离心5分钟，在冰冷的FACS缓冲液中将细胞洗涤两次。将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中。在每次流式细胞术运行之前，将碘化丙啶添加到2.5μg/ml的最终浓度，以在分析期间排除死细胞。在添加碘化丙啶后立即将细胞应用于Canto II流式细胞仪。针对每个抗体-S2P-1273蛋白组合捕获一万个事件。使用FlowJo软件进行数据分析。
材料实例12
在各种温度下处理后在293T细胞中表达的S2P-1273和S2P.奥密克戎.BA.1-1273糖蛋白的蛋白质印迹。根据制造商的说明书，使用FUGENE HD(普洛麦格公司)用S2P-1273和S2P.奥密克戎-1273表达载体转染293T细胞。转染后48小时，用冰冷的PBS洗涤细胞，在10,000rpm下离心90秒，并且将沉淀物在裂解缓冲液(在含有1mM乙二胺四乙酸的PBS中的1％Triton X100)中在冰上裂解30分钟。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟来澄清裂解物。将澄清的裂解物分成等体积，并且调节到含有1.2％(w/v)SDS和0.25％(v/v)β巯基乙醇的最终浓度。将样品在各种温度下处理5分钟，并且在5％聚丙烯酰胺凝胶中经历SDS-PAGE。使用iBLOT2系统(赛默飞世尔公司)将蛋白质转移到硝化纤维素上，并且用于PBS中的5％脱脂奶粉封闭膜。用兔抗S1多克隆抗体(义翘神州公司)和抗兔IRDye800CW(奥得赛公司)探测过滤器。然后在LI-CORE成像仪中对过滤器进行扫描。
重组S2P.奥密克戎-1208.H6蛋白。将编码奥密克戎BA.1分离株的S残基16-1208(Hu-1编号系统)、弗林蛋白酶切割位点突变H681RRAR->P681GSAS和位置986和987处的di-Pro取代的合成基因用编码GSGS接头和六-His标签的合成DNA序列附加在3'端处以得到S2P.奥密克戎-1208.H6。合成基因是从GeneART赛默飞世尔科技公司获得的。S2P基因通过NheI连接在pcDNA3(英杰公司)内的编码组织纤溶酶原激活剂前导的DNA序列的下游。使用由GeneART赛默飞世尔科技公司生产的编码突变的S2P亚片段的合成基因将突变引入S2P表达载体中。
S2P.奥密克戎-1208.H6蛋白的表达和纯化。根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司)，通过使用Expifectamine用合适的表达载体转染Expi293F(Expi293F)细胞来产生S2P.奥密克戎-1208.H6蛋白。细胞在34℃下培养7天，之后通过离心并通过0.45μm硝化纤维素过滤器过滤清除转染上清液中的细胞。然后使用与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的HiTrap螯合HP固定的金属亲和柱(思拓凡公司)通过二价阳离子亲和色谱法纯化S2P.奥密克戎-1208蛋白。使用咪唑浓度梯度洗脱S2P蛋白。使用与AKTApure仪器(思拓凡公司)连接的Superdex 200 16/600或Superose 6柱，通过尺寸排阻色谱法纯化S2P.奥密克戎-1208三聚体。
实例2——S2P的特性
CMV启动子驱动的表达载体用于产生称为S2P(Wrapp等人,2020)的可溶形式的S糖蛋白，其包括S残基16-1208、弗林蛋白酶切割位点突变、R682RAR->G682SAS、位置986和987处的di-Pro取代。将折叠子、八-His和avitag序列添加到C末端以得到S2P-FHA。通过二价阳离子亲和色谱法进行部分纯化后，S2P-FHA蛋白的SEC显示与甲状腺球蛋白(669kDa)共洗脱的主峰，所述主峰被收集为同质蛋白，如SEC和SDS-PAGE所指示的(图2A和B)。生物素化的形式的纯化的S2P-FHA在ELISA中表现出与hACE2-Fc(与人IgG1的Fc结构域连接的人ACE2残基19-615)和各种人mAb的结合活性(图2C)。热荧光测定指示，S2P蛋白具有相对较低的热稳定性，表现出43.6℃的熔融温度(图2D)。
实例3——Ala腔取代对热稳定性的影响
评估了用更粗大的疏水性残基(Val、Leu、Ile、Phe)置换Ala1016/1020对SARS-CoV-2S三聚体的稳定性和抗原结构的影响。(2个实例在图1D中示出)。在S2P-FHA中，丙氨酸1016和A1020被Val、Ile、Leu和Phe单取代和双取代，并且293F表达的糖蛋白通过二价阳离子亲和色谱法部分纯化。SDS-PAGE指示一定范围的产率：S2P-FHA、1016V、1020V、1020I>1016/20VV、1016I、1020I、1016L、1020L、1016/20VI>1016/20II、1016/20LL、1016/20VL、1016/20VF、1016/20IF>1016/20FF(图3A)。使用热荧光测定检查S2P-FHA和突变体的热稳定性。S2P-FHA包括主要物种，其熔融温度为43.6℃，以及更稳定的次要物种，其熔融温度为58℃(图3B)。位置1016中的疏水性残基的取代增加了58℃物种的比例，其中A1016L是最稳定的突变。相比之下，43.6℃物种仍然是具有A1020的取代的主要形式。除了1016/20VV外，双取代均与稳定形式相关。
将代表性突变体纯化到均一性，并且在热荧光测定中重新分析(图4A-C)。用部分纯的蛋白质获得的热荧光数据被经纯化的三聚体大量概括。对于突变体，观察到58℃形式相对于43.6℃形式的比例增加，如下所示：1016/20VI＝1016/20II>1016L>1016V>S2P-FHA(图4C)。有趣的是，这种稳定性的层次与三聚体产率呈负相关(图4B)。图4D证实了在非还原条件和还原条件下通过SDS-PAGE评估的经纯化的三聚体的纯度。
实例4——Ala腔突变体的抗原特性
1016L和1016/20VI突变体表现出有利的热特性，并且可以以合理的产率纯化。因此，通过在生物层干涉测量法(BLI)中检测其与hACE2-Fc和重组人抗S单克隆抗体(mAb)的结合，将其抗原特性与S2P的抗原特性进行比较。hACE2-Fc和mAb与抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器连接，而S2P蛋白处于分析物相中。大多数S配体的可测量解离速率并不明显，推测是由于亲合力效应，使得无法获得KD值(图5A)。传感图的比较指示，相对于S2P-FHA，1016L和1016/20VI对hACE2-Fc和干扰S-ACE2相互作用的mAb(如H4、B38和CB6)的总体结合能力连续降低。对于CR3022(一种mAb，其引导到RBD的碱基处的表位，当所述RBD处于“向上”定向时，所述表位暴露)也观察到了这种结合模式。相比之下，观察到1016L和1016/20VI分别与引导到RBD外部的S中的表位的COVA1-25的结合连续增加(图5A)。数据汇总在热图中(图5B)，所述热图示出了与30nM的分析物缔合240秒后观察到的波长变化。这些数据表明，1016L和1016/20VI促进S2P-FHA三聚体中的RBD向下构象，同时暴露在S内但在RBD外的表位。
实例5——Ala腔突变体的免疫原性
使用豚鼠来检查Ala腔突变是否可以影响对S2P-FHA三聚体的抗体应答的幅度和特异性。在第0周、第4周和第14周，用于Addavax佐剂中的30μg的S2P-FHA、1016L和1016/20VI免疫接种远交豚鼠，并且在第6周和第16周进行采血(图6A)。在ELISA中确定第16周血清对RBD、S1和S2P-FHA(Hu-1序列)蛋白的抗体结合滴度。几何平均结合滴度在1.3×105至9.5×105的范围内的免疫原组之间未观察到显著差异(图6B)。
使用S假型化HIV荧光素酶报告基因病毒和293-ACE2靶细胞确定疫苗血清中的中和活性，如Jackson等人,2020所描述的。使用含有S2P-FHA免疫原匹配的S糖蛋白(Hu-1)分离株的假型对第6周和第16周血清(分别在第1次和第2次加强后2周采血)的比较指示，在S2P-FHA免疫血清、1016L免疫血清和1016/20VI免疫血清中具有强大的中和活性，其中第6周血清的平均ID50范围为1,700至1,900，并且第16周血清为6,000至9,100。这些数据等同于第2次加强后平均中和ID50增加了约3倍至5.4倍，尽管S2P-FHA免疫血清和1016/20VI免疫血清没有达到统计学显著性(图7)。接下来评估对含有β(B.1.351)VOC S蛋白的假型(Jackson,2020#20)的中和活性。相对于疫苗株(Hu-1)，S2P-FHA免疫血清和1016L免疫血清对βS假型的平均中和效力分别降低了3.7倍和2.8倍，而对1016/20VI血清观察到的1.8倍的小幅度降低没有统计学显著性。这些数据表明，1016/20VI免疫原引发不受β变体突变的影响的NAb特异性。ELISA用于比较血清与Hu-1和β变体RBD的结合，后者含有K417N、E484K和N501Y(“NKY”)突变(图6C)。2种抗原的结合滴度没有观察到显著差异，这指示S2P-FHA和1016L血清的β变体中和降低不能简单地用对RBD中NKY突变的敏感性来解释。
接下来评估疫苗血清对在关键相关变体(VOC和VOI)中观察到的携带个体突变的S假型(包含N439K、S477N、E484K和N501Y)的中和活性。这些突变与D614G(其存在于绝大多数大流行分离株中)组合。血清表现出对D614G的中和效力总体增强，添加N439K、S477N和N501Y后，1016/20VI的中和效力很大程度上被保留(图8)。有趣的是，当与Hu-1 S假型相比时，针对突变体的中和效力的降低并不明显。因此，用S2P-FHA和1016L血清观察到的β变体假型的中和效力的降低不能归因于此变体中存在的单个组分突变。
实例6——抗体应答的特异性
采用血清-单克隆抗体交叉竞争测定来了解接种疫苗的动物的抗体应答的特异性。将捕获到链霉亲和素涂覆的ELISA板上的生物素化的S2P-FHA与包括亚饱和量的人单克隆抗体和稀释系列的血清的混合物一起温育。用抗人F(ab')2-HRP和TMB开发测定。数据(图9A和B)示出了S2P-FHA、S2P.1016L-FHA和S2P.1016/20VI-FHA具有很大程度上等效的能力，能够通过ACE2-Fc和引导到ACE2结合位点(CB6、B38和COVA2-15)的NAb、引导到NTD(COVA1-22)的NAb和与S中的非RBD、非NTD表位结合的COVA1-25来引发抗体特异性，从而阻断S2P-FHA结合。来自3个免疫原组的血清也表现出对CR3022(一种引导到RBD的碱基的非中和抗体，在RBD向下构象中被遮挡)的阻断活性。数据指示，所述3种免疫原具有类似的能力，可以引发针对ACE2结合位点、NTD以及RBD和NTD之外的S中未定义的表位的中和抗体。这些数据还指示，尽管在BLI实验中发现此位点在1016L和1016L/20VI中暴露较少，但所述3种免疫原具有诱导引导到与ACE2bs重叠的表位的抗体的类似能力。
实例7——临床前评估
稳定的刺突加强剂mRNA疫苗将在豚鼠中进行临床前评估。每组10只豚鼠的三组将最初获得2个剂量的编码祖先刺突的mRNA，间隔3周，以模拟mRNA-刺突疫苗方案。可替代地，每组10只豚鼠的3组每隔12周接受2剂量的编码祖先刺突的腺病毒5，以模拟阿斯利康疫苗方案。豚鼠将通过编码以下的mRNA加强：1)祖先刺突，2)新型稳定的刺突，或3)安慰剂。血清中和以及刺突蛋白结合(RBD和刺突三聚体)将在加强后14天和28天确定。血清中和测定将使用刺突-HIV荧光素酶报告基因系统(Jackson等人,2020)进行，并且将包含源自VOC的刺突蛋白。将在ELISA中确定刺突结合；源自VOC的刺突蛋白将包含在分析中。
实例8——通用加强剂mRNA疫苗的I期安全性和免疫原性试验
将进行I期临床试验以评估加强剂疫苗候选物(mRNA和腺病毒载体)的安全性和功效。每种疫苗候选物都将通过随机、双盲、安慰剂对照的临床试验进行测试。试验参与者的年龄将介于18岁与85岁之间，其在招募前至少6个月已经接种了当前两剂量辉瑞(mRNA疫苗)或阿斯利康(腺病毒载体疫苗)的完整疗程。mRNA稳定的刺突加强剂试验中的参与者将被分配为4组：安慰剂和30ug的mRNA稳定的刺突疫苗(剂量基于当前辉瑞生物科技公司疫苗接种方案)。目标是安慰剂组中有10人，并且加强剂疫苗组中有至少20人(总共至少60人)。主要终点将是：1)在接受加强剂疫苗或安慰剂后7天内请求的局部反应、全身性事件和使用退烧药或止痛药；2)到接受加强剂疫苗后6个月内评估的未请求的不良事件和严重不良事件；3)在接受加强剂疫苗后1天和7天评估的临床实验室异常；4)实验室评估在基线与疫苗给药后1天和7天之间的分级变化。协议规定的安全性停止规则将对所有参与者有效。次要终点将是在加强后7天、14天、28天、180天和365天确定的血清中和以及刺突蛋白结合(RBD和刺突三聚体)。血清中和测定将使用刺突-HIV荧光素酶报告基因系统(Jackson等人,2020)进行，并且将包含源自VOC的刺突蛋白。将在ELISA中确定刺突结合；源自VOC的刺突蛋白将包含在分析中。
实例9——与常规mRNA和腺病毒疫苗相比，S2P-FHA对祖先毒株(祖先毒株Hu-1)和β变体(B.1.351)的应答增强
进行了假病毒中和ID 50研究以比较对S2P-FHA 1016/20VI刺突蛋白产生的疫苗应答和使用常规疫苗在人中产生的疫苗应答。将豚鼠体内的三个剂量的S2P-FHA 1016/20VI蛋白疫苗与给予人的两个剂量的mRNA或腺病毒疫苗进行比较。在S-HIV假型测定中使用的S基因型如下所示。数据显示了与在人中接种两个剂量的常规疫苗(右侧为常规疫苗)后3周至5周获得的血清相比，接种含有1016/20VI的S2P-FHA蛋白三聚体(左侧Burnet VI刺突)的豚鼠对匹配的WT病毒和高抗性相关变体(β变体)的中和抗体应答。使用威尔科克森配对检验来确定组间观察到的ID 50的差异是否显著：ns，不显著，p≥0.05；****，p<0.0001。如可从图14中所见，与常规mRNA和腺病毒疫苗相比，S2P-FHA 1016/20VI对祖先毒株和βVOC产生了更大的中和抗体应答。S2P-FHA 1016/20VI抗原产生了初级疫苗方案(用于在SARS-CoV-2受试者体内产生免疫应答的第一疫苗方案)和加强剂疫苗方案所期望的中和抗体曲线。加强剂疫苗可以用于例如已接受初级疫苗方案的受试者，所述初级疫苗方案已经产生以下中的一种或多种：对祖先毒株的应答、对祖先毒株的低应答、对VOC的低免疫应答和对βVOC的低免疫应答。
实例10——实验动物中由S2P-FHA、S2P.1016L-FHA和S2P.1016/20VI-FHA三聚体免疫原引发的血清抗体的特性
捕获ELISA形式(采用板结合的亲和素捕获生物素化的Hu-1、δ和奥密克戎BA.1RBD)用于确定疫苗血清的RBD结合滴度。δ(B.1.617.2)VOC于2020年10月出现，并且成为全球主要变体。RBD中存在两个显著的突变，L452R和E484Q。奥密克戎(B.1.1.529)首先在南非和博茨瓦纳发现(2021年11月)，已经在大多数国家取代了δ变体。奥密克戎由2021年出现的至少三个基因不同的亚谱系(BA.1、BA.2和BA.3)组成。最初，BA.1是最常见的循环版本，但更具传染性的BA.2变体现在已经成为主导。30个突变发生在刺突中，包含RBD中的15个和NTD中的8个，其含有中和的主要位点。图15A示出了几何平均结合滴度在3.5×105至1.36×105的范围内的免疫原组之间没有显著差异。观察到3个免疫原组对于奥密克戎BA.1RBD的结合滴度的小(约3倍)但显著的降低。接下来确定直接与ELISA板结合的Hu-1、δ和奥密克戎BA.1S2P-FHA刺突蛋白三聚体的血清结合滴度。图15B显示了3个免疫原组与3个S2P-FHA三聚体变体的结合滴度没有显著差异。S2P-FHA结合滴度在3.0×105至1.1×106的范围内。这些结果表明，所有免疫原产生类似的抗体滴度，能够与S2P-FHA刺突三聚体结合。
接下来使用S假型化HIV荧光素酶报告基因病毒和293-ACE2靶细胞确定疫苗血清中的中和活性，如Jackson等人,2020所描述的。含有S2P免疫原匹配的Hu-1刺突糖蛋白的假病毒或δ的假病毒在S2P-FHA免疫血清、1016L免疫血清和1016/20VI免疫血清中显示出强大的中和活性，平均ID50范围为3,900至5,100(图16A)。尽管针对奥密克戎BA.1假病毒的IC50呈下降趋势，观察到3组的平均滴度降低了<3倍，但针对含有奥密克戎BA.1或β刺突的假病毒的血清中和活性相对于Hu-1和δ假病毒中和没有显著差异。
接下来，在由Aggarwal等人,2021开发的R-20微量中和测定中使用HAT-24细胞测试了对Hu-1、δ、奥密克戎BA.1和βSARS-CoV-2的真实感染性病毒的中和活性。尽管Hu-1和δ病毒被来自3个免疫原组的血清有效地中和，但奥密克戎BA.1和β病毒的中和略微降低了约1log10(图16B)。图17示出了在ELISA(RBD和刺突三聚体)、假型病毒中和以及微量中和测定中获得的所有几何平均滴度的汇总。总体而言，数据指示，3个剂量的S2P-FHA、S2P.1016L-FHA和S2P.1016/20VI-FHA引发针对RBD和S三聚体的高滴度抗体，所述抗体能够有效地中和含有匹配的祖先Hu-1刺突的HIV假病毒以及携带来自δ、奥密克戎BA.1和βVOC的刺突的假病毒。尽管在奥密克戎BA.1和β变体中观察到ID50适度降低约1log10，但在真实传染性SARS-CoV-2中也观察到了高中和滴度。
实例11——评估丙氨酸腔中的突变在引入源自高度分化的SARS-CoV-2序列的刺突三聚体时是否具有一般的稳定作用
当与Hu-1的祖先序列相比时，奥密克戎BA.1刺突中发生了三十个突变，其中8个在N末端结构域(NTD)中，并且15个在RBD中(Jung等人,2022)。NTD和RBD含有主要中和表位，并且与这2个结构域中存在的多个突变一致，从mRNA双重疫苗接种的个体获得的血清在体外对奥密克戎BA.1病毒保持非常小的中和活性(Tada等人,2022)，与针对奥密克戎感染的低疫苗功效相对应(Andrews等人,2022)。
奥密克戎BA.1刺突中存在的突变(与祖先Hu-1相比)是：
NTD：A67V；H69-V70的缺失；T95I；G142D；delV143-Y145；211的缺失；L212I；残基214之后EPE的插入；
RBD：G339D；S371L；S373P；S375F；K417N；N440K；G446S；S477N；T478K；E484A；Q493R；G496S；Q498R；N501Y；Y505H；
S1的C末端区：T547K；D614G；H655Y；N679K；P681H；
S2：N764K；D796Y；N856K；Q954H；N969K；L981F
为了确定丙氨酸腔中的突变在引入源自高度分化的VOC序列的刺突三聚体时是否具有一般的稳定作用，制备了奥密克戎BA.1版本的S2P-FHA和S2P.1016/20VI-FHA构建体(图24、25中的序列)，并且在此分别称为S2P.奥密克戎-FHA和S2P.奥密克戎.VI-FHA。S2P.奥密克戎-FHA序列包括S残基16-1208的上游的组织纤溶酶原激活剂前导序列、弗林蛋白酶切割位点突变、H681RRAR->P681GSAS、位置986和987处的di-Pro取代。将折叠子、八-His和avitag序列添加到C末端。将DNA序列克隆到CMV启动子驱动的表达载体中，并且通过转染在Expi293F细胞中表达蛋白质。
通过二价阳离子亲和色谱法从培养上清液中提取蛋白质，并且通过Superose6SEC进一步纯化。S2P.奥密克戎-FHA作为靠近甲状腺球蛋白(669kDa)的位置的主峰洗脱(图18A，顶部)，并且具有与源自Hu-1分离株生的S2P-FHA几乎相同的曲线(图18A，底部)。如通过分析SEC所指示的，三聚体作为同质蛋白收集(图18B)。S2P.奥密克戎.VI-FHA洗脱为4个物种，然而，观察到一个显著的推测的三聚体峰(由图18A中的虚线框指示，中间)。将与三聚体相对应的级分(图18A中的虚线框)汇集并浓缩，并且在Superose 6柱中重新色谱，显示出与三聚体相对应的基本均匀的物种(图18B；图18C，顶部)。
热荧光测定指示，S2P.奥密克戎-FHA三聚体具有相对较低的热稳定性，其中熔融温度为61℃(图18C，顶部)。源自Hu-1的S2P-FHA的熔融温度为43℃(图18C，底部)，与图4C一致。未观察到S2P.奥密克戎.VI-FHA的热展开(图18C，中间)。
在不存在样品煮沸的非还原和还原(1％β巯基乙醇)的条件下，通过SDS-PAGE进一步分析经纯化的S2P.奥密克戎-FHA和S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体(图18D)。在存在还原剂和不存在还原剂的两种情况下，S2P.奥密克戎-FHA三聚体很大程度上被分解为其预期的约160kDa的单体分子量。相比之下，主要的S2P.奥密克戎.VI-FHA物种(由箭头指示)被保留为迁移到凝胶顶部附近的高分子量物种；在单体位置处也观察到少量物种。图18E示出了重复实验，其中样品在电泳前煮沸5分钟。在非还原条件下，图18D中所见的结果被再次观察到的高分子量主要S2P.奥密克戎.VI-FHA物种大量概括。然而，在存在还原剂的情况下沸腾将此物种分解为其单体分子量。数据(图18E)表明S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体在25℃下可抵抗0.8％w/v十二烷基硫酸钠变性剂(含有和不含1％β巯基乙醇)的破坏。数据进一步表明，S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体在煮沸后可抵抗0.8％w/v十二烷基硫酸钠变性剂的破坏。S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体仅在存在0.8％w/v十二烷基硫酸钠变性剂和1％β巯基乙醇两者的情况下沸腾后分解为单体。数据表明，将VI突变添加到S2的丙氨酸腔中赋予S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体超稳定性，使三聚体结构能够承受更大的变性力。
将甲状腺球蛋白与双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯共价交联以获得理论分子量为669kDa的SDS-PAGE标志物，其与S三聚体的分子量接近。图18F示出了交联的甲状腺球蛋白在电泳前用25℃或100℃下的0.8％SDS处理3分钟，或在25℃下用0.8％SDS+1％β巯基乙醇处理3分钟后与抗SDS/β巯基乙醇的高分子量形式的S2P.奥密克戎.VI-FHA共迁移。再次，S2P.奥密克戎.VI-FHA在0.8％SDS+1％β巯基乙醇中沸腾后分解为单体。S2P.奥密克戎-FHA和S2P-FHA蛋白在所有处理后作为单体迁移，除了在25℃下用1％SDS处理后的一些残留三聚体S2P-FHA。
施用采用板结合的链霉亲和素以捕获生物素化的S2P.奥密克戎-FHA或生物素化的S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体(图19，分别为左侧小图和右侧小图)的捕获ELISA以确定这些蛋白质是否可以被构象依赖性NAb识别。数据显示，RBD引导的NAb COVOX222、S2H97，以及在较小程度上，S2E12和COVA2-17与具有类似活性的2种蛋白质结合。还通过CV3-25、NAb与S2、COVA1-21与NTD和非RBD引导的NAb、COVA1-25和COVA1-22观察到结合。HC33.1是作为阴性对照的丙型肝炎病毒NAb。数据指示，S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体保留构象依赖性NAb表位，也在S2P.奥密克戎-FHA中观察到。
使用祖先Hu-1 SARS-CoV-2序列的序列工程化的S2P-FHA和此处工程化的相关变体与文献(例如Wrapp等人,2020)中所描述的可溶性S三聚体相同，含有C末端三聚化模块以稳定三聚体结构。此模块通常是噬菌体T4纤维蛋白的三聚体折叠子结构域(图20A)。NMR研究表明，天然跨膜结构域可能是嵌入脂质双层的三股卷曲盘绕。为了在不存在三聚化标签的情况下确定Hu-1 S胞外结构域的寡聚化状态，在胞外结构域的最后的残基Q1208处截短Hu-1 S2P以得到S2P-1208.H6(图20A；序列参见图26和27)。还制备了对应的1016/20VI突变体S2P.VI-1208.H6。这两种蛋白质在C末端都具有六-His标签，以促进由H6表示的纯化。蛋白质在293FS细胞中表达，并且然后通过二价阳离子亲和色谱法从上清液中提取。Superose6SEC显示了与S2P-FHA的三聚体结构相反，Hu-1 S2P-1208.H6以二聚体形式洗脱(图20B，顶部2个小图)。相比之下，对于Hu-1S2P.VI-1208.H6观察到的三聚体和二聚体大致等量(图20B，第三小图)。为了能够纯化S2P.VI-1208.H6三聚体，在Expi293F细胞中表达蛋白质，并且用咪唑梯度从负载HiTrap二价阳离子的柱洗脱。Superose 6SEC指示S2P.VI-1208-H6具有显著的三聚体峰(图20B，第四小图)。
热荧光测定指示Hu-1 S2P-FHA三聚体和S2P-1208.H6二聚体的熔融温度为43℃，而S2P.VI-1208.H6包括2个物种，熔融温度分别为43℃和58℃(图20C)。在非还原条件和还原条件下的SDS-PAGE证实，蛋白质制剂具有高纯度，并且在0.8％SDS中变性为单体，并且在含有和不含1％β巯基乙醇的情况下沸腾，指示其为非二硫键连接的三聚体(图20D)。这些数据指示，1016/20VI突变赋予S2P三聚体足够的稳定性，消除了对三聚化标签的需要，并且赋予经纯化的S2P寡聚物热稳定性。
检查了1016/20VI突变在含有天然跨膜结构域和细胞质尾部的全长S2P背景中的作用。制备了CMV驱动的表达载体，其含有编码源自Hu-1、δ和奥密克戎BA.1的S糖蛋白的残基1-1273的密码子优化的基因。弗林蛋白酶位点处的R/H681RRAR->P681GSAS突变和位置986和987处的di-Pro“2P”取代也包含在内。S2P-1273的示意图参见图21A；蛋白质和DNA序列参见图28-33。
为了证明Hu-1、δ和奥密克戎BA.1S2P-1273糖蛋白以及其1016/20VI突变体版本(S2P.VI-1273)的表达，将DNA载体转染到293T细胞中。裂解细胞并用兔抗S1多克隆抗体对裂解物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。图21B示出了每个构建体的单个约180kDa蛋白质带，与未切割的S单体的预期一致。用空载体(pcDNA3)转染没有产生此类带。
使用流式细胞术证明Hu-1、δ和奥密克戎BA.1S2P.1273以及S2P.VI-1273糖蛋白在细胞表面上表达，并且被引导到关键中和表位的人单克隆抗体识别。293T细胞用各种S2P-1273表达载体转染，并且完整细胞用各种人单克隆NAb和AlexaFluor缀合的抗人免疫球蛋白染色。用碘化丙啶对细胞进行复染，以将死细胞排除在分析之外。图22中的直方图示出，所有表达的S2P-1273糖蛋白以类似的水平与ACE2-Fc结合，并且也与大多数测试的单克隆NAb结合。同种型对照HCV特异性抗体(HC33.1)不表现结合。例外是CB6，其未能与奥密克戎刺突结合，而COVA 1-03表现出与δ刺突的最小结合。这些数据指示，S2P-1273糖蛋白在细胞表面上表达，并且其能够与ACE2受体结合并保留不同的NAb表位。
使用门对图22中所呈现的数据进行进一步分析，以区分细胞的非荧光(nil)、中等(lo)荧光和高(hi)荧光群体(图23A)。在S2P-1273的背景下引入VI突变不会改变ACE2受体结合能力，也不会改变COVOX222识别的RBD中的广泛中和表位或CV3-25识别的S2内的表位的暴露(图23B)。然而，VI增加了源自Hu-1祖先、δ和奥密克戎BA.1分离株的S2P-1273中的广泛中和抗体S2H97、COVA2-17和COVA1-21识别的表位的暴露。因此，1016/20VI突变以分离株依赖的方式选择性地增强bNAb表位的暴露。
实例12——1016/20VI突变对源自Hu-1和奥密克戎BA.1的全长S2P-1273和S2P-1208的稳定性的影响
检查了1016/20VI突变对源自Hu-1和奥密克戎BA.1(分别为S2P-1273和S2P.奥密克戎-1273)并在293T细胞中表达的全长S2P-1273(含有天然跨膜结构域和细胞质尾部)的稳定性的影响。将细胞裂解物调节为含有1.2％(w/v)SDS和0.25％(v/v)β巯基乙醇的最终浓度，并且在SDS-PAGE和用兔抗S1多克隆抗体进行蛋白质印迹之前在所指示的温度下处理。为了分别标记单体和三聚体的位置，包含在电泳前用0.67％SDS在室温下处理5分钟的经纯化的S2P.奥密克戎-FHA三聚体的AA和VI版本(如图18F)。图38显示了显著的S2P.奥密克戎-FHA单体和推测的S2P.奥密克戎.VI-FHA三聚体带分别位于泳道2和3中。在S2P-1273的情况下(图38，左侧小图)，当1016/20VI突变存在时，在55℃、70℃和85℃下处理后观察到推测的三聚体，而在位置1016和1020处含有Ala的S2P-1273中不存在此带。在100℃下处理后，三聚体带不存在，表明解离。S2P.奥密克戎-1273三聚体似乎能抵抗55℃、70℃和85℃的处理，无论是否存在1016/20VI，尽管在1016/20VI中观察到略微更多的三聚体(图38,，右侧小图)。这些数据与S2P.奥密克戎-FHA相对于源自Hu-1的S2P-FHA观察到的更高的总体热稳定性一致。数据表明，VI突变赋予S2P-1273三聚体稳定性，如在可溶性S2P-FHA三聚体中观察到的那样。数据还指示，源自奥密克戎BA.1的S2P三聚体总体上表现出比Hu-1 S三聚体更大的稳定性。
接下来，VI对源自奥密克戎BA.1序列的S2P-1208.H6的三聚化和稳定性的影响，所述序列缺乏折叠子三聚化结构域。对在胞外结构域Q1208的最后的残基处截短的S2P.奥密克戎在C末端处附加有GSGS-H6以得到S2P.奥密克戎-1208.H6进行了检查。还制备了对应的1016/20VI突变体S2P.奥密克戎.VI-1208.H6。蛋白质在Expi293F细胞中表达，并且然后通过二价阳离子亲和色谱法从上清液中提取。Superose 6SEC显示了这两种蛋白质主要以三聚体的形式洗脱(图39A)。冷冻(-80℃)-解冻循环后，用Superose6SEC对纯化的三聚体进行重新分析，显示出约15％的S2P.奥密克戎-1208.H6蛋白已解离为二聚体。相比之下，保留了S2P.奥密克戎.VI-1208.H6的三聚体结构(图39B)。热荧光测定指示，大多数经纯化的S2P.奥密克戎-1208.H6的熔融温度为41℃，而S2P.奥密克戎.VI-1208.H6三聚体的熔融温度高得多，为64℃(图39C)。SDS-PAGE/考马斯蓝染色指示S2P.奥密克戎-1208.H6蛋白的纯度接近100％(图39D)。这些数据指示，在奥密克戎BA.1胞外结构域的背景中的VI突变能够获得高度稳定的可溶性三聚体，由此消除了对外源性三聚化结构域维持三聚体结构的要求。
实例13。VI对源自Hu-1和奥密克戎BA.1的S2P-FHA三聚体中的广泛中和人mAb和ACE2-Fc识别的表位的暴露的影响
接下来，使用生物层干涉测量法比较VI对源自Hu-1和奥密克戎BA.1的S2P-FHA三聚体中的广泛中和人mAb和ACE2-Fc识别的表位的暴露的影响。当S2P三聚体处于分析物相中时，将ACE2-Fc和mAb与抗人IgG Fc捕获生物传感器连接。感测图的比较指示，相对于S2P-FHA，Hu-1源性S2P.VI-FHA与RBD引导的配体(ACE2-Fc、S2E12、S2H97和COVOX222)的总体结合降低(图40A)。相比之下，S2P.奥密克戎-FHA与RBD配体结合的这种VI依赖性降低并不明显(图40B)。具有和不具有VI的Hu-1和奥密克戎BA.1源性S2P-FHA蛋白与识别RBD外部的表位的COVA1-25以相同程度结合。与S2茎区中的表位结合的CV3-25与S2P.VI-FHA的结合相对于其它蛋白质减少，指示VI在Hu-1而不是奥密克戎BA.1的背景下部分阻塞了此表位。这些数据表明，1016/20VI促进Hu-1 S2P-FHA三聚体中的RBD向下构象，而不是奥密克戎BA.1-FHA三聚体。因此，VI稳定S2P.奥密克戎三聚体，所述三聚体也维持RBD内关键广泛中和表位的暴露。由于奥密克戎毒株突变可能在新出现的毒株中广泛存在，结果支持使用本文所公开的经修饰的抗原来提供对新出现的毒株的有效免疫。
实例14——结果汇总
SARS-CoV-2和SARS-CoV融合前三聚体的中心处的卷曲盘绕由3个弓形螺旋形成，所述弓形螺旋从由向内的Ile1013以及Leu1012介导的接触点彼此远离地扩展。3个至4个重复的其余部分主要包含极性残基，所述极性残基几乎不介导螺旋间接触。本发明人认为这种极性拓扑结构可能有助于融合前三聚体相对较低的热稳定性(在本文所描述的研究中观察到43.6℃)。SARS-CoV是呼吸系统病原体，并且这些复制位点处的较低体温范围为20.5℃至35.5℃，可能使刺突三聚体能够以持续的方式维持其结构和功能。然而，与肌内疫苗接种一样，暴露在较高的体温下可能会导致三聚体刺突不稳定，并且随着时间的推移失去构象，这将损害免疫原性。
通过基于结构的设计克服I类融合蛋白在其融合前状态下的固有不稳定性的努力已被广泛用于HIV-1、埃博拉(Ebola)、呼吸道合胞病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、人偏肺病毒和冠状病毒。先前的研究发现，在形成中心卷曲盘绕的螺旋CH1和七肽重复序列1之间的铰链环中引入两个脯氨酸残基稳定了SARS-CoV的S蛋白，并且中东呼吸道综合征病毒(middle eastern respiratory syndrome virus，MERS)稳定了融合前三聚体构象，而不会失去受体结合或抗原性。在SARS-CoV-2刺突的情况下，通过引入S2-P突变和消融Arg682ArgAlaArg弗林蛋白酶切割位点来实现融合前稳定(Wrapp等人,2020)，后者不存在于SARS-CoV和MERS刺突中。目前的人SARS-CoV-2疫苗要么含有亲代S序列(牛津/阿斯利康(Watanabe等人,2021))，要么含有S-2P/弗林蛋白酶突变体(辉瑞生物科技公司，强生公司(Johnson and Johnson)(Bos等人,2020；Vogel等人,2021))，或者含有完整弗林蛋白酶位点的S2P(莫德纳公司(Jackson等人,2020))。本文所描述的实验证明，通过在CH1螺旋的S2卷曲盘绕的中心中产生人工疏水性核，S2P S三聚体可以进一步稳定并显示出增强的稳定性和抗原功能。在一个实施例中，可以通过用更粗大的疏水性残基置换Ala1016和Ala1020来填充与这些残基相关的腔，从而产生人工疏水性核。Ala1016的诱变(用更具疏水性的残基置换残基)使熔融温度从43.6℃偏移到58℃，其中A1016L在58℃物种中占最高比例。相比之下，43.6℃物种仍然是具有Ala1020的取代的主要形式。除了1016/20VV外，双取代均与更稳定的形式相关。有趣的是，增加的热稳定性有时与降低的可溶性S2P-FHA表达相关，1016/20II、1016/20LL、1016/20VF、1016/20IF和1016/20FF获得的产率最低。1016L和1016/20VI突变体产生高产率，这表明选择来填充腔的侧链的体积和/或几何形状可以影响S2P三聚体的折叠，其中一些侧链对折叠具有更有利的影响。在奥密克戎BA.1VOC的情况下，1016/20VI突变稳定了S2P-FHA三聚体，以对抗严重的变性条件，如在存在0.8％SDS的情况下煮沸或在环境温度下暴露于0.8％SDS加还原剂β巯基乙醇，这与超稳定的S2P三聚体一致。数据指示，在S2的CH卷曲盘绕的中心中产生人工疏水性核提高了稳定性和表达。这些突变可以与已知的稳定突变(例如S-2P和弗林蛋白酶位点突变)组合以增强冠状病毒刺突蛋白疫苗的生物物理特性。
稳定的1016L和1016/20VI对Hu-1 SARS-CoV-2刺突三聚体的抗原性具有可测量的影响。生物层干涉测量法显示，ACE2胞外结构域和阻断RBD-ACE2相互作用的单克隆抗体已经减少了与1016L和1016/20VI S2P三聚体的结合，这表明RBD向下构象已被诱导。相反，引导到RBD外部的S中的表位的COVA1-25显示出与1016L和1016/20VI S2P三聚体的改善的结合，这表明此结构域在S中的增强的暴露。稳定突变对RBD定向的这些影响可能通过变构效应发生，由此卷曲盘绕的几何形状或构象的变化通过三聚体结构传输到远程RBD。在S2P三聚体的背景中，RBD定向的这些变化没有翻译成由此处所检查的3种免疫原诱导的RBD、S1和S2P三聚体引导的抗体滴度的差异。此外，S2P-FHA、1016L和1016/20VI三聚体在2次疫苗接种后，对用毒株匹配的Hu-1刺突包装的假型产生了相对高的NAb滴度，这在三次疫苗接种后进一步增强。然而，与改变的抗原格局的改变一致，1016/20VI免疫血清保留了对β/B.1.351S变体假型的中和效力，而S2P-FHA和1016L引发的血清的这种活性显著降低。这些1016/20L的数据与用疫苗接种了辉瑞生物科技公司、莫德纳公司或牛津/阿斯利康疫苗的人的人疫苗血清获得的数据进行了对比，显示β/B.1.351的中和滴度降低了7.6倍至42倍(Dejnirattisai等人,2021；Garcia-Beltran等人,2021)。与包含α/B.1.1.7、γ/P.1和δ/B.1.617在内的其它VOC相比，β变体已被证明对自然感染或疫苗接种引发的NAb表现出最大的耐药性(Dejnirattisai等人,2021；Garcia-Beltran等人,202118,21；Hoffmann等人,2021)。在S2P-FHA、1016L和1016/20VI中观察到的β/B.1.351变体中和能力的差异没有反映在与含有β/B.1.351突变K417N、E484K、N501Y的Hu-1 RBD或RBD-NKY结合的差异中。这些数据表明，S2P疫苗引发RBD引导的抗体特异性，其不靶向包含在β/B.1.351VOC中突变的关键残基的表位。此外，血清中和效力不受VOC中存在的选定个体突变的影响，这再次表明这些抗体靶向除RBD中在VOC中突变的残基之外的残基。此观察与在血清-NAb交叉竞争测定中获得的数据一致，所述数据指示能够阻断引导到RBD的ACE2和NAb(CB6、B38、COVA2-15)、引导到NTD的COVA1-22以及引导到S1表位(其位于RBD和NTD外部)的COVA1-25的结合的高滴度血清抗体。因此，所有三种免疫原都引发了对S三聚体的多克隆应答，这可以解释为什么血清对β/B.1.351变体保留至少一些效力。1016/20VI免疫血清保持对β/B.1.351变体的中和效力的机制没有通过血清-NAb竞争测定来解释，这可能是由于此测定依赖于血清中存在的大IgG分子来空间阻断人IgG分子与S2P三聚体的结合。总的来说，三种抗原似乎具有类似的能力来诱导引导到与ACE2结合位点和NTD重叠的表位的抗体，但竞争ELISA对测量抗体结合模式的细微差异不够敏感。因此，1016/20VI中RBD向下构象的趋势不会对其诱导NAb的能力产生不利影响，并且似乎与针对中和抗性VOC的优越NAb活性相关。
目前的SARS-CoV-2疫苗提供源自原始Hu-1分离株的‘祖先’刺突序列，并且对疫苗受体的细胞进行编程，以产生引起抗体应答的刺突蛋白。全球人类群体的成功疫苗接种因未接种疫苗的群体的高传播率而变得复杂，从而导致VOC的进化和传播。在接种疫苗的个体中突破性感染VOC引起了主要担忧，即SARS-CoV-2在继续复制、进化和传播的过程中可能会克服疫苗诱导的免疫力。五种主要的VOC已在人类群体中传播：α(英国来源)、β(南非来源)、γ(巴西来源)和δ(印度来源)。α和δ变体的增强的传播特性使其能够取代祖先Hu-1源性病毒谱系并在全球传播。-奥密克戎(B.1.1.529)的传播性甚至比δ更强，并且现在是大多数国家的主导VOC。最初，BA.1是最常见的循环版本，但更具传染性的BA.2亚变体现在已经成为主导。其它亚变体如BA.4、BA.5和BA.2.12.1继续出现。最近的公开指示，相对于Hu-1谱系，阿斯利康和辉瑞生物科技公司疫苗对α和δ变体的有效性略微下降，这指示这些疫苗引发的免疫力对这些VOC保持有效(Emary等人,2021；Lopez等人,2021)。与α和δ相比，β和γ变体在分布上更具局限性，但表现出使疫苗诱导的免疫力较差的特性。例如，一项在南非的试验显示，阿斯利康疫苗对βVOC的功效仅为10.4％(Madhi等人,2021)。此发现尤其令人担忧，因为理论上出现一种具有高传播性和疫苗逃避特性的变体将使接种疫苗的群体易感COVID-19。奥密克戎刺突的关键中和位点中的极端变化已导致采用祖先序列的2剂量疫苗接种方案的功效大幅降低，使得需要使用加强剂来恢复保护性免疫应答(Andrews等人,2022；Magen等人,2022)。此处呈现的数据表明，尽管对稳定的S2P-FHA蛋白产生的疫苗血清对β和奥密克戎VOC的中和效力仅适度降低，但在基于祖先序列的传统疫苗中添加源自不同VOC(如奥密克戎)的稳定刺突可能会扩大免疫力，以保护其免受新出现的VOC的影响。因此，当VOC不可避免地在人类群体中流行时，扩大针对其的免疫力的加强剂疫苗对于长期控制COVID-19至关重要。1016/20VI刺突提供了一种用于开发通用S加强剂疫苗的策略，所述疫苗将抗体应答集中在RBD外部的高度保守区(除RBD外)。
在基于S的疫苗(如1016/20VI)中，RBD向下构象的趋势也可能对所引发的中和以及感染增强抗体的平衡具有重要意义。使SARS-CoV疫苗的开发更加复杂的是，有证据表明，S引导的抗体可以通过Fc效应子介导的机制增强病毒进入并促进急性肺损伤。感染的抗体依赖性增强可以通过受体模拟发生，其中NAb与RBD结合，启动S三聚体进行融合激活。病毒内化通过细胞表面Fcγ受体相互作用发生，引起病毒融合和进入。对从COVID-19患者中分离的单克隆IgG的研究表明，一组RBD表位的抗体可以通过Fcγ受体依赖性机制介导ADE。可替代地，针对NTD的抗体可以诱导向上RBD构象，增强ACE2结合和传染性。另一项研究发现，尽管选择的RBD NAb和非中和NTD抗体在体外证明了Fcγ受体介导的病毒感染增强，但这两种类型的抗体都能保护猴和小鼠免受SARS-CoV-2的复制。这些数据暗示，体外ADE的观察并不一定能预测体内的此过程。然而，在三聚体刺突疫苗(如1016/20VI)中，将RBD锁定在向下构象可能有利于产生中和RBD引导的抗体，而不是ADE抗体特异性。
虽然如本文所示，可以通过取代氨基酸位置1016和1020处的疏水性残基来填充SARS-CoV毒株(如SARS-CoV-2S2)的中心中的不寻常的丙氨酸腔，CH卷曲盘绕中的另外的或替代性a和d残基可以被突变以通过结构引导的诱变产生另外的稳定突变。通过提高热稳定性和锁定RBD以防止潜在的感染增强抗体特异性的产生，使卷曲盘绕稳定与现有的二脯氨酸和弗林蛋白酶诱变方法相比具有多种优势。此外，对于SARS-COV-2，本文显示，包括丙氨酸腔突变(如1016/20VI)的刺突三聚体引发了改进的中和广度、强度和寿命。如本文所描述的突变，如1016/20VI的引入提供了一种策略，以改善针对SARS-CoV的毒株的NAb应答的性质、持久性和稳健性，重要的是包含新出现的VOC，以使疫苗针对SARS-CoV-2不会过时。事实上，结果表明，将1016/20VI引入奥密克戎VOC中对S2P三聚体具有稳定作用，消除了对三聚化标签的需要，并且赋予经纯化的S2P寡聚物热稳定性。热和变性稳定性对于满足全球疫苗供应链需求至关重要，同时也能在体外和体内提供益处。在一个实施例中，经修饰的抗原消除了对异源三聚化标签的需要，降低了脱靶反应性的风险。
本领域的普通技术人员将了解在不脱离概括地描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如特定实施例中所展示的本发明作出许多变化和/或修改。因此，本发明的实施例应当在所有方面都被视为是说明性的而非限制性的。
本申请要求于2021年8月11日提交的题为“疫苗抗原(Vaccine Antigen)”的澳大利亚临时申请第2021902500号、于2021年8月13日提交的题为“疫苗抗原”的澳大利亚临时申请第2021902530号和于2022年5月6日提交的题为“疫苗抗原”的PCT申请第PCT/AU2022/050429号的优先权，所述申请完整内容特此通过引用并入。
本文所讨论和/或引用的所有公开整体并入本文。
关于已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。
参考文献
Abu-Raddad等人,2021.《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》doi:10.1056/NEJMc2104974。
Aggarwal等人,2021.doi:10.21203/rs.3.rs-1210846/v1。
Alter等人,2021.《自然》doi:10.1038/s41586-021-03681-2。
Andrews等人,2022.doi:10.1056/NEJMoa2119451。
Andreano等人,2020.《生物预印本(bioRxiv)》doi:10.1101/2020.12.28.424451。
Baden等人,2021.《新英格兰医学杂志》384:403-416。
Bos等人,2020.《NPJ疫苗(NPJ Vaccines)》5:91。
Brouwer等人,2020.《科学(Science)》369:643-650。
Bullough等人,1994.《自然》371:37-43。
Cai等人,2020.《科学》369:1586-1592。
Center等人,2020.《生物化学杂志(J Biol Chem)》2020,295,(21),7179-7192。
Cerutti等人,2021.《细胞宿主微生物(Cell Host Microbe)》doi:10.1016/j.chom.2021.03.005。
Chan等人,1997.《细胞(Cell)》89:263-73。
Dejnirattisai等人,2021.《细胞》doi:10.1016/j.cell.2021.03.055。
Duan等人,2020.《免疫(Immunol)》11:576622。
Emary等人,2021.《柳叶刀(Lancet)》doi:10.1016/S0140-6736(21)00628-0。
Finkelstein等人,2021.SARS-CoV-2刺突的中和表位的结构分析，用于指导疗法和疫苗设计策略(Structural Analysis of Neutralizing Epitopes of the SARS-CoV-2Spike to Guide Therapy and Vaccine Design Strategies).《病毒(Viruses)》13。
Fou等人,2021.《美国化学学会杂志(J Am Chem Soc)》143:8543-6；doi:10.1021/jacs.1c02394。
Fu和Chou 2021.《美国化学学会杂志》143:8543-8546。
Garcia-Beltran等人,2021.《细胞》doi:10.1016/j.cell.2021.03.013。
Guthe等人,2004.《分子生物学杂志(J Mol Biol)》337:905-15；doi:10.1016/j.jmb.2004.02.020。
Hoffmann等人,2021.《细胞报告(Cell Rep)》36:109415。
Hoffmann等人,2020.《分子细胞(Mol Cell)》78:779-784e5。
Huang等人,2021.《当代胶体与界面科学评论(Curr Op in Coll&Inter Sci)》.https://doi.org/10.1016/j.cocis.2021.101468。
Jackson等人,2020.《新英格兰医学杂志》383:1920-1931。
Jennewein等人,2021.《生物预印本》doi:10.1101/2021.03.23.436684。
Julien等人,2013.《科学》342:1477-83。
Jung等人,2022.doi:10.1128/jvi.02077-21。
Ke等人,2020.《自然》588:498-502。
Kustin等人,2021.《自然医学(Nat Med)》doi:10.1038/s41591-021-01413-7。
Liang等人,2020年11月6日；11:589833.https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.589833。
Liu等人,2020.《自然》584:450-456。
Liu等人,2021.《新英格兰医学杂志》doi:10.1056/NEJMc2102017。
Logunov等人,2021.《柳叶刀》397:671-681。
Lopez等人,2021.《新英格兰医学杂志》doi:10.1056/NEJMoa2108891。
Madhi等人,2021.《新英格兰医学杂志》doi:10.1056/NEJMoa2102214。
Magen等人,2022.《新英格兰医学杂志》doi:10.1056/NEJMoa2201688。
McCallum等人,2021.《细胞》doi:10.1016/j.cell.2021.03.028。
Naldini等人,1996.《科学》272(5259):263-7。
Niesen等人,2007.《自然实验手册(Nat Protoc)》2,(9),2212-21。
Piccoli等人,2020.《细胞》183:1024-1042e21。
Plante等人,2021.《细胞宿主微生物》doi:10.1016/j.chom.2021.02.020。
Polack等人,2020.《新英格兰医学杂志》383:2603-2615。
Sadoff等人,2021.《新英格兰医学杂志》384:2187-2201。
Sanyaolu等人,2021.《传染病的治疗进展(Ther Adv Infect Dis.)》8:20499361211024372.doi:10.1177/20499361211024372。
Schoenmaker等人,2021.《国际药物科学杂志(Int J Pharm)》doi:10.1016/j.ijpharm.2021.120586。
Shi等人,2020.《自然》584:(7819):120-124。
Starr等人,2021.《自然》597:97-102doi:10.1038/s41586-021-03807-6。
Supasa等人,2021.《细胞》184:2201-2211e7。
Tada等人,2021.《生物预印本》doi:10.1101/2021.02.05.430003。
Vasireddy等人,2021.《临床医学与研究杂志(J Clin Med Res.)》13(6):317-325.doi:10.14740/jocmr4518。
Vogel等人,2021.《自然》592:283-289。
Voysey等人,2021.《柳叶刀》397:99-111。
Walls等人,2020.《细胞》183:1735。
Walls AC等人,2017.《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)》114:11157-11162。
Watanabe等人,2021.《ACS中心科学(ACS Cent Sci)》7:594-602。
Weissenhorn等人,1997.《自然》387:426-30。
Wilson 1981.《自然》289:366-73。
Wrapp等人,2020.《科学》367:1260-1263。
Wu等人,2020.《科学》368:1274-1278。

Claims (57)

1.一种冠状病毒(CoV)疫苗抗原，其包括CoV S蛋白三聚体，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小所述S蛋白三聚体的卷曲盘绕区中的丙氨酸腔的大小，并且其中所述S蛋白三聚体引发中和抗体应答。
2.根据权利要求1所述的CoV疫苗抗原，其中所述结构修饰位于卷曲盘绕内。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的CoV疫苗抗原，其中所述结构修饰在所述丙氨酸腔中产生人工疏水性核。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述结构修饰是以下中的一种或多种：氨基酸取代、二硫键、氢键、π堆积(π-π堆积)、盐桥、范德华相互作用(van derWaals interactions)或脯氨酸稳定化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中一种或所述：
i)相对于没有所述结构修饰的S蛋白三聚体，所述S蛋白三聚体的热稳定性增加；并且
ii)相对于没有所述结构修饰的S蛋白三聚体，变性剂稳定性增加。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体的ACE2受体结合结构域(RBD)处于向下(非ACE2结合就绪)定向。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体的S蛋白单体的所述卷曲盘绕区中的至少一个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。
8.根据权利要求7所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体的S蛋白单体的所述卷曲盘绕区中的至少两个氨基酸被更具疏水性的氨基酸取代。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的CoV疫苗抗原，其中所述至少一个氨基酸或所述至少两个氨基酸位于所述S蛋白单体的所述卷曲盘绕区的七肽重复序列基序的位置a和/或d中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述更具疏水性的氨基酸包括以下特性中的一种或多种特性：
i)大于丙氨酸的疏水性；
ii)是大于丙氨酸的疏水性氨基酸；
iii)在pH为2时的疏水性大于47；
iv)在pH为7时的疏水性大于41；以及
v)选自：异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体中的所述S蛋白单体是SARS-COV-2S蛋白单体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体中的所述S蛋白单体进一步包括以下中的一项或多项：
i)VOC/VOI突变：S13I、L18F、T19R、T20N、P26S、A67V、delH69-V70、D80A、T95I、D138Y、G142D、delY144、W152C、E154K、E156del、F157del、R158G、R190S、D215G、del242-245、D253G、R246I、K417N/T、N439K、L452R/Q、Y453F、S477N、T478K、E484K/Q、N501Y、F565L、A570D、D614G、H655Y、Q677H、P681H/R、I692V、A701V、T716I、F888L、D950N、S982A、T1027I、Q1071H、D1118H,A67V、del69-70、T95I、del142-144、Y145D、del211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F；
ii)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:08中任一者的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列；
iii)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的任一者的氨基酸序列，其包括iii)中所列的突变中的多个或多个突变；
iv)SARS-CoV-2相关变体的S蛋白残基1-1208；
v)所关注的SARS-CoV-2变体的S蛋白残基1-1208；
vi)SARS-CoV-2高后果变体的S蛋白残基1-1208；以及
vii)SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其至少90％相同的序列；
viii)SEQ ID NO:25的氨基酸序列，其包括ii)中所列的突变中的多个或多个突变。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述疫苗抗原缺乏以下中的一个或两个：跨膜结构域和三聚化序列。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述疫苗抗原包括以下中的一个或两个：跨膜结构域和三聚化序列。
15.根据权利要求7至14中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中S蛋白单体的所述卷曲盘绕区中的所述至少一个氨基酸是A1016。
16.根据权利要求15所述的CoV疫苗抗原，其中A1016被缬氨酸取代。
17.根据权利要求7至16中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中S蛋白单体的所述卷曲盘绕区中的所述至少一个氨基酸是A1020。
18.根据权利要求17所述的CoV疫苗抗原，其中A1020被异亮氨酸取代。
19.根据权利要求8至18中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中S蛋白单体的所述卷曲盘绕区中的所述至少一个氨基酸是用缬氨酸取代的A1016，并且A1020是经取代的异亮氨酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述S蛋白三聚体引发以下中和抗体应答中的一种或多种中和抗体应答：
a)中和在所述RBD处引导的抗体；
b)中和在N末端结构域(NTD)处引导的抗体；以及
c)中和所述RBD和所述NTD外的S1中的未定义的表位处的抗体。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述抗原产生针对所述RBD外的表位(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸16至329和522至1208或SEQ ID NO:1的氨基酸16至329)的广泛中和抗体应答。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述抗原是可溶性抗原。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述抗原在融合前构象中稳定。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的CoV疫苗抗原，其中所述抗原包括一个或多个进一步修饰的区以增强稳定性和/或免疫原性。
25.一种载体或多核苷酸，其编码根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的所述S蛋白单体。
26.根据权利要求25所述的载体或多核苷酸，其包括本文所描述的多核苷酸序列，或包括对本文所描述的多核苷酸序列内的天然存在的碱基进行优化的密码子或类似物或修饰。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的载体或多核苷酸，其中所述载体或多核苷酸是核糖核酸。
28.一种脂质纳米颗粒，其包括根据权利要求25至27中任一项所述的载体或多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其包括根据权利要求25或27中任一项所述的载体或多核苷酸。
30.一种产生根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的方法，所述方法包括在培养基中培养根据权利要求29所述的宿主细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括从所述细胞和/或细胞培养基中分离CoV疫苗抗原、S蛋白、载体或多核苷酸。
32.一种蛋白质纳米颗粒，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
33.一种病毒样颗粒，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
34.一种疫苗，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原、或编码所述冠状病毒(CoV)疫苗抗原的所述S蛋白单体的根据权利要求25至27中任一项所述的载体或多核苷酸、或根据权利要求32所述的蛋白质纳米颗粒或根据权利要求33所述的病毒样颗粒。
35.根据权利要求34所述的疫苗，其中所述疫苗是加强剂疫苗。
36.根据权利要求35所述的疫苗，其中所述加强剂疫苗提供针对以下CoV中的一种或多种CoV的保护：VOC、VOI和VHC。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗提供针对SARS-CoV-2的保护。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗选自：a)基于mRNA的疫苗；b)基于DNA的疫苗；c)病毒载体疫苗；d)灭活疫苗；e)减毒活疫苗；以及f)蛋白质亚基疫苗。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗进一步包括至少一种另外的CoV疫苗抗原或编码并能够表达CoV疫苗抗原的另外的载体或多核苷酸。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包括佐剂。
41.根据权利要求40所述的疫苗，其中所述佐剂选自以下中的一种或多种：基于铝盐的佐剂、乳液佐剂和TLR激动剂。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗包括脂质纳米颗粒。
43.一种诱导受试者对冠状病毒(CoV)的免疫应答的方法，所述方法包括施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
44.一种增强受试者对冠状病毒(CoV)的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
45.一种预防受试者的冠状病毒(CoV)感染或降低其可能性的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
46.一种预防受试者的冠状病毒(CoV)感染的症状或降低其可能性或严重程度的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
47.一种降低受试者的冠状病毒(CoV)感染的严重程度和/或持续时间的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
48.一种预防或降低感染冠状病毒(CoV)的人类个体的病毒脱落的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求34至42中任一项所述的疫苗。
49.根据权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述CoV是SARS-CoV-2。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的方法，其中所述受试者先前患有CoV感染。
51.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述疫苗在受试者已经接受初级CoV疫苗方案后施用。
52.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述疫苗通过肌内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、鼻内、舌下、扁桃体、口服、肺、局部或其它肠胃外和粘膜途径施用。
53.根据权利要求1至24中任一项所述的CoV疫苗抗原，其用于以下中的一项或多项：
i)预防受试者的CoV感染或降低其可能性；
ii)预防受试者的CoV症状或降低其可能性或严重程度；
iii)降低受试者的CoV感染的严重程度和/或持续时间；
iv)预防或降低受试者的病毒脱落；以及
v)治疗受试者的CoV感染。
54.一种试剂盒、装置、表面或条带，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原。
55.一种根据权利要求1至24中任一项所述的冠状病毒(CoV)疫苗抗原的用途，其用于制备用于以下中的一项或多项的药物：
i)预防受试者的CoV感染或降低其可能性；
ii)预防受试者的CoV症状或降低其可能性或严重程度；
iii)降低受试者的CoV感染的严重程度和/或持续时间；
iv)预防或降低受试者的病毒脱落；以及
v)治疗受试者的CoV感染。
56.一种抗原或编码序列的用途，其用于制备用于治疗、预防冠状病毒(CoV)感染或对群体中的所述CoV感染进行测试的制剂。
57.一种产生缺乏异源三聚化序列的可溶性S蛋白三聚体的方法，其中所述S蛋白三聚体被修饰以包括结构修饰，所述结构修饰减小所述S蛋白三聚体的卷曲盘绕区中的丙氨酸腔的大小，并且其中所述S蛋白三聚体引发中和抗体应答。
CN202280061029.3A 2021-08-11 2022-08-11 疫苗抗原 Pending CN118043451A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2021902500 2021-08-11
AU2021902500A AU2021902500A0 (en) 2021-08-11 Vaccine Antigen
AU2021902530A AU2021902530A0 (en) 2021-08-13 Vaccine Antigen
AU2021902530 2021-08-13
PCT/AU2022/050429 WO2023015332A1 (en) 2021-08-11 2022-05-06 Vaccine antigen
AUPCT/AU2022/050429 2022-05-06
PCT/AU2022/050880 WO2023015352A1 (en) 2021-08-11 2022-08-11 Vaccine antigen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118043451A true CN118043451A (zh) 2024-05-14

Family

ID=85199645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280061029.3A Pending CN118043451A (zh) 2021-08-11 2022-08-11 疫苗抗原

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN118043451A (zh)
AU (1) AU2022326491A1 (zh)
WO (2) WO2023015332A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024086575A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 BioNTech SE Combination vaccines against coronavirus infection, influenza infection, and/or rsv infection
CN116726160B (zh) * 2023-08-09 2023-10-27 中国医学科学院医学生物学研究所 新冠病毒突变体通用型疫苗cRBD的制备与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220144416A (ko) * 2020-02-04 2022-10-26 큐어백 아게 코로나바이러스 백신
US11576966B2 (en) * 2020-02-04 2023-02-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
JP2023530229A (ja) * 2020-05-29 2023-07-14 キュアバック エスイー 核酸ベースの混合ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023015332A1 (en) 2023-02-16
WO2023015352A1 (en) 2023-02-16
AU2022326491A1 (en) 2024-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11964010B2 (en) Prefusion coronavirus spike proteins and their use
US20230113170A1 (en) Sars-cov-2 vaccine
ES2858315T3 (es) Proteína F de prefusión de VRS soluble estabilizada para uso en la profilaxis de la infección por VRS
CN118043451A (zh) 疫苗抗原
WO2022110099A1 (en) Coronavirus vaccines and uses thereof
US20210393769A1 (en) Coronavirus vaccine and methods of use thereof
JP2023526073A (ja) 合成改変ワクシニアアンカラ（ｓＭＶＡ）ベースのコロナウイルスワクチン
US20230190917A1 (en) Viral vaccine vector for immunization against a betacoronavirus
JP2023523423A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン及びその調製物
EP4165060A1 (en) Vaccine compositions, methods, and uses thereof
KR20230034936A (ko) 면역 반응을 생성하는 백신, 아쥬반트 및 방법
AU2022368453A1 (en) Chimeric betacoronavirus spike polypeptides
WO2021235503A1 (ja) コロナウイルスの蛋白質が担持された複合蛋白質単量体、当該単量体の会合体、及び当該会合体を有効成分とするコンポーネントワクチン
CA3217591A1 (en) Coronavirus and influenza compositions and methods for using them
ES2410593T3 (es) Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos
EP4144752A1 (en) Viral-like particles for the treatment or prevention of an infection by a coronaviridae virus
US20230321217A1 (en) Compositions comprising complexes displaying antigens and methods of using the compositions
US20230084012A1 (en) Vaccine for use against coronavirus and variants thereof
US20220233682A1 (en) Vaccine compositions for the treatment of coronavirus
WO2024044108A1 (en) Vaccines against coronaviruses
TW202417016A (zh) 冠狀病毒疫苗
KR102102065B1 (ko) 호흡기 세포융합 바이러스 백신
WO2023227758A1 (en) Vaccine with reduced anti-vector antigenicity
CN118159288A (zh) 冠状病毒的病毒样颗粒疫苗
JP2024520730A (ja) コロナウイルスに対するウイルス様粒子ワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication