TW202144574A - 冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗 - Google Patents

Abstract

本發明係提供使用於冠狀病毒感染及伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療之疫苗。

Description

冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗

本發明係關於冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療用疫苗，其係以包含由編碼冠狀病毒之特定部分之胺基酸序列的鹼基序列所構成之核酸的表現載體或由前述部分胺基酸序列所構成之肽作為免疫原。

冠狀病毒被歸類為套式病毒(Nidovirus)目、冠狀病毒亞科、冠狀病毒科，由於形態近似王冠(crown)，故而以在希臘語中意指王冠的“corona”來命名。冠狀病毒為直徑約100nm之球形病毒，在脂質二重膜之外膜(envelope)中，具有捲繞核鞘(nucleocapsid)蛋白質的單股(+)RNA基因組，病毒基因組之大小在RNA病毒中為最大尺寸的30kb。在外膜表面配置有棘狀蛋白質(spike protein)、外膜蛋白質、膜蛋白質。

人類於日常中所感染的冠狀病毒(Human Coronavirus；HCoV)已知有4種，為HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63及HCoV-HKU1。感冒之10至15%(流行期35%)係起因於此4種冠狀病毒，在冬季可見流行之高峰，幾乎所有小 孩在至6歲為止皆有被感染過。許多感染者為輕症，然而亦有引起高燒之情形。HCoV-229E、HCoV-OC43最初係在1960年代被發現，HCoV-NL63及HCoV-HKU1係於進入2000年代時被新發現。此外，2002年於中國廣東省出現且從2002年11月至2003年7月擴及超過30個國家地區的SARS-CoV，係蝙蝠之冠狀病毒感染人類而引起重症肺炎。更近年而言，於2012年在沙烏地阿拉伯所發現的MERS-CoV係在單峰駱駝引起感冒症狀的病毒，但若超越物種之屏壁而感染人類則會引起重症肺炎。

2019年在中國武漢市附近首次被確認發生的SARS-CoV-2，係以急速之勢而感染擴大，不僅遍及中國國內，亦擴展到包含日本的亞洲、歐洲、北美、南美、中東、非洲、大洋洲等其他國家。2020年3月11日，因SARS-CoV-2之世界流行，世界衛生組織(WHO)宣布大流行(pandemic)，於2020年3月23日之時間點已確認全世界有超過30萬人感染者。有報導指出SARS-CoV-2為對人類具有病原性的第7種冠狀病毒(非專利文獻1)。SARS-CoV-2在2020年3月之時間點仍無有效之治療藥，雖然其開發急迫，然而一般醫藥品之開發需要數年至十數年之久，因此，目前係以採取用於防止感染擴大的預防措施為重要。就對病毒感染之代表性預防手段而言，可列舉疫苗，期望能盡快供給針對SARS-CoV-2之疫苗為。

[先前技術文獻]

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Na Zhu et al., New England Journal of Medicine 382(8), 727-733, 2020

本發明之課題為提供使用於冠狀病毒感染及伴隨冠狀病毒感染之症狀之預防或治療的疫苗。

一般就疫苗而言，藉由將減毒之病毒或失活之病毒接種於對象，可誘導對病毒之免疫(抗體、T細胞)。然而，由於減毒之病毒或失活之病毒的製備，若使用雞蛋法則約需5至8個月，若使用細胞培養法則約需4至7個月，所以不適於製備期望儘早供應之SARS-CoV-2疫苗。因此，本發明人等檢討以構成病毒之蛋白質作為抗原而使其在對象體內暫時表現的方法(DNA疫苗)、或將蛋白質本身直接投予至對象的方法(肽疫苗)。使用存在於SARS-CoV-2之外膜上的棘狀蛋白之全長胺基酸序列及部分胺基酸序列，作為誘導阻礙SARS-CoV-2感染之抗體用的候選抗原。將包含由編碼前述候選抗原之鹼基序列所構成之核酸的表現載體投予至小鼠、大鼠及猴，確認能誘導對抗SARS-CoV-2之抗血清。

發明人等基於此等見識，更進一步重複檢討的結果，於是完成本發明。

亦即，本發明係提供以下項目。

[1]一種冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗，其包含下列(1)至(4)之任一者，

(1)表現由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2)表現由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(3)由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成的多肽，

(4)由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成之胺基酸序列構成的多肽。

[2]如[1]記載之疫苗，其包含下列之(1’)或(2’)，

(1’)表現由序列編號：2所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2’)由序列編號：2所示之胺基酸序列構成的多肽。

[3]如[1]或[2]記載之疫苗，其中，表現由序列編號：2所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，為包含由序列編號：1所示之鹼基序列構成之核酸的表現載體。

[4]如[1]記載之疫苗，其包含下列之(1”)或(2”)，

(1”)表現由序列編號：4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2”)由序列編號：4所示之胺基酸序列構成的多肽。

[5]如[1]或[4]記載之疫苗，其中，表現由序列編號：4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，為包含由序列編號：3所示之鹼基序列構成之核酸的表現載體。

[6]如[1]至[5]中任一項記載之疫苗，其中，多肽更包含承載蛋白質(carrier protein)。

[7]如[1]至[6]中任一項記載之疫苗，其更包含佐劑(adjuvant)。

[8]如[1]至[7]中任一項記載之疫苗，其中，伴隨冠狀病毒感染之症狀係選自由發燒、咳嗽、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、肌肉痛、關節痛、支氣管炎、下痢、味覺異常、嗅覺異常、肺炎及髓膜炎所構成之群組。

藉由使用包含由編碼冠狀病毒之棘狀蛋白質之全長胺基酸序列或部分胺基酸序列的鹼基序列構成之核酸的表現載體作為DNA疫苗，或使用前述全長胺基酸序列或部分胺基酸序列構成之肽作為肽疫苗，誘導阻礙冠狀病毒 感染或殺傷受感染細胞的抗體及T細胞，藉此可期待不僅可用於預防或治療冠狀病毒之感染，並且亦可用於預防或治療伴隨冠狀病毒感染之症狀。

1.冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗

本發明提供冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗(以下亦稱為本發明之疫苗)。

藉由本發明之疫苗可預防或治療感染的冠狀病毒，只要為感染人類之冠狀病毒，將無特別限制。就如此之冠狀病毒而言，可列舉人類冠狀病毒(HCoV)-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、嚴重呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸症候群冠狀病毒(MERS-CoV)及SARS-CoV-2，較佳可列舉SARS-CoV、SARS-CoV-2，最佳可列舉SARS-CoV-2。

藉由本發明之疫苗可預防或治療之伴隨冠狀病毒感染的症狀，只要為起因於冠狀病毒之感染而誘發的症狀，將無特別限制。例如可列舉發燒、咳嗽、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、肌肉痛、關節痛、支氣管炎、下痢、味覺異常、嗅覺異常、肺炎及髓膜炎等。

本發明疫苗之投予對象，只要為可能感染冠狀病毒之哺乳動物，將無特別限制。就如此之哺乳動物而言，例如可列舉小鼠等囓齒類，狗等寵物，豬、馬等家畜，人類、猴、紅毛猩猩及黑猩猩等靈長類等，以人類為特佳。

本發明之疫苗包含下列(1)至(4)任一者：

(1)表現由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2)表現由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(3)由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成之多肽，

(4)由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成之胺基酸序列構成的多肽。

本發明之疫苗，較佳為包含下列之(1’)或(2’)：

(1’)表現由序列編號：2所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2’)由序列編號：2所示之胺基酸序列構成的多肽，或者

下列之(1”)或(2”)：

(1”)表現由序列編號：4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

(2”)由序列編號：4所示之胺基酸序列構成的多肽。

本發明之疫苗所含的上述(1)、(1’)及(1”)之表現載體所表現的多肽，以及上述(3)、(2’)及(2”)之多肽(以下亦稱為本發明之多肽)，為構成SARS-CoV-2之棘狀蛋白質的胺基酸序列之全長序列或部分序列。SARS-CoV-2之棘狀蛋白質係在外膜上形成3聚體，各棘狀蛋白質係由S1次單元及S2次單元構成。S1次單元及S2次單元係轉譯成1分子蛋白質後，藉由切斷成2分子而產生。S1次單元具有識別細胞表面之受體的受體結合結構域(RBD)，S2次單元包含參與膜融合之功能結構域。本發明之多肽中，序列編號：2所示之胺基酸序列係相當於由SARS-CoV-2之S1次單元及S2次單元構成的多肽。序列編號：2所示之胺基酸序列，例如係以由序列編號：1所示之鹼基序列所構成的核酸所編碼。此外，序列編號：4所示之胺基酸序列係相當於SARS-CoV-2之S1次單元構成的多肽。 另外，序列編號：4所示之胺基酸序列，例如係以由序列編號：3所示之鹼基序列所構成的核酸所編碼。

再者，本發明之疫苗所含的上述(2)之表現載體所表現的多肽或上述(4)之多肽，係在本發明之多肽中將1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸刪除、置換、插入或附加而成的胺基酸序列。就如此之多肽而言，亦包含在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸刪除、置換、插入或附加而成的胺基酸序列。就該胺基酸序列而言，例如包含：(1)序列編號：2或4所示之胺基酸序列中1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸被刪除的胺基酸序列；(2)序列編號：2或4所示之胺基酸序列中1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸被附加的胺基酸序列；(3)序列編號：2或4所示之胺基酸序列中1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸被插入的胺基酸序列；(4)序列編號：2或4所示之胺基酸序列中1或數個(較佳為1至數個(2至5個))胺基酸被其他胺基酸置換的胺基酸序列；或(5)將上述(1)至(4)之變異予以組合而成的胺基酸序列(在此情況下，變異之胺基酸的總和為1或數個(較佳為1至數個(2至5個)))。

就「胺基酸殘基之置換」而言，可列舉例如保存性胺基酸置換。保存性胺基酸置換係意指將特定之胺基酸以具有與該胺基酸之側鏈同樣性質之側鏈的胺基酸置換。具體言之，就保存性胺基酸置換而言，特定之胺基酸可藉由與該胺基酸屬於相同群組的其他胺基酸置換。具有同樣性質之側鏈的胺基酸之群組為該領域所周知。例如，就此種胺基酸之群組而言，可列舉具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有中性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)。此外，具有中性側鏈之胺基酸亦可進一步分類為具有極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、及具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)。另外，就其他群組而言，例如亦可列舉具有芳香族側鏈之胺基酸(例如苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸)、具有包含羥基(醇性羥基、酚性羥基)之側鏈的胺基酸(例如絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)等。

就「胺基酸殘基之刪除」而言，可列舉從序列編號：2或4所示之胺基酸序列中選擇任意之胺基酸殘基予以刪除。

就「胺基酸殘基之插入」或「胺基酸殘基之附加」而言，可列舉在序列編號：2或4所示之胺基酸序列的內部、N末端側或C末端側，插入或附加胺基酸殘基。為了增強肽之水溶解性，亦可在胺基酸序列之N末端側或C末端側附加屬於鹼性胺基酸之精胺酸(Arg)或離胺酸(Lys)的1至2個殘基。

本發明之多肽可更包含附加之胺基酸。此種胺基酸附加，只要該多肽不會阻礙對冠狀病毒之特異性免疫反應的誘導，皆被容許。所附加之胺基酸序列係無特別限定，可列舉例如使多肽之檢測或精製等變得容易用的標籤。就標籤而言，可例示Flag標籤、組胺酸標籤、c-Myc標籤、HA標籤、AU1標籤、GST標籤、MBP標籤、螢光蛋白質標籤(例如GFP、YFP、RFP、CFP、BFP等)、免疫球蛋白Fc標籤等。胺基酸序列被附加的位置為本發明之多肽的N末端及/或C末端。

本發明之多肽中所用的胺基酸係包含L體、D體及DL體，通常以L體為較佳。此等多肽可藉由通常之多肽合成法合成以供給本發明，惟在本發明中關於製造方法、合成方法、調配方法等係無特別限定。

在上述(1)、(2)、(1’)及(1”)之表現載體(以下亦稱為本發明之表現載體)中，編碼本發明之多肽的多核苷酸(DNA或RNA，較佳為DNA)，係功能性地連結在屬於投予對象之哺乳動物的細胞內可發揮啟動子活性之啟動子的下游。亦即，本發明之表現載體，係在啟動子之控制下，以轉譯產物之形式產生本發明之多肽。藉由將本發明之表現載體投予至哺乳動物，在該哺乳動物之體內可產生本發明之多肽，而可於該哺乳動物中誘導對本發明多肽的特異性免疫反應。

所使用之啟動子，只要在為在屬於投予對象之哺乳動物的細胞內可發揮功能者，將無特別限制。就啟動子而言，可使用polI系啟動子、polII系啟動子、polIII系啟動子等。具體而言，可使用源自SV40之初期啟動子、巨細胞病毒LTR等之病毒啟動子、β-肌動蛋白基因啟動子等哺乳動物之構成蛋白質基因啟動子等。

本發明之表現載體，較佳係在由編碼本發明之多肽的鹼基序列構成之核酸的下游含有轉錄終結信號(亦即終止子區域)。再者，亦可含有轉形細胞選擇用的選擇標記基因(賦予對四環素(tetracycline)、安比西林(ampicillin)、康黴素(kanamycin)等藥劑之抗性的基因、與營養要求性變異互補的基因等)。

此外，本發明之表現載體，可將編碼信號序列之鹼基序列(信號密碼子)附加於由編碼本發明之多肽之鹼基序列構成的核酸之5’末端側(或與原本的信號密碼子置換)。就所使用之信號序列而言，例如可使用胰島素信號序列、α-干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。

在本發明中，使用於表現載體的載體之種類並無特別限制，而就投予至人類等哺乳動物的較佳載體而言，可列舉病毒載體、質體(plasmid)載體等。就病毒載體而言，可列舉逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒等。若考慮製造及操作之容易性或經濟性，以使用質體載體為較佳。

為了提高本發明之多肽的免疫原性，本發明之疫苗可更包含承載蛋白質。就承載蛋白質而言，一般為結合於因分子量小而不具有免疫原性之分子(半抗原(hapten))並藉此賦予免疫原性的物質，其為該技術領域所周知。就承載蛋白質之例而言，較佳可列舉牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、卵白蛋白(OVA)、鎖孔帽貝血藍素(Keyhole-Limpet hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白(TG)、免疫球蛋白等等。在本發明之疫苗為多肽的情況下，承載蛋白質可與本發明之多肽之N末端或C末端接合(conjugation)。就接合之方法而言，可藉由在本發明之多肽中導入半胱胺酸殘基，經由屬於該半胱胺酸之側鏈的SH基，與承載蛋白質之胺基結合，而予以接合(MBS法)。此外，亦可藉由使蛋白質之離胺酸殘基的ε胺基或α胺基等胺基彼此結合而接合(戊二醛法)。在本發明之疫苗為表現載體的情況下，可在由編碼本發明之多肽之鹼基序列構成的核酸之5’側或3’側，與由編碼該承載蛋白質之鹼基序列構成的核酸連結。

另外，本發明之疫苗以更含有製藥上可容許且與活性成分具有相容性的佐劑為較佳。就佐劑而言，一般為將宿主之免疫回應非特異性地增強的物質，多數佐劑為此技術領域所周知。使用於本發明之疫苗的佐劑，只要能將免疫回應非特異性地增強，將無特別限定，例如，可列舉明礬、CpG寡脫氧核苷酸、dsRNA、Montanide、保蓓(Cervarix)等。

本發明之疫苗中，除了本發明之多肽或本發明之表現載體以外，亦可包含任何載劑，例如可以包含醫藥上可容許之載劑的醫藥組成物的形式來提供。

醫藥上可容許之載劑，可依照劑型而適宜選擇，例如可列舉如：蔗糖、澱粉等賦形劑；纖維素、甲基纖維素等黏合劑；澱粉、羧基甲基纖維素等崩解劑；硬脂酸鎂等滑劑；檸檬酸、薄荷醇等芳香劑；苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉等保存劑；檸檬酸、檸檬酸鈉等安定劑；甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮等懸浮劑；界面活性劑等分散劑；水、生理食鹽水等稀釋劑；底蠟(base wax)等。惟不以此等為限。

再者，在本發明之疫苗為本發明之表現載體的情況下，為了促進該表現載體對細胞內之導入，本發明之疫苗可更包含核酸導入用試藥。在使用病毒載體作為表現載體的情況下，就基因導入試藥而言，可使用重組人纖黏連蛋白(retronectin)、纖維接合素(fibronectin)、聚凝胺(polybrene)等。此外，在使用質體載體作為表現載體的情況下，可使用立波非汀(Lipofectin)、立波非他命(Lipofectamine)、DOGS(轉司非克他姆(Transfectam))、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、聚凝胺、或聚(伸乙基亞胺)(PEI)等陽離子性脂質。

本發明之疫苗能以經口或非經口方式投予至哺乳動物。由於多肽或表現載體可於胃中分解，故以非經口方式投予為較佳。就適於經口投予的較佳製劑而言，可列舉液劑、膠囊劑、囊袋(sachet)劑、錠劑、懸浮液劑、乳劑等。就非經口方式投予(例如皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔內投予等)之較佳製劑而言，例如有水性及非水性之等張無菌注射液劑，其中亦可包含抗氧化劑、緩衝液、制菌劑、等張化劑等。此外，可列舉水性及非水性之無菌懸浮液劑，其中 亦可包含懸浮劑、助溶劑、增黏劑、安定化劑、防腐劑等。該製劑可如安瓿(ampoul)或小瓶(vial)般將每次單位投予量或複數次投予量封入容器中。另外，亦可將有效成分及醫藥上可容許之載劑凍結乾燥而以在即將使用前可溶解或懸浮於適當無菌媒液的狀態來保存。

醫藥組成物中之有效成分的含量，通常為醫藥組成物總量之約0.1至100重量%，較佳為約1至99重量%，更佳為約10至90重量%。

本發明之疫苗的投予量，雖隨著投予對象、投予方法、投予形式等而異，惟在有效成分為本發明之多肽的情況下，通常成人每人每次投予之多肽係在1μg至1000μg之範圍，較佳為在20μg至100μg之範圍，每次通常相隔4週至12週而投予2次至3次，若抗體價降低則再追加投予1次。在有效成分為本發明之表現載體的情況下，通常成人每人每次投予之表現載體係在1μg至1000μg之範圍，較佳為在20μg至100μg之範圍，通常每次相隔4週至12週而投予2次至3次，若抗體價降低則再追加投予1次。

藉由將本發明之疫苗投予至哺乳動物，誘導對冠狀病毒之特異性免疫回應(特異性抗體產生、特異性T細胞之增殖等)，該哺乳動物會獲得對抗冠狀病毒的中和抗體，可阻礙已侵入哺乳動物內之冠狀病毒的感染。因此，藉由本發明之疫苗阻礙冠狀病毒感染的結果，可發揮對於伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療效果。

此外，本發明提供一種套組，其包含本發明之疫苗的1種或2種以上之成分，且包含1種或2種以上的容器。藉由使用本發明之套組，亦可預防伴隨冠狀病毒感染的症狀，或者可治療或減輕其症狀。

[實施例]

以下列舉實施例，更具體地說明本發明，惟本發明不被此等所限定，則不待言。

DNA疫苗設計

選擇由SARS-CoV-2之S1次單元及S2次單元構成之多肽(序列編號2)及只由S1次單元構成之多肽(序列編號4)，分別合成編碼該多肽之鹼基序列(序列編號1、3)，分別以可表現的方式連結於表現載體pVAX1，調製DNA疫苗S1+S2及DNA疫苗S1(2mg/ml)。

實施例1：對小鼠投予DNA疫苗

在8週齡之BALB/c雄小鼠(N=6)背部之左右4處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以每1處20μL(160μg/80μL)之量使用注射器(Daicel公司)，每2週進行皮內投予3次。

此外，在8週齡BALB/c雄小鼠(N=6)肢體之左右2處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以每1處50μL(200μg/100μL)與明礬佐劑(氫氧化鋁)一起，每2週進行肌肉內投予3次。

從前述之經皮內投予及肌肉內投予的小鼠，在初次投予前、初次投予後第2週、第4週、第6週、第8週及第12週取得血清，實施抗體價之測定及酶聯免疫斑點檢定(Elispot assay)。

實施例2：對大鼠投予DNA疫苗

在8週齡SD雄雌大鼠(各N=6)之背部左右4處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處30μL(240μg/120μL)之量使用注射器(Daicel公司)，每2週進行皮內投予3次。

此外，在8週齡之SD雄雌大鼠(各N=6)背部之左右2處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處50μL(200μg/100μL)之量使用注射器(Injex公司)，每2週進行皮下投予3次。

另外，在8週齡SD雄雌大鼠(各N=6)肢體之左右2處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處100μL(400μg/200μL)之量與明礬佐劑(氫氧化鋁)一起，每2週進行肌肉內投予3次。

從前述之經皮內投予、皮下投予及肌肉內投予的大鼠，在初次投予前、初次投予後第2週、第4週及第6週取得血清，實施抗體價之測定。

再者，就DNA疫苗之毒性評價而言，觀察、測定或檢査下列之項目。

(1)一般狀態觀察(1次/日)

(2)體重測定(1次/週)

(3)攝餌量測定(1次/週)

(4)眼科學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(5)尿檢査(投予前及投予期間中各1次)

(6)血液學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(7)血液生化學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(8)剖檢

(9)器官重量測定

(10)病理組織學之檢査

實施例3：對猴投予DNA疫苗

在食蟹猴(N=3)背部之左右8處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處50μL(800μg/400μL)之量使用注射器(Daicel公司)，每2週進行皮內投予3次。

同樣地，在食蟹猴(N=3)背部之左右4處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1分別以1處100μL(800μg/400μL)之量使用注射器(Injex公司)，每2週進行皮下投予3次。

又同樣地，在食蟹猴(N=3)之脚的左右2處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處500μL(2000μg/1000μL)之量與明礬佐劑(氫氧化鋁)一起，每2週進行肌肉內投予3次。

在初次投予前、初次投予後第2週、第4週及第6週取得血清，實施抗體價之測定。

在食蟹猴(N=3)背部之左右8處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處50μL(800μg/400μL)之量使用注射器(Daicel公司)，每2週進行皮內投予3次。

同樣地，在食蟹猴(N=3)背部之左右4處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1分別以1處100μL(800μg/400μL)之量使用注射器(Injex公司)，每2週進行皮下投予3次。

又同樣地，在食蟹猴(N=3)之脚的左右2處，將DNA疫苗S1+S2、DNA疫苗S1或表現載體pVAX1分別以1處500μL(2000μg/1000μL)之量與明礬佐劑(氫氧化鋁)一起，每2週進行肌肉內投予3次。

就馴化中進行1次、投予期間進行2次的「DNA疫苗之安全性藥理評價」而言，測定或檢査下列之項目。

(1)循環系統：藉由霍特氏(Holter’s)心電計而進行之心電圖測定，於拘束條件下之血壓測定

(2)呼吸系統：藉由目視而進行之呼吸數測定、血液氣體測定

(3)中樞系統：FOB檢査、體溫測定

此外，就DNA疫苗之毒性評價而言，觀察、測定或檢査下列之項目。

(1)一般狀態觀察(1次/日)

(2)體重測定(1次/週)

(3)攝餌量測定(1次/週)

(4)眼科學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(5)尿檢査(投予前及投予期間中各1次)

(6)血液學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(7)血液生化學之檢査(投予前及投予期間中各1次)

(8)剖檢

(9)器官重量測定

(10)病理組織學之檢査

[產業上之可利用性]

藉由使用本發明之表現載體作為DNA疫苗、或使用本發明之肽作為肽疫苗，而誘導阻礙冠狀病毒感染的抗體，藉此而可阻礙冠狀病毒之感染、或誘導殺傷受感染細胞的抗體或T細胞，因此，不僅可期待預防或治療冠狀病毒的感染，甚至可期待預防或治療伴隨冠狀病毒的症狀。依照本發明，由於無直接操作冠狀病毒的必要性，故疫苗之製造步驟安全。此外，由於不伴隨病毒之製 造，故可於短期間內提供疫苗。本案係以在日本申請的日本特願2020-061369(申請日：2020年3月30日)作為基礎，其內容全部包含於本說明書中。

<110> 國立大學法人大阪大學(OSAKA UNIVERSITY) 日商安琪士股份有限公司(AnGes,Inc.)

<120> 冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗

<130> 093139

<140> TW 110111332

<141> 2021-03-29

<150> JP 2020-061369

<151> 2020-03-30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 冠狀病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3822)

<400> 1

<210> 2

<211> 1273

<212> PRT

<213> 冠狀病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 2058

<212> DNA

<213> 冠狀病毒

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2058)

<400> 3

<210> 4

<211> 685

<212> PRT

<213> 冠狀病毒

<400> 4

Claims (8)

1. 一種冠狀病毒感染或伴隨冠狀病毒感染之症狀的預防或治療疫苗，其包含下列(1)至(4)之任一者，

   (1)表現由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

   (2)表現由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成的胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

   (3)由序列編號：2或4所示之胺基酸序列構成的多肽，

   (4)由在序列編號：2或4所示之胺基酸序列中將1或數個胺基酸殘基置換、刪除、插入或附加而成的胺基酸序列構成之多肽。
2. 如請求項1所述之疫苗，其包含下列之(1’)或(2’)，

   (1’)表現由序列編號：2所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

   (2’)由序列編號：2所示之胺基酸序列構成的多肽。
3. 如請求項1或2所述之疫苗，其中，

   表現由序列編號：2所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，為包含由序列編號：1所示之鹼基序列構成之核酸的表現載體。
4. 如請求項1所述之疫苗，其包含下列之(1”)或(2”)，

   (1”)表現由序列編號：4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，

   (2”)由序列編號：4所示之胺基酸序列構成的多肽。
5. 如請求項1或4所述之疫苗，其中，

   表現由序列編號：4所示之胺基酸序列構成之多肽的表現載體，為包含由序列編號：3所示之鹼基序列構成之核酸的表現載體。
6. 如請求項1至5中任一項所述之疫苗，其中，多肽更包含承載蛋白質。
7. 如請求項1至6中任一項所述之疫苗，其更包含佐劑。
8. 如請求項1至7中任一項所述之疫苗，其中，伴隨冠狀病毒感染之症狀係選自由發燒、咳嗽、喀痰、喀血、咽頭痛、頭痛、肌肉痛、關節痛、支氣管炎、下痢、味覺異常、嗅覺異常、肺炎及髓膜炎所構成之群組。