KR20220154121A - 코로나바이러스 면역원성 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

코로나바이러스 면역원성 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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버트랜드 빅터 길버트 조지스
엠 스콧 로버츠
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알티뮨 인크.
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Abstract

포유동물에서 2019 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염 및 변종에 대한 보호성 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 화합물, 이의 약학 제제 및 이의 용도가 본 개시에 제공된다.

Description

코로나바이러스 면역원성 조성물 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2020년 2월 14일에 출원된 가출원 번호, 미국 일련 번호 제62/977,078호; 2020년 3월 20일에 출원된 미국 일련 번호 제62/992,553호; 2020년 4월 06일에 출원된 미국 일련 번호 제63/005,923호; 2020년 4월 28일에 출원된 미국 일련 번호 제63/016,902호; 2020년 7월 12일에 출원된 미국 일련 번호 제63/050,844호; 2020년 8월 05일에 출원된 미국 일련 번호 제63/069,792호; 2020년 10월 07일에 출원된 미국 일련 번호 제63/088,736호; 2021 년 1월 21일에 출원된 미국 일련 번호 제63/140,128호; 2021 년 1월 27일에 출원된 미국 일련 번호 제63/142,077호; 및 2021 년 2월 11일에 출원된 미국 일련 번호 제63/148,374호에 대해 우선권을 주장하고, 이로써 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 전자 제출되고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2021 년 2월 11일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 ALT2029PCT_ST25.TXT이고 크기가 471,040 바이트이다.
개시의 분야
본 출원은 일반적으로 대상체에서 면역 반응을 유도하고 선택적으로 신종 2019 코로나바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 방어를 제공하는, 포유동물 대상체에 투여하기 위한 아데노바이러스 벡터화된 코로나바이러스 항원 약학 제제에 관한 것이다.
코로나바이러스는 인간 및 다른 동물에서 호흡기 및 장 질환을 유발하는 다양한 그룹의 큰 외피의 양성-가닥 RNA(ssRNA)이다. 예를 들어, 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), OC43(HCoV-OC43), NL63, 및 HKU1은 인간 집단에서 엔데믹이며 일반 감기의 최대 30%를 유발한다. 동물의 코로나바이러스(예를 들어, 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV), 뮤린 간염 바이러스(MHV) 및 조류 감염성 기관지염 바이러스(IBV))는 이들의 각각의 숙주에서 호흡기, 위장, 신경계 또는 간 질환을 유발한다.
코로나바이러스는 적어도 18 개의 바이러스 단백질(예컨대, 비-구조 단백질(NSP) 1-13, 구조 단백질 E, M, N, S, 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제)을 코딩하는 양성-센스, 비-분절, 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는다. 코로나바이러스는 3 개의 주요 표면 당단백질(S, E, 및 M으로 지정됨)을 갖고, 일부 코로나바이러스는 헤마글루티닌 에스테라제(HE)로 지칭되는 또 다른 표면 당단백질을 갖고, 또한 N(뉴클레오캡시드) 단백질은 일반적으로 게놈과 관련된 염기성 인단백질로서 항원성으로 보고된 바 있다(Holmes and Lai, Fields Virology, Chapter 34, 1996). 코로나바이러스의 주요 항원인 S(스파이크(spike)) 단백질은 2 개의 도메인, 즉, 수용체 결합에 관여하는 것으로 여겨지는 S1 및 바이러스와 표적 세포 간의 막 융합을 매개하는 것으로 여겨지는 S2를 갖는다(문헌[Holmes and Lai, 1996], 상동).
S(스파이크) 단백질은 수용체 결합과 바이러스 감염성을 매개할 수 있는 비공유 결합된 동종삼량체(올리고머)를 형성할 수 있다. S 단백질의 동종삼량체는 수용체 결합 도메인의 정확한 천연 입체형태를 제시하고 중화 항체 반응을 유도하기 위해 필수적일 가능성이 있다. 또한, S 단백질의 세포내 가공은 중요한 전사후 올리고당류 변형과 관련이 있다. N-글리칸 모티프 분석으로 예상되는 전사후 올리고당류 변형(글리코실화)은 S 단백질이 이러한 변형을 위해 23 개 정도의 많은 부위를 갖고 있음을 지시한다. 또한, C-말단 시스테인 잔기도 단백질 폴딩(folding) 및 천연(기능적) S 단백질 입체형태의 보존에 참여할 수 있다. 일부 코로나바이러스의 S 단백질은 S 단백질의 중심 근처에서 골지체내 트립신-유사 프로테아제에 의해 또는 세포 외부에 위치한 효소에 의해 N-말단 S1 및 C-말단 S2 폴리펩타이드를 함유하는 연결된 폴리펩타이드로 단백분해성 가공될 수 있다. 현재, 코로나바이러스는 α-속, β-속(예를 들어, MERS, SARS, SARS-CoV-2), 및 γ-속으로 세분된다. 도 14를 참조한다.
코로나바이러스 감염은 바이러스 외피의 지질 이중층과 숙주 세포막의 융합을 통해 달성된다. 막 융합은 바이러스 외피 상의 바이러스 스파이크(S) 당단백질에 의해 매개된다. S-당단백질은 소포체에서 올리고머화되고 프리-골지(pre-Golgi) 구획에서 발아 비리온으로 혼입되는 약 180 kDa의 전구체로서 합성된다. S1은 수용체-결합 부위를 함유하므로 바이러스의 숙주 범위를 규정하는 데 기여한다. S2는 바이러스와 세포 막 사이의 융합을 매개하는 데 기여하는 막관통 서브유닛이다. S2는 이중 코일 구조를 형성할 것으로 예측되는 2 개의 4,3-소수성 반복 도메인(HR)을 함유한다. 이러한 영역은 HR-1 및 HR-2로 표시되며, 나선간 도메인으로 불리는 개재된 아미노산 잔기의 스트레치에 의해 분리된다. 이러한 이중 코일 영역은 천연 상태의 스파이크 단백질의 올리고머 구조 및 이의 융합형성 능력을 정의하는 데 중요한 역할을 할 수 있다.
신종 코로노바이러스 SARS-CoV-2(처음에는 2019-nCoV로 보고되었고, 계통발생, 분류학 및 확립된 관행에 기반하여 코로나바이러스 연구 그룹(바이러스 분류에 관한 국제 위원회의 연구 그룹)에 의해 공식적으로 SARS-CoV-2로 명명됨(BioRxiv; doi.org/10.1101/2020.02.07.937862))는 이전에는 인간에서 확인되지 않았고 중국 후베이성 우한에서 처음 보고된 새로운 균주이다. SARS-CoV-2는 전 세계적인 건강 비상 사태인 진행 중인 2019-20 우한 코로나바이러스 발발의 원인이다. 게놈 시퀀싱은 이것이 양성-센스, 단일-가닥 RNA 코로나바이러스임을 보여주었다(젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 MN908947.3; RefSeq NC_045512; "우한 해산물 시장 폐렴 바이러스 단리물 우한-Hu-1"). 코로나바이러스는 주로 밀접 접촉을 통해, 특히 약 6 피트(1.8 m) 범위 내의 기침 및 재채기로부터의 호흡기 비말을 통해 확산된다. 감염의 일반적인 징후는 호흡기 증상, 발열, 기침, 숨가쁨 및 호흡 곤란을 포함한다. 더 심한 경우에, 감염은 폐렴, 중증 급성 호흡기 증후군, 신부전 및 심지어 사망을 초래할 수 있다. SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있는 벡터 및 이를 포함하는 면역원성 조성물이 긴급히 필요하다. 본 개시는 이러한 문제들을 해결한다.
개시의 요약
일부 실시양태에서, 본 개시는 코로나바이러스, 특히 신종 2019 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 개선(예를 들어, 증진)하기 위한 시약, 조성물, 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원(들)(예를 들어, E1A/E3 결손 인간 아데노바이러스 유형 5(hAd5)(hAd5-SARS-CoV-2)) 및/또는 상이한 유형의 감염원(예를 들어, 상이한 유형의 바이러스, 예컨대, 인플루엔자(예를 들어, Ad-HA))의 또 다른 하나 이상의 외인성 항원을 코딩하는, 또는 트랜스진이 없는("hAdE"; 외인성 감염원의 적어도 하나의 항원 또는 면역원을 코딩하지 않는 "빈") 복제 결함 아데노바이러스 벡터(이는 본원에서 총괄하여 "SARS-CoV-2 면역화 벡터"로 지칭될 수 있음)를 제공한다. 본원에 논의된 바와 같이, 이러한 벡터(및/또는 이를 포함하는 면역원성 조성물)는 SARS-CoV-2에 대항하여(예를 들어, 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)과 같은 보호성 SARS-CoV-2 에피토프에 대항하여) 점막, 세포-매개 및/또는 체액 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2 T 에피토프(들)(예를 들어, 우성 에피토프)에 대해 특이성을 갖는 면역 반응(예를 들어, 항체 및/또는 CD8+ T 세포(및/또는 다른 T 세포)의 생산)을 유도하고/유도하거나 증진시키는 동물 및/또는 인간에 대한 이러한 벡터(예를 들어, hAd5-SARS-CoV-2 및/또는 hAd5)의 투여를 기술한다. 일부 실시양태에서, 비강내 투여된 벡터에 의해 유도된 면역 반응은 기도에서 상주 기억 표현형을 갖는 T 세포 반응을 유도 및/또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성이고/보호성이거나 SARS-CoV-2에 의한 증상 및/또는 감염을 호전시키는 데 효과적이며, 일부 실시양태에서 SARS-CoV-2 공격에 대해 보호성일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2 전염 및 감염과 관련하여 당 분야에서 인지되는 문제들에 대한 해결책을 제공하기 위한 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 면역원성 조성물(들)의 용도를 기술한다.
특정 실시양태에서, SARS-Cov-2 바이러스 감염에 의해 유발된 COVID-19 관련 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역원성 조성물, 이의 제제 및 사용 방법이 본원에 제공되며, 여기서 면역원성 조성물은 SEQ ID NO: 446 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함한다. 실시양태에서, 면역원성 조성물은 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함한다. SEQ ID NO: 15는 스파이크 단백질의 S1 도메인의 긴 측접 서열(SEQ ID NO: 3) 및 리더 서열을 갖는 RBD 서열(SEQ ID NO: 446)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13(S1 도메인)을 코딩한다. 실시양태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3의 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩한다.
본원에서 사용되는 "변이체"는 RBD 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 475-476 및 SEQ ID NO: 460(SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 15의 RBD 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 RBD 서열) 중 하나 이상을 코딩한다. 실시양태에서, 핵산 서열은 위치 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 또는 513-526에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411 또는 SEQ ID NO: 3(전장 스파이크 단백질)에 상응한다. 실시양태에서, 핵산 서열은 아미노산 위치 367, 403, 439, 417, 446, 447, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 487, 490, 493, 494, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411 또는 SEQ ID NO: 3(전장 스파이크 단백질)에 상응한다.
실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N에 의한 아미노산 417(K)의 치환; V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G)의 치환; N에 의한 아미노산 449(Y)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)에서 치환; F에 의한 아미노산 455(L)의 치환; L에 의한 아미노산 456(F)의 치환; V에 의한 아미노산 473(Y)의 치환; V에 의한 아미노산 475(A)의 치환; S 또는 A에 의한 아미노산 476(G)의 치환; N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S)의 치환; Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E)의 치환; L 또는 S에 의한 아미노산 486(F)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)의 치환; L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q)의 치환; N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y)의 치환; I에 의한 아미노산 500(T)의 치환; Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N)의 치환; R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G)의 치환; L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V)의 치환; 또는 H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)의 치환으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응한다. 실시양태에서, 핵산 서열은 K417T, K417N, E484K, L452R 및/또는 N501Y로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411 또는 SEQ ID NO: 3(전장 스파이크 단백질)에 상응한다. 실시양태에서, SEQ ID NO: 446을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 418 내지 437로부터 선택된 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 추가로 포함한다.
실시양태에서, 트랜스진의 코딩 서열이 포유동물 대상체에 코돈 최적화된 면역원성 조성물이 본원에 제공된다. 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 돼지(porcine 또는 swine) 아데노바이러스, 또는 인간 아데노바이러스이다. 실시양태에서, 비-인간 영장류 아데노바이러스는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스이다. 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스이다. 실시양태에서, 인간 아데노바이러스는 Ad5 또는 Ad26이다.
실시양태에서, 유효량의 면역원성 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 446 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는)을 포함하는, 약학 제제로서, 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하고, 선택적으로 희석제는 인산염-완충 식염수인, 약학 제제가 본원에 제공된다. 실시양태에서, 제제는 비-침습성 또는 비강내 투여를 위해 구성되며, 선택적으로 여기서 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태이다.
실시양태에서, SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, SEQ ID NO: 446 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는)을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 일 실시양태에서, 유효량은 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 적어도 109 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 1010 개 바이러스 입자(vp)이다. 실시양태에서, 면역원성 조성물은 비강내 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 조성물은 SARS-CoV-2의 치료 또는 예방에 사용될 수 있고, 본 개시의 조성물은 SARS-Cov-2의 치료 또는 예방을 제공하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 SARS-CoV-2의 치료 및 예방 방법을 포괄하지만, 본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 용도를 포괄하고, 이러한 용도는 임의의 본 발명의 방법과 병행할 수 있고, 임의의 또는 모든 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 개시의 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 상세한 설명 및 실시예 섹션과 함께, 본 개시의 원리 및 구현을 설명하는 역할을 한다.
도 1a 내지 1j는 예시적인 SARS-CoV-2 완전 게놈(우한 해산물 시장 폐렴 바이러스 단리물 우한-Hu-1, 완전 게놈; 젠뱅크: MN908947.3; SEQ ID NO: 1)이다.
도 2a 내지 2e는 SARS-CoV-2 ORF1ab 다단백질(젠뱅크: QHD43415.1; SEQ ID NO: 2)이다.
도 3a는 천연 리더 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(예를 들어, 스파이크 단백질)(젠뱅크: QHD43416.1; SEQ ID NO: 3)이다.
도 3b는 SARS-CoV-2 표면 당단백질 스파이크 단백질의 RBD 영역(SED ID NO: 446)이다.
도 4는 SARS-CoV-2 ORF3A 다단백질(젠뱅크: QHD43417.1; SEQ ID NO: 4)이다.
도 5는 SARS-CoV-2 외피 단백질(젠뱅크: QHD43418.1; SEQ ID NO: 5)이다.
도 6은 SARS-CoV-2 막 당단백질(젠뱅크: QHD43419.1; SEQ ID NO: 6)이다.
도 7은 SARS-CoV-2 ORF6 단백질(젠뱅크: QHD43420.1; SEQ ID NO: 7)이다.
도 8은 SARS-CoV-2 ORF7a 단백질(젠뱅크: QHD43421.1; SEQ ID NO: 8)이다.
도 9는 SARS-CoV-2 ORF8 단백질(젠뱅크: QHD43422.1; SEQ ID NO: 9)이다.
도 10은 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 인단백질(젠뱅크: QHD43423.2; SEQ ID NO: 10)이다.
도 11은 SARS-CoV-2 ORF10 단백질(젠뱅크: QHI42199.1; SEQ ID NO: 11)이다.
도 12는 우한-Hu-1 SARS-CoV-2 완전 게놈(젠뱅크 MN908497; NCBI 참조 서열: NC_045512.2; SEQ ID NO: 1)의 개략도를 보여준다.
도 13은 스파이크 단백질 폴리펩타이드 및 이의 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 3)의 개략도를 보여준다.
도 14는 코로나바이러스 스파이크 단백질의 S1 및 S2 도메인을 통한 코로나바이러스의 분류를 보여준다.
도 15는 스파이크 단백질의 S1 부분의 수용체 결합 도메인(RBD)의 위치 455, 486, 493, 494 및 501에서의 보존적 아미노산 치환의 표를 보여준다.
도 16은 밑줄 그어진 pTA 신호 서열이 있는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(예를 들어, 스파이크 단백질)(젠뱅크: QHD43416.1)이다. (SEQ ID NO: 12).
도 17a는 밑줄 그어진 pTA 신호 서열이 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)이다. SEQ ID NO: 13이 아데노바이러스 벡터에 삽입될 때, 이는 본원에서 "S1 벡터"로 지칭된다.
도 17b는 S1 도메인에서 SARS-CoV-2 변이체 돌연변이이다("서열"은 SEQ ID NO: 411이다).
도 18은 pTA 신호 서열 및 밑줄 그어진 짧은 측접 서열이 있는 S1 도메인의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)이다. (SEQ ID NO: 14).
도 19는 pTA 신호 서열 및 밑줄 그어진 긴 측접 서열이 있는 S1 도메인의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)이다(SEQ ID NO: 15). SEQ ID NO: 15가 아데노바이러스 벡터에 삽입될 때, 이는 본원에서 "RBD 벡터"로 지칭된다.
도 20은 위치 455, 486, 493, 494 및 501(SEQ ID NO: 16)에서 보존적 치환을 갖는 S1 도메인의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)이다.
도 21은 위치 455, 486, 493, 494 및 501에서 보존적 치환을 갖는 S1 도메인의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, 수용체 결합 도메인(RBD)의 일부이다(SEQ ID NO: 17).
도 22는 밑줄 그어진 pTA 신호 서열 및 S1/S2, S2' 및 HR1 부위에 치환을 갖는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(예를 들어, 스파이크 단백질)(SEQ ID NO: 18)이다.
도 23은 밑줄 그어진 pTA 신호 서열 및 S1/S2, S2' 및 HR1 부위에 치환을 갖는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(예를 들어, 스파이크 단백질)(SEQ ID NO: 19)이다.
도 24는 밑줄 그어진 pTA 신호 서열 및 S1/S2, S2', HR1, 융합 펩타이드 및 ER 보유 모티프 부위에 치환을 갖는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(예를 들어, 스파이크 단백질)(SEQ ID NO: 20)이다.
도 25는 기준선 대비 29 일에 GMR로 제시된 항-벡터 항체 및 발견된 복제 적격 바이러스가 없는(폴리머라제 연쇄 반응("PCR") 검정을 통해 결정하는 경우) (본 발명의 1가 인플루엔자 백신 조성물(예를 들어, NasoVAX))의 투여 후 2 주에 존재하지 않는 용량-의존적 벡터 발산을 보여주고, 여기서 최고 용량에서 1 개월 후에 단지 2.3 배 유도가 나타났다. 본 발명의 1가 인플루엔자 백신 조성물은 제한된 항-벡터(Ad-벡터) 면역 반응을 갖는 일시적인 발산(AdVector)을 나타낸다.
도 26은 체액(29 일에 "HAI" 또는 미세중화 "MN"), 점막(29 일에 "IgA") 및 세포(8 일에 "ELISpot")에 대해 측정한 경우의 기존(기준선 Ad5 혈청상태) 항-벡터(Ad5) 면역의 NasoVAX 투여(고용량; 11×1011 vp)의 효과를 보여주고, 여기서 Ad5 혈청음성 또는 Ad5 혈청양성 대상체 사이에 면역 반응의 차이는 관찰되지 않았다. Ad5+ 대상체의 중간 역가는 정량 하한(LLOQ)보다 22 배 높았다.
도 27은 전체 SARS-CoV-2 프로테옴에 걸친 고친화성 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 프로파일이다.
도 28은 전체 SARS-CoV-2 프로테옴에 걸친 고친화성 및 중간정도의 친화성 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 프로파일이다.
도 29는 SEQ ID NO: 328에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 30은 SEQ ID NO: 329에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 31은 SEQ ID NO: 330에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 32는 SEQ ID NO: 331에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 33은 SEQ ID NO: 332에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 34는 SEQ ID NO: 333에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 35는 SEQ ID NO: 334에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 36은 SEQ ID NO: 335에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 37은 SEQ ID NO: 336에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 38은 SEQ ID NO: 337에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 39는 SEQ ID NO: 338에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 40은 SEQ ID NO: 339에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 41은 SEQ ID NO: 340에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 42는 SEQ ID NO: 341에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 43은 SEQ ID NO: 342에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 44는 SEQ ID NO: 343에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 45는 SEQ ID NO: 344에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 46은 SEQ ID NO: 345에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 47은 SEQ ID NO: 346에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 48은 SEQ ID NO: 347에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 49는 SEQ ID NO: 348에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 50은 SEQ ID NO: 349에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 51은 SEQ ID NO: 350에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 52는 SEQ ID NO: 351에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 53은 SEQ ID NO: 352에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 54는 SEQ ID NO: 353에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 55는 SEQ ID NO: 354에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 56은 SEQ ID NO: 355에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 57은 SEQ ID NO: 356에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 58은 SEQ ID NO: 357에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 59는 SEQ ID NO: 358에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 60은 SEQ ID NO: 359에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 61은 SEQ ID NO: 360에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 62는 SEQ ID NO: 361에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 63은 SEQ ID NO: 362에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 64는 SEQ ID NO: 363에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 65는 SEQ ID NO: 364에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 66은 SEQ ID NO: 365에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 67은 SEQ ID NO: 366에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 68은 SEQ ID NO: 367에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 69는 SEQ ID NO: 368에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 70은 SEQ ID NO: 369에 대한 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이다.
도 71은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15에 제시된 바와 같음)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터 상이한 시점에 수득된 기관지폐포 세척액으로부터의 혈청 중 항-SAR-CoV-2 IgG(μg/ml)(A), BAL 항-SARS-Cov-2 IgG(ng/ml)(B) 및 BAL 항-SARS-CoV-2 IgA(ng/ml)(C)의 측정이다. 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현되었다. 0 일은 모든 그룹에 대한 대조 값을 보고한 것이다. 2 개의 비강내 용량을 받은 그룹의 경우 7 일 및 14 일은 동일한 용량으로 단일 투여를 받은 그룹으로부터의 값을 보고한 것이다.
도 72는 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 10 마리의 C57BL/6 마우스에서 병소 감소 중화 시험(PRNT)에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화 항체이다. 각각의 그래프(도 72A 내지 도 72J)는 1 마리의 면역화된 마우스로부터 얻어진 결과에 해당한다. 검정색 선은 음성 대조 혈청에 해당하고, 적색 선은 시험된 혈청 샘플에 해당한다.
도 73은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 중간-용량을 받은 5 마리의 C57BL/6 마우스에서 병소 감소 중화 시험(PRNT)에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화 항체이다. 각각의 그래프(도 73A 내지 도 73E)는 1 마리의 면역화된 마우스로부터 얻어진 결과에 해당한다. 검정색 선은 음성 대조 혈청에 해당하고, 적색 선은 시험된 혈청 샘플에 해당한다.
도 74A 내지 도 74L은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 폐에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 75A 내지 도 75E는 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 중간 용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 기관지폐포 세척액에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 76A 내지 도 76J는 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 종격동 림프절에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 77A 내지 도 77L은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 비장에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 78은 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터 상이한 시점에 수득된 기관지폐포 세척액(BAL)으로부터의 혈청 중 항-SAR-CoV-2 IgG(μg/ml)(A), BAL 항-SARS-2 S IgA(ng/ml)(B) 및 BAL 항-SARS-CoV-2 IgA(ng/ml)(BAL)(C)의 측정이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다. 0 일은 모든 그룹에 대한 대조군 값을 보고한 것이다. 2 개의 비강내 용량을 받은 그룹의 경우 7 일 및 14 일은 동일한 용량으로 단일 투여를 받은 그룹으로부터의 값을 보고한 것이다.
도 79는 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 5 마리의 C57BL/6 마우스에서 병소 감소 중화 시험(PRNT)에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화 항체이다. 각각의 그래프는 1 마리의 면역화된 마우스로부터 얻어진 결과(도 79A 내지 도 79E)에 해당한다. 검정색 선은 음성 대조 혈청에 해당하고, 청색 선은 양성 대조에 해당하고, 적색 선은 시험된 혈청 샘플에 해당한다.
도 80은 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 중간-용량을 받은 5 마리의 C57BL/6 마우스에서 병소 감소 중화 시험(PRNT)에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화 항체이다. 각각의 그래프는 1 마리의 면역화된 마우스로부터 얻어진 결과(도 80A 내지 도 80E)에 해당한다. 검정색 선은 음성 대조 혈청에 해당하고, 청색 선은 양성 대조에 해당하고, 적색 선은 시험된 혈청 샘플에 해당한다.
도 81A 내지 도 81L은 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 폐에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 82A 내지 도 82E는 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 중간 용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 기관지폐포 세척액에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 83A 내지 도 83J는 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 종격동 림프절에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 84A 내지 도 84L은 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 개별 C57BL/6 마우스로부터의 비장에서 면역 세포의 유세포 분석이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 85는 RBD 도메인(SEQ ID N0: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 1 개 또는 2 개 비강내 용량을 받은 개별 CD-1 마우스로부터 상이한 시점에 수득된 기관지폐포 세척액(BAL)에서 혈청 중 항-SAR-CoV-2 IgG(μg/ml)(A), BAL 항-SARS-CoV-2 IgG(ng/ml)(B) 및 BAL 항-SARS-COV-2 IgA(ng/ml)(C)의 측정이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다. 0 일은 모든 그룹에 대한 대조군 값을 보고한 것이다. 2 개의 비강내 용량을 받은 그룹의 경우 7 일 및 14 일은 동일한 용량으로 단일 투여를 받은 그룹으로부터의 값을 보고한 것이다.
도 86은 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 용량을 받은 개별 CD-1 마우스로부터 상이한 시점에 수득된 기관지폐포 세척액으로부터의 혈청 중 항-SAR-CoV-2 IgG(μg/ml)(A), BAL 항-SARS-CoV-2 IgG(ng/ml)(B) 및 BAL 항-SARS-CoV-2 IgA(ng/ml)(C)의 측정이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다. 0 일은 모든 그룹에 대한 대조군 값을 보고한 것이다.
도 87a 내지 도 87e는 SARS-CoV-2 연결된 다단백질이고; SEQ ID NO: 1로부터 유래된다(젠뱅크: MN908947.3).
도 88은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터("RBD 벡터")의 단일 비강내 용량을 받은 개별 CD-1 마우스 또는 A195 완충액만을 받은 대조군으로부터 10 일차 폐 T 세포(A) 및 14 일차 폐 T 세포(B) 및 10 일차 비장 T 세포(C) 및 14 일차 비장 T 세포(D)의 측정이다. 그룹에 대한 결과는 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간으로 표현된다.
도 89는 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터("RBD 벡터")의 단일 비강내 용량을 받은 또는 대조 A195 완충액만을 받은 개별 CD-1 마우스로부터 14 일차의 폐 CD4+ IFN-g+ CD11a+ T 세포(A), 폐 CD4+ TNF-a+ CD11a+ T 세포(B), 폐 CD4+ IFN-g+ CD11a+ T 세포(C) 및 폐 CD4+ TNF-α+ CD11a+ T 세포(D)의 측정이다. 유세포 분석 전에, 세포는 2 mcg/펩타이드/mL의 RBD 펩타이드 풀로 재자극되었다. 선은 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간에 해당한다.
도 90은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터("RBD 벡터")의 단일 비강내 용량을 받은 또는 대조 A195 완충액만을 받은 개별 CD-1 마우스로부터 14 일차의 비장 CD4+ IFN-g+ CD11a+ T 세포(A), 비장 CD4+ TNF-a+ CD11a+ T 세포(B), 비장 CD4+ IFN-g+ CD11a+ T 세포(C) 및 비장 CD4+ TNF-α+ CD11a+ T 세포(D)의 측정이다. 선은 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간에 해당한다.
도 91은 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터("RBD 벡터")의 단일 비강내 용량을 받은 또는 대조 A195 완충액만을 받은 개별 CD-1 마우스로부터 14차의 조직-상주 기억 T 세포(TRM) 마커 CD103 및 CD69를 발현하는 폐 상주 기억 CD4+(A) 및 CD8+(B) T 세포의 측정이다. 선은 기하 평균 반응 +/- 95% 신뢰 구간에 해당한다.
도 92는 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일 비강내 고용량을 받은 10 마리의 CD-1 마우스에서 병소 감소 중화 시험(FRNT)에 의해 측정된 SARS-CoV-2에 대한 혈청 중화 항체이다. 각각의 그래프는 1 마리의 면역화된 마우스로부터 얻어진 결과(도 92A 내지 도 92J)에 해당한다. 검정색 선은 음성 대조 혈청에 해당하고, 적색 선은 시험된 혈청 샘플에 해당한다.
도 93은 S1 또는 RBD 벡터 감염된 세포에서 스파이크 트랜스진의 발현 및 검출이다. Per.C6 세포는 MOI:5에서 각각 S1(SEQ ID NO: 13) 또는 RBD(SEQ ID NO: 15) 벡터("S1 벡터" 또는 "RBD 벡터")로 감염되었다. 감염 24 시간 후에, 세포가 수확되고, 고정되고, 투과된 다음, 마우스 중화 스파이크-특이적 단클론성 항체 MM-43(상부 패널) 또는 MM-57(하부 패널)로 채워진 히스토그램으로 염색되었다. 감염되지 않은 세포가 음성 대조로 사용되었다(개방 히스토그램).
도 94는 S1 벡터 및 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 후 혈청에서 SARS-CoV-2 중화 항체 반응이다. A: 지시된 바와 같은 중간 또는 고용량의 S1 또는 RBD 벡터로 28 일 전에 백신접종된 C57BL/6 또는 CD-1 마우스에 의한 중화 항체 반응. 결과는 허용되는 Vero E6 세포의 야생형 SARS-CoV-2 감염의 50% 중화(FRNT50)를 달성하는 데 필요한 혈청 샘플의 희석의 역수로 표현된다. 선은 그룹 중앙 값을 나타낸다. B: 백신접종된 동물의 혈청에서 중화 항체 반응과 스파이크-특이적 IgG 반응 사이의 상관관계. 상관 분석은 양측 스피어만(Spearman) 검정으로 수행되었다. RBD 벡터를 사용한 고용량 비강내 백신접종은 10/10 마리의 C57BL/6 및 8/10 마리의 CD-1 마우스에서 배경 초과의 중화 항체 반응을 유도하였다.
도 95는 RBD 벡터로의 단일 비강내 투여 14 일 후에 폐 상주 기억 T 세포에 의한 세포내 사이토카인 생산이다. CD-1 마우스는 실시예 17에 기재된 바와 같이 비히클(Ctrl) 또는 고용량 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 제공받았다. 폐 세포(n = 10 마리 마우스/백신, 3 마리 마우스/대조)는 14 일에 단리되고, 5 시간 동안 RBD 펩타이드 풀로 재자극되고, CD69+CD103+ 상주 기억 T 세포(Trm)를 확인하기 위해 유세포 분석에 의해 분석되었다. 결과는 개별 마우스에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 %로 표현된다. 선은 그룹에 대한 평균 반응 +/- SD로 제시되었다. 통계 분석은 맨-휘트니(Mann-Whitney) 검정으로 수행되었다: *, P < 0.05; **, P <0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 96는 RBD 벡터로의 단일 비강내 투여 10 일 후에 비장 T 세포에 의한 분비된 사이토카인 생산이다. CD-1 마우스는 실시예 18에 기재된 바와 같이 비히클(Ctrl) 또는 고용량 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 제공받았다. 비장 세포(n= 10 마리 마우스/백신, 3 마리 마우스/대조)는 10 일차에 단리되고 48 hr 동안 RBD 펩타이드 풀로 재자극되었다. 분비된 사이토카인은 사이토카인 멀티플렉스 검정을 사용하여 상청액에서 검출되었다. 결과는 pg/ml로 표현된다. 선은 평균 반응 +/- SD를 나타낸다. 통계 분석은 맨-휘트니 검정으로 수행되었다: *, P < 0.05; **, P <0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001.
도 97은 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 후 종방향 스파이크-특이적 혈청 IgG 반응이다. C57BL/6J 마우스(n=20)는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. 백신접종 전 0 일 및 백신접종 후 15 일, 30 일, 63 일 및 120 일에 혈청이 수집되고, 스파이크-특이적 IgG의 정량화를 위해 개별적으로 분석되었다. 결과는 μg/ml로 표현된다. 실시예 18을 참조한다.
도 98은 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 후 골수 및 폐에서 IgG 및 IgA 항체가 생산된 RBD-특이적 항체 분비 세포("ASC")의 정량화이다. CD-1 마우스(n=5)는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. 폐 세포(LG) 및 골수 세포(BM)를 면역화 69 일 후에 수집하고("69 dpi"), ELISpot에 의한 ASC의 정량화를 위해 개별적으로 분석하였다. (A)는 B-세포 ELISpot 플레이트 웰의 예를 보여준다. (B)는 골수에서 106 개의 총 세포 당 수 또는 빈도로서 제시된 IgG 및 IgA를 생산한 RBD-특이적 ASC의 측정을 보여준다. (C)는 폐에서 106 개의 총 세포 당 수 또는 빈도로서 제시된 IgG 및 IgA를 생산한 RBD-특이적 ASC의 측정을 보여준다. 실시예 19을 참조한다.
도 99는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 후 168 일에 장기 지속형 RBD-특이적 기억 B 세포의 정량화이다. C57BL/6J(n=4) 마우스는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. 종격동 림프절이 면역화 후 168 일(24 주)에 수집되고 유세포 분석에 의한 RBD-특이적 기억 B 세포의 정량화에 대해 개별적으로 분석되었다. 나이브 C57BL/6J(n=5)가 음성 대조로서 사용되었다. (A)는 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 보여준다. (B)는 나이브 동물과 비교하여 백신접종된 동물에서 측정된 RBD 특이적 기억 B 세포의 절대 수를 보여준다. 실시예 20을 참조한다.
도 100은 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 후 골수에서 IgG 및 IgA 항체를 생산한 장기 지속형 RBD-특이적 ASC의 정량화이다. C57BL/6J(n=4) 마우스는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. 골수 세포(BM)가 면역화 후 168 일(24 주)에 수집되고, ELISpot에 의한 ASC의 정량화에 대해 개별적으로 분석되었다. 나이브 C57BL/6J(n=5)가 음성 대조로서 사용되었다. (A)는 B-세포 ELISpot 플레이트 웰의 예를 보여준다. (B)는 골수에서 106 개의 총 세포 당 수로서 제시된 IgG 및 IgA를 생산한 RBD-특이적 ASC의 측정을 보여준다. 실시예 20을 참조한다.
상세한 설명
본 개시는 적어도 하나의 2019 신종 코로나바이러스 SARS-CoV-2 항원(들)("SARS-Cov-2 트랜스진")을 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신), 이를 포함하는 조성물, 및 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 아데노바이러스는 유전 물질을 세포에 도입하기 위한 벡터로서 빈번하게 사용된 자연 발생 호흡기 바이러스이며, 여기서 아데노바이러스 벡터는 SARS-CoV-2 항원 유전자를 비강 점막의 세포에 형질도입하여(비강내 투여를 통해), 이러한 세포에서 코딩된 SARS-CoV-2 항원 단백질 또는 이의 펩타이드의 일시적인 발현을 야기할 수 있다. 정상 인간 상피 세포에서 SARS-CoV-2 항원의 후속 생산은 자연적으로 순환하는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV-2)에서 발생하기 때문에 SARS-CoV-2 항원에 대한 면역 반응을 가능하게 한다. 처음에 2019-nCoV로 보고된 SARS-CoV-2는 2019년 12월에야 출현한 새로운 고병원성 바이러스이다. 인간에서, SARS-CoV-2는 세계 보건 기구(WHO)에 의해 공식적으로 정의된 바와 같이 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)로 칭해지는 병에 원인이 된다. 본원에 개시된 조성물은 SARS-CoV-2를 표적화하는 최초의 조성물 중 하나이며, COVID-19 및 관련 질병에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 본원에 개시된 면역원성 조성물은 이러한 신종의 병원성인 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 예방 및 치료를 제공하며, 이에 대해서는 이전 치료가 존재하지 않았고 팬데믹의 가능성이 남아 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[FDA Guidance for Industry "Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19" June 2020] 및 문헌[FDA Guidance for Industry "Emergency Use Authorization for Vaccines to Prevent COVID-19" October 2020]에 의해 정의된 바와 같이 COVID-19를 예방하고/예방하거나 이의 중증도를 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 COVID-19의 감염 또는 바이러스학적으로 확인된 무증상 또는 증상 사례의 발병률을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 중증 및/또는 중증이 아닌(경증 또는 중등도) COVID-19의 발병률 또는 COVID-19 관련 입원의 발병률을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 경증 또는 중등도의 COVID-19의 발병률을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 중증 COVID-19의 발병률을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 COVID-19-관련 응급실 방문, COVID-19 입원 및/또는 COVID-19-관련 사망의 발생률을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 COVID-19-관련 질병의 중증도를 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2의 전염을 감소시킨다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2의 전염을 감소시킨다.
실시양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원(예를 들어, E1A/E3 결손 인간 아데노바이러스 유형 5(hAd5)(hAd5-SARS-CoV-2)) 및/또는 상이한 유형의 감염원(예를 들어, 상이한 유형의 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자(예를 들어, Ad-HA))의 또 다른 하나 이상의 외인성 항원을 코딩하거나, 트랜스진이 없는("hAdE"; 예를 들어, 외인성 감염원의 적어도 하나의 항원 또는 면역원을 코딩하지 않는 "빈") 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 뿐만 아니라, 예를 들어, 코딩 서열(들)을 벡터(들)에 함유 및/또는 삽입하기 위한 발현 카세트로서, 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원(및/또는 상이한 유형의 감염원의 또 다른 또는 하나 이상의 외인성 항원)을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 이러한 벡터는 본원에서 총괄하여 "SARS-CoV-2 면역화 벡터"로 지칭된다. 본원에 논의된 바와 같이, 이러한 SARS-CoV-2 면역화 벡터(및/또는 이를 포함하는 면역원성 조성물)는 바람직하게는 SARS-CoV-2에 대항하여(예를 들어, 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)과 같은 보호성 SARS-CoV-2 에피토프에 대항하여) 점막, 세포-매개 및/또는 체액 면역 반응을 유도하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 이러한 SARS-CoV-2 면역화 벡터(및/또는 이를 포함하는 면역원성 조성물)는 예방적으로 사용되는 경우 벡터의 적응성 면역을 지원하거나 노출 전 기간(감염 며칠 전) 또는 노출 후 기간 동안 투여되는 경우 SARS-CoV-2 감염을 직접 방해하여 선천성 면역 반응을 자극한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2 T 세포 에피토프(들)(예를 들어, 우성 에피토프)에 대해 특이성을 갖는 면역 반응(예를 들어, 항체 및/또는 CD8+ T 세포(및/또는 다른 T 세포)의 생산)을 유도하고/유도하거나 증진시키는 동물 및/또는 인간에 대한 이러한 벡터(예를 들어, hAd5-SARS-CoV-2 및/또는 hAd5)의 투여를 기술한다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성이고/보호성이거나 SARS-CoV-2에 의한 증상 및/또는 감염을 호전시키고/호전시키거나 SARS-CoV-2의 전염을 감소시키는 데 효과적이며, 일부 실시양태에서 SARS-CoV-2 공격에 대해 보호성일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2 전염 및 감염과 관련하여 당 분야에서 인지되는 문제들에 대한 해결책을 제공하기 위한 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 면역원성 조성물(들)의 용도를 기술한다.
실시양태에서, SARS-CoV-2 항원은 본원에 개시된 바와 같은, 또는 달리 당업자에게 이용 가능할 수 있는 바와 같은 스파이크(S) 항원 또는 다른 SARS-CoV-2 항원일 수 있다. 특정 실시양태에서, SARS-CoV-2 항원은 SARS-CoV-2(또는 밀접하게 관련된 SARS 단리물)의 다중 균주로부터 스파이크 항원의 서열로부터 유래된 전장 스파이크(S) 단백질, 이의 면역원성 단편, 또는 컨센서스 스파이크(S) 항원일 수 있으며, SARS-CoV-2는 2019/2020 발발 동안 확인되고 젠뱅크 MN908497; NCBI 참조 서열: NC_045512.2 "우한 해산물 시장 폐렴 바이러스 단리물 우한-Hu-1"(본원에 참조로 포함됨)로서 처음 시퀀싱되고 제공되었다(또한, 인터넷 doi.org/10.1038/s41591-021-01255-3을 통해 이용 가능한 문헌[Tegally et al., "Sixteen novel lineages of SARS-CoV-2 in South Africa", Nat Med (2021)](Tegally에 인용된 모든 데이터 및 코드(확장 데이터 포함)와 함께 본원에 참조로 포함되고, Tegally 등에 인용된 모든 참고문헌이 또한 본원에 참조로 포함됨); doi: 10.23812/21-3-E에서 인터넷을 통해 이용 가능한 문헌[Conti et al., "The British variant of the new coronavirus-19 (Sars-Cov-2) should not create a vaccine problem", J Biol Regul Homeost Agents", Dec 30;35(1) (2020)](본원에 참조로 포함됨); doi.org/10.1016/ S1473-3099(21)00007-4에서 온라인으로 이용 가능한 문헌[Fiorentini et al., "First detection of SARS-Cov-2 spike protien N501 mutation in Italy in August, 2020", Lancet Infect Dis (2021)](이로써 본원에 또한 참조로 포함되는 Fiorentini에 인용된 참고문헌과 함께 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트는 스파이크 단백질의 적어도 S1 및/또는 S2 도메인, 또는 이의 면역원성 단편(예를 들어, 스파이크 단백질의 S1 도메인의 RBD 서열)을 포함한다. 도 13, 도 14 및 도 15를 참조한다. 일부 실시양태에서, 융합전 안정화된 스파이크 단백질이 사용될 수 있다(예를 들어, MERS 및 SARS에서 개선된 발현을 나타내는 바와 같이(예를 들어, 미국 특허 공개 제2020/0061185 A1호(Graham, et al.; 예를 들어, 이의 도 4 참조), S2(HR1 도메인)에 프롤린 잔기를 도입하고, S1/S2 절단 부위에서 야생형 아미노산 서열 NSPRRARSVAS(SEQ ID NO: 450)를 NSPQQAQSVAS(SEQ ID NO: 451)로 치환(QQAQ 돌연변이), S2' 절단 부위에서 KRSFIEDLLFNKVTLADA(SEQ ID NO: 452)를 KRSFIADA(SEQ ID NO: 453)로(융합 펩타이드 절단, 819-828 결실), 및/또는 SRLDPPEAEV(SEQ ID NO: 454)를 SRLDPPEAEV(SEQ ID NO: 455)로(2P 돌연변이, K986P/V987P) 치환함으로써). 다른 유형의 S 단백질/항원의 사용이 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다. 하기 안정화된 스파이크 단백질 항원 설계 섹션을 참조한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트는 S1의 수용체 결합 도메인(RBD) 및/또는 N-말단 도메인(NTD)을 포함한다. 예를 들어, 도 13, 도 16 내지 도 21을 참조한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 SEQ ID NO: 3을 코딩하는 코딩 서열(도 3a), 또는 SEQ ID NO: 3의 적어도 하나의 도메인 서열(예를 들어, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프), 또는 적어도 SEQ ID NO: 446을 코딩하는 RBD 도메인 코딩 서열(도 3b)을 포함한다. 실시양태에서, SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 아데노바이러스 벡터는 1가 또는 다가(즉, 하나, 또는 하나 초과의 항원 에피토프)일 수 있다. 실시양태에서, 발현 카세트는 코딩된 서열의 더 나은 발현 및 분비를 위한 리더 서열(예를 들어, tPA)을 포함하며, 여기서 코딩 서열은 선택적으로 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)에 코돈 최적화된다. 실시양태에서, 발현 카세트는 RBD 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 446)을 포함하며, 이는 선택적으로 SARS-CoV-2 바이러스에 고유한 긴 또는 짧은 측접 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 14 및 15)을 추가로 포함하여, 이의 고유의 구형 입체형태의 RBD의 발현을 향상시킬 수 있다. 실시양태에서, 면역원성 조성물은 각각 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원(들)을 코딩하는 하나 이상의 재조합 아데노바이러스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 인간 대상체를 포함하는 포유동물 대상체에서 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 코로나바이러스 항원 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 면역원성 조성물은 세포(T 세포), 체액(B 세포) 및/또는 점막, 또는 이들의 조합일 수 있는 적응성(특이적) 면역 반응을 프라이밍, 강화, 활성화, 유발, 자극, 증대, 부스팅, 증폭 또는 증진시킬 수 있는 임의의 하나 이상의 Ad-벡터화된 화합물 또는 작용제 또는 발현된 면역원 및/또는 항원을 지칭한다. 세포 반응은 비점막 또는 기도에서의 말초 T 세포 반응 또는 상주 T 세포 반응일 수 있다. 또한, 세포 반응은 바람직하게는 항바이러스 표현형(예를 들어, 생산 인터페론-감마의 생산)을 갖는 CD8+ T 세포 및/또는 CD4+ T 세포에 의해 구동될 수 있다. 바람직하게는, 적응성 면역 반응은 보호성이며, 이는 바이러스의 중화(바이러스 감염성 감소 또는 제거) 및/또는 증상 또는 바이러스 발산(즉, 전염)의 감소를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 점막 선천성 면역 반응을 포함하는 선천성 면역 반응의 활성화를 통해 코로나바이러스에 대한 치료제로서 빈(즉, Ad5 게놈에 코딩된 외인성 비-Ad 병원체 항원이 없는) 아데노바이러스 벡터(AdE)를 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다. 실시예 2을 참조한다. 일부 실시양태에서, 단일 비강내 투여는 SARS-Cov-2에 노출되기 약 2 일 내지 약 20 일 전에 AdE가 투여될 때 보호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 투여는 백신접종 후와 공격 후 둘 모두에 증가된 수준의 MCP-1 및 IFN-γ을 유도하여 단핵구, 호중구, 및/또는 림프구의 동원을 야기할 수 있고, 이는 이후 IFN-γ의 생산을 자극할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물의 투여는 COVID-19에서 폐 간질 염증을 매개하는 것으로 입증된 사이토카인인 IL-1α, IL-6, 및/또는 IL-12p70의 유의한 감소(예를 들어, 위약 대조와 비교하여)를 유도할 수 있다. 실시예 7을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위해 AdE 벡터(즉, Ad5 게놈에 코딩된 외인성 비-Ad 병원체 항원이 없는 복제 결핍 ΔE1E3 아데노바이러스 유형 5(Ad5)) 바이러스 입자)의 비강내(i.n.) 투여를 위한 시약(예를 들어, 면역원성 조성물) 및 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 AdE 면역원성 조성물은 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임), 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 생성된 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성이다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신이다). 바람직한 실시양태에서, 이러한 AdE 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 감염된 인간(예를 들어, 입원 환자)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 실시예 3을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 프로모터(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV))에 작동 가능하게 연결된 리더 서열(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)) 및 적어도 하나의 SARS-CoV-2 단백질(들)(예를 들어, SEQ ID NO: 2-11 중 어느 하나 이상, 및/또는 하나 이상의 이의 단편(들) 및/또는 유도체(들))을 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 E1/E3 결손 복제 결함 hAd5, 면역원성 조성물 및 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 이를 사용하기 위한 방법을 제공한다. 실시예 4를 참조한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 코딩 서열은 hAd5의 E1 영역에 삽입된다("hAd5-SARS-CoV-2"). 일부 실시양태에서, hAd5-SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(수탁 번호 QHD43416.1(SEQ ID NO: 3))의 S1 도메인(잔기 16 내지 685(예를 들어, 실시예 14, 16 참조)) 또는 RBD 도메인(S1 도메인의 잔기 331-527(예를 들어, 실시예 15, 17 참조))에 대한 인간 코돈-최적화된 유전자를 발현시키기 위한 복제-결핍 E1- 및 E3-결실 아데노바이러스 유형 5 벡터 플랫폼(Tang et al 2009)에 기반할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 Ad5-벡터화된 S1 및 RBD 트랜스진은 인간 조직 플라스미노겐 활성제 리더 서열을 포함하고, 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터/인핸서의 제어 하에 발현될 수 있다(예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 15의 바람직한 실시양태 참조). 일부 실시양태에서, 인간은 중화 항체가 유도되도록 충분한 수의 hAd5-SARS-CoV-2 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)로 비강내(i.n.) 면역화될 수 있다. 일부 실시양태에서, hAd5-SARS-CoV-2 백신은 질병 중증도의 감소로 이어지는 보호 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, hAdv5-SARS-CoV-2 조성물은 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(즉, 이는 면역원성 조성물임) 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 일부 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 감염된 환자(예를 들어, 입원 환자)에서 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간을 개선할 수 있다. 실시예 5를 참조한다. 일부 실시양태에서, 스파이크 단백질의 RBD 도메인(예를 들어, 바람직한 실시양태 SEQ ID NO: 15 참조)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터의 단일(또는 프라임-부스트 일정의 일부로서, 동일하거나 상이한 면역원성 조성물) 비강내 투여는 혈청에서 IgG 항체의 생산을 자극하여, 포유동물, 바람직하게는 인간에서 전신 반응의 유도뿐만 아니라 IgG 및 IgA 항체의 생산을 지시한다. 바람직한 실시양태에서, 고용량 백신의 단일 투여를 받은 동물은 병소 감소 중화 시험(FRNT)에 의해 측정하는 경우 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체의 존재(바람직하게는 지속적(예를 들어, 실시예 18 참조))를 나타내고/나타내거나 상이한 면역 구획에서 선천성 및 후천성 면역 세포의 동원 및/또는 증식을 유도한다(실시예 13B 참조). 바람직한 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물의 투여는 유세포 분석을 사용하여 결정될 수 있는 바와 같이, 포유동물, 바람직하게는 인간에서 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 T 세포 면역(예를 들어, 바람직한 실시양태에서 Th-1-편향 반응)을 유도할 수 있다(예를 들어, 실시예 17 참조). 바람직한 실시양태에서, hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 면역원성 조성물은 포유동물에게 단일 비강내 용량으로 투여될 때, 적어도 4 개월, 적어도 약 5 개월, 적어도 약 6 개월, 적어도 약 7 개월, 적어도 약 8 개월, 적어도 약 9 개월, 적어도 약 10 개월, 적어도 약 11 개월, 또는 적어도 약 12 개월(1 년)동안 지속되는 스파이크 단백질에 대한 항체 반응을 유도할 수 있다. 실시예 18을 참조한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물(예를 들어, RBD 벡터와 같은 hAd5-SARS-CoV-2)의 투여는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 골수 및 폐 상주 기억 항체 분비 세포(예를 들어, 바람직한 실시양태에서 항-스파이크 IgG와 IgA 둘 모두를 분비하는 골수 및 폐 상주 기억 항체 분비 세포)를 유도할 수 있다. 실시예 19을 참조한다. 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 스파이크 RBD 서열(예를 들어, 바람직한 실시양태 SEQ ID NO: 15 참조)을 발현하는 복제 부적격 Ad5 벡터의 비강내 투여는 특히, 감염 및 임상 질환의 주요 부위를 나타내는 폐에서 점막 부위와 전신 부위 둘 모두에서 체액 및 세포 면역 반응을 생성할 수 있다(예를 들어, 실시예 20 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위해 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터의 조합물(예를 들어, "조합된 SARS-CoV-2 조성물")의 비강내(i.n.) 투여 방법을 제공한다. 실시예 10을 참조한다. 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 성분(예를 들어, AdE, AdD, 및/또는 hAd5-SARS-CoV-2; 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 지칭하는 "AdD"는 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 발현하지 않지만 상이한 유형의 감염원(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)의 하나 이상의 항원을 발현하는 것일 수 있고; 코로나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 rdAd 벡터를 지칭하는 "AdE"는 외인성 항원을 발현하지 않는 것일 수 있고(아데노바이러스 벡터가 유래된 아데노바이러스에 대해 외인성임); "rdAD" 또는 "rdAd"는 복제-결함 아데노바이러스를 지칭함)은 단일 조성물 내에 함유될 수 있거나 동시에 또는 상이한 시간에(예를 들어, 프라임-부스트 프로토콜의 일부로서) 및 대상체(예를 들어, 포유동물, 바람직하게는 인간)의 동일하거나 상이한 부위에 투여될 수 있는 상이한 조성물에 함유될 수 있다. 바람직한 프라임 부스트 프로토콜은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 제1 조성물을 투여한 후, 적절한 시간 후에(일부 바람직한 실시양태에서, 7 일 내지 21 일 후, 바람직하게는 7 일 후에) 제2 조성물을 투여하는 것(즉, 제1 및 제2 조성물의 개별 투여)를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 조성물은 동일하거나 상이한 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 상기 면역원성 조성물(들)이 투여되는 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체, IgA 및/또는 세포 면역 반응(들) 및/또는 본원에 개시된 다른 반응(들)을 유도(예를 들어, Covid-19 환자의 입원을 막거나 입원 시간을 단축)하도록 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 허용되는 안전성 프로파일로 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임). 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 조합된 SARS-CoV-2 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터; b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원(즉, hAd5-SARS-CoV-2)을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는, rdAd 벡터; c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터; d) a) 및 b)의 벡터의 조합; e) b) 및 c)의 벡터의 조합; f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합; 및/또는 g) b)(즉, hAd5-SARS-CoV-2)의 2 개의 상이한 유형의 rdAd 벡터의 조합을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 유형은 조합("다가 COVID-19 백신")에서 적어도 하나의 다른 유형의 hAd5-SARS-CoV-2 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 성분은 AdE 및/또는 AdD 중 하나 또는 둘 모두 및/또는 하나 이상의 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 인간에게 투여되는 AdE 및/또는 AdD를 포함하는 제1 조성물, 및 이어서 적어도 하나의 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 적어도 2 개의 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 유형의 hAd5-SARS-CoV-2는 조합에서 다른 유형(들)의 hAd5-SARS-CoV-2 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 제1 SARS-CoV-2 항원을 발현하는 제1 유형의 hAd5-SARS-CoV-2 및 제2 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 제2 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함할 수 있고, 제2 SARS-CoV-2 항원은 제1 SARS-CoV-2 항원과 상이하다. 일부 실시양태에서, 조합된 SARS-CoV-2 조성물은 인간에게 투여되는 AdE, AdD, 및/또는 제1 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 제1 조성물을 포함할 수 있고, 이어서 적절한 시점 이후에(일부 바람직한 실시양태에서 7 일 내지 21 일 후, 바람직하게는 7 일 후) 제1 유형의 hAd5-SARS-CoV-2와 상이한 적어도 하나의 제2 유형의 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 제2 조성물이 투여(또는 제1 조성물이 AdE 또는 AdD인 경우 먼저)된다(즉, 제1 및 제2 조성물의 개별 투여).
일부 실시양태에서, 본 개시는 AdD 벡터(즉, SARS-CoV-2 이외의 감염원, 예를 들어, 인플루엔자, 예컨대, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 발현하는 AdVector(Ad5)인 NasoVAX로부터 유래된 병원체 항원을 코딩하는 복제 결핍 ΔE1E3 아데노바이러스 타입 5(Ad5) 바이러스 입자)의 비강내(i.n.) 투여를 포함하는 면역원성 조성물 및 방법을 제공하고, NasoVAX는, 예를 들어, 2019년 4월 06일에 출원된 미국 출원 일련 번호 제62/830,444호로부터 우선권을 주장하고 US 2020/0316188호로서 공개된 2020년 4월 6일에 출원된 미국 출원 일련 번호 제16/840,723호(NasoVAX의 제조가 개시되어 있음)에 기재되어 있고(이들 각각은 각각의 이들 출원 및 간행물에 인용된 모든 참고문헌과 함께 본원에 참조로 포함됨); 예를 들어, 또한 미국 특허 제6,706,693호; 제6,716,823호; 제6,348,450호; 및 각각에서 인용된 모든 참고문헌과 함께 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제2003/0045492호; 제2004/0009936호; 제2005/0271689호; 제2007/0178115호; 및 제2012/0276138호(SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위해, 인플루엔자 항원을 포함하고 발현할 수 있는, 포유동물에 대한 투여를 위해 제조된 아데노바이러스 벡터(들)에 관한 것일 수 있음)를 참조한다(NasoVAX는 특정 산물이지만, "NasoVAX"라는 용어가 본 개시에서 사용되는 경우, 당업자는 특정 산물 모두를 읽을 수 있고, 또한 광범위하게 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 발현하는 AdVector(Ad5), 유리하게는 E1 및/또는 E3 Ad5 벡터를 읽을 수 있는 것으로 언급됨). 이러한 실시양태에서, AdD 벡터는 SARS-CoV-2 및 AdD 벡터의 발현된 외인성 항원과 관련된 병원체 둘 모두에 대해 선천성 면역 반응, 바람직하게는 보호성 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, NasoVAX(또는 보다 광범위하게는 인플루엔자 항원(들)을 발현하는 AdD 벡터를 포함하는 면역원성 조성물)는 SARS-CoV-2를 포함하는 인플루엔자와 코로나바이러스 둘 모두에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, AdD는 2 개의 호흡기 감염원에 대한 선천성 면역 반응 및 발현된 항원에 대한 보호성 적응 면역 반응을 유도하는 이중 백신이다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물은 이미 SARS-CoV-2에 감염된 환자에게 투여될 수 있고, 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간을 개선할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이후, AdD 조성물은 허용되는 안전성 프로파일과 함께 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임). 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 AdD 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 일부 실시양태에서, NasoVAX는 감염의 초기 단계에 대한 요법으로서 또는 일부 실시양태에서 직접적인 항바이러스제(예를 들어, 클로로퀸, 아지트로마이신)와 조합하여 COVID-19에 대한 병용 요법으로서 사용될 수 있다. 실시예 7을 참조한다. 일부 시점에, 원료 의약품은 벡터 단독(예를 들어, AdE에서와 같이 트랜스진 제외)이 투여되는 제품으로 전이될 수 있다. 일부 실시양태에서, NasoVAX는 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 ICU 입원 및 기계적 인공호흡의 비율을 감소시키고/감소시키거나 입원이 필요한 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 COVID-19의 중증도를 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에 NasoVAX의 투여 후 염증성 사이토카인, 예컨대, IL-1α, IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, MCP-1, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및/또는 RANTES(CCL5)(예를 들어, 실시예 2 참조)의 발현 감소가 발생할 수 있고, 일부 실시양태에서 COVID-19를 진단하고/진단하거나 COVID-19로부터의 회복을 예측하는 데 사용될 수 있고, 이에 따라 치료 프로토콜(예를 들어, 비-NasoVAX 치료)을 조정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, NasoVAX의 투여 직후 MCP1 및/또는 RANTES의 증가는 COVID-19로부터의 회복 및 증상의 호전을 예측하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 마커로서). 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 NasoVAX가 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물은 아데노바이러스 벡터 자체에 대한 유의한 면역 반응을 유도하지 않고 반복적으로(예를 들어, 약 11-14 개월마다 1 회 투여되는 계절성 백신으로서) 투여될 수 있다. 실시예 9를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 실온(예를 들어, 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 20℃ 내지 25℃)과 같은 주위 온도에서 약 3 개월 동안 안정한 아데노바이러스 벡터화된 백신 조성물(예를 들어, AdD, NasoVAX)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 아데노바이러스 벡터화된 백신 조성물은 냉장 또는 특정 저장 조건에 대한 필요 없이 저장되거나 운송될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 아데노바이러스 벡터화된 백신 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스(팬데믹 코로나바이러스 균주) 감염에 대한 면역 반응을 유도하고/유도하거나 COVID-19 질병 증상을 호전시키도록 구성될 수 있고, 환자에게 투여하기 위해(바람직하게는 비강내 투여) 사용자에게 직접 운반될 수 있다. 실시예 8을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원의 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 마우스에 대한 AdE의 투여는 인플루엔자와 같은 바이러스에 의해 유발된 감염성 질환의 진행 및 이의 증상에 관여하는 것으로 알려진 특정 사이토카인의 발현을 감소시켰다. 예를 들어, 감염되지 않은 마우스(인플루엔자에 의해)는 AdE 투여 25 일 후에 단핵구 화학유인 단백질(MCP-1(CCL2)), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 RANTES(CCL5)의 발현 증가를 나타낸 것으로 밝혀졌다. AdE의 투여 28 일 후에, 이러한 감염되지 않은 마우스는 MCP-1 및 IFN-γ의 발현 증가 뿐만 아니라 IL-12 발현의 감소를 나타냈다. 마우스는 AdE 투여 3 일 후에 인플루엔자로 공격되었는데, 마우스는 IL-1α, IL-6, IL-12, MCP-1, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 과립구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 RANTES의 발현 감소를 나타낸 것으로 밝혀졌다. AdE의 투여 육(6)일 후에, 감염된 마우스는 IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, MCP-1 및 GM-CSF의 발현 감소, 및 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α(CCL3)) 및 RANTES(CCL5)의 발현 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2에 의한 감염 동안 "사이토카인 폭풍(cytokine storm)"의 발달과 일치한다. 일부 실시양태에서, 이후, 예를 들어, 사이토카인 폭풍의 발달을 억제하거나 저지시킴으로써 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)(예를 들어, 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 항-IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP-1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들))과 함께 인간에게 투여된다. 실시예 11을 참조한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않을 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는 예시적인 항-사이토카인 시약은, 예를 들어, 본원의 표 1에 제시된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 항-사이토카인 시약은 SARS-CoV-2 면역원성 조성물과 동일한 시간에(즉, 동시에), 또는 본질적으로 동일한 시간에 유효량의 각각의 시약에 적절한 적합한 경로(예를 들어, SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 비강내 투여 및 항-사이토카인 시약(들)의 경우 피하 주사)에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 SARS-CoV-2 조성물과 공동-투여될 수 있고, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 후속하여 단독 활성제로서 투여된다. 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 조성물(들)과 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)의 조합은 허용되는 안전성 프로파일, 및 일부 환자가 경험하는 사이토카인의 유해한 영향(예를 들어, 상기 언급된 사이토카인 폭풍)과 관련된 증상의 완화와 함께 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수 있다(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임). 바람직한 실시양태에서, 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호 및/또는 치유 면역 반응이다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 조성물(들)과 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)의 조합은 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 S 단백질(스파이크 단백질) 면역원, 이의 단편, 및 변이체는 면역 반응, 바람직하게는 체액성 반응, 점막 IgA 반응 및/또는 세포-매개 면역 반응일 수 있는 보호성 면역 반응을 유발하거나 유도하는 하나 이상의 에피토프를 함유한다. 보호성 면역 반응은 다음 중 적어도 하나에 의해 나타날 수 있다: 코로나바이러스에 의한 숙주의 감염 예방; 감염의 변형 또는 제한; 감염으로부터 숙주의 회복을 보조, 개선, 증진 또는 자극; 및 코로나바이러스에 의한 후속 감염을 예방하거나 제한할 면역학적 기억 생성. 체액성 반응은 감염성을 중화시키고, 바이러스 및/또는 감염된 세포를 용해시키고, 숙주 세포에 의한 바이러스의 제거를 용이하게 하고(예를 들어, 식세포작용을 용이하게 함), 및/또는 바이러스 항원 물질에 결합하여 이의 제거를 용이하게 하는 항체의 생산을 포함할 수 있다. 항체 반응은 또한 특정 점막 IgA 반응을 유발하거나 유도하는 것을 포함하는 점막 반응을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, SARS-CoV-2 감염에 대해 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 세포-매개 보호 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 제공된다.
포유동물 대상체에 대한 비강내 투여에 적합하고/적합하거나 이를 위해 구성되고 항원(예를 들어, 면역원)에 대한 면역 반응을 유도하도록, 선택적으로 보호 면역 반응을 유도하도록(즉, 백신으로서) 구성되는 약학적으로 허용되는 조성물(제제로도 지칭될 수 있음)이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 투여 시 포유동물 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물이다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 포유동물 대상체에서 외래 감염원에 대해 보호성이고, 바람직한 실시양태에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 보호 반응을 유도하거나 자극하는 보호 면역 반응을 유도하도록 구성된 백신 또는 치료용 조성물이다.
정의
본원에서 사용되는 단수 용어("a" 또는 "an")는 특허 문서에서 일반적인 바와 같이 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 임의의 다른 경우 또는 용법과 무관하게 하나 이상을 포함하도록 사용된다.
본원에서 사용되는 "또는"이라는 용어는 비배타성을 지칭하거나, 또는 "A 또는 B"가 달리 명시되지 않는다면 "A이지만 B는 아님", "B이지만 A는 아님" 및 "A 및 B"를 포함하도록 사용된다.
본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 명시된 양과 동일하거나 이와 대략, 가깝게, 거의 동일하거나 이의 부근에 있는 양, 예를 들어, 명시된 양 +/- 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1%를 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 조성물, 제제 및 방법은 본 발명의 구성 성분 및 성분뿐만 아니라 본원에서 기재된 기타 성분을 포함하거나 이들로 필수적으로 이루어지거나 이들로 이루어질 수 있다. 본원에서 사용되는 "필수적으로 이루어지는" 및 "필수적으로 이루어지다"는, 조성물, 제제 및 방법이 추가의 단계, 구성 성분 또는 성분을 포함할 수 있지만, 상기 추가의 단계, 구성 성분 또는 성분이 청구된 조성물, 제제 및 방법의 기본 및 신규 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 포함할 수 있다는 것을 의미한다. "포함하다", "포함한", "포함하는" 등과 같은 용어는 "비롯하여", "함유하는", 또는 "특징화되는"과 같은 용어와 동의어이고, 추가의 인용되지 않은 요소, 성분 또는 구성성분 또는 단계를 배제하지 않는 포괄적이거나 개방적인 용어이다. 이와 관련하여, 임의의 이전에 공지된 생산물, 생산물의 제조 방법 또는 생산물의 사용 방법을 본 발명 내에 포함하지 않는 것이 본 발명의 목적이므로 출원인(들)은 권리를 유보하며 이로써 임의의 이전에 공지된 생산물, 공정 또는 방법에 대한 권리 포기를 드러낸다. 추가로, 본 발명은 출원인이 권리를 유보하도록 US 법/USPTO(예를 들어, 35 USC §112(a), (b)) 또는 EPC/EPO(예를 들어, EPC의 83항)의 서면 기재 요건, 실시 가능 요건 및/또는 명확성 또는 확정성 요건을 충족하지 않는 임의의 생산물, 공정, 또는 생산물의 제조 또는 생산물의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키고자 하는 것이 아니고, 이에 의해 서면 기재 요건, 실시 가능 요건 및/또는 명확성/확정성 요건 및/또는 충분성 요건을 충족하지 않는 임의의 요지 및/또는 임의의 이전에 기재되거나 공지된 생산물, 생산물의 제조 공정, 또는 생산물의 사용 방법의 포기를 개시한다는 것이 주지된다. 본 발명의 실시에 있어서 조항 53(c) EPC 및 규칙 28 (b) 및 (c) EPC를 준수하는 것이 유리할 수 있다. 본 출원의 계보 또는 임의의 다른 계보 또는 임의의 제3자의 임의의 선행 출원된 출원에서 출원인의 임의의 등록된 특허(들)의 요지인 임의의 실시양태를 명백히 포기하는 모든 권리는 명백히 유보된다. 임의의 선행 출원되었지만 이전에 공개되지 않은 특허 출원 또는 특허에 있는 것을 명시적으로 포기하는 모든 권리는 명시적으로 유보된다("선행 출원되었지만 이전에 공개되지 않은"은 본 개시에 부여된 출원일과 관련됨). 본원에서 어떤 것도 약속으로 해석되어서는 안된다. 또한, 본 출원에서 임의의 문서의 인용 또는 확인은 그러한 문서가 종래 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것이 아니다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 "구성되는"이라는 용어는 특정 작업을 수행하거나 특정 구성을 채택하도록 제작(constructed) 또는 구성된(configured) 시스템, 장치 또는 기타 구조를 기술한다는 것이 주지되어야 한다. "구성된"이라는 용어는 배열 및 구성, 제작 및 배열, 조정 및 구성, 조정, 제작, 제조 및 배열 등과 같은 다른 유사한 구문과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "애주번트(adjuvant)"는 항원에 대한 신체의 면역 반응을 증진시키는 물질을 지칭한다. 실시양태에서, 본 발명의 1가 인플루엔자 약학 제제는 애주번트가 첨가되지 않은 백신 조성물이다.
"투여"는 본 개시의 면역원성 또는 백신 조성물을 대상체 내로 도입하는 것을 의미하며; 이는 또한 본 개시의 조성물을 (예를 들어, 처방 또는 투여에 의해) 대상체에게 제공하는 행위를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 "주위 온도"라는 용어는 본 발명의 1가 인플루엔자 약학 제제를 저장하기 위한 공기 온도이다. 실시양태에서, 주위 온도는 실온이고, 예컨대, 약 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 약 20℃ 내지 25℃ 범위 내의 임의의 온도로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 점막, 체액성 및 세포 매개성 면역 반응의 조합을 유도할 투여되는 화합물의 양을 지칭한다. 상기 용어는 또한 치료될 병태의 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화 또는 예방할 본 발명의 조성물의 양을 지칭한다. 본 개시의 조성물로 직접 치료될 수 있는 병태/질환과 관련하여, 치료적 유효량은 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 병태/질환의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않는 포유 동물에서 병태/질환의 발생 예방(예방적 치료), 병태/질환의 증상 완화, 병태/질환의 정도 감소, 병태/질환의 안정화(예를 들어, 악화되지 않음), 병태/질환의 확산 방지, 병태/질환 진행의 지연 또는 둔화, 병태/질환 상태의 호전 또는 일시적 완화, 및 이들의 조합의 효과를 갖는 양을 지칭한다. "유효량"이라는 용어는 화합물의 부재 하에 발생할 반응과 다르게 반응(예를 들어, 보호 면역 반응 및/또는 백신에 의해 제공되는 반응)을 생성할 투여되는 화합물의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "퍼센트(%) 상동성" 또는 "퍼센트(%) 동일성" 및 2 개의 서열(예를 들어, 단백질 서열)의 맥락에서 이의 문법적 변형은 잘 알려진 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정하는 경우 최대 일치성을 위해 비교하고 정렬할 때 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및/또는 100%의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 동일성(상동성)을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 서브서열(즉, 이의 단편)을 지칭한다. 2 개의 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877]에서와 같이 수정된 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268]의 알고리즘이다. 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 문헌[Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 국소 서열 유사성 및 정렬의 영역을 확인하기 위한 추가의 또 다른 유용한 알고리즘은 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다. WU-BLAST(Washington University BLAST) 버전 2.0 소프트웨어의 사용이 유리하다. 여러 UNIX 플랫폼용 WU-BLAST 버전 2.0 실행 가능한 프로그램은 ftp://blast.wustl.edu/blast/executables에서 다운로드될 수 있다. 이러한 프로그램은 WU-BLAST 버전 1.4를 기반으로 하고, 이는 이후 공개 도메인 NCBI-BLAST 버전 1.4을 기반으로 한다(모두 본원에 참조로 포함되는 문헌[Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460-480; Altschul et al., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877]). 또한, 이러한 정의로부터, 본 개시에서 약 퍼센트(%) 상동성이 언급되는 경우, 독자는 이를 또한 퍼센트(%) 동일성으로 이해할 수 있다. 또한, 본 발명 내의 단백질은 본 개시에 예시되고 기재된 정확한 서열과 상이할 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 서열이 본 발명의 방법에 따라 기능하는 한, 제시된 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 고려한다. 이와 관련하여, 일반적으로 특히 바람직한 치환은 본질적으로 보존적일 것이며, 즉, 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 치환일 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 4 개의 패밀리로 나뉜다: (1) 산성--아스파테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전 극성-글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 류신이 이소류신 또는 발린으로 단리된 대체, 또는 이의 반대; 아스파르테이트가 글루타메이트로 이의 반대; 트레오닌이 세린으로 또는 이의 반대의 단리된 대체; 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로의 아미노산의 유사한 보존적 대체는 생물학적 활성에 주요 영향을 미치지 않을 것임이 충분히 예측 가능하다. 따라서, 예시되고 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 소수의 아미노산 치환을 갖는 단백질은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 단백질과 관련하여, 본 발명 내의 핵산 서열은 본원에 명시적으로 개시된 것과 유사하게 달라질 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 항원 또는 단백질의 기능적으로 및/또는 항원적으로 등가인 변이체 및 유도체 및 이의 기능적으로 등가인 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 기능적으로 등가인 변이체, 유도체, 및 단편은 항원 활성을 보유하는 능력을 나타낸다. 예를 들어, 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않는 DNA 서열의 변화, 뿐만 아니라 아미노산 잔기의 보존적 치환, 하나 또는 몇 개의 아미노산 결실 또는 부가, 및 아미노산 잔기의 아미노산 유사체로의 치환인 변화는 코딩된 폴리펩타이드의 성질에 유의하게 영향을 미치지 않는 것들이다. 보존적 아미노산 치환은 글리신/알라닌; 발린/이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 세린/트레오닌/메티오닌; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신/트립토판이다.
본원에서 사용되는 "인간 아데노바이러스"라는 용어는 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속의 구성원을 포함하는 아데노바이러스과의 모든 인간 아데노바이러스를 포괄하는 것으로 의도된다. 현재까지, 아데노바이러스의 51 개가 넘는 인간 혈청형이 확인되었다(예를 들어, 문헌[Fields et al., Virology 2, Ch. 67 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참조). 상기 아데노바이러스는 혈청군 A, B, C, D, E 또는 F일 수 있다. 상기 인간 아데노바이러스는 혈청형 1 (Ad 1), 혈청형 2 (Ad2), 혈청형 3 (Ad3), 혈청형 4 (Ad4), 혈청형 5 (Ad5), 혈청형 6 (Ad6), 혈청형 7 (Ad7), 혈청형 8 (Ad8), 혈청형 9 (Ad9), 혈청형 10 (Ad10), 혈청형 11 (Ad11), 혈청형 12 (Ad12), 혈청형 13 (Ad13), 혈청형 14 (Ad14), 혈청형 15 (Ad15), 혈청형 16 (Ad16), 혈청형 17 (Ad17), 혈청형 18 (Ad18), 혈청형 19 (Ad19), 혈청형 19a (Ad19a), 혈청형 19p (Ad19p), 혈청형 20 (Ad20), 혈청형 21 (Ad21), 혈청형 22 (Ad22), 혈청형 23 (Ad23), 혈청형 24 (Ad24), 혈청형 25 (Ad25), 혈청형 26 (Ad26), 혈청형 27 (Ad27), 혈청형 28 (Ad28), 혈청형 29 (Ad29), 혈청형 30 (Ad30), 혈청형 31 (Ad31), 혈청형 32 (Ad32), 혈청형 33 (Ad33), 혈청형 34 (Ad34), 혈청형 35 (Ad35), 혈청형 36 (Ad36), 혈청형 37(Ad37), 혈청형 38 (Ad38), 혈청형 39 (Ad39), 혈청형 40 (Ad40), 혈청형 41 (Ad41), 혈청형 42 (Ad42), 혈청형 43 (Ad43), 혈청형 44 (Ad44), 혈청형 45 (Ad45), 혈청형 46 (Ad46), 혈청형 47 (Ad47), 혈청형 48 (Ad48), 혈청형 49 (Ad49), 혈청형 50 (Ad50), 혈청형 51 (Ad51) 또는 이들의 조합일 수 있지만, 이러한 예에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 상기 아데노바이러스는 혈청형 5 (Ad5)이다.
본원에서 사용되는 "면역원성 조성물"은, 전형적으로 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 유형의 복제 결함 아데노바이러스 벡터 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 숙주에 투여될 때 이러한 면역 반응이 지시되는 항원 및/또는 감염원(예를 들어, 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 의해 코딩되고/코딩되거나 "빈" hAd5 벡터에 의해 유도/증진될 수 있는 항원)에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 증진시키는 조성물을 지칭한다. "백신"은 투여될 때 감염원에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는(예를 들어, 감염원으로의 공격으로부터 숙주를 보호하는) 이러한 면역원성 조성물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은, 예를 들어, 하나 이상의 애주번트, 서방형 화합물, 용매, 완충제 등을 포함하여, 포유동물 숙주에 투여하기에 적합한 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 다른 성분과 함께 항원을 함유하고/함유하거나 발현하는 하나 이상의 바이러스 벡터(들)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 및/또는 백신은 하나 이상의 사멸된 항원(들)(예를 들어, 사멸되거나 완전히 불활성인 바이러스) 또는 약독화 생 항원(예를 들어, 약독화 바이러스)을 비제한적으로 포함하는 단백질 및/또는 탄수화물 및/또는 지질 및/또는 다른 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물(들) 및/또는 백신(들)은 항원 공급원 또는 이의 기능에 관계없이 임의의 항원에 대한 면역 반응을 개선한다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 인간 대상체에게 심각한 자극을 유발하지 않고 투여된 면역원성 또는 백신 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "혈청전환"이라는 용어는 백신접종(예를 들어, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물의 투여) 후 혈청 중화 항체 역가(예를 들어, 항-S1/S2 항체 또는 S1 항체의 항-RBD)의 4 배 이상 증가로 정의된다.
본원에서 사용되는 "혈청양성"이라는 용어는 백신접종(예를 들어, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여) 후 혈청 중화 항체에서 측정 가능한(예를 들어, 시험관내 검정에서 검출 가능한) 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "보호"라는 용어는 보호 면역 반응이 유발되었다는 것을 나타내며, 보호 면역 반응은 다음 중 적어도 하나에 의해 나타날 수 있다: 코로나바이러스에 의한 숙주의 감염 예방; 감염의 변형 또는 제한; 감염으로부터 숙주의 회복을 보조, 개선, 증진 또는 자극; 및 코로나바이러스에 의한 후속 감염을 예방하거나 제한할 면역학적 기억 생성. 체액성 반응은 감염성을 중화시키고, 바이러스 및/또는 감염된 세포를 용해시키고, 숙주 세포에 의한 바이러스의 제거를 용이하게 하고(예를 들어, 식세포작용을 용이하게 하고), 및/또는 바이러스 항원 물질에 결합하여 이의 제거를 용이하게 하는 항체의 생산을 포함할 수 있다. 항체 반응은 또한 특정 점막 IgA 반응을 유발하거나 유도하는 것을 포함하는 점막 반응을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "혈청보호된"이라는 용어는 혈청 중화 항체의 생성을 통해 감염으로부터 보호되는 백신접종 후 대상체를 의미한다. 집단에서, 이는 혈청보호된 개체의 백분율(%)(예를 들어, 50%)로 지칭된다. 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 및 사용 방법은 SARS-CoV-2 감염에 대한 인간 대상체와 같은 포유동물 대상체에 혈청보호를 제공한다. 보호 기간은 적어도 약 1 개월 내지 적어도 약 14 개월일 수 있다. 혈청보호는 적어도 약 1 개월, 2 개월, 4 개월, 6 개월, 8 개월, 10 개월, 12 개월 또는 적어도 약 13 개월 동안 지속될 수 있다.
"치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 구체적으로, 유익하거나 목적하는 임상 결과로는 증상의 완화, 질환의 정도 감소, 질병의 안정화(예를 들어, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질환의 실질적 확산 방지, 질환 상태의 호전 또는 일시적 완화, 및 검출 가능 여부에 관계 없이 관해(부분 또는 전체)가 포함되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 추가로, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있고/있거나 질환에 대한 부분적 또는 완전한 치료 및/또는 질환에 기인하는 역 효과의 측면에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용되는 "예방적으로 치료하다" 또는 "예방적으로 치료하는"이라는 용어는 숙주에서 질환/병태 또는 이의 하나 이상의 증상을 완전히, 실질적으로 또는 부분적으로 예방하는 것을 지칭한다. 유사하게, "병태의 발병을 지연하는"은 또한 "예방적으로 치료하는"에 포함될 수 있으며, 병태에 걸리기 쉬운 환자에서 병태의 실제 발병 이전의 시간을 증가시키는 행위를 지칭한다.
본 개시에서, "백신"은 유리하게는, 보호 면역 반응을 유도하기 위한, 예를 들어, 애주번트, 서방형 화합물, 용매 등을 포함하는 백신 제제의 다른 성분과 함께, 코로나바이러스 항원 또는 다른 감염원을 함유하고 발현하고/발현하거나 외인성 항원에 대한 코딩 서열이 결여된(예를 들어, 빈 AdVector) 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 애주번트, 서방형 화합물, 용매 등을 포함하는 백신 제제의 다른 성분과 함께, 코로나바이러스 항원 또는 다른 감염원을 함유하고 발현하고/발현하거나 외인성 항원에 대한 코딩 서열이 결여된(예를 들어, 빈 AdVector) 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 본 개시 내의 이러한 조성물은 또한 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 본원에서 논의되는 "면역원성 조성물" 내에 있다. 본 발명의 실시양태에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 항원 공급원 또는 이의 기능에 관계없이 임의의 항원에 대한 면역 반응을 개선할 수 있다.
본원에서 언급되는 "벡터"는 항원에 대한 유전 암호 또는 이의 일부를 보유하지만, 이는 항원 자체가 아니다. 예시적인 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 본원에서 언급되는 "항원"은 인간 및/또는 동물을 포함하는 대상체에서 항원, 및/또는 이러한 항원을 발현하는 감염원에 대한 특정 면역 반응을 유도 및/또는 증진시키는 물질을 의미한다. 상기 항원은 사멸, 약독화 또는 살아있는 온전한 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 갖는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에게 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 조각 또는 단편; 폴리펩타이드, 에피토프, 합텐, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 상기 항원은 바이러스, 세균, 유기체의 서브유닛, 자가 항원, 또는 암 항원이다.
범위는 본원에서 약 하나의 특정 값, 및/또는 약 또 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행사 약 또는 대략의 사용에 의해 근사치로서 표현될 때, 특정 값은 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여, 및 다른 종점과 독립적으로 둘 모두에서 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 범위(예를 들어, 90-100%)는 범위 자체 뿐만 아니라 각각의 값이 개별적으로 열거된 것처럼 범위 내의 각각의 독립적인 값을 포함하는 것을 의미한다.
면역원성 조성물 및 백신
코로나바이러스 감염(바람직하게는, 여기서 코로나바이러스는 SARS-CoV-2임)의 예방 및/또는 치료를 위해 포유동물 대상체에 투여하기에 적합한 및/또는 이를 위해 구성된, 복제-결함 아데노바이러스("rdAd") 벡터 및 이를 포함하는 면역원성 조성물("코로나바이러스 약학 제제")(일부 실시양태에서 백신 제제)이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스 항원, 바람직하게는 SARS-CoV-2 항원을 포함하고 발현할 수 있을 뿐만 아니라, 외인성(즉, 비-Ad) 항원을 발현하지 않을 수 있거나, 빈 AdVector일 수 있는(예를 들어, 외인성 항원 트랜스진 없음), 당업자에게 공지되어 있고 포유동물에 투여하도록 제조된 임의의 아데노바이러스 벡터(Ad-벡터)가 본 출원의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 이러한 Ad-벡터는 미국 특허 제6,706,693호; 6,716,823호; 제6,348,450호; 및/또는 미국 특허 공개 제2003/0045492호; 제2004/0009936호; 제2005/0271689호; 제2007/0178115호; 및/또는 제2012/0276138호(모두 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 비제한적으로 포함하여 당업자에게 공지된 임의의 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-복제 아데노바이러스 바이러스 벡터(rdAd)는 인간 아데노바이러스이다. 대안적인 실시양태에서, 아데노바이러스는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스(예를 들어, 침팬지), 닭 아데노바이러스, 또는 돼지 아데노바이러스이다. 예시적인 실시양태에서, 비-복제 바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 비-복제 아데노바이러스 벡터는 진핵 세포로의 유전자 전달 및 면역원성 조성물(예를 들어, 백신) 개발에, 및 동물 모델에서 특히 유용하다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 복제를 위한 상보성 E1 활성을 필요로 하는 비-복제 또는 복제-결핍(RD)일 수 있다. 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1-결함, E3-결함 및/또는 E4-결함 아데노바이러스 벡터, 또는 바이러스 유전자들이 결실된 "무장(gutless)" 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. E1-결함 아데노바이러스 돌연변이체는 비-허용 세포에서 복제 부적격이기 때문에 E1 돌연변이는 벡터의 안전 마진(safety margin)을 높인다. E3 돌연변이는 아데노바이러스가 MHC 클래스 I 분자를 하향 조절하는 기전을 파괴함으로써 항원의 면역원성을 증진시킨다. E4 돌연변이는 후기 유전자 발현을 억제하여 아데노바이러스 벡터의 면역원성을 감소시키므로 동일한 벡터를 이용한 반복적인 재백신접종이 가능할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E3 결함 벡터이다. "무장" 아데노바이러스 벡터 복제는 헬퍼 바이러스 및 자연 환경에 존재하지 않는 조건인 E1a와 Cre 둘 모두를 발현하는 특별한 인간 293 세포주가 필요하며; 벡터에 바이러스 유전자들이 없으므로 면역원성 조성물(예를 들어, 백신) 운반체로서의 벡터는 비-면역원성이고 재백신접종을 위해 다회 접종될 수 있다. "무장" 아데노바이러스 벡터는 또한 트랜스진을 수용하기 위한 36 kb 공간을 포함하므로 많은 수의 항원 유전자들을 세포로 공동-전달할 수 있다. RGD 모티프와 같은 특정 서열 모티프는 이의 감염성을 증진시키기 위해 아데노바이러스 벡터의 H-I 루프에 삽입될 수 있다. 아데노바이러스 재조합체는 특정 트랜스진 또는 트랜스진의 단편을 하기에 기재된 것과 같은 임의의 아데노바이러스 벡터로 클로닝함으로써 작제될 수 있다. 아데노바이러스 재조합 벡터는 면역제로 사용하기 위해 비침습적 방식으로 척추동물의 표피 세포를 형질도입하는 데 사용된다. 아데노바이러스 벡터는 또한 정맥내, 근육내 또는 피하 주사와 같은 침습적 투여 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 코로나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 데 사용하기 위한 이러한 rdAd 벡터는 외인성 항원(아데노바이러스 벡터가 유래된 아데노바이러스에 대해 외인성인)을 발현하지 않는 것일 수 있고, 이러한 벡터는 본원에서 "AdE" 벡터로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 발현하지 않지만, 상이한 유형의 감염원(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)의 하나 이상의 항원을 발현하는 것(본원에서 "AdD"로 지칭됨)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 hAd5-SARS-CoV-2 벡터로 지칭되는 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 면역원성 조성물은 상이한 유형의 이러한 벡터(예를 들어, AdE, 또는 AdD)를 단독으로 또는 hAd5-SARS-CoV-2 벡터와 조합하여 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 유형의 벡터는 총괄하여, 또는 "rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터"로 지칭되는 적어도 2 개의 이러한 벡터의 서브세트일 수 있다. SARS-CoV-2 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 하나 이상의 이러한 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 약학 제제이다.
AdE 벡터는 외인성 항원(즉, 아데노바이러스 벡터가 유래된 아데노바이러스에 대해 외인성인 항원, 예를 들어, 인플루엔자와 같은 상이한 유형의 감염원의 항원)을 코딩하지 않는 rdAd 벡터이다. 이러한 hAd5 벡터는 또한 외인성 트랜스진이 결여되고/결여되거나, "트랜스진-비함유"인 "빈"으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, AdE 벡터는 ΔE1E3 Ad5 벡터(예를 들어, 바이러스 게놈의 E1 영역(뉴클레오타이드 343 내지 3511) 및 E3 영역에 뉴클레오타이드 28132 내지 30813이 결여됨)일 수 있다. 본 개시는 AdE 벡터(AdE 바이러스 입자 포함)를 포함하는 면역원성 조성물 및 바람직하게는 코로나바이러스가 SARS-CoV-2인 코로나바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 이러한 면역원성 조성물의 용도, 및 이를 수행하는 방법을 포함하는 일부 실시양태를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 AdE 벡터는 하나 이상의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터와 공동-투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 공동-투여는 AdE 벡터 및 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 단일 면역원성 조성물의 투여, 및/또는 AdE 벡터를 포함하는 다중 면역원성 조성물과 하나 이상의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 또 다른 면역원성 조성물의 본질적으로 동시 및/또는 순차적 투여를 지칭할 수 있다. 이러한 AdE 벡터는 또한 프라임-부스트 프로토콜의 일부로서 투여될 수 있으며, 여기서 AdE를 포함하는 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 유형의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 투여 전 또는 후(예를 들어, 이의 7-28 일 전 및/또는 후)에 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 유효량의 이러한 조성물(들)(예를 들어, 적어도 약 107 감염 단위(ifu) 또는 바이러스 입자(vp)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 AdE, 및 존재하는 경우, 적어도 하나의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)을 투여(예를 들어, 비강내)함으로써 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도(및/또는 증진)시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물의 투여에 의해 유도 또는 증진된 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 바람직하게는 투여 약 24 시간 이내에 시작되고, 바람직하게는 적어도 약 21 일 동안 지속된다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 방법은 유효량의 이러한 면역원성 조성물(예를 들어, 적어도 약 107 ifu의 AdE, 및 존재하는 경우, 적어도 하나의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)의 비강내 투여를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제2 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터는 SARS-CoV-2의 적어도 하나의 이종성 항원 및/또는 적어도 하나의 다른 감염원(예를 들어, AdD)을 코딩함으로써, 약물-백신 이중 섭생을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다중 용량의 AdE 벡터(및/또는 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)의 투여는 약 7 일, 10 일, 14 일, 21 일, 28 일, 35 일, 42 일, 49 일, 또는 56 일 간격 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역원성 조성물은 비강내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주는 동물, 예컨대, 성인 또는 소아 인간이고, 선택적으로 여기서 숙주는 면역손상된다. 바람직한 실시양태에서, 코로나바이러스에 대한 면역 반응은 적어도 약 40-50 일 동안 지속되고, 하나 이상의 SARS-CoV-2 벡터의 존재 또는 부재 하에 AdE의 재투여에 의해 재개시될 수 있다. 이러한 AdE 벡터, 면역원성 조성물, 및/또는 방법의 다른 실시양태가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다.
AdD 벡터는 코로나바이러스 및/또는 SARS-CoV-2 이외의 감염원의 외인성 항원(예를 들어, 인플루엔자(예를 들어, 돼지 인플루엔자, 계절성 인플루엔자, 조류 인플루엔자, H1N1 인플루엔자, 또는 H5N1 인플루엔자)와 같은 상이한 유형의 감염원의 항원)을 코딩하는 rdAd 벡터이다. 일부 실시양태에서, AdD 벡터는, 바람직하게는 숙주(예를 들어, 포유동물)에서의 발현을 위해 최적화된 적어도 하나의 이종성(예를 들어, 비-Ad) 항원을 코딩하는 ΔE1E3 Ad5 벡터일 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 생성하는 데 사용될 수 있는 항원의 대표적인 예는 인플루엔자 헤마글루티닌, 인플루엔자 핵 단백질, 인플루엔자 M2, 파상풍 독소 C-단편, 탄저병 보호 항원, 탄저병 치사 인자, 광견병 당단백질, HBV 표면 항원, HIV gp 120, HIV gp 160, 인간 암배아 항원, 말라리아 CSP, 말라리아 SSP, 말라리아 MSP, 말라리아 pfg, 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 HSP 등을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, AdD 벡터는 A/뉴칼레도니아/20/99 H1N1 IFV (NC20) HA1 도메인을 코딩하는 AdNC.H1.1 벡터일 수 있다(예를 들어, 문헌[Tang et al. Expert Rev Vaccines 8: 469-481 (2009)] 참조). 일 실시양태에서, AdD 벡터는 바람직하게는 복제-허용 PER.C6 세포에서의 증식, 및 이어서 감염된 세포 수확물로부터 바이러스의 정제에 의해 제작되고 최종 생성물에는 다음 부형제, 즉, Tris HCl(pH 7.4), 히스티딘, 수크로스, 소듐 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 폴리소르베이트 80, 에틸렌디아민테트라아세트산, 및 에탄올이 포함되어 제조된, 인플루엔자(AdcoCA09.HA "NasoVAX")의 A/캘리포니아/04/2009(H1N1)-유사 균주로부터 헤마글루티닌(HA) 표면 단백질 항원을 코딩하는 유전자 삽입물을 함유할 수 있다. 본 개시는 AdD 벡터(AdD 바이러스 입자 포함)를 포함하는 면역원성 조성물 및 코로나바이러스 감염(바람직하게는, 여기서 코로나바이러스는 SARS-CoV-2임)을 예방 및/또는 치료하기 위한 이러한 면역원성 조성물의 용도, 및 이를 수행하는 방법을 포함하는 일부 실시양태를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 AdD 벡터는 하나 이상의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터와 공동-투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 공동-투여는 AdD 벡터 및 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 단일 면역원성 조성물의 투여, 및/또는 AdD 벡터를 포함하는 다중 면역원성 조성물 및 하나 이상의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 또 다른 면역원성 조성물의 본질적으로 동시 및/또는 순차적 투여를 지칭할 수 있다. 이러한 AdD 벡터는 또한 프라임-부스트 프로토콜의 일부로서 투여될 수 있으며, 여기서 AdD 벡터(예를 들어, 바이러스 입자)를 포함하는 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 유형의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 투여 전 또는 후(예를 들어, 이의 7-21 일 전 및/또는 후)에 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 유효량의 이러한 조성물(들)(예를 들어, 적어도 약 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 각각의 AdD 벡터, 및 존재하는 경우, 적어도 하나의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)을 투여(예를 들어, 비강내)함으로써 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도(및/또는 증진)시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역원성 조성물의 투여에 의해 유도 또는 증진된 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 바람직하게는 투여 약 24 시간 이내에 시작되고, 바람직하게는 적어도 약 21 일 동안 지속된다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 방법은 유효량의 이러한 면역원성 조성물(예를 들어, 적어도 약 107 vp 또는 ifu(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 각각의 AdD 벡터, 및 존재하는 경우, 적어도 하나의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)의 비강내 투여를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 제2 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터는 AdE이고/이거나 SARS-CoV-2의 적어도 하나의 이종성 항원 및/또는 적어도 하나의 다른 감염원을 코딩함으로써, 약물-백신 이중 섭생을 제공한다. 일부 실시양태에서, 다중 용량의 AdD 벡터(및/또는 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터)의 투여는 임의의 약 7 일, 10 일, 14 일, 21 일, 28 일, 35 일, 42 일, 49 일, 또는 56 일 간격일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 면역원성 조성물은 비강내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주는 동물, 예컨대, 성인 또는 소아 인간이고, 선택적으로 여기서 숙주는 면역손상된다. 바람직한 실시양태에서, 코로나바이러스에 대한 면역 반응은 적어도 약 40-50 일 동안 지속되고, 하나 이상의 SARS-CoV-2 벡터의 존재 또는 부재 하에 AdD의 재투여에 의해 재개시될 수 있다. 이러한 AdD 벡터, 이를 포함하는 면역원성 조성물, 및/또는 이를 사용하는 방법의 다른 실시양태가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 SARS-CoV-스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터를 포함하는 하나 이상의 SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 면역원성 조성물, 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 제공하고, 이러한 조성물은 포유동물 대상체에서 스파이크 단백질 RBD에 대한 중화 항체를 유도하도록 구성된다. 추정적인 연구는 S1의 수용체 결합 도메인을 통해 스파이크 단백질이 안지오텐신-전환 효소 2(ACE2) 수용체에 결합함을 지시하였다(문헌[Y. Wan et al.; receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS; J. Virol. doi:10.1128/JVI.00127-20]; 2020년 1월 29일 온라인 게시). 스파이크 단백질의 적어도 RBD에 대한 면역 반응을 발생시키는 것은 중화 항체를 유도하기 위한 매력적인 표적이며, 여기서 스파이크 단백질은 먼저 숙주 수용체(예를 들어, ACE2)에 결합한 다음 바이러스 및 숙주 막을 융합시킴으로써 숙주 세포로의 코로나바이러스 진입을 매개한다. SARS-CoV-2에 대한 스파이크 단백질은 본원에서 SEQ ID NO: 3(젠뱅크: QHD43416.1)으로서 제공된다. 도 3을 참조한다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 포함한다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스는 SARS-CoV-2이고, 여기서 우한 2019 단리물(SARS-CoV-2)에 대한 코딩 서열은 본원에서 SEQ ID NO: 1로서 제공된다. 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1의 하나 이상의 코딩 서열을 포함한다. 이러한 서열은 B 세포 및/또는 T 세포 에피토프와 같은 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 코딩된 임의의 SEQ ID NO: 2 내지 20에 제공된 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하고/포함하거나 발현한다(예를 들어, 코딩하는 발현 카세트를 포함한다). 바람직한 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 15 또는 이의 변이체(즉, RBD 서열(SEQ ID NO: 15(SEQ ID NO: 446 포함)의 아미노산 57-253), 및/또는 신호 및/또는 리더 및/또는 측접 서열)을 포함하고/포함하거나 발현한다(예를 들어, 발현 카세트를 포함한다). 실시양태에서, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 코딩 서열은 적어도 하나 이상의 B 세포 에피토프, 하나 이상의 CD8+ T 세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩한다. 당업자는 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB)에서 접근 가능한 공개적으로 이용 가능한 도구, 항원 서열을 스캐닝하는 짧은 선형 펩타이드와 조합하여 감염-양성 대상체로부터의 PBMC에 기반한 시험관내 검정 또는 짧은 선형 또는 입체형태적 펩타이드를 사용하여 항원 서열을 스캐닝하는 혈청에 기반한 시험관내 검정과 같은 생물정보학 방법론을 사용하여 더 큰 서열 내의 이러한 에피토프를 확인하는 방법을 이해한다.
실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, RBD 아미노산 서열(SEQ ID NO: 15(SEQ ID NO: 446)의 아미노산 57-253), 또는 이의 면역원성 단편의 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질, S1 도메인, S2 도메인, 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크(S) 단백질에 대한 코딩 서열(예를 들어, 바람직한 실시양태 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 12에서와 같이), 스파이크 단백질의 S1 도메인(예를 들어, 바람직한 실시양태 SEQ ID NO: 13에서와 같이), 또는 이의 면역원성 단편(예를 들어, 바람직한 실시양태 SEQ ID NO: 14-17에서와 같이)을 포함한다(도 17b 내지 도 21). 바람직한 실시양태에서, 코딩 서열은 SEQ ID NO: 15(SEQ ID NO: 446)의 아미노산 57-253을 포함하는 RBD 서열을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 이러한 코딩된 서열은 천연 또는 PTA 신호 서열을 포함하는 재조합 서열(예를 들어, 바람직한 실시양태 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSGTGS(SEQ ID NO: 427))로서 리더 신호 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 13에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 14에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 15에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 16에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 16에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 17에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 17에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 17에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 446에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 임의의 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 460 및 SEQ ID NO: 475-476에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 460 및 SEQ ID NO: 475-476에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 임의의 SEQ ID NO: 412-420에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다.
특정 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크 단백질의 S1 도메인(예를 들어, SEQ ID NO: 13), 또는 이의 면역원성 단편에 대한 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 코딩 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 13의 적어도 아미노산 잔기 331 내지 527을 코딩하며, 여기서 아미노산 위치 넘버링은 전장 스파이크 단백질 서열을 기준으로 한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 12; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 잔기 331 내지 527에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이고; 여기서 아미노산 위치 넘버링은 전장 스파이크 단백질 서열을 기준으로 한다(도 3).
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 코딩 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 13; 도 17a), 또는 이의 단편(바람직하게는 면역원성 단편)(예를 들어, SEQ ID NO: 14 또는 15)을 포함하고, 여기서 서열은 다음 잔기 중 하나 이상를 포함한다: L455, F486, Q493, S494 및/또는 N501(아미노산 위치 넘버링은 전장 스파이크 단백질을 기준으로 함). 예를 들어, 도 3, 도 15, 및 도 17b 내지 도 21을 참조한다. 실시양태에서, 코딩된 서열은 Q493 및 N501을 포함한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 서열은 Q493을 포함한다. 위치 455, 486, 493, 494 및/또는 501에서 SARS-CoV-2의 이러한 특정 아미노산 잔기는 이들의 수용체와 직접 상호작용하는 것으로 여겨진다. 독립적으로, 이러한 아미노산 잔기는 스파이크 단백질의 위치 455, 486, 493, 494 및 501에서 SARS-CoV-2의 아미노산의 물리-화학적 특성에 기반한 보존적 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 잠재적으로 이탈(예를 들어, 획득된 중화 항체를 회피하지만 여전히 숙주 수용체에 결합하는 바이러스 돌연변이)을 포획하는 대안적인 서열이 생성될 수 있고, 여기서 면역원성 조성물은 이러한 대안적인 서열(들)에 기반하여 중화 항체를 유도할 것이다. 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크 단백질의 S1 도메인, S1 도메인의 RBD, 또는 이의 면역원성 단편에 대한 코딩 서열을 포함하고, 여기서 서열은 SEQ ID NO: 16을 포함하고, 455(L)는 Y, F, L 또는 S로부터 선택되고; 486(F)는 L, F, S 또는 P로부터 선택되고; 493(Q)는 L, N, Q, R 또는 K로부터 선택되고; 494(S)는 D, G, P, L 또는 S로부터 선택되고; 501(N)은 T, S, N 또는 Y로부터 선택된다. 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크 단백질의 S1 도메인, S1의 RBD, 또는 이의 면역원성 단편에 대한 코딩 서열을 포함하고, 여기서 서열은 SEQ ID NO: 17을 포함하고, 455(L)는 Y, F, L 또는 S로부터 선택되고; 486(F)는 L, F, S 또는 P로부터 선택되고; 493(Q)는 L, N, Q, R 또는 K로부터 선택되고; 494(S)는 D, G, P, L 또는 S로부터 선택되고; 501(N)은 T, S, N 또는 Y로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 SEQ ID NO: 13의 스파이크 단백질 서열의 서브섹션의 변형에 대한 코딩 서열을 포함하고, 서브섹션의 아미노산 서열은 도 17b("서열") 및 하기에 나타나 있다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 코딩 서열은 SEQ ID NO: 411의 임의의 아미노산의 적어도 하나의 치환을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 SEQ ID NO: 411에 대해 적어도 하나의 치환("돌연변이")을 코딩할 수 있다. 바람직하게는, SEQ ID NO: 411에 대한 하나 이상의 치환은 도 17b에 나타낸 것들 중 하나이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 치환은 아미노산 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 또는 513-526 중 어느 하나 이상에 대한 것일 수 있으며, 넘버링은 도 17b에 나타낸 것에 상응한다. 바람직한 실시양태에서, 치환은 인간 ACE2 수용체와 주요 접촉 잔기로서 작용하는 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 아미노산 417, 446, 447, 449, 453, 455, 456, 473, 475-477, 484, 486, 487, 493, 495-498, 500-503, 및/또는 505 중 하나 이상일 수 있다(넘버링은 도 17b에 나타낸 것에 상응함). 일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 411에 대한 치환은 다음 중 적어도 하나이다: N에 의한 아미노산 417(K)의 치환; V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G)의 치환; N에 의한 아미노산 449(Y)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)에서 치환; F에 의한 아미노산 455(L)의 치환; L에 의한 아미노산 456(F)의 치환; V에 의한 아미노산 473(Y)의 치환; V에 의한 아미노산 475(A)의 치환; S 또는 A에 의한 아미노산 476(G)의 치환; N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S)의 치환; Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E)의 치환; L 또는 S에 의한 아미노산 486(F)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)의 치환; L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q)의 치환; N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y)의 치환; I에 의한 아미노산 500(T)의 치환; Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N)의 치환; R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G)의 치환; L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V)의 치환; 및/또는 H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)의 치환. 넘버링은 도 17b에 나타낸 것에 상응한다.
실시양태에서, 코딩된 스파이크 단백질 RBD 서열은 Y455, F455 또는 S455로부터 선택된 잔기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 코딩된 스파이크 단백질 RBD 서열은 L486 또는 P486으로부터 선택된 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 코딩된 스파이크 단백질 RBD 서열은 N493, R493 또는 K493으로부터 선택된 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 코딩된 스파이크 단백질 RBD 서열은 D494 또는 G494로부터 선택된 잔기를 포함한다. 실시양태에서, 코딩된 스파이크 단백질 RBD 서열은 T501 또는 S501로부터 선택된 잔기를 포함한다.
안정화된 스파이크 단백질 항원 설계
Covid-19(예를 들어, SARS-CoV-2)에 대한 바이러스 벡터 면역원성 조성물 또는 백신의 개발은 다음과 관련된 몇 가지 주요 난제에 직면한다: (1) 코로나바이러스에 의해 발현되고 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화 항체의 유도와 상용성인 천연 예비-융합 단백질을 나타내는 4차 구조를 갖는 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 능력; 및 (2) 트랜스제닉 스파이크 단백질의 동시 발현과 관련될 수 있는 제한된 간섭으로 세포-기반 발현 시스템에서 이의 제조 동안 바이러스 벡터를 증식시키는 능력.
실시양태에서, 백신의 제조와 항원성 둘 모두를 해결하기 위해 Covid-19 면역원성 조성물 또는 백신의 개발에는 감염된 세포의 표면 상에 발현된 융합전 삼량체 입체형태로 안정화된 스파이크 항원을 발현하는 바이러스 벡터를 설계하는 것이 요망될 수 있다. 다른 실시양태에서, 또한 면역원성 조성물 또는 백신의 제조와 항원성 둘 모두를 해결하는 Covid-19 면역원성 조성물 또는 백신의 개발에는 S1 또는 수용체 결합 도메인(RBD)과 같은 이의 면역원성 단편(스파이크 단백질)이 요망될 수 있다. 이러한 공격은, 부분적으로, SARS-Cov-2 스파이크 단백질의 "융합원성" 성질에 기인하며, 이는 본원에서 사용되는 바와 같이 이웃 세포와 융합하여 더 큰 융합체들 또는 융합체(다핵 숙주 세포)를 형성하도록 숙주 세포 상에서 발현되는 경우 진입 수용체와 무관하게 이러한 세포-세포 융합을 사용함으로써 매우 빠르게 증식하는 수단으로서 또는 진입 수용체로서 ACE2를 사용하여 숙주 세포에 진입하기 위한(예를 들어, 바이러스 입자의 표면 상의 코트 단백질로서) 스파이크 단백질의 융합 성질을 지칭한다. 숙주 세포 프로테아제에 의한 코로나바이러스 S 단백질의 프라이밍은 ACE2를 발현하는 세포로의 바이러스 진입에 필수적이며, S1/S2 및 S2' 부위에서 S 단백질 절단을 포함한다. SARS-CoV-2 S의 S1/S2 절단 부위는 높은 절단성을 나타내는 여러 아르기닌 잔기(다염기성)를 보유한다(Hoffmann et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor; Cell; 2020 Apr 16; 181(2): 271-280.e8). 막 융합으로 이어지는 S 단백질의 성공적인 입체형태 변화는 수용체 결합뿐만 아니라 적절한 프로테아제 활성화를 필요로 한다. 고병원성 인플루엔자 바이러스에서 발견되는 것들과 유사한 SARS-CoV-2 S 단백질에서 S1과 S2 서브유닛 사이에 푸린 부위(아미노산 682-685, RRAR)가 있다. 이러한 푸린 부위(RRAR)는 다른 코로나바이러스 S 단백질에 존재하지 않고(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Walls et al. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein; Cell; 2020 Mar 9]의 도 1c 참조), 불안정성에 기여할 수 있고, 아마도 바이러스-벡터 백신 개발을 교란시킬 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, SARS-Cov-2 스파이크 단백질에서 이러한 아미노산 잔기는 SARS-Cov-2 스파이크 단백질에 존재하는 S1과 S2 도메인 사이의 푸린 효소 절단 부위를 개선 또는 제거하기 위해 제거 및/또는 변형될 수 있다.
따라서, 스파이크 단백질을 안정화시키기 위한 한 가지 접근법은 (1) (아데노바이러스) 바이러스 벡터의 생산 동안 E1 상보성 세포주와 같이 세포-기반 제조에서 단백질의 발현 동안 및/또는 (2) 바이러스 벡터의 투여 후 포유동물에서 단백질의 발현 동안 단백질을 단백질분해성 분해에 더 내성으로 만드는 것이다. 단백질분해 절단 부위는 효소 분해를 방지하거나 감소시키기 위해 아미노산 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형될 수 있다. 이러한 유형의 접근법에 대한 관심 단백질분해 절단 부위는 바람직하게는 단백질 삼량체 복합체의 3차원 구조의 용매-대향 표면을 형성하는 단백질의 용매-접근성 영역에서 발견된다. 이러한 용매-접근 가능한 부위는 S1/S2 접합부 QTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO: 25) 및 S2' 접합부 PDPSKPSKRSF(SEQ ID NO: 26)를 포함한다. 다른 용매 접근 가능한 영역은 상대적 용매 접근 가능한 점수 영역(SASA)을 계산하는 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 스파이크 단백질의 단백질분해 절단에 관여하는 잠재적인 효소는 푸린, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, TMPRSS2, 키모트립신, 카텝신-L, 카텝신-B, TMPRSS11D, 디펩티딜 펩티다제 IV, MMP-13, MMP-12, MMP-2, MMP-9, MMP-3, 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9를 포함한다. 프로테아제 절단 부위는 Proper, Properous, PeptideCutter, Pripper, CasCleave, CasCleave 2.0, CASVM 및 iProt-Sub와 같은 공지된 알고리즘을 사용하여 예측될 수 있다.
SARS-CoV-2로부터의 S1/S2 접합부 QTQTNSPRRARSVASQ(SEQ ID NO: 25) 및/또는 다른 코로나바이러스의 상응하는 서열의 절단은 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 12로부터의 위치 685, 682 및/또는 683에서의 아르기닌과 같이 아르기닌 잔기에 주로 의존하는 것으로 입증되었다. 단백질분해 절단을 방해하기 위해, 아르기닌 잔기의 치환에는 친수성, 비-양으로 하전된 아미노산 또는 소형 아미노산, 예컨대, N, Q, D, E, T, S, G 또는 A가 고려될 수 있다. 또한, S1/S2 접합부는 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해 단백질분해 절단에 대해 내성이 될 수 있는데, 단, 이러한 서열 변형은 스파이크 항원의 3차원 입체형태를 변경하지 않아서 이의 항원성 및 중화 항체의 생산을 자극하는 능력을 보존한다. 유사한 접근법이 또한 서열 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 12에서 위치 814의 리신 잔기 및 위치 815의 아르기닌 잔기에 대해 S2' 접합부 PDPSKPSKRSF(SEQ ID NO: 26)에 적용될 수 있다. 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 SEQ ID NO: 18(바람직한 실시양태); SEQ ID NO: 19(바람직한 실시양태); 또는 SEQ ID NO: 20의 코딩 서열을 포함한다. 도 22 내지 도 24를 참조한다. 따라서, 특정의 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물의 코딩된 서열은 SEQ ID NO: 18 또는 SEQ ID NO: 19에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열이다.
다른 실시양태에서, 스파이크 단백질을 안정화시키기 위한 또 다른 접근법은 준안정 스파이크 단백질을 이의 융합전 입체형태로 유지하는 것을 포함한다. 융합전 입체형태에서 코로나바이러스 스파이크 단백질을 안정화시키기 위한 서열의 변형은 문헌[Pallesen et al. 2017 (Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Aug 29;114(35):E7348-E7357)] 및 문헌[Wrapp et al. 2020 (Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020 Mar 13;367(6483): 1260-1263)]에서 이전에 개시된 바 있는데, 이는 제1 헵타드 반복부(HR1)와 중심 나선(CH) 사이의 루프에서 프롤린 치환이 융합 단백질의 조기 촉발을 제한하고 종종 융합전 엑토도메인의 발현 수율을 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 22 내지 도 24 및 SEQ ID NO: 18, 19 및 20을 참조한다.
실시양태에서, 다른 접근법은 감염된 세포의 표면에서 단백질의 발현을 촉진하는 것으로 이루어진다. 스파이크 단백질은 막관통 및/또는 세포내 도메인의 성질과 관련된 현상인 소포체 및/또는 프리-골지/골지에 보유될 수 있다. 세포내 체류를 방지하는 것은 시스테인-부유 도메인에서 시스테인의 치환에 의해 또는 C-말단 소포체 보유 모티프(VKLHYT(SEQ ID NO: 409))의 변형을 통해 세포내 도메인(IC)을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 도 24 및 SEQ ID NO: 20을 참조한다.
특정 실시양태에서, 바이러스 벡터의 제조 동안 트랜스제닉 스파이크 단백질의 독성을 제한하는 것은 스파이크 항원 서열 내에 함유된 융합 펩타이드를 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 아미노산의 치환에 의한 변형은 융합 펩타이드의 알파-나선 입체형태를 파괴하기 위해 스파이크 서열에 도입될 수 있다. 융합 펩타이드의 알파 나선 입체형태의 파괴는 프롤린 잔기에 의한 특정 아미노산의 치환에 의해 달성될 수 있다.
따라서, 실시양태에서, 안정화된 전장 삼량체 스파이크 항원을 발현하는 Covid-19에 대한 바이러스 벡터 면역원성 조성물 또는 백신의 설계는 상기 기재된 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 표 1(S1/S2, S2' 및 융합 도메인) 및 표 2(HR1/CH 및 IC 도메인)(도 22 내지 도 24, SEQ ID NO: 18-20)에 제시되어 있다.
표 1
전장 스파이크의 안정성 또는 표면 발현을 증가시키기 위한 예시적인 변형
Figure pct00002
표 2
전장 스파이크 단백질의 안정성 또는 표면 발현을 증가시키는 예시적인 변형
Figure pct00003
실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 다가 조성물이다. 특정 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트는 SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함한다. 각각의 이러한 구조적 단백질은 본원에서 각각 SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 10으로 제시되어 있다. 또한 도 5, 도 6 및 도 10을 참조한다. 대안적인 실시양태에서, 이러한 구조 단백질은 별개의 복제 결함 아데노바이러스 벡터로부터 코딩될 수 있고, 적어도 SARS-CoV-2(2019 신종 코로나바이러스; 2019-nCoV) 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD), 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 갖는 다가 제제로서 제공될 수 있다.
융합후 스파이크 항원의 중화
상기 논의된 바와 같이, 서브그룹 B의 다른 베타-코로나바이러스와 달리, SARS-CoV-2의 S 단백질은 독특한 S1/S2 푸린-인식가능한 부위를 보유하는데, 이는 이의 S 단백질이 독특한 감염 성질을 가질 수 있음을 지시한다. 실제로, 활성 SARS-CoV-2 감염에서, 융합체 현상은 SARS-CoV 감염에서 거의 보고되지 않는 감염된 세포에 의해 자연적으로 형성되는 것으로 나타났는데, 이는 막 융합을 매개하는 높은 능력을 입증하는 것이다(Xu Z. et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. Lancet Respir Med. 2020 Apr;8(4):420-422). 이러한 세포변성 융합체는 아마도, 적어도 부분적으로, COVID-19 환자에서 관찰되는 병리학의 원인이 된다. 또한, 융합체의 형성은 수용체와 독립적으로 이러한 세포-세포 융합 기전을 이용함으로써 바이러스가 매우 빠르게 전파되는 것을 돕는다(수용체 독립적 확산). 따라서, 융합후 형태의 S 항원에 대한 중화 항체의 유도는 융합체의 형성을 제한하고/제한하거나 진입 수용체-비의존적 방식으로 바이러스의 빠른 확산을 방지하기 위한 수단을 나타낸다. 융합후 스파이크 항원은 프로테아제에 의한 스파이크 단백질의 절단 후에 달성된다. 절단은 문헌[Wall et al. 2017 (Walls, et al. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(42):11157-11162]에 제시된 바와 같이 S2 도메인의 3차원 재배열을 유도한다.
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 또한 또는 대안적으로 S1 도메인이 없는 스파이크 항원, 예컨대, 스파이크의 S2 도메인(대략 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 816) 또는 스파이크의 S2' 도메인(대략 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 816으로부터) 또는 SEQ ID NO: 3의 잔기 816 너머에서 시작되고 최소 HR1, HR2 및 막관통 도메인을 포함하는 서열의 세포에서 발현을 유발하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 이러한 SARS-CoV-2 면역화 벡터는 융합후 스파이크 단백질을 중화시키고(예를 들어, S2 도메인에 대한 항체), 융합체의 형성을 방지하고/방지하거나 진입-수용체 독립적인 방식으로 바이러스의 전파를 방지함으로써 보호를 제공하는 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 스파이크(S) 단백질의 S2 부분에 대한 코딩 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 발현 카세트는 융합 펩타이드를 대체하기 위한 추가의 막관통 도메인을 함유하는 스파이크(S) 단백질의 S2 부분에 대한 코딩 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 24)을 포함한다. SEQ ID NO: 21, 22, 23, 및 24의 폴리펩타이드는 하기에 나타나 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
T 세포 에피토프 펩타이드
실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 8 개 내지 60 개 아미노산 길이의 하나 이상의 펩타이드-코딩 서열(하나 초과인 경우 연결됨)을 포함하고, 여기서 각각의 펩타이드는 적어도 하나의 CD8+ T 세포 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. 이러한 경우, 연결된 펩타이드-코딩 폴리뉴클레오타이드는 T 세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프-함유 서열이 글리신, 세린 또는 알라닌 잔기와 같은 아미노산을 함유하는 스페이서 서열에 의해 분리된 폴리펩타이드를 발현한다. 폴리뉴클레오타이드는 유비퀴틴 또는 신호 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 하나 이상의 S 단백질 항원을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다(Ahmed, et al. Preliminary Identification of Potential Vaccine Targets for the COVID-19 Coronavirus (SARS-CoV-2) Based on SARS-CoV Immunological Studies. Viruses, 12: 254 (2020)). 하나 이상의 S 단백질 펩타이드 항원은 임의의 T 세포 에피토프, 예를 들어, 표 3A에 제시된 임의의 펩타이드를 포함할 수 있다:
표 3A
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 바람직한 실시양태에서, 벡터는 개별적으로 또는 단일 폴리펩타이드의 일부로서(예를 들어, 2 개 내지 10 개의 아미노산이 연결되거나, 선택적으로 링커 아미노산 서열에 의해 분리된) 다중 에피토프를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 표 3B에 제시된 예시적인 그룹에서와 같이 다중 에피토프를 코딩할 수 있다:
표 3B
Figure pct00009
Figure pct00010
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 조합의 에피토프가 또한 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 벡터(들)는 B 세포 에피토프일 수 있는 다음 에피토프 중 하나 이상을 코딩할 수 있다: DVVNQNAQALNTLVKQL (SEQ ID NO: 283), FFGMSRIGMEVTPSGTW (SEQ ID NO: 284), EAEVQIDRLITGRLQSL (SEQ ID NO: 285), GLPNNTASWFTALTQHGK (SEQ ID NO: 286), EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY (SEQ ID NO: 287), GTTLPK (SEQ ID NO: 288), EVAKNLNESLIDLQELG (SEQ ID NO: 289), IRQGTDYKHWPQIAQFA (SEQ ID NO: 290), GAALQIPFAMQMAYRFN (SEQ ID NO: 291), KHIDAYKTFPPTEPKKDKKK (SEQ ID NO: 292), GAGICASY (SEQ ID NO: 293), KHWPQIAQFAPSASAFF (SEQ ID NO: 294), AISSVLNDILSRLDKVE (SEQ ID NO: 295), YNVTQAFGRRGPEQTQGNF (SEQ ID NO: 296), GSFCTQLN (SEQ ID NO: 297), KTFPPTEPKKDKKKK (SEQ ID NO: 298), ILSRLDKVEAEVQIDRL (SEQ ID NO: 299), LLPAAD (SEQ ID NO: 300), KGIYQTSN (SEQ ID NO: 301), LNKHIDAYKTFPPTEPK (SEQ ID NO: 302), AMQMAYRF (SEQ ID NO: 303), LPQGTTLPKG (SEQ ID NO: 304), KNHTSPDVDLGDISGIN (SEQ ID NO: 305), LPQRQKKQ (SEQ ID NO: 306), MAYRFNGIGVTQNVLYE (SEQ ID NO: 307), PKGFYAEGSRGGSQASSR (SEQ ID NO: 308), AATKMSECVLGQSKRVD (SEQ ID NO: 309), QFAPSASAFFGMSRIGM (SEQ ID NO: 310), PFAMQMAYRFNGIGVTQ (SEQ ID NO: 311), QGTDYKHW (SEQ ID NO: 312), QALNTLVKQLSSNFGAI (SEQ ID NOS: 313, 50), QLPQGTTLPKGFYAE (SEQ ID NO: 314), QLIRAAEIRASANLAAT (SEQ ID NO: 315), QLPQGTTLPKGFYAEGSR (SEQ ID NO: 316), QQFGRD (SEQ ID NO: 317), QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ (SEQ ID NO: 318), RASANLAATKMSECVLG (SEQ ID NO: 319), TFPPTEPK (SEQ ID NO: 320), RLITGRLQSLQTYVTQQ (SEQ ID NO: 321), RRPQGLPNNTASWFT (SEQ ID NO: 322), EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY (SEQ ID NO: 323), SQASSRSS (SEQ ID NO: 324), SLQTYVTQQLIRAAEIR (SEQ ID NO: 325), SRGGSQASSRSSSRSR (SEQ ID NO: 326), 및 DLGDISGINASVVNIQK (SEQ ID NO: 327); 및/또는 이의 조합. 일부 바람직한 실시양태에서, 벡터는 개별적으로 또는 단일 폴리펩타이드의 일부로서(예를 들어, 일부 실시양태에서 2 개 내지 10 개의 아미노산이 연결되거나, 선택적으로 링커 아미노산 서열에 의해 분리된) 이러한 다중 에피토프를 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터에 의해 코딩된 SARS-CoV-2 펩타이드 서열은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 자극하는 능력에 기초하여 선택될 수 있고, 일부 실시양태에서 선택된 HLA 대립유전자의 범위에 걸쳐 가장 많은 수의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프를 함유하는 프로테옴 영역의 예측에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 서열에 걸친 HLA 클래스 II 결합 모티프의 분석은 IEDB에서 이용 가능한 NetMHCpan EL 4.0을 사용하여 수행될 수 있다(http://tools.iedb.org/mhci/; Jurtz, et al. NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data. J Immunol. 2017;199(9):3360-3368). 일부 실시양태에서, NetMHCpan EL 4.0은 HLA 클래스 I 분자에 대해 9 개 내지 11 개의 다양한 아미노산 길이를 갖는 결합 모티프를 확인하는 데 사용될 수 있고 백분율 순위(% 순위)가 할당된다. 일부 실시양태에서, 고 친화성 결합 펩타이드는 %-순위 ≤0.1을 나타내는 것으로 확인될 수 있는 반면, 중간 친화성 결합 펩타이드는 >0.1 내지 ≤0.5에 포함된 %-순위를 갖는 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, NetMHCpan EL 4.0 예측은 본원에 제시된 18 개의 HLA-A 대립유전자, 32 개의 HLA-B 대립유전자 및 20 개의 HLA-C 대립유전자의 세트로 수행될 수 있다: HLA-A*01:01, HLA-A*02:01, HLA-A*02:06, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*23:0, HLA-A*24:02, HLA-A*25:01, HLA-A*26:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*30:02, HLA-A*31:01, HLA-A*32:01, HLA-A*33:03, HLA-A*68:01, HLA-A*68:02, HLA-A*74:01, HLA-B*07:02, HLA-B*08:01, HLA-B*13:01, HLA-B*13:02, HLA-B*14:02, HLA-B*15:01, HLA-B*15:02, HLA-B*15:25, HLA-B*18:01, HLA-B*27:02, HLA-B*27:05, HLA-B*35:01, HLA-B*35:03, HLA-B*37:01, HLA-B*38:01, HLA-B*39:01, HLA-B*40:01, HLA-B*40:02, HLA-B*44:02, HLA-B*44:03, HLA-B*46:01, HLA-B*48:01, HLA-B*49:01, HLA-B*50:01, HLA-B*51:01, HLA-B*52:01, HLA-B*53:01, HLA-B*55:01, HLA-B*56:01, HLA-B*57:01, HLA-B*58:01, HLA-B*58:02, HLA-C*01:02, HLA-C*02:02, HLA-C*02:09, HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04, HLA-C*04:01, HLA-C*05:01, HLA-C*06:02, HLA-C*07:01, HLA-C*07:02, HLA-C*07:04, HLA-C*08:01, HLA-C*08:02, HLA-C*12:02, HLA-C*12:03, HLA-C*14:02, HLA-C*15:02, HLA-C*16:01 및 HLA-C*17:01. 다른 HLA 클래스 I 대립유전자가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 폴리펩타이드 서열 내의 HLA 클래스 II 결합 모티프는 NetMHCII 2.3을 사용하여 수행될 수 있는데(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/; Jensen et al. Improved methods for predicting peptide binding affinity to MHC class II molecules. Immunology. 2018 Jul;154(3):394-406), 이는 면역 에피토프 데이터베이스(IEDB)로부터의 정량적 펩타이드 결합 친화성 데이터에 대해 훈련된 인공 신경망의 앙상블에 기반한다. 일부 실시양태에서, NetMHCII 2.3은, 예를 들어, 백분율 순위(%-순위)(HLA 분자에 대한 펩타이드의 친화성과 관련됨) 및 코어 9 아미노산 결합 모티프를 결정함으로써 HLA 클래스 II 분자에 의해 제시될 수 있는 펩타이드를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고친화성 HLA 클래스 II 결합 펩타이드는 %-순위 ≤2를 나타내는 것들로서 확인될 수 있는 반면, 중간 친화성 결합 펩타이드는 %-순위 > 2 내지 10을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, NetMHCII 2.3 시스템은 본원에 제시된 20 개의 HLA-DR 대립유전자, 20 개의 HLA-DQ 대립유전자 및 9 개의 HLA-DP 대립유전자의 세트에 기반할 수 있다: DRα1*0101-DRβ1*0101, DRα1*0101-DRβ1*0301, DRα1*0101-DRβ1*0401, DRα1*0101-DRβ1*0701, DRα1*0101-DRβ1*0801, DRα1*0101-DRβ1*0802, DRα1*0101-DRβ1*0901, DRα1*0101-DRβ1*1001, DRα1*0101-DRβ1*1101, DRα1*0101-DRβ1*1201, DRα1*0101-DRβ1*1301, DRα1*0101-DRβ1*1302, DRα1*0101-DRβ1*150, DRα1*0101-DRβ1*1602, DRα1*0101-DRβ3*0101, DRα1*0101-DRβ3*0202, DRα1*0101-DRβ3*0301, DRα1*0101-DRβ4*0101, DRα1*0101-DRβ4*0103, DRα1*0101-DRβ5*0101, DPα1*0103-DPβ1*0301, DPα1*0103-DPβ1*0401, DPα1*0103-DPβ1*0402, DPα1*0103-DPβ1*0601, DPα1*0201-DPβ1*0101, DPα1*0201-DPβ1*0501, DPα1*0201-DPβ1*1401, DPα1*0301-DPβ1*0402, DPα1*0103-DPβ1*0201, DQα1*0101-DQβ1*0501, DQα1*0102-DQβ1*0501, DQα1*0102-DQβ1*0502, DQα1*0102-DQβ1*0602, DQα1*0103-DQβ1*0603, DQα1*0104-DQβ1*0503, DQα1*0201-DQβ1*0202, DQα1*0201-DQβ1*0301, DQα1*0201-DQβ1*0303, DQα1*0201-DQβ1*0402, DQα1*0301-DQβ1*0301, DQα1*0301-DQβ1*0302, DQα1*0303-DQβ1*0402, DQα1*0401-DQβ1*0402, DQα1*0501-DQβ1*0201, DQα1*0501-DQβ1*0301, DQα1*0501-DQβ1*0302, DQα1*0501-DQβ1*0303, DQα1*0501-DQβ1*0402 및 DQα1*0601-DQβ1*0402. 다른 HLA 클래스 II 대립유전자가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 적합할 수 있다.
선택된 70 개의 HLA 클래스 I 대립유전자에 걸친 HLA 클래스 I 결합 모티프의 수 및 고 또는 초고(+) 중간 친화성을 갖는 선택된 49 개의 HLA 클래스 II 대립유전자에 걸친 HLA 클래스 II 결합 모티프의 수를, SARS-CoV-2 서열을 스캐닝하고 도 27-70에 제시된 각각의 41 개 아미노산 길이 범위에 대해 각각 계산하였다. 이러한 분석을 위해, 예측된 막관통 도메인은 이들의 높은 소수성으로 인해 배제되었다. 이러한 분석에 기초하여, 표 4에 제시된 바와 같이 34 개 내지 124 개의 다양한 아미노산 길이를 갖는 사십이(42) 개의 긴 펩타이드 서열이 SRAS-CoV-2 프로테옴(SEQ ID NO: 410)에 걸쳐 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 모티프에서 가장 높은 함량을 기준으로 하여 선택되었다.
표 4
고밀도 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 결합 모티프를
함유하는 선택된 SARS-CoV-2 긴 펩타이드 서열(SEQ ID NO: 328 내지 369)
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
각각의 선택된 긴 서열 SEQ ID NO: 328 내지 SEQ ID NO: 369에 대해, 높거나 중간 정도의 결합이 예측된 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자의 수는 표 5에 제시되어 있다.
표 5
고밀도 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 결합 모티프를 함유하는 선택된 SARS-CoV-2 긴 펩타이드 서열 내에서 높거나 중간 정도의 결합이 예측된 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자의 수(SEQ ID NO: 328 내지 369)
Figure pct00015
긴 펩타이드 서열 SEQ ID NO: 328 내지 SEQ ID NO: 369에 더하여, 31 개 내지 47 개의 다양한 아미노산 잔기 길이를 갖는 삼십구(39) 개의 더 짧은 서열이 또한 확인되었다. 가장 많은 수의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 모티프를 갖는 SEQ ID NO: 328 내지 SEQ ID NO: 369 내의 서열의 일부에 상응하는 39 개의 더 짧은 펩타이드 서열은 표 6에 나타나 있다(SEQ ID NO: 370 내지 408). 실시양태에서, 이러한 더 짧은 펩타이드는 아데노바이러스 벡터로부터의 삽입 및 발현을 위해 연결될 수 있다.
표 6
고밀도 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 결합 모티프를 함유하는 선택된 SARS-CoV-2 더 짧은 펩타이드 서열(SEQ ID NO: 370 내지 408)
Figure pct00016
각각의 SEQ ID NO: 370-408에 대해(표 3), 높거나 중간 정도의 결합이 예측된 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자의 수는 표 7에 제시되어 있다.
표 7
고밀도 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 결합 모티프를 함유하는 선택된 SARS-CoV-2 더 짧은 펩타이드 서열 내에서 높거나 중간 정도의 결합이 예측된 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 대립유전자의 수(SEQ ID NO: 370 내지 408)
Figure pct00017
SEQ ID NO: 328 내지 SEQ ID NO: 369로부터 각각의 선택된 서열에 대해, HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 결합 모티프의 맵이 도 29 내지 도 70에 제시되어 있다. 도 29 내지 도 70에서, 이의 각각의 HLA 클래스 I 및 II 모티프에 대한 N-말단 아미노산(즉, 아미노산 #1)은 X 또는 O에 의해 확인되며, 여기서 X는 추가로 HLA 결합 모티프에 대한 고친화성 모티프를 나타내고 O는 중간 정도의 친화성을 나타낸다. 예시적인 HLA 결합 모티프는 각 도면에 표시된 SEQ ID 번호를 참조하여 X 또는 O 아미노산 잔기를 포함하고 각 모티프가 9 개 내지 11 개의 아미노산 잔기를 포함하도록 모티프에 후속하는 8 개 내지 10 개의 아미노산을 포함함으로써(즉, 각각의 모티프가 9-11 개의 아미노산 펩타이드임) 도 29 내지 도 70으로부터 추론될 수 있다. 임의의 이러한 결합 모티프는 본원에 개시된 벡터에서 단독으로 및/또는 조합하여 면역원으로서 사용될 수 있다. 임의의 SEQ ID NO: 328-369의 다른 결합 모티프가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원의 SARS-CoV-2 면역화 벡터에 포함시키기에 적합할 수 있다.
순환하는 SARS-CoV-2 변이체와 일치하는 RBD 서열
상기 기재된 바와 같이, rdAd 벡터는 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15에 상동성인 서열 또는 추가의 측접하는 잔기가 있거나 없는 SEQ ID NO: 446을 포함하고 도 17b에 기재된 것들과 같이 단일 또는 다중 RBD 돌연변이(들)를 혼입한 임의의 서열을 코딩하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, RBD 변이체 서열은 아미노산 위치 367, 403, 439, 417, 446, 447, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 487, 490, 493, 494, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505에서 단일 또는 조합된 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 아미노산 위치 넘버링은 SEQ ID NO: 3(전장 스파이크 단백질)에 상응한다(도 17b). 더욱 바람직하게는, RBD 서열은 위치 K417T, K417N, E484K, L452R 및/또는 N501Y에서 단일 또는 조합된 돌연변이를 포함한다(도 17b). 바람직한 실시양태에서, RBD 변이체 단백질 서열은 SEQ ID NO: 412-417로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 RBD 서열은 밑줄이 그어져 있다:
SARS-CoV 캘리포니아 CAL.20C B.1.429 계통으로부터의 스파이크 RBD:
Figure pct00018
SARS-CoV 브라질 P.2 계통 B.1.1.28.2 계통으로부터의 스파이크 RBD:
Figure pct00019
SARS-CoV UK VOC 202012/01; B.1.1.7 계통으로부터의 스파이크 RBD(일명 20I/501Y.V1):
Figure pct00020
SARS-CoV UK B.1.1.7 계통으로부터의 스파이크 RBD(E484K):
Figure pct00021
SARS-CoV 브라질 P.1 계통 B.1.1.28.1 계통으로부터의 스파이크 RBD(일명 20J/501Y.V3):
Figure pct00022
남아프리카 공화국 501Y.V2 B.1.351 계통(일명 20H/501Y.V2):
Figure pct00023
바람직한 실시양태에서, rdAd(1가 RBD 벡터)에 의해 발현되는 RBD 서열은 폴리펩타이드의 세포 분비 경로의 발현을 다루기 위해 리더/신호 펩타이드 서열이 선행될 것이다. 포유동물 세포에서 발현된 재조합 단백질의 효율적인 표적화를 위해 일반적으로 사용되는 리더 펩타이드 서열은 표 9에 기재되어 있다.
표 9
Figure pct00024
변이체 RBD 서열 및 다가 백신 조성물
공동-순환하는 SARS-CoV-2 변이체 및 잠재적으로 미래의 변이체에 대한 면역을 제공하는 다가 면역원성 조성물 또는 백신을 개발하는 것이 또한 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다가 유전 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 각각 동일한 제제에서 항원 서열 변이체를 발현하는 여러 1가 유전 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 조합함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 유전자 작제물은 또한 다중 항원 서열 변이체를 공동-발현하여 다가 RBD SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 제공하도록 작제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 본 개시의 rdAd 벡터는 스파이크 단백질 RBD 영역에 하나 이상의 돌연변이를 혼입하고 순환하는 SARS-CoV-2 변이체 및 잠재적으로 미래의 변이체에 대항하여 보호할 수 있는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 유전자 작제물은 단일 발현 카세트 내에 공선형으로 배열된 다중 RBD 변이체 단위를 포함할 수 있다. RBD 변이체 단위는 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 또는 추가의 측접 잔기가 있거나 없는 SEQ ID NO: 446을 포함하고 도 17b에 기재된 것들과 같이 단일 또는 다중 RBD 돌연변이(들)를 혼입한 임의의 서열로부터 선택될 수 있다. 각각의 RBD 변이체 단위는, 예를 들어, 글리신 및 세린 아미노산 잔기를 포함하는 가요성 스페이서 서열에 의해 공선형 배열로 다른 RBD 변이체로부터 이격될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 스페이서 펩타이드는 아미노산 서열 (GGGGS)n, (GGGGA)n, (GGGGQ)n, (GGGPS)n, (GPGPG)n 및 이들의 조합을 포함할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 10을 포함한다. 바람직하게는 본질적으로 친수성이고 극성 아미노산을 포함하는 다른 스페이서가 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 다염기성 모티프에서 전구체 단백질을 절단함으로써 생물활성 단백질 및 펩타이드, 예컨대, 호르몬, 수용체, 및 성장 인자를 생성하는 푸린 (PACE), PC1 (PC3), PC2, PC4, PACE4, PC5 (PC6), 및 PC7 (LPC, PC8)을 포함하는 세린 프로테아제의 그룹에 의해 표현되는, 진핵생물 서브틸라제로도 알려진, 전구단백질 컨버타제(PC)를 위한 하나 이상의 단백질분해 절단 모티프를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 다염기성 모티프는 하기 표에 기재된 것을 포함한다:
표 8
Figure pct00025
스페이서 서열은 바람직하게는 유사-단백질 서열 내에 네오-에피토프의 도입을 피하도록 최적화된다. 또한, 상이한 스페이서가 동일한 순서로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 가요성 부분 및 절단성 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 다가 작제물 내의 RBD 변이체 단위 사이에 상이한 스페이서 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 다가 RBD 벡터에서, 동일한 유전자 서열에서 공선형으로 배열된 RBD 변이체 단위의 수는 2 개 내지 10 개의 단위, 바람직하게는 2 개 내지 6 개의 단위로 다양할 수 있다. RBD 변이체 서열의 각각의 순서는 또한 다양할 수 있고; 스페이서의 사용은 각각의 RBD 변이체 단위가 면역원적으로 독립적이도록 도입된다. 각각의 RBD 변이체 단위는 도 17b에 기재된 것들과 같은 임의의 단일 돌연변이 또는 돌연변이의 조합을 포함할 수 있다.
바람직하게는, RBD 변이체 서열은 위치 367, 403, 439, 417, 446, 447, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 487, 490, 493, 494, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505에서 단일 또는 조합된 돌연변이를 포함할 수 있다(도 17b). 더욱 바람직하게는, RBD 서열은 위치 K417T, K417N, E484K, L452R 및/또는 N501Y에서 단일 또는 조합된 돌연변이를 포함하고, 여기서 아미노산 위치 넘버링은 SEQ ID NO: 3(전장 스파이크 단백질)에 상응한다(도 17b). SEQ ID NO: 438 내지 443 및 460은 다가 RBD 벡터의 설계에 사용될 수 있는 RBD 변이체 서열의 바람직한 실시양태로서 제공된다. 다중 RBD 변이체 단위를 포함하는 다가 RBD 서열의 바람직한 예는 SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 475 및 SEQ ID NO: 476으로 제시된다. 바람직한 실시양태에서, rdAd에 의해 발현될 다가 RBD 서열("다가 RBD 벡터", 다가 hAd5-SARS-CoV-2의 유형)에는 폴리펩타이드 세포 분비 경로의 발현을 다루기 위해 리더/신호 펩타이드 서열이 선행될 것이다. 포유동물 세포에서 발현된 재조합 단백질의 효율적인 표적화를 위해 일반적으로 사용되는 리더 펩타이드 서열은 표 9에 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, RBD 변이체 단백질 서열은 SEQ ID NO: 438-443 및 460으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 예시적인 다가 RBD 작제물은 하기 SEQ ID NO: 444, 445, 475 및 476에 나타나 있고, 여기서 RBD 서열은 밑줄이 그어져 있다:
SARS-CoV로부터의 스파이크 RBD(젠뱅크: MN908947.3):
Figure pct00026
SARS-CoV 캘리포니아 CAL.20C B.1.429 계통으로부터의 스파이크 RBD:
Figure pct00027
SARS-CoV 브라질 P.2 계통 B.1.1.28.2 계통으로부터의 스파이크 RBD:
Figure pct00028
SARS-CoV UK VOC 202012/01; B.1.1.7 계통으로부터의 스파이크 RBD(일명 20I/501Y.V1):
Figure pct00029
SARS-CoV UK B.1.1.7 계통으로부터의 스파이크 RBD(E484K):
Figure pct00030
SARS-CoV 브라질 P.1 계통 B.1.1.28.1 계통으로부터의 스파이크 RBD(일명 20J/501Y.V3):
Figure pct00031
남아프리카 공화국 501Y.V2 B.1.351 계통(일명 20H/501Y.V2):
Figure pct00032
SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 443 및 SEQ ID NO: 441을 포함하는 다가 RBD 작제물의 조합:
Figure pct00033
SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 443 및 SEQ ID NO: 441을 포함하는 다가 RBD 작제물의 조합:
Figure pct00034
SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442 및 SEQ ID NO: 443을 포함하는 다가 RBD 작제물의 조합:
Figure pct00035
SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442 및 SEQ ID NO: 443을 포함하는 다가 RBD 작제물의 조합:
Figure pct00036
다른 펩타이드, 폴리펩타이드, 작제물, 및 이들의 조합은 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다.
수용체 결합 길항제
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터(즉, 하나 이상의 외인성 항원을 발현하는 것들)는 하나 이상의 SARS-CoV-2 차단 단백질(예를 들어, 수용체 결합 길항제)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스는 숙주 세포 부착, 융합 및 숙주 세포로의 진입을 위해 스파이크(S) 단백질의 동종삼량체를 사용하는 것으로 알려져 있고, 시알산 및/또는 ACE2(안지오텐신 1의 안지오텐신 1-9로의 절단 및 안지오텐신 II의 혈관확장제 안지오텐신 1-7로의 절단을 촉매작용하여 전신 혈압 조절에서 중요한 역할을 하는 세포막 C-말단 고정 단백질(Alifano, et al. Renin-angiotensin system at the heart of COVID-19 pandemic. Biochimie, 174: 30-33 (2020))을 포함할 수 있다. 숙주 세포 프로테아제는 코로나바이러스 S 단백질을 가공하여 2 개의 서브유닛(S1 및 S2)을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 이는 바이러스의 융합전 입체형태에서 비공유적으로 결합된 상태로 유지된다(예를 들어, 문헌[Tortorici, et al. Structural basis for human coronavirus attachment to sialic acid receptors. Nat. Struc. Mol. Biol. 26: 481-489 (2019)] 참조). S1 서브유닛은 도 13에 제시된 바와 같이 링커 서열에 의해 분리된 NTD 및 RBD를 갖는 4 개의 도메인 NTD, RBD, SD1 및 SD1을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 또한 또는 대안적으로, 일부 바람직한 실시양태에서, S 단백질(예를 들어, S1 RDB 및/또는 NTD 도메인(들)에 대한 항체)의 상기 언급된 시알산 및/또는 ACE2로의 결합을 방해하여 SARS-CoV-2의 숙주 세포 내로의 진입 및/또는 ACE2에 대한 이의 효과를 방해하는 면역 반응을 유도하는, S1 도메인(NTD 및/또는 RBD) 중 적어도 하나 또는 둘 모두 또는 전장 S 단백질(막관통 도메인의 존재 또는 부재)의 일부, 및/또는 이의 면역원성 단편으로서 세포에서 발현을 유발하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 또한 또는 대안적으로 S 단백질(예를 들어, S1 RDB 및/또는 이의 NTD 도메인(들), 및/또는 S2)에 결합하여, SARS-CoV-2의 숙주 세포 내로의 진입을 방해(예를 들어, S 단백질이 이의 숙주 세포 수용체, 예컨대, ACE2에 결합하는 것을 차단) 및/또는 ACE2(총괄하여 "RBD 결합제"로 지칭됨)에 대한 이의 효과를 방해할 수 있는 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 또는 펩타이드(예를 들어, ACE2 모방체, RBD 결합 펩타이드))의 세포에서 발현을 유발하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RBD 결합제는 ACE2의 바이러스-결합 도메인에 상응하는 적어도 하나의 도메인을 갖는 펩타이드, 예를 들어, RBD와 입체형태적으로 일치하는 펩타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 또한 또는 대안적으로 ACE2에 결합할 수 있는 단백질(예를 들어, ACE2 결합제)의 세포에서 발현을 야기하고/야기하거나 달리 S 단백질이 이에 부착하는 것을 방지하고(예를 들어, S1 RDB 및/또는 이의 NTD 도메인(들), 및/또는 S2는 유리 단백질로서 발현될 수 있음), 이에 의해 SARS-CoV-2의 숙주 세포 내로의 진입 및/또는 바람직하게는 ACE2의 정상적인 생리학적 기능(즉, SARS-CoV-2에 대한 수용체로서 작용하는 이의 능력 외에)을 방해하지 않으면서 ACE2에 대한 이의 효과를 방해하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 ACE2 결합제는 ACE2에 대한 SARS-CoV-2의 결합을 방해하는 펩타이드와 같은 펩타이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터는 RBD 결합제와 ACE2 결합제 둘 모두, 및/또는 이중 RBD 결합제와 ACE2 결합제 둘 모두를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, RBD 결합제(들) 및/또는 ACE2 결합제(들)는 현재 RBD와 상호작용하는 것으로 이해되는 ACE2로부터의 15 개 잔기(24(Q), 27(T), 30(D), 31(K), 34(H), 35(E), 37(E), 38(D), 41(Y), 및 42(Q)는 α1에 있고, 하나의 잔기(잔기 82 M)는 α2로부터 유래되고, 잔기 353(K), 354(G), 355(D), 및 357(R)은 β3와 β4 사이의 링커로부터 유래됨) 중 하나 이상에서, 바람직하게는 ACE2 단백질의 정상적인 생리학적 기능(즉, SARS-CoV-2에 대한 수용체로서 작용하는 능력 이외의)에 영향을 미치지 않으면서, ACE2와 RBD의 상호작용을 방해한다(Han, et al. Computational Design of ACE2-Based Peptide Inhibitors of SARS-CoV-2. ACS Nano　2020, 공개일: 2020년 4월 14일(https://doi.org/10.1021/acsnano.0c02857); Yan, et al. Structural Basis for the Recognition of the SARS-CoV-2 by Full-Length Human ACE2. Science 367: 1444-1448 (2020)). 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시의 SARS-CoV-2 면역화 벡터는 ACE2 수용체에 결합하고 이를 차단할 수 있는 분비된 항원(예를 들어, S1, NTD, RBD, ACE2 결합제)을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 면역에 더하여 추가 활성을 부가할 수 있다.
바이러스 벡터화된 애주번트
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터(들)는 또한 또는 대안적으로 숙주 세포에 의해 발현되는 벡터(들)의 면역원성을 개선하거나 증진시키고(예를 들어, 애주번트(예를 들어, 분자 애주번트)로서 작용하고), 항-SARS-CoV-2 면역 반응의 유도를 보조하고, 및/또는 숙주에 대한 벡터(들)의 투여로부터 야기되는(예를 들어, 바람직한 실시양태에서, SARS-CoV-2 감염으로부터 환자의 회복을 방해할 수 있는 전신 염증 반응을 유도하지 않으면서) 진행 중인 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 증진시키는 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역화 벡터(들)는 다음 중 하나 이상을 코딩할 수 있다: 1) "공동-자극" 성분(들)으로서 작용하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 예컨대, 이를테면, CD28 패밀리의 구성원을 결합하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드(즉, CD28, ICOS; CD28, ICOS; Hutloff, et al. Nature 1999, 397: 263-265; Peach, et al. J Exp Med 1994, 180: 2049-2058), 예컨대, CD28 결합 폴리펩타이드 B7.1(CD80; Schwartz, 1992; Chen et al, 1992; Ellis, et al. J. Immunol., 156(8): 2700-9) 및 B7.2(CD86; Ellis, et al. J. Immunol., 156(8): 2700-9); 인테그린 패밀리의 구성원(즉, LFA-1 (CD11a / CD18); Sedwick, et al. J Immunol 1999, 162: 1367-1375;
Figure pct00037
Science 1998, 282: 2266-2269; Lub, et al. Immunol Today 1995, 16: 479-483), 예컨대, ICAM 패밀리의 구성원(즉, ICAM-1, -2 또는 -3); CD2 패밀리 구성원(즉, CD2, 신호전달 림프구 활성화 분자(CDw150 또는 "SLAM"; Aversa, et al. J Immunol 1997, 158: 4036-4044), 예컨대, CD58(LFA-3; CD2 리간드; Davis, et al. Immunol Today 1996, 17: 177-187) 또는 SLAM 리간드(Sayos, et al. Nature 1998, 395: 462-469); 열 안정성 항원(HSA 또는 CD24; Zhou, et al. Eur J Immunol 1997, 27: 2524-2528); TNF 수용체(TNFR) 패밀리의 구성원(즉, 4-1BB(CD137; Vinay, et al. Semin Immunol 1998, 10: 481-489)), OX40(CD134; Weinberg, et al. Semin Immunol 1998, 10: 471-480; Higgins, et al. J Immunol 1999, 162: 486-493), 및 CD27(Lens, et al. Semin Immunol 1998, 10: 491-499)), 예컨대, 4-1BBL(4-1BB ligand; Vinay, et al. Semin Immunol 1998, 10: 481-48; DeBenedette, et al. J Immunol 1997, 158: 551-559), TNFR 관련 인자-1(TRAF-1; 4-1BB 리간드; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862, Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565), TRAF-2(4-1BB 및 OX40 리간드; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187: 1849-1862; Oshima, et al. Int Immunol 1998, 10: 517-526, Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), TRAF-3(4-1BB 및 OX40 리간드; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Jang, et al. Biochem Biophys Res Commun 1998, 242: 613-620; Kawamata S, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), OX40L(OX40 리간드; Gramaglia, et al. J Immunol 1998, 161: 6510-6517), TRAF-5(OX40 리간드; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18: 558-565; Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273: 5808-5814), 및 CD70(CD27 리간드; Couderc, et al. Cancer Gene Ther., 5(3): 163-75), CD154(CD40 리간드 또는 "CD40L"; Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161: 4563-4571; Sine, et al. Hum. Gene Ther., 2001, 12: 1091-1102); 2) 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, 문헌[Ohs, et al. Interleukin-Encoding Adenoviral Vectors as Genetic Adjuvant for Vaccination against Retroviral Infection. PLos One, 8(12): e82528 (Dec. 2013)]에서 레트로바이러스에 대해 기재된 바와 같은), 예컨대, 인터루킨-2(IL-2)(Rosenberg, et al. Nature Med. 4: 321-327 (1998)), IL-4, IL-5, IL-6 IL-7, IL-12(문헌[Pardoll, 1992; Harries, et al. J. Gene Med. 2000 Jul-Aug;2(4):243-9; Rao, et al. J. Immunol. 156: 3357-3365 (1996)]에서 검토됨), IL-15(Xin, et al. Vaccine, 17:858-866, 1999), IL-16(Cruikshank, et al. J. Leuk Biol. 67(6): 757-66, 2000), IL-18(J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. 127(12): 718-726), GM-CSF(CSF (Disis, et al. Blood, 88: 202-210 (1996)), IL-23, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 또는 인터페론(예를 들어, 인터페론-감마(INF-γ)); 3) 케모카인, 예컨대, 항-종양 면역을 유도하는 것으로 밝혀진 종양 자가-항원에 융합된 CXCL10(IP-10) 및 CCL7(MCP-3)을 포함하는 융합 단백질(Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999, 17: 253-258), CCL3(MIP-1α), 및/또는 CCL5(RANTES)(Boyer, et al. Vaccine, 1999, 17 (Supp. 2): S53-S64); 4) 면역 억제 단백질 및/또는 펩타이드, 예컨대, 항-CTLA-4 작용제(들)(Shrikant, et al. Immunity, 1996, 14: 145-155; Sutmuller, et al. J. Exp. Med., 2001, 194: 823-832), 항-CD25 작용제(들)(Sutmuller, 상동), 항-CD4 작용제(들)(Matsui, et al. J. Immunol., 1999, 163: 184-193), 융합 단백질 IL13Rα2-Fc(Terabe, et al. Nature Immunol., 2000, 1: 515-520), 항-사이토카인 작용제(예컨대, 항-IL6, 항-IL6 수용체, 항-IL17과 같은 항체 또는 이의 단편(예를 들어, BMS-945429(ALD518), 클라자키주맙, 두필루맙, 엘실리모맙, 올로키주맙(CDP6038), 실툭시맙(Sylvant), 시루쿠맙(CNTO 136), 토클리주맙(Actemra); 또한 본원의 표 4에 열거된 작용제들 참조); 5) 하나 이상의 TLR 효능제(LPS 모사 7-mer 펩타이드(TLR4 효능제; 예를 들어, Gln Glu Ile Asn Ser Ser Tyr (SEQ ID NO: 463) (RS01); Ser His Pro Arg Leu Ser Ala (SEQ ID NO: 464) (RS02); Ser Met Pro Asn Pro Met Val (SEQ ID NO: 465) (RS03); Gly Leu Gln Gln Val Leu Leu (SEQ ID NO: 466) (RS04); His Glu Leu Ser Val Leu Leu (SEQ ID NO: 467) (RS05); Tyr Ala Pro Gln Arg Leu Pro (SEQ ID NO: 468) (RS06); Thr Pro Arg Thr Leu Pro Thr (SEQ ID NO: 469) (RS07); Ala Pro Val His Ser Ser Ile (SEQ ID NO: 470) (RS08); Ala Pro Pro His Ala Leu Ser (SEQ ID NO: 471) (RS09); Thr Phe Ser Asn Arg Phe Ile (SEQ ID NO: 472) (RS10); Val Val Pro Thr Pro Pro Tyr (SEQ ID NO: 473) (RS11); 및, Glu Leu Ala Pro Asp Ser Pro (SEQ ID NO: 474) (RS12)); 또는 플라겔린(TLR5 효능제(예를 들어, FliC; Skountzou, et al. Salmonella flagellins are potent adjuvants for intranasally administered whole inactivated influenza vaccine, Vaccine. May 28; 28(24): 4103-4112 (2010)); 예를 들어, 통합된 TLR 효능제 서열을 갖는 S1 서브유닛(Kim et al. Microneedle array delivered recombinant coronavirus vaccines: Immunogenicity and rapid translational development. EBioMedicine (2020)); 및 이들의 조합. 다른 유형의 분자 애주번트의 사용이 또한 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 본원에서 고려된다.
제제
일부 실시양태에서, 인간 대상체를 위해 코돈-최적화될 수 있는 SARS-CoV-2 스파이크(S) 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 함유하고 발현하는 본 발명의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터는 다른 코로나바이러스 항원(예를 들어, 바이러스 벡터 발현 항원)과 조합하여 다가 코로나바이러스 약학 제제를 형성할 수 있다. 다른 성분은 스파이크 단백질 항원을 함유하는 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 제시된 것과 상이한 에피토프에 대한 항체로 체액 반응을 유도하기 위해 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다른 성분(들)은 코로나바이러스 항원에 대한 세포-매개 또는 점막 면역 반응과 같은 면역 시스템의 상이한 아암을 유도하기 위해 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 비강내 투여에 적합한 1가 또는 다가 코로나바이러스 약학 제제로서, 적어도 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 유효량의 rdAd 벡터(즉, 하나 이상의 SARS-CoV-2 벡터); 및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체를 포함하는, 제제가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, rdAd 벡터는 인간 대상체에 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 함유하고 발현하며; 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체를 함유한다. 특정 실시양태에서, 유효량은 SARS-CoV-2 감염에 대해 적어도 1 개월(예를 들어, 28 일 또는 4 주), 적어도 2 개월, 적어도 3 개월, 적어도 6 개월, 적어도 8 개월, 적어도 12 개월, 적어도 13 개월, 또는 적어도 14 개월 동안 인간 대상체에게 혈청보호, 점막 보호 또는 세포 보호(예를 들어, T 세포와 같은 세포 면역 반응에 기반함)를 제공하도록 구성된 보호 면역 반응을 유도한다. 적어도 1 개월 내지 적어도 14 개월의 기간이 보호 기간으로 간주될 수 있다. 특정 실시양태에서, 보호 면역 반응은 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 반응을 포함한다. 실시양태에서, 보호 면역 반응은 단일 비강내 용량을 통해 유도된다. 대안적인 실시양태에서, 보호 면역 반응은 2 회 이상의 비강내 용량, 예를 들어, 프라임 용량 및 이어서 약 2 주 내지 3 주 후에 부스트 용량을 통해 유도된다.
예시적인 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 비강내 투여에 적합한 SARS-CoV-2 면역원성 조성물(예를 들어, 백신) 약학 제제로서, 적어도 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 유효량의 적어도 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터, 또는 인간 대상체에 코돈 최적화된 이의 적어도 하나의 면역원성 단편; 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하고, 인간 대상체에서 스파이크 단백질 RBD에 중화 항체를 유도하도록 구성되는 조성물이 본원에 제공된다.
투약량, 투여 경로, 제형, 애주번트, 및 재조합 바이러스 및 이로부터의 발현 산물을 위한 용도와 관련하여, 본 발명의 조성물은 비경구, 국소 또는 점막 투여를 위해, 바람직하게는 진피내, 피하, 비강내 또는 근육내 경로에 의해 사용될 수 있다. 점막 투여가 사용될 때, 경구, 안구 또는 비강 경로를 사용하는 것이 가능하다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 비강내로 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 포유동물 대상체에게 비강내로 투여된다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 미세바늘과 같은 장치를 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kim et al. EBioMedicine, 00 (2020)]에서와 같이).
관심 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 제제)은 약학 또는 수의학 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지된 표준 기법에 따라 제조될 수 있다. 실시예 1 및 실시예 2를 참조한다. 이러한 제제는 연령, 성별, 체중 및 투여 경로와 같은 요인을 고려하여 임상 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지된 투약량 및 기법으로 투여될 수 있다. 상기 제제는 단독으로(즉, 단독의 활성제(들)로서) 투여될 수 있거나, 조성물, 예를 들어, "다른" 면역원성 조성물, 또는 약독화, 불활성화 재조합 면역원성 조성물(예를 들어, 백신) 또는 치료용 조성물과 함께 공동 투여되거나 순차적으로 투여되므로, 본 발명의 다가 또는 "칵테일" 또는 조합 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 동결 방지제로서의 수크로스 및 비이온성 계면활성제로서의 폴리소르베이트-80을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 자유 라디칼 산화 억제제 에탄올 및 히스티딘, 금속-이온 킬레이트화제 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 유사한 활성(예를 들어, 금속 이온 촉매작용된 자유 라디칼 산화를 차단 또는 방지함)을 갖는 기타 제제를 추가로 포함한다.
상기 조성물(예를 들어, 제제)은 점막 투여, 예를 들어, 경구, 비강, 안구 등의 투여를 위한 액상 제제, 현탁액과 같은 제형, 및 비경구, 피하, 진피내, 근육내, 정맥내 투여(예를 들어, 주사 가능한 투여)를 위한 제제, 예컨대, 멸균 현탁액 또는 에멀젼으로 존재할 수 있다. 이러한 제형에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 멸균수, 생리 식염수 점도 향상 부형제 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 점막부착제, 점막 침투제 및 점막 파괴제를 포함하는 점막 투여를 위한 특정 특수 제제가 사용될 수 있다. 상기 제제는 또한 동결 건조되거나 냉동될 수 있다. 상기 제제는 투여 경로 및 요망되는 제제에 따라 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 애주번트, 보존제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기 제제는 적어도 하나의 애주번트 화합물을 함유할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 애주번트가 첨가되지 않는다. 본원에 참조로 포함되는 문헌["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]와 같은 표준 교과서는 과도한 실험 없이 적절한 제제를 제조하는 데 참고될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유효량(예를 들어, 보호 면역 반응을 유도하는 양)의 아데노바이러스 벡터는 적어도 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 인간 대상체에 코돈 최적화된 코로나바이러스 스파이크 단백질 항원, 또는 이의 단편을 함유하고 발현하는 복제 결핍 아데노바이러스 벡터이다. 당해 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 코돈 최적화는 숙주 유기체에서 이종 유전자의 발현을 개선한다.
바람직한 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터 및/또는 면역원성 조성물의 "유효량"은 일부 실시양태에서 SARS-CoV-2 감염(및/또는 CoV 질병 진행)으로부터 보호될 수 있는 항-SARS-CoV-2 면역 반응(예를 들어, 체액, 점막 및/또는 세포-매개 면역 반응)을 유도하기에 충분한 형태, 용량, 및/또는 투여 섭생으로 숙주 세포에 투여되는 양이다. 일부 실시양태에서, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, 유효량이 투여된 숙주는 CoV 및/또는 이의 항원(또는 면역원)에 결합하는 항체를 생산한 항-SARS-CoV-2 항체-생산 세포(예를 들어, B 세포, 형질 세포)의 수 및/또는 기능, 예컨대, SARS-CoV-2 특이적 면역글로불린 G(IgG) 반응의 유도(예를 들어, 출현) 및/또는 증가를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, 유효량이 투여된 숙주는 항-SARS-CoV-2 세포-매개 반응을 형성하는 세포(예를 들어, T 세포, 과립구, 자연 살해(NK) 세포 등)의 수 및/또는 기능의 유도(예를 들어, 출현) 및/또는 증가를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량이 투여된 숙주는 항-SARS-CoV-2 항체-생산 세포 및 항-SARS-CoV-2 세포-매개 반응을 형성하는 세포의 수 및/또는 기능의 유도(예를 들어, 출현) 및/또는 증가를 나타낼 수 있다.
유효량이 투여된 숙주가 항-SARS-CoV-2 항체-생산 세포의 수 및/또는 기능의 유도(예를 들어, 출현) 및/또는 증가를 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2-특이적 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)이 사용될 수 있다. 뮤린 모델을 사용하여 실시예에 제시된 바와 같이, 면역원성 조성물의 투여 후(예를 들어, 투여 21 일 후), 마우스는 SARS-CoV-2-특이적 ELISA를 사용하여 전신 항체 반응의 존재를 결정하기 위한 샘플을 제공하기 위해(예를 들어, SARS-CoV-2 특이적 IgG 반응이 발생했는지 결정하기 위해) 채혈될 수 있다. 간략히, ELISA는 폴리스티렌 96-웰 플레이트를 소듐 카보네이트 완충액(pH 9.3)에서 1 μg/ml의 SARS-CoV-2 S 단백질로 4℃에서 밤새 코팅함으로써 수행될 수 있다. 플레이트는 세척되고(예를 들어, 0.02% Tween 20을 갖는 PBS에서 3 회), 적합한 양의 시간 및 온도 동안(예를 들어, PBS, 2% BSA, 및 0.02% Tween 20로 37℃에서 1 시간) 차단(예를 들어, 무지방 분유로)될 수 있다. hAd5-SARS-CoV-2 백신접종된 마우스로부터의 혈청은 연속 희석되고(예를 들어, PBS에서), 적절한 온도 및 시간(예를 들어, 37℃)에서 인큐베이션되고, 세척되고(예를 들어, 0.02% Tween 20을 함유하는 PBS로 4 회), 이후 적절한 양의 시간(예를 들어, 1 시간) 동안 표지된 이차 항체(예를 들어, 비오틴-표지된 염소 항-마우스 이차 항체)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 샘플은 세척되고 적절한 시약(예를 들어, HRP-접합된 스트렙타비딘)과 함께 인큐베이션되고, 적절한 제제(예를 들어, 테트라메틸벤지딘 기질)를 사용하여 현상될 수 있으며, 반응은 적절한 시약(예를 들어, 2 N H2SO4)의 첨가로 중단되고, 방출(450 nm)은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 판독된다. 일부 실시양태에서, 숙주에 대한 하나 이상의 CoV 항원(예를 들어, 스파이크 단백질)을 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 유효량의 면역원성 조성물의 투여는 특정 유형(예를 들어, IgA, IgM, IgG) 및/또는 양(예를 들어, 반응을 나타내는 특정 역 평균 종점(예를 들어, 나이브 숙주와 비교하여))의 SARS-CoV-2-특이적(예를 들어, CoV S 단백질-특이적) 항체의 발현을 야기할 수 있다. 다른 검정 시스템이 또한, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 중화 항체 검정과 같은 유효량이 투여되었는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
유효량이 투여된 숙주가 항-SARS-CoV-2 세포-매개 반응을 형성하는 세포의 수 및/또는 기능의 유도(예를 들어, 출현) 및/또는 증가를 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 세포 유형 및/또는 수 및/또는 사이토카인 발현 및/또는 기능적 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물이 투여된(또는 조성물을 투여한) 숙주의 T 세포는 단리되고 연구될 수 있다(예를 들어, 다른 세포로부터 물리적으로 단리되고/단리되거나 혈액과 같은 생물학적 샘플 내의 존재로서). 일부 실시양태에서, 세포내 사이토카인 염색 검정은 특정 사이토카인을 발현하는 세포의 유형 및/또는 수, 및/또는 그 안에서 발현되는 이러한 사이토카인의 수준을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 간략히, 면역원성 조성물이 투여된 숙주의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 비장)은 투여 후 특정 시점(예를 들어, 투여 후 8 일 내지 21 일)에 단리될 수 있다. 이어서, 상기 생물학적 샘플(들)로부터 단리된 세포(예를 들어, 세포 배양 배지(예를 들어, 10% FBS 및 HEPES를 갖는 RPMI) 중 대략 106 개 세포)는 배양 플레이트(들)(예를 들어, 둥근 바닥 96 웰 플레이트)에 플레이팅되고, 자극제(들)(예를 들어, 10 μg/ml의 브레펠딘 A 및 α-CD3(2C11 클론) 또는 10 μg의 CoV 펩타이드(예를 들어, 90% DMSO 중의 스파이크 항원 SARS-CoV-2 펩타이드(SEQ ID NO 3))의 존재에서 적절한 양의 시간, 온도 등(예를 들어, 37℃, 5% CO2에서 6시간)에서 자극될 수 있다. CoV 펩타이드 자극 후, 세포는 세척되고(예를 들어, 인산염-완충 식염수(PBS)로 1 회), 세포 유형을 지시하는 다음 세포 표면 마커(예를 들어, α-CD8-PerCP-Cy 5.5(클론 53-6.7), α-CD3-AF700(클론 500A2), 및 α-CD19-BV605(클론 1D3))에 대해 염색될 수 있다. 이후, 세포는 고정되고(예를 들어, 포르말린 사용), 투과되고, 세포내 사이토카인 마커(예를 들어, α-IFN-γ-APC(클론 B27))에 대해 염색되고, 유세포 분석(예를 들어, Attune-NXT 사용)에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량은 사이토카인(예를 들어, IFN-γ)을 발현하는 세포의 수를 증가시키는 면역원성 조성물의 양 및/또는 이러한 세포에 의해 발현되는 양일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 면역 반응은 보호성인데, 이는 SARS-CoV-2 감염의 증상 중 하나 이상을 경험하는 것으로부터 숙주를 보호할 수 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 보호 면역 반응은 SARS-CoV-2 감염을 예방하며, 이는 유효량이 투여된(유효량을 투여한) 숙주의 공격에 의해 입증될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보호성인 면역원성 조성물, 및/또는 이의 유효량은 백신이다. 면역원성 조성물이 보호성인지 여부를 결정하기 위해, 전임상 동물 모델이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 감염 및 질병에 민감한 마우스에 투여될 수 있고, 마우스는 후속 시간(예를 들어, 투여 후 7-21 일)에 생 SARS-CoV-2에 의해 공격되고, 대조군과 비교하여 생존 및/또는 증상에 대해 모니터링될 수 있다. 질병의 임상 징후(예를 들어, 상기도 및 하기도 증상)를 포함하는 SARS-CoV-2 감염의 증상이 또한 모니터링될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, hAd5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물이 보호성인지(즉, 백신인지)의 여부를 결정하기 위해, 당업자는 동물 공격 연구를 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동물 모델의 백신접종 후, 보호성 면역 반응의 유도를 입증할 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 또는 병소 감소 중화 시험(FRNT)과 같은 중화 항체의 역가를 결정하기 위한 검정이 수행된다. 이러한 경우에, 혈청 또는 다른 생물학적 유체는 백신접종 후 동물(예를 들어, hAd5-SARS-CoV-2로)로부터 수집되고, SARS-CoV-2 현탁액과 혼합되고, 혈청 항체가 SARS-CoV-2와 반응할 수 있도록 일정 기간 동안 인큐베이션된다. 혈청 항체/SARS-CoV-2 혼합물은 숙주(즉, SARS-CoV-2 허용) 세포의 전면생장 단층 위에 부어진다. 세포 층의 표면은 SARS-CoV-2 바이러스가 무차별적으로 확산되는 것을 방지하기 위해 한천 또는 카르복시메틸 셀룰로스의 층으로 덮여 있다. 플라크 형성 단위(pfu)의 농도는 며칠 후에 형성된 플라크(감염된 세포의 영역)의 수에 의해 추정될 수 있다. 플라크 형성 단위는 현미경 관찰, 형광 항체 또는 감염된 세포와 반응하는 특정 염료에 의해 측정될 수 있다. 무혈청 바이러스와 비교하여 플라크의 수를 50%만큼 감소시키기 위한 혈청의 농도는 얼마나 많은 중화 항체가 존재하는지 또는 이것이 얼마나 효과적인지(즉, 보호성)의 척도를 제공한다. 이러한 측정은 PRNT50 값으로 표시된다. 또한, FRNT 검정에서, 바이러스는 FRNT50을 유사하게 계산하기 위해 항체 표지를 사용하여 가시화될 수 있다. 유사-바이러스 중화 검정 또는 ACE-2 결합 억제 검정을 사용하는 다른 방법은 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체의 존재를 정량화하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 약 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 유효량의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 약 108 개 바이러스 입자(vp)의 유효량의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특정의 다른 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 약 109 개 바이러스 입자(vp)의 유효량의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특정의 다른 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 약 1010 개 이상 바이러스 입자(vp)의 유효량의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 특정의 다른 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 약 1011 개 이상 바이러스 입자(vp)의 유효량의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 반려동물 또는 가축 또는 식용 또는 사료 생산 또는 가축 또는 게임 또는 경주 또는 스포츠 동물, 예컨대, 소, 개, 고양이, 염소, 양, 토끼, 또는 돼지 또는 말, 또는 심지어 가금류, 예컨대, 칠면조, 오리 또는 닭이다. 예시적인 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간이다.
사용 방법
코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 SARS-CoV-2 면역원성 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 비강내 투여를 통해 면역 반응(예를 들어, 백신으로서 보호 면역 반응)을 유도하도록 구성된 본 발명의 치료/면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 약학적 용량의 경점막 투여 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 적어도 하나의 코로나바이러스 항원 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하고, 여기서 코딩 서열은 적어도 하나 이상의 B 세포 에피토프, 하나 이상의 CD8+ T 세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩한다. 예시적인 실시양태에서, 포유동물 대상체는 인간이고, 코로나바이러스 항원은 SARS-CoV-2로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체는 SARS-CoV-2에 감염된 인간(예를 들어, 입원 중인 인간)이다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2 감염(예를 들어, 이러한 감염 및/또는 입원 중인 인간에서)을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 방법은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 하나 이상의 본 개시의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있고, 항-SARS-CoV-2 면역 반응, 바람직하게는 통계적으로 유의한 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하고; 보호성 및/또는 치유성 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하고; 허용 가능한 안전성 프로파일과 함께 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하고; SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하고; COVID-19가 조기에 발병한 환자의 집중 치료실(ICU) 입원 및 기계 인공호흡의 비율을 감소시키고; 입원이 필요한 조기 발병 COVID-19 환자의 COVID-19 중증도 감소시키고; SARS-CoV-2에 의한 감염 동안 "사이토카인 폭풍"의 발생을 억제, 억제 및/또는 예방하고(바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 면역원성 조성물을 하나 이상의 항-사이토카인 시약과 공동-투여); COVID-19를 갖는 환자(즉, SARS-CoV-2에 감염된 환자)에서 IL-1α, IL-6, 및/또는 IL-12p70 및/또는 폐 간질 염증의 유의한 감소(예를 들어, 위약 대조와 비교하여)를 유도하고; SARS-CoV-2에 감염된 환자(예를 들어, 입원 환자)에서 임상적 개선 및/또는 회복까지의 시간을 가속화시키고; 항-SARS-CoV-2 중화 항체(바람직한 실시양태에서, IgG 및/또는 IgA)를 유도하고; 항-SARS-CoV-2 T 세포 면역(예를 들어, 전신 및/또는 점막)을 유도하고; 골수 및 폐 상주 기억 항체 분비 세포를 유도하고; 적어도 4 개월, 또는 적어도 약 5 개월, 적어도 약 6 개월, 적어도 약 7 개월, 적어도 약 8 개월, 적어도 약 9 개월, 적어도 약 10 개월, 적어도 약 11 개월, 또는 적어도 약 12 개월 동안 효과적이고/효과적이거나 검출될 수 있는 면역 반응(예를 들어, 중화 항체 및/또는 T 세포 기억)을 유도하고; 및/또는 아데노바이러스 벡터 자체에 대한 상당한 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복 투여(예를 들어, 계절성 백신으로서 약 11-14 개월마다 1회 투여)를 제공한다.
애주번트와 함께 또는 없이 사용될 때 면역원성 조성물(예를 들어, Ad-벡터 SARS-CoV-2 백신)의 투여량은 약 107 내지 약 1012 감염 단위 또는 플라크 형성 단위(ifu 또는 pfu)의 범위일 수 있거나, 투여량 단위는 바이러스 입자(vp)일 수 있고, 여기서 1 vp는 약 1-100 ifu 또는 pfu이다. 일 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 107 vp 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 108 vp이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 109 vp이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 1010 vp이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 1011 vp이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 대상체에 투여되는 Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 용량은 약, 또는 적어도 약 1012 vp이다.
당업자는 마우스의 유효 용량이 인간, 개, 돼지, 비인간 영장류, 밍크, 흰 족제비, 고양이, 말/말과 등과 같은 더 큰 동물에 대해 조정될 수 있음을 이해하고; 이러한 더 큰 동물은 본 개시에 따른 투여 대상이다. 이러한 방식으로, 알로메트릭 스케일링(생물학적 스케일링으로도 지칭됨)을 통해, 더 큰 동물에서의 용량은 마우스에서의 용량으로부터 외삽되어 동물의 체중 또는 체표면적에 기반한 등가 용량을 수득할 수 있다.
특정 실시양태에서, Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 비-침습적 투여는 피부, 및/또는 비강내 및/또는 점막 및/또는 설하 및/또는 협측 및/또는 경구 및/또는 구강 투여로의 국소 적용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Ad-벡터 SARS-CoV-2 면역원성 조성물 또는 백신의 적용을 위한 투여 형태는 액체, 연고, 분말 및 스프레이를 포함할 수 있다. 활성 성분은 멸균 조건 하에 생리학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제, 추진제, 또는 흡수 증진제와 혼합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 인간 대상체에게 치료적 용량의 비-복제 바이러스 벡터화된 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 경점막 투여를 위한 방법이 본원에 제공되며, 여기서 상기 방법은 인간 대상체에게 적어도 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 유효량의, 포유동물 대상체에 코돈 최적화된 이종성 SARS-CoV-2 항원 코돈을 함유하고 발현하는 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 비강내 투여하는 것을 포함하고; 이에 의해 경점막으로 투여된 치료적 용량은 보호 면역 반응을 유도한다.
실시양태에서, (경)점막 투여용 조성물은 스퀴즈 스프레이 디스펜서, 펌프 디스펜서, 다회-용량 디스펜서, 드로퍼-타입 디스펜서 또는 에어로졸 디스펜서의 형태로 분배될 수 있다. 이러한 디스펜서는 또한 조성물을 경구 또는 구강(예를 들어, 협측 또는 설하) 점막에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 에어로졸은 일반적으로 탄화수소에 의해 가압된다. 펌프 디스펜서는 바람직하게는 계량 용량 또는 특정 입도를 갖는 용량을 분배할 수 있다. 에어로졸 입자/액적 크기의 분포는 다음 중 하나의 관점에서 표현될 수 있다: 공기역학적 질량 중위 직경(MMAD) - 에어로졸 질량의 절반이 더 작은 액적에 포함되고 절반이 더 큰 액적에 함유되는 액적 크기; 부피 중위 직경(VMD); 질량 중위 직경(MMD); 또는 미세 입자 분획(FPF) - 직경이 < 5 um인 입자의 백분율. 이러한 측정은 충격(MMD 및 MMAD) 또는 레이저(VMD)에 의해 이루어질 수 있다. 액체 입자의 경우, VMD, MMD 및 MMAD는 환경 조건, 예를 들어, 표준 습도가 유지되는 경우 동일할 수 있다. 그러나, 습도가 유지되지 않으면, 충격기 측정 동안 탈수로 인해 MMD 및 MMAD 결정이 VMD보다 작아질 것이다. 본 설명의 목적을 위해, VMD, MMD 및 MMAD 측정은 VMD, MMD 및 MMAD의 설명이 비교 가능하도록 하는 표준 조건 하에 있는 것으로 간주된다. 약 5 마이크론 초과의 공기역학적 질량 중위 직경(MMAD)을 갖는 입자는 일반적으로 폐에 도달하지 않으며; 대신, 경구 투여되는 경우, 이들은 인후 뒤쪽에 영향을 미치는 경향이 있고 삼키고 가능하게는 경구 흡수되며; 비강으로 투여되는 이러한 크기의 입자는 비점막에 머무를 것이다. 약 1 내지 약 5 마이크론의 직경을 갖는 입자는 중상부 영역(기도 전도)에 도달하기에 충분히 작지만, 폐포에 도달하기에는 너무 크다. 더 작은 입자, 즉, 약 0.5 내지 약 2 마이크론은 폐포 영역에 도달할 수 있다. 약 0.5 마이크론 미만의 직경을 갖는 입자는 또한 침강에 의해 폐포 영역에 침착될 수 있지만, 매우 작은 입자는 호기될 수 있다. 비점막으로 또는 중상부 폐 영역으로 또는 폐포로 점막 투여하고자 하는지 여부에 따라, 당업자는 본 개시내용 및 당업계의 지식으로부터 임의의 또는 모든 이들 표적을 달성할 수 있다. 또한, 비강내 투여를 위해, Teleflex LLC로부터의 LMA MAD300(Intranasal Mucosal Atomization Device LMA™ #MAD300 주사기가 없는 비강 장치, 1.65 인치 길이, 및 0.17 팁 직경)과 같은 분무 장치가 유리하게 사용될 수 있다. 약 30 마이크론 내지 약 100 마이크론의 통상적인 입도를 갖는 미스트를 후각 점막 또는 비강 점막에 전달하는 분무기와 같은 에어로졸 장치 또는 분배기가 본 발명의 실시에 유리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 실시를 위한 본 개시의 제제의 액적의 유리한 입도는 비강내 투여의 경우 약 30 마이크론 내지 약 100 마이크론, 예를 들어, 약 30 마이크론 또는 약 40 마이크론 또는 약 50 마이크론 내지 약 60 마이크론 또는 약 70 마이크론 또는 약 80 마이크론 또는 약 90 마이크론 또는 약 100 마이크론일 수 있다.
실시양태에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 약학 제제는 계절성 코로나바이러스에 대한 보호를 제공하는 데 사용된다. 특정 다른 실시양태에서, 본 발명의 CoV 약학 제제는 팬데믹 SARS-CoV-2에 대한 보호를 제공하는 데 사용된다. 특정 다른 실시양태에서, 본 발명의 SARS-CoV-2 약학 제제는 SARS-CoV-2에 대한 보호를 제공하는 데 사용된다. 실시양태에서, 혈청보호는 적어도 약 1 개월, 2 개월, 4 개월, 6 개월, 8 개월, 10 개월, 12 개월 또는 적어도 약 13 개월 동안 지속된다.
일부 실시양태에서, 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 본 발명의 면역원성 조성물/제제/투여형의 단일 용량을 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 포유동물 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물의 비강내 투여를 포함하고, 면역 반응은 SARS-CoV-2로의 공격에 대한 보호를 제공한다. 특정 실시양태에서, 코로나바이러스에 대하여 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 인간 대상체에게 단일 용량의 SARS-CoV-2 약학 제제(면역원성 조성물), 또는 이의 약학적 투여형을 비강내 투여하는 것을 포함하고, 투여가 코로나바이러스에 대한 혈청 항체, 점막 항체 및 T 세포를 유도하는, 방법이 제공된다. 실시양태에서, 인간 대상체는 적어도 약 1 개월, 2 개월, 4 개월, 6 개월, 8 개월, 10 개월, 12 개월 또는 적어도 약 13 개월 동안 혈청보호된다. 특정 실시양태에서, 인간 대상체는 적어도 약 9 개월 동안 혈청보호된다.
대안적인 실시양태에서, 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 본 발명의 면역원성 조성물/제형/투여량의 적어도 프라임 및 부스트 용량을 투여하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 부스트 용량은 프라임 용량의 투여 후 약 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 17 주, 18 주, 19 주, 20 주, 21 주, 22 주, 23 주, 24 주, 25 주, 26 주, 27 주, 28 주, 29 주, 30 주, 31 주, 32 주, 33 주, 34 주, 35 주, 36 주, 37 주, 38 주, 39 주, 40 주, 41 주, 42 주, 43 주, 44 주, 45 주, 46 주, 47 주, 48 주, 49 주, 50 주, 51 주 또는 52 주에 투여된다.
실시양태에서, 프라임 부스트 용량은 이들이 동일한 제형임을 의미하는 상동성이다. 특정 실시양태에서, 제공된 방법 및 조성물은 이종성 면역원성 조성물 또는 백신 프라임 용량 및 부스트 용량을 투여하여 면역 반응(예를 들어, T 세포, 체액성 및/또는 점막)을 유도하는 것을 포함하며, 여기서 "이종성"은 둘 모두가 적어도 하나, 또는 그 초과의 SARS-Cov-2 항원 에피토프를 포함하는 한 부스트 용량과 상이한 프라임 용량을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이는 항원/면역원/펩타이드가 상이한 전달 담체 및/또는 벡터를 통해 면역계에 제공되는 프라임 용량 및 부스트 용량을 의미한다. 본원에서 사용되는 "이종성 투약 섭생"은 항원/면역원/펩타이드가 상이한 전달 담체 및/또는 벡터를 통해 면역 시스템에 제공되는 프라임 용량 및 부스트 용량을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서, 제1 조성물(프라임 용량 또는 부스트 용량으로서)은 바이러스 벡터화된 항원 또는 면역원을 포함하고, 제2 조성물(프라임 용량 또는 부스트 용량으로서)은 플루오로카본-연결 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 바이러스 벡터화된 항원 또는 면역원과 공통인 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함한다. 다시 말해서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조합물은 2 개의 상이한 T 세포 유도 면역원성 조성물 또는 백신 조성물이고, 여기서 각각의 조성물은 동일한 항원에 대해 항원 특이적 CD8+ T 세포를 유도한다. 대안적인 실시양태에서, 제1 조성물(프라임 용량 또는 부스트 용량으로서)은 바이러스 벡터화된 항원 또는 면역원을 포함하고, 제2 조성물(프라임 용량 또는 부스트 용량으로서)은 RNA 면역원성 조성물 또는 백신 조성물, 예컨대, 리포솜 또는 지질 나노입자에 제형화된 변형된 mRNA, 비변형된 mRNA 또는 자가-증폭 mRNA를 포함하는 조성물, 전기천공에 의해 또는 지질 기반 제형을 사용하여 투여되는 DNA 조성물, 약독화된 생 면역원성 조성물 또는 백신 조성물, 애주번트 또는 전달 시스템으로 제형화되거나 그렇지 않은 단백질-기반 조성물, 사멸된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물, 상이한 아데노바이러스 벡터화된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물, 예컨대, HAdV-1 내지 57, 원숭이 아데노바이러스 또는 비-아데노바이러스 벡터, 이로 제한되지는 않지만, 예컨대, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 또는 폭스바이러스를 포함한다. 제1 조성물은 먼저 면역 반응을 국소적으로 또는 전신적으로 프라이밍하기 위해 투여될 수 있고, 아데노바이러스와 같은 제2 면역원성 조성물 또는 백신은 프라이밍된 면역 세포를 국소적으로 "풀(pull)"하고 항원 특이적 방식으로 이들을 재-자극하기 위해 부스터로서 점막으로 투여될 수 있다.
실시양태에서, 프라임 및 부스트 용량은 적어도 7 일 간격으로, 적어도 14 일 간격으로, 또는 그 이상 간격으로 투여된다. 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 7 일 간격, 약 14 일 간격, 약 20 일 간격, 약 25 일 간격, 약 30 일 간격, 약 35 일 간격, 약 40 일 간격, 약 45 일 간격, 약 50 일 간격, 약 55 일 간격, 약 60 일 간격 또는 약 65 일 간격으로 투여된다. 유리하게는, 용량은 약 40 일 간격, 약 41 일 간격, 약 42 일 간격, 약 43 일 간격, 약 44 일 간격, 약 45 일 간격, 약 46 일 간격, 약 47 일 간격, 약 48 일 간격, 약 49 일 간격 또는 약 50 일 간격으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 1 주 간격, 약 2 주 간격, 약 3 주 간격, 약 4 주 간격, 약 5 주 간격, 약 6 주 간격, 약 7 주 간격, 약 8 주 간격, 약 9 주 간격, 약 10 주 간격, 약 11 주 간격 또는 약 12 주 간격으로 투여된다. 특정의 다른 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 1 개월 간격, 약 2 개월 간격, 약 3 개월 간격, 약 4 개월 간격, 약 5 개월 간격, 약 6 개월 간격, 약 7 개월 간격, 약 8 개월 간격, 약 9 개월 간격, 약 10 개월 간격, 약 11 개월 간격, 또는 약 12 개월 간격으로 투여된다.
실시양태에서, 제1 또는 제2 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 적어도 7 일 간격으로, 적어도 14 일 간격으로, 또는 그 이상 간격으로 투여되는 프라임 및 부스트 용량으로서 투여된다. 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 7 일 간격, 약 14 일 간격, 약 20 일 간격, 약 25 일 간격, 약 30 일 간격, 약 35 일 간격, 약 40 일 간격, 약 45 일 간격, 약 50 일 간격, 약 55 일 간격, 약 60 일 간격 또는 약 65 일 간격으로 투여된다. 유리하게는, 용량은 약 40 일 간격, 약 41 일 간격, 약 42 일 간격, 약 43 일 간격, 약 44 일 간격, 약 45 일 간격, 약 46 일 간격, 약 47 일 간격, 약 48 일 간격, 약 49 일 간격 또는 약 50 일 간격으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 1 주 간격, 약 2 주 간격, 약 3 주 간격, 약 4 주 간격, 약 5 주 간격, 약 6 주 간격, 약 7 주 간격, 약 8 주 간격, 약 9 주 간격, 약 10 주 간격, 약 11 주 간격 또는 약 12 주 간격으로 투여된다. 특정의 다른 실시양태에서, 프라임 용량 및 부스트 용량은 약 1 개월 간격, 약 2 개월 간격, 약 3 개월 간격, 약 4 개월 간격, 약 5 개월 간격, 약 6 개월 간격, 약 7 개월 간격, 약 8 개월 간격, 약 9 개월 간격, 약 10 개월 간격, 약 11 개월 간격, 또는 약 12 개월 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(예를 들어, SARS-CoV-2 면역원성 조성물(이는 하나 초과의 유형의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함할 수 있음))는 하나 이상의 항-사이토카인 시약과 투여될 수 있다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 마우스에 대한 AdE 투여는 인플루엔자와 같은 바이러스에 의해 유발된 감염성 질환의 진행 및 증상에 관여하는 것으로 알려진 사이토카인의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, AdE는 감염되지 않은 포유동물에 투여 시 단핵구 화학유인 단백질(MCP-1(CCL2)), 인터페론 감마(IFN-γ), 및 RANTES(CCL5) 발현 증가를 야기할 수 있는데, 이는 IL-12 발현의 감소를 동반할 수 있다. 인플루엔자에 노출된 지 3 일 후에, AdE가 투여된 동물은 IL-1α, IL-6, IL-12, MCP-1의 발현 감소를 나타내는 것으로 나타났으며, IL-1α 및 IL-12는 상당히 감소하였다. 인플루엔자에 노출된 지 육(6)일 후에, 동물은 IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, MCP-1 및 GM-CSF의 발현 감소, 및 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α(CCL3)) 및 RANTES(CCL5)의 발현 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2에 의한 감염 동안 "사이토카인 폭풍"의 발달과 일치한다. 일부 실시양태에서, 이후, SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 인간과 같은 포유동물에게 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)과 함께 투여될 수 있다(즉, 공동-투여됨). 이러한 공동-투여는 적절한 경로(예를 들어, SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 비강내 투여 및 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)의 피내 또는 정맥내 투여)에 의해 각 유형의 항-사이토카인 시약에 대해 다양할 수 있는(및 당분야에 공지된 바와 같이) 유효량으로 본질적으로 동시에 및/또는 동일한 또는 거의 동일한 해부학적 부위에서 또는 상이한 해부학적 부위에서 투여되는 별도의 조성물로서 또는 단일 혼합물(예를 들어, 하나 이상의 항-사이토카인 시약이 SARS-CoV-2 면역원성 조성물에 포함될 수 있음)로서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 하나 이상의 항-사이토카인 시약과 마찬가지로 단일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 조성물의 첫 투여를 포함하여 SARS-CoV-2 조성물의 투여 후 다회(예를 들어, 임의의 약 7 일, 14 일, 21 일, 또는 임의의 약 1 개월, 2 개월 또는 3 개월) 투여될 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2를 예방 및/또는 치료하기 위해 포유동물에 투여하기 위한 예시적인 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 항-IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP -1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않을 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는 예시적인 항-사이토카인 시약은, 예를 들어, 본원의 표 10에 제시된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
표 10
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일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 항-SARS-CoV-2 제제는 또한 예를 들어 클로로퀸(예를 들어, 약학적 염 및/또는 이의 유도체; 예를 들어, 하이드록시클로로퀸 5 일 동안 1 일 400 mg 또는 10 일 동안 1 일 3 회 200 mg) 및/또는 아지스로마이신(예를 들어, 첫째 날에 500 mg, 및 이어서 매일 250 mg 4 회 용량) 및/또는 렘데시비르(예를 들어, 처음에 200 mg, 및 이어서 1 일 100 mg 용량) 및/또는 하나 이상의 항염증제(예를 들어, 프레드니손, 덱사메타손) 및/또는 임의의 다른 적합한 시약과 같은 SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 투여 전, 본질적으로 동시에, 또는 그 후에 대상체(들)에 투여될 수 있다. 당업자에게 이용 가능한 다른 투여/투약 방식, 항-사이토카인 시약, 이들의 조합, 및 다른 항-SARS-CoV-2 제제와의 조합은 당업자에게 이해되는 바와 같이 본원에 개시된 바와 같이 사용하기에 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체(예를 들어, 인간)는 적합한 기술(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 바이러스 입자를 검출하기 위한 비강 면봉)에 의해 코로나바이러스 감염에 대해 검사될 수 있다. 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 바이러스 입자로서; SARS-CoV-2 면역원성 조성물)은 이후 코로나바이러스 감염에 대해 양성으로 검사된 개체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 투여는 코로나바이러스에 처음 노출된 후 7 일 내지 10 일 이내에 완료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(예를 들어, 바이러스 입자로서)를 포함하는 SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 고위험 감염 및/또는 증상(예를 들어, 호흡기 증상, 사망)이 있는 개체, 예컨대, 면역저하된 개체 및/또는 또 다른 질병 상태(예를 들어, 신부전)를 앓고 있는 개체, 및/또는 고위험 상황에 있는 사람(예를 들어, 팬데믹 지역 여행자, 유람선과 같은 밀폐된 공간)에게, 이러한 개체가 코로나바이러스 감염에 대해 양성으로 검사되었는지의 여부에 상관 없이, 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 비공을 포함하여 숙주에 투여될 수 있고, 여기서 이러한 비공은 비강내 투여를 통해 강한 면역원성 반응을 생성하기 위해 위쪽으로 기울어진 상태에 있다(즉, 등쪽 위치). 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 투여 및 투약 전략이 또한 본원에서 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 복제 결합 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, rdAd 벡터는 a) 외인성 비-아데노바이러스 항원(예를 들어, AdE)을 코딩하는 코딩 서열이 결여되고; b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고(선택적으로, 여기서 상기 항원은 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함함); c) SARS-CoV-2 이외의 감염원 중 적어도 하나의 항원(예를 들어, AdD)을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고; d) a) 및 b)의 벡터의 조합(여기서, 벡터는 함께 또는 개별적으로 투여됨); e) b) 및 c)의 rdAd 벡터의 조합(여기서, 벡터는 함께 또는 개별적으로 투여됨); f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 임의의 조합(여기서, rdAd 벡터는 함께 또는 개별적으로 투여됨); 및/또는 g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합(여기서, 각 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터는 함께 또는 개별적으로 투여됨)이고; 상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대해 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은, 예컨대, a) 내지 c)의 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 하나의 조성물 및 a) 내지 c)의 상이한 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 하나의 제2 조성물을 포함하는 2-부 조성물에서와 같이, 임의의 2 개의 a) 내지 c)의 rdAd 벡터의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 스파이크(S) 단백질 또는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 코딩 서열; SEQ ID NO: 3에 제시된 서열, 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열로부터 선택된 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하고; SEQ ID NO: 3의 적어도 아미노산 331 내지 527을 포함하고; 스파이크 단백질 RBD 서열을 코딩하고, 스파이크 단백질 RBD 서열은 다음 잔기: L455, F486, Q493, S494 및/또는 N501, 바람직하게는 일부 실시양태에서 Q493 및 N501, 바람직하게는 일부 실시양태에서 Y455, F455 또는 S455로부터 선택된 잔기, 바람직하게는 일부 실시양태에서 L486 또는 P486으로부터 선택된 잔기, 바람직하게는 일부 실시양태에서 N493, R493 또는 K493으로부터 선택된 잔기, 바람직하게는 일부 실시양태에서 D494 또는 G494로부터 선택된 잔기, 바람직하게는 일부 실시양태에서 T501 또는 S501로부터 선택된 잔기 중 하나 이상을 포함하고(넘버링은 SEQ ID NO: 3에 상응함); SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, 바람직하게는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 446; 임의의 SEQ ID NO: 412-417 및 SEQ ID NO: 438-445, 및 SEQ ID NO: 475-476 또는 460; 또는 이의 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하고; SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 아미노산 455는 Y, F, L 또는 S로부터 선택되고; 아미노산 486은 L, F 또는 P로부터 선택되고; 아미노산 493은 N, Q, R 또는 K로부터 선택되고; 아미노산 494는 D, G 또는 S로부터 선택되고; 아미노산 501은 T, S 또는 N으로부터 선택되고; SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 임의의 하나 이상의 아미노산 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 및/또는 513-526의 하나 이상의 치환; 임의의 하나 이상의 아미노산 367, 403, 417, 439, 446, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 490, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505의 하나 이상의 치환; 및/또는 F, I, L, S 또는 A에 의한 아미노산 367(V), K 또는 S에 의한 아미노산 403(R), N 또는 T에 의한 아미노산 417(K), K에 의해 아미노산 439(N), V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G); N에 의한 아미노산 449(Y); L, M 또는 Q에 의한 아미노산 452(L), F에 의한 아미노산 453(Y); F에 의한 아미노산 455(L); L에 의한 아미노산 456(F); I, A 또는 N에 의한 아미노산 470(T), V에 의한 아미노산 473(Y); V에 의한 아미노산 475(A); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G); N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G), N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S), I, K, R 또는 A에 의한 아미노산 478(T), Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E); L 또는 S에 의한 아미노산 486(F); L 또는 S에 의한 아미노산 490(F), L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q); P 또는 L에 의한 아미노산 494(S), N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y); V 또는 S에 의한 아미노산 496(G), H, S 또는 R에 의한 아미노산 499(P), I에 의한 아미노산 500(T); Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N); R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G); L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V); 및 V, D 또는 S에 의한 아미노산 504(G); H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 411의 변형된 버전에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 SARS-CoV-2에 대한 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하도록 추가로 구성된다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 적어도 하나 이상의 B 세포 에피토프, 하나 이상의 CD8+ T 세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열은 포유동물 대상체에 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2 감염에 대해 혈청보호성인 중화 항체의 생산을 유도하며, 선택적으로 여기서 포유동물 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터(rdAd)는 인간 아데노바이러스, 선택적으로 Ad5 또는 Ad26이다. 일부 실시양태에서, rdAd는 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 또는 돼지 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, rdAd는 E1, E3, 및/또는 E4 결손 또는 파괴 아데노바이러스이다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 유효량의 이러한 면역원성 조성물(즉, 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 조성물) 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 제제를 제공하며, 선택적으로 희석제는 인산염-완충 식염수이다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 포유동물 대상체에 대한 비-침습적 투여 및/또는 비강내 투여를 위해 구성된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체에 대한 약학 제제의 투여는 포유동물 대상체에서 보호 면역 반응, 선택적으로 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)(rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(들))이다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 단일 비강내 용량으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 약학 제제는 2 개 이상의 비강내 용량으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 적어도 107 개 바이러스 입자(vp) 또는 감염 단위(ifu)(예를 들어, 적어도 1×107, 또는 적어도 1×108, 또는 적어도 1×109, 또는 적어도 1×1010, 또는 적어도 1×1011 vp 또는 ifu)의 유효량의, 적어도 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물(유효량은 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도함); 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는, 인간 대상체에 대한 단일 용량 비강내 투여에 적합한 코로나바이러스 약학 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제제는 SARS-CoV-2에 대해 적어도 6 개월 또는 바람직하게는 9 개월 동안 인간 대상체에게 혈청보호를 제공하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 면역원성 조성물과 혼합된 스프레이 또는 에어로졸 형태의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 비강내 투여를 위한 약학적 투여형을 제공하며, 여기서 투여량은 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 비-침습적으로 유도하기 위해 비강내 투여하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)의 유효량의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(들)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2에 대한 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 약학 투여 제제는 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위해 2 개 이상의 용량으로 구성된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 본원에 개시된 면역원성 조성물(또는 제제 또는 투여형)을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 여기서 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성인, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 포유동물 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 면역원성 조성물의 비강내 투여를 포함하고, 여기서 면역 반응은 SARS-CoV-2로의 공격에 대한 보호를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 코로나바이러스에 대한 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 보호 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 인간 대상체에게 단일 용량의 본원에 개시된 코로나바이러스, 바람직하게는 SARS-CoV-2 약학 제제 또는 투여형을 비강내 투여하는 것을 포함하고, 투여는 SARS-CoV-2에 대한 혈청 항체, 점막 항체 및 T 세포를 유도하고, 선택적으로 이에 의해 인간 대상체가 적어도 약 6 개월 또는 바람직하게는 적어도 약 9 개월 동안 혈청보호되는, 방법을 제공한다. 바람직하게는, 혈청보호는 적어도 12 개월, 적어도 13 개월 또는 적어도 14 개월 동안 지속된다.
바람직한 실시양태에서, rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터는 바람직하게는 발현 카세트 내에 SEQ ID NO: 15(또는 SEQ ID NO: 15를 코딩하는 핵산 서열 포함)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터는 도 19에 예시된 바와 같이 S1 도메인의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD), pTA 신호 서열(이탤릭체) 및 긴 측접 서열(밑줄그어짐)을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. SEQ ID NO: 15의 변이체가 또한 고려된다. 예를 들어, 도 19에 제시된 임의의 리더 및 측접 서열은 결실(즉, 포함되지 않음)되거나 다른 리더 및/또는 측접 서열로 치환될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, SEQ ID NO: 15를 포함하는(또는 SEQ ID NO: 15를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는) rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터 또는 이의 변이체는 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 적어도 109 개 바이러스 입자(vp), 적어도 1010 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 1011 개 바이러스 입자(vp)의 유효량을 포함하는 약학 조성물로서 투여되고; 바람직하게는 비강내 투여되고(바람직하게는 포유동물(바람직하게는 인간)이 투여 동안 앙와위 자세에 있음); 바람직하게는 단일 투여(용량)로서, 그러나 일부 실시양태에서는 시간차를 두어(예를 들어, 7-21 일) 서로 분리된 적어도 2 회의 투여(용량)를 포함하여 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 투여는 적어도 약 6 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월 이상 동안 보호(예를 들어, 일부 바람직한 실시양태에서 혈청보호)를 제공하는 항-SARS-CoV-2 중화 항체 및/또는 항-SARS-CoV-2 세포 반응(예를 들어, T 세포)의 생산을 유도한다. 바람직한 실시양태에서, SEQ ID NO: 15를 포함하는(또는 SEQ ID NO: 15를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는) rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터의 투여는 SARS-CoV-2로의 감염에 대한 보호를 야기하고, SARS-CoV-2로의 감염으로부터의 회복을 가속화시키고, SARS-CoV-2에 감염된 환자에서 임상 악화를 늦추고/늦추거나 역전시키고/역전시키거나, SARS-CoV-2에 의해 감염된 환자에게 ICU 유닛에서의 관리 및/또는 입원 필요를 감소시키거나 없앤다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 SARS-CoV-2를 예방 및/또는 치료하기 위해 하나 이상의 항-사이토카인 시약(예를 들어, 표 4 참조)을 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 상기와 같은 방법을 제공하며, 선택적으로 여기서 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP-1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 공동-투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 투여되지 않는다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 포유동물에게 1 회 투여되고, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 다회 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 포유동물에게 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)과 공동-투여되고, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)이 후속하여 포유동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 포유동물에서 호흡기 바이러스 감염의 증상을 치료 및/또는 억제(예를 들어, 개선)하는 방법으로서, 상기 호흡기 바이러스 감염은 숙주에서 유해한 효과를 유발할 수 있는 상기 포유동물의 폐에서 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1-알파(IL-1α) 및/또는 인터루킨-12(IL-12)의 상승된 발현을 유발하는, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 유효량의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터를 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 이에 의해 벡터의 투여 후 최대 약 28 일 동안 폐에서 IL-6, IL-1α, 및/또는 IL-12의 발현이 감소되어 상기 증상을 완화시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), RANTES, 및/또는 IL-17의 발현을 유발하여 벡터의 투여 후 폐에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α) 및/또는 RANTES의 발현은 벡터의 투여 후 감소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 호흡기 바이러스 감염을 갖거나 이의 위험이 있는, 항-바이러스 면역 반응의 유도를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 항-바이러스 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터를 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 항-바이러스 면역 반응은 투여 단계 후에 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1) 및/또는 인터페론 알파(IFN-γ)의 증가된 발현을 야기하는, 방법을 제공한다. 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 포유동물 대상체(예를 들어, 인간)는 약학 제제를 대상체에 투여하기 전에 SARS-CoV-2에 의해 감염된다(예를 들어, SARS-CoV-2 감염에 대해 치료 중인 병원에서). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적인 항-SARS-CoV-2 제제는 예를 들어 클로로퀸(예를 들어, 약학적 염 및/또는 이의 유도체; 예를 들어, 하이드록시클로로퀸 5 일 동안 1 일 400 mg 또는 10 일 동안 1 일 3 회 200 mg) 및/또는 아지스로마이신(예를 들어, 첫째 날에 500 mg, 및 이어서 매일 250 mg 4 회 용량) 및/또는 렘데시비르(예를 들어, 처음에 200 mg, 및 이어서 1 일 100 mg 용량) 및/또는 임의의 다른 적합한 시약과 같은 SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 투여 전, 본질적으로 동시에, 또는 그 후에 대상체(들)에 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 표 3A의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 표 3B의 하나 이상의 T 세포 에피토프 그룹, 또는 SEQ ID NO: 27-282; 및/또는 SEQ ID NO: 283-327의 하나 이상의 B 세포 에피토프 그룹; 및/또는 하나 이상의 SEQ ID NO: 328-408을 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 SARS-CoV-2 면역원성 조성물로서, 선택적으로 펩타이드는 연결되고, 선택적으로 2 개 내지 10 개의 아미노산의 링커 아미노산 서열에 의해 분리되는, 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 공동-자극 성분으로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 하나 이상의 사이토카인; 하나 이상의 케모카인; 하나 이상의 면역 억제 단백질; 선택적으로 하나 이상의 TLR 효능제가 SEQ ID NO: 463-474로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TLR 효능제; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 분자 애주번트를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 SARS-CoV-2 면역원성 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 적어도 하나의 SARS-CoV-2 차단 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 SARS-CoV-2 면역원성 조성물로서; 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하고, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 방해하는 면역 반응을 유도하고, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 직접적으로 방해하고, RBD 결합제이고, ACE2 결합제이고, 및/또는 RBD 결합제와 ACE2 결합제 둘 모두인 적어도 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는, 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 숙주 세포에서 이러한 폴리뉴클레오타이드(들)의 발현 시 생산된 하나 이상의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 이러한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터를 포함하는 하나 이상의 조성물로서, 일부 실시양태에서 약학 조성물 또는 약학적 투여형인, 조성물을 제공한다.
본 개시의 바람직한 측면
본 개시의 바람직한 측면은 하기를 포함한다:
복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물로서, rdAd 벡터는
a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는, rdAd 벡터;
c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합으로부터 선택되고,
상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는, 면역원성 조성물.
상기 측면에 있어서, 발현 카세트는 스파이크(S) 단백질 또는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 발현 카세트는 SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%)의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 12에 존재하는 서열; SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%)의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%)의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 446; SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%)의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; 임의의 SEQ ID NO: 412-417; 임의의 SEQ ID NO: 438-445, 및 SEQ ID NO: 475-476 및 460; 임의의 SEQ ID NO: 412-417 및 SEQ ID NO: 438-445, 및 SEQ ID NO: 475-476 및 460에 대해 적어도 80%(예를 들어, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%)의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 S1/S2 절단성 부위 및/또는 S2'가 단백질분해성 분해에 내성인 서열, 및/또는 융합 펩타이드가 이의 융합형성 활성을 방지하도록 결실되거나 변형되고/변형된 서열, 및/또는 세포내 도메인이 소포체 보유 모티프를 변경시키도록 변형되거나 부분적으로 변경시키도록 변형되는 서열을 포함하는 스파이크 단백질 서열을 코딩하는, 면역원성 조성물. 임의의 상기 측면에 있어서, 발현 카세트는 S1/S2 절단 부위에서 NSPQQAQSVAS (SEQ ID NO: 451), NSPSGAGSVAS (SEQ ID NO: 456) 또는 NSP-----VAS (SEQ ID NO: 461), S2' 절단 부위에서 KRSFIADA (SEQ ID NO: 453), PSKPSKQSF (SEQ ID NO: 457), PSKPSKNSF (SEQ ID NO: 458), PSKPSNASF (SEQ ID NO: 459), 또는 SRLDPPEAEV (SEQ ID NO: 455), 및/또는 표 1 및/또는 표 2에 제시된 임의의 서열 변형 중 적어도 하나로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열 및/또는 이를 포함하는 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 SEQ ID NO: 3의 적어도 아미노산 331 내지 527을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 다음 치환: K417N, K417T, R403K, N439K, G446V, G446S, L452R, G476A, S477N, T478K, E484D, T478I, E484K, F490S, Q493R, S494P, P499H 및/또는 N501Y 중 하나 이상을 포함하는 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 서열을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 서열 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하고/코딩하거나 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, 및 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 475 및 SEQ ID NO: 476의 아미노산 서열; 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트는 SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 추가의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트는 임의의 하나 이상의 아미노산 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 및/또는 513-526의 하나 이상의 치환; 임의의 하나 이상의 아미노산 367, 403, 417, 439, 446, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 490, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505의 하나 이상의 치환; 및/또는 F, I, L, S 또는 A에 의한 아미노산 367(V), K 또는 S에 의한 아미노산 403(R), N 또는 T에 의한 아미노산 417(K), K에 의해 아미노산 439(N), V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G); N에 의한 아미노산 449(Y); L, M 또는 Q에 의한 아미노산 452(L), F에 의한 아미노산 453(Y); F에 의한 아미노산 455(L); L에 의한 아미노산 456(F); I, A 또는 N에 의한 아미노산 470(T), V에 의한 아미노산 473(Y); V에 의한 아미노산 475(A); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G); N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G), N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S), I, K, R 또는 A에 의한 아미노산 478(T), Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E); L 또는 S에 의한 아미노산 486(F); L 또는 S에 의한 아미노산 490(F), L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q); P 또는 L에 의한 아미노산 494(S), N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y); V 또는 S에 의한 아미노산 496(G), H, S 또는 R에 의한 아미노산 499(P), I에 의한 아미노산 500(T); Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N); R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G); L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V); 및 V, D 또는 S에 의한 아미노산 504(G); H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 411의 변형된 버전에 대한 코딩 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, a) 내지 c)의 rdAd 벡터 중 어느 2 개의 조합을 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 a) 내지 c)의 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 하나의 조성물 및 a) 내지 c)의 상이한 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 제2 조성물을 포함하는 2-부분 조성물인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서 SARS-CoV-2에 대한 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하도록 추가로 구성되는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 코딩 서열은 적어도 하나 이상의 B 세포 에피토프, 하나 이상의 CD8+ T 세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 코딩 서열은 포유동물 대상체에 코돈 최적화되는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 중화 항체는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2 감염에 대해 혈청보호성이고, 선택적으로 여기서 포유동물 대상체는 인간인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스, 선택적으로 Ad5 또는 Ad26인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 또는 돼지 아데노바이러스인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1, E3, 및/또는 E4 결손 또는 파괴 아데노바이러스인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 표 3A의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 표 3B의 하나 이상의 T 세포 에피토프 그룹, 또는 SEQ ID NO: 27-282; 및/또는 SEQ ID NO: 25-68의 하나 이상의 B 세포 에피토프; 및/또는 SEQ ID NO: 328-369 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 코딩하고; 선택적으로 펩타이드는 연결되고, 선택적으로 2 개 내지 10 개의 아미노산의 링커 아미노산 서열에 의해 분리되는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, rdAd 벡터는 공동-자극 성분으로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 하나 이상의 사이토카인; 하나 이상의 케모카인; 하나 이상의 면역 억제 단백질; 선택적으로 하나 이상의 TLR 효능제가 SEQ ID NO: 463-474로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 TLR 효능제; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 분자 애주번트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, rdAd 벡터는 적어도 하나의 SARS-CoV-2 차단 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열은, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 방해하는 면역 반응을 유도하고, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 직접적으로 방해하고, RBD 결합제이고, ACE2 결합제이고, 및/또는 RBD 결합제와 ACE2 결합제 둘 모두인 적어도 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면의 면역원성 조성물의 rdAd 벡터를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현 시 생산된 rdAd 벡터, 및 상기 rdAd 벡터를 포함하는 조성물.
유효량의 임의의 상기 측면의 면역원성 조성물; 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 제제로서, 선택적으로 희석제는 인산염-완충 식염수인, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 비-침습적 투여를 위해 구성되는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 포유동물 대상체에 대한 비강내 투여를 위해 구성되는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 포유동물 대상체에 대한 약학 제제의 투여는 포유동물 대상체에서 보호 면역 반응, 선택적으로 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태인, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)인, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 단일 비강내 용량으로 구성되는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 2 회 이상의 비강내 용량으로 구성되는, 약학 제제.
인간 대상체에 대한 단일 용량 비강내 투여에 적합한 약학 제제로서,
적어도 107 개 바이러스 입자(vp)의 유효량의, 적어도 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 임의의 상기 측면의 면역원성 조성물로서, 유효량은 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물; 및
약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 제제는 SARS-CoV-2에 대해 적어도 6 개월 동안 인간 대상체에게 혈청보호를 제공하도록 구성되는, 약학 제제.
임의의 상기 측면에 있어서, 코딩 서열은 인간 대상체에 코돈 최적화되는, 약학 제제.
비강내 투여를 위한 약학적 투여형으로서,
임의의 상기 측면의 면역원성 조성물과 혼합된 스프레이 또는 에어로졸 형태의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 여기서 투여형은 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 비-침습적으로 유도하기 위해 비강내 투여하도록 구성되는, 약학적 투여형.
임의의 상기 측면에 있어서, 면역원성 조성물은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)의 유효량을 포함하는, 약학적 투여형.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량은 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는, 약학적 투여형.
임의의 상기 측면 중 어느 하나에 있어서, 코로나바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 단일 용량으로서 구성되는, 약학적 투여형.
임의의 상기 측면 중 어느 하나에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 2 회 이상 용량으로서 구성되는, 약학적 투여형.
코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 임의의 상기 측면의 면역원성 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성인, 방법.
SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 임의의 상기 측면의 약학 제제 또는 임의의 상기 측면의 약학적 투여형을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성인, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 방법은 포유동물 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물의 비강내 투여를 포함하고, 면역 반응은 SARS-CoV-2로의 공격에 대한 보호를 제공하는, 방법.
코로나바이러스에 대해 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
인간 대상체에게 단일 용량의 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 임의의 상기 측면의 약학 제제 또는 임의의 상기 측면의 약학적 투여형을 비강내 투여하는 것을 포함하고, 투여는 SARS-CoV-2에 대한 혈청 항체, 점막 항체 및 T 세포를 유도하고, 선택적으로 이에 의해 인간 대상체는 적어도 약 6 개월 또는 더욱 바람직하게는 약 9 개월 동안 혈청보호되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 혈청보호는 적어도 12 개월, 적어도 13 개월 또는 적어도 14 개월 동안 지속되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2를 예방 및/또는 치료하기 위해 하나 이상의 항-사이토카인 시약을 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP-1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서,
하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 공동-투여되거나;
하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 투여되지 않거나;
면역원성 조성물은 포유동물에게 1 회 투여되고, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 다회 투여되거나;
면역원성 조성물은 포유동물에게 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)과 공동-투여되고, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)이 후속하여 포유동물에게 투여되는, 방법.
포유동물에서 호흡기 바이러스 감염의 증상을 치료하거나 억제하는 방법으로서, 상기 호흡기 바이러스 감염은 상기 포유동물의 폐에서 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1-알파(IL-1α) 및/또는 인터루킨-12(IL-12)의 상승된 발현을 유발하고, 상기 방법은 임의의 상기 측면의 유효량의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터, 또는 이를 포함하는 제제 또는 조성물을 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 이에 의해 벡터의 투여 후 최대 약 28 일 동안 폐에서 IL-6, IL-1α, 및/또는 IL-12의 발현이 감소되어 상기 증상을 완화시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1), IFN-γ, 및/또는 RANTES의 발현은 벡터의 투여 후 폐에서 증가되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α) 및/또는 RANTES의 발현은 벡터의 투여 후 감소되지 않는, 방법.
호흡기 바이러스 감염을 갖거나 이의 위험이 있는, 항-바이러스 면역 반응의 유도를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 항-바이러스 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 임의의 상기 측면의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터, 또는 이를 포함하는 제제 또는 조성물을 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 항-바이러스 면역 반응은 투여 단계 후에 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1) 및/또는 인터페론 알파(IFN-γ)의 증가된 발현을 야기하는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 하나 이상의 추가의 항-SARS-CoV-2 제제는 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터의 투여 전, 본질적으로 동시에, 또는 투여 후에 대상체에게 투여되고, 선택적으로 상기 하나 이상의 추가 제제는 클로로퀸, 아지트로마이신, 렘데시비르, 항염증제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 포유동물 대상체는 대상체에게 약학 제제를 투여하기 전에 SARS-CoV-2에 의해 감염되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 포유동물 대상체는 인간인, 방법.
SARS-CoV-2의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물로서, rdAd 벡터는
a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는, rdAd 벡터;
c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합으로부터 선택되고,
상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는, 면역원성 조성물.
SARS-CoV-2의 치료 또는 예방을 제공하기 위한 의약의 제조에서를 특징으로 하는, 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 용도로서, rdAd 벡터는
a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는, rdAd 벡터;
c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합;
g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는, rdAd 벡터의 조합으로부터 선택되고,
상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는, 용도.
SEQ ID NO: 446 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 15를 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 475-476 및 SEQ ID NO: 460 중 하나 이상을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3의 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 위치 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 또는 513-526에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 아미노산 위치 367, 403, 439, 417, 446, 447, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 487, 490, 493, 494, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는, 면역원성 조성물.
상기 측면에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 N에 의한 아미노산 417(K)의 치환; V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G)의 치환; N에 의한 아미노산 449(Y)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)에서 치환; F에 의한 아미노산 455(L)의 치환; L에 의한 아미노산 456(F)의 치환; V에 의한 아미노산 473(Y)의 치환; V에 의한 아미노산 475(A)의 치환; S 또는 A에 의한 아미노산 476(G)의 치환; N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S)의 치환; Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E)의 치환; L 또는 S에 의한 아미노산 486(F)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)의 치환; L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q)의 치환; N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y)의 치환; I에 의한 아미노산 500(T)의 치환; Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N)의 치환; R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G)의 치환; L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V)의 치환; 또는 H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)의 치환으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 K417T, K417N, E484K, L452R 및/또는 N501Y로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 412-417 중 하나 이상을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 438-443 또는 460 중 하나 이상을 코딩하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, SEQ ID NO: 446을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 418 내지 437로부터 선택된 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 코딩 서열은 포유동물 대상체에 코돈 최적화되는, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 돼지 아데노바이러스, 또는 인간 아데노바이러스인, 면역원성 조성물.
상기 측면에 있어서, 비-인간 영장류 아데노바이러스는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스인, 면역원성 조성물.
임의의 상기 측면에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스인, 면역원성 조성물.
상기 측면에 있어서, 인간 아데노바이러스는 Ad5 또는 Ad26인, 면역원성 조성물.
유효량의 임의의 상기 측면의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 제제로서, 상기 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하고, 선택적으로 상기 희석제는 인산염-완충 식염수인, 약학 제제.
상기 측면에 있어서, 비-침습성 또는 비강내 투여를 위해 구성되고, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태인, 약학 제제.
SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 임의의 상기 측면의 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
상기 측면에 있어서, 유효량은 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 적어도 109 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 1010 개 바이러스 입자(vp)인, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 면역원성 조성물은 비강내 투여되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 인간 대상체에 투여된 후 적어도 6 개월, 적어도 9 개월 또는 적어도 12 개월 동안 지속되는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 면역원성 조성물의 투여 후에 유도된 SARS-CoV-2에 대한 점막 IgA 및/또는 T 세포 반응을 포함하는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 경증 또는 중등도 COVID-19-관련 질병의 발병률을 감소시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 중증 COVID-19-관련 질병의 발병률을 감소시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 COVID-19-관련 질병의 중증도를 감소시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 SARS-CoV-2에 의한 감염의 발병률을 감소시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 무증상 COVID-19의 발병률을 감소시키는, 방법.
임의의 상기 측면에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 SARS-CoV-2의 전염을 감소시키는, 방법.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 실시양태가 또한 본원에서 고려된다.
실시예
하기 실시예는 본원에서 제공되는 실시양태를 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당해 분야의 통상의 기술자들에게 제공하기 위해 제시된 것이고, 본 개시의 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니며, 또한 이들은 하기의 실시예가 모든 실험 또는 수행된 유일한 실험임을 나타내려고 의도된 것이 아니다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 관하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였으나, 일부 실험적 오차와 편차들을 고려해야 한다. 달리 지시되지 않는다면, 부는 부피 기준 부이며, 온도는 섭씨 온도이다. 기재된 바와 같은 방법의 변형은 실시예가 예시하는 것으로 여겨지는 기본 측면을 변경하지 않고 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
재조합 복제 결핍 아데노바이러스 유형 5. 복제 결함 인간 아데노바이러스 5(hAd5)는 이전에 기재된 방법을 이용하여 생성되었다(Miravet, et al. Methods Mol Biol 2014, 1089, 159-173). 요약하면, 결함 hAd5에는 트랜스진 삽입물에 대한 게놈 공간을 허용하는 E1 및 E3 유전자가 결여된다. 일부 실시양태에서, hAd5에는 임의의 외인성 항원(즉, AdE 벡터에서와 같은 비-아데노바이러스 항원)에 대한 코딩 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, hAd5는 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원(들)(본원에서 "hAd5-SARS-CoV-2"로 지칭됨)을 코딩한다. 일부 실시양태에서, hAd5는 (AdD 벡터에서와 같이) 하나 이상의 인플루엔자 항원(들)을 코딩한다. hAd5-SARS-CoV-2 벡터 및 AdD 벡터는 인간 또는 비인간 동물(예를 들어, 포유동물)에서 이러한 항원(들)과 관련하여 면역원성인 임의의 SARS-CoV-2 또는 인플루엔자 항원을 각각 코딩할 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2 항원 삽입체는 SEQ ID NO: 1(도 1a 내지 도 1j), 예컨대, SEQ ID NO: 2-11, 13 또는 15 중 어느 하나 이상 및/또는 이의 임의의 하나 이상의 단편 및/또는 유도체(예를 들어, 이의 적어도 3 개, 6 개, 9 개 또는 11 개 연속 아미노산의 펩타이드)에 의해 코딩된 임의의 단백질(및/또는 이의 임의의 하나 이상의 단편(들) 및/또는 유도체(들))를 코딩할 수 있다, 발현 카세트는 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입된 코돈 최적화된 SARS-CoV-2 스파이크(S) 카세트가 뒤따르는, 선택적으로 조직 플라스미노겐 활성화제 신호 서열(tPA)을 코딩하는 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기 구동 트랜스진이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 복제-허용 CAP 세포에서 RD-Ad5 벡터의 증식(
Figure pct00039
BMC Proceedings, 2011, 5(Supp 8):P133; Cevec) 및 이어서 감염된 세포 수확물로부터의 바이러스의 정제에 의해 제조되고, 최종 생성물은 다음 부형제 Tris HCl(pH 7.4), 히스티딘, 수크로스, 소듐 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 폴리소르베이트 80, 에틸렌디아민테트라아세트산, 및 에탄올을 포함할 수 있고, 최종 생성물은 -80℃에서 저장된다.
동물 및/또는 임상 연구의 경우, 본 발명의 약학 제제는 각각 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010 또는 1×1011 바이러스 입자(vp)의 공칭 용량을 전달하도록 제형화된 0.7 mL의 공칭 부피의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 멸균 냉동 현탁액을 함유하는 일회용 유리 바이알에 공급된다. 대안적으로, 본 발명의 약학 제제는 각각 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010 또는 1×1011 바이러스 입자(vp)의 공칭 용량을 전달하도록 제형화된 0.5 mL의 공칭 부피의 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 멸균 냉동 현탁액을 함유하는 일회용 (사전-충전된) 주사기(선택적으로 분무기가 구비됨)(예를 들어, BD Accuspray)에 공급된다.
병소 형성 검정. hAd5 벡터(예를 들어, AdE, hAd5-SARS-CoV-2, AdD) 적정을 병소 형성 검정(FFA) 또는 다른 적합한 검정에 의해 수행하였다. 간략히, FFA와 관련하여, 바이러스 수용체(예를 들어, ACE2 수용체(안지오텐신 전환 효소 2))를 발현하는 세포를 검정 전날 96-웰 플레이트에 플레이팅한 다음, 연속 희석된 바이러스 스톡으로 세포를 감염시키고, 이어서, 선택적으로 메틸셀룰로스로 오버레이시켰다. 세포를 37℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한 후, 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 코로나바이러스 단클론성 항체 및 이차 항체를 사용한 면역염색을 사용하여 hAd5-SARS-CoV-2 스톡에 대한 개별 감염된 세포에 대한 병소의 형성을 가시화하였다.
웨스턴 블롯. hAd5(예를 들어, 재조합 hAd5-SARS-CoV-2 바이러스)로부터의 단백질 발현을 확인하기 위해, 293 세포(예를 들어, 293, Calu-3, Caco-2 또는 Vero)를 hAd5-SARS-CoV-2로 감염시켰다. 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션 기간(예를 들어, 48 시간) 후, 세포를 PBS로 1 회 헹구고 2xNuPage 완충액을 사용하여 수확하였다. 샘플을 95℃에서 10 분 동안 가열하고, 냉각시키고, NuPage 4-12% 겔에 로딩하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 전달하고, 무지방 우유로 차단하고, 각각 하나 이상의 SARS-CoV-2 항원에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 유형의 일차 항체로 TBST에서 탐침하였다. 밤새 인큐베이션 후, 막을 TBST로 3 회 세척하고 형광 접합된 이차 항체(molecular probes)로 블롯팅하였다. 이차에서 1 시간 후, 막을 TBST에서 3 회 및 PBS에서 1 회 세척한 다음, 형광 신호를 이미저로 포획하였다.
세포내 사이토카인 염색. 백신접종 8 일 후에 백신접종된 마우스로부터 비장을 수확하였다. 비장을 100 μm 세포 스트레이너 상에서 분쇄하고 10% FBS 및 HEPES를 갖는 RPMI에 취했다. 대략 106 개의 세포를 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 플레이팅하고, 10 μg/ml의 브레펠딘 A 및 α-CD3(2C11 클론) 또는 10 μg의 90% DMSO 중의 펩타이드의 존재 하에 37℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 자극하였다. 펩타이드 자극 후, 세포를 PBS로 1 회 세척하고 표면 마커에 대해 염색하였다. 이어서, 세포를 고정시키고 투과하고 세포내 마커(예를 들어, IFN-γ)에 대해 염색하였다. 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다.
ELISA. 폴리스티렌 96-웰 플레이트를 소듐 카르보네이트 완충액(pH 9.3) 중 1 μg/ml의 SARS-CoV-2 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.02% Tween 20을 갖는 PBS에서 3 회 세척하고, PBS, 2% BSA, 및 0.02% Tween 20과 함께 37℃에서 1시간 무지방 분유로 차단하였다. hAd5(예를 들어, hAd5-SARS-CoV-2) 백신접종된 마우스로부터의 혈청을 PBS에서 연속 희석한 다음 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.02% Tween 20을 갖는 PBS로 4 회 세척하고, 표지된 이차 항체와 함께 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 및 인큐베이션 후, 필요에 따라 플레이트를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 판독하였다.
재조합 복제 결핍 아데노바이러스 유형 5로의 백신접종. 마우스를 케타민/자일라진(90 mg/kg: 10 mg/kg)을 사용하여 마취시킨 후, PBS에 희석된 1×107 개 hAd5-SARS-CoV-2 입자의 적절한 부피를 비강내로 백신접종하였다.
동물 공격. SARS-CoV-2를 멸균 PBS(pH 7.4)에서 희석하여 10-50 μL의 최종 부피로 마우스(예를 들어, 바이러스 수용체를 발현하는 것들) 당 SARS-CoV-2의 적합한 최종 농도를 수득하였다. 바이러스 공격은 hAd5-SARS-CoV-2 백신접종 21 일 후에 비강내 투여에 의해 수행하였다. 마우스를 이 절차 동안 케타민/자일라진(90 mg/kg: 10 mg/kg)을 사용하여 마취시켰다. 공격 후, 각 마우스를 눈에 보이는 외상에 대해 검사하고, 회복을 위해 마우스 케이지에 다시 넣었다.
임상 모니터링. SARS-CoV-2 공격 후 매일 임상 결과에 대해 동물을 관찰하였다. 체중 변화, SARS-CoV-2 바이러스 감염의 증상, 및 사망률을 각 동물에 대해 매일 기록하였다.
실시예 2: 호흡기 감염에 대한 면역화를 위한 AdE 조성물
본 실시예에 기재된 연구에서는 혈구응집 억제 검정에 의한 혈청 항체 수준 및 폐 세척액 중 분비 IgA 수준의 측정을 포함하는 호흡기 감염(예를 들어, 인플루엔자에 의해 초래될 수 있음)의 예방 및/또는 치료를 위한 AdE의 투여 후 면역 반응을 평가하였다. 세포 면역을 폐 세척액에서 ELISpot 검정에 의해 IFN-γ 및 IL-4를 방출하는 세포의 정량에 의해 평가하였다. 또한, 백신접종된 마우스로부터의 혈청을 사용하여 아데노바이러스 중화에 의해 아데노바이러스-특이적 면역을 평가하였다. 본 연구에서는 마우스에서 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1, 및 인플루엔자 B 바이러스 공격 감염에 대한 보호를 제공하는 빈 아데노바이러스 벡터(AdE)의 능력을 확인하였다. 또한, 폐 세척액 중의 사이토카인 수준을 AdE 벡터에 의해 제공되는 보호 기전을 확인하려는 시도로 백신접종 및 공격 후에 평가하였다.
재료 및 방법
본 실시예에서 사용된 약어는 다음을 포함한다: IL - 인터루킨; MCP - 단핵구 화학유인 단백질; IFN - 인터페론; TNF - 종양 괴사 인자, MIP - 대식세포 염증성 단백질; GM-CSF - 과립구/대식세포 집락 자극 인자; 및 RANTES - 활성화 시 조절, 정상 T 세포 발현 및 분비.
동물: 6주령된 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories로부터 입수하였다. 마우스를 사용 전에 72 시간 동안 격리시키고 유타 주립 대학의 실험실 동물 연구 센터에서 Teklad 설치류 식이(Harlan Teklad) 및 수돗물로 유지시켰다.
바이러스: 인플루엔자 A/캘리포니아/04/2009(팬데믹 H1N1), 균주 명칭 175190은 세인트 쥬드 소아 병원(St. Jude Children's Research Hospital, 멤피스 TN)의 감염내과 Dr. Elena Govorkova로부터 접수되었다. 바이러스를 마우스 폐를 통한 9 회의 순차적 계대에 의해 BALB/c 마우스의 폐에서 복제에 적합화시켰다. 바이러스를 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포(American Type Culture Collection, 매너서스, VA)에서 플라크 정제하고, 발육란 및 이어서 MDCK 세포에서의 성장에 의해 바이러스 스톡을 제조하였다. 인플루엔자 A/빅토리아/3/75(H3N2) 바이러스는 American Type Culture Collection(매너서스, VA)으로부터 입수하였다. 바이러스는 감염된 동물의 폐에서 7 회의 연속 계대 후 마우스에게 치명적이 되었다. 마우스-적응 후, MDCK 세포에서의 성장에 의해 바이러스 스톡을 제조하였다. 인플루엔자 A/베트남/1203/2004(H5N1)는 질병 관리 센터(Centers for Disease Control)(애틀랜타, GA)로부터 입수하였다. 바이러스 증식 및 검정을 MDCK 세포에서 수행하였다. 모 바이러스를 1 회 계대하여 챌린지 풀을 제조하였다. 인플루엔자 B/쓰촨/379/99 바이러스는 질병 관리 센터(애틀랜타, GA)에서 입수하였다. 바이러스를 MDCK 세포에서 2 회 증식시킨 다음, 마우스에서 연속 10 회 계대시켰다. 마우스-적응 후, MDCK 세포에서의 성장에 의해 바이러스 스톡을 제조하였다.
AdE 조성: AdE에 대한 바이러스 역가는 6.4×109 감염 형성 단위(ifu)/ml(3.2×108 ifu/0.05 ml)이었다. 백신을 단일 경우에 50 μl 부피로 비강내 경로에 의해 투여하였다(실험 설계 참조).
실험 설계: 동물 수 및 연구 그룹은 표 1 내지 표 3에 기재되어 있다. 연구 0 일 또는 20 일에 마우스 그룹을 비강내 경로에 의해 백신접종하였다. 위약 그룹은 동일한 경로에 의해 50 μl의 멸균 생리 식염수(PSS)를 받았다. 인플루엔자 바이러스 공격을 위해, 마우스를 90 μl의 인플루엔자 A/CA/04/2009 (H1N1p), A/빅토리아/3/1975 (H3N2), B/쓰촨/379/1999 또는 75 μl의 인플루엔자 A/베트남/1203/2004 (H5N1)로의 비강내 공격 전 케타민/자일라진(50 mg/kg//5 mg/kg)의 i.p. 주사로 마취시켰다. 공격 용량은 마우스 당 대략 3x LD50 CCID50(세포 배양 감염 용량)의 바이러스였다. 연구 22 일에 모든 마우스에 바이러스 공격을 투여하였다. 공격 후, 모든 마우스를 공격 후 21 일까지 체중 감소 및 사망률에 대해 관찰하였다.
표 11
사망률 및 체중에 대해 관찰된 연구 그룹
Figure pct00040
표 12
사이토카인 분석에 사용된 연구 그룹
Figure pct00041
표 13
사이토카인 분석을 위한 음성 대조
Figure pct00042
연구 0 일 또는 20 일에 마우스 그룹을 비강내 경로에 의해 백신접종하였다. 위약 그룹은 동일한 경로에 의해 50 μl의 멸균 생리 식염수(PSS)를 받았다. 인플루엔자 바이러스 공격을 위해, 마우스를 90 μl의 인플루엔자 A/CA/04/2009 (H1N1p), A/빅토리아/3/1975 (H3N2), B/쓰촨/379/1999 또는 75 μl의 인플루엔자 A/베트남/1203/2004 (H5N1)로의 비강내 공격 전 케타민/자일라진(50 mg/kg/5 mg/kg)의 i.p. 주사로 마취시켰다. 공격 용량은 마우스 당 대략 3x LD50 CCID50(세포 배양 감염 용량)의 바이러스였다. 연구 22 일에 모든 마우스에 바이러스 공격을 투여하였다. 공격 후, 모든 마우스를 공격 후 21 일까지 체중 감소 및 사망률에 대해 관찰하였다.
통계적 분석: 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선을 생성하고, 로그-순위(Mantel-Cox) 검정 및 이어서 Prism 5.0f(GraphPad Software Inc., 라 호야, CA)에서 Gehan-Breslow-Wilcoxon 검정을 이용한 쌍별 비교에 의해 비교하였다. 평균 체중을 분산 분석(ANOVA) 및 이어서 Prism 5.0f를 사용한 Tukey의 다중 비교 검정에 의해 분석하였다.
기관지폐포 세척(BAL): 세척 절차는 혈액 수집 직후 시작되었고, 각 동물의 사망 5 min 내지 10 min 이내에 완료하였다. 0.75 ml 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)를 기관 튜브를 통해 폐로 서서히 전달하였다. 전달 직후에 약간 흡입에 의해 유체를 서서히 빼내고 샘플을 -80℃에서 저장하였다. 절차를 총 3 회 반복하고 각 마우스로부터의 세척액을 풀링하였다.
폐 바이러스 역가 결정: BAL 샘플을 2000 xg에서 5 분 동안 원심분리하였다. 다양한 10배 희석의 BAL 상청액을 MDCK 세포에서 감염성 바이러스에 대해 3 회 검정하였고, 바이러스 역가는 전술한 바와 같이(1, 2) 계산하였다. 바이러스 역가 차이를 등분산 및 정규 분포를 가정하여 로그-변환된 값에 대한 ANOVA에 의해 평가하였다. ANOVA 후, Prism 5.0f를 사용하여 Tukey의 쌍별 비교 검정에 의해 개별 치료 값을 위약 대조와 비교하였다.
폐 사이토카인/케모카인 결정: 제조업체의 지침에 따라 화학발광 ELISA-기반 검정(Quansys Biosciences Q-Plex™ Array, 로건, UT)을 이용하여 각 폐 세척액으로부터의 샘플(200 μl)을 사이토카인 및 케모카인에 대해 시험하였다. Quansys 멀티플렉스 ELISA는 16 개의 별개의 포획 항체를 지정된 어레이의 96-웰 플레이트의 각 웰에 적용한 정량적 시험이다. 각각의 샘플 상청액을 다음에 대해 2 개의 희석액으로 시험하였다: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, MCP-1, IFN-g, TNF-a, MIP-1a, GM-CSF, 및 RANTES.
사이토카인 및 케모카인 역가는 폐 세척액의 pg/ml로 보고된다. 등분산 및 정규 분포를 가정한 값에 대해 ANOVA에 의해 역가 차이를 평가하였다. 또한, 치료 그룹 평균 값을 Prism 5.0f를 사용하여 감염 후 일수를 기준으로 한 효과에 대하여 양측 ANOVA에 의해 평가하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서는 마우스에서 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1, 및 인플루엔자 B 바이러스 공격 감염에 대한 보호를 제공하는 빈 아데노바이러스 벡터(AdE)의 능력을 확인하였다. 또한, 폐 세척액 중의 사이토카인 수준을 AdE 벡터에 의해 제공되는 보호 기전을 확인하려는 시도로 인플루엔자 A/CA/04/2009(팬데믹 H1N1) 바이러스로의 백신접종 및 공격 후에 평가하였다. 마우스를 비강내 경로에 의해 3.2×108 ifu/50 μl의 AdE로 백신접종하였다. 공격 감염 3 주 전에 단일 백신접종을 제공하였다. 또한, 본 연구에서는 공격 감염 2 일 전에 투여될 때 AdE-벡터의 항바이러스 효과를 평가하였다. 감염 후 모든 마우스를 공격 후 21 일까지 체중 감소 및 사망률에 대해 관찰하였다.
AdE 벡터는 공격 20 일 전에 투여될 때 인플루엔자 A/CA/04/2009(팬데믹 H1N1) 바이러스로의 공격으로부터 100% 보호를 제공하고, 공격 이(2)일 전에 투여될 때 80% 보호를 제공한 것으로 밝혀졌다. AdE 벡터는 공격 20 일 전에 투여될 때 인플루엔자 A/빅토리아/3/75 (H3N2) 바이러스로부터 90% 보호를 제공하였다. 그러나, 공격 이(2)일 전에 투여된 AdE 벡터에 의해 제공되는 보호는 유의하지 않았다. 인플루엔자 A/베트남/1203/2004(H5N1) 바이러스 공격 20 일 전에 투여된 AdE 벡터는 사망률로부터의 보호를 제공하지 않았지만, 평균 사망일을 유의하게 증가시켰다. 그러나, AdE 벡터가 공격 이(2)일 전에 투여되었을 때 인플루엔자 A/베트남/1203/2004(H5N1)로부터의 보호는 제공되지 않았다. AdE 벡터는 또한 공격 20 일 전에 투여될 때 인플루엔자 B/쓰촨/379/9 바이러스로부터 100% 보호를 제공하였다. 또한, AdE 벡터는 인플루엔자 B/쓰촨/379/9 바이러스로 공격 이(2)일 전에 투여될 때 90% 보호를 제공하였다. AdE 벡터만이 인플루엔자 B/쓰촨/379/9 바이러스에 의한 공격 후 체중 감소로부터 유의한 보호를 제공하였다. 0 일 및 20 일의 AdE 투여 시점 둘 모두는 공격 후 체중 감소로부터 보호를 제공하였다. 공격 20 일 전에 AdE를 투여받은 마우스 그룹은 두 모두의 일수에 위약 대조와 비교하여 인플루엔자 A/CA/04/2009(팬데믹 H1N1) 바이러스 역가에서 1-2 log 감소를 나타냈다.
AdE 벡터로의 면역화에 의해 제공되는 보호의 면역 기전을 확인하려는 시도에서, 인플루엔자 A/CA/04/2009(팬데믹 H1N1) 바이러스 감염 후 폐 세척액에서 사이토카인 및 케모카인의 발현을 확인하였다. IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17, MCP-1, IFN-γ, TNFα, MIP-1α, GM-CSF, 및 RANTES의 발현을 백신접종 후 3 일 및 6 일, 백신접종 후 25 일 및 28 일, 및 공격 후 3 일 및 6 일에(이는 백신 접종 후 25 일 및 28 일과 동일함)에 측정하였다. IL-1α, IL-6, IL-12p70, MCP-1, IFN-γ, 및 RANTES에 대해 사이토카인 및 케모카인 수준의 유의한 변화가 관찰되었다. IL-1α, IL-6, 및 IL-12p70에 대한 공격 감염 후 위약 대조와 비교하여 유의한 감소가 관찰되었다. IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, TNF-α, MIP-1α, 및 GM-CSF에 대해서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. IL-1α 발현의 유의한 감소(p<0.01)는 공격 20 일 전에 AdE를 투여한 경우 공격 후 3 일에 관찰되었다. AdE로의 백신접종 및 공격 후 폐 세척액에서 IL-6 발현의 유의한 감소(p<0.01)가 관찰되었다(예를 들어, AdE가 공격 20 일 전에 투여된 경우 공격 후 6 일에). 공격 전 20 일에 AdE가 투여된 경우 공격 후 3 일에 AdE로의 백신접종 및 공격 후 폐 세척액에서 IL-12p70 발현의 유의한 감소(p<0.01)가 관찰되었다. 백신접종 후 및 공격 감염 후에 폐 세척액에서 MCP-1 및 IFN-γ의 발현의 유의한 변화(p<0.01)가 관찰되었다. MCP-1 수준은 백신접종 후 모든 AdE 처리된 그룹에 대해 3 일, 6 일, 25 일, 및 28 일에 증가하였다. 그러나, MCP-1 수준은 공격 20 일 전에 AdE가 투여된 경우 공격 후 6 일에 감소하였다. IFN-γ 수준은 AdE가 공격 이(2)일 전에 투여된 경우 백신접종 후 6 일에 증가하였고, AdE가 공격 20 일 전에 투여된 경우 백신접종 후 25 일 및 28 일까지 상승된 상태(p<0.001)를 유지하였다. 또한, IFNγ 수준은 공격 이(2)일 전에 AdE를 투여한 경우 공격 후 6 일에 대략 10배 증가하였다. 백신접종 후 3 일(p<0.0001), 6 일(p<0.001) 및 25 일(p<0.01)에 RANTES 수준의 유의한 변화가 관찰되었다. 이러한 데이터는 표 14에 요약되어 있다.
표 14
Figure pct00043
결론
본 실시예는 마우스에서 인플루엔자 A H1N1, H3N2, H5N1, 및 인플루엔자 B 바이러스 공격 감염에 대한 백신으로서의 빈 아데노바이러스 벡터(AdE)의 용도를 기술한다. 단일 백신접종은 공격 감염 삼(3)주 전에 또는 공격 감염 이(2)일 전에 제공되었다. 놀랍게도, AdE가 공격 20 일 전에 투여되었을 때 모든 공격 균주에 대해 보호가 제공되었다. H5N1 바이러스에 대해 관찰된 생존 효과는 실제로 사망률이 아니라 평균 사망일의 증가였다. 또한, 공격 이(2)일 전에 투여될 때, AdE 벡터에 의해 H1N1 및 인플루엔자 B 바이러스 공격에 대한 보호가 제공되었다. 백신접종 이(2)일 후에 관찰된 보호는 선천성 면역 기전을 시사한다. 그러나, 선천성 면역은 감염 후 사(4)일 이상 지속되지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 백신접종 삼(3)주 후에 추가로 단지 이(2)일 후에 마우스가 바이러스 공격으로부터 보호될 수 있다는 관찰은 하나보다 많은 작용 기전을 시사한다. 백신 접종 후와 공격 후 둘 모두에 MCP-1과 IFN-γ의 증가된 수준에 의해 시사되는 한 가지 가능한 기전은 AdE로의 백신접종이 단핵구, 호중구, 및/또는 림프구를 동원하는 MCP-1의 증가를 야기하고, 이것이 이후 IFN-γ의 생산을 자극한다는 것이다.
실시예 3: SARS-CoV-2 백신접종을 위한 AdE 인간 임상 시험
본 실시예에서, SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위해 AdE 벡터(즉, Ad5 게놈에 코딩된 외인성 비-Ad 병원체 항원이 없는 복제 결핍 ΔE1E3 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 바이러스 입자)의 비강내(i.n.) 투여의 용도가 기술된다. SARS-CoV-2에 대한 AdE 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 면역원성 및/또는 보호 능력을 확립하기 위해, AdE 바이러스 입자(vp)를 포함하는 AdE 면역원성 조성물을 인간 대상체에게 투여하고 여기서 SARS-CoV-2에 대항하는 면역 반응에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 이를 수행하기 위해, 18세 내지 49세의 건강한 성인에서 AdE 면역원성 조성물의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약-대조, 용량-증대 임상 시험이 실시될 수 있다. 대상체를 전형적으로 무작위화(1 일) 28 일 이내에 스크리닝하였다.
예를 들어, 연구는 두 가지 파트를 포함할 수 있다: AdE 면역원성 조성물의 안전성을 평가하는 파트 A, 및 이의 면역원성을 평가하는 파트 B. 파트 A에서, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 120 명의 대상체를 각각 AdE 용량(1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp)에 의해 규정된 30 명의 대상체의 4 개의 순차적 코호트에 등록하였다. 각 코호트(및 제1 용량 코호트의 센티넬 그룹) 내에서, 대상체를 1 회 비강내 용량의 AdE 면역원성 조성물(1 일) 또는 1 회 비강내 용량의 위약(생리 식염수)(1 일)을 받도록 4:1:1 비율로 무작위화하였다. AdE 면역원성 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. 반응원성은 백신접종 후 14 일 동안 코 자극, 재채기, 코 울혈, 기침, 인후통, 후각 변화, 미각 변화, 시력 변화, 눈 통증, 통증, 압통, 경결, 홍반, 국소 림프절병증, 및 전신 사건(두통, 피로, 근육통, 메스꺼움, 구토, 설사, 기침, 오한, 발열)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 국소 사건을 갖는 대상체의 수 및 백분율을 결정함으로써 확인될 수 있다. 유해 사례(AE)는 AdE 면역원성 조성물의 투여 후 1 일부터 57 일까지 AE; 1 일부터 181 일까지 의학적으로 주시가 요해지는 AE(MAAE), 심각한 AE(SAE), 및 신규 발병 만성 질환(NCI)을 갖는 대상체의 수 및 백분율로 결정된다. 예를 들어, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 4 일, 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 면역원성 시험을 위해 채취될 수 있다. 파트 A에서 안전성 프로파일의 평가를 위한 일차 종점은 백신접종 후 기록되는 예상된 및 예상되지 않은 AE를 갖는 대상체의 수 및 백분율(95% 신뢰 구간(CI))이다. 안전성 분석은 안전성 집단을 사용하여 수행된다. 국소 사건 및 전신 사건을 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 반응성과 마찬가지로 그룹별로 요약된다. 1 일부터 57 일까지 AE(MAAE, NCI, SAE 포함)를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 선호 용어(PT) 및 그룹별로 규제 활동 시스템 기관 부류(SOC)에 대한 각각의 의학 사전에 대해 요약된다. 1 일부터 181 일까지 MAAE, NCI, 및 SAE를 갖는 대상체의 수(백분율)는 유사한 방식으로 요약된다. 중증도 및 임상시험용 의약품(IP)과의 관련성 별로 AE를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)가 또한 요약된다. AE, MAAE, NCI, 및 SAE의 목록이 제공된다.
파트 B에서, AdE 면역원성 조성물의 면역원성이 결정된다. 비강내 스프레이에 의해 AdE 면역원성 조성물을 대상체에게 1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp의 단일 용량 및 이들 용량 중 가장 잘 용인되는 2 회의 용량(3 주 간격)으로 투여한 후, 면역 반응은 항-SARS-CoV-2 항원 항체, GMT, 기하 평균 비율(GMR)(동일한 용량 그룹 내 백신접종 후 및 백신접종 전 GMT의 비율), 및 확인된 반응자 비율(투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승)를 측정하기 위해 혈청의 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 25 명의 대상체를 파트 A 또는 위약으로부터 21 일 간격으로(1 일 및 22 일) 가장 잘 용인되는 용량의 AdE 면역원성 조성물의 2 개의 비강내 용량을 받도록 4:1 비율로 무작위화하였다. AdE 면역원성 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. AdE 면역원성 조성물 및 위약의 비강내 용량은 앉은 자세 또는 기대어 앉은 자세에서 대상체에게 투여된다. 파트 B에서, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 면역원성 시험을 위해 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 채취되고; 비인두 면봉은 8 일, 15 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 57 일, 및 91 일에 수집될 수 있다. 스크리닝 및 29 일 및 57 일에 수집된 비인두 샘플은 또한 점막 면역 반응의 평가를 위해 후속적으로 시험될 수 있다.
일부 실시양태에서, 임상 시험은 SARS-CoV-2에 이미 감염된 환자 및 확인된 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간(또는, 일부 실시양태에서, 시험된 환자의 코호트)을 사용하여 수행될 수 있다. 일차 결과 척도는 상기 기재된 바와 같은 AdE 조성물의 투여 후 최대 28 일 동안 확인되는 임상 개선까지의 시간(TTCI) 및/또는 임상 회복까지의 시간(TTCR)이다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 1(퇴원) 내지 6(사망)의 범위인 임상 상태의 6 개-카테고리 순위 척도에서 무작위화 상태로부터 2 개 카테고리의 감소까지의 시간(일)으로 정의된다. 6-카테고리 순위 척도는 다음과 같다: 6. 사망; 5. ICU, 체외막 산소공급(ECMO) 및/또는 침습적 기계적 인공호흡(IMV) 필요; 4. 중환자실(ICU)/입원, 비침습적 기계적 인공호흡(NIV)/고유량 비강 캐뉼라(HFNC) 요법 필요; 3. 산소 보충이 필요한 입원(그러나 NIV/HFNC는 아님); 2. 보충 산소이 필요하지 않은 입원; 및, 1. 병원 퇴원 또는 퇴원 기준 충족(퇴원 기준은 임상 회복, 즉, 정상으로 회복된 발열, 호흡수, 산소 포화도, 및 기침 완화로 규정됨). 이차 결과 TTCI 척도는 모든 원인 사망률(스크리닝 중 기준선 SpO2, PaO2/FiO2 <300 mmHg 또는 호흡수 산소 보충 없이 min 당 ≥ 24 회 호흡); 호흡 진행 빈도(실내 공기 또는 PaO2/FiO2 <300 mmHg에서 SPO2≤ 94% 및 산소 보충 또는 추가 진행되는 인공호흡기 보조 필요); 해열까지의 시간(등록 시 열이 있는 경우); 경증 또는 부재로 보고된 기침까지의 시간(등록 시 기침이 중증 또는 중등도로 평가된 경우); 경증 또는 부재로 보고된 호흡곤란까지의 시간(중증 또는 중등도로 평가된 등록 시 호흡곤란이 있는 경우 중증 또는 중등도, 경증 부재의 등급으로); 산소 보충 또는 비-침습적 인공호흡 필요 빈도; 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 RT-PCR 음성까지의 시간; 바이러스 부하 곡선하 면적에 의해 평가하는 경우(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정하는 경우) 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 바이러스 부하의 변화(감소); 기계적 인공호흡 필요 빈도; 및 심각한 유해 사례의 빈도를 포함한다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 발열, 호흡수 및 산소 포화도의 정상화, 및 기침의 완화까지 적어도 72 시간 동안 지속되는 시간(시)으로 규정된다. 일차 TTCR 결과 척도는 정상화 및 완화 기준을 포함한다: 발열 - ≤36.9℃ 또는 겨드랑이 - ≤37.2℃ 경구; 호흡수 - 실내 공기에서 ≤24/분; 산소 포화도 - 실내 공기에서 >94%; 및, 기침 - 중증, 중등도, 경증, 부재의 등급으로 보고된 환자에서 경증 또는 부재. 이차 TTCR 결과 척도는 상기 열거된 TTCI 이차 결과와 동일하다.
표준 임상 시험 설계 및 통계적 방법이 이의 분석에 사용된다. 예를 들어, 본 연구에 대한 샘플 크기는 통계적 검정력(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 120 명의 대상체)이 아니라 잘 용인되는 용량에서 AdE 면역원성 조성물의 안전성 및 면역원성 프로파일의 초기 검토에 적절하고 합리적인 것으로 선택된다. 샘플 크기는 반응원성의 초기 추정을 가능하게 한다. 예를 들어, AdE 면역원성 조성물을 받은 총 100 명의 대상체를 고려할 때, 연구는 1.6%의 비율로 발생한 적어도 하나의 AE를 검출할 확률을 80% 갖도록 설계된다. AdE 면역원성 조성물을 받은 100 명의 대상체 중에서 SAE가 관찰되지 않았다면, SAE 발생률에 대한 95% 신뢰 구간(CI)의 단측 상한에 대한 근사치는 3%일 것이다. 면역학 분석은 PP 집단으로부터 도출된 일차 결론과 함께 평가 가능한 및 프로토콜-당(PP) 집단을 사용하여 수행된다. 평가 가능한 집단에 기반한 분석은 임의의 한 그룹에서 >1명의 대상체가 PP 집단에서 제외된 경우에만 착수되고 제시된다. 하기 기재된 바와 같이 제외 반응자 분석으로, 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 데이터는 분석 전에 적절하게 변환된다. 기준선은 1 일에 AdE 면역원성 조성물 투여 전 수집된 샘플로 규정된다. SARS-CoV-2에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응(예를 들어, T 세포 매개된 반응)의 평가를 위한 주요 관심 변수가 결정된다. 일부 실시양태에서, 위약 그룹에 대한 각각의 AdE 면역원성 조성물 용량 그룹의 반응자의 비교는 또한 피셔(Fisher)의 정확 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 29 일(파트 A) 또는 50 일(파트 B)에 AdE 면역원성 조성물의 면역원성에 대한 투여 전 Ad5 혈청 항체 수준의 효과를 알아보기 위해, 공변량으로서 기준선 Ad5 역가로 ANCOVA를 사용하여 분석이 수행된다. 평가 가능한 및 PP 집단을 사용하여 점막 면역원성 분석이 수행된다. 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 분석된 종점은 ELISA에 의해 측정된 IgA 항체 수준에 대한 GMT 및 GMR이다. 연속 파라미터(안전성 실험실 시험 및 활력 징후)에 대한 요약 통계는 다음과 같이 그룹별로 제시된다: 백신접종 전, 백신접종 후, 및 백신접종 전에서 백신접종 후로의 평가 변화. 연구 백신접종 후에 백신접종 후 안전성 실험실 값 또는 활력 징후 값이 새로 비정상인 것으로 기록된(즉, 기준선 값에 비해 독성 등급이 증가하고 중증도 등급이 중간 이상인 사건) 대상체의 수 및 백분율이 표로 작성된다. 중증도 등급별로 각 대상체의 백신접종 전 및 백신접종 후 안전성 실험실 값을 교차표로 작성하는 이동 표가 만들어진다. 정상, 임상적으로 유의하지 않은 비정상, 및 임상적으로 유의한 비정상 ECG 해석을 갖는 대상체의 수 및 백분율의 요약이 제시된다. Ad5 벡터의 발산을 위해, 데이터는 중간 카피 수와 함께 시점별 양성 퍼센트 및 수로 요약된다. Ad5 발산의 중앙값 지속기간, 사분위수 범위, Ad5 발산의 최소 및 최대 지속기간은 각각의 AdE 면역원성 조성물 그룹 및 조합된 모든 면역원성 조성물 용량 그룹에 대해 제시된다. 아데노바이러스 감염의 평가를 위한 바이러스 배양 결과가 또한 열거된다.
이러한 연구는 AdE 조성물이 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임), 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여줄 것이다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 AdE 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 4.
A. 재조합 인간 아데노바이러스 타입 5 SARS-CoV-2(hAd5-SARS-CoV-2)의 생성
E1/E3 결손 복제 결함 hAd5는 선택적으로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 리더 서열 및 이어서 적어도 하나의 SARS-CoV-2 단백질(들)을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 2-11 중 어느 하나 이상, 및/또는 이의 하나 이상의 단편(들) 및/또는 유도체(들))을 사용한다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 SARS-CoV-2 코딩 서열을 함유하는 발현 카세트는 hAd5의 E1 영역에 삽입된다. 이 벡터는 본원에서 "hAd5-SARS-CoV-2"로 지칭된다.
hAd5-SARS-CoV-2 백신으로부터의 SARS-CoV-2 단백질(들)의 발현 수준을 조사하기 위해, S에 항-SARS-CoV-2 토끼 다클론성 특이성으로 웨스턴 블롯에 의해 SARS-CoV-2-감염된 Vero 세포로부터 SARS-CoV-2 단백질(들)의 발현을 비교하였다. 웨스턴 블롯은 hAd5-SARS-CoV-2 백신이 감염된 세포에서 S를 발현한다는 것을 보여주었다. 발현된 S 항원을 또한 천연 서열을 확인하기 위해 시퀀싱하였다.
B. hAd5- SARS-CoV-2 백신의 면역원성.
hAd5-SARS-CoV-2 백신의 면역원성을 이해하기 위해, 8주령된 마우스(예를 들어, 이들이 SARS-CoV-2에 대한 수용체를 발현한다면 야생형 또는 트랜스제닉)를 충분한 수(예를 들어, 1×107)의 hAd5-SARS-CoV-2 바이러스 입자로 비강내(i.n.) 면역화시켰다. T 세포 적응성 면역 반응의 피크인 8 일에, 백신접종된 마우스의 서브세트를 안락사시키고, SARS-CoV-2 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 세포내 사이토카인 염색 및/또는 IFN-γ ELISpot에 의해 평가하였다. 비장 또는 PBMC T 세포를 항원 및/또는 면역우성 SARS-CoV-2 펩타이드를 커버링하는 펩타이드 풀로 자극하고, IFN-γ-생산 T 세포의 빈도를 알아보았다. 백신접종 21 일 후에 마우스를 채혈하여 혈청 항체 반응을 평가하였다. SARS-CoV-2 특이적 ELISA를 사용하여 SARS-CoV-2 S 특이적 면역글로불린(IgG) 반응을 알아보았다. 단일 hAd5-SARS-CoV-2 백신접종은, 예를 들어, 검출 한계 미만의 역 평균 종점 역가를 갖는 나이브 동물에 비해 더 높은 역 평균 종점을 갖는 SARS-CoV-2 S 특이적 IgG 반응을 생성할 수 있다. 중화 항체의 양을 결정하기 위해, 병소 감소 중화 시험을 완료하였다.
C. SARS-CoV-2의 중화
백신의 바이러스 중화 능력은 플라크 감소 또는 감염된 병소 감소의 방법을 사용하여 본 실시예의 섹션 B에 기재된 바와 같이 면역화된 마우스로부터의 혈청을 사용하여 결정될 것이다. SARS-CoV-2 S의 야생형, 약독화 또는 VSV-위형은 백신접종된 마우스 혈청의 다양한 희석액과 혼합되고 실온에서 30 min 동안 인큐베이션된 후 Vero 또는 다른 적절한 세포주의 감염이 수행될 것이다. 이후, 바이러스 중화는 플라크 또는 감염성 병소의 수를 미리 결정된 값, 예를 들어, 50%만큼 감소시킬 수 있는 가장 높은 항체 희석액으로서 정량화된다.
D. hAd5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 보호 능력
SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 보호 능력을 확립하기 위해, 충분한 수의 hAd5-SARS-CoV-2 바이러스 입자(예를 들어, 1×107)를 마우스 또는 다른 적절한 설치류(예를 들어, 바이러스 수용체를 발현하는 트랜스제닉 설치류)에 i.n. 투여하였다. 21 일 후, 동물을 인산염 완충 식염수(PBS)-백신접종된 대조군과 함께 SARS-CoV-2로 공격하고 생존에 대해 모니터링하였다. 엄격한 공격 후, 모든 PBS-백신접종된 대조 마우스는 증상을 나타내고/나타내거나, SARS-CoV-2 감염에 굴복한 반면, hAd5-SARS-CoV-2 백신접종된 마우스의 대부분은 생존한 것으로 밝혀졌다. 질병의 임상 징후를 12 일 동안 점수매김하고, 백신접종되지 않은 대조와 비교하여 hAd5-SARS-CoV-2 백신접종된 마우스에서 개선된 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 hAd5-SARS-CoV-2 백신이 이러한 동물 모델에서 질병 중증도의 감소를 야기하는 보호 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증할 것이다.
E. 기타
상기 기재된 시험은 또한 당업자에 의해 이해될 바와 같이 hAd5-SARS-CoV-2를 또 다른 이러한 벡터(예를 들어, AdE, AdD)로 치환함으로써 하나 이상의 다른 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(예를 들어, AdE, AdD)를 사용하여 수행될 수 있다. 결과의 생성 및 해석은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 시험되는 특정 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터(들)에 따라 조정될 것이다.
실시예 5: SARS-CoV-2 백신접종을 위한 hAd5-SARS-CoV-2 인간 임상 시험
hAd5-SARS-CoV-2 바이러스 입자(vp) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 면역원성 및/또는 보호 능력을 확립하기 위해, 이를 인간 대상체에 투여하고, 이러한 대상체에서 SARS-CoV-2에 대항하는 면역 반응에 대한 이의 효과 및 SARS-CoV-2에 감염된 환자(예를 들어, 입원 환자)에 대한 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간에 대한 이의 효과에 대하여 시험하였다. 이를 수행하기 위해, 18세 내지 49세의 건강한 성인에서 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약-대조, 용량-증대 임상 시험을 실시하였다. 대상체를 전형적으로 무작위화(1 일) 28 일 이내에 스크리닝하였다.
예를 들어, 연구는 두 가지 파트를 포함할 수 있다: hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 안전성을 평가하는 파트 A, 및 면역원성을 평가하는 파트 B. 파트 A에서, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 120 명의 대상체를 각각 hAdv5 SARS-CoV-2 용량(1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp)에 의해 규정된 30 명의 대상체의 4 개의 순차적 코호트에 등록하였다. 각 코호트(및 제1 용량 코호트의 센티넬 그룹) 내에서, 대상체를 1 회 비강내 용량의 hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물(1 일) 또는 1 회 비강내 용량의 위약(생리 식염수)(1 일)을 받도록 4:1:1 비율로 무작위화하였다. hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. 반응원성은 백신접종 후 14 일 동안 코 자극, 재채기, 코 울혈, 기침, 인후통, 후각 변화, 미각 변화, 시력 변화, 눈 통증, 통증, 압통, 경결, 홍반, 국소 림프절병증, 및 전신 사건(두통, 피로, 근육통, 메스꺼움, 구토, 설사, 기침, 오한, 발열)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 국소 사건을 갖는 대상체의 수 및 백분율을 결정함으로써 확인될 수 있다. 유해 사례(AE)는 hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 투여 후 1 일부터 57 일까지 AE; 1 일부터 181 일까지 의학적으로 주시가 요해지는 AE(MAAE), 심각한 AE(SAE), 및 신규 발병 만성 질환(NCI)을 갖는 대상체의 수 및 백분율로 결정된다. 예를 들어, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 4 일, 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 면역원성 시험을 위해 채취될 수 있다(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 항원 항체를 측정하기 위한 혈청의 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 0 일(기준선)과 비교한 기하 평균 역가(GMT)). 반응자 비율은 또한 하기 기재된 바와 같이 결정된다(예를 들어, 투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승). 파트 A에서 안전성 프로파일의 평가를 위한 일차 종점은 백신접종 후 기록되는 예상된 및 예상되지 않은 AE를 갖는 대상체의 수 및 백분율(95% 신뢰 구간(CI))이다. 안전성 분석은 안전성 집단을 사용하여 수행된다. 국소 사건 및 전신 사건을 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 반응성과 마찬가지로 그룹별로 요약된다. 1 일부터 57 일까지 AE(MAAE, NCI, SAE 포함)를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 선호 용어(PT) 및 그룹별로 규제 활동 시스템 기관 부류(SOC)에 대한 각각의 의학 사전에 대해 요약된다. 1 일부터 181 일까지 MAAE, NCI, 및 SAE를 갖는 대상체의 수(백분율)는 유사한 방식으로 요약된다. 중증도 및 임상시험용 의약품(IP)과의 관련성 별로 AE를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)가 또한 요약된다. AE, MAAE, NCI, 및 SAE의 목록이 제공된다.
파트 B에서, hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 면역원성이 결정된다. 비강내 스프레이에 의해 hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물을 대상체에게 1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp의 단일 용량 및 이들 용량 중 가장 잘 용인되는 2 회의 용량(3 주 간격)으로 투여한 후, 면역 반응은 항-SARS-CoV-2 항원 항체, 및 GMT, 기하 평균 비율(GMR)(동일한 용량 그룹 내 백신접종 후 및 백신접종 전 GMT의 비율), 및 확인된 반응자 비율(투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승)를 측정하기 위해 혈청의 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 25 명의 대상체를 파트 A 또는 위약으로부터 21 일 간격으로(1 일 및 22 일) 가장 잘 용인되는 용량의 hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 2 개의 비강내 용량을 받도록 4:1 비율로 무작위화하였다. hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. hAdv5-SARS-CoV-2 면역원성 조성물 및 위약의 비강내 용량은 앉은 자세의 대상체에게 투여된다. 파트 B에서, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 면역원성 시험을 위해 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 채취되고; 비인두 면봉은 8 일, 15 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 57 일, 및 91 일에 수집될 수 있다. 스크리닝 및 29 일 및 57 일에 수집된 비인두 샘플은 또한 점막 면역 반응의 평가를 위해 후속적으로 시험될 수 있다.
임상 시험은 SARS-CoV-2에 이미 감염된 환자 및 확인된 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간(또는, 일부 실시양태에서, 시험된 환자의 코호트)으로 수행될 수 있다. 일차 결과 척도는 상기 기재된 바와 같은 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물의 투여 후 최대 28 일 동안 확인되는 임상 개선까지의 시간(TTCI) 및/또는 임상 회복까지의 시간(TTCR)이다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 1(퇴원) 내지 6(사망)의 범위인 임상 상태의 6 개-카테고리 순위 척도에서 무작위화 상태로부터 2 개 카테고리의 감소까지의 시간(일)으로 정의된다. 6-카테고리 순위 척도는 다음과 같다: 6. 사망; 5. ICU, 체외막 산소공급(ECMO) 및/또는 침습적 기계적 인공호흡(IMV) 필요; 4. 중환자실(ICU)/입원, 비침습적 기계적 인공호흡(NIV)/고유량 비강 캐뉼라(HFNC) 요법 필요; 3. 산소 보충이 필요한 입원(그러나 NIV/HFNC는 아님); 2. 보충 산소이 필요하지 않은 입원; 및, 1. 병원 퇴원 또는 퇴원 기준 충족(퇴원 기준은 임상 회복, 즉, 정상으로 회복된 발열, 호흡수, 산소 포화도, 및 기침 완화로 규정됨). 이차 결과 TTCI 척도는 모든 원인 사망률(스크리닝 중 기준선 SpO2, PaO2/FiO2 <300 mmHg 또는 호흡수 산소 보충 없이 min 당 ≥ 24 회 호흡); 호흡 진행 빈도(실내 공기 또는 PaO2/FiO2 <300 mmHg에서 SPO2≤ 94% 및 산소 보충 또는 추가 진행되는 인공호흡기 보조 필요); 해열까지의 시간(등록 시 열이 있는 경우); 경증 또는 부재로 보고된 기침까지의 시간(등록 시 기침이 중증 또는 중등도로 평가된 경우); 경증 또는 부재로 보고된 호흡곤란까지의 시간(중증 또는 중등도로 평가된 등록 시 호흡곤란이 있는 경우 중증 또는 중등도, 경증 부재의 등급으로); 산소 보충 또는 비-침습적 인공호흡 필요 빈도; 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 2019-nCoV-2 RT-PCR 음성까지의 시간; 바이러스 부하 곡선하 면적에 의해 평가하는 경우(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정하는 경우) 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 바이러스 부하의 변화(감소); 기계적 인공호흡 필요 빈도; 및 심각한 유해 사례의 빈도를 포함한다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 발열, 호흡수 및 산소 포화도의 정상화, 및 기침의 완화까지 적어도 72 시간 동안 지속되는 시간(시)으로 규정된다. 일차 TTCR 결과 척도는 정상화 및 완화 기준을 포함한다: 발열 - ≤36.9℃ 또는 겨드랑이 - ≤37.2℃ 경구; 호흡수 - 실내 공기에서 ≤24/분; 산소 포화도 - 실내 공기에서 >94%; 및, 기침 - 중증, 중등도, 경증, 부재의 등급으로 보고된 환자에서 경증 또는 부재. 이차 TTCR 결과 척도는 상기 열거된 TTCI 이차 결과와 동일하다.
시험으로부터 얻어진 표준 임상 시험 설계 및 통계적 방법이 이의 분석에 사용된다. 예를 들어, 본 연구에 대한 샘플 크기는 통계적 검정력(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 120 명의 대상체)이 아니라 잘 용인되는 용량에서 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물의 안전성 및 면역원성 프로파일의 초기 검토에 적절하고 합리적인 것으로 선택된다. 샘플 크기는 반응원성의 초기 추정을 가능하게 한다. 예를 들어, hAdv5-SARS-CoV-2 조성물을 받은 총 100 명의 대상체를 고려할 때, 연구는 1.6%의 비율로 발생한 적어도 하나의 AE를 검출할 확률을 80% 갖도록 설계된다. hAdv5-SARS-CoV-2 면역학적 조성물을 받은 100 명의 대상체 중에서 SAE가 관찰되지 않았다면, SAE 발생률에 대한 95% 신뢰 구간(CI)의 단측 상한에 대한 근사치는 3%일 것이다. 면역학 분석은 PP 집단으로부터 도출된 일차 결론과 함께 평가 가능한 및 프로토콜-당(PP) 집단을 사용하여 수행된다. 평가 가능한 집단에 기반한 분석은 임의의 한 그룹에서 >1명의 대상체가 PP 집단에서 제외된 경우에만 착수되고 제시된다. 하기 기재된 바와 같이 제외 반응자 분석으로, 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 데이터는 분석 전에 적절하게 변환된다. 기준선은 1 일에 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 투여 전 수집된 샘플로 규정된다. SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응의 평가를 위한 주요 관심 변수는 항-SARS-CoV-2 항원 IgG 역가이다. GMT는 기준선 및 백신접종 후 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 결정되고, 용량 그룹별로 요약된다. hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 용량과 위약 사이의 비교는 종속 변수로서의 항-SARS-CoV-2 IgG의 기준선 후 로그-변환된 수준에 대한 공변량으로서의 기준선 로그-변환 수준 및 고정 효과로서의 치료로 공분산 분석(ANCOVA)에 의해 평가된다. 이러한 분석으로부터, 최소 제곱(LS) 평균, LS 치료 차이, 및 로그-스케일의 치료 차이에 대한 95% CI가 얻어진다. 결과는 각 연구일에 치료 기하 LS 평균, 기하 LS 평균 비율의 점 추정치, 및 이러한 비율에 대한 95% CI를 제공하기 위해 지수화에 의해 원래 척도로 다시 변환된다. "반응자"는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 기준선으로부터 항-SARS-CoV-2 항원 역가의 4 배 상승을 갖는 대상체로 규정된다. 반응자 상태의 결정을 위한 배수 변화는 +1 변환 없이 전가 후 값, 즉, 배수 변화 = 현재 귀속 값/기준선 귀속 값을 사용하여 산출된다. 반응자 비율은 용량 그룹당 백분율 및 백분율의 95% 클로퍼-피어슨(Clopper-Pearson) 정확 CI에 의해 표로 작성된다. 95% CI의 차이는 각각의 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 용량 그룹의 반응률을 및 위약 그룹과 비교하기 위해 제시된다. 일부 실시양태에서, 위약 그룹에 대한 각각의 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 용량 그룹의 반응자의 비교는 또한 피셔의 정확 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 29 일(파트 A) 또는 50 일(파트 B)에 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물의 면역원성에 대한 투여 전 Ad5 혈청 항체 수준의 효과를 알아보기 위해, 공변량으로서 기준선 Ad5 역가로 ANCOVA를 사용하여 분석이 수행된다. 평가 가능한 및 PP 집단을 사용하여 점막 면역원성 분석이 수행된다. 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 분석된 종점은 ELISA에 의해 측정된 IgA 항체 수준에 대한 GMT 및 GMR이다. 사용된 방법은 체액성 면역원성 분석과 동일하다. 연속 파라미터(안전성 실험실 시험 및 활력 징후)에 대한 요약 통계는 다음과 같이 그룹별로 제시된다: 백신접종 전, 백신접종 후, 및 백신접종 전에서 백신접종 후로의 평가 변화. 연구 백신접종 후에 백신접종 후 안전성 실험실 값 또는 활력 징후 값이 새로 비정상인 것으로 기록된(즉, 기준선 값에 비해 독성 등급이 증가하고 중증도 등급이 중간 이상인 사건) 대상체의 수 및 백분율이 표로 작성된다. 중증도 등급별로 각 대상체의 백신접종 전 및 백신접종 후 안전성 실험실 값을 교차표로 작성하는 이동 표가 만들어진다. 정상, 임상적으로 유의하지 않은 비정상, 및 임상적으로 유의한 비정상 ECG 해석을 갖는 대상체의 수 및 백분율의 요약이 제시된다. RD-Ad5 벡터의 발산을 위해, 데이터는 중간 카피 수와 함께 시점별 양성 퍼센트 및 수로 요약된다. Ad5 발산의 중앙값 지속기간, 사분위수 범위, Ad5 발산의 최소 및 최대 지속기간은 각각의 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 그룹 및 모든 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물 용량 그룹 조합에 대해 제시된다. 아데노바이러스 감염의 평가를 위한 바이러스 배양 결과가 또한 열거된다.
이러한 연구는 hAdv5-SARS-CoV-2 조성물이 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(즉, 이는 면역원성 조성물임), 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여줄 것이다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 hAdv5-SARS-CoV-2 백신 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 6: SARS-CoV-2 백신접종을 위한 AdD 벡터 인간 임상 시험
본 실시예에서, 예를 들어, SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위한 AdD 벡터(즉, SARS-CoV-2 이외의 감염원, 예를 들어, 인플루엔자, 예컨대, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 발현하는 AdVector(Ad5)인 NasoVAX으로부터 유래된 병원체 항원을 코딩하는 복제 결핍 ΔE1E3 아데노바이러스 타입 5(Ad5) 바이러스 입자(NasoVAX는, 예를 들어, NasoVAX의 제조가 개시되어 있는 본원에 참조로 포함된 2019년 4월 06 일에 출원된 미국 특허 제62/830,444호에 기재됨))의 비강내(i.n.) 투여의 사용이 기술된다. 실시양태에서, AdD 벡터는 SARS-CoV-2 및 AdD 벡터의 발현된 외인성 항원과 관련된 병원체 둘 모두에 대해 면역 반응, 바람직하게는 보호성 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, NasoVAX는 SARS-CoV-2를 포함하는 코로나바이러스와 인플루엔자 둘 모두에 대한 면역 반응을 유도할 것이다. 이러한 방식으로, AdD는 2 개의 호흡기 감염원에 대한 면역 반응을 유도하는 이중 백신이다.
SARS-CoV-2에 대한 AdD 벡터를 포함하는 조성물의 면역원성 및/또는 보호 능력을 확립하기 위해, AdD 바이러스 입자(vp)를 포함하는 AdD 조성물을 인간 대상체에게 투여하고 여기서 SARS-CoV-2에 대항하는 면역 반응에 대한 이의 효과에 대해 시험하였다. 이를 수행하기 위해, 18세 내지 49세의 건강한 성인에서 AdD 면역원성 조성물의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약-대조, 용량-증대 임상 시험이 실시될 수 있다. 대상체를 전형적으로 무작위화(1 일) 28 일 이내에 스크리닝하였다.
예를 들어, 연구는 두 가지 파트를 포함할 수 있다: AdD 조성물(예를 들어, NasoVax)의 안전성을 평가하는 파트 A, 및 면역원성을 평가하는 파트 B. 파트 A에서, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 120 명의 대상체를 각각 AdD 용량(1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp)에 의해 규정된 30 명의 대상체의 4 개의 순차적 코호트에 등록하고, 각각의 대상체는 비강 스프레이로서 비공 사이에 고르게 분할된 0.5 ml의 총 부피의 단일 비강내 용량을 투여받았다("위약" 대상체는 AdD를 포함하지 않는 0.5 ml의 생리 식염수를 받고, 용량은 또한 비강 스프레이로서 비공 사이에 균일하게 분할됨). 각 코호트(및 제1 용량 코호트의 센티넬 그룹) 내에서, 대상체를 1 회 비강내 용량의 AdD 조성물(1 일) 또는 1 회 비강내 용량의 위약(생리 식염수)(1 일)을 받도록 4:1:1 비율로 무작위화하였다. AdD 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. 반응원성은 백신접종 후 14 일 동안 코 자극, 재채기, 코 울혈, 기침, 인후통, 후각 변화, 미각 변화, 시력 변화, 눈 통증, 통증, 압통, 경결, 홍반, 국소 림프절병증, 및 전신 사건(두통, 피로, 근육통, 메스꺼움, 구토, 설사, 기침, 오한, 발열)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 국소 사건을 갖는 대상체의 수 및 백분율을 결정함으로써 확인될 수 있다. 유해 사례(AE)는 AdD 조성물의 투여 후 1 일부터 57 일까지 AE; 1 일부터 181 일까지 의학적으로 주시가 요해지는 AE(MAAE), 심각한 AE(SAE), 및 신규 발병 만성 질환(NCI)을 갖는 대상체의 수 및 백분율로 결정된다. 예를 들어, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 4 일, 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 면역원성 시험을 위해 채취될 수 있다(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 항원 및/또는 항-D 항원 항체를 측정하기 위한 혈청의 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 0 일(기준선)과 비교한 기하 평균 역가(GMT), 및/또는 항-SARS-CoV-2 및/또는 항-AdD 면역 세포 반응(예를 들어, T 세포 반응)). 반응자 비율은 또한 하기 기재된 바와 같이 결정된다(예를 들어, 투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승). 파트 A에서 안전성 프로파일의 평가를 위한 일차 종점은 백신접종 후 기록되는 예상된 및 예상되지 않은 AE를 갖는 대상체의 수 및 백분율(95% 신뢰 구간(CI))이다. 안전성 분석은 안전성 집단을 사용하여 수행된다. 국소 사건 및 전신 사건을 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 반응성과 마찬가지로 그룹별로 요약된다. 1 일부터 57 일까지 AE(MAAE, NCI, SAE 포함)를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 선호 용어(PT) 및 그룹별로 규제 활동 시스템 기관 부류(SOC)에 대한 각각의 의학 사전에 대해 요약된다. 1 일부터 181 일까지 MAAE, NCI, 및 SAE를 갖는 대상체의 수(백분율)는 유사한 방식으로 요약된다. 중증도 및 임상시험용 의약품(IP)과의 관련성 별로 AE를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)가 또한 요약된다. AE, MAAE, NCI, 및 SAE의 목록이 제공된다.
파트 B에서, AdD 조성물의 면역원성이 결정된다. 비강내 스프레이에 의해 AdD 조성물을 비강 스프레이로서 비공 사이에 고르게 분할되는 대상체에게 0.5 ml 부피 중 1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp의 단일 용량(및 일부 실시양태에서 이들 용량 중 가장 잘 용인되는 2 회의 용량(3 주 간격)으로서) 투여한 후, 면역 반응은 항-SARS-CoV-2 항원 항체 및/또는 항-AdD 항체, 및 GMT, 기하 평균 비율(GMR)(동일한 용량 그룹 내 백신접종 후 및 백신접종 전 GMT의 비율), 및 확인된 반응자 비율(투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승), 뿐만 아니라 면역 세포 반응(예를 들어, T 세포 반응)을 측정하기 위해 혈청의 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 25 명의 대상체를 파트 A 또는 위약으로부터 21 일 간격으로(1 일 및 22 일) 가장 잘 용인되는 용량의 AdD 조성물의 2 개의 비강내 용량을 받도록 4:1 비율로 무작위화하였다. AdD 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. AdD 조성물 및 위약의 비강내 용량은 앉은 자세 또는 기대어 앉은 자세에서 대상체에게 투여된다. 파트 B에서, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 면역원성 시험을 위해 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 채취되고; 비인두 면봉은 8 일, 15 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 57 일, 및 91 일에 수집될 수 있다. 스크리닝 및 29 일 및 57 일에 수집된 비인두 샘플은 또한 점막 면역 반응의 평가를 위해 후속적으로 시험될 수 있다.
일부 실시양태에서, 임상 시험은 SARS-CoV-2에 이미 감염된 환자 및 확인된 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간(또는, 일부 실시양태에서, 시험된 환자의 코호트)을 사용하여 수행될 수 있다. 일차 결과 척도는 상기 기재된 바와 같은 AdD 조성물의 투여 후 최대 28 일 동안 확인되는 임상 개선까지의 시간(TTCI) 및/또는 임상 회복까지의 시간(TTCR)이다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 1(퇴원) 내지 6(사망)의 범위인 임상 상태의 6 개-카테고리 순위 척도에서 무작위화 상태로부터 2 개 카테고리의 감소까지의 시간(일)으로 정의된다. 6-카테고리 순위 척도는 다음과 같다: 6. 사망; 5. ICU, 체외막 산소공급(ECMO) 및/또는 침습적 기계적 인공호흡(IMV) 필요; 4. 중환자실(ICU)/입원, 비침습적 기계적 인공호흡(NIV)/고유량 비강 캐뉼라(HFNC) 요법 필요; 3. 산소 보충이 필요한 입원(그러나 NIV/HFNC는 아님); 2. 보충 산소이 필요하지 않은 입원; 및, 1. 병원 퇴원 또는 퇴원 기준 충족(퇴원 기준은 임상 회복, 즉, 정상으로 회복된 발열, 호흡수, 산소 포화도, 및 기침 완화로 규정됨). 이차 결과 TTCI 척도는 모든 원인 사망률(스크리닝 중 기준선 SpO2, PaO2/FiO2 <300 mmHg 또는 호흡수 산소 보충 없이 min 당 ≥ 24 회 호흡); 호흡 진행 빈도(실내 공기 또는 PaO2/FiO2 <300 mmHg에서 SPO2≤ 94% 및 산소 보충 또는 추가 진행되는 인공호흡기 보조 필요); 해열까지의 시간(등록 시 열이 있는 경우); 경증 또는 부재로 보고된 기침까지의 시간(등록 시 기침이 중증 또는 중등도로 평가된 경우); 경증 또는 부재로 보고된 호흡곤란까지의 시간(중증 또는 중등도로 평가된 등록 시 호흡곤란이 있는 경우 중증 또는 중등도, 경증 부재의 등급으로); 산소 보충 또는 비-침습적 인공호흡 필요 빈도; 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 RT-PCR 음성까지의 시간; 바이러스 부하 곡선하 면적에 의해 평가하는 경우(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정하는 경우) 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 바이러스 부하의 변화(감소); 기계적 인공호흡 필요 빈도; 및 심각한 유해 사례의 빈도를 포함한다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 발열, 호흡수 및 산소 포화도의 정상화, 및 기침의 완화까지 적어도 72 시간 동안 지속되는 시간(시)으로 규정된다. 일차 TTCR 결과 척도는 정상화 및 완화 기준을 포함한다: 발열 - ≤36.9℃ 또는 겨드랑이 - ≤37.2℃ 경구; 호흡수 - 실내 공기에서 ≤24/분; 산소 포화도 - 실내 공기에서 >94%; 및, 기침 - 중증, 중등도, 경증, 부재의 등급으로 보고된 환자에서 경증 또는 부재. 이차 TTCR 결과 척도는 상기 열거된 TTCI 이차 결과와 동일하다.
일부 실시양태에서, 임상 시험은 위약 및 치료 그룹으로 무작위화된 50세 초과의 SARS-CoV-2에 대해 양성인 약 120 명의 대상체에 대하여 수행될 수 있다. 위약 그룹은 비강 스프레이로서 비공 사이에 고르게 분할된 단일 비강내 용량으로 투여되는 임의의 AdD 벡터를 포함하지 않는 0.5 ml의 생리 식염수를 받는다. 치료 그룹은 비강 스프레이로서 비공 사이에 고르게 분할된 단일 비강내 용량으로 투여되는 임의의 AdD 벡터(즉, NasoVax)를 포함하는 0.5 ml의 생리 식염수를 투여받는다. 일차 효능 종점은 강제 호기량(FEV-1) 및 방사선학적 기준에 의해 급성 호흡 곤란 증상(ARDS) 및 COVID-19의 최대 중증도(즉, SARS-CoV-2 감염의 증상)를 나타내는 대상체의 비율이다. 이차 종점은 바이러스 발산, 기계적 인공호흡 일수 및 입원 기간을 포함한다.
표준 임상 시험 설계 및 통계적 방법이 이의 분석에 사용된다. 예를 들어, 본 연구에 대한 샘플 크기는 통계적 검정력(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 120 명의 대상체)이 아니라 잘 용인되는 용량에서 AdD 조성물의 안전성 및 면역원성 프로파일의 초기 검토에 적절하고 합리적인 것으로 선택된다. 샘플 크기는 반응원성의 초기 추정을 가능하게 한다. 예를 들어, AdD 조성물을 받은 총 100 명의 대상체를 고려할 때, 연구는 1.6%의 비율로 발생한 적어도 하나의 AE를 검출할 확률을 80% 갖도록 설계된다. hAdv5-D(AdD) 조성물을 받은 100 명의 대상체 중에서 SAE가 관찰되지 않았다면, SAE 발생률에 대한 95% 신뢰 구간(CI)의 단측 상한에 대한 근사치는 3%일 것이다. 면역학 분석은 PP 집단으로부터 도출된 일차 결론과 함께 평가 가능한 및 프로토콜-당(PP) 집단을 사용하여 수행된다. 평가 가능한 집단에 기반한 분석은 임의의 한 그룹에서 >1명의 대상체가 PP 집단에서 제외된 경우에만 착수되고 제시된다. 하기 기재된 바와 같이 제외 반응자 분석으로, 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 데이터는 분석 전에 적절하게 변환된다. 기준선은 1 일 AdD 조성물 투여 전에 수집된 샘플로 정의되었다. SARS-CoV-2에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 및/또는 항-AdD 항원 IgG 역가, T 세포 반응)의 평가를 위한 주요 관심 변수가 결정된다. GMT는 기준선 및 백신접종 후 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 결정되고, 용량 그룹별로 요약된다. AdD 조성물 용량과 위약 사이의 비교는, 예를 들어, 종속 변수로서의 항-SARS-CoV-2 IgG의 기준선 후 로그-변환된 수준에 대한 공변량으로서의 기준선 로그-변환 수준 및 고정 효과로서의 치료로 공분산 분석(ANCOVA)에 의해 평가되었다. 이러한 분석으로부터, 최소 제곱(LS) 평균, LS 치료 차이, 및 로그-스케일의 치료 차이에 대한 95% CI가 얻어진다. 결과는 각 연구일에 치료 기하 LS 평균, 기하 LS 평균 비율의 점 추정치, 및 이러한 비율에 대한 95% CI를 제공하기 위해 지수화에 의해 원래 척도로 다시 변환된다. "반응자"는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 기준선으로부터 항-SARS-CoV-2 및/또는 항-D 항원 역가의 4 배 상승을 갖는 대상체로 규정된다. 반응자 상태의 결정을 위한 배수 변화는 +1 변환 없이 전가 후 값, 즉, 배수 변화 = 현재 귀속 값/기준선 귀속 값을 사용하여 산출된다. 반응자 비율은 용량 그룹당 백분율 및 백분율의 95% 클로퍼-피어슨 정확 CI에 의해 표로 작성된다. 95% CI의 차이는 각각의 AdD 조성물 용량 그룹의 반응률을 및 위약 그룹과 비교하기 위해 제시된다. 일부 실시양태에서, 위약 그룹에 대한 각각의 AdD 조성물 용량 그룹의 반응자의 비교는 또한 피셔의 정확 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 29 일(파트 A) 또는 50 일(파트 B)에 AdD 조성물의 면역원성에 대한 투여 전 Ad5 혈청 항체 수준의 효과를 알아보기 위해, 공변량으로서 기준선 Ad5 역가로 ANCOVA를 사용하여 분석이 수행된다. 평가 가능한 및 PP 집단을 사용하여 점막 면역원성 분석이 수행된다. 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 분석된 종점은 ELISA에 의해 측정된 IgA 항체 수준에 대한 GMT 및 GMR이다. 사용된 방법은 체액성 면역원성 분석과 동일하다. 연속 파라미터(안전성 실험실 시험 및 활력 징후)에 대한 요약 통계는 다음과 같이 그룹별로 제시된다: 백신접종 전, 백신접종 후, 및 백신접종 전에서 백신접종 후로의 평가 변화. 연구 백신접종 후에 백신접종 후 안전성 실험실 값 또는 활력 징후 값이 새로 비정상인 것으로 기록된(즉, 기준선 값에 비해 독성 등급이 증가하고 중증도 등급이 중간 이상인 사건) 대상체의 수 및 백분율이 표로 작성된다. 중증도 등급별로 각 대상체의 백신접종 전 및 백신접종 후 안전성 실험실 값을 교차표로 작성하는 이동 표가 만들어진다. 정상, 임상적으로 유의하지 않은 비정상, 및 임상적으로 유의한 비정상 ECG 해석을 갖는 대상체의 수 및 백분율의 요약이 제시된다. Ad5 벡터의 발산을 위해, 데이터는 중간 카피 수와 함께 시점별 양성 퍼센트 및 수로 요약된다. Ad5 발산의 중앙값 지속기간, 사분위수 범위, Ad5 발산의 최소 및 최대 지속기간은 각각의 AdD 조성물 그룹 및 조합된 모든 면역원성 조성물 용량 그룹에 대해 제시된다. 아데노바이러스 감염의 평가를 위한 바이러스 배양 결과가 또한 열거된다.
이러한 연구는 AdD 조성물이 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임) 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여줄 것이다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 AdD 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 임상 악화의 예방에서 NasoVAX의 이중 맹검, 무작위, 위약-대조 연구
본 실시예에서, NasoVAX는 감염의 초기 단계에 대한 요법으로서 또는 직접적인 항바이러스제와의 병용 요법으로서 사용된다. COVID-19의 치료와 관련하여, NasoVAX(및 AdE)는 전임상 마우스 모델에서 호흡기 바이러스에 의한 치명적인 공격으로부터 보호를 제공하는 것으로 입증되었으며, 효과는 2 일만큼 적게 발생하고 3 주 이상 지속되었다. 미국 특허 제9,175,310호를 참조한다. 상기 실시예 2에서, AdE(트랜스진 발현 없음)의 사용은 IL-6, IL-1α 및 IL-12의 하향조절과 관련이 있었다. 이들은 COVID-19에서 폐 간질 염증을 매개하는 것으로 입증된 사이토카인이다. 전임상 마우스 모델에서 NasoVAX 및 AdE에 의해 제공되는 보호는 아데노바이러스 벡터에 기인할 수 있는데, 이는 벡터가 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원을 발현하는 트랜스진의 존재 또는 부재 하에 상응하는 효과를 가졌기 때문이다. NasoVAX의 보호 효과는 호흡기 병원체에 대한 과도한 병원성 면역 반응을 약화시키는 선천성 면역을 조절하는 생물학적 반응으로 볼 수 있다. 이는 COVID-19와 관련된 폐 염증을 조절하기 위한 IL-6 억제제 케브자라(사릴루맙) 및 악템라(토실리주맙)의 사용과 유사할 것이다. 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터(호흡기 병원체로부터 트랜스진을 발현하거나 발현하지 않는)는 비강내 투여될 때 COVID-19 질병 증상을 호전시킨다.
벡터 접근법의 강점은 COVID-19와 관련된 폐 염증을 조절하는 데 사용될 수 있는 다른 제제(예를 들어, 케브자라(사릴루맙) 및 악템라(토실리주맙))와 달리, NasoVAX가 비강내 투여되어, 다른 의약에 대해 IV 접근 포트를 자유롭게 두고; 단일 사이토카인으로 제한되지 않고; 혈액학적 부작용 프로파일(예를 들어, 호중구감소증)을 갖지 않고; 연장된 작용 지속기간을 나타내는데, 이것이 질병 과정의 매우 초기 단계에서 후속 사이토카인 손상을 조절하는 데 유용할 것이라는 점이다. 또한, 하기 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스 벡터화된 면역원성 조성물이 비강내 투여되는 경우, 대상체의 아데노바이러스 면역(예를 들어, 바이러스 벡터, 즉, Ad5에 대해 혈청양성인 면역)을 우회하여, 아데노바이러스 혈청양성 대상체에 대한 반복 투여 및/또는 투여를 가능하게 한다.
따라서, 일부 실시양태에서, NasoVAX는 감염의 초기 단계에 대한 요법으로서 또는 일부 실시양태에서 직접적인 항바이러스제(예를 들어, 클로로퀸, 아지트로마이신)와 조합하여 COVID-19에 대한 병용 요법으로서 사용될 수 있다. 일부 시점에, 원료 의약품은 벡터 단독(예를 들어, AdE에서와 같이 트랜스진 제외)이 투여되는 제품으로 전이될 수 있다.
NasoVAX는 인플루엔자 A/캘리포니아/04/2009 (pAdcoCA09.HA)로부터 인간 코돈-최적화된 헤마글루티닌 cDNA를 보유하는 큰 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 지니는 박테리아 콜로니의 단리에 의해 제조된다. AdcoCA09.HA 재조합 벡터는 유동-세포 전기천공 기법(모델 STX-100, Maxcyte Inc. 게이더스버그, MD)를 사용하여 단일 작업으로 대략 4×109 개 세포로 pAdcoCA09.HA 플라스미드의 대규모 형질감염 후 현탁액 중의 PER.C6 세포로부터 회수되었다. 수확 시점에, 임의의 방출된 벡터를 함유하는 감염된 세포 및 성장 배지에 3 회 사이클의 동결-해동을 수행한 후, CsCl 등밀도 원심분리에 의한 벡터의 단리 및 정제 및 최종 생성물 형성 완충액에 대한 투석을 수행하였다. 정제된 벡터를 PER.C6 세포에서 증폭시키고, 감염된 세포 펠렛으로부터 3 회 사이클의 동결-해동에 의해 방출시켜 원심분리에 의해 정화되고 프리-마스터 바이러스 시드(Pre-Master Virus Seed)로서 멸균 여과된 감염된 세포 용해물을 생성하였다. NasoVAX Pre-MVS는 시험 후에 방출되었다. AdcoCA09.HA의 제조는 벡터 확장 단계를 포함하며, 이에 의해 벡터 pre-MVS는 cGMP 하에 증폭되어 생산 진행의 감염에 이용 가능한 시드 스톡을 증가시켰다. 이러한 중간 확장 단계의 산물은 AdcoCA09.HA MVS였다. AdcoCA09.HA MVS의 생산은 pre-MVS의 cGMP 벡터 확장으로 시작한 후 MVS의 유도, 생산, 및 특징화가 이어졌다. 원료 의약품의 제조는 현탁액 중의 PER.C6 세포의 AdcoCA09.HA 감염 및 이어서 세포 펠렛에서 벡터의 농축, 세포 펠렛으로부터 벡터의 방출, 용해물의 정화 및 2 개의 연이은 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용한 벡터의 정제를 포함하였다. 산물 용리액을 제제 완충액에 대해 정용여과하고, 필요한 경우 농축시키고, 멸균 여과하여 벌크 원료 의약품(BDS)을 생성하였다. 최종 용기에 충전하기 전에 제제 완충액 및 멸균 여과로 적절한 농도로 희석한 후 최종 약물 생성물(FDP)을 BDS로부터 수득하였다. 본 실시예에서 사용될 시험 제품은 A195 완충액(10 mM Tris, 10 mM 히스티딘, 5% (w/v) 수크로스, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.02% (w/v) 폴리소르베이트-80, 0.1 mM EDTA, 0.5% (v/v) 에탄올(pH 7.4)) 중 500 μL의 멸균 냉동 현탁액을 함유하는 1 회용 유리 주사기에 공급된(예를 들어, 1×109, 1010 및/또는 1011 vp) NasoVAX이다. 주사기(BD, Accuspray™)는 250 μL의 비강내 스프레이를 각 비공에 전달하도록 설계되었다. 대안적으로, NasoVAX는 2 mL 유리 바이알에 공급되며, 여기서 용량은 비강내 투여 전에 투베르쿨린 주사기로 제거되고 LMA MAD300 분무기 장치(Teleflex, 이스라엘)에 부착된다. 안정성 샘플을 시험 제품과 동일한 투여형 및 용기(BD Accuspray™)에 패키징하고, 바이러스 입자의 물리적 안정성(바이러스 입자 시험, HPLC), 바이러스의 감염성(감염성 역가, 아데노바이러스 형광 병소 단위(FFU) 검정), 아데노바이러스 벡터의 기능성(트랜스진 발현)(역가), 제제의 물리적 안정성(외관 및 pH), 및 멸균성을 포함하는 안정성 지시 검정을 사용하여 시험하였다.
본 실시예에서, NasoVAX(1×1011 vp 용량) 또는 위약에 1:1 무작위화되고 연령별로 계층화된 조기 발병 COVID-19를 갖는 대략 120 명의 환자를 포함하는 임상 시험이 기술된다. 각 환자는 최대 약 6주까지(2 주 치료 기간 및 1 개월 추적 전화 통화) 연구에 참여할 것이다. 본 연구에 포함된 환자는 다음 비제한적인 기준을 사용하여 선택된다: 사전 동의를 제공할 수 있고 제공할 의향 있음; 35세 이상의 남성 및 여성; 구강 온도 ≥ 38.0℃, 48 시간 이내에 증상의 개시, 및 무작위화 24 시간 이내에 PCR-기반 진단에 의한 COVID-19의 확인으로 규정되는 조기 발병 COVID-19; 2 회의 연속 측정에서 5 분 동안 휴지 시 O2 포화도(SaO2) ≥ 96.0%; 가임 여성(영구적으로 불임[문서화된 자궁적출술, 양측 난관 결찰, 난관 절제술, 또는 난소 절제술] 또는 폐경후[대체적 의학적 원인 없이 월경이 없는 12 개월]가 아닌 여성)은 스크리닝 시 음성 소변 임신 검사를 나타내고 금욕, 동성끼리만 하는 성관계, 폐경 후 파트너와의 일부일처 관계, 정관 절제된 파트너와의 일부일처 관계, 정관 절제술, 허가된 호르몬 방법, 자궁내 장치, 또는 연구 의약의 마지막 용량 후 28 일 동안 살정제와 함께 배리어 방법(예를 들어, 콘돔, 다이어프램)의 지속적 사용을 비제한적으로 포함하는 매우 효과적인 피임 방법을 시행할 의향이 있음; 가임기의 성 파트너가 있는 남성은 연구 의약의 마지막 용량 후 45 일 동안 상기 정의된 바와 같은 매우 효과적인 피임 방법을 기꺼이 시행할 의향이 있음; 및 전체 연구 기간 동안 연구의 모든 양태를 따를 능력 및 의향이 있음. 배제 기준은 다음을 포함한다: 임신 또는 수유 중인 여성; 중등도 또는 중증의 휴식 시 호흡 곤란; 빠른 질병 진행, 즉각적인 입원 필요, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 및 천식을 포함하는 폐쇄성 기도 질환, 또는 COVID-19에 의해 야기되는 것과 무관하게 악화될 수 있는 다른 호흡기 질환을 시사하는 신체 검사에서의 소견; 만성 비염, 코 중격 결손, 구개열, 비용종, 또는 미용 코성형 이외의 코 수술의 이력과 같은 비강내 의약의 적합성에 영향을 줄 수 있는 코 상태; 지난 30 일 이내에 COVID-19에 대한 클로로퀸 및 하이드록시클로로퀸 및 다른 연구용 제제의 사용; 스크리닝 30 일 이내에 경구 또는 정맥내 코르티코스테로이드, 알킬화 약물, 항대사물질, 세포독성 약물, 방사선, 면역-조절 생물제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 면역계에 영향을 미치는 것으로 알려진 치료, 또는 면역손상과 관련된 병태의 이력; 및, 연구원의 재량에 따라 프로토콜 준수, 안전성 평가(반응원성 포함), 또는 사전 동의를 제공하는 환자의 능력을 방해하거나 금기로 작용할 임의의 의학적, 정신과적, 또는 사회적 상태 또는 직업적 또는 다른 책임.
환자는 COVID-19 진단 24 시간 이내에 0.5 mL(각 비공에 0.25 mL)의 단일 비강내 용량으로 투여되는 NasoVAX 또는 위약에 1:1로 무작위화된다. 처음 20 명의 연구 참가자(대략 10 명 NasoVAX 처리 및 10 명 위약 처리)는 35세 내지 49세의 환자의 센티넬 코호트(sentinel cohort)로 이루어진다. 환자에게 일회용 핑거-팁 옥시미터 및 디지털 온도계가 제공되고 시험 기간 동안 가정으로 돌아간다. SaO2, 구강 온도, 및 맥박 호흡수는 구강 온도, 증상 및 수반되는 약물을 기록하기 위해 모바일/스마트 폰 맥박 산소 측정기 및 웹-기반 다이어리를 사용하여 14 일 동안 매일 2 회 2 분 동안 휴식 시 원격으로 모니터링되고, 임상 상태 및 유해 사례(AE)를 문서화하기 위해 매일 전화를 받는다. 환자는 최종 결과 및 유해 사례를 문서화하기 위해 원격 모니터링의 마지막 날 이후 대략 7±2 일마다 호출된다. 입원 환자의 SAE, 병원 및 ICU 입원 기간, 및 사망률이 문서화될 것이다. 연구 동안 예정된 대면 방문은 없다.
효능과 관련하여, 본 연구의 1차 목적은 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 임상 악화를 예방하는 데 있어서 NasoVAX의 유효성을 평가하는 것이며; 이차 목적은 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 ICU 입원 및 기계적 인공호흡의 비율 및 입원이 필요한 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 COVID-19의 중증도를 감소시키는 데 있어서 NasoVAX의 유효성을 평가하는 것이다. 일차 종점은 가정 후속 조치 또는 입원 동안 임의의 측정에서 이동 맥박 산소 측정법에 의해 평균 SaO2가 94% 이하의 수준으로 4% 감소하는 것으로 규정되는 임상 악화를 갖는 환자의 비율이다. 보행 환자에서, 이차 효능 종점은 가정 후속 조치 동안 SaO2의 최대 감소 및 외래 환자 맥박 산소 측정법에 의한 자발적 호흡에 의해 평가된 COVID-19의 중증도 및 기계적 인공호흡이 필요한 환자의 비율을 포함한다. 입원 환자에서, 이차 효능 종점은 환자가 기계적 인공호흡이 없는 상태와 살아있는 상태 둘 모두인 1 일과 30 일(연구 의약의 첫 용량 대비) 간에 연구 의약의 용량에서 매일 1 점(일)으로 규정되는 인공호흡기가 없는 날 및 부분 흡기 산소에 대한 동맥 산소 분압의 비율(P/F 비율)을 포함한다.
안전성과 관련하여, 일차 목적은 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 임상 악화를 예방하는 데 있어서 NasoVAX의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 이들은 유해 사례(AE)의 발생률 및 중증도, 사망률, 병원 재원 기간, 및 ICU 재원 기간을 포함한다. 안전성 종점은 집에서 보고된 AE 대 의료를 위해 입원 동안 보고된 AE 간에 별도로 분류된다.
통계적 방법은 검정력 및 샘플 크기 가정을 포함하고, 이는 위약을 받은 29%에 비해 임상적 악화가 발생한 NasoVAX를 받은 환자의 10%로서, 치료 아암 당 60 명의 환자가 일차 효능 변수에 대한 통계적 유의성을 달성하기 위해 0.05의 단측에서 77% 검정력을 제공한다. 집단 정의는 다음을 포함한다: "안전성 분석 세트": 임의의 연구 의약을 받은 모든 환자; "치료 의향"(ITT): 임의의 양의 연구 의약을 받은 모든 무작위화된 환자는 기준선 및 적어도 하나의 기준선 후 SaO2 측정을 갖는다. 대상체는 이들이 받는 치료에 따라 분석되고 "프로토콜당"(PP): 정확한 치료 할당에 따라 임의의 양의 연구 의약을 받고 14 일 또는 입원까지 SaO2 측정으로부터 1 일 2 회 결과를 갖는 모든 무작위화된 환자이다. 기준선은 임의의 연구 의약 투여 전에 무작위화에 가장 가깝게 수집된 데이터로 규정된다. 모든 분석 및 요약 통계는 치료 그룹에 의해 제시된다(NasoVAX, 위약). 범주형 변수에 대한 수 및 백분율 및 연속 변수에 대한 수, 평균, 표준 편차, 중앙값, 최소값 및 최대값을 포함하는 기술 통계는 치료별로 제공된다. 환자는 NasoVAX 또는 위약에 1:1로 무작위화되고 연령 그룹(35-49세 대 50세 이상)으로 계층화된다. 센티넬 코호트에서 NasoVax 및 위약(20 명의 환자 각각 10 명의 환자)의 1:1 분포를 보장하기 위해, 이 그룹의 무작위화는 계층화되지 않는다. 효능 분석의 경우, 인구통계학적 및 기준선 특성의 차이를 평가하기 위해 기술 통계가 사용된다. 일차 분석을 위해, 가정 후속 조치 또는 입원 동안 임의의 측정 시 이동 맥박 산소 측정법에 의해 평균 SaO2가 94% 이하의 수준까지 4% 감소하는 것으로 정의되는 임상 악화를 갖는 환자의 비율은 0.05% 단측 유의성 수준에서 Cochrane Mantel Haenszel 검정을 사용하여 NasoVAX와 위약 그룹 간에 비교된다. 본질적으로 범주형인 이차 또는 탐색적 종점에 대해 동일한 접근법이 적용된다. 조기에 중단하거나 데이터가 누락된 대상체는 해당 종점에 대해 비반응자로 간주된다. 연구 의약에 대한 반응에 대한 부위의 효과를 평가하기 위해 민감도 분석이 수행된다. 선형 및 로지스틱 회귀는 반응에 대한 연령, 성별, 의약 및 의학적 동반질환과 같은 기준선 인자의 효과를 조사하기 위해 사용된다. 정량적 안전성 데이터는 기술 통계 및 빈도 분포를 사용하여 요약된다. 모든 요약은 치료 아암에 의해 제시된다. AE는 규제 활동에 대한 의학 사전(MedDRA®)을 사용하여 코드화되고, 병행 약물은 세계 보건 기구(WHO) 약물 사전을 사용하여 코드화된다. 가정 후속 조치 동안 외래 환자 맥박 산소 측정법에 의한 SaO2의 최대 감소 및 자발적 호흡수에 의해 평가된 COVID-19의 중증도의 기준선으로부터의 변화는 반복 측정에 대한 혼합 모델(MMRM) 모델을 사용하여 분석된다. 모델은 치료의 고정 효과, 계층화 인자, 주, 및 방문별 치료 상호작용 뿐만 아니라 기준선 수준의 연속적인 공변량을 포함할 것이다. 모델은 환자 공분산 내 비구조화 매트릭스 및 제한 최대 우도(ReML) 추정 방법을 사용할 것이다. 인공호흡기가 없는 날은 연속 데이터에 대해 t-검정 또는 맨-휘트니를 사용하여 분석된다. 카플란-마이어 모델은 시간 경과에 따른 SaO2의 치료 그룹 간의 변화를 비교하기 위해 개발되었다. 이차 또는 탐색적 종점에 대해서는 다중도 조정이 이루어지지 않았다.
이러한 연구는 NasoVAX가 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임) 허용되는 안전성 프로파일을 나타낸다는 것을 보여줄 것이다. 데이터는 또한 NasoVAX가 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 ICU 입원 및 기계적 인공호흡의 비율을 감소시키고, 입원이 필요한 조기 발병 COVID-19를 갖는 환자에서 COVID-19의 중증도를 감소시키는 데 효과적임을 보여줄 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 NasoVAX의 투여 후 염증성 사이토카인, 예컨대, IL-1α, IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, MCP-1, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및/또는 RANTES(CCL5)(예를 들어, 실시예 2 참조)의 발현 감소가 발생할 수 있고, 일부 실시양태에서 COVID-19를 진단하고/진단하거나 COVID-19로부터의 회복을 예측하는 데 사용될 수 있고, 이에 따라 치료 프로토콜(예를 들어, 비-NasoVAX 치료)을 조정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, NasoVAX의 투여 직후 MCP1 및/또는 RANTES의 증가는 COVID-19로부터의 회복 및 증상의 호전을 예측하는 데(예를 들어, 마커로서) 사용될 수 있다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 NasoVAX가 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 8. 실온에서 NasoVAX 안정성
본 실시예는 실온에서 액체인 제형에서 NasoVAX의 장기 안정성을 기술한다. 실온에서의 장기 안정성은 냉장 또는 제형을 안정화시키기 위한 다른 수단을 이용할 수 없는 상황에서 사용될 수 있는 백신의 요망되는 특징이다. 이는 백신이 더 낮은 온도에서 제형을 유지하기 위한 장비가 부족할 수 있는 원격 지역으로 운송되어야 하거나 가정 또는 검역에서 개별 자가-격리와 같이 최종 사용자에게 직접 운송되어야 하는 에피데믹 또는 팬데믹 상황에서 중요할 것이다. 하기 표 9 및 표 10에 제시된 바와 같이, 저용량(2×109 vp/mL 용량) 및 고용량(2×1011 vp/mL 용량) 제형을 각각 제조되고, 유리 바이알에서 실온에서 1 개월, 3 개월 및 6 개월 동안 유지되었다. NasoVAX 벡터의 생존력은 아데노바이러스 형광 병소 단위(FFU) 검정을 사용하여 결정하였다. 간략히, FFU 검정은 세포 단층을 적절한 NasoVAX 희석액으로 감염시킴으로써 수행되고, 24-48 시간 동안 인큐베이션된다. 이후, 세포가 세척되고, 검사되고, 고정되고(예를 들어, 4 분 동안 빙냉된 90% 메탄올), 다시 세척되었다. 이어서, 항-Ad5 항체가 다양한 희석액(대조군 샘플에서 항체 생략됨)으로 첨가된 다음, 적절한 조건(예를 들어, 실온에서 10 분 동안 진탕시키면서) 하에 검출제(예를 들어, NCL-Adeno(예를 들어, NCL-Adeno(Novocastra, 뉴캐슬, UK))가 첨가되었다. 이어서, 세포가 세척되고, 감염성 입자의 총 수를 확인된다(예를 들어, 디지털 광 산란(DLS)에 의해). 표 15 및 표 16에 제시된 바와 같이, 저용량 및 고용량 NasoVAX 제제는 실온에서 적어도 3 개월 동안 안정하였다.
본 연구는 아데노바이러스 벡터화된 백신 조성물(예를 들어, NasoVAX)이 실온(예를 들어, 15℃ 내지 30℃, 바람직하게는 20℃ 내지 25℃)과 같은 주위 온도에서 약 3 개월 동안 안정하다는 것을 보여준다. 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터화된 백신 조성물은 냉장 또는 특정 저장 조건에 대한 필요 없이 저장되거나 운송될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 비강내 아데노바이러스 벡터화된 백신은 SARS-CoV-2 바이러스(팬데믹 코로나바이러스 균주) 감염에 대한 면역 반응을 유도하고/유도하거나 COVID-19 질병 증상을 호전시키도록 구성될 수 있고, 비강내 투여를 위해 사용자에게 직접 운반될 수 있다.
표 15
NasoVAX(2×10 9 vp/mL 용량)에 대한 안정성 데이터
Figure pct00044
표 16
NasoVAX(2×10 11 vp/mL 용량)에 대한 안정성 데이터
Figure pct00045
실시예 9: NasoVAX 발산 및 항-NasoVAX 벡터 항체
NasoVAX는 이전에 18세 내지 49세의 건강한 성인에서 NasoVAX(1가 Adco.CA.HA)의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 2a상, 무작위, 이중 맹검, 위약-대조 시험에서 평가되었다. 대상체는 무작위화되고, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 바이러스 입자(vp) 또는 식염수 위약의 단일 용량을 제공받았고, 모두 각각의 비공에 대략 0.25 ml 비강 스프레이로서 0.5 mL 용량 분할로 제공되었다. 프로토콜은 2019년 4월 06일에 출원된 미국 일련 번호 제62/830,442호에 기재되어 있다.
상기 연구의 이차 목적은 NasoVAX의 투여 시점에 Ad5에 대해 혈청양성인 대상체에 대한 아데노바이러스 벡터(Ad5)에 대항하는 면역 반응(혈청음성인 대상체와 비교하여)을 평가하는 것이었다. 투여 후 4 일, 8 일 및 15 일에, 비인두 면봉 샘플이 각 대상체로부터 수집되고, 각각에 의해 발산된 Ad5 벡터의 농도가 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 검정에 의해 정량화되었다. 도 25에 도시된 바와 같이, NasoVAX 벡터의 용량-의존적 발산은 투여 후 8 일까지 검출되었고, 15 일에는 검출되지 않았다. 복제 적격 바이러스는 검출되지 않았다.
도 25는 또한 109 vp, 1010 vp, 또는 1011 vp의 NasoVAX의 단일 비강내 용량의 투여 후 NasoVAX의 Ad5 벡터 성분에 대한 항체의 GMR을 예시한 것이다. 이에 제시된 바와 같이, 최고 용량(1011 vp)의 투여만이 놀랍게도 대조와 비교하여 대상체에서 항-Ad5 벡터 항체의 약 2.3 배 유도를 초래하였다. 이는 비강내 투여 경로가 NasoVAX, 또는 Ad5-기반 벡터를 포함하는 잠재적으로 다른 아데노바이러스 벡터화된 면역원성 조성물의 반복된 투여에 사용될 수 있음을 나타내기 때문에 중요한 발견이다.
도 26은 대상체에게 단일 비강내 용량(1011 vp)의 NasoVAX를 투여한 후 Ad5 혈청상태에 대한 기존의 항-Ad5 면역 효과를 보여준다. 본원에 제시된 바와 같이, 기존의 항-Ad5 면역("Ad5 혈청양성"(중앙 역가는 정량 하한("LLOQ")보다 22 배 높음)은 NasoVAX의 비강내 용량의 투여 후 체액성(HAI), 미세중화(MN), 점막(IgA), 또는 세포(ELISpot) 항-Ad5 면역에 거의 영향을 미치지 않았다. 이는 NasoVAX가 Ad5에 기존 면역을 갖는 대상체에게도 비강내 투여될 수 있음을 지시하기 때문에 또 다른 중요한 발견이다. 실시양태에서, 본 발명의 비강내 아데노바이러스 벡터화된 백신은 바이러스 벡터에 대한 유의한 면역 반응을 유도하지 않고 반복적으로(예를 들어, 약 11-14 개월마다 1 회 투여되는 계절성 백신으로서) 투여될 수 있다.
실시예 10: SARS-CoV-2 백신으로서의 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터 인간 임상 시험의 조합
본 실시예에서, SARS-CoV-2에 대한 예방 요법을 제공하기 위한 rdAd 항-SARS-CoV-2 벡터의 조합물(예를 들어, "조합된 SARS-CoV-2 조성물")의 비강내(i.n.) 투여가 기술된다. 이러한 면역원성 조성물(들)의 면역원성 및/또는 보호 능력을 확립하기 위해, AdE를 포함하는 조성물을 먼저 인간에게 투여하고, 7 일 후에 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 조성물을 투여하고, 이어서 인간(들)에서 SARS-CoV-2에 대항하는 면역 반응에 대한 이러한 조합물의 효과를 시험하였다. 조성물 AdE 및 이후 hAd5-SARS-CoV-2를 포함하는 조성물의 순차적 투여는 본원에서 "조합된 SARS-CoV-2 조성물"로 지칭된다. 이를 수행하기 위해, 18세 내지 49세의 건강한 성인에서 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위한 무작위, 이중 맹검, 위약-대조, 용량-증대 임상 시험이 실시될 수 있다. 대상체를 전형적으로 무작위화(1 일) 28 일 이내에 스크리닝하였다.
예를 들어, 연구는 두 가지 파트를 포함할 수 있다: 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 안전성을 평가하는 파트 A, 및 면역원성을 평가하는 파트 B. 파트 A에서, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 120 명의 대상체를 각각 조합된 SARS-CoV-2 조성물 용량(각 용량에서 1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp)에 의해 규정된 30 명의 대상체의 4 개의 순차적 코호트에 등록하였다. 각 코호트(및 제1 용량 코호트의 센티넬 그룹) 내에서, 대상체를 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 1 회 비강내 용량(1 일에 AdE 조성물 및 이어서 7 일에 hAd5-SARS-CoV-2 조성물) 또는 위약(생리 식염수)의 비강내 용량(1 일 및 7 일에)을 받도록 4:1:1 비율로 무작위화하였다. 조합된 SARS-CoV-2 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. 반응원성은 백신접종 후 14 일 동안 코 자극, 재채기, 코 울혈, 기침, 인후통, 후각 변화, 미각 변화, 시력 변화, 눈 통증, 통증, 압통, 경결, 홍반, 국소 림프절병증, 및 전신 사건(두통, 피로, 근육통, 메스꺼움, 구토, 설사, 기침, 오한, 발열)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 국소 사건을 갖는 대상체의 수 및 백분율을 결정함으로써 확인된다. 유해 사례(AE)는 조합된 SARS-CoV-2 조성물 또는 위약의 투여 후 1 일부터 57 일까지 AE; 1 일부터 181 일까지 의학적으로 주시가 요해지는 AE(MAAE), 심각한 AE(SAE), 및 신규 발병 만성 질환(NCI)을 갖는 대상체의 수 및 백분율로 결정된다. 예를 들어, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 4 일, 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 면역원성 시험을 위해 채취될 수 있다(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 항원 항체를 측정하기 위한 혈청의 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 0 일(기준선)과 비교한 기하 평균 역가(GMT), 및/또는 항-SARS-CoV-2 면역 세포 반응(예를 들어, T 세포 반응)). 반응자 비율은 또한 하기 기재된 바와 같이 결정된다(예를 들어, 투여 후 IgG의 ≥ 4 배 상승). 파트 A에서 안전성 프로파일의 평가를 위한 일차 종점은 백신접종 후 기록되는 예상된 및 예상되지 않은 AE를 갖는 대상체의 수 및 백분율(95% 신뢰 구간(CI))이다. 안전성 분석은 안전성 집단을 사용하여 수행된다. 국소 사건 및 전신 사건을 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 반응성과 마찬가지로 그룹별로 요약된다. 1 일부터 57 일까지 AE(MAAE, NCI, SAE 포함)를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)는 선호 용어(PT) 및 그룹별로 규제 활동 시스템 기관 부류(SOC)에 대한 각각의 의학 사전에 대해 요약된다. 1 일부터 181 일까지 MAAE, NCI, 및 SAE를 갖는 대상체의 수(백분율)는 유사한 방식으로 요약된다. 중증도 및 임상시험용 의약품(IP)과의 관련성 별로 AE를 갖는 대상체의 수(백분율, 95% CI)가 또한 요약된다. AE, MAAE, NCI, 및 SAE의 목록이 제공된다.
파트 B에서, 조합된 SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 면역원성이 결정된다. 대상체에 대한 이러한 용량 중 가장 잘 용인되는 1×108, 1×109, 1×1010, 및 1×1011 vp의 단일 용량으로서 비강내 스프레이에 의해 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 투여 후(즉, 1 일에 조합된 SARS-CoV-2 조성물(AdE 조성물) 및 이어서 7 일에 hAd5-SARS-CoV-2), 면역 반응은 항-SARS-CoV-2 항원 항체, 및 GMT, 기하 평균 비율(GMR)(동일한 용량 그룹 내의 백신접종 후 및 백신접종전 GMT의 비율), 및 반응자 비율(투여 후 IgG의 ≥ 4 배 증가), 뿐만 아니라 면역 세포 반응(예를 들어, T 세포 반응)을 측정하기 위해 혈청의 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 모든 포함 기준을 충족하고 배제 기준을 충족하지 않으며 서면 사전 동의를 제공한 대략 25 명의 대상체를 파트 A 또는 위약으로부터 21 일 간격으로(1 일 및 22 일) 가장 잘 용인되는 용량의 조합된 SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 2 개의 비강내 용량을 받도록 4:1 비율로 무작위화하였다. 조합된 SARS-CoV-2 조성물 및 위약을 이중-맹검 방식으로 투여하였다. 조합된 SARS-CoV-2 조성물 면역원성 조성물 및 위약의 비강내 용량은 앉은 자세 또는 비스듬한 자세의 대상체에게 투여된다. 파트 B에서, 활력 징후를 포함하는 표적화된 및 증상-유도 신체 검사는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 심전도는 57 일에 수행될 수 있고; 안전성 실험실 시험은 8 일, 29 일, 및 57 일에 수행될 수 있고; 혈청 샘플은 면역원성 시험을 위해 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 181 일, 및 361 일에 채취되고; 비인두 면봉은 8 일, 15 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 57 일, 및 91 일에 수집될 수 있다. 스크리닝 및 29 일 및 57 일에 수집된 비인두 샘플은 또한 점막 면역 반응의 평가를 위해 후속적으로 시험될 수 있다.
일부 실시양태에서, 임상 시험은 SARS-CoV-2에 이미 감염된 환자 및 확인된 임상 개선 및/또는 회복까지의 시간(또는, 일부 실시양태에서, 시험된 환자의 코호트)을 사용하여 수행될 수 있다. 일차 결과 척도는 상기 기재된 바와 같은 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 투여 후 최대 28 일 동안 확인되는 임상 개선까지의 시간(TTCI) 및/또는 임상 회복까지의 시간(TTCR)이다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 1(퇴원) 내지 6(사망)의 범위인 임상 상태의 6 개-카테고리 순위 척도에서 무작위화 상태로부터 2 개 카테고리의 감소까지의 시간(일)으로 정의된다. 6-카테고리 순위 척도는 다음과 같다: 6. 사망; 5. ICU, 체외막 산소공급(ECMO) 및/또는 침습적 기계적 인공호흡(IMV) 필요; 4. 중환자실(ICU)/입원, 비침습적 기계적 인공호흡(NIV)/고유량 비강 캐뉼라(HFNC) 요법 필요; 3. 산소 보충이 필요한 입원(그러나 NIV/HFNC는 아님); 2. 보충 산소이 필요하지 않은 입원; 및, 1. 병원 퇴원 또는 퇴원 기준 충족(퇴원 기준은 임상 회복, 즉, 정상으로 회복된 발열, 호흡수, 산소 포화도, 및 기침 완화로 규정됨). 이차 결과 TTCI 척도는 모든 원인 사망률(스크리닝 중 기준선 SpO2, PaO2/FiO2 <300 mmHg 또는 호흡수 산소 보충 없이 min 당 ≥ 24 회 호흡); 호흡 진행 빈도(실내 공기 또는 PaO2/FiO2 <300 mmHg에서 SPO2≤ 94% 및 산소 보충 또는 추가 진행되는 인공호흡기 보조 필요); 해열까지의 시간(등록 시 열이 있는 경우); 경증 또는 부재로 보고된 기침까지의 시간(등록 시 기침이 중증 또는 중등도로 평가된 경우); 경증 또는 부재로 보고된 호흡곤란까지의 시간(중증 또는 중등도로 평가된 등록 시 호흡곤란이 있는 경우 중증 또는 중등도, 경증 부재의 등급으로); 산소 보충 또는 비-침습적 인공호흡 필요 빈도; 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 2019-nCoV-2 RT-PCR 음성까지의 시간; 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 SARS-CoV-2 바이러스 부하의 변화(감소); 바이러스 부하 곡선하 면적에 의해 평가하는 경우(예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정하는 경우) 인후 면봉, 가래, 하기도 검체 및/또는 상기도 검체에서 2019-nCoV 바이러스 부하의 변화(감소); 기계적 인공호흡 필요 빈도; 및 심각한 유해 사례의 빈도를 포함한다. TTCI는 연구 치료(활성 또는 위약)의 개시로부터 발열, 호흡수 및 산소 포화도의 정상화, 및 기침의 완화까지 적어도 72 시간 동안 지속되는 시간(시)으로 규정된다. 일차 TTCR 결과 척도는 정상화 및 완화 기준을 포함한다: 발열 - ≤36.9℃ 또는 겨드랑이 - ≤37.2℃ 경구; 호흡수 - 실내 공기에서 ≤24/분; 산소 포화도 - 실내 공기에서 >94%; 및, 기침 - 중증, 중등도, 경증, 부재의 등급으로 보고된 환자에서 경증 또는 부재. 이차 TTCR 결과 척도는 상기 열거된 TTCI 이차 결과와 동일하다.
표준 임상 시험 설계 및 통계적 방법이 이의 분석에 사용된다. 예를 들어, 본 연구에 대한 샘플 크기는 통계적 검정력(예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 120 명의 대상체)이 아니라 잘 용인되는 용량에서 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 안전성 및 면역원성 프로파일의 초기 검토에 적절하고 합리적인 것으로 선택된다. 샘플 크기는 반응원성의 초기 추정을 가능하게 한다. 예를 들어, 조합된 SARS-CoV-2 조성물을 받은 총 100 명의 대상체를 고려할 때, 연구는 1.6%의 비율로 발생한 적어도 하나의 AE를 검출할 확률을 80% 갖도록 설계된다. hAdv5-SARS-CoV-2 조성물을 받은 100 명의 대상체 중에서 SAE가 관찰되지 않았다면, SAE 발생률에 대한 95% 신뢰 구간(CI)의 단측 상한에 대한 근사치는 3%일 것이다. 면역학 분석은 PP 집단으로부터 도출된 일차 결론과 함께 평가 가능한 및 프로토콜-당(PP) 집단을 사용하여 수행된다. 평가 가능한 집단에 기반한 분석은 임의의 한 그룹에서 >1명의 대상체가 PP 집단에서 제외된 경우에만 착수되고 제시된다. 하기 기재된 바와 같이 제외 반응자 분석으로, 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 데이터는 분석 전에 적절하게 변환된다. 기준선은 1 일(AdE 조성물의 경우) 및 7 일(hAdv5-SARS-CoV-2 조성물의 경우)에 조합된 SARS-CoV-2 조성물 투여 전에 수집된 샘플로 규정된다. SARS-CoV-2에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 항원 IgG 역가, T 세포 반응)의 평가를 위한 주요 관심 변수가 결정된다. GMT는 기준선 및 백신접종 후 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 결정되고, 용량 그룹별로 요약된다. 조합된 SARS-CoV-2 조성물 용량과 위약 사이의 비교는, 예를 들어, 종속 변수로서의 항-SARS-CoV-2 IgG의 기준선 후 로그-변환된 수준에 대한 공변량으로서의 기준선 로그-변환 수준 및 고정 효과로서의 치료로 공분산 분석(ANCOVA)에 의해 평가된다. 이러한 분석으로부터, 최소 제곱(LS) 평균, LS 치료 차이, 및 로그-스케일의 치료 차이에 대한 95% CI가 얻어진다. 결과는 각 연구일에 치료 기하 LS 평균, 기하 LS 평균 비율의 점 추정치, 및 이러한 비율에 대한 95% CI를 제공하기 위해 지수화에 의해 원래 척도로 다시 변환된다. "반응자"는 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 57 일, 91 일, 및 181 일(파트 A) 및 8 일, 15 일, 22 일, 29 일, 36 일, 43 일, 50 일, 91 일, 및 181 일(파트 B)에 기준선으로부터 항-SARS-CoV-2 항원 역가의 4 배 상승을 갖는 대상체로 규정된다. 반응자 상태의 결정을 위한 배수 변화는 +1 변환 없이 전가 후 값, 즉, 배수 변화 = 현재 귀속 값/기준선 귀속 값을 사용하여 산출된다. 반응자 비율은 용량 그룹당 백분율 및 백분율의 95% 클로퍼-피어슨 정확 CI에 의해 표로 작성된다. 95% CI의 차이는 각각의 조합된 SARS-CoV2 조성물 용량 그룹의 반응률을 및 위약 그룹과 비교하기 위해 제시된다. 일부 실시양태에서, 위약 그룹에 대한 각각의 조합된 SARS-CoV-2 조성물 용량 그룹의 반응자의 비교는 또한 피셔의 정확 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 29 일(파트 A) 또는 50 일(파트 B)에 조합된 SARS-CoV-2 조성물의 면역원성에 대한 투여 전 Ad5 혈청 항체 수준의 효과를 알아보기 위해, 공변량으로서 기준선 Ad5 역가로 ANCOVA를 사용하여 분석이 수행된다. 평가 가능한 및 PP 집단을 사용하여 점막 면역원성 분석이 수행된다. 결측 데이터에 대한 전가는 수행되지 않는다. 분석된 종점은 ELISA에 의해 측정된 IgA 항체 수준에 대한 GMT 및 GMR이다. 사용된 방법은 체액성 면역원성 분석과 동일하다. 연속 파라미터(안전성 실험실 시험 및 활력 징후)에 대한 요약 통계는 다음과 같이 그룹별로 제시된다: 백신접종 전, 백신접종 후, 및 백신접종 전에서 백신접종 후로의 평가 변화. 연구 백신접종 후에 백신접종 후 안전성 실험실 값 또는 활력 징후 값이 새로 비정상인 것으로 기록된(즉, 기준선 값에 비해 독성 등급이 증가하고 중증도 등급이 중간 이상인 사건) 대상체의 수 및 백분율이 표로 작성된다. 중증도 등급별로 각 대상체의 백신접종 전 및 백신접종 후 안전성 실험실 값을 교차표로 작성하는 이동 표가 만들어진다. 정상, 임상적으로 유의하지 않은 비정상, 및 임상적으로 유의한 비정상 ECG 해석을 갖는 대상체의 수 및 백분율의 요약이 제시된다. Ad5 벡터의 발산을 위해, 데이터는 중간 카피 수와 함께 시점별 양성 퍼센트 및 수로 요약된다. Ad5 발산의 중앙값 지속기간, 사분위수 범위, Ad5 발산의 최소 및 최대 지속기간은 각각의 조합된 SARS-CoV-2 조성물 그룹 및 조합된 모든 면역원성 조성물 용량 그룹에 대해 제시된다. 아데노바이러스 감염의 평가를 위한 바이러스 배양 결과가 또한 열거된다.
이러한 연구는 조합된 SARS-CoV-2 조성물이 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있고(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임) 허용되는 안전성 프로파일이라는 것을 보여줄 것이다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호성 면역 반응인 것이 바람직하다(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임). 바람직한 실시양태에서, 데이터는 조합된 SARS-CoV-2 조성물이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 11: 사이토카인 억제를 이용한 항-SARS-CoV-2 인간 임상 시험
실시예 2에 나타낸 바와 같이, 마우스에 AdE의 투여는 인플루엔자와 같은 바이러스에 의해 유발된 감염성 질환의 진행 및 증상에 관여하는 것으로 알려진 특정 사이토카인의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 감염되지 않은 마우스(인플루엔자에 의해)는 AdE 투여 25 일 후에 단핵구 화학유인 단백질(MCP-1(CCL2)), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 RANTES(CCL5)의 발현 증가를 나타낸 것으로 밝혀졌다. AdE의 투여 28 일 후에, 이러한 감염되지 않은 마우스는 MCP-1 및 IFN-γ의 발현 증가 뿐만 아니라 IL-12 발현의 감소를 나타냈다. 마우스는 AdE 투여 3 일 후에 인플루엔자로 공격되었는데, 마우스는 IL-1α, IL-6, IL-12, MCP-1, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 과립구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 및 RANTES의 발현 감소를 나타낸 것으로 밝혀졌다. AdE의 투여 육(6)일 후에, 감염된 마우스는 IL-5, IL-6, IL-12, IL-17, MCP-1 및 GM-CSF의 발현 감소, 및 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α(CCL3)) 및 RANTES(CCL5)의 발현 증가를 나타냈다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2에 의한 감염 동안 "사이토카인 폭풍"의 발달과 일치한다. 일부 실시양태에서, 이후, 예를 들어, 사이토카인 폭풍의 발달을 억제하거나 저지시킴으로써 SARS-CoV-2 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해, SARS-CoV-2 면역원성 조성물은 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)(예를 들어, 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 항-IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP-1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들))과 함께 인간에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않을 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 사용될 수 있는 예시적인 항-사이토카인 시약은, 예를 들어, 본원의 표 10에 제시된 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
이러한 항-사이토카인 시약은 SARS-CoV-2 면역원성 조성물과 동일한 시간에(즉, 동시에), 또는 본질적으로 동일한 시간에 유효량의 각각의 시약에 적절한 적합한 경로(예를 들어, SARS-CoV-2 면역원성 조성물의 비강내 투여 및 항-사이토카인 시약(들)의 경우 피하 주사)에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 SARS-CoV-2 조성물과 공동-투여되고, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 후속하여 단독 활성제로서 투여된다. 이러한 연구는 SARS-CoV-2 조성물(들)과 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)의 조합이 허용되는 안전성 프로파일, 및 일부 환자가 경험하는 사이토카인의 유해한 영향(예를 들어, 상기 언급된 사이토카인 폭풍)과 관련된 증상의 완화로 인간에서 항-SARS-CoV-2 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수 있다(예를 들어, 이는 면역원성 조성물임)는 것을 보여줄 것이다. 면역 반응은 통계적으로 유의하고, 더욱 더 바람직하게는 보호 및/또는 치유 면역 반응인(즉, 이는 SARS-CoV-2 백신임) 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 데이터는 SARS-CoV-2 조성물(들)과 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)의 조합이 SARS-CoV-2에 감염된 대상체(예를 들어, 입원 환자)를 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 12. 동물 연구 투약 전략
일부 실시양태에서, 하나 이상의 항-SARS-CoV-2 벡터 및/또는 항-SARS-CoV-2 벡터의 조합(들)(즉, "SARS-CoV-2 백신")은 이의 전임상 검증을 평가하기 위해 다양한 투여량으로 동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 동물에서 백신-유도된 보호의 기전이 확인된다. 일부 실시양태에서, (대부분의 인간의 경우와 같이) 보다 흔한 순환 코로나바이러스에 대한 기존 면역을 갖는 동물에서 백신-유도된 보호의 기전이 확인된다. 이러한 연구는 (i) SARS-CoV-2 백신-유도된 폐 염증의 평가; (ii) 28 일까지의 반응성의 폭 및 아이소타입으로 SARS-CoV-2 백신 Ab 역가; (iii) 투여 후 28 일까지 항-SARS-CoV-2 항체(Ab) 중화 역가; 및 (iv) 최적의 SARS-CoV-2 백신 용량/투여 일정의 확인을 제공한다.
일부 실시양태에서, 동물의 면역은 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 호산구, 염증성 단핵구, 상주 단핵구, 대식세포(예를 들어, 조직 특이적 대식세포, 상주/간질 대식세포, 폐포 대식세포, 미세아교세포), 비만 세포, 호염기구, 및/또는 형질세포양 DC를 포함하여 11 개의 별개의 면역 세포 유형을 정확하게 정량화하는 데 유용하고 특정 세포 유형의 상세한 표현형을 수행하는 것으로 나타난 문헌[Yu, et al. (PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0150606 March 3, 2016)]에 기재된 유세포 분석 기술을 이용하여 연구될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, SSC 대 MHC 클래스 II 발현의 비교는 성숙한 골수 세포로부터 NK 세포 및 단핵구를 분리하기 위해 사용될 수 있고/있거나; CD64 대 CD24 발현의 비교는 CD11c 대 MHC 클래스 2 발현과 같이 수지상 세포로부터 대식세포를 구별하는 데 사용될 수 있다(전자가 더 정확할 수 있기는 함). 다른 마커는 또한 당 분야에 공지된 바와 같이 연구될 수 있다(예를 들어, CD11b, CD14, CD24, CD68, CD103, CD169, CD206, CX3CR1, CCR2, F4/80, IA-IE, Ly6C, 및/또는 MerTK 중 어느 하나 이상). 일부 실시양태에서, 폐 기도 및 혈청에서 항-SARS-2-CoV-2 특이적 항체 역가가 결정되고(예를 들어, 비드 어레이를 사용하여); 폐로의 염증 세포 침윤물이 측정되고(예를 들어, 유세포 분석을 이용하여); 항-SARS-CoV-2 중화 역가가 결정되고(예를 들어, SARS-2 미세중화 검정을 이용하여); 국소 및 전신 사이토카인 수준이 평가되고; 나이브 마우스 및 관련 엔데믹 코로나바이러스에 대한 기존 면역을 갖는 마우스에서 초기(7-14 일)에서 백신접종 후 기억(1-4 개월) 시점까지 항-SARS-2 특이적 B 세포(예를 들어, 및 서브세트), T 세포(예를 들어, ICCS 또는 사이토카인 ELISPOT 이용) 및 형질 세포(예를 들어, 항체 ELISPOT 이용)의 수 및 기능적 속성이 확인된다. 다른 유형의 분석이 또한 당 분야에 공지된 바와 같이 사용될 수 있거나, 달리 적용 가능한 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 동물에서 백신-유도된 보호의 기전은 표 17에 나타낸 투약 방식에 따라 SARS-CoV-2 백신이 투여된 동물을 연구하여 확인된다.
표 17
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일부 실시양태에서, 예컨대, 가장 우수한 투약 및 투여 일정을 결정하도록 백신 후보에 대한 B 및 T 세포 반응을 평가하기 위해, 표 17에 제시된 투약 섭생이 사용된다. 일부 실시양태에서, 동물은 표 18에 제시된 방식에 의해 결정된 최적의 투약 및 투여 일정을 이용하여 SARS-CoV-2 백신(또는 표 17에 나타낸 바와 같은 2 개의 상이한 SARS-CoV-2 백신)을 받는다. 4 개의 시점에 데이터가 수집된다(예를 들어, n=7/그룹/시점/기능적 검정, 0-120 일 사이의 시점). SARS-CoV-2 백신-유도된 폐 염증 및 Ab 반응은 28 일까지 측정되고, 아이소타입 및 반응성의 폭으로 항-SARS-CoV-2 Ab 역가는 120 일까지 결정되고, 항-SARS-CoV-2 Ab 중화 역가는 120 일까지 결정되고, SARS-CoV-2 백신-유도 T 세포 반응은 28 일까지 결정되고, SARS-CoV-2 백신-유도 ASC 및 기억 B 세포 반응은 120 일까지 결정된다.
표 18
Figure pct00047
일부 실시양태에서, 엔데믹 β-코로나바이러스에 대한 기존 면역이 SARS2에 대한 백신 반응에 영향을 미치는지 여부에 관계없이 하기 프로토콜을 이용하였다. 이 실험(표 3)에서, 엔데믹 β-코로나바이러스에 대한 기존의 항-코로나바이러스 스파이크 단백질 기억 B 세포의 영향을 평가하였다. 동계교배 마우스(BALB/c 또는 B6)에 엔데믹 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 기억 B 세포 반응을 확립하기 위해 2 개의 상이한 애주번트를 사용하여(CFA 또는 알룸) 재조합 OC43 또는 HKU1 스파이크 단백질을 백신접종하였다(즉, "기억 마우스"). 면역화된 마우스 및 대조 나이브 마우스는 이후 최적의 SARS-CoV-2 백신(들)을 받았다. 폐 염증, 항-SARS-CoV-2 Ab 및 B 세포 반응, 항-SARS-CoV-2 Ab 품질을 기억 마우스에서 평가하였다. 투여 방식에 관한 추가 세부사항은 표 19에 제공된다.
표 19
Figure pct00048
Figure pct00049
실시예 13A. 전임상 시험을 위한 아데노바이러스 벡터(S1 및 RBD)의 제조
실시예 13A 내지 18에서 이용된 백신 후보를 복제-결핍 E1- 및 E3-결손 아데노바이러스 타입 5 벡터 플랫폼(Tang et al 2009)을 사용함으로써 제조하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(수탁 번호 QHD43416.1)의 S1 도메인(잔기 16 내지 685) 또는 RBD 도메인(잔기 302 내지 543)에 대해 인간 코돈-최적화된 유전자를 발현시켰다. 이러한 Ad5-벡터화된 S1 및 RBD 트랜스진은 인간 조직 플라스미노겐 활성제 리더 서열을 포함하고, 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터/인핸서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 15의 제어 하에 각각 발현되었다. 확장 가능한 형질감염 시스템(Maxcyte STX-100)을 사용하여 E1-상보성 PER.C6 세포로의 재조합 벡터 플라스미드의 대규모 형질감염으로부터 초기 시드 스톡을 수득하였다. CL1.1 가공 어셈블리 절차(Li LH, Shivakumar R, Feller S, Allen C, Weiss JM, Dzekunov S, Singh V, Holaday J, Fratantoni J, Liu LN. Highly efficient, large volume flow electroporation. Technol Cancer Res Treat. 2002 Oct;1(5):341-50)를 이용하여 정전기적 전기천공에 의해 세포 형질감염을 수행하였다. 추가 확장 후, 감염 70 시간 후에 감염된 세포를 수집하고 동결-해동 사이클에 의해 펠렛화된 세포로부터 바이러스를 방출시켰다. 생성된 세포 용해물을 원심분리에 의해 정화한 다음, 0.22 μm 컷오프를 사용하여 여과하였다. RBD 및 S1 Ad5 벡터를 CsCl 구배로 정제하고, 10 mM Tris(pH 7.4), 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM 히스티딘, 5%(wt/vol) 수크로스, 0.02% 폴리소르베이트-80(wt/vol), 0.1 mM EDTA, 및 0.5%(vol/vol) 에탄올을 함유하는 제제 완충액(A195)에 대해 투석하고, 이어서 냉동시키고, -65℃에서 저장하였다. S1 및 RBD 트랜스진이 발현되고 항원적으로 온전성임을 확인하기 위해, S1 벡터 또는 RBD 벡터로 PerC6 세포를 감염시킨 후, SARS-CoV-2 S1(SinoBiologicals Cat: 40591-MM43) 및 SARS-CoV-2 RBD(SinoBiologicals, Cat: 40592-MM57)에 대한 2 개의 상이한 중화 단클론성 항체를 사용하여 세포내 염색, 및 유세포 분석에 의해 분석을 수행하였다(도 93).
실시예 13B. C57BL/6 마우스에서 RDB 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-CoV-2의 스파이크 항원으로부터 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터를 C57BL/6 마우스에 비강내 투여하여 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 면역의 유도를 평가하였다. C57BL/6 마우스는 표 18에 나타낸 바와 같이 50 μl의 부피로 3 개의 상이한 용량의 Ad5 벡터의 1 회 또는 2 회 비강내 투여를 받았다. A195 완충액에서 고용량은 6.7E+09 ifu/ml(50 μL 중 3.35E+08 ifu)이고, 중간-용량은 1.2E+09 ifu/ml(50 μL 중 6E+07 ifu)이고, 저용량은 1.2E+08 ifu/ml(50 μL 중 6E+06 ifu)였다. 대조군은 50 μl의 A195 완충액 단독의 비강내 투여를 받았다. 백신 투여 후 7 일, 14 일, 21 일 또는 28 일에, 혈청, 기관지폐포 세척액(BAL) 및 폐, 종격동 림프절 및 비장을 포함하는 조직을 하기 표에 따라 그룹당 10 마리의 동물로부터 수집하였다. 면역학적 판독은 혈청 및 BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적-IgG 및 BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적 IgA, 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 반응 및 상이한 시점에서의 폐, 림프절, BAL 및 비장에서의 면역 세포의 수의 측정을 포함하였다. 이러한 매개변수는 표 20에 요약되어 있다.
표 20
Figure pct00050
SARS-CoV-2 스파이크 IgG 및 IgA의 정량화를 재조합 SARS-CoV-2 엑토도메인 스파이크 단백질이 접합된 세포계산 비드 어레이를 사용하여 면역화된 동물로부터 수득된 혈청 또는 BAL 샘플에서 수행하였다. 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 단백질을 생산하기 위해, 2 개의 코돈-최적화된 작제물을 다음을 코딩하는 선형 서열 순서로 생성하였다: 인간 IgG 리더 서열, SARS-CoV-2 S 엑토도메인(아미노산 14-1211), GGSG 링커, T4 피브리틴 폴돈 서열, GS 링커, 및 마지막으로 AviTag(작제물 1) 또는 6X-HisTag(작제물 2). 각각의 작제물을 융합전 입체형태로 단백질을 안정화시키기 위해 2 개의 세트의 돌연변이로 조작하였다. 이들은 S1/S2 절단 부위에서 RRAR>SGAG(문헌[Walls et al 2020]에서와 같이 잔기 682 내지 685)의 치환 및 2 개의 프롤린 잔기, 문헌[Walls et al 2020] 및 문헌[Wrapp et al 2020]에서와 같이 K983P, V984P의 도입을 포함하였다. 플라스미드 작제물 1 및 2(1:2 비)를 FreeStyle 293-F 세포에 공동-형질감염시킴으로써 Avi/His-태깅된 삼량체를 생산하였다. 세포를 3 일 동안 성장시키고, 상청액(배지)을 원심분리에 의해 회수하였다. 재조합 S 삼량체를 HisTrap HP 컬럼(GE)을 사용한 FPLC 및 250 mM의 이미다졸로의 용리에 의해 배지로부터 정제하였다. 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 또는 50 mM Bicine(pH 8.3)으로 교환한 후, 정제된 스파이크 엑토도메인 삼량체를 비오틴-단백질 리가제(Avidity, 오로라, CO)의 첨가에 의해 비오티닐화하였다. 비오티닐화된 스파이크 엑토도메인 삼량체를 PBS로 완충액 교환하고, 멸균 여과하고, 분취한 다음, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. his-태깅된 단백질의 친화성 정제 및 효소적 비오티닐화 후, 생성된 재조합 SARS-CoV-2 삼량체를 스트렙타비딘 작용성화된 형광 미세입자(Spherotech 3.6um cat# CPAK-3567-4K, 피크 4) 상에 수동적으로 흡수시켰다. 500 μg의 비오티닐화된 SARS2-CoV-2를 400 μl의 1% BSA PBS에서 2x1e7 스트렙타비딘 작용성화된 형광 미세입자와 함께 인큐베이션하였다. 커플링 후, SARS-CoV-2 스파이크 접합된 비드를 1×108 개 비드/mL의 농도로 최종 재현탁 전에 1 ml의 1% BSA, PBS, 0.05% NaN3에서 2 회 세척하였다. SARS-CoV-2 커플링된 비드를 4℃에서 저장하였다. 비드 상으로의 재조합 SARS2-CoV-2 스파이크의 로딩을 1 ug 내지 2 ng/ml 범위의 재조합 항-SARS 스파이크 항체 CR3022의 희석액으로 1×105 개 비드를 염색함으로써 평가하고, 항-인간 IgG 이차로 가시화하였다. 아이소타입 특이적 다클론성 항체를 형광 입자에 공유 커플링시켜 IgG 및 IgA 표준을 수득하였다. 간략히, PBS 중 0.2 mg의 염소 다클론 항-마우스 IgG(southern Biotech cat# 1013-01), 항-IgM(cat# 1 022-01), 및 항-IgA(cat# 1040-01) 항체를 0.1 M MES 완충액(pH 5.0)에 재현탁된 원적색 채널(Spherotech 3.6um cat# CPAK-3567-4K, 피크 1-3)에서 각각 고유의 형광 강도를 갖는 5x1e7 형광 미세입자와 혼합하였다. 0.1 M MES(2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산) 완충액(pH 5.0) 중 등가 부피의 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드)(10 mg/mL), 및 혼합물을 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 비드를 원심분리 및 PBS에서의 재현탁에 의해 펠렛화함으로써 2 회 세척하였다. 세척 후, 비드를 보존제로서 0.005% NaN3를 갖는 1% BSA, PBS에 재현탁시켰다. 1/4-8 희석된 BAL 샘플, 또는 혈청 샘플을 50 μl의 PBS에서 1/1000-5000까지 희석하고, 0.75x 희석에서 1 μg/ml 내지 2 ng/ml의 범위의 마우스 IgG, IgM, 또는 IgA(southern biotech IgM: cat# 0106-01, IgG: cat# 0107-01, IgA cat# 0106-01)로 이루어진 50 μl의 표준물과 함께 96 웰 u-바닥 폴리스티렌 플레이트에 배열하였다. 5x1e5의 각각의 SARS-CoV-2 스파이크, 항-IgM, 항-IgA, 및 항-IgG 비드를 함유하는 5 μl의 현탁액을 희석된 샘플에 첨가하였다. 현탁액을 피펫팅에 의해 혼합하고 실온에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. 200 μl의 PBS를 첨가하고 실온에서 5 min 동안 3000 g에서 원심분리함으로써 비드를 세척하였다. CBA 입자를 PBS 중 1% BSA에서 1/400 희석된 PE에 접합된 염소 다클론성 항-IgM(southern Biotech cat# 1020-09) 또는 항-IgA(southern Biotech cat# 1040-09) 또는 다클론성 항-IgG 488(southern Biotech cat#1010-30)로 이루어진 이차 염색 용액에 재현탁시켰다. 현탁액을 실온에서 암실 하에 15 min 동안 인큐베이션하였다. 200 μl의 PBS를 첨가함으로써 비드를 세척하고, 실온에서 5 min 동안 3000 g에서 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 입자를 75 μl의 PBS에 재현탁시키고, 분당 100 ul의 샘플 속도로 플레이트 모드의 BD Cytoflex 유세포 분석기에서 직접 분석하였다. 75 μL의 획득 후에 샘플 수집을 중단하였다. 획득 후, 생성된 FCS 파일을 flowJo(treestar)에서 분석하였다. 간략히, 정방향 산란 및 측면 산란 파라미터에서 로그 규모의 일중항 3.6 um 입자에 대한 게이팅에 의해 비드를 확인하였다. APC-Cy7 채널 형광 게이트를 사용하여 비드 동일성에 의해 입자를 분리하였다. PE 및 488 채널에서 기하 평균 형광 강도를 계산하였다. 플레이트별 기준으로 공지된 농도의 표준물을 이용하여 Ig 포획 비드로부터 가장 우수한 피트 파워 곡선을 생성하였다. MFI를 ng/ml 또는 μg/ml로 변환시키는 상응하는 검정의 모든 샘플에 대해 SARS-COV-2 스파이크 입자의 MFI에 상기 식을 적용하였다. 이러한 계산된 값을 희석 인자에 대해 보정하였다.
병소 감소 중화 시험(FNRT)을 이용하여 SARS-CoV-2 단리물 USA-WA1/2020에 대한 중화 항체의 역가를 정량화하였다. Vero E6 세포를 96-웰 플레이트에서 전면생장까지 성장시켰다. 검정의 감염 시기 당일에, 항혈청의 연속 희석액(1:20-1:2560)을 제조하고, 조합하고, 항혈청의 최종 희석이 (1:40 - 1:5120)의 범위가 되도록 특정 희석으로 등가 부피의 바이러스 스톡과 RT에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 스톡을 농축된 작업 스톡으로부터 희석하여 웰 당 추정된 30 개의 바이러스 병소 단위를 생성하였다. 인큐베이션 후, 혈청:바이러스 혼합물을 웰(100 μL)에 첨가하고, Vero 세포에 대해 35℃에서 1 시간 동안 감염을 진행시켰다. 1 시간 인큐베이션 완료 시, 4% FBS 및 항생제 및 1.2% Avicell을 갖는 이글(Eagle)의 MEM의 점성 오버레이를 최종 부피가 웰 당 200 μL이 되도록 세포 단층 상의 혈청:바이러스 혼합물에 첨가하였다. 감염을 24 hr 동안 진행시켰다. 다음날, 전체 플레이트 및 내용물을 10% 포르말린/PBS에 24 h 동안 침지시켜 각 플레이트를 고정시켰다. 바이러스 병소 감소의 검출을 고정된 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 간략히, 플레이트를 H2O에서 헹구고, 메탄올:과산화수소를 30 min 동안 웰에 로킹과 함께 첨가하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭시켰다. 켄칭 후, 플레이트를 H2O에서 헹구어 메탄올을 제거하고, 5% Blotto를 차단 용액으로서 웰에 1 시간 동안 첨가하였다. 일차 항체 검출을 위해, SARS-CoV-2 스파이크/RBD 항체(토끼, 다클론성, SinoBiologicals Ct No. 40592-T62)를 5% Blotto에 첨가하고, 단층 상에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 5 회 세척하여 헹구고, 5% Blotto에서 양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-토끼 IgG의 이차 항체(Boster Biological Technology Co., #BA1054-0.5)와 함께 1 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 플레이트를 1X PBS에서 0.05% 트윈으로 1 회 세척한 후 1X PBS에서 5회 세척하였다. 퍼옥시다제 활성의 검출은 제조업체의 지침에 따라 Impact DAB 검출 키트(Vector Labs #SK-4105)를 사용하여 이루어졌다. 갈색 병소를 각 웰의 스캔된 이미지로부터 수동으로 계수하고, 기록하고, 동등한 나이브 마우스 혈청 대조와 비교하여 병소의 감소를 결정하였다. FRNT50 역가를 또한 4PL 곡선 피트를 사용하여 계산하였다.
유세포 분석에 의한 기관지폐포 세척액(BAL) 세포의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 존재하는 BAL 세포를 BAL 유체의 4℃에서 5 분 동안 700 xg에서의 원심분리에 의해 수득하였다. 세포를 500 μl의 적혈구 세포 용해 완충액[ACK 완충액(10 mM KHCO3(pH 7.2-7.4), 150 mM NH4Cl 및 0.1 mM EDTA)]에 재현탁시켰다. 1 min 후, 2 mM EDTA를 갖는 2 ml의 염색 배지(PBS + 2% 소 태아 혈청). 이러한 배지는 SME로 지칭된다. 이어서, 샘플을 70 um Nitex® 나일론 필터 막을 통해 깨끗한 15-ml 코니칼 튜브에 통과시킴으로써 여과하였다. 4℃에서 5 min 동안 700 xg에서 원심분리한 후, 세포를 225 μl의 SME에 재현탁시켰다. 이후, 25 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트로 옮겼다. 나머지 세포를 유세포 분석을 위한 항체 염색을 위해 별개의 V-바닥 96-웰 플레이트로 옮겼다. BAL 세포 샘플을 Fc-블록(1:1000 희석)과 함께 암실 하에 4℃에서 10 min 동안 인큐베이션한 후, 다음 BAL 염색 패널로 염색하였다: 자가형광(빈 FITC 채널), Ly6G-PE(클론 1A8; 1:200 희석), CD64-PerCP-Cy5.5(클론 X54-5/7.1; 1:150 희석), CD8a-APC(클론 53-6.7; 1:200 희석), CD11c-PE-Cy7(클론 N418; 1:200 희석), CD19-APC-Fire750(클론 6D5; 1:200 희석), CD4-eFluor450(클론 GK1.5; 1:200 희석) 및 Aqua LIVE/DEAD(1:1000 희석). 암실 하에 4℃에서 20 min 동안 항체 혼합물(50 μl 총 부피)과 함께 인큐베이션한 후, 세포를 200 ul의 SME로 세척하였다. 이어서, 2 일 이내에 FACSCanto II에 대한 분석 전에 세포를 200 μl의 10% 포르말린에 재현탁시켰다.
유세포 분석에 의한 종격동 림프절의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 종격동 림프절(mLN)을 수집하고, 2 mM EDTA가 첨가된 1 ml의 염색 배지(PBS + 2% 소 태아 혈청)를 함유하는 24-웰 플레이트의 별개의 웰에 넣었다. 이러한 배지는 SME로 지칭된다. mLN을 조심스럽게 그라인딩하고, 2 개의 현미경 슬라이드 사이에서 문지름으로써 분쇄한 다음, 1 ml의 SME로 헹구어 15-ml 코니칼 튜브로 옮겼다. SME를 사용하여 부피를 10 ml로 만들었다. 이후, 세포 현탁액을 70 um Nitex® 나일론 필터 막을 통해 깨끗한 15-ml 코니칼 튜브에 통과시켜 여과한 후 필터 막을 추가의 2 ml의 SME로 헹구었다. 5 min 동안 4℃에서 1800 rpm으로 원심분리한 후, 세포를 1 ml의 SME로 재현탁시켰다. 50 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트로 옮겼다. 200-250 μl의 각 샘플을 유세포 분석을 위한 항체 염색을 위해 3 개의 개별 V-바닥 96-웰 플레이트로 옮겼다. mLN 조직을 3 개의 상이한 유동 패널로 염색하였다. mLN 샘플을 암실 하에 4℃에서 10 min 동안 Fc-블록(1:1000 희석)과 함께 인큐베이션하고, 200 ul의 SME로 세척한 후, 다음 3 개의 패널로 염색하였다. 골수 패널은 B220/CD45R-FITC (클론 RA3-6B2; 1:200 희석), Ly6G-PE (클론 1A8; 1:200 희석), CD64-PerCP-Cy5.5 (클론 X54-5/7.1; 1:150 희석), CD11b-APC (클론 M1/70; 1:200 희석), CD11c-PE-Cy7 (클론 N418; 1:300 희석), Ly6C-APC-Cy7 (클론 AL-21; 1:200 희석), MHCII-PB (클론 M5/114.15.4; 1:600 희석), CD3-BV510 (클론 17A2; 1:200 희석), CD19-BV510 (클론 HIB19; 1:200 희석) 및 Aqua LIVE/DEAD (1:1000 희석)로 이루어졌다. 이러한 골수 패널 염색을 위해, 세포를 암실 하에 4℃에서 20 분 동안 항체 혼합물(50 ul 총 부피)과 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 200 μl의 SME로 세척하고, 200 μl의 10% 포르말린(고정제)에 재현탁시킨 후, 2 일 이내에 FACSCanto II에 대한 분석을 수행하였다. T 세포 패널은 CXCR5/CD185-FITC (클론 J252D4; 1:50 희석), PD1/CD279-PE (클론 J43; 1:200 희석), CD8a-PerCP-Cy5.5 (클론 53-6.7; 1:200 희석), CD25-PE-Cy7 (클론 PC61; 1:300 희석), CD4-AF647 (클론 GK1.5; 1:200 희석), CD3-APC-eFluor780 (클론 17A2; 1:200 희석), NK1.1-eFlour450 (클론 PK136; 1:200 희석) 및 Aqua LIVE/DEAD (1:1000 희석)로 이루어졌다. T 세포 패널 염색을 위해, 세포를 항-CXCR5-FITC 단독(30 ul 총 부피; 1:50 희석)과 함께 암실 하에 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션한 다음, 200 μl의 SME로 세척하였다. 이어서, 세포를 암실 하에 4℃에서 15 min 동안 나머지 항체 혼합물(50 μl 총 부피)과 함께 인큐베이션한 다음, 200 ul의 SME로 세척하였다. 이후, 세포를 200 μl의 10% 포르말린(고정제)에 재현탁시킨 후, 2 일 이내에 FACSCanto II에 대한 분석을 수행하였다. B 세포 패널은 CD95/FAS-FITC (클론 Jo2; 1:200 희석), 스파이크(Covid-19)-PE (1:50 희석) 7-AAD (1:1000 희석), F4/80-PerCP-Cy5.5 (클론 BM8; 1:200 희석), CD3-PerCP-Cy5.5 (클론 17A2; 1:200 희석), 스파이크(Covid-19)-APC (1:50 희석) CD38-PE-Cy7 (클론 90; 1:400 희석), CD19-APC-Fire750 (클론 6D5; 1:200 희석), CD138-BV421 (클론 281-2; 1:200 희석) 및 IgD-BV510 (클론 11-26c.2a; 1:500 희석)로 이루어졌다. B 세포 패널 염색을 위해, 세포를 암실 하에 4℃에서 20 min 동안 항체 혼합물(50 ul 총 부피)과 함께 인큐베이션한 다음, 200 ul의 SME로 세척하였다. 세포를 200 ul의 SME(고정제 없음)에 재현탁시키고, 즉시 FACSCanto II에서 분석하였다.
유세포 분석에 의한 폐 조직의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 절개된 폐를 가위를 사용하여 매우 작은 조각으로 절단한 후 콜라게나제/DNase를 첨가하였다. 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션 후, 폐 균질액을 1 ml의 SME로 희석하였다. 소화된 조직을 스트레이너에 주사기 플런저의 평평한 단부를 사용하여 부드럽게 그라인딩하고 분쇄한 후 10-15 ml의 SME로 헹궜다. 1800 rpm 및 4℃에서 5 min 동안 원심분리한 후, 펠렛을 3 ml의 적혈구 용해 완충액[ACK 완충액(10 mM KHCO3(pH 7.2-7.4), 150 mM NH4Cl 및 0.1 mM EDTA)]에 재현탁시켰다. 실온에서 5 min 동안 인큐베이션한 후, 용해 완충액을 불활성화시키기 위해 3 ml의 SME를 첨가함으로써 샘플을 1:2로 희석하였다. 세포를 Nitex® 나일론 필터 막을 통해 깨끗한 50-ml 코니칼 튜브에 통과시킴으로써 각각의 용해물을 여과하였다. 추가 5-10 ml의 SME로 헹군 후, 세포를 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 1 ml의 SME에 재현탁시켰다. 50 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트에 넣었다. 200 μl의 각 샘플을 유세포 분석을 위한 항체 염색을 위해 3 개의 개별 V-바닥 96-웰 플레이트에 넣었다. 샘플을 암실 하에 4℃에서 10 min 동안 Fc-블록(1:1000 희석)과 함께 인큐베이션한 다음, 200 μl의 SME로 세척한 후 림프절에 사용된 동일한 3 개의 패널로 염색하였다.
유세포 분석에 의한 비장세포의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 비장을 50-ml 코니칼 튜브에 장착된 70-um 세포 스트레이너로 옮기고, 주사기 플런저의 평평한 단부를 사용하여 부드럽게 분쇄하고 파쇄한 후, 스트레이너를 10-15 ml의 SME로 헹구었다. 1800 rpm 및 4℃에서 5 min 동안 원심분리한 후, 펠렛을 5 ml의 적혈구 용해 완충액[ACK 완충액(10 mM KHCO3(pH 7.2-7.4), 150 mM NH4Cl 및 0.1 mM EDTA)]에 재현탁시켰다. 실온에서 5 min 동안 인큐베이션한 후, 20 ml의 SME를 각 용해물에 첨가하여 ACK 완충액을 희석하였다. 이후, 세포를 70 um Nitex® 나일론 필터 막에 통과시켜 여과하였다. 여과된 것을 추가 5 ml의 SME로 헹구었다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 20 ml의 SME에 재현탁시켰다. 50 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트에 넣었다. 200 μl의 각 샘플을 유세포 분석을 위한 항체 염색을 위해 3 개의 개별 V-바닥 96-웰 플레이트에 넣었다. 샘플을 암실 하에 4℃에서 10 min 동안 Fc-블록(1:1000 희석)과 함께 인큐베이션한 다음, 200 μl의 SME로 세척한 후 림프절에 사용된 동일한 3 개의 패널로 염색하였다.
단일 비강내 투여 후, 스파이크의 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터는 도 71의 A 내지 도 71의 C에 나타낸 바와 같이 혈청에서 IgG 항체의 생산을 자극하여 전신 반응의 유도를 지시할 뿐만 아니라, 기관지폐포 세척액에서 IgG 및 IgA 항체의 생산으로 점막 반응의 유도를 지시하는 것으로 입증되었다. 고용량 백신이 최고 반응을 초래하고 저용량 백신이 한계 반응을 초래하면서 중간-용량이 중간 반응을 발생시켜, 상이한 항체 마커에 걸쳐 용량 반응이 관찰되었다. 단일 고용량 백신으로 14 일 및 28 일에, 혈청에서 스파이크-특이적 IgG 반응은 총 혈청 IgG의 대략 5%를 차지하는 ml 당 1 밀리그램을 초과하는 매우 높은 수준에 도달하였다는 점에 주목할 가치가 있다. 14 일에 동일한 벡터로 비강내 부스트 후, BAL에서 IgA 생산은 21 일 및 28 일에 단일 용량의 백신 IgG 반응에 의해 유도된 반응보다 높게 유의하게 증가했지만, IgG 반응에 대한 영향은 제한적이었다.
고용량 백신의 단일 투여를 받은 그룹으로부터 시험된 10 마리의 동물(100%) 모두는 병소 감소 중화 시험(FRNT)에 의해 측정하는 경우 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체의 존재를 나타냈지만(도 72A 내지 도 72J), 동물 5 마리 중 3 마리(60%)만이 중간-용량 백신의 단일 투여를 받은 그룹에서 유의한 중화 반응을 나타냈다(도 73A 내지 도 73E).
백신의 비강내 투여는 상이한 면역 구획에서 선천성 및 적응성 면역 세포의 동원 및/또는 증식을 유도하였다. 도 74A 내지 도 74L, 도 75A 내지 75E, 도 76A 내지 도 76J, 및 도 77A 내지 77L은 고용량 백신의 단일 비강내 투여 후 폐, BAL, 종격동 림프절 및 비장에서 각각 면역 세포 수의 변화를 나타낸다. 중요하게는, 폐, BAL 및 림프절에서 그리고 더 적은 범위로 비장에서 관찰된 CD19 세포, 기억 B 세포, 생식 중심(GC) B 세포 및/또는 T 소포 헬퍼(hf) 세포의 수에서의 상승은 장기 지속형 체액 및 점막 항체 반응을 자극하는 백신의 능력을 지시한다. 또한, 폐, BAL 및 림프절에서 그리고 더 적은 범위로 비장에서 관찰된 대식세포, 수지상 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 상승은 SARS-CoV-2 감염과 관련하여 유익할 것으로 예상되는 점막 및 전신, 선천성 및 세포-매개 면역 반응을 자극하는 백신의 능력을 지시한다. 더 낮은 백신 용량으로 얻어진 결과는 더 낮은 수준이지만 유사한 경향을 나타내어 제시되어 있지 않다.
실시예 14. C57BL/6 마우스에서 S1 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-CoV-2의 스파이크 항원으로부터 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터를 C57BL/6 마우스에 비강내 투여하여 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 면역의 유도를 평가하였다. C57BL/6 마우스는 표 19에 나타낸 바와 같이 50 μl의 부피로 3 개의 상이한 용량의 Ad5 벡터의 1 회 또는 2 회 비강내 투여를 받았다. A195 완충액에서 고용량은 1.2E+09 ifu/ml(50 μL 중 6E+08 ifu)이고, 중간-용량은 1.2E+09 ifu/ml(50 μL 중 6E+07 ifu)이고, 저용량은 1.2E+08 ifu/ml(50 μL 중 6E+06 ifu)였다. 대조군은 50 μl의 A195 완충액 단독의 비강내 투여를 받았다. 백신 투여 후 7 일, 14 일, 21 일 또는 28 일에, 혈청, 기관지폐포 세척액(BAL) 및 폐, 종격동 림프절 및 비장을 포함하는 조직을 하기 표에 따라 그룹당 10 마리의 동물로부터 수집하였다. 면역학적 판독은 혈청 및 BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적-IgG, BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적 IgA, 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 항체 반응 중화 및 상이한 시점에서의 폐, 림프절, BAL 및 비장에서의 면역 세포의 수의 측정을 포함하였다. 이러한 매개변수는 표 21에 요약되어 있다.
표 21
Figure pct00051
혈청 또는 BAL 샘플에서 SARS-CoV-2 스파이크 IgG 및 IgA의 정량화, 병소 감소 중화 시험 뿐만 아니라 기관지폐포 세척액(BAL) 세포, 종격동 림프절, 폐 조직 및 비장세포의 유세포 분석을 위한 방법은 실시예 13B에서 기술된다.
단일 비강내 투여 후, 스파이크의 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터는 도 78의 A 내지 도 78의 C에 나타낸 바와 같이 혈청에서 IgG 항체의 생산을 자극하여 전신 반응의 유도를 지시할 뿐만 아니라, 기관지폐포 세척액에서 IgG 및 IgA 항체의 생산을 자극하여 점막 반응의 유도를 지시하는 것으로 입증되었다. 고용량 백신이 최고 반응을 초래하고 저용량 백신이 한계 반응을 초래하면서 중간-용량이 중간 반응을 발생시켜, 상이한 항체 마커에 걸쳐 용량 반응이 관찰되었다. 전반적으로, 혈청 및 BAL에서의 IgG 반응은 실시예 13B에 제시된 바와 같이 RBD 벡터로 얻어진 결과와 비교하여 S1 벡터로 더 낮았다. 14 일에 동일한 벡터로 비강내 부스트 후, BAL에서의 IgA 생산은 21 일 및 28 일에 단일 용량의 백신 IgG 반응에 의해 유도된 반응보다 높게 유의하게 증가했지만, IgG 반응에 대한 영향은 제한적이었다.
고용량 백신의 단일 투여를 받은 그룹으로부터 시험된 동물 5 마리 중 3 마리는 병소 감소 중화 시험(FRNT)에 의해 측정하는 경우 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체의 유의한 유도를 나타냈다(도 79A 내지 79E). 단일 중간-용량 그룹에서, 5 마리의 동물 중 2 마리(도 80B 및 도80D)는 낮은 중화 반응을 나타냈다(도 80A 내지 도 80E).
백신의 비강내 투여는 상이한 면역 구획에서 선천성 및 적응성 면역 세포의 동원 및/또는 증식을 유도하였다. 도 81A 내지 도 81L, 도 82A 내지 82E, 도 83A 내지 도 83J, 및 도 84A 내지 도 84L은 고용량 백신의 단일 비강내 투여 후 폐, BAL, 종격동 림프절 및 비장에서 각각 면역 세포 수의 변화를 나타낸다. 중요하게는, 폐, BAL 및 림프절에서 그리고 더 적은 범위로 비장에서 관찰된 CD19 세포, 기억 B 세포, 생식 중심(GC) B 세포 및/또는 T 소포 헬퍼(hf) 세포의 수에서의 상승은 장기 지속형 체액 및 점막 항체 반응을 자극하는 백신의 능력을 지시한다. 또한, 폐, BAL 및 림프절에서 그리고 더 적은 범위로 비장에서 관찰된 대식세포, 수지상 세포, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 상승은 SARS-CoV-2 감염과 관련하여 유익할 것으로 예상되는 점막 및 전신, 선천성 및 세포-매개 면역 반응을 자극하는 백신의 능력을 지시한다. 더 낮은 백신 용량으로 얻어진 결과는 더 낮은 수준이지만 유사한 경향을 나타내어 제시되어 있지 않다.
실시예 15. CD-1 마우스에서 RBD 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-CoV-2의 스파이크 항원으로부터 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터를 CD-1 마우스에 비강내 투여하여 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 면역의 유도를 평가하였다. CD-1 마우스는 50 μl의 부피로 3 개의 상이한 용량의 Ad5 벡터의 1 회 또는 2 회 비강내 투여를 받았다. A195 완충액에서 고용량은 6.7E+09 ifu/ml(50 μL 중 3.35E+08 ifu)이고, 중간-용량은 1.2E+09 ifu/ml(50 μL 중 6E+07 ifu)이고, 저용량은 1.2E+08 ifu/ml(50 μL 중 6E+06 ifu)였다. 대조군은 50 μl의 A195 완충액 단독의 비강내 투여를 받았다. 백신 투여 후 7 일, 14 일 및/또는 21 일에, 혈청, 및 기관지폐포 세척액(BAL)을 표 22에 따라 그룹당 10 마리의 동물로부터 수집하였다. 면역학적 판독은 혈청 및 BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적-IgG, BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적 IgA, 및 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 반응의 측정을 포함하였다. 이러한 매개변수는 표 22에 요약되어 있다.
표 22
Figure pct00052
혈청 또는 BAL 샘플에서 SARS-CoV-2 스파이크 IgG 및 IgA의 정량화, 및 병소 감소 중화 시험을 위한 방법은 실시예 13B에서 기술된다.
단일 비강내 투여 후, 스파이크의 S1 도메인의 RBD(SEQ ID NO: 15)를 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터는 도 85의 A 내지 도 85의 C에 나타낸 바와 같이 혈청에서 IgG 항체의 생산을 자극하여 전신 반응의 유도를 지시할 뿐만 아니라 기관지폐포 세척액에서 IgG 및 IgA 항체의 생산을 자극하여 점막 반응의 유도를 지시하는 것으로 입증되었다. 고용량 백신이 최고 반응을 초래하고 저용량 백신이 한계 반응을 초래하면서 중간-용량이 중간 반응을 발생시켜, 상이한 항체 마커에 걸쳐 용량 반응이 관찰되었다. 14 일에 동일한 벡터로 비강내 부스트 후, IgG 및 IgA 반응에 대한 영향은 동일한 용량의 단일 투여와 비교하여 제한되었다.
고용량 백신의 단일 투여를 받은 그룹으로부터 시험된 동물 10 마리 중 8마리(도 92A, 도 92C 내지 도 92E 및 도 92G 내지 도 92J)는 병소 감소 중화 시험(FRNT)에 의해 측정하는 경우 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체의 유의한 유도를 나타냈다(도 92A 내지 92J).
실시예 16. CD-1 마우스에서 S1 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-CoV-2의 스파이크 항원으로부터 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터를 CD-1 마우스에 비강내 투여하여 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 면역의 유도를 평가하였다. CD-1 마우스는 50 μl의 부피로 3 개의 상이한 용량의 Ad5 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. A195 완충액에서 고용량은 6.7E+09 ifu/ml(50 μL 중 3.35E+08 ifu)이고, 중간-용량은 1.2E+09 ifu/ml(50 μL 중 6E+07 ifu)이고, 저용량은 1.2E+08 ifu/ml(50 μL 중 6E+06 ifu)였다. 대조군은 50 μl의 A195 완충액 단독의 비강내 투여를 받았다. 백신 투여 후 7 일, 14 일 및 21 일에, 혈청, 및 기관지폐포 세척액(BAL)을 표 23에 따라 그룹당 10 마리의 동물로부터 수집하였다. 면역학적 판독은 혈청 및 BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적-IgG, BAL에서 SARS-CoV-2 스파이크 항원-특이적 IgA, 및 혈청에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 반응의 측정을 포함하였다. 이러한 매개변수는 표 23에 요약되어 있다.
표 23
Figure pct00053
혈청 또는 BAL 샘플에서 SARS-CoV-2 스파이크 IgG 및 IgA의 정량화, 및 병소 감소 중화 시험을 위한 방법은 실시예 13B에서 기술된다.
단일 비강내 투여 후, 스파이크의 S1 도메인(SEQ ID NO: 13)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터는 도 86의 A 내지 도 86의 C에 나타낸 바와 같이 혈청에서 IgG 항체의 생산을 자극하여 전신 반응의 유도를 지시할 뿐만 아니라 기관지폐포 세척액에서 IgG 및 IgA 항체의 생산을 자극하여 점막 반응의 유도를 지시하는 것으로 입증되었다. 고용량 백신이 최고 반응을 초래하고 저용량 및 중간 용량 백신이 한계 면역 반응을 초래하면서 상이한 항체 마커에 걸쳐 용량 반응이 관찰되었다.
실시예 17. CD-1 마우스에서 RBD 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-CoV-2의 스파이크 항원으로부터 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터를 CD-1 마우스에 비강내 투여하여 SARS-CoV-2에 대한 전신 및 점막 T 세포 면역의 유도를 평가하였다. CD-1 마우스는 A195 완충액에서 6.7E+09 ifu/ml(50 μL 중 3.35E+08 ifu)의 Ad5 벡터의 단일 비강내 투여를 받았다. 대조군은 50 μl의 A195 완충액 단독의 비강내 투여를 받았다. 백신 투여 후 10 일, 14 일 및 28 일에, 백신 그룹의 10 마리의 마우스 및 대조군의 3 마리의 마우스로부터의 폐 및 비장을 표 24에 따라 수집하였다. 면역학적 판독은 유세포 분석에 의한 폐 및 비장에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 측정, IFN-감마 ELISpot 검정에 의한 폐 및 비장에서의 T 세포 반응의 측정 뿐만 아니라 RBD-유래 펩타이드에 의한 시험관내 회수 후 T 세포 사이토카인의 측정을 포함하였다.
표 24
Figure pct00054
비장 및 폐에서 IFN-감마 ELISpot에 의한 RBD-특이적 T 세포 반응의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 비장을 50-ml 코니칼 튜브에 장착된 70-um 세포 스트레이너로 옮기고, 주사기 플런저의 평평한 단부를 사용하여 부드럽게 분쇄하고 파쇄한 후, 스트레이너를 10-15 ml의 SME로 헹구었다. 1800 rpm 및 4℃에서 5 min 동안 원심분리한 후, 펠렛을 5 ml의 적혈구 용해 완충액[ACK 완충액(10 mM KHCO3(pH 7.2-7.4), 150 mM NH4Cl 및 0.1 mM EDTA)]에 재현탁시켰다. 실온에서 5 min 동안 인큐베이션한 후, 20 ml의 SME를 각 용해물에 첨가하여 ACK 완충액을 희석하였다. 이후, 세포를 70 um Nitex® 나일론 필터 막에 통과시켜 여과하였다. 여과된 세포를 추가 5 ml의 SME로 헹구었다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 20 ml의 SME에 재현탁시켰다. 50 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트에 넣었다.
절개된 폐를 가위를 사용하여 매우 작은 조각으로 절단한 후 콜라게나제/DNase를 첨가하였다. 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션 후, 폐 균질액을 1 ml의 SME로 희석하였다. 소화된 조직을 스트레이너에 주사기 플런저의 평평한 단부를 사용하여 부드럽게 분쇄하고 파쇄한 후 10-15 ml의 SME로 헹구었다. 1800 rpm 및 4℃에서 5 min 동안 원심분리한 후, 펠렛을 3 ml의 적혈구 용해 완충액[ACK 완충액(10 mM KHCO3(pH 7.2-7.4), 150 mM NH4Cl 및 0.1 mM EDTA)]에 재현탁시켰다. 실온에서 5 min 동안 인큐베이션한 후, 용해 완충액을 불활성화시키기 위해 3 ml의 SME를 첨가함으로써 샘플을 1:2로 희석하였다. 세포를 Nitex® 나일론 필터 막을 통해 깨끗한 50-ml 코니칼 튜브에 통과시킴으로써 여과하였다. 추가 5-10 ml의 SME로 헹군 후, 세포를 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 1 ml의 SME에 재현탁시켰다. 50 ul의 각 샘플을 Fluoresbrite Carboxylate YG 10 μm 미소구체를 사용하여 유세포 분석에 의한 세포 계수를 위해 96-웰 플레이트에 넣었다.
T 세포 반응의 분석을 위해, SARS-CoV-2(319-541)의 스파이크 당단백질의 RBD를 통한 펩타이드 스캔으로부터 유래된 53 개 펩타이드의 풀을 JPT(JPT Peptide Technologies, 베를린, 독일)에 의해 설계하고 합성하였다. 펩타이드는 15 a.a.의 길이 및 11 a.a의 중첩으로 설계되었다. 사용 전에, 바이알 당 15 nmol(약 25 μg)의 각 펩타이드를 함유하는 각 바이알을 완전 배양 배지로 희석하기 전에 50 μl의 DMSO에서 재구성하였다.
비장 및 폐 세포 현탁액(150,000 개 세포/웰)을 항-IFN-γ(AN18, (5 μg/ml))로 사전 코팅된 ELIspot 플레이트(Millipore-Sigma)의 개별 웰에 넣었다. 세포를 0.5 내지 2.0 μg/펩타이드/ml의 상기 기재된 RBD 펩타이드 풀로 자극하였다. 24 hr 자극 후, 플레이트를 비오티닐화된 항-IFN-γ(R4-6A2)로 염색한 다음, 세척 단계를 수행하고, 스트렙타비딘-ALP와 함께 인큐베이션하였다. 분비된 IFN-γ를 7-10 min 동안 NBT/NCPI 기질과 함께 인큐베이션 후 검출하였다. IFN-γ 스폿-형성 세포의 수를 각 웰의 디지털 이미지로부터 수동으로 계수하였다. 통계 분석을 맨-휘트니 검정을 사용하여 GraphPad Prism에서 수행하였다.
유세포 분석에 의한 폐 조직 및 비장에서의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 분석을 다음과 같이 수행하였다. 비장 및 폐 단일 세포 현탁액을 브레펠딘 A(5 시간, 12.5 ug/mL 농도)의 존재 하에 5 시간 동안 RBD 펩타이드 풀로 자극하였다. 이어서, 세포를 항-CD4-V500 (클론 GK1.5; 1:200 희석), 항-CD8α-APC-Fire750 (클론 53-6.7; 1:200 희석), 항-CD11a/CD18-Pacific Blue (H155-78; 1:200 희석), 항-CD103-PE (M290; 1:200 희석), 항-CD69-FITC (H1-2F3; 1:200 희석), 항-Ly6G-PerCP-Cy5.5 (클론 1A8; 1:200 희석), 항-CD64-PerCP-Cy5.5 (클론 X54-5/7.1; 1:200 희석), 항-B220/CD45R-PerCP (클론 RA3-6B2; 1:200 희석), 및 Red LIVE/DEAD (1:1000 희석)를 포함하는 형광 염료-표지 항체의 조합으로 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 표면 염색 후, 세포를 BD Biosciences Cytofix/Cytoperm 키트를 사용하여 투과시키고, 항-IFN-γ-PE-Cy7(XMG1.2; 1:200 희석) 및 항-TNF-α-APC(MP6-XT22; 1:200 희석)로 염색하였다. 항체와 함께 인큐베이션 후, 세포를 세척하고 12 시간 이내에 FACSCanto II에 대한 분석 전에 재현탁시켰다. 통계 분석을 맨-휘트니 검정을 사용하여 GraphPad Prism에서 수행하였다.
마우스-특이적 Milliplex® 다중-분석물 패널 키트 MT17MAG-47K(Millipore; Sigma) 및 관련 xPONENT® 소프트웨어(Luminex Corporation)를 갖는 MagPix® 기기 플랫폼을 사용하여 배양 상청액에서 IFNγ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A 및 TNFα의 단백질 수준을 정량화하였다. 판독값을 EMD Millipore의 Milliplex® Analyst 소프트웨어의 표준 버전으로 분석하였다. 통계 분석을 맨-휘트니 검정을 사용하여 GraphPad Prism에서 수행하였다.
단일 비강내 투여 후, 스파이크의 RBD 도메인(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제-결핍 Ad5 벡터는 도 88의 A 내지 도 88의 D에 도시된 바와 같이 폐 및 비장에서 IFN-감마 생산 T 세포의 유의한 생산을 유도하는 것으로 입증되었다. 높은 빈도의 IFN-γ-생산 RBD-특이적 T 세포가 백신접종 후 10 일 및 14 일에 폐에서 검출되었고, 각각 100만 개 투입 세포 당 915 및 706 개 스폿의 평균 반응에 도달하였다. 도 88을 참조한다. IFN-γ 생산 RBD-특이적 T 세포는 또한 ELISpot에 의해 폐에 비해 낮은 빈도이긴 하지만 비장에서 검출되었다. 이는 점막-전달된 항원에 반응하여 프라이밍된 기능성 이펙터 T 세포가 말초 림프 조직으로 이동할 수 있음을 시사한다. 또한, 초기 활성화 귀소 마커 CD11a 및 IFN-감마 및/또는 TNF-알파를 발현하는 RBD-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 또한 폐(도 89의 A 내지 도 89의 D) 및 비장(도 90의 A 내지 도 90의 D)에서 유의한 수준으로 발견되었다. 인테그린 CD11a의 발현은 최근에 활성화된 T 세포에서만 상향조절되고 조직에서 최적의 혈관 부착 및 기도 내 체류를 필요로 하는데(Thatte J, Dabak V, Williams MB, Braciale TJ, Ley K. LFA-1 is required for retention of effector CD8 T cells in mouse lungs. Blood. 2003 Jun 15;101(12):4916-22), 이는 이러한 세포가 최근에 폐에 동원되었다는 가설을 뒷받침한다. T 세포 반응은 폐에서 더 높은 수준으로 발견되었고 CD8+ T 세포가 우세했다. 비강내 RBD 벡터는 또한 폐에서 높은 수준의 조직-상주 기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포(TRM)를 유도하였다(도 91의 A 및 도 91의 B).
백신-유도된 T 세포가 상주 기억 T 세포(Trm)를 나타낼 수 있는지 여부를 평가하기 위해, Trm 마커 CD103 및 CD69의 발현(Takamura S. Persistence in Temporary Lung Niches: A Survival Strategy of Lung-Resident Memory CD8+ T Cells. Viral Immunol. 2017 Jul/Aug;30(6):438-450. doi: 10.1089/vim.2017.0016)을 폐 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 평가하였다. 비강내 투여 경로와 일치하여, IFN-γ, TNF-α 또는 이 둘 모두의 사이토카인을 발현하는 폐 RDB-특이적 CD4+ 및 CD8+ Trm의 유도가 관찰되었다(도 95).
데이터는 RBD 벡터 백신의 비강내 투여가 Th-1 편향 세포 반응과 관련된 IFN-γ 및 TNF-α 사이토카인을 생산하는 데 적격인 T 세포를 유도하였음을 보여주었다. 또한, 백신은 바이러스 감염의 제어에 중요한 IFN-조절된 T 세포 반응과 일반적으로 상관관계가 있는 높은 빈도의 항원-특이적 CD8+ T 세포를 유발한다는 것이 관찰되었다. 백신접종된 마우스로부터의 T 세포의 사이토카인 생산 가능성을 추가로 평가하기 위해, 비장 T 세포를 48 시간 동안 RBD 펩타이드로 재자극한 다음, 사이토카인 비드 어레이를 사용하여 상청액에서 사이토카인 수준을 측정하였다. 예상된 바와 같이, T 세포에 의한 IFN-γ 및 TNF-α의 유도가 관찰되었고, 또한 백신접종된 동물로부터의 T 세포가 비히클 대조 처리된 마우스로부터의 T 세포와 비교하여 중간 수준의 IL-10을 생산한다는 것이 발견되었다. 중요하게는, 백신접종된 마우스로부터 유래된 재자극된 세포로부터의 상청액에서 인터루킨(IL)-4, IL-5, IL-13 및 IL-17a 수준은 비히클 대조 동물로부터의 펩타이드-자극된 세포를 함유하는 배양물에서 관찰된 것과 같았다(도 96).
실시예 18. 지속적인 항체 반응을 유발하는 C57BL/6 마우스에서 RBD 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여
SARS-Cov-2의 RBD 도메인 잔기 302 내지 543(SEQ ID NO: 15)을 코딩하는 비강내 복제-결함 Ad5 벡터의 면역원성을 동계 교배 C57BL/6 마우스에서 시간 경과에 따른 스파이크-특이적 혈청 IgG 반응을 측정함으로써 평가하였다. 백신접종 전 0 일 및 백신접종 후 15 일, 30 일, 63 일 및 120 일(예를 들어, 약 2 주, 약 1 개월, 약 2 개월 및 약 4 개월)에, 표 25에 기재된 바와 같이 단일 비강내 백신접종 후 혈청을 수집하였다. 혈청에서 SARS-CoV-2 스파이크 IgG의 정량화 방법은 실시예 13B에서 기술된다.
표 25
Figure pct00055
결과는 도 97에 제시되어 있으며, 여기서 30x 기준선은 점선으로 표시되어 있다. 15 일에 모든 20 마리의 백신접종된 동물에서 검출된 스파이크-특이적 IgG 반응의 검출 후, 반응은 Wilcoxon 일치-쌍 부호 순위 검정에 기반하여 상이한 백신접종 후 시점에 걸쳐 통계적 차이 없이 120 일까지 안정하게 유지되었다. 본 실시예는 백신접종 후 30 일 내지 120 일 사이에 혈청으로부터 측정된 항-스파이크 IgG에서 유의한 감쇠를 나타내지 않았다. 실시양태에서, 포유동물에게 단일 비강내 용량으로 투여될 때 적어도 4 개월 동안 지속되는 스파이크 단백질에 대한 항체 반응을 유도하는 백신 또는 RBD 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에게 단일 비강내 용량으로 투여될 때, 적어도 약 5 개월, 적어도 약 6 개월, 적어도 약 7 개월, 적어도 약 8 개월, 적어도 약 9 개월, 적어도 약 10 개월, 적어도 약 11 개월, 또는 적어도 약 12 개월(1 년)동안 지속되는(약 4 개월에 측정할 때 감쇠가 부재인 경우) 스파이크 단백질에 대한 항체 반응을 유도할 수 있는 백신 또는 RBD 벡터가 본원에 제공된다.
실시예 19. 골수 및 폐에서 장기 지속형 항체 분비 세포를 유발하는 CD1 마우스에서 RBD 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여.
SARS-Cov-2의 RBD 도메인 잔기 302 내지 543(SEQ ID NO: 15)을 코딩하는 비강내 복제-결함 Ad5 벡터의 면역원성을 골수(BM) 및 폐에서 스파이크-특이적 IgG 및 IgA를 생산한 RBD-특이적 형질 세포(항체 분비 세포; ASC)를 측정함으로써 이계 교배 CD-1 마우스에서 평가하였다. 백신접종 후 69 일에, 표 26에 기재된 바와 같이 단일 비강내 백신접종 후 골수 및 폐를 수집하였다.
표 26
Figure pct00056
ELISPOT에 의한 스파이크-특이적 IgG 및 IgA를 생산하는 골수(BM) 및 폐에서의 RBD-특이적 ASC의 검출은 다음과 같이 요약된다. 골수(2 개의 경골 + 2 개의 대퇴골/마우스) 및 폐 세포로부터의 단일 세포 현탁액을 백신접종된 마우스로부터 제조하였다. 세포를 완전 배지에서 2 회 연속 희석하고, 정제된 재조합 RBD 단백질(Sino Biological)로 미리 코팅된 멀티스크린 셀룰로스 필터 ELISPOT 플레이트(Millipore) 상에 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 조직에 존재하는 형질 세포에 의해 분비된 RBD-특이적 항체를 AP-접합 염소 항-마우스 IgG Ab(Jackson ImmunoResearch) 또는 AP-접합 염소 항-마우스 IgA(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 검출하였다. ELISPOTS를 영상화하고, S6 Ultra-V 분석기(Cellular Technology Limited)를 사용하여 계수하였다.
결과는 표 98에 제시되어 있다. RBD-특이적 ASC는 69 일차 백신접종된 마우스의 골수에서 확인되었다. 이러한 ASC는 특히 ASC의 장기 생존을 지원하는 적소에 위치하기 때문에, RBD 벡터에 의해 유도된 전신 RBD-특이적 항체 역가가 매우 지속성 있을 것으로 예측된다. 또한, 비강내 백신접종은 또한 추후 감염 부위에서 점막 보호를 제공할 수 있는 IgA ASC를 포함한 폐에서 지속성 있는 ASC 집단의 확립을 야기하였다. 호흡기 바이러스에 의한 감염은 또한 폐 내에서 장기 지속형 ASC를 확립할 수 있고, 이러한 세포는 재감염으로부터의 조기 보호에 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 비강내 백신-유도된 ASC의 존재는 또한 백신접종된 동물에 국소 보호를 제공할 수 있는 합리적인 가정이다. 실시양태에서, 골수 및 폐 상주 기억 항체 분비 세포를 유도하기 위한 조성물(예를 들어, RBD 벡터) 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 포유동물에게 단일 비강내 용량으로 투여될 때 항-스파이크 IgG와 IgA 둘 모두를 분비하는 골수 및 폐 상주 기억 항체 분비 세포를 유도하는 백신 또는 RBD 벡터가 본원에 제공된다.
실시예 20. 장기 지속형 RBD-특이적 B 세포 기억을 유발하는 C57BL/6 마우스에서 RBD 도메인을 발현하는 Ad5 벡터의 비강내 투여.
SARS-Cov-2의 RBD 도메인 잔기 302 내지 543(SEQ ID NO: 15)을 코딩하는 비강내 복제-결함 Ad5 벡터의 면역원성을 동계 교배 C57BL/6 마우스에서 종격동 림프절의 장기 지속형 RBD-특이적 B 세포 기억 및 골수(BM)에서 RBD-특이적 형질 세포(항체 분비 세포; ASC)를 측정함으로써 평가하였다. 백신접종 후 168 일(예를 들어, 24 주 또는 6 개월)에, 표 27에 기재된 바와 같이 단일 비강내 백신접종 후 종격동 림프절 및 골수를 수집하였다. 나이브 C57BL/6 마우스(n=5)를 음성 대조로서 사용하였다.
표 27
Figure pct00057
RBD-특이적 B 세포 기억의 유세포 분석을 위해, B 세포 항체 패널은 CD95/FAS-FITC (클론 Jo2; 1:200 희석), SARS-CoV-2 RBD-PE (1:200 희석), SARS-CoV-2 RBD-APC (1:200 희석), 7-AAD (1:1000 희석), CD3-PerCP-Cy5.5 (클론 17A2; 1:200 희석), CD38-PE-Cy7 (클론 90; 1:400 희석), CD19-APC-Fire750 (클론 6D5; 1:200 희석), CD138-BV421 (클론 281-2; 1:200 희석) 및 IgD-BV510 (클론 11-26c.2a; 1:500 희석)으로 이루어졌다. 세포를 암실 하에 4℃에서 20 min 동안 항체 혼합물(50 ul 총 부피)과 함께 인큐베이션한 다음, 200 ul의 SME로 세척하였다. 세포를 200 ul의 SME(고정제 없음)에 재현탁시키고, 즉시 FACSCanto II에서 분석하였다.
RBD-특이적 기억 B 세포에 대한 결과는 도 99에 제시되어 있다. 도 99의 B는 나이브 동물과 비교하여 백신접종된 동물의 종격동 림프절에 존재하는 더 높은 절대 수의 RBD-특이적 기억 B 세포를 보여준다. RBD 벡터의 단일 비강내 투여 168 일 후에 항원-특이적 기억 B 세포의 존재를 검출하는 것은 비강내 백신에 의해 유도된 RBD-특이적 B의 장기 지속형 성질의 강력한 지표를 제공한다. 종격동 림프절에 존재하는 RBD-특이적 기억 B 세포는 SARS-CoV-2와 같은 호흡기 감염에 신속하게 반응하기에 매우 적합할 것이다.
골수에서 ASC의 측정은 실시예 19에 기재된 것과 동일한 방법을 따랐다. 결과는 도 100에 제시되어 있다. IgG 및 IgA 항체를 생산한 장기 지속형 RBD-특이적 ASC는 RBD 벡터의 단일 비강내 투여 168 일 후에 대부분의 동물의 골수에서 검출되었다.
고찰 - 마우스에서 SARS-CoV-2에 대한 신속하고 지속성 있는 전신 및 점막 면역을 유발하는 S1 및 RBD 아데노바이러스 벡터로의 단일-용량 비강내 백신접종
동계 교배 C57BL/6 및 이계 교배 CD-1 마우스까지의 SARS-CoV-2의 우한-1 균주(수탁 번호 QHD43416.1)로부터 S1 도메인(잔기 16 내지 685)(SEQ ID NO: 13) 또는 RBD 도메인(잔기 302 내지 543)(SEQ ID NO: 15)을 코딩하는 복제-결함 Ad5 벡터의 단일 투여 후 S1 및 RBD 벡터의 면역원성을 혈청 및 기관지폐포 세척액(BAL) 유체에서 스파이크-특이적 항체 수준의 유도를 측정함으로써 평가하였다. 각각의 백신을 상기 기재된 바와 같이 세 가지(3) 상이한 용량 수준(높음, 중간 또는 낮음)으로 평가하였다. 0 일에 단일 백신 투여 후, 혈청, 기관지폐포 세척액(BAL) 샘플을 7-28 일(C57BL/6) 또는 7-21 일(CD-1)에 수집하였다. SARS-CoV-2 스파이크에 특이적인 IgG 및 IgA 항체를 스파이크 세포측정 비드 어레이를 사용하여 혈청 또는 BAL 샘플에서 측정하였다. 이러한 백신-유발된 항체의 기능을 생 바이러스 중화 검정에서 측정하였다. SARS-CoV-2에 대한 강력한 중화 항체 반응 및 점막 IgA의 유도 외에도, RBD는 T-헬퍼 1(Th1) 유형 사이토카인 프로파일에 의해 및 폐-상주 기억 T(Trm) 세포를 포함하여 사이토카인-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유도를 통해 특징화되는 전신 및 점막 세포-매개 면역 반응을 자극하였다.
전신 스파이크-특이적 IgG 항체 반응은 S1 벡터 또는 RBD 벡터 백신의 단일 비강내 투여를 받은 마우스의 두 균주 모두에서 검출되었다. 도 78 및 도 85. 중간 및 높은 백신 용량에서, RBD 벡터는 S1 벡터와 비교하여 약간 더 큰 혈청 스파이크-특이적 IgG 반응을 유도하였고, 효과는 CD-1 마우스와 비교하여 C57BL/6 마우스에서 더 두드러졌다. 또한, S1 또는 RBD 벡터의 비강내 투여는 둘 모두의 마우스 균주의 BAL에서 스파이크-특이적 IgG의 빠른 상승을 야기하였다. S1 또는 RBD의 단일 비강내 용량 후 IgA의 유도가 또한 입증되었다. 비강내 투여 후 RBD 벡터(SEQ ID NO: 15를 코딩)에 의해 유도된 전신 스파이크-특이적 IgG 항체 반응은 또한 실시예 18에 제시된 바와 같이 백신접종 후 최대 120 일 동안 시간 경과에 따른 감소의 증거 없이 지속성이 있는 것으로 입증되었다. 도 97을 참조한다. 또한, 비강내 백신접종은 또한 백신접종된 동물에 국소 보호를 제공할 수 있는 IgA ASC를 포함한 폐 환경에서 지속성 있는 RBD-특이적 ASC 및 장기 지속형 B 세포 기억 집단의 확립을 야기하였다. 도 98 내지 도 100을 참조한다.
야생형 SARS-CoV-2 단리물 USA-WA1/2020을 사용하여 감염 허용 Vero E6 세포에서 병소 중화 감소 시험(FNRT)(플라크 감소 중화 시험(PRNT)과 유사)에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 반응을 유발한 S1 벡터 또는 RBD 벡터의 비강내 투여를 측정하였다. 분석은 중간 또는 높은 백신 용량을 사용하여 S1 및 RBD로 백신접종한지 4 주 후에 C57BL/6 마우스로부터의 샘플, 및 높은 백신 용량의 RBD 벡터로 백신접종한지 3 주 후에 CD1 마우스로부터의 샘플을 포함하였다(도 94의 A). RBD 벡터의 비강내 투여는 평가된 모든 조건 하에서 S1 벡터의 사용과 비교하여 유의하게 더 큰 중화 역가를 유발하였다. 가장 높은 용량에서, RBD 벡터로의 비강내 백신접종은 각각 563 및 431의 중앙값 역가로 10/10 C57BL/6 및 8/10 CD-1 마우스에서 배경보다 높은 중화 항체 반응을 유도하였다(도 94의 A). 중화 항체 반응의 수준은 개별 동물에서 측정된 스파이크-특이적 혈청 IgG 반응의 크기와 밀접하게 상관관계가 있었는데(도 94의 B), 이는 RBD 벡터로의 투여에 대한 강력한 항체 반응이 잠재적으로 보호성인 중화 항체의 생성과 관련이 있었다는 것을 지시한다.
실시예 13, 15 및 17은 본 발명의 백신 조성물, 예를 들어, 비강내 투여를 위해 구성된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 서열(SEQ ID NO: 15)을 코딩하는 아데노바이러스-벡터화된 백신이 동계 교배 마우스와 이계 교배 마우스 둘 모두에서 고도로 면역원성이고 강력한 전신 및 국소 점막 항체 및 T 세포 반응을 유도한다는 것을 입증해 준다. 단일 비강내 백신접종 후, RBD 벡터 조성물은 허용 세포 뿐만 아니라 점막 IgA 및 사이토카인-생산 폐 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 야생형 SARS-CoV-2 감염을 중화시키는 기능성 항체의 유도를 통해 SARS-CoV-2 스파이크에 대해 강력하고 집중적인 면역 반응을 유발하였다. RBD 벡터 조성물에 의해 유도된 세포 매개 반응은 높은 비율의 항원-특이적 CD8+ T 세포 및 IFN-γ 및 TNF-α를 포함한 사이토카인 발현에 의해 입증된 바와 같이 항-바이러스 반응으로 편향되었다. 폐에서 상주 기억 CD8+ T 세포 집단의 확립은 스파이크 단백질에 대한 점막 IgA 항체의 강력한 유도를 보완하고 RBD 벡터 조성물에 대한 전체 면역 반응에 중요한 부가를 나타낸다. 이러한 데이터는 또한 RBD 벡터 백신 조성물의 비강내 투여가 잠재적으로 유해한 Th2 반응을 개시하지 않았고, 오히려 비강내 투여된 아데노바이러스 벡터의 사용으로 유도된 항-바이러스 반응으로 인해 예상된 항-바이러스 T 세포 반응을 유도하였다는 것을 지시한다. 미국 특허 제9,605,275호를 참조한다. 종합하면, 데이터는 SARS-CoV-2 스파이크 RBD 서열(SEQ ID NO: 15)을 발현하는 복제 부적격 Ad5 벡터의 비강내 투여가 점막 부위와 전신 부위 둘 모두에서, 특히 감염 및 임상 질환의 주요 부위를 나타내는 폐 내에서 체액 및 세포 면역 반응을 생성한다.
특정 실시양태가 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 당업자에게 변형 및 수정이 이루어질 것임이 이해된다. 따라서, 첨부된 청구범위는 하기 청구항의 범위 내에 있는 이러한 모든 등가 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Altimmune, Inc <120> CORONAVIRUS IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> ALT2029.PCT <150> 62/977,078 <151> 2020-02-14 <150> 62/992,553 <151> 2020-03-20 <150> 63/005,923 <151> 2020-04-06 <150> 63/016,902 <151> 2020-04-28 <150> 63/050,844 <151> 2020-07-12 <150> 63/069,792 <151> 2020-08-25 <150> 63/088,736 <151> 2020-10-07 <150> 63/140,128 <151> 2021-01-21 <150> 63/142,077 <151> 2021-01-27 <150> 63/148,374 <151> 2021-02-11 <160> 476 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29903 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Wuhan-Hu-1 <400> 1 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 300 acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 360 agactccgtg 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1130 1135 1140 Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly 1145 1150 1155 Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 1160 1165 1170 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu 1175 1180 1185 Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly 1190 1195 1200 Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro 1205 1210 1215 Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln 1220 1225 1230 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 1235 1240 1245 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn 1250 1255 1260 Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1265 1270 1275 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu 1280 1285 1290 Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu 1295 1300 1305 Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly 1310 1315 1320 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 1325 1330 1335 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 1340 1345 1350 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 1355 1360 1365 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser 1370 1375 1380 Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 1385 1390 1395 Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 1400 1405 1410 Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys 1415 1420 1425 Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser 1430 1435 1440 Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 1445 1450 1455 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr 1460 1465 1470 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly 1475 1480 1485 Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His 1490 1495 1500 Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val 1505 1510 1515 Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe 1520 1525 <210> 476 <211> 1567 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> SARS-CoV spike protein <400> 476 Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn 1 5 10 15 Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr 20 25 30 Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser 35 40 45 Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr 50 55 60 Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly 65 70 75 80 Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala 85 90 95 Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly 100 105 110 Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 115 120 125 Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val 130 135 140 Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu 145 150 155 160 Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser 165 170 175 Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln 180 185 190 Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 195 200 205 Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys 210 215 220 Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe 225 230 235 240 Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val 260 265 270 Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu 275 280 285 Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu 290 295 300 Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys 305 310 315 320 Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala 325 330 335 Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn 340 345 350 Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly 355 360 365 Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp 370 375 380 Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp 385 390 395 400 Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg 405 410 415 Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile 420 425 430 Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu 435 440 445 Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr 450 455 460 Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu 465 470 475 480 Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn 485 490 495 Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly 500 505 510 Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr 530 535 540 Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn 545 550 555 560 Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe 565 570 575 Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala 580 585 590 Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys 595 600 605 Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val 610 615 620 Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala 625 630 635 640 Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp 645 650 655 Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser 660 665 670 Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser 675 680 685 Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala 690 695 700 Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro 705 710 715 720 Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro 725 730 735 Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr 740 745 750 Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val 755 760 765 Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser 770 775 780 Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe 785 790 795 800 Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro 805 810 815 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 820 825 830 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 835 840 845 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 850 855 860 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 865 870 875 880 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 885 890 895 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile 900 905 910 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 915 920 925 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 930 935 940 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 945 950 955 960 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly 965 970 975 Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 980 985 990 Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 995 1000 1005 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys 1010 1015 1020 Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly 1025 1030 1035 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly 1040 1045 1050 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu 1055 1060 1065 Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu 1070 1075 1080 Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly 1085 1090 1095 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 1100 1105 1110 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 1115 1120 1125 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 1130 1135 1140 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser 1145 1150 1155 Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 1160 1165 1170 Thr Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe 1175 1180 1185 Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys 1190 1195 1200 Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser 1205 1210 1215 Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 1220 1225 1230 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr 1235 1240 1245 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly 1250 1255 1260 Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His 1265 1270 1275 Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val 1280 1285 1290 Lys Asn Lys Ser Val Asn Phe Thr Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1295 1300 1305 Ser Arg Arg Lys Arg Ser Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1310 1315 1320 Gly Ser Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln 1325 1330 1335 Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe 1340 1345 1350 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala 1355 1360 1365 Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser 1370 1375 1380 Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe 1385 1390 1395 Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp 1400 1405 1410 Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly 1415 1420 1425 Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala 1430 1435 1440 Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 1445 1450 1455 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr 1460 1465 1470 Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 1475 1480 1485 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro 1490 1495 1500 Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 1505 1510 1515 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg 1520 1525 1530 Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val 1535 1540 1545 Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Ser Val 1550 1555 1560 Asn Phe Thr Phe 1565

Claims (92)

  1. 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물로서, rdAd 벡터는
    a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
    b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 것인 rdAd 벡터;
    c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
    d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    f) 임의의 a), b), 또는 c) 중 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합
    으로부터 선택되고, 상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는 것인 면역학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 스파이크(S) 단백질 또는 스파이크 단백질의 S1 도메인에 대한 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 12에 존재하는 서열; SEQ ID NO: 12에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 15에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; SEQ ID NO: 446; SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열; 임의의 SEQ ID NO: 412-417; 임의의 SEQ ID NO: 438-445, 및 임의의 SEQ ID NO: 475-476 또는 460; 임의의 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, 및 SEQ ID NO: 475-476 및 460에 대해 적어도 80%의 상동성 및/또는 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은, S1/S2 절단성 부위 및/또는 S2'가 단백질분해성 분해에 내성인 서열, 및/또는 융합 펩타이드가 이의 융합형성 활성을 방지하도록 결실되거나 변형된 서열, 및/또는 세포내 도메인이 소포체 보유 모티프를 변경시키도록 변형되거나 부분적으로 변경시키도록 변형되는 서열을 포함하고, 선택적으로 S1/S2 절단 부위에서 NSPQQAQSVAS (SEQ ID NO: 451), NSPSGAGSVAS (SEQ ID NO: 456) 또는 NSP-----VAS (SEQ ID NO: 461), S2' 절단 부위에서 KRSFIADA (SEQ ID NO: 453), PSKPSKQSF (SEQ ID NO: 457), PSKPSKNSF (SEQ ID NO: 458), PSKPSNASF (SEQ ID NO: 459), 또는 SRLDPPEAEV (SEQ ID NO: 455), 및/또는 표 1 및/또는 표 2에 제시된 임의의 서열 변형 중 적어도 하나를 포함하는 서열을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 스파이크 단백질 서열을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  5. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 제시된 서열, 또는 이의 면역원성 단편인 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 SEQ ID NO: 3의 적어도 아미노산 331 내지 527을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은 다음 치환: K417N, K417T, R403K, N439K, G446V, G446S, L452R, G476A, S477N, T478K, E484D, T478I, E484K, F490S, Q493R, S494P, P499H 및/또는 N501Y 중 하나 이상을 포함하는 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 서열을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 항원 코딩 서열은, 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 서열 또는 이의 면역원성 단편을 코딩하고/코딩하거나 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO 475-476, SEQ ID NO: 446 및 SEQ ID NO: 460의 아미노산 서열; 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트는 SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 구조 단백질 외피(E), 막(M) 또는 뉴클레오캡시드(N) 중 하나 이상을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 추가의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트는
    임의의 하나 이상의 아미노산 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 및/또는 513-526의 하나 이상의 치환; 임의의 하나 이상의 아미노산 367, 403, 417, 439, 446, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 490, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505의 하나 이상의 치환; F, I, L, S 또는 A에 의한 아미노산 367(V), K 또는 S에 의한 아미노산 403(R), N 또는 T에 의한 아미노산 417(K), K에 의한 아미노산 439(N), V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G); N에 의한 아미노산 449(Y); L, M 또는 Q에 의한 아미노산 452(L), F에 의한 아미노산 453(Y); F에 의한 아미노산 455(L); L에 의한 아미노산 456(F); I, A 또는 N에 의한 아미노산 470(T), V에 의한 아미노산 473(Y); V에 의한 아미노산 475(A); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G); N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S); S 또는 A에 의한 아미노산 476(G), N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S), I, K, R 또는 A에 의한 아미노산 478(T), Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E); L 또는 S에 의한 아미노산 486(F); L 또는 S에 의한 아미노산 490(F), L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q); P 또는 L에 의한 아미노산 494(S), N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y); V 또는 S에 의한 아미노산 496(G), H, S 또는 R에 의한 아미노산 499(P), I에 의한 아미노산 500(T); Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N); R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G); L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V); 및 V, D 또는 S에 의한 아미노산 504(G); H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환
    을 포함하는 SEQ ID NO: 411의 변형된 버전에 대한 코딩 서열을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  12. 제1항에 있어서, SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 것인 면역원성 조성물.
  13. 제1항에 있어서, a) 내지 c)의 rdAd 벡터 중 어느 2 개의 조합을 포함하는 면역원성 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 a) 내지 c)의 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 하나의 조성물 및 a) 내지 c)의 상이한 rdAd 벡터를 포함하는 적어도 제2 조성물을 포함하는 2-부분 조성물인 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하도록 추가로 구성되는 면역원성 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 적어도 하나 이상의 B 세포 에피토프, 하나 이상의 CD8+ T 세포 에피토프, 및/또는 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 포유동물 대상체에 코돈 최적화되는 것인 면역원성 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 중화 항체는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2 감염에 대해 혈청보호성이고, 선택적으로 포유동물 대상체는 인간인 면역원성 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스, 선택적으로 Ad5 또는 Ad26인 면역원성 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 또는 돼지(porcine 또는 swine) 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 E1, E3, 및/또는 E4 결손 또는 파괴 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 항원은 표 3A의 하나 이상의 T 세포 에피토프, 표 3B의 하나 이상의 T 세포 에피토프 그룹, 또는 SEQ ID NO: 27-282; 및/또는 SEQ ID NO: 25-68의 하나 이상의 B 세포 에피토프; 및/또는 SEQ ID NO: 328-369 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 코딩하고; 선택적으로 펩타이드는 연결되고, 선택적으로 2 개 내지 10 개의 아미노산의 링커 아미노산 서열에 의해 분리되는 것인 면역원성 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, rdAd 벡터는, 공동-자극 성분으로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드; 하나 이상의 사이토카인; 하나 이상의 케모카인; 하나 이상의 면역 억제 단백질; 하나 이상의 TLR 효능제로서, 선택적으로 하나 이상의 TLR 효능제가 SEQ ID NO: 463-474로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 하나 이상의 TLR 효능제; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 분자 애주번트를 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, rdAd 벡터는, 적어도 하나의 SARS-CoV-2 차단 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열은, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 방해하는 면역 반응을 유도하고, SARS-CoV-2 S 단백질의 이의 세포 수용체에 대한 결합을 직접적으로 방해하고, RBD 결합제이고, ACE2 결합제이고, 및/또는 RBD 결합제와 ACE2 결합제 둘 모두인 적어도 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물의 rdAd 벡터를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  26. 숙주 세포에서 제25항의 폴리뉴클레오타이드의 발현 시 생산되는 rdAd 벡터.
  27. 제26항의 rdAd 벡터를 포함하는 조성물.
  28. 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물; 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 제제로서, 선택적으로 희석제는 인산염-완충 식염수인 약학 제제.
  29. 제28항에 있어서, 비-침습적 투여를 위해 구성되는 약학 제제.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 포유동물 대상체에 대한 비강내 투여를 위해 구성되는 약학 제제.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체에 대한 약학 제제의 투여는 포유동물 대상체에서 보호 면역 반응, 선택적으로 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 것인 약학 제제.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태인 약학 제제.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)인 약학 제제.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 비강내 용량으로 구성되는 약학 제제.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 2 회 이상의 비강내 용량으로 구성되는 약학 제제.
  36. 인간 대상체에 대한 단일 용량 비강내 투여에 적합한 약학 제제로서,
    적어도 107 개 바이러스 입자(vp)의 유효량의, 적어도 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD) 또는 이의 적어도 하나의 면역원성 단편을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 복제 결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물로서, 유효량은 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 것인 면역원성 조성물; 및
    약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체
    를 포함하는 약학 제제.
  37. 제36항에 있어서, 제제는 SARS-CoV-2에 대해 적어도 6 개월 또는 바람직하게는 9 개월 동안 인간 대상체에게 혈청보호를 제공하도록 구성되는 것인 약학 제제.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 코딩 서열은 인간 대상체에 코돈 최적화되는 것인 약학 제제.
  39. 비강내 투여를 위한 약학적 투여형으로서, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물과 혼합된 스프레이 또는 에어로졸 형태의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 투여형은 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 비-침습적으로 유도하기 위해 비강내 투여하도록 구성되는 것인 약학적 투여형.
  40. 제39항에 있어서, 면역원성 조성물은 적어도 107 개 바이러스 입자(vp), 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 109 개 바이러스 입자(vp)의 유효량을 포함하는 것인 약학적 투여형.
  41. 제39항에 있어서, 유효량은 조합된 점막, 체액 및 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 것인 약학적 투여형.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 코로나바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 단일 용량으로서 구성되는 것인 약학적 투여형.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 2 회 이상 용량으로서 구성되는 약학적 투여형.
  44. 코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제27항의 면역원성 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성인 방법.
  46. SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항의 약학 제제 또는 제39항 내지 제43항의 약학적 투여형을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 면역 반응은 SARS-CoV-2에 대해 보호성인 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포유동물 대상체에게 유효량의 면역원성 조성물의 비강내 투여를 포함하고, 면역 반응은 SARS-CoV-2로의 공격에 대한 보호를 제공하는 것인 방법.
  49. 코로나바이러스에 대해 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
    인간 대상체에게 단일 용량의 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항의 약학 제제 또는 제39항 내지 제43항의 약학적 투여형을 비강내 투여하는 것을 포함하고, 투여는 SARS-CoV-2에 대한 혈청 항체, 점막 항체 및 T 세포를 유도하고, 선택적으로 이에 의해 인간 대상체는 적어도 약 6 개월 또는 바람직하게는 9 개월 동안 혈청보호되는 것인 코로나바이러스에 대해 인간 대상체에서 조합된 점막, 체액 및/또는 T 세포 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 혈청보호는 적어도 12 개월, 적어도 13 개월 또는 적어도 14 개월 동안 지속되는 것인 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2를 예방 및/또는 치료하기 위해 하나 이상의 항-사이토카인 시약을 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-IL-1α 시약(들), 하나 이상의 항-IL5 시약(들), 하나 이상의 항-IL-6 시약(들), 하나 이상의 IL-12 시약(들), 하나 이상의 항-IL-17 시약(들), 하나 이상의 항-MCP-1 시약(들), 하나 이상의 항-TNF-α 시약(들), 하나 이상의 항-GM-CSF 시약(들), 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 하나 이상의 항-사이토카인 시약은 하나 이상의 항-MIPα 시약(들) 및/또는 하나 이상의 항-RANTES 시약(들)을 포함하지 않는 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 공동-투여되거나;
    하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 실질적으로 유효량의 면역원성 조성물과 투여되지 않거나;
    면역원성 조성물은 포유동물에게 1 회 투여되고 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)은 다회 투여되거나;
    면역원성 조성물은 포유동물에게 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)과 공동-투여되고, 하나 이상의 항-사이토카인 시약(들)이 후속하여 포유동물에게 투여되는 것인 방법.
  54. 포유동물에서 호흡기 바이러스 감염의 증상을 치료하거나 억제하는 방법으로서, 상기 호흡기 바이러스 감염은 상기 포유동물의 폐에서 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-1-알파(IL-1α) 및/또는 인터루킨-12(IL-12)의 상승된 발현을 유발하고, 상기 방법은 SARS-CoV-2 항원을 발현하면서 또는 발현하지 않으면서 유효량의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터를 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 이에 의해 벡터의 투여 후 최대 약 28 일 동안 폐에서 IL-6, IL-1α, 및/또는 IL-12의 발현이 감소되어 상기 증상을 완화시키는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1), IFN-γ, 및/또는 RANTES의 발현은 벡터의 투여 후 폐에서 증가되는 것인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 대식세포 염증성 단백질 1 알파(MIP-1α) 및/또는 RANTES의 발현은 벡터의 투여 후 감소되지 않는 것인 방법.
  57. 호흡기 바이러스 감염을 갖거나 이의 위험이 있는, 항-바이러스 면역 반응의 유도를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 항-바이러스 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 SARS-CoV-2 항원을 발현하면서 또는 발현하지 않으면서 유효량의 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터를 대상체에게 비강내 투여하는 것을 포함하고, 항-바이러스 면역 반응은 투여 단계 후에 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1) 및/또는 인터페론 알파(IFN-γ)의 증가된 발현을 유도하는 것인 방법.
  58. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 항-SARS-CoV-2 작용제는 E1 및 E3 결손 아데노바이러스 벡터의 투여 전, 이와 본질적으로 동시에, 또는 그 후에 대상체에게 투여되고, 선택적으로 상기 하나 이상의 추가 작용제는 클로로퀸, 아지트로마이신, 렘데시비르, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  59. 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체는 대상체에게 약학 제제를 투여하기 전에 SARS-CoV-2에 의해 감염되는 것인 방법.
  60. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 대상체는 인간인 방법.
  61. SARS-CoV-2의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물로서, rdAd 벡터는
    a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
    b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 것인 rdAd 벡터;
    c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
    d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합
    으로부터 선택되고, 상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는 것인 면역원성 조성물.
  62. SARS-CoV-2의 치료 또는 예방을 제공하기 위한 의약의 제조를 특징으로 하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 용도로서, rdAd 벡터는
    a) 외인성 비-아데노바이러스 항원을 코딩하는 코딩 서열이 결여된 rdAd 벡터;
    b) 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 SARS-CoV-2 항원 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터로서, 선택적으로 상기 항원이 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 것인 rdAd 벡터;
    c) SARS-CoV-2 이외의 감염원의 적어도 하나의 외인성 항원을 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 rdAd 벡터;
    d) a)와 b)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    e) b)와 c)의 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    f) 임의의 a), b), 또는 c)의 임의의 rdAd 벡터의 조합으로서, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합;
    g) 2 개의 상이한 유형의 b)의 rdAd 벡터의 조합으로서, 각각의 유형의 rdAd 벡터는 조합에서 다른 유형의 rdAd 벡터에 의해 코딩된 것과 상이한 적어도 하나의 SARS-CoV-2 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하고, rdAd 벡터가 함께 또는 별도로 투여되는 것인 조합
    으로부터 선택되고, 상기 면역원성 조성물은 상기 면역원성 조성물이 투여되는 포유동물 대상체에서 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체 및/또는 세포 면역 반응을 유도하도록 구성되는 것인 용도.
  63. SEQ ID NO: 446 또는 SEQ ID NO: 446에 대해 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일성을 포함하는 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스(rdAd) 벡터를 포함하는 면역원성 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 15를 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  65. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  66. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 412-417, SEQ ID NO: 438-445, SEQ ID NO: 475-476 및 SEQ ID NO: 460 중 하나 이상을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  67. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3의 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  68. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 위치 333-388, 390-395, 397-399, 401-411, 413-415, 417-419, 424, 426-435, 437, 439-442, 444-446, 449, 450, 452, 453, 455-463, 465, 467-473, 475-479, 481-486, 490, 491, 493-495, 499-510, 또는 513-526에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는 것인 면역원성 조성물.
  69. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 아미노산 위치 367, 403, 439, 417, 446, 447, 449, 452, 453, 455, 456, 470, 473, 475, 476, 477, 478, 484, 486, 487, 490, 493, 494, 496, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 및/또는 505에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는 것인 면역원성 조성물.
  70. 제68항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는, N에 의한 아미노산 417(K)의 치환; V, S 또는 A에 의한 아미노산 446(G)의 치환; N에 의한 아미노산 449(Y)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)에서의 치환; F에 의한 아미노산 455(L)의 치환; L에 의한 아미노산 456(F)의 치환; V에 의한 아미노산 473(Y)의 치환; V에 의한 아미노산 475(A)의 치환; S 또는 A에 의한 아미노산 476(G)의 치환; N, R, T, G, A 또는 I에 의한 아미노산 477(S)의 치환; Q, K, D, A 또는 R에 의한 아미노산 484(E)에서의 치환; L 또는 S에 의한 아미노산 486(F)의 치환; F에 의한 아미노산 453(Y)의 치환; L 또는 R에 의한 아미노산 493(Q)의 치환; N 또는 F에 의한 아미노산 495(Y)의 치환; I에 의한 아미노산 500(T)의 치환; Y, T 또는 S에 의한 아미노산 501(N)의 치환; R, D 또는 C에 의한 아미노산 502(G)의 치환; L, I 또는 F에 의한 아미노산 503(V)의 치환; 또는 H, E, W 또는 C에 의한 아미노산 505(Y)의 치환으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는 것인 면역원성 조성물.
  71. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 K417T, K417N, E484K, L452R 및/또는 N501Y로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열을 코딩하고, 여기서 아미노산 넘버링은 SEQ ID NO: 411에 상응하는 것인 면역원성 조성물.
  72. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 412-417 중 하나 이상을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  73. 제63항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 438-443 또는 460 중 하나 이상을 코딩하는 것인 면역원성 조성물.
  74. 제63항에 있어서, SEQ ID NO: 446을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO: 418 내지 437로부터 선택된 서열을 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 추가로 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  75. 제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열은 포유동물 대상체에 코돈 최적화되는 것인 면역원성 조성물.
  76. 제63항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 소 아데노바이러스, 개 아데노바이러스, 비-인간 영장류 아데노바이러스, 닭 아데노바이러스, 돼지(porcine 또는 swine) 아데노바이러스, 또는 인간 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 비-인간 영장류 아데노바이러스는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  78. 제63항에 있어서, 복제 결함 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 인간 아데노바이러스는 Ad5 또는 Ad26인 면역원성 조성물.
  80. 유효량의 제63항의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 제제로서, 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하고, 선택적으로 희석제는 인산염-완충 식염수인 약학 제제.
  81. 제80항에 있어서, 비-침습성 또는 비강내 투여를 위해 구성되고, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체는 스프레이 또는 에어로졸 형태인 약학 제제.
  82. SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 유효량의 제63항의 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 유효량은 적어도 108 개 바이러스 입자(vp), 적어도 109 개 바이러스 입자(vp), 또는 적어도 1010 개 바이러스 입자(vp)인 방법.
  84. 제82항에 있어서, 면역원성 조성물은 비강내 투여되는 것인 방법.
  85. 제82항에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 인간 대상체에 투여된 후 적어도 6 개월, 적어도 9 개월 또는 적어도 12 개월 동안 지속되는 것인 방법.
  86. 제82항에 있어서, SARS-CoV-2에 대한 면역 반응은 면역원성 조성물의 투여 후에 유도된 SARS-CoV-2에 대한 점막 IgA 및/또는 T 세포 반응을 포함하는 것인 방법.
  87. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 경증 또는 중등도 COVID-19-관련 질병의 발병률을 감소시키는 것인 방법.
  88. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 중증 COVID-19-관련 질병의 발병률을 감소시키는 것인 방법.
  89. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 COVID-19-관련 질병의 중증도를 감소시키는 것인 방법.
  90. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 SARS-CoV-2에 의한 감염의 발병률을 감소시키는 것인 방법.
  91. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 무증상 COVID-19의 발병률을 감소시키는 것인 방법.
  92. 제82항에 있어서, 유효량의 면역원성 조성물은 인간 대상체에 투여된 후 SARS-CoV-2의 전염을 감소시키는 것인 방법.
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