CN116350770B

CN116350770B - 一种带状疱疹疫苗制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN116350770B
Application number: CN202111627083.3A
Authority: CN
Inventors: 陈德祥; 胡业勤; 艾绪露; 卫鹏飞; 陈静; 方习静; 魏胜男
Original assignee: Chengdu Maikekang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Maikekang Biotechnology Co ltd
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2024-07-12
Anticipated expiration: 2041-12-28

Abstract

本发明涉及一种带状疱疹疫苗制剂及其制备方法，所述的制剂中包含：(1)序列如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白抗原，含量为75‑130ug/ml；(2)用于保持gE蛋白抗原稳定性的药用辅料组合：(3)用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平的疫苗佐剂：所述制剂的制备方法为：(1)向纯化后的抗原溶液中按照所述抗原缓冲液的配方添加辅料制得抗原原液；(2)分别制备阳离子脂质体和中性脂质体；(3)将抗原原液、疫苗佐剂、阳离子脂质体、中性脂质体及其他辅料成份混合并搅拌均匀制成半成品；(4)分装后获得重组带状疱疹疫苗制剂成品。

Description

一种带状疱疹疫苗制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种带状疱疹疫苗制剂及其制备方法。

背景技术

2017年美国疾病控制和预防中心(CDC)免疫实践顾问委员会(ACIP)发布意见，推荐葛兰素史克重组亚单位疫苗取代默沙东减毒活疫苗用于50岁及以上老年人群的免疫接种。

默沙东生产的水痘带状疱疹减毒活疫苗的保护效力随接种者年龄的增长而逐渐降低，其III期临床结果显示，在60～69岁人群中，抗带状疱疹的整体保护率约为64％，而在＞70岁的人群中，保护率下降到38％；同时该疫苗不能用于免疫系统有缺陷的人群，不能产生有效保护。GSK生产的是重组亚单位疫苗，其技术核心源于其AS01_B佐剂系统及特异性抗原，临床III期试验结果显示，该疫苗的整体有效性为97.2％，在≥70岁的人群中保护率也能达到97.5％；同时发现诱导的抗原特异性CD4+T细胞数量大约是诱导细胞数量的10倍。普遍观点认为细胞免疫(特别是CD4+T细胞)是控制带状疱疹发病的关键因素。

铝佐剂虽然是一种常用的疫苗佐剂，但研究表明铝佐剂主要引起Th2细胞介导的体液免疫反应，不能引起Th1细胞介导的细胞免疫反应(不能诱导与细胞免疫相关的IL-2、INF-γ等细胞因子的表达)。默克公司采用铝佐剂配制的灭活水痘带状疱疹疫苗，由于其免疫原性未达预期，最终未能上市。进一步说明能诱导细胞免疫反应(特别是CD4+T细胞)的佐剂是水痘带状疱疹疫苗拥有高保护性的关键因素。

我公司研发的重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)使用的抗原为水痘带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)系通过DNA重组技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中转染截短水痘带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白编码序列，表达特异性抗原。抗原采用的gE蛋白序列与人水痘-带状疱疹病毒Strain NH29_3(ABH08489.1)、Dumas(NP_040190.1)、DE10-2480(AKG56356.1)、VZV-VSD(AAG48520.1)等多个菌株来源的gE蛋白可溶性膜外部分完全一致，具有广泛的保护能力。所用的佐剂系统为自行开发的MA105佐剂系统，其成分包括混合脂质体和两种免疫增强剂：Poly I:C和QS-21。临床前研究显示，本品具有良好的安全性，免疫原性同类似，能够诱导产生高水平的抗体和高频数的CD4+T细胞应答。

基于此，进一步提出本发明，涉及重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)制剂的制备方法

发明内容

本发明首先涉及一种重组带状疱疹疫苗制剂，以每毫升疫苗制剂计算，所述的制剂中包含：

(1)序列如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白抗原(分子量为63530.6，等电点为4.8～5.8)，含量为75-130ug/ml；

SEQ ID NO.1：

SVLRYDDFHTDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLLRY；

(2)用于保持gE蛋白抗原稳定性的药用辅料组合，所述的药用辅料组合包含：

1)聚山梨酯80，200-600μg/ml；

2)组氨酸，800-1000μg/ml；

3)蔗糖，40-100mg/ml；

4)氯化钠，1.5-6.5mg/ml；

(3)用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平的疫苗佐剂，所述的免疫佐剂包含：

1)DOTAP，70-240μg/ml；

2)DOPC，500-2000μg/ml；

3)胆固醇，175-600μg/ml；

4)QS-21，50-120μg/ml；

5)Poly I:C，400-900μg/ml。

优选的，以每毫升疫苗制剂计算，所述的制剂中包含：

(1)序列如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白抗原，含量为95-110ug/ml；

1)聚山梨酯80，450-550μg/ml；

2)组氨酸，850-950μg/ml；

3)蔗糖，52-55mg/ml；

4)氯化钠，2.5-5mg/ml；

(3)用于提高抗原诱导的抗体水平和提升抗原诱导的活性CD4+T细胞水平的疫苗佐剂，所述的免疫佐剂包含：

1)DOTAP，140-215μg/ml；

2)DOPC，1200-1650μg/ml；

2)胆固醇，320-450μg/ml；

3)QS-21，80-110μg/ml；

4)Poly I:C，780-830μg/ml。

优选的，所述的细胞免疫为Th1型细胞免疫反应；

所述的gE抗原蛋白，分子量为63530.6，等电点为4.8～5.8。

进一步的，

所述的疫苗制剂的渗透压为210～350mOsmol/kg；

所述的疫苗制剂的平均粒径为100～300nm，优选的为130～200nm；

所述的疫苗制剂的pH值为6.0～7.0。

进一步的，所述的gE蛋白抗原溶解保存于抗原缓冲液中，所述的抗原缓冲液为含如下成份的水溶液：

10％蔗糖、10mM组氨酸、0.025％Tween-80；溶液pH6.5。

进一步的，所述的gE蛋白抗原由重组CHO细胞发酵生产制备得到，所述的发酵生产方法为：

(1)工作细胞，经过种子复苏，扩大培养后收集细胞收获液；

(2)细胞收获液经澄清过滤，阴离子层析纯化，收集纯化蛋白，再经过低pH灭活病毒，最后通过疏水层析和阳离子复合层析纯化后，得到洗脱蛋白；

(3)经超滤置换脱盐，并完成纳米膜过滤后得到抗原溶液。

本发明还涉及所述的重组带状疱疹疫苗制剂的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)向纯化后的抗原溶液中按照所述抗原缓冲液的配方添加蔗糖、组氨酸和Tween-80，调节pH后制得抗原原液；

(2)分别制备阳离子脂质体和中性脂质体；

(3)抗原原液、QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及其他辅料成份混合并搅拌均匀制成半成品；

(4)分装后获得重组带状疱疹疫苗制剂成品。

所述的阳离子脂质体的制备方法为：

由1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇按照质量比为2:2:1进行配制；三种脂质成份分散均匀后，使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法制备脂质体；

优选的，使用乙醇注入法进行制备，制备方法为：在超滤后依次使用孔径为200nm、100nm的挤出膜进行挤出成型，最后通过无菌过滤器过滤除菌即得。

更优选的，所述阳离子脂质体的制备步骤如下：

(1)三种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切1～3次；

(2)使用蔗糖组氨酸缓冲液超滤置换，浓缩倍数2～4倍，洗滤倍数6～8倍；

(3)200nm脂质体挤出，使用孔径为200nm的滤膜进行挤出，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

(4)100nm脂质体挤出，使用孔径为100nm的滤膜进行挤出，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

(5)使用无菌过滤器过滤除菌。

制备得到的阳离子脂质体的理化参数为：

平均粒径(D50)：60～120nm；

溶液pH值：5.5～7.0；

Zeta电位：38～52mV(pH6.5)。

所述的中性脂质体的制备方法为：

由二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇按照质量比为4:1进行配制，脂质成份分散均匀后，使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法制备脂质体；

优选的，使用乙醇注入法进行制备，制备方法为：按照生产初乳、依次使用孔径为200nm、100nm的挤出膜进行挤出成型，随后进行超滤、过滤除菌即得。

更优选的，所述中性脂质体的制备步骤如下：

(1)两种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切1～3次；

(2)200nm脂质体挤出，使用孔径为200nm的滤膜进行过滤，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

(3)100nm脂质体挤出，使用孔径为100nm的滤膜进行过滤，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

(4)使用蔗糖组氨酸缓冲液超滤置换，浓缩倍数3～6倍，洗滤倍数6～8倍；

(5)使用无菌过滤器过滤除菌。

制备得到的中性脂质体的理化参数为：

平均粒径(D50)：80～140nm；

溶液pH值：5.5-7.0，优选为6.4-6.6。

本发明还涉及所述的重组带状疱疹疫苗制剂的如下应用：

(1)制备药物或疫苗，所述的药物用于治疗或预防由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起的疾病；

(2)治疗或预防由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起的疾病；

(3)制备联用型药物或疫苗。

附图说明

图1、不同配方的抗原配制液振荡4h后的溶液浊度分析(浊度检测使用浊度仪进行检测，图中纵坐标单位为NTU)。

图2、不同配方的抗原配制液冻融不同次数聚合物峰面积变化，图中峰面积变化是通过SEC-HPLC检测(纵坐标为百分数，例如纵坐标变化0.25指峰面积变化0.25％)；0次冻融的数据有微小变化，是因为蛋白配制成不同配方后在冻融前检测，会存在一定的检测偏差。

图3、各试验组疫苗二次免疫后14天血清抗体亚型IgG2a滴度分析。

图4、各试验组疫苗二次免疫后14天细胞免疫分析(CD4+T细胞反应)。

图5、各试验组疫苗二次免疫后14天细胞免疫分析(CD4+T细胞反应)。

图6、混合佐剂系统(混合脂质体)的制备流程路线图。

图7、重组带状疱疹疫苗透射电镜图。

图8、重组带状疱疹疫苗粒径分布图。

具体实施方式

抗原及生产

gE蛋白是VZV病毒表面含量最多的蛋白，是由623个氨基酸残基组成的跨膜糖蛋白，其N-端1-30氨基酸为信号肽，氨基酸31-538为膜外片段，氨基酸539-559为跨膜片段，氨基酸560-623为膜内区。gE蛋白在病毒的表面与糖蛋白gI形成二聚体，在病毒感染宿主细胞过程中起重要作用。自然感染或者接种VZV减毒疫苗都能诱导产生gE特异性的中和抗体和CD4⁺T细胞免疫反应，所以gE是人体免疫反应的重要靶点。gE蛋白抗体反应的最主要位点位于其N-端的50-135个氨基酸片段，至少有一个可以被中和抗体识别的线性表位。而T细胞识别gE蛋白的位点分布在其31-538整个膜外片段。gE蛋白跨膜区不含已知的抗原表位和T细胞识别位点。

本申请抗原采用的gE蛋白序列是常见的人水痘-带状疱疹病毒(Strain NH29_3(ABH08489.1)、Dumas(NP_040190.1)、DE10-2480(AKG56356.1)、VZV-VSD(AAG48520.1)的gE蛋白膜外区，氨基酸顺序为31-538，不含跨膜区和膜内区的氨基酸顺序。

抗原生产：每次投料基础培养基35～55L，接种1.5～3L细胞悬液，补料8～10L，细胞收获液体积约为45～65L。最终得到5～10g gE抗原。

表达抗原的宿主细胞：宿主细胞CHO-K1细胞由南京金斯瑞生物科技有限公司购买，该株细胞编号为CCL-61。

实施例1、抗原稳定性辅料筛选

为保证gE蛋白在-70℃长期保存稳定，我们前期对多种辅料进行筛选，研究在50℃加热条件下、室温振荡条件下对蛋白的保护效果，评价样品处理前后的OD350值、浊度、IEC-HPLC检测主峰面积及SDS-PAGE的变化差异。

1、实验发现Tween-80可有效降低制剂中的抗原蛋白在振荡条件下产生蛋白聚集，甘油、组氨酸、山梨醇和蔗糖，可有效降低蛋白在高温条件下的降解。

2、由于甘油通常不被用于原液保存，对比山梨醇、组氨酸和选择组氨酸作为缓冲体系，同时考虑到大多数重组生物制品中，蔗糖作为制剂辅料的首选，因此选择10％蔗糖作为热稳定保护剂。最终选择10％蔗糖+10mM组氨酸+0.025％聚山梨酯80(Tween-80)，pH6.5作为原液配方。

筛选了多个配方，考察不同配方下的溶液浑浊度，结果如下表1、图1所示；进一步考察不同配方的溶剂体系经过反复冻融后的抗原聚合情况，结果如表1、图2所示。

表1、抗原溶液配方筛选

按照上述配方制备样品Y202009-15批次，进行稳定性测试，具体稳定性测试参数及步骤如下，

长期条件(-70℃)，取样点：0天，3个月、6个月

加速条件(2-8℃)，取样点：0天，3天，7天，14天

检测结果显示，样品稳定，外观合格，蛋白质含量合格，抗原活性合格，电泳纯度检查和HPLC纯度检查合格，无菌测试合格，等电点、肽图和N端测序结果显示抗原蛋白性质未发生变化。表明，重组带状疱疹疫苗原液能至少耐受4次冻融。

实施例2、带状疱疹疫苗制剂的处方筛选

本发明所述的带状疱疹疫苗制剂是由重组水痘带状疱疹病毒糖蛋白E(gE抗原)和MA105佐剂系统组成的混悬液。MA105佐剂系统是含有皂树皂苷(QS-21)和聚肌胞(Poly I:C)两种免疫增强成分的脂质体制剂。我们通过配方筛选确定了MA105佐剂系统的配方及有效抗原的含量，通过生产工艺开发确定了半成品的配制工艺。

佐剂系统含有两种免疫增强剂(QS-21和Poly I:C)，为了降低QS-21和Poly I:C的毒性，提高免疫原性，我们使用阳离子脂质体和中性脂质体的混合物吸附QS-21和Poly I:C。

Poly I:C的信号传导主要依赖于Toll样受体3(TLR3)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)，可强烈驱动细胞免疫和有效的I型干扰素应答，且能够通过I型干扰素(IFN-α/β)信号传导和抗原交叉呈递诱导强烈的抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞反应。由于Poly I:C的受体位于细胞内膜，同时为了使肌注后的Poly I:C靶向淋巴结，减少其扩散至血液带来的不良反应，我们使用阳离子脂质体(由DOTAP、DOPC和胆固醇组成)作为载体，通过静电作用与Poly I:C进行吸附。

研究中发现，单独的阳离子脂质体吸附PolyI:C后出现了大块絮状物或沉淀，为了保持产品物理性状的稳定性，本发明选择包含阳离子脂质体和中性脂质体(由DOTAP、胆固醇组成)的混合脂质体吸附Poly I:C。肌注混合脂质体吸附后的Poly I:C能被动或主动传递到抗原呈递细胞(APC)，限制其与非特异性吞噬细胞的相互作用，并调节由此产生的细胞因子分泌特征。本品的毒理学研究已证实将Poly I:C吸附于混合脂质体上能有效提高产品的安全性。

游离的QS-21会与细胞膜上的胆固醇结合，形成不可逆的复合物，当其与红细胞结合后会造成溶血现象。当QS-21与混合脂质体中的胆固醇发生吸附后，阻止了其与细胞膜的结合，从而显著降低了溶血活性。试验证明本发明所述佐剂系统中胆固醇加入量至少可以吸附成品3倍剂量的QS-21，而不引起溶血现象，说明胆固醇含量是过量的，能够降低由QS-21的溶血活性引起的潜在风险，提高了工艺的安全边界。

使用单一的免疫增强剂(Poly I:C或QS-21)与混合脂质体组合配制的疫苗均能够诱导产生较高水平的结合抗体和较高频数的CD4+T细胞反应，当两种免疫增强剂同时与混合脂质体组合配制的疫苗诱导产生了更高水平的结合抗体及更高频数的CD4+T反应，说明了Poly I:C与QS-21存在协同作用。因此，两种免疫增强剂联用更有助于提高本品的免疫原性和CD4+T细胞的数量，详见实施例4的内容。

选择聚山梨酯80(Tween-80)是为了避免成品出现絮状聚集物，组氨酸为疫苗的缓冲液成分。氯化钠用于调节疫苗的渗透压，维持体系渗透压(210～350mOsmol/kg)。蔗糖能够维持脂质体的稳定性。

具体的，每1ml制剂中，活性成分和辅料具体信息见下表2：

表2、疫苗制剂中的各个成份含量列表

DOPC：二油酰基磷脂酰胆碱；

DOTAP：1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷；

胆固醇；

上述辅料为市售符合药典标准的产品即可，具体的的质量标准可参考《中国药典》(2020年版四部通则2302/0401/0402/0406/0502/0512/0521/0612/0631/0633/0713/0822/0821/0831//0832/0841/0861/0901/1105/1106/1143/等)的相关规定；

Poly I:C：聚肌胞；

QS-21：皂树皂苷21，该辅料以南美皂树提取出来的皂素粗品为原料，经溶解过滤、有机提纯、超滤置换、除菌过滤后获得QS-21。具体生产工艺见申请人同日提交的专利申请：“一种QS21免疫佐剂的制备方法”

实施例3、带状疱疹疫苗制剂的制备及性质测试

疫苗制剂的配制步骤如下：

3.1、阳离子脂质体的制备；

由1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇按照质量比为2:2:1进行配制，通过乙醇注入法进行制备，具体制备步骤如下：

(1)三种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切，1～3次；

(5)使用无菌过滤器过滤除菌。

制备得到的阳离子脂质体的理化参数为：

平均粒径(D50)：60～120nm；

溶液pH值：5.5～7.0；

Zeta电位：38～52mV(pH6.5)。

2-8℃下保存，长期稳定性考察12个月后，阳离子脂质体形态、成份稳定。

3.2、中性脂质体的制备；

中性脂质体由二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)与胆固醇组成的脂质双分子层的球状物，其中DOPC与胆固醇的质量比为4:1，具体制备步骤如下：

(1)两种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切加入1～3次；

(5)使用无菌过滤器过滤除菌。

制备得到的中性脂质体的理化参数为：

平均粒径(D50)：80～140nm；

溶液pH值：5.5-7.0，优选为6.4-6.6；

3.3、疫苗制剂的配制

疫苗制剂的各成分最终的含量如实施例2的表2所述比例进行配制：

阳离子脂质体、中性脂质体及各组分辅料按照表2浓度计算的加入量加入，再分别加入QS-21、Poly I:C与gE抗原溶液，调节pH6.0-7.0。

完整的疫苗制剂的制备流程如图6所示。

3.4、疫苗制剂的质量检测

按照上述方法制备多个批次的疫苗制剂，具体如下表3所示

表3、疫苗制剂生产批次记录

对产品进行质量检测，检测各个主要成份的含量，检测结果如下表4所示

表4、疫苗制剂质量检测结果

实施例4、带状疱疹疫苗制剂的性质测试

选择本发明配方的疫苗，氢氧化铝佐剂配方(gE/纳米型氢氧化铝佐剂/QS-21/Poly I:C)作为对照组1，配方作为对照组2，中性脂质体配方(gE/中性脂质体/QS-21/Poly I:C)作为对照组3；考察免疫小鼠后的效果，结果显示，

(1)四种不同配方配制的gE抗原疫苗免疫小鼠均能够刺激产生较高滴度的结合抗体，本发明的混合脂质体配方优于其它配方；检测结果详见图3，图中：

所有参比制剂组别中的gE抗原浓度一致(100ug/ml)；

MPL、3M-52(TLR7/8激动剂)、氢氧化铝、Poly I:C为免疫佐剂；

gE组为不含脂质体制剂的纯抗原溶液；

纳米乳剂组为水包油制剂配方；

中性脂质体的配方和制备方法如实施例3第3.2节所述，中性脂质体的参比制剂中的中性脂质体用量与纳米乳剂组一致；

所有组别中使用的缓冲液、溶剂、QS-21、Poly I:C(除Poly I:C高低剂量组外)保持一致，成份用量见表2。

(2)本发明的混合脂质体配方、中性脂质体配方和配方均能够诱导刺激产生CD4+T细胞应答，各组间无明显差异，但均优于氢氧化铝配方组，检测结果详见图4，图中：

所有参比制剂组别中的gE抗原浓度一致(100ug/ml)；

空白对照为不含抗原，但疫苗制剂为完整配方；

病毒对照为仅含有抗原，但不含混合脂质体、Poly I:C与QS-21；

欣按立适为市售疫苗产品组；

混合脂质体组为实施例3第3.3节中记载的阳离子脂质体和中性脂质体混合配方；

所有组别中使用的缓冲液、溶剂、QS-21、Poly I:C保持一致，成份用量见表2。

实施例5、不同制剂疫苗的性质比对

5.1、免疫增强剂协同效果

为了研究单一免疫增强剂(Poly I:C或QS-21)对疫苗免疫原性的影响，以及配方中Poly I:C和QS-21对疫苗免疫原性是否有协同作用。在实施例2确定的疫苗配方和实施例3确定的制备路线的基础上，用单一免疫增强剂(Poly I:C或QS-21)与混合脂质体的疫苗配方，与同时含有Poly I:C、QS-21和混合脂质体的疫苗配方进行了免疫原性的比较。

免疫增强剂与脂质体组合配制疫苗均能够诱导产生较高水平的结合抗体，诱导产生较高频数的(IL-2/IFN-γ)CD4+T细胞反应，但gE/复合佐剂候选疫苗诱导产生更高水平的结合抗体及更高频数的(IL-2/IFN-γ)CD4+T反应，证明Poly I:C与QS-21存在协同作用，对比结果详见图5，图中：

各个参比组制剂的制备方法见实施例3，具体的制剂成份差异为：

空白对照组：不含抗原，但疫苗制剂为完整配方；

gE缓冲液组：不含混合脂质体、Poly I:C与QS-21；

gE混合脂质体组：混合脂质体制剂，但不含Poly I:C与QS-21；

gE混合脂质体/QS-21组：混合脂质体制剂，不含Poly I:C；

gE混合脂质体/Poly I:C组：混合脂质体制剂，不含QS-21；

gE混合佐剂组：实施例3制备的完整制剂。

5.2、Poly I:C、QS-21的剂量优化

5.2.1、Poly I:C的剂量优化

比较不同含量Poly I:C(400μg/ml，800μg/ml，1600μg/ml)配制的gE/复合佐剂候选疫苗的免疫原性，以确定疫苗配方中Poly I:C含量。

含有不同剂量Poly I:C的gE/复合佐剂候选疫苗均能产生较高水平的结合抗体，各组间无明显差异，均能够诱导产生较高频数的(IL-2/IFN-γ)CD4+T细胞反应。考虑到使用混合脂质体可以提高Poly I:C的稳定性和传递效率，因此将疫苗中Poly I:C含量暂定为800μg/ml。

5.2.2、QS-21的剂量优化

比较不同含量QS-21(100μg/剂，50μg/剂，25μg/剂，12.5μg/剂)配制的gE/复合佐剂候选疫苗的免疫原性，以确定疫苗配方中QS-21含量(每剂0.5ml)。

含有不同剂量QS-21的gE/复合佐剂候选疫苗免疫后，均能够刺激产生较高水平的结合抗体；试验各组均能够诱导刺激产生(IL-2/IFN-γ)CD4+T细胞反应。参考配方，将本品中QS-21浓度暂定为50μg/剂(100μg/ml)。

5.3、抗原含量研究

本疫苗为含新型佐剂的液体制剂，根据《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》的要求，比较了不同含量gE抗原(100μg/剂；50μg/剂；25μg/剂；5μg/剂，0ug/剂，每剂为0.5ml)配制的四组gE疫苗和纯佐剂对照，研究gE抗原含量对疫苗免疫原性的影响。

在本试验抗原含量研究范围内，不同含量gE抗原配制的gE疫苗均能够诱导产生较高水平的结合抗体及较高频数的(IL-2/IFN-γ)的CD4+T细胞反应。体液免疫与细胞免疫结果显示，50μg/剂及以上的gE抗原含量能够诱导产生良好的免疫反应。最终确定抗原为50μg/剂(浓度为100ug/ml)。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

序列表

<110> 成都迈科康生物科技有限公司

<120> 一种带状疱疹疫苗制剂及其制备方法

<130> TBD

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> Varicella zoster

<400> 1

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys

180 185 190

His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu

195 200 205

Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly

210 215 220

Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu

245 250 255

Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn

260 265 270

Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr

275 280 285

Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro

290 295 300

Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val

305 310 315 320

Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys

325 330 335

Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro

340 345 350

Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr

355 360 365

His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr

370 375 380

Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln

385 390 395 400

Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser

405 410 415

His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr

420 425 430

Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe

435 440 445

Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val

450 455 460

Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro

465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr

485 490 495

Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr

500 505

Claims

1.一种重组带状疱疹疫苗制剂，其特征在于，以每毫升疫苗制剂计算，所述的制剂中包含：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白抗原，含量为75-130ug/ml；

（2）用于保持gE蛋白抗原稳定性的药用辅料组合，所述的药用辅料组合包含：

1）聚山梨酯80，200-600 μg/ml；

2）组氨酸，800-1000 μg/ml；

3）蔗糖，40-100mg/ml；

4）氯化钠，1.5-6.5mg/ml；

（3）用于提高抗原诱导的抗体水平和细胞免疫水平的疫苗佐剂，所述的疫苗佐剂包含：

1）DOTAP，70-240 μg/ml；

2）DOPC，500-2000 μg/ml；

3）胆固醇，175-600 μg/ml；

4）QS-21，50-120 μg/ml；

5）Poly I:C，400-900 μg/ml；

疫苗制剂的制备方法，包括如下步骤：

1）将抗原原液、QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及其他辅料成份混合并搅拌均匀制成半成品；

2）分装后获得重组带状疱疹疫苗制剂成品；

所述的阳离子脂质体中：DOTAP、DOPC和胆固醇的质量比为2:2:1；

所述的中性脂质体中：DOPC和胆固醇的质量比为4:1。

2.根据权利要求1所述的重组带状疱疹疫苗制剂，其特征在于，以每毫升疫苗制剂计算，所述的制剂中包含：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的gE蛋白抗原，含量为95-110ug/ml；

1）聚山梨酯80，450-550 μg/ml；

2）组氨酸，850-950 μg/ml；

3）蔗糖，52-55mg/ml；

4）氯化钠，2.5-5mg/ml。

3.权利要求1或2所述的一种重组带状疱疹疫苗制剂，其特征在于，所述的抗原原液为：gE蛋白抗原溶解保存于抗原缓冲液中，所述的抗原缓冲液为包含如下成份的水溶液：10%蔗糖、10mM组氨酸、0.025%Tween-80；抗原溶液pH6.5。

4.权利要求1-3任一所述的重组带状疱疹疫苗制剂的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）向纯化后的抗原溶液中按照所述抗原缓冲液的配方添加蔗糖、组氨酸和Tween-80，调节pH后制得抗原原液；

（2）分别制备阳离子脂质体和中性脂质体；

（3）将抗原原液、QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及其他辅料成份混合并搅拌均匀制成半成品；

（4）分装后获得重组带状疱疹疫苗制剂成品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的阳离子脂质体的制备方法为：

由1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷、二油酰磷脂酰胆碱和胆固醇按照质量比为2:2:1进行配制；三种脂质成份分散均匀后，使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法或逆向蒸发法制备脂质体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用乙醇注入法进行所述的阳离子脂质体的制备，制备方法为：在超滤后依次使用孔径为200nm、100nm的挤出膜进行挤出成型，最后通过无菌过滤器过滤除菌。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述阳离子脂质体的制备步骤如下：

（1）三种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切1~3次；

（2）使用蔗糖组氨酸缓冲液超滤置换，浓缩倍数2~4倍，洗滤倍数6~8倍；

（3）200nm脂质体挤出，使用孔径为200nm的滤膜进行挤出，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

（4）100nm脂质体挤出，使用孔径为100nm的滤膜进行挤出，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

（5）使用无菌过滤器过滤除菌；

制备得到的阳离子脂质体的理化参数为：

平均粒径：60～120nm；

溶液pH值：5.5～7.0；

Zeta电位：38～52mV；

pH6.5。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的中性脂质体的制备方法为：

由二油酰磷脂酰胆碱和胆固醇按照质量比为4:1进行配制，脂质成份分散均匀后，使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法或逆向蒸发法制备脂质体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，使用乙醇注入法进行所述的中性脂质体的制备，制备方法为：按照生产初乳、依次使用孔径为200nm、100nm的挤出膜进行挤出成型，随后进行超滤、过滤除菌即得。

10.根据权利要求4、8、9任一所述的方法，其特征在于，所述中性脂质体的制备步骤如下：

（1）两种脂质成份溶于乙醇中，与水相在线剪切1~3次；

（2）200nm脂质体挤出，使用孔径为200nm的滤膜进行过滤，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

（3）100nm脂质体挤出，使用孔径为100nm的滤膜进行过滤，进行多次循环挤出，控制粒径均匀性；

（4）使用蔗糖组氨酸缓冲液超滤置换，浓缩倍数3~6倍，洗滤倍数6~8倍；

（5）使用无菌过滤器过滤除菌；

制备得到的中性脂质体的理化参数为：

平均粒径：80～140nm；

溶液pH值：5.5-7.0。

11.权利要求1-3任一所述的重组带状疱疹疫苗制剂的如下应用：

（1）制备药物或疫苗，所述的药物用于治疗或预防由水痘带状疱疹病毒引起的疾病；

（2）制备联用型药物或疫苗。