CN116747298B - 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体公开了一种水痘‑带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用，解决了现有技术中的基因工程重组亚单位疫苗抗原免疫原性较弱，以及使用的佐剂系统为传统铝佐剂，细胞免疫功能弱的技术问题。本发明中的融合蛋白可包含增强细胞及体液免疫功能的分子佐剂、提高抗原免疫原性的通用T细胞抗原表位肽和Th细胞辅助表位肽、增强抗原稳定性，提高抗原递呈效率及表达量的人免疫球蛋白Fc。融合蛋白配合创新的佐剂系统组成的疫苗，可以诱导产生强烈的细胞免疫和体液免疫。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）又称3型人疱疹病毒，是一种人类α疱疹病毒。水痘-带状疱疹病毒在正常人群中的原发性感染，会在儿童时期导致水痘。感染VZV后，病毒会于人体神经节内潜伏，当各种原因导致的免疫力下降时，病毒会再度被激活并大量复制，会导致带状疱疹（herpes zoster，HZ），并常常伴随有带状疱疹后遗神经痛（Post-herpetic neuralgia，PHN）。在免疫功能受损的人群中 VZV 感染可能伴有脊髓炎、脑髓炎等严重的并发症。VZV的基因组大小约为125kb，编码约69种蛋白，编码的糖蛋白有8个，包括gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL、gM；其中糖蛋白E(glycoprotein E，gE)是宿主免疫系统识别的主要糖蛋白，也是病毒包膜和感染细胞膜上抗原性最强、含量最丰富的糖蛋白，同时它还广泛存在于在VZV颗粒的表面和宿主细胞的细胞膜和胞质中，能诱导细胞免疫和体液免疫。
水痘-带状疱疹病毒的传染性极强，主要通过空气飞沫和直接接触传播，据报道全世界50岁以上成人中约有90%的血清VZV检测呈阳性。儿童感染VZV后会引起发热，并出现周身性红色斑丘疹、疱疹和痂疹，有自限性。随着年龄增长，机体免疫力下降，带状疱疹的发病率呈逐渐增加，随着现在生活节奏加快，生活压力增加，带状疱疹的发病呈现年轻化的趋势。水痘-带状疱疹的发病严重影响人们的生活质量，特别是PHN的存在，PHN是带状疱疹最常见的后遗症，在带状疱疹中的发生率为10%～30%，疼痛可持续数月至数年，最长可达10年。
目前被批准用于预防VZV感染的疫苗有两种，一种是VZV减毒活疫苗（Oka株），低剂量用于预防儿童水痘，高剂量用于预防带状疱疹；一种是配合佐剂系统使用的基因工程重组亚单位疫苗。默沙东公司高剂量（约20000PFU）减毒活疫苗产品 Zostavax，2005年被批准在50岁以上成人中用于预防带状疱疹，疫苗的不良反应主要以接种部位的疼痛、红斑和肿胀为主，大规模临床实验证明，在50-59岁年龄阶段人群中，疫苗的保护率为69.8%，大于60岁以上人群中保护率为51%，随年龄的增加保护率逐渐降低，≥80岁以上人群中保护率只有18%。在预防PHN方面，对≥60岁以上人群，疫苗保护率为39%。有文献报道Zostavax疫苗接种5～8年后疫苗效力持续下降，超过8年后统计学上不再显著，国内目前有长春百克的带状疱疹减毒活疫苗于2023年02月获批上市。
葛兰素史克公司的佐剂带状疱疹亚单位疫苗Shingrix于2017年经FDA批准上市，用于在50岁以上成人中预防带状疱疹。该疫苗有两部分组成，一是由CHO细胞表达的截短VZV糖蛋白E，一是AS01B佐剂系统。相对于减毒活疫苗Zostavax，佐剂亚单位疫苗Shingrix的副反应更严重，疫苗接种后7天内，试验组和安慰剂组受试者至少1种征集性症状的发生率分别为84.5%和33.7%，至少1种3级征集性AE的发生率分别为16.0%和2.5%。临床实验证明，该疫苗在≥50 岁的受试者中，对HZ 的总体保护率为 97.16%。按50-59岁、60-69岁、≥70岁分层分析，本品对 HZ的保护率在各年龄层相当，其中50-59岁 为96.57%，60-69 岁为97.36 %，≥70 岁为97.93 %。在预防PHN反面，在≥50岁正常人群中，Shingrix可使PHN的发病率降低91.2%。在≥70岁正常人群中，降低88.8%。对疫苗效力的持续研究表明，疫苗的有效性可持续10年以上。AS01B佐剂系统含有3D-MPL、QS-21以及磷脂酰胆碱、胆固醇等成分，能显著提高疫苗的效力，但它有个极大的缺点是副反应程度和发生率都高。
临床实验证明减毒活疫苗的副反应较小，但是保护效率及保护持久性较低，疫苗生产工艺复杂，放大生产受限；配合佐剂系统的重组亚单位疫苗，保护效率好持久性高，但疫苗副反应及强，佐剂系统中3D-MPL来源于沙门氏菌的脂多糖的脱毒产物，产量低，疫苗成本高。大量研究证明，细胞免疫功能在VZV感染中发挥着极其重要的作用，文献报道的其他基因工程重组亚单位疫苗，要么因抗原设计原因导致的抗原免疫原性较弱，要么是因为使用的佐剂系统为传统铝佐剂，细胞免疫功能弱，因此在预防水痘带状疱疹发病方面较弱。
公布号为CN110343722A的专利公布了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒v-Oka株截短型糖蛋白E的方法，该方法将截短的gE蛋白基因导入杆状病毒中，利用重构的杆状病毒感染昆虫细胞表达可溶性的gE蛋白。该方法易于筛选，批间稳定，但用昆虫细胞表达的蛋白相较于哺乳动物细胞糖基化方面有较大差异，且单独的蛋白并不能有效激活人体的体液及细胞免疫功能。
公布号为CN112870344A专利公开了一种重组水痘带状疱疹疫苗的制备方法，该方法在CHO细胞中表达截短gE和IgG抗体Fc段的融合蛋白gE-Fc。重组蛋白经一系列色谱纯化，并经过病毒灭活后，得到了高度纯化的融合蛋白质。融合蛋白配合铝佐剂免疫动物可以产生高效价的血清中和抗体。有大量研究证明，带状疱疹疫苗的作用主要是由其细胞免疫功能决定的，虽然融合蛋白中的Fc可提高一定水平的细胞免疫功能，但该发明中使用佐剂为铝佐剂，单独的融合蛋白配合铝佐剂，可能不能高效激活人体的细胞免疫功能。
白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）又称为T淋巴细胞生长因子，具有多重生物学功能，其中就包括促进T细胞增长（辅助性T细胞和细胞毒型T细胞），增殖及分化；促进B淋巴细胞的分化和分泌抗体；促进其他细胞因子释放；增强抗原递呈作用。有报道指出IL-2和狂犬病灭活疫苗一起使用，对小鼠的保护作用提高了25倍以上。IL-2与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D融合表达，使融合蛋白在体内的半衰期延长了4倍，且保护效果远远高于重组糖蛋白D。免疫球蛋白Fc与抗原融合表达时，抗原的半衰期会显著提高，蛋白稳定性得到加强，因Fc作用抗原形成了二聚体，免疫原性得到加强，同时融合蛋白的Fc区可以与抗原递呈细胞表面的Fc受体相结合，促进抗原递呈。在融合蛋白中加入特异性或非特异性的T细胞表位肽，如破伤风毒素通用T细胞表位肽P2，Th辅助表位Pan HLA DR-binding epitope(PADER)肽，可以增强与主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex,MHC）的结合能力,增强抗原的免疫原性，增强机体的体液免疫及细胞免疫水平。
佐剂的使用对基因工程重组亚单位疫苗极其重要，因为单独的抗原往往达不到疫苗免疫所需要的免疫原性，需要佐剂对其进行放大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法和应用，以解决现有技术中的基因工程重组亚单位疫苗抗原免疫原性较弱、使用的佐剂系统为传统铝佐剂，细胞免疫功能弱、以及使用复合佐剂系统，副反应高的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗，所述疫苗由水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E（gE）的融合蛋白和佐剂组合而成。
进一步的，本发明的含有VZV gE的融合蛋白，VZV gE为去掉信号肽囊膜外片段。
进一步的，本发明的含有VZV gE的融合蛋白，所述融合蛋白的亚单元包括IL-2、P2、PADRE或Fc。
进一步的，本发明的融合蛋白由含有VZV gE在内的三个以上亚单元任意组合而成。
进一步的，所述融合蛋白优选组合形式为IL-2-gE-P2、PADRE-gE-P2、IL-2-gE-Fc、PADRE-gE-Fc、P2-gE-Fc、IL-2-PADRE-gE-Fc、PADRE-gE-P2-Fc、P2-gE-Fc-Fc，氨基酸序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：13所示。
进一步的，所述融合蛋白亚单元间的接头序列为GGS和/或GGGS和/或GGGGS和/或GSGSG。
进一步的，所述融合蛋白由哺乳动物细胞表达。
进一步的，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，优选地为CHO-K1细胞。
进一步的，所述佐剂为氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、含有皂素的中性脂质体佐剂、含有皂素的阳离子脂质体佐剂、含有皂素的阴离子脂质体佐剂，CpG佐剂、纳米乳剂、含有3D-MPL的佐剂中的任意一种或任意多种组合使用。
进一步的，所述佐剂优选的为含有皂素的中性脂质体佐剂。
进一步的，所述佐剂系统为脂质体佐剂，脂质体佐剂的制备包括以下步骤：
S21,分别称取500-1000mgDOPC和100-300mg胆固醇，然后将DOPC和胆固醇完全溶于无水乙醇中，混合均匀，即为有机相；
S22,将有机相注入的pH为7.0的M PBS缓冲盐溶液中，制备成脂质体初乳；
S23,用高压微射流均质机整粒脂质体粒径至90-110nm；
S24,通过透析方法去除乙醇；最后使用0.22μm除菌滤器过滤除菌，制备成脂质体成品；
S25,按1：1的比例取制备好的脂质体和浓度为0.4mg/mL皂苷QS-21溶液，混合均匀，即制备成含有QS-21的脂质体佐剂。
进一步的，所述DOPC800mg，胆固醇200mg，无水乙醇10mL，有机相10mL， pH为7.0的10mM PBS缓冲盐溶液90mL。
进一步的，所述融合蛋白的制备方法包括下述步骤：
S1、对融合蛋白的基因进行密码子优化，不同亚单元之间用连接肽连接，全基因合成上述融合蛋白的基因序列，得到融合蛋白基因；
S2、将融合蛋白基因连接入表达载体中，构建成重组表达质粒；
S3、将重组表达质粒导入CHO细胞，经筛选后获得工程细胞；
S4、培养工程细胞，收集培养上清，对收集的上清对其进行纯化，得到所要表达的融合蛋白。
本发明提供的一种水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法，包括下述步骤：
S1,制备融合蛋白；
S2,制备佐剂系统；
S3,将融合蛋白与佐剂系统混合配制疫苗。
进一步的，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗的每个剂量单位中含有融合蛋白5～200μg，优选的，每个剂量单位中含有融合蛋白10～100μg，更优选的，每个剂量单位中含有融合蛋白20～80μg。
进一步的，所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗及其制备方法在预防或改善带状疱疹和/或带状疱疹后遗症的药物中的应用。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
（1）本发明提供的水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法及应用，抗原为融合蛋白，在其中融合表达了增强细胞及体液免疫动能的分子佐剂，提高CD4+T活化增强抗体及杀伤T细胞表达的通用T细胞抗原表位肽，增强抗原稳定性，提高抗原递呈效率及表达量的Fc。融合表达的元件均已经过临床实验证明其安全性。使得抗原在结构和机制上，在保持安全性的同时，既可以增强体液免疫反应，又可以增强细胞免疫反应，全面增强其免疫原性。本发明提供的基因工程重组亚单位佐剂疫苗成本低，副作用小，保护效率高。
（2）本发明提供的水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法及应用，疫苗配套使用的佐剂系统也做了相应创新，在GSK AS01B佐剂系统的基础上，去掉生产工艺复杂，产量低，副反应高的3D-MPL成分。保留主要佐剂成分QS-21，制备中性脂质体佐剂系统，在保持一定免疫增强的基础上，大大降低了疫苗的副反应作用。同时配合创新的融合蛋白，使疫苗在有效性上得到极大提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1是本发明实施例带His标签蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；图中M：蛋白标准品；R：还原电泳；N-R：非还原电泳；图1a1：gE蛋白电泳图；图1b1：PADRE-gE蛋白电泳图；图1c1：IL-2-gE蛋白电泳图；图1d1：gE-P2蛋白电泳图；图1e1：PADRE-gE-P2蛋白电泳图；图1f1：IL-2-gE-P2蛋白电泳图；
图2是本发明实施例Fc融合蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；图中M：蛋白标准品；R：还原电泳；N-R：非还原电泳；图2a2：gE-Fc蛋白电泳图；图2b2：PADRE-gE-Fc蛋白电泳图；图2c2：IL-2-gE-Fc蛋白电泳图；图2d2：P2-gE-Fc蛋白电泳图；图2e2：PADRE-gE-P2-Fc蛋白电泳图；图2f2：IL-2-PADRE-gE -Fc蛋白电泳图；图2g2：P2-gE-Fc-Fc蛋白电泳图；
图3是本发明实施例二次免疫后gE蛋白特异性血清GMT效价图；
图4是本发明实施例使用流式细胞仪检测分泌细胞的数量柱形图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当人认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
实施例1：制备水痘-带状疱疹病毒疫苗：
1、水痘-带状疱疹病毒gE融合蛋白表达质粒构建
（1）基因来源
检索NCBI数据库，选择Genbank上公布的天然水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E基因序列（登录号为AAY57677.1），人免疫球蛋白G1的Fc段基因序列(登录号为AJ294730.1)，人白细胞介素2（IL-2）基因序列（登录号为BC066254.1）和破伤风毒素通用T细胞表位肽P2基因序列（登录号为M12739.1）。gE蛋白序列去掉前面信号肽及后面胞内区域，共514个氨基酸，IL-2蛋白序列去掉前面的信号肽区域，共133个氨基酸。Th辅助表位Pan HLA DR-bindingepitope(PADER)肽来源于文献。
（2）融合蛋白表达质粒构建
根据哺乳动物偏好对融合蛋白的基因进行密码子优化，不同亚单元之间用柔性连接肽GSGSG或GGS连接。设计gE、PADRE-gE、IL-2-gE、gE-P2、gE-Fc、PADRE-gE-P2、IL-2-gE-P2、PADRE-gE-Fc、IL-2-gE-Fc、P2-gE-Fc、IL-2-PADRE-gE-Fc、PADRE-gE-P2-Fc、P2-gE-Fc-Fc等融合蛋白，在融合蛋白上加上信号肽，终止密码子等元件后全序列合成，连入pCDNA3.4载体，不含Fc片段的融合蛋白在其后加入6×His标签，便于后续纯化；构建的质粒进行测序验证；构建成功的重组质粒，大量抽提，过滤除菌后待用。
涉及到的序列如下：
水痘带状疱疹病毒糖蛋白E（gE）截短氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；人免疫球蛋白G1的Fc段氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；人白细胞介素2（IL-2）氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示；Th辅助表位Pan HLA DR-binding epitope(PADER)氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示；破伤风毒素通用T细胞表位肽P2氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：5所示；融合蛋白IL-2-gE-P2氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：6所示；融合蛋白PADRE-gE-P2氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：7所示；融合蛋白IL-2-gE-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：8所示；融合蛋白PADRE-gE-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示；融合蛋白P2-gE-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：10所示；融合蛋白IL-2-PADRE-gE-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：11所示；融合蛋白PADRE-gE-P2-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：12所示；融合蛋白P2-gE-Fc-Fc氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：13所示。
2、融合蛋白的瞬转表达及纯化
（1）细胞瞬转表达
用不含血清的化学限定培养基复苏一只ExpiCHO-S细胞，然后用该培养基将ExpiCHO-S细胞连续传代两次以上，当细胞密度到6×106个细胞/mL，细胞活率大于95%以上时可以进行转染操作。
转染前将ExpiFectamine CHO转染试剂管上下颠倒数次，轻轻混匀，分别取30μg左右的gE-His-pCDNA3.4、PADRE-gE-His-pCDNA3.4、IL-2-gE-His-pCDNA3.4、gE-P2-His-pCDNA3.4、gE-Fc-pCDNA3.4、PADRE-gE-P2-His-pCDNA3.4、IL-2-gE-P2-His-pCDNA3.4、PADRE-gE-Fc-pCDNA3.4、IL-2-gE-Fc-pCDNA3.4、P2-gE-Fc-pCDNA3.4、IL-2-PADRE-gE-Fc-pCDNA3.4、PADRE-gE-P2-Fc-pCDNA3.4、P2-gE-Fc-Fc-pCDNA3.4质粒，用1mL冷的OptiPROSFM培养基将其稀释，轻轻吹吸混匀。每种质粒取80μL ExpiFectamine CHO转染试剂，加入920μL 冷的OptiPRO SFM培养基。立即将稀释的ExpiFectamine CHO转染试剂加入相应的质粒稀释液中，轻轻混匀，室温孵育3 min。将DNA-ExpiFectamine CHO试剂复合物逐滴加入至含有25mL细胞的125mL摇瓶中，缓慢晃动摇瓶。转染的细胞置于转速125rpm 温度37℃，二氧化碳浓度为8%的摇床中培养。
转染后次日每种质粒细胞摇瓶中加入150μL ExpiCHO增强剂和6mL ExpiCHOFeed，然后置于转速125rpm 温度37℃，二氧化碳浓度为8%的摇床中继续培养，转染后第5天每种质粒细胞摇瓶中加入4mLExpiCHO Feed，置于转速125rpm 温度33℃，二氧化碳浓度为8%的摇床中继续培养，至转染后第8天，离心取培养上清用于蛋白纯化。
（2）融合蛋白的纯化
带His标签融合蛋白的纯化：
采用Cytiva公司HisTrap HP 5mL预装柱进行纯化。分别用5倍柱体积的超纯水，洗脱缓冲液(20mmol/L PB，500 mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH7.4)，平衡缓冲液(20mmol/LPB，40 mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，pH7.4)清洗柱子，培养上清直接上柱，然后用平衡缓冲液洗脱未结合蛋白，用洗脱液线性进行线性洗脱结合蛋白，收集紫外吸收峰组分，用SDS-PAGE检测样品大小及纯度。如图1a1-f1所示，经纯化后的目的蛋白大小正确，纯度达到95％以上。
带Fc融合蛋白的纯化：
采用Cytiva公司HiTrap rProtein A FF 5mL预装柱进行纯化，分别用5倍柱体积的超纯水，洗脱缓冲液(100mmol/L柠檬酸，pH3.0)，平衡缓冲液(20mmol/L PB，500mmol/LNaCl，pH7.0)清洗柱子，培养上清直接上柱，然后用平衡缓冲液洗脱未结合蛋白，用洗脱液线洗脱目标蛋白，收集目标蛋白，用SDS-PAGE检测样品大小及纯度。如图2a2-g2所示，经纯化后的目的蛋白大小正确，纯度达到90％以上。
3、不同抗原及佐剂的重组疫苗配制
分别用融合蛋白与不同佐剂配伍免疫小鼠，测定其产生的抗体滴度，产生白介素-2和γ-干扰素的T细胞水平。该试验评估的佐剂包括氢氧化铝佐剂和含有QS-21的脂质体佐剂。每只小鼠免疫的疫苗含5μg融合蛋白，50微升的含有QS-21的脂质体佐剂或50微克氢氧化铝佐剂。
（1）含有QS-21的脂质体佐剂系统制备
分别称取800mg DOPC和200mg 胆固醇，然后将DOPC和胆固醇完全溶于10mL无水乙醇中，混合均匀，即为有机相；将10mL有机相注入90mL的pH为7.0的10mM PBS缓冲盐溶液中，制备成脂质体初乳；用高压微射流均质机整粒脂质体粒径至100nm左右；然后通过透析方法去除乙醇；最后使用0.22μm除菌滤器过滤除菌，制备成脂质体成品。按1：1的比例取制备好的脂质体和浓度为0.4mg/mL皂苷QS-21溶液，混合均匀，即制备成含有QS-21的脂质体佐剂系统。
（2）疫苗配制
与含有QS-21的脂质体佐剂系统配伍使用的疫苗：
制备的含有QS-21的脂质体佐剂分装至西林瓶中，向西林瓶中加入等体积的融合蛋白，混合均匀后制备成与含有QS-21的脂质体佐剂系统配伍使用的疫苗（gE浓度为100μg/mL；免疫增强剂皂苷QS-21为100μg/mL；脂质体成分：DOPC和胆固醇分别为2mg/mL和0.5mg/mL）。
与铝佐剂配伍的疫苗：
取氢氧化铝佐剂分装至不同的西林瓶中，磁力搅拌状态下，向西林瓶中加入融合蛋白，吸附30min后，制备成与铝佐剂配伍的疫苗（gE浓度为100μg/mL；铝1mg/mL）。
实施例2：进行动物免疫实验以及比较不同抗原及佐剂的重组疫苗免疫原性
实验小鼠采用6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠，在无特定病原体条件下进行，为模拟在自然环境中水痘-带状疱疹病毒的感染，在进行候选疫苗免疫前35天，用水痘-带状疱疹病毒（包含不少于3.3lg PFU活病毒，0.5mL）颈部皮下预敏免疫小鼠。在第0天和28天，腿部肌肉注射候选疫苗与对照疫苗(GSK公司上市疫苗)，注射剂量为每只小鼠50μL。在二免后28天采用眼球取血法采血，采血后处死小鼠。采集好的全血2～8℃下静置过夜，第二天3000rpm离心30min,吸取顶部血清。用间接ELISA法测小鼠血清效价，并计算GMT值。小鼠脾脏分离脾脏细胞，用胞内细胞因子染色法检测gE特异性分泌INF-γ和IL-2的CD4+T细胞数量，评价细胞免疫水平。
（1）与gE蛋白结合的血清效价检测
利用间接ELISA的方式检测所有个体小鼠（包括所有候选疫苗组和对照疫苗组）二免后28天血清样本中的总gE特异性抗体。流程为用碳酸盐缓冲液将gE蛋白包被至96孔板中，包被量为500ng/孔，4℃包被过夜，用含BSA的TPBS溶液封闭，TPBS溶液洗板3次，然后所有个体小鼠血清按不同稀释度稀释后，加入孔板中，37℃孵育1小时，TPBS溶液洗板3次，然后用HRP标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1小时，TPBS溶液洗板3次后用TMB显色液显色10min，加入0.2M硫酸终止反应，酶标仪读取OD450处数值。以一免前血清混合样品的读数的3倍作为Cut-Off值，判定免疫后血清效价。
免疫两次后，所用实验组小鼠均阳转。如图3所示，对各实验组测定的血清效价进行统计学分析显示，含有QS-21的脂质体佐剂系统实验组血清GMT效价明显高于铝佐剂系统实验组血清GMT效价。单独的gE蛋白加上含有QS-21的脂质体佐剂系统实验组血清GMT效价低于GSK疫苗实验组血清GMT效价。
当使用相同的含有QS-21的脂质体佐剂系统作为佐剂时，融合蛋白融合表达一个免疫增强亚单元的PADRE-gE组、IL-2-gE组、gE-P2组、gE-Fc组的血清GMT效价要高于单独的gE蛋白组，但低于GSK疫苗实验组。
当使用相同的含有QS-21的脂质体佐剂系统作为佐剂时，融合表达两个免疫增强亚单元的PADRE-gE-P2组、IL-2-gE-P2组、PADRE-gE-Fc组、IL-2-gE-Fc组的血清GMT效价要高于单独的gE蛋白组和融合一个亚单元实验组，P2-gE-Fc组的血清GMT效价略低于gE-Fc组，与IL-2-gE组持平，但高于单独的gE蛋白组和其他两个融合一个亚单元实验组。除P2-gE-Fc组外其他组均不低于GSK疫苗实验组。
当使用相同的含有QS-21的脂质体佐剂系统作为佐剂时，融合表达三个免疫增强亚单元的IL-2-PADRE-gE-Fc组、PADRE-gE-P2-Fc组、P2-gE-Fc-Fc组的血清GMT效价高于融合一或两个亚单元实验组，也高于GSK疫苗实验组。
（2）胞内细胞因子染色（Intracellular cytokine staining，ICS)及流式细胞检测实验
使用含有QS-21的脂质体佐剂系统作为佐剂的实验组，二免后28天小鼠取脾脏，制备脾单细胞悬液，调整细胞浓度后用裂红液裂解单细胞悬液中的红细胞，用特异性肽池刺激脾脏细胞，使其分泌细胞因子，加入Containing Brefeldin A分泌阻断剂后阻断分泌，然后经过细胞活死染色，表面受体FcR阻断，CD3、CD45、CD4表面染色，固定破膜和IL-2 、IFN-γ胞内染色等步骤后，利用流式细胞仪检测分泌IL-2 、IFN-γ的CD4+T细胞的数量。
如图4所示，结果显示单独的gE蛋白配合含有QS-21的脂质体佐剂系统的实验组或融合一个亚单元的（PADRE-gE、IL-2-gE、gE-P2、gE-Fc）融合蛋白配合含有QS-21的脂质体佐剂系统的实验组，gE特异性的分泌IL-2 、IFN-γ的记忆CD4+T细胞占总的记忆CD4+T细胞比例要小于GSK疫苗实验组。融合两个亚单元以上融合蛋白（PADRE-gE-P2、IL-2-gE-P2、PADRE-gE-Fc、IL-2-gE-Fc、P2-gE-Fc、IL-2-PADRE-gE-Fc、PADRE-gE-P2-Fc、P2-gE-Fc-Fc）配合含有QS-21的脂质体佐剂系统实验组，gE特异性的分泌IL-2 、IFN-γ的记忆CD4+T细胞占总的记忆CD4+T细胞比例要大于GSK疫苗实验组，且融合三个亚单元的实验组优于融合两个亚单元的实验组。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种水痘-带状疱疹病毒疫苗，其特征在于：所述疫苗由水痘-带状疱疹病毒VZV糖蛋白E的融合蛋白和佐剂组合而成，所述融合蛋白为IL-2-gE-P2、PADRE-gE-P2、IL-2-gE-Fc、PADRE-gE-Fc、P2-gE-Fc、IL-2-PADRE-gE-Fc、PADRE-gE-P2-Fc、P2-gE-Fc-Fc，其融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：13所示；所述佐剂为脂质体佐剂，脂质体佐剂的制备包括以下步骤：
S21,分别称取500-1000mgDOPC和100-300mg胆固醇，然后将DOPC和胆固醇完全溶于无水乙醇中，混合均匀，即为有机相；
S22,将有机相注入pH为7.0的PBS缓冲盐溶液中，制备成脂质体初乳；
S23,用高压微射流均质机整粒脂质体粒径至90-110nm；
S24,通过透析方法去除乙醇；最后使用0.22μm除菌滤器过滤除菌，制备成脂质体成品；
S25,按1：1的比例取制备好的脂质体和浓度为0.4mg/mL皂苷QS-21溶液，混合均匀，即制备成含有QS-21的脂质体佐剂。
2.根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗，其特征在于：所述融合蛋白由哺乳动物细胞表达，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
3.一种水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法，应用于制备权利要求1～2任意一项所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗，其特征在于：包括下述步骤：
S1,制备融合蛋白；
S2,制备佐剂系统；
S3,将融合蛋白与佐剂系统混合配制疫苗。
4.根据权利要求3所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法，其特征在于：所述水痘-带状疱疹病毒疫苗的每个剂量单位中含有融合蛋白5～200μg。
5.根据权利要求3所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法，其特征在于：所述融合蛋白的制备方法包括下述步骤：
S11、对融合蛋白的基因进行密码子优化，不同亚单元之间用连接肽连接，全基因合成上述融合蛋白的基因序列，得到融合蛋白基因；
S12、将融合蛋白基因连接入表达载体中，构建成重组表达质粒；
S13、将重组表达质粒导入CHO细胞，经筛选后获得工程细胞；
S14、培养工程细胞，收集培养上清，对收集的上清进行纯化，得到所要表达的融合蛋白。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的水痘-带状疱疹病毒疫苗的制备方法所制配的水痘-带状疱疹病毒疫苗在制备预防或改善带状疱疹和/或带状疱疹后遗症的药物中的应用。
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