CN112870344B

CN112870344B - 一种重组水痘带状疱疹病毒疫苗

Info

Publication number: CN112870344B
Application number: CN201911203663.2A
Authority: CN
Inventors: 孔健; 姜培红; 彭玲; 杨帅; 许磊涛; 张琨
Original assignee: Beijing Luzhu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Luzhu Biotechnology Co ltd; Lvzhu biopharmaceutical (Zhuhai) Co.,Ltd.
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: JP2022515271A; GB202108457D0; JP7337935B2; EP3906940A1; AU2020391074A1; GB2603974A; US20220363721A1; EP3906940A4; CA3125908A1; AU2020391074B2; WO2021103434A1; CN112870344A; KR20210102342A; US11993634B2

Abstract

本发明公开了一种重组水痘带状疱疹病毒疫苗，其包括减毒活VZV毒株(OKA株)基因的重组糖蛋白gE胞外区的氨基酸序列和人免疫球蛋白Fc段形成的融合蛋白，本发明进一步包括所述融合蛋白的制备和应用，以及相应的重组基因，真核表达载体等，本发明的融合蛋白具有较好的免疫原性，可诱导产生高水平的血清中和抗体。

Description

一种重组水痘带状疱疹病毒疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗制剂，特别设计能诱导机体免疫系统针对重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E融合蛋白产生中和抗体的疫苗制剂。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)是疱疹病毒属(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科成员，是一种直径150～200nm的双链DNA病毒，形态学上是由核酸内心、蛋白衣壳和包膜构成的同心圆状结构。VZV基因组为约125kb的线性双链DNA分子，包含一个约100kb的独特长片段(UL)和约5.4kb的独特短片段(US),他们被6.8kb的末端和内部重复序列隔开，共有72个开放读码框(Open reading frames,ORF)，除了编码与病毒复制、转录、包装、释放等生物活性相关的蛋白分子以及与宿主细胞相互作用的蛋白以外，还编码gB、gC、gE、gH、gI、gK、gL和gM共8种糖蛋白，这些糖蛋白在病毒的成熟与包装方面发挥着极为重要的作用。其中gE(glycoprotein E，gE)由ORF68基因编码，该基因由1872个碱基组成，位于VZV基因组的短片段区，编码的gE含623个氨基酸(amino acid,AA)。其N端为544个AA的亲水胞外区(含有信号肽)，C端是17AA的跨膜疏水区和62AA的胞内区。gE属于I型膜蛋白，是生成感染性VZV颗粒的必需糖蛋白，也是病毒包膜和感染细胞膜上抗原性最强、含量最丰富的糖蛋白，同时它还广泛存在于在VZV颗粒的表面和宿主细胞的细胞膜和胞质中，能诱导细胞免疫和体液免疫。

VZV病毒的糖蛋白E中包括两个抗原决定簇编码区e1和c1，在不同地区来源的VZV株间这些抗原决定簇是稳定的，具有较高的保守性，是比较合适的疫苗抗原候选亚单位。gE存在于VZV病毒颗粒的表面以及被感染细胞的表面和胞质内，在病毒的不同成熟阶段它以不同的含糖多肽形式存在。gE分子含运输信号，可参与病毒蛋白的装配和高尔基体中的包膜形成。在处于恢复期的水痘和带状疱疹患者的血清中，VZV抗体主要针对gB、gH和gE三种糖蛋白，尤其是以gE为主要靶点。gE诱导机体产生的特异性体液免疫和细胞免疫，能够保护机体免受病毒的攻击。gE含有磷酸化的高甘露糖O-链和N-链的复合型聚糖，可协同gI结合到人IgG的Fc段，gE和gI共价相连，在被感染细胞的表面发挥着Fc受体的作用。

VZV原发感染时通过呼吸道黏膜上皮进入局部淋巴结复制，感染病毒的淋巴细胞随后经淋巴循环进入血液循环感染外周血单核白细胞，病毒随血流播散至皮肤，临床表现为水痘。水痘痊愈后，病毒潜伏在颅脑神经节、脊髓后根神经节、自主神经元或肠道神经元。当机体抵抗力降低时，潜伏病毒被重新激活、复制，并沿外周神经移行至皮肤，临床表现为带状疱疹。

VZV传染性强，水痘或带状疱疹患者是唯一的传染源，VZV主要经空气飞沫和直接接触传播。水痘患者出现皮疹前2天通过唾液或眼液排出病毒。水痘或带状疱疹患者水疱液含有感染性病毒颗粒，呼吸时产生的飞沫被易感者吸入后可发生感染，也可经直接接触皮损水泡液传染，皮损越多传染性越强。易感者感染后可发生水痘，但不直接引发带状疱疹。

血清流行病学调查显示95％～97％的育龄妇女血清抗VZV抗体为阳性，因此婴儿出生后6个月内发生水痘病毒感染的几率很低。血清抗体阴性的成人、血清抗体阴性的孕妇所生小婴儿、免疫缺陷者、妊娠第4～5月患过水痘的孕妇所怀胎儿以及分娩前后患过水痘的母亲所生新生儿均容易发生严重的VZV原发感染。高龄人群、免疫缺陷者、母亲在妊娠期患过水痘的儿童以及生后一年患过水痘的儿童发生带状疱疹的风险升高。

北美和欧洲地区95％以上的年轻人血清VZV抗体阳性，因而有罹患带状疱疹的风险。如以人口基数进行统计，带状疱疹的发病率为3～5/千人年，其中亚太地区为3～10/千人年，韩国为10.4/千人年，日本为10.9/千人年，中国大陆和台湾地区分别为3.4～5.8/千人年和4.89～5.67/千人年。目前尚缺乏非洲地区带状疱疹发病率的资料。

带状疱疹患者约13％～47％有并发症或后遗症，主要累及神经系统和眼部。神经系统并发症包括带状疱疹后神经痛(PHN)、Ramsay-Hunt综合征、Bell面瘫、脑膜炎、脊髓炎和一过性脑缺血或中风。眼部并发症主要为眼带状疱疹。

PHN是最常见的带状疱疹后遗症，国际上较公认的定义是皮疹出现后疼痛持续超过90天。约30％～50％的PHN持续1年以上，少数可长达10年。带状疱疹患者发生PHN者约5％～30％，多数文献报告为10％～20％，中国大陆地区为8.6％～13.8％。PHN发生率随患者年龄增长而升高，在≥50岁患者约8％，在≥80岁患者高达33％。PHN易患因素比较明确的有高龄、前驱症状重、皮疹重、疼痛重和免疫力低下。三叉神经受累，伴SLE、糖尿病或神经精神异常者也易患PHN。

带状疱疹眼病(HZO)为潜伏的VZV被再激活和复制后累及三叉神经眼支所致。以人口基数统计，HZO发生率为30.9/10万，在≥65岁人群达104.6/10万。以带状疱疹患者基数统计，HZO发生率为10％～20％，也随年龄增长而升高。HZO临床表现依次为睑缘炎、角膜炎、结膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎或急性渐进性视网膜坏死。美国HZO患者约2.5％发生眼损害，其中6％致盲。约半数HZO患者有皮肤损害，约21％最终发展成PHN。

老年或免疫力低下患者还可出现带状疱疹反复发作，皮损播散或伴细菌感染或呈疣状增生，也可致病毒耐药。严重者甚至累及肺部、胃肠道、脑部等多个器官，在带状疱疹皮疹出现前发生肝炎、胰腺炎、肺炎、心肌炎、食管炎或消化性溃疡，容易误诊。

接种过VZV减毒株(OKA株)的人或自然感染VZV后可以获得保护性免疫。OKA株减毒活疫苗已被美国FDA、中国药品监督管理局、欧盟等机构批准用于儿童接种，以预防野生型水痘病毒感染儿童，高剂量的OKA株病毒减毒活疫苗已被美国FDA、欧盟批准用于预防50岁以上老年人，以预防或降低他们罹患带状疱疹病毒引起的肋间神经痛等带状疱疹病毒引起的疾病。目前，欧盟、美国等60多个国家和地区已推荐≥50岁免疫功能正常人群接种Zostavax预防带状疱疹和PHN。接种方法是在上臂三角肌区皮下注射单剂疫苗(0.65mL，含19，400PFU病毒)。偶出现头痛、注射局部反应等不良反应。经大规模多中心临床试验验证，50～59岁免疫功能正常人群接种后带状疱疹发病率降低69.8％，而≥60岁人群接种后带状疱疹发病率、PHN发病率和疾病负担分别下降51.3％、66.5％和61.1％。Zostavax的预防效率随接种者年龄增长而逐渐降低，严重免疫抑制和孕妇又是接种的禁忌症。因此，制备更加安全有效疫苗的需要尤为迫切。GSK公司开发的VZV gE重组蛋白和AS01B佐剂制备的带状疱疹亚单位疫苗，接种≥50岁免疫功能正常人群使带状疱疹和PHN的发病率分别降低97.2％和91.2％，接种≥70岁人群则分别降低89.8％和88.8％，效果优于减毒活疫苗Zostavax，应用前景可能更好。重组VZV病毒gE疫苗使用的AS01B稀释液中含有QS21、3D-MPL、以及磷脂酰胆碱等油性佐剂，尽管其效果明显优于VZV减毒活疫苗Zostavax，但它的最大缺点是导致注射部位产生暂时的结节或需要经过较长时间才能消退的结节。

CN102517302A公开了一种重组表达水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其应用。该方法是将去除跨膜区和胞内区并添加His标签的水痘-带状疱疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因导入宿主细胞中，经表达得到重组水痘-带状疱疹病毒截短型糖蛋白E。该表达方法有助于提高目的蛋白的表达量，简化了下游的纯化工作，可较容易地实现蛋白的规模化生产，以该重组蛋白作为捕获抗原可用于血浆样本中抗水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白的间接ELISA检测，可提高临床诊断VZV感染的准确性，并用于其它需要VZV特异性免疫球蛋白进行高通量检测的领域。由于此方法为原核表达的非糖基化蛋白质，主要用于VZV既往感染的检测，并不适用于制备需要复杂的糖基化才能产生血清中和VZV抗体的免疫组合物或人用疫苗。李福民等人公开了一种用PCR方法扩增VZV糖蛋白E基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1并用双酶切和测序方法鉴定。结果扩增的目的基因包括了全长的糖蛋白E基因，长度约1.9kb；并且成功构建了糖蛋白E基因重组表达载体(实用医院临床杂志，2006年02期)。伊兴旭等人公开了一种构建含有VZV gE胞外域基因的真核表达质粒pCDNA3.1-gE，测序后脂质体转染COS-7细胞，经G418筛选出稳定表达VZV gE的细胞株。采用RT-PCR法检测VZV gE的mRNA，免疫印迹和间接免疫荧光法检测gE的免疫反应性，表达产物经Ni⁺⁺-NTA柱纯化后包被ELISA板，对127份0～10岁正常儿童血清中VZV-IgG抗体水平进行检测。结果成功筛选出能够稳定表达VZVgE胞外域基因的COS-7细胞株，RT-PCR检测到gE的mRNA，经免疫印染和间接免疫荧光鉴定，所表达的gE具有免疫反应性，COS-7细胞株和其培养上清液中均有gE蛋白表达，表达量约为0.632μg/mL，纯度约为90％。ELISA实验检测了127份0～10岁儿童血清中VZV-IgG抗体，总阳性率为81.89％，特异度和灵敏度分别为93.75％和88.24％(安徽医科大学学报，2015年03期)。这些对VZV糖蛋白E的研究主要集中于实现真核细胞表达该蛋白质，表达产物的纯度很低，仅能满足作为检测实际的需要，远不能达到人用疫苗的质量要求，未见后续对表达产物进行纯化的研究，也未见用于人用疫苗的报道。

李春明等人公开了一种用Oka株VZV(VZV-Oka)感染人二倍体细胞(2BS株)，提取基因组DNA，以其为模板，PCR扩增gE537目的片段，克隆至载体pCI-neo，构建重组真核表达质粒pCI-neo-gE537-His。大量扩增后提取质粒，转染293FT细胞，瞬时表达，经镍柱纯化，获得目的蛋白gE537-His。纯化产物可与鼠抗gE糖蛋白单抗在相对分子质量约90KDa处的条带发生特异性结合，且可与mAb-10、mAb-12抗gE单抗发生反应(中国生物制品学杂志，2016年11期)。伊兴旭公开了一种VZVgE基因胞外域的克隆、表达方法，具体为：从临床采集带状疱疹患者的皮肤囊泡液接种至单层人胚胎成纤维细胞，进行病毒分离；对分离的病毒株进行特征性细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，间接免疫荧光和DNA测序鉴定。将确认的VZV临床分离株体外培养，PCR扩增VZV gE基因胞外域片段，分别构建原核表达质粒gE-pET-32a(+)和真核表达质粒gE-pCDNA3.1/myc-His(-)，测序后将原核质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导，获得VZV gE原核表达的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳、免疫印迹鉴定重组蛋白的特异性，利用Ni⁺⁺-NTA柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。将真核质粒用脂质体介导转染至COS-7细胞，经G418筛选出稳定表达VZV gE蛋白的细胞株，表达产物经Ni⁺⁺-NTA柱纯化；通过RT-PCR检测VZV gE基因的mRNA，免疫印迹和间接免疫荧光检测gE融合蛋白的免疫反应性。分别用纯化后的原核表达gE蛋白和真核表达gE蛋白免疫新西兰家兔，获得兔抗VZV gE多克隆抗体(安徽医科大学，硕博论文)。上述结果显示他们实现了VZV gE在动物细胞中的表达，但所得到的表达产物的纯度较低。

Fc受体在许多先天性免疫细胞表面都有表达，因此，Fc片段在DC靶向的研究中应用也很广泛，根据受体结合的抗体亚型的不同，Fc受体分为FcαR(IgA)、Fcα/γR(IgA andIgM)、FcεR(IgE)和FcγR(IgG)。此外，根据亲和力的不同，Fc受体还可以划分为高亲和力受体和低亲和力受体，高亲和力受体结合单克隆抗体，低亲和力抗体结合多克隆抗体。在靶向DC的研究中，靶向FcγR的应用最早，已公开发表的许多研究显示FcγR靶向可以在体外显著提高抗原递呈效率，促进抗原与MHC II的结合，靶向FcγR的抗原最终被递呈给CD4⁺T细胞，激活TH1信号通路(Dai X,Jayapal M,Tay HK,Reghunathan R,et al.Differentialsignal transduction,membrane trafficking,and immune effector functionsmediated by FcγRI versus FcγRIIa.Blood.2009；114:318-27.)。

将VZV gE(或其它病原微生物来源的抗原)与DC受体的单克隆抗体Fc片段融合表达，这样构建的融合蛋白通过DCs内化，在内吞途径中Fc重组蛋白或Fc偶联蛋白被细胞内蛋白酶降解，所形成的抗原肽即可加载到MHC-1和/或MHC-II分子上。这种经Fc介导的突出优势在于可以将抗原直接递送给抗原递呈细胞，提高了抗原递呈的效率，而且这种方法还可以通过靶向DC表面特定的受体来选择性激活特定的信号通路(Caminschi I,ShortmanK.Boosting antibody responses by targeting antigens to dendritic cells.Trendsin immunology.2012；33:71-7.)。

本发明将编码VZV病毒gE蛋白肽链的膜外区与编码人免疫球蛋白的CH2-CH3区的基因进行链接，将目的基因插入到真核细胞表达载体中，转染CHO细胞，成功的表达出了含VZV gE-Fc融合蛋白质。重组蛋白经亲和色谱、离子交换色谱柱、分子筛色谱纯化，并经过病毒灭活去除可能的病毒污染之后，得到了高度纯化的融合蛋白质。该融合蛋白质的Fc片段可以和人体内免疫系统的树突状细胞表面的Fc受体结合，增强了树突状细胞的抗原呈递效率，免疫后可以产生高效价的血清中和抗体。

发明内容

本发明涉及一种预防带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛(PHN)和/或减少其严重程度的方法，包括供给个体包含与减毒活VZV(OKA株)或全灭活VZV组合的VZV抗原或其重组免疫原性衍生物gE蛋白的免疫原性组合物。

本发明也涉及一种预防或改善带状疱疹重激活和/或带状疱疹后神经痛的方法，该方法包括递送给有需要的个体包含与佐剂组合的gE融合蛋白或其免疫原性衍生物或免疫原性片段的免疫原性组合物或疫苗。

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E-Fc基因融合蛋白，以实现获得高纯度的水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E在哺乳类动物中的表达产物。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种重组水痘-带状疱疹病毒疫苗制剂，其包括减毒活VZV毒株(OKA株)基因的重组糖蛋白gE胞外区的氨基酸序列和人免疫球蛋白Fc段形成的融合蛋白，所述融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

本发明所述的疫苗制剂，还含有疫苗佐剂。所述疫苗佐剂选自：氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂，或氢氧化铝和磷酸铝佐剂的混合物。

本发明所述的疫苗制剂，其中每个剂量单位中含有融合蛋白5～200μg。

本发明所述的疫苗制剂，优选的，其中每个剂量单位中含有融合蛋白10～100μg。

本发明所述的疫苗制剂，更有选的，其中每个剂量单位中含有融合蛋白20～60μg。

本发明所述的疫苗制剂，还含有其它能增强免疫原性的物质，包含但不限于：磷脂酰胆碱、卵磷脂、3D-MPL、长链脂肪酸(酯)、矿物油、植物油、甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、以及含有胆固醇的脂质体的组合物。

本发明所述的疫苗制剂，为冻干制剂。所述冻干制剂，使用前用加入氢氧化铝佐剂混悬液溶解，混合均匀后，肌肉或皮下注射。

本发明进一步提供一种重组基因，其可以表达本发明所述的融合蛋白，其DNA序列为SEQ ID No.2。

本发明所述的融合蛋白(后简述为gE-Fc或VZV gE)表达载体为将gE-Fc融合基因插入到真核哺乳类细胞表达载体中所形成的。

本发明所述的融合蛋白，是一种能高效引发人体的免疫系统产生免疫应答的外源性抗原或其衍生物，所述免疫应答指的是能诱导机体的免疫系统应答，产生高效价的血清中和抗体。这样的应答可以降低人群带状疱疹疾病的发病率，或可以减轻带状疱疹所致肋间神经痛等疼痛或症状的缓解。利用本领域的通用技术如血清中和抗体水平或VZV gE(糖基化蛋白)ELISA抗体水平测定来评估免疫应答的改善，或利用已知临床判定标准评估在临床症状或体征水平上的改善。

作为一种优选的实施方式，上述表达产物可与铝佐剂或其它增强免疫原性的药物混合，制备用于50岁以上老年人预防带状疱疹引起的肋间神经痛等感染性疾病，同时它也可用于婴幼儿预防水痘-带状疱疹病毒引起的感染。

与各种病毒的保护性抗原一样，VZV的保护性抗原也属于糖蛋白特别是糖蛋白gE这种VZV的主要糖基化蛋白，它多样化的糖基化形式形成了VZV的主要中和抗原，已有的研究证实针对gE蛋白的血清抗体是可以中和VZV。

其它适合的抗原还包括各种糖蛋白，例如gB、gH、gC、gI、IE63(如参见Huang等J.Virol.1992，66：2664，Sharp等J.Inf.Dis.1992，165：852，Debrus，J Virol.1995 May；69(5)：3240-5及其中的参考文献)、IE62(如参见Arvin等J.Immunol.1991 146：257，SabellaJ Virol.1993Dec；67(12)：7673-6及其中的参考文献)、ORF4或ORF 10(Arvin等ViralImmunol.2002 15：507.)，但这些糖蛋白在VZV膜上的丰度低于gE的丰度，不构成机体产生VZV中和抗体的主要来源。

本发明实现了VZV糖蛋白E基因在哺乳类动物表达系统中的高效表达，在不改变其氨基酸序列的情况下，我们根据CHO细胞偏爱的密码子优化密码子合成VZV糖蛋白E胞外区基因，构建gE-Fc融合基因后再以此构建真核表达载体，并将其转染CHO K1细胞，利用Protein A亲和色谱HPLC检测其蛋白表达情况，利用ELISA检测VZV gE和人抗水痘病毒特异性免疫球蛋白的结合活性，证实成功实现了VZV糖蛋白E基因在CHO细胞中的分泌表达。将高度纯化后的VZV gE免疫家兔、BALB/C小鼠，免疫血清中和OKA株病毒的血清中和试验证明所表达的VZV gE-Fc蛋白具有很好的免疫原性，免疫2次以后可以产生高效价的血清中和抗体。

VZV gE抗原的用量应为能诱导机体产生免疫保护性应答而无明显不良副作用的剂量。抗原的使用量随所使用的佐剂以及其所存在方式的不同而改变。一般而言，可以预计每剂可能包含VZV gE约为2～1000μg；在人体中使用时，为了减少注射次数，可以使用铝佐剂进行吸附，在使用铝佐剂吸附时，预计使用5～200μg VZV gE即可产生高效价的中和抗体，优选的剂量可能为10～100μg，适当的免疫剂量可能为约10μg、25μg、50μg、100μg VZVgE、或约200μg VZV gE，成人中最佳的剂量可能为50μg或100μg VZV gE；婴幼儿中最佳的剂量可能为10μg、20μg VZV gE。

本发明的疫苗制剂的给药方式，包括例如，局部、鼻内、粘膜、真皮内、腹膜内、皮下和肌肉内注射给药。

本发明的疫苗制剂，任选地与佐剂和/或(其他)合适的载体组合。

在利用加强免疫方案情况下，或在利用多次接种方案的情况下，可使用2、3、4或更多次免疫接种。适合于激发加强的方案包括在每次免疫接种之间间隔1、2、3或6个月。

VZV gE包膜外区的序列为具有本发明附件1中所列的序列的一部分，VZV gE的完整序列最早发表在于病毒研究(Virus Research，Haumont等Vol.40，1996p 199-204)。除非上下文另有明确的标示，在下文中所涉及的VZV gE或gE包括截短的VZV gE或VZV gE-Fc的其它片段或衍生物。

gE或其衍生物或片段是液体的或冻干的，在另一方面，gE或其衍生物gE-Fc或其片段、聚合物可存在于含有铝佐剂的混悬液中，也可以存在于含其它免疫增强剂成分的溶液中(例如含有QS21、胆固醇、矿物油、植物油、鱼油、长链脂肪酸、长链脂肪酸酯、和3D-MPL佐剂等)的溶液或混悬液中。

gE或其衍生物可以包裹在聚乳酸微载体内，也可以包裹在乙交酯/丙交酯共聚物形成的微载体内，所形成的微载体肌肉或皮下注射后，可在一定的时间缓慢释放所包裹的重组蛋白药物，刺激机体的免疫系统产生抗体。

与现有技术相比本发明具有以下优势：

1.本发明选用哺乳类动物细胞(CHO)高效表达了分泌型的gE-Fc融合蛋白，所获得的目标产物为糖基化蛋白，表达产物主要为二聚体，单体次之；每个二聚体形式的分子中含4个分子的gE，本发明生产的融合蛋白的分子量大，免疫原性强。

2.本发明的gE-Fc为VZV gE的膜外区与人免疫球蛋白Fc片段(CH2-CH3区)的融合蛋白，可以采用商品化的Protein A亲和色谱填料进行高效率的初步分离纯化，最大限度的减少环境污染物的排放，为环境友好型的分离工艺，有利于后续步骤采用离子交换色谱、分子大小排阻色谱等对目标蛋白进行进一步的纯化；

3.本发明的CHO细胞表达的重组gE-Fc融合蛋白质为糖基化蛋白，保持了天然gE蛋白质的空间结构，免疫原性好，具有大规模推广的前景和优势。

4.由本发明提供的gE-Fc融合蛋白的Fc可以和人体内免疫系统中存在的抗原呈递细胞表面的Fc受体结合，主动地呈递gE抗原。动物免疫原性实验结果表明，以本分明的重组CHO细胞生产的gE-Fc蛋白为抗原，在不使用油性佐剂及免疫刺激物的情况下免疫家兔、小鼠后仍可以产生高效价的血清中和抗体；

附图说明

图1 VZV gE-Fc质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测

泳道1：DL10000 DNA Marker(10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、500bp和250bp)

泳道2-3：质粒pUC57-gE-Fc酶切产物

泳道4-5：质粒pXC-K383L酶切产物

图2 VZV gE-Fc重组质粒菌落PCR筛选阳性克隆

泳道2-7：菌落PCR筛选随机挑取的6个克隆gE-Fc-1～6

图3质粒表达载体线性化酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测

泳道2：质粒pXC4-VZV gE-Fc

泳道3：线性化后的质粒VZV gE-Fc-直

图4.亲和色谱纯化后的重组VZV gE蛋白质的HPLC-SEC色谱图

图5.重组VZV gE蛋白质的HPLC-SEC色谱图

图6.各剂量VZV gE铝佐剂疫苗免疫小鼠后的血清抗体效价(几何平均滴度GMT)

图7.重组VZV gE铝佐剂吸附疫苗免疫BALB/C小鼠后的血清中和抗体效价测定

图8不同剂量的VZV gE铝佐剂疫苗免疫BALB/C小鼠后的中和抗体几何平均效价

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、质粒表达载体的构建：

1.基因序列来源

本发明所述的水痘带状疱疹病毒E蛋白(VZV gE)是gE蛋白的胞外区(ECD，31-546aa)，共516个氨基酸；Fc段为人IgG1 Fc，共232个氨基酸(附录：氨基酸序列1)。将水痘带状疱疹病毒E蛋白基因和人IgG1的Fc的基因进行串联(附录：DNA序列2)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成VZV gE-Fc融合蛋白基因序列并连接至pUC57-1.8K载体上，所合成的基因包括酶切位点、Kozak序列、信号肽、目的基因(2244bp)以及终止密码子，全长共2355bp。该重组基因合成时进行了密码子优化以利于在中国仓鼠卵巢细胞Cricetulusgriseus(CHO细胞)中表达。

2.含VZV gE-Fc基因表达质粒的构建

将金斯瑞生物技术有限公司提供的含有重组基因的甘油菌菌种接种于LB(Amp+)培养基中，37℃，180rpm培养15h，利用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.4.0提取质粒pUC57-gE-Fc；利用HindIII和EcoR双酶切质粒pUC57-gE-Fc，获得目的基因片段gE-Fc-H/E(大小约为2300bp)，酶切哺乳类动物细胞表达质粒pXC-K383L获得载体片段pXC-H/E(大小约为7000bp)；酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测见图1。

利用TaKaRa MiniBest Agarose Gel Extraction Kit回收目的片段(图1箭头所示)。采用粘端连接技术，将回收的酶切产物gE-Fc-H/E和pXC-H/E通过TaKaRa DNALigation Kit LONG(TaKaRa)在16℃条件下连接反应6h后转化感受态DH5α，37℃倒置培养15h；通过菌落PCR筛选(图2)出两个克隆gE-Fc-1和gE-Fc-2；以pXC-F和pXC-R为引物，以质粒gE-Fc-1为模板PCR扩增目的基因，大小约为2400bp；扩增产物由北京华大基因完成测序，加测两个反应将序列测通；利用软件BioEdit7.0.9.0分析测序结果，克隆gE-Fc-1的序列与设计的序列完全一致。测序引物为：

pXC-F：5’-TAACAGACTGTTCCTTTCCATG-3’

pXC-R：5’GTAAAACCTCTACAAATGTGGT-3’

1-F：5’-AGCACATCTGCCTGAAGC-3’

1-F1：5’-GCTTATTGTCTGGGCATCT-3’

将克隆gE-Fc-1接种于300ml LB(Amp⁺)培养基中，37℃、180rpm培养16h，利用大量/大型质粒提取试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司)提取质粒pXC-VZV gE-Fc；质粒经内切酶PvuI(TaKaRa)线性化后，采用苯酚/氯仿/异戊醇进行抽提纯化、乙醇沉淀后复溶于1ml无菌的TE Buffer缓冲液(TaKaRa)中。质粒pXC-VZV gE-Fc及线性化后的质粒VZV gE-Fc-直的凝胶电泳检测见图3。

实施例2、稳定克隆株的建立、筛选

在无菌层流工作台内，设定基因脉冲发生器Xcell(Bio-Rad)的穿孔电压为300V电压、900μF单脉冲、电阻无穷大，取出间隙为4mm的一次性电击杯(Bio-Rad)，加入40μg直线化的质粒DNA(100μl)及0.7ml CHO K1细胞悬液(1.5×10⁷cells/ml)，通过电转染的方法将线性化后的质粒VZV gE-Fc-直转染至CHO K1细胞内，将电击杯内的细胞转移至三角培养瓶内，加入30ml CD CHO培养液(GIBCO)，于36～37℃、5％CO₂摇床上培养，135转/分钟，培养24小时之后，低速离心收集细胞，更换为含50μM MSX的CD CHO培养液(不含谷氨酰胺)，通过有限稀释法将细胞转入96孔平底培养板内，将培养板置于37℃、10％CO₂培养箱内培养，倒置显微镜下观察，标记单克隆细胞孔，之后通过ELISA的方法(羊抗人IgG+表达产物VZV gE-Fc+羊抗人IgG-HRP)和protein A HPLC方法筛选出表达量较高的单克隆株，连续传代培养、检测，最终获得了3个高表达目的基因的细胞克隆株，克隆编号分别为5B3、8D8和12C3；根据补料试验及HPLC检测培养上清中重组蛋白的表达量，选择5B3克隆株进行放大试验。

实施例3、目标产物的表达及纯化

将获得的5B3克隆株接种到含500ml CD CHO培养液的2L三角瓶内，旋紧透气瓶盖，于36～37℃、5％CO₂、135r/min的回旋式摇床上培养，培养4天之后，将5B3细胞转移到一个内含2.0L CD Opti-CHO培养液的5L全自动生物反应器内，培养参数设定为转速60r/min、温度36.5℃、pH7.0～pH7.4、溶解氧DO 40％～60％，逐日取样检测细胞活性、细胞密度、葡萄糖含量，培养4天之后活细胞密度升到5×10⁶～7×10⁶cells/ml，补加200ml～300ml CDEfficient Feed C，之后隔日补加1次，每日测定培养液中的葡萄糖含量，如果葡萄糖含量低于11.1mmole/L，则通过蠕动泵补加40％葡萄糖溶液到全自动生物反应器内，直到葡萄糖含量达到22mmole/L；培养12～14天，当活细胞占比降至60％～70％时终止培养，12000r/min高速离心(或使用3M深层滤器)去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清。将培养物上清经0.45μm滤膜过滤，将滤液流经40mM PBS(pH7.4，150mM NaCl)预先平衡的Protein A凝胶色谱柱(Mabselect^TM Sure,MabSelect^TM Sure LX,MabCapture^TM A,AT Besterose A等)，之后用40mM PBS流洗2～4个柱体积至A₂₈₀回到基线水平；将流洗液换为100mM甘氨酸-盐酸缓冲液(或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液，pH3.0～4.0)洗脱结合物，将收集到的洗脱物室温下(18～25℃)放置30分钟(低pH灭活病毒)，之后用0.2M Na₂HP0₄调节pH至7.4～8.0，经0.45μm滤膜过滤进一步除去不溶性颗粒。Protein A亲和色谱纯化获得的蛋白质溶液经岛津LC-20AT HPLC(BioCore SEC-500，7.8mm×30cm，苏州纳维生物科技有限公司))检测，主峰(二聚体)占比约为65％～78％，单体约占20％～30％，在主峰之前尚有部分多聚体产物，占比一般在10％以内，色谱图见图4。

之后将收获的含目标产物的蛋白质溶液加载到经20mM PB(pH7.4～8.0)缓冲液平衡好的DEAE Sepharose 4Fast Flow(或Q Sepharose 4Fast Flow,NanoGel 50Q、Besterose DEAE,Besterose Q,POROS Q，POROS XQ等)，加载完成后，使用20mM PB缓冲液流洗色谱柱至A₂₈₀回到基线水平，依次用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白VZV gE，用1.0M NaCl溶液再生阴离子交换色谱柱1个柱体积，最后经20mM PB(pH7.4～8.0)缓冲液平衡后备用。

将收获的VZV gE再经Sephacryl S400 HR或其他适宜的分子筛色谱柱纯化，收集目标产物，除菌过滤后2～8℃存放。

纯化后的VZV gE用岛津LC-20AT HPLC进行纯度检测，流动相为40mM PBS(含0.5MNa₂SO₄,pH 7.5)，流速0.750ml/min，分析柱为BioCore SEC500(7.8×300mm，纳维科技有限公司，或TSK 5000SWxl,东洋曹达公司)，A₂₈₀检测结果表明VZV gE纯度达到98％以上，结果见图5，相对分子量约400KDa。

实施例4甲醛灭活目标产物

将实施例3得到的重组VZV gE用20mM PBS(pH7.2～8.0，135mM NaCl)稀释到100μg/ml～1000μg/ml，加入38％甲醛溶液至溶液总体积的0.1％(v/v)，37℃放置72小时，期间每天摇动两次，混合均匀，之后将溶液放置在2～8℃。

实施例5β-丙内酯灭活目标产物

将实施例3得到的重组VZV gE溶液降温至2～8℃，称重后加入β-丙内酯至终浓度为溶液重量的0.1％-0.01％，2～8℃条件下继续放置72小时，期间每天摇动两次，混合均匀。72小时之后，将VZV gE溶液升温至37℃，维持4小时，使β-丙内酯彻底转化为乳酸，之后将溶液放置在2～8℃。

实施例6从目标产物中除去甲醛或β-丙内酯

将实施例5、或实施例6所得含重组VZV gE的蛋白质溶液用20mM PB(pH7.2～8.0,或20mM Tris-HCl溶液pH7.2～8.0)进行适当的稀释，至溶液中NaCl的浓度降低到50mM以下，然后将含VZV gE的溶液流过经20mM PB(或20mM Tris-HCl,pH7.2～8.0)平衡好的DEAESepharose 4FF色谱柱，之后用20mM PB(或20mM Tris-HCl溶液，pH7.2～8.0)继续流洗至A₂₈₀完全回到基线水平，继续流洗4个柱体积的液量，用含0.4M NaCl的洗脱液(含20mM PB或20mM Tris-HCl溶液，pH7.5)洗脱结合在凝胶上的VZV gE，收集含目标产物的溶液，用0.2μm孔径的除菌滤膜过滤，收集滤液即为疫苗原液。

实施例7制备含铝佐剂的疫苗

将实施例6所得疫苗原液，用20mM Tris-HCl(pH7.2～7.5，含135～150mM NaCl)稀释到10μg/ml～800μg/ml，室温条件下与等体积的氢氧化铝佐剂混悬液(铝含量0.2～1.5mg/ml)混合均匀，然后放置于2～8℃。

自2～8℃取出含铝佐剂的疫苗溶液，无菌条件下分装入2ml西林瓶内(或预填充玻璃注射器内)，每瓶0.5ml(或1.0ml)，密封后放置于2～8℃避光保存。

下表以配制1000ml体积的不同VZV gE含量的疫苗为例(左起第1列为每配制1毫升疫苗中的抗原含量，右起第1列为常规肌肉注射使用的0.5ml疫苗中的抗原含量)，使用含VZV gE浓度为800μg/ml的疫苗原液配制含铝佐剂疫苗，配制方法如下：

表1、不同抗原含量的VZV gE铝佐剂疫苗液的配制

实施例8冻干重组VZV gE融合蛋白

将实施例6所得疫苗原液，用20mM Tris-HCl(pH7.2～7.5，含135mM NaCl)稀释到40μg/ml～800μg/ml，加入10％蔗糖(或10％海藻糖、10％甘露醇、10乳糖)溶液至终浓度为3％，调整待分装溶液中VZV gE的浓度至20μg/ml(或50、80、100、200、400μg/ml)，混合均匀后分装入2ml管制瓶内，每瓶1.0ml，半加丁基胶塞后，送入冻干仓内，设定预冷冻温度为-40～-45℃，冷冻4小时，之后开始抽真空冻干，采用自动升温程序控温，自-40～-25℃升温6小时，-25～-5℃升温4小时，0～5℃维持1小时，25℃维持1小时，35℃维持6～8小时，之后真空状态下压紧丁基胶塞(或充入高纯氮气或氩气压塞)。

自冻干机取出已压塞的小瓶，送入自动轧盖机，锁紧铝盖。之后转移到2-8℃冷库存放。使用前用一次性无菌注射器吸取1.0ml注射用水或氢氧化铝佐剂混悬液注入含冻干VZV gE的小瓶内，轻轻混合，约5分钟后，即成为无肉眼可见颗粒物的疫苗。疫苗溶解后应立即使用，或最迟于30分钟内使用。本疫苗用于皮下、或肌肉内注射使用，严禁用于内静脉注射。

实施例9动物免疫实验自2～8℃冷库中取出含VZV gE 100μg/ml的铝佐剂吸附的疫苗，用20mM Tris-HCl稀释成含VZV gE 8μg/ml、2μg/ml的溶液，之后加入等体积的铝佐剂，配制成含VZV gE 4μg/ml、1μg/ml的动物实验用铝佐剂疫苗(或含VZV gE 2μg/ml、0.5μg/0.5ml)。

将4～6周玲的雌性BALB/C随机分成5组，每组8只，对照组每只小鼠腹腔注射铝佐剂0.5ml；4个实验组分别腹腔注射0.5ml含铝佐剂吸附的VZV gE抗原50、10、2、0.5μg，每个剂量组注射8只小鼠；初次免疫后间隔两周免疫1次，共免疫4次，第2、3次免疫后7天尾静脉采集血液，分离血清后冻存于-70℃，第4次免疫后7天心脏采血，分离血清，分离后冻存于-70℃。

ELISA抗体效价检测：用碳酸盐缓冲液将重组VZV gE-His蛋白稀释到1μg/ml，包被96孔酶标板(Costar)，每孔100μl，37℃放置1小时后，2～8℃放置过夜；废弃96孔板内的液体，用20mM PBS洗3次，之后每孔加入200μl封闭液(2％牛血清白蛋白,组分V)，室温封闭60分钟；吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，将经过1:50(或1:500、或1:1000)预稀释的小鼠血清加入到96孔酶标板的第一列孔内，之后行2倍系列的倍比稀释，阴性对照为仅使用铝佐剂腹腔免疫的小鼠血清(1:100)，37℃反应60分钟，吸出孔内的封闭液，用20mMPBS-T溶液洗涤3遍；取出羊抗小鼠IgG-HRP结合物，用酶结合物稀释液1:100稀释(稀释液中含人IgG 1mg/ml)，室温下预反应30分钟，之后加入到96孔酶标板内，每孔100μl，37℃反应30分钟；吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，每孔加入TMB显色液100μl，10分钟后加入50μl终止液终止反应，之后用TECAN Infinit 200酶标仪测定A₄₅₀吸光值，以阴性对照组混合血清A₄₅₀的3倍作为Cut-Off值(如阴性对照A₄₅₀值低于0.100，按0.100计算)，判定免疫后血清的效价。各实验组小鼠的血清中抗VZV gE抗体滴度的几何平均值及标准差见下表2；2次免疫后，除最低剂量组(0.5μg)1只小鼠血清抗体未阳转外，均出现阳转；对各组实验动物测定的抗体效价进行统计分析显示，各剂量组的实验小鼠经3次免疫后，血清抗体效价明显高于2次免疫后，第4次免疫后，血清抗体效价仍有部分增加，但增加不明显，第2、3、4次免疫后，三个高剂量组的小鼠血清效价无显著性差异，血清中的抗体效价无明显差异。各剂量VZV gE铝佐剂疫苗免疫BALB/C小鼠后的血清抗体效价见图6。

血清中和抗体效价测定：VZV病毒是在人胚肺二倍体细胞上可产生细胞融合病变的病毒，因此可以采用病毒噬斑减少中和实验检测不同血清稀释度的抗体中和病毒的能力，计算使病毒数量减少50％的血清效价。血清抗体中和病毒实验是最直接的检测免疫后的血清中是否存在可中和VZV病毒抗体的实验，该实验存在操作繁琐、灵敏度低、耗费人力较多、耗时较长、不能使用仪器设备自动判读等缺点，且ED₅₀的计算需要专业的数据处理软件，以上种种不便导致很少有人使用该实验进行血清中和抗体的测定。由于该实验使用血清量太大，我们仅对末次免疫后采集的小鼠血清进行中和抗体测定。

本试验为在平底96孔微孔板上进行的VZV血清中和试验，细胞基质为对VZV敏感的MRC-5细胞(购自ATCC)。自-70℃冰箱内取出冻存的血清，室温下融化后，在无菌净化工作台内将待检血清用含10％FBS的199培养液(GIBCO)先进行1:10稀释，之后在96孔板内进行4倍系列稀释，共7个稀释度，每个稀释度做两孔测定，阳性对照血清为兔抗VZV gE血清，阴性对照血清使用铝佐剂免疫的小鼠混合血清(1:10稀释)，每块96孔板设置6孔病毒液对照孔及6孔细胞对照；将稀释好的待检血清与一定量的OKA株病毒(购自美国ATCC)进行混合，盖好96孔微孔板盖，微孔板振荡器上震荡30秒钟，之后放置于10％CO₂、37℃培养箱内(10％)反应30分钟。

自二氧化碳培养箱内取出已长满单层的MRC-5细胞(ATCC，代次25～38代)，在百级净化工作台内吸出T75培养瓶(Corning)内的培养液，加入0.25％胰酶(GIBCO)溶液5ml消化已长成单层的MRC-5细胞，室温下作用3分钟，吸出胰酶溶液后加入10ml细胞培养液，轻轻吹打细胞培养瓶的内表面，分散MRC-5细胞，加入一定体积的细胞培养液，制成细胞悬液。自培养箱内取出含待测血清的96孔微孔板，用多通道移液器加入细胞悬液，盖好板盖，微孔板振荡器上震荡30秒钟，放入37℃二氧化碳培养箱内(10％)培养3～4天，48小时后每天用倒置显微镜观察每孔的细胞病变，准确计数并记录每个孔内的空斑数量。96小时后用12道移液器吸出孔内的液体至含0.1％次氯酸钠的废液缸内，加入0.1％结晶紫染色1小时，脱色后将微孔板反扣在吸水纸上，室温干燥。将每份血清各稀释度的空斑数量录入EXCEL 2016表内，以病毒溶液孔内的空斑数量的均数(6孔平均值，25～30个/孔)为100％计算各稀释度血清的空斑减少数量，转换成百分比，之后将数据用Prism 5.0软件计算ED₅₀值，此ED₅₀值即是空斑数量减少50％的血清效价，四个剂量组各小鼠血清中和抗体效价ED₅₀的测定曲线图见图7，各剂量组血清中和抗体效价的几何平均滴度及中和抗体效价的分布见表3；各剂量组VZV血清中和抗体效价的几何平均滴度对比见图8，从图中可以看出，除最低剂量组的中和抗体效价明显低于其他3个组外，其它3各组的血清中和抗体效价均达到了较高的水平。

表2、不同剂量的VZV gE铝佐剂疫苗免疫BALB/C小鼠后的血清抗体效价(ELISA)

表3、不同剂量的VZV gE铝佐剂吸附疫苗免疫BALB/C小鼠后的血清中和抗体效价

序列表

<110>北京绿竹生物技术股份有限公司

<120>一种重组水痘带状疱疹病毒疫苗

<160> 2

<210> 1

<211>

<212> PRO

<213> 人工序列

<220>

<221>748

<222>

<223>

<400> 1

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu

5 10 15

Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala

20 25 30

Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr

35 40 45

Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly

50 55 60

Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly

65 70 75

Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met

80 85 90

Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile

95 100 105

Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp

110 115 120

Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys

125 130 135

Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His

140 145 150

Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg

155 160 165

Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys Thr Gly

170 175 180

Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr Thr

185 190 195

Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

200 205 210

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys

215 220 225

Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu

230 235 240

Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val

245 250 255

Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile

260 265 270

Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe

275 280 285

Leu Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro

290 295 300

Ala Val Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn

305 310 315

Tyr His Ser His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala

320 325 330

Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu

335 340 345

Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met

350 355 360

Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys

365 370 375

Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu

380 385 390

Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala

395 400 405

Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met Glu Pro

410 415 420

Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys Phe

425 430 435

Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

440 445 450

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser

455 460 465

Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro

470 475 480

Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile

485 490 495

Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala

500 505 510

Trp Thr Gly Gly Leu Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

515 520 525

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

530 535 540

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

545 550 555

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

560 565 570

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

575 580 585

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

590 595 600

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

605 610 615

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

620 625 630

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

635 640 645

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

650 655 660

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

665 670 675

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

680 685 690

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

695 700 705

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

710 715 720

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

725 730 735

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

740 745

<210> 2

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agcgtgctgc ggtacgacga tttccacatc gacgaggata agctggacac caatagcgtg 60

tatgagcctt actatcactc cgaccacgcc gagtccagct gggtgaacag gggcgagtct 120

tcccggaagg cttacgacca caactctccc tatatctggc ctagaaatga ctacgatggc 180

tttctggaga acgcccatga gcaccatggc gtgtataatc agggccgggg catcgactct 240

ggcgagagac tgatgcagcc tacacagatg tccgctcagg aggatctggg cgacgataca 300

ggcatccacg tgatcccaac cctgaatggc gacgacaggc ataagatcgt gaacgtggat 360

cagaggcagt acggcgacgt gttcaagggc gatctgaatc ccaagcctca gggccagcgc 420

ctgatcgagg tgtccgtgga ggagaaccat ccattcaccc tgcgcgcccc tatccagcgc 480

atctacggcg tgaggtatac cgagacatgg tcctttctgc ctagcctgac ctgcacaggc 540

gacgctgctc cagctatcca gcacatctgc ctgaagcata ccacatgttt tcaggacgtg 600

gtggtggacg tggattgtgc cgagaataca aaggaggatc agctggctga gatcagctac 660

agattccagg gcaagaagga ggccgatcag ccatggatcg tggtgaacac ctctacactg 720

tttgacgagc tggagctgga cccccctgag atcgagcctg gcgtgctgaa ggtgctgcgc 780

accgagaagc agtacctggg cgtgtatatc tggaacatga ggggcagcga cggcacctcc 840

acatacgcta ccttcctggt gacatggaag ggcgatgaga agacccggaa tccaacacca 900

gctgtgaccc ctcagccaag aggcgctgag tttcacatgt ggaactatca cagccacgtg 960

ttctccgtgg gcgacacctt ttccctggcc atgcacctgc agtacaagat ccatgaggct 1020

ccattcgacc tgctgctgga gtggctgtat gtgcccatcg atcctacatg ccagcccatg 1080

cgcctgtaca gcacctgtct gtatcaccca aatgcccccc agtgcctgtc ccatatgaac 1140

agcggctgta cctttacatc cccacacctg gcccagaggg tggctagcac agtgtaccag 1200

aactgcgagc atgccgacaa ttacaccgct tattgtctgg gcatctctca catggagcct 1260

tccttcggcc tgatcctgca tgacggcggc accacactga agtttgtgga tacccctgag 1320

agcctgtctg gcctgtacgt gttcgtggtg tacttcaacg gccacgtgga ggccgtggct 1380

tacacagtgg tgtctaccgt ggatcatttc gtgaacgcca tcgaggagag gggatttcca 1440

ccaacagctg gacagcctcc agctaccaca aagcccaagg agatcacacc tgtgaaccca 1500

ggcacctccc ctctgctgag atatgccgct tggaccggcg gcctggctga gcccaaatct 1560

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 1620

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1680

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1740

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1800

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1860

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1920

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcctc catctcggga tgagctgacc 1980

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 2040

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgccccc cgtgctggac 2100

tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 2160

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 2220

agcctctccc tgtctccggg taaa 2244

Claims

1.一种重组水痘带状疱疹病毒疫苗制剂，其包括减毒活VZV毒株基因的重组糖蛋白gE胞外区的氨基酸序列和人免疫球蛋白Fc段形成的融合蛋白，所述融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，其中减毒活VZV毒株为OKA株。

2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，还含有疫苗佐剂。

3.根据权利要求2所述的疫苗制剂，所述疫苗佐剂选自：氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂，或氢氧化铝和磷酸铝佐剂的混合物。

4.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其中每个剂量单位中含有融合蛋白5～200μg。

5.根据权利要求4所述的疫苗制剂，其中每个剂量单位中含有融合蛋白10～100μg。

6.根据权利要求5所述的疫苗制剂，其中每个剂量单位中含有融合蛋白20～60μg。

7.根据权利要求1所述的疫苗制剂，还含有其它能增强免疫原性的物质，包含但不限于：磷脂酰胆碱、卵磷脂、3D-MPL、长链脂肪酸、矿物油、植物油、甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、以及含有胆固醇的脂质体的组合物。

8.根据权利要求1所述的疫苗制剂，为冻干制剂。

9.根据权利要求8所述的疫苗制剂，所述冻干制剂，使用前用加入氢氧化铝佐剂混悬液溶解，混合均匀后，肌肉或皮下注射。

10.一种重组基因，其可以表达权利要求1中所述的融合蛋白，其DNA序列为SEQ IDNo.2。