CN107441485B - 一种复合疫苗佐剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合佐剂组合物和含有此佐剂的疫苗组合物，复合佐剂组合物含有水包油乳剂、聚肌苷酸‑聚胞苷酸或其衍生物和DDA，能够显著提高抗原的细胞免疫。

Description

一种复合疫苗佐剂组合物
技术领域
本发明涉及一种疫苗佐剂组合物，具体而言本发明涉及一种兽用的复合疫苗佐剂组合物。
背景技术
“佐剂”一般是指增加对抗原的体液或细胞性免疫应答的任何物质。佐剂被用于达成二个目的：其减缓抗原从注射部位释出，且其刺激免疫系统；可容许使用较小剂量的抗原来刺激类似的免疫应答，从而减少疫苗的制造成本。因此，当将抗原与佐剂组合时可显著增加某些抗原的效力。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。猪繁殖与呼吸综合征变异快，猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株之间交叉保护效果较差，多种毒株共同流行。如何提高不同毒株之间的较差保护是本领需要解决的技术问题。
伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。目前以活疫苗免疫为主，提高伪狂犬抗原的细胞免疫活性，以及灭活疫苗和亚单位疫苗伪狂犬抗原的细胞免疫活性是本领域所要解决的技术问题。
现有技术需要一种提高抗原交叉免疫保护能力，在促进细胞免疫和体液免疫共同提高的佐剂以及含有此佐剂的疫苗组合物
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明涉及的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物和DDA。
作为本发明的一种实施方式，本发明的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和左旋咪唑。
作为本发明的另外一种实施方式，本发明的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和草分枝杆菌培养物。
本发明的佐剂还可以包含其他佐剂包括但不限于卡波姆、铝胶、皂苷(Quil A)。
作为本发明的另外一种实施方式，本发明的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和卡波姆。
作为本发明的另外一个方面，本发明提供一种疫苗组合物包含抗原、水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物和DDA。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种疫苗组合物包含抗原、水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和左旋咪唑。
作为本发明的另外一种实施方式，本发明提供一种疫苗组合物包含抗原、水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和草分枝杆菌培养物。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种疫苗组合物包含抗原、水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和卡波姆。
本发明所述的抗原包括但不限于猪繁殖与呼吸综合征抗原、猪圆环病毒抗原、猪大肠杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪流行性腹泻抗原、猪伪狂犬病毒抗原、牛传染性鼻气管炎病毒抗原、口蹄疫抗原的一种或者多种组合。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的抗原为猪繁殖与呼吸综合征抗原。
作为本发明的另外一种优选实施方式，所述的抗原为猪伪狂犬病毒抗原。
如本文所述，“约”或“大约”是指所指示的变量值及所有在所指示数值的实验误差内(如：平均值的95％置信区间内)或所指示数值的10％内(无论那一个数值较大)的变量值，除非“约”被用于表示以周计的间隔，其中“约3周”为17至25天，而约2至约4周为10至40天。
如本文所述，“术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。如本文所述，“抗体”是指可因为对抗原的免疫应答而与特异抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链所组成的血清蛋白质，且根据该恒定区的组成而区分为数类(如：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。
如本文所述，“缓冲液”是指防止另一种化学物质的浓度变化的化学系统，如：质子供体及受体系统可作为防止氢离子浓度(pH)明显改变的缓冲液。另一缓冲液例子为含有弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。
如本文所述，“细胞性免疫应答”或“经细胞介导的免疫应答”为一种由T-淋巴细胞或其它白细胞或此二者介导的免疫应答，其包括生产细胞因子、趋化因子及由活化的T细胞、白细胞或此二者制造的类似分子。
如本文所述，“乳化剂”是指用于使乳液更稳定的物质。
如本文所述，“乳液”是指两种不相溶混的液体的组合物，其中一种液体的小滴悬浮于另一种液体的连续相中。
如本文所述，“赋形剂”是指任何非抗原的疫苗的组分。
如本文所述，“匀化”是指将一或多种相似或不相似的组分混合成均匀的混合物的过程。
如本文所述“体液免疫应答”是指由抗体介导的免疫应答。
如本文所述受试者中的“免疫应答”是指应答抗原的体液免疫应答、细胞性免疫应答或体液及细胞性免疫应答的发生。免疫应答通常可利用本领域已知的标准免疫分析及中和分析来测定。
如本文所述“药学上可接受的”是指在明智的医疗判断下适合与受试者组织接触而无不当毒性、刺激、变应原性应答等，与合理的利益对风险的比率匹配并对其预期用途有效的物质。
如本文所述“室温”是指18至25℃的温度。
如本文所述“TCID50”是指“组织培养感染剂量”且定义为感染50％指定批次的经接种的细胞培养物时所需要的病毒稀释量。可使用多种方法来计算TCID50，包括本说明书全文中所使用的斯皮尔曼-卡伯法(Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡伯法的描述见B.W.Mahy&H.O.Kangro，Virology Methods Manual，p.25-46(1996)。
如本文所述，“疫苗”是指包含如本文定义的抗原的组合物。将疫苗施用给受试者可产生大致上针对一种或多种特定疾病的免疫应答。治疗有效的疫苗量可根据所使用的具体抗原、或受试者的状况而有不同，且可由本领域技术人员决定。
组合物的组分
如本文所述“草分枝杆菌培养物”可以是草分枝杆菌灭活的全菌体，也可以草分枝杆菌灭活的全菌体的破碎纯化物、草分枝杆菌的多糖提取物、草分枝杆菌的细胞壁提取物。草分枝杆菌培养物浓度可以为0.01mg/剂量～0.8mg/剂量，也可以为0.02mg/剂量～0.7mg/剂量、0.03mg/剂量～0.6mg/剂量、0.030mg/剂量～0.6mg/剂量、0.04mg/剂量～0.5mg/剂量、0.050mg/剂量～0.4mg/剂量、0.06mg/剂量～0.3mg/剂量、0.07mg/剂量～0.2mg/剂量、0.08mg/剂量～0.1mg/剂量。
如本文所述，“聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物”其包括但不限于：聚肌苷酸-聚胞苷酸(“聚I：C”或“PIC”等用语是指含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的组合物，亦分别称作为聚肌苷酸:聚胞苷酸)、“PICKCa”、聚肌胞钠盐(CAS 42424-50-0)、壳寡糖-卡那霉素-聚肌胞钠盐复合物，此其中PICKCa用语是一般性地指称由PIC卡那霉素和钙所构成的组合物。使用量通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。
如本文所述左旋咪唑术语“左旋咪唑或其衍生物”包括左旋咪唑、左旋咪唑衍生物如盐酸左旋咪唑(Levamisole Hydrochloride)或磷酸左旋咪唑(Levamisole phosphate)中的至少一种；所述左旋咪唑(Levamisole，LMS)又称左咪唑(L-Tetramisol)或左旋四咪唑，为四咪唑的左旋光学异构体，是一种广谱驱虫药。所述左旋咪唑或其衍生物还可以包括以下任一产品如TotalonTM Topical Cattle Anthelmintic(Pitman-Moore,Inc.)、
Figure GDA0002802737060000051
(Intervet,Inc.)、
Figure GDA0002802737060000052
(Schering-Plough)、
Figure GDA0002802737060000053
(Janssen Pharmaceuticals,Inc.)、Levamisole Hydrochloride(Bimeda,Inc.)、
Figure GDA0002802737060000054
Plus(Fort Dodge Animal Health)、ProhibitTM Soluble Drench Power(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole phosphate(Agri laboratories,Ltd.)、Levamisole Hydrochloride Soluble Pig Wormer(Cross Vetpharm Group Ltd.)、左旋咪唑原料药(西安帅诺生物科技有限公司)、盐酸左旋咪唑(陕西汉江药业集团股份有限公司)、盐酸左旋咪唑注射液(广西南宁市桃源兽药厂)、左旋咪唑搽剂(参见中国专利CN1048399A)。左旋咪唑或衍生物可以为0.1毫克～10毫克/剂量，亦可以为0.5毫克～5毫克/剂量，1.0毫克～3毫克/剂量，1.5毫克～2毫克/剂量，1.5毫克/剂量。
如本文所述，所述“DDA”为双十八烷基二甲基溴化铵的简称，其使用量通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。
抗原
如本文所述，“猪繁殖与呼吸综合征”与“PRRS”，“猪繁殖与呼吸综合征病毒”、“猪繁殖与呼吸综合征病毒株”与“PRRSV”，包括但不限于“高致病性猪繁殖与呼吸综合征”、“猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC-30like毒株”、“经典猪繁殖与呼吸综合征病毒株”。作为示例高致病性猪繁殖与呼吸综合征为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株公开于中国专利申请CN101045917A；猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC-30like毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株(Porcine reproductive and respiratory Syndrome virus,strain HNjz15)保藏号为：CCTCC NO.V201540，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年9月21日。“经典猪繁殖与呼吸综合征病毒株”代表性毒株为CQ株，公开于中国专利申请CN101607082中。
如本文所述，水包油乳剂是指由油、乳化剂组成，所述的乳化剂包括亲水性表面活性剂、亲油性表面活性剂、水组成。其中所述“油”：适合用于本发明的油包括烷、烯、炔，其对应的酸及醇，及其醚及酯，及其混合物。油的个别化合物为轻烃化合物，即，这类组分具有6至30个碳原子。该油可合成制备或从石油产物纯化。此部分可具有直链或支链构造。其可为完全饱和或具有一个或多个双键或参键。用于本发明的一些不可代谢的油包括，例如：矿物油、石蜡油及环烷烃。包括“轻矿物油”，即：以类似方法通过蒸馏石油取得，但其比重较白矿物油稍低的油。可代谢的油包括可代谢的、无毒的油。例如角鲨烷、角鲨烯。典型地，本发明的油组分的存在量为1％至50％(以体积计)；或为10％至45％；或为20％至40％。所述的“亲油性表面活性剂”选自包括但不限于司本-80、甘露醇油酸酯或者二缩甘露醇油酸酯AEO-3的一种或者几种组合；优选地，所述的亲油性表面活性剂优选蔗糖衍生物具有至少一个但不多于N-1个脂肪酸酯基团的蔗糖酯；优选地，蔗糖衍生物为硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、(硫酸酯)1-(十二酰)7-蔗糖、蔗糖酯L195(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)、(硫酸酯)2-L195的一种或者几种组合。所述的“亲水性表面活性剂”选用包括但不限于吐温-80、蔗糖酯L1695 Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)、聚乙烯甘露醇油酸酯、卵磷脂、AE0-9、AE0-12、泊洛沙姆407的一种或者几种混合。
本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂覆层、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等等。载体在可与组合物的其它组分兼容且对受试者无害方面必须为“可接受的”。典型地，载体应为无菌且不含病原体，并根据欲使用的施用模式选择。
组合物任选地可包含作为药学载剂、赋形剂或介质发挥作用的，相容的药学上可接受(即，无菌或非毒性)的液体、半固体或固体稀释剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖及其他。稳定剂包括白蛋白及其他。
组合物亦可含有抗生素或防腐剂，包括，例如：庆大霉素、硫柳汞、或氯甲酚。本领域技术人员公知可用于选择的不同类别的抗生素或防腐剂。
本发明的免疫佐剂组合物制备的疫苗至少有以下优点：
1、本发明的佐剂组合物能够增强抗原交叉免疫保护；
2、本发明的佐剂组合物协同促进细胞免疫作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
PH为7.0的磷酸盐缓冲液配制方法：取磷酸氢二钠10.9g，磷酸二氢钠2.3g，加水700ml使溶解，调pH值至7.0，再加水稀释至1000ml。
猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株(Porcine reproductive and respiratorySyndrome virus,strain HNjz15)保藏号为：CCTCC NO.V201540，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年9月21日。
猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株公开于中国专利申请CN101045917A。
实施例1、水包油乳剂组合物
将蔗糖酯L195 10g(Mitsubishi-Kagaku食品公司，东京，日本)与吐温-80 10g、兽用注射用白油40g、190g 0.01w/v％硫柳汞(Sigma)磷酸缓冲盐溶液(PBS-硫柳汞；pH7.0)混合制得。于环境温度下、以至少400巴的内压，三次通过均质机进行混合物进行乳化。于显微镜下对每一乳液进行检测。如果在放大1000倍的显微镜下，每10个受检视野中有多于10个直径大于1μm的油滴，那就重复进行该乳化过程。将所得的乳液保存于4℃直至使用。
实施例2、PICKCa溶液
双链聚肌胞冻干粉(购自杭州美亚药业有限公司)1g,用100mL无菌PBS溶解，为10mg/mL,取15mL加入卡那霉素2.25g、无水氯化钙0.555g用PBS定容至150mL,配制成1mg/mL的PICKCa溶液。
实施例3、DDA溶液
将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA；Fluka Analytical)溶解在乙醇中，制备15毫克/毫升的储备溶液，用0.2微米滤器过滤DDA储备溶液。
实施例4、草分枝杆菌培养物储备溶液的制备
草分枝杆菌(分枝杆菌来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为CGMCC4.1180)置于发酵罐中进行培养，37℃通气培养，pH值为7.0，培养时间为4天，培养基配方：酵母提取粉1g，浓缩麦芽汁3ml，葡萄糖25g，磷酸氢二铵3g，磷酸氢二钾0.8g，注射用水加至1000ml。将发酵液用甲醛溶液(0.1％)灭活后，离心浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离心除去杂质，测定水分，计算干菌体重量，与生理盐水均匀后进行高压均质，然后冻干，得到草分枝杆菌培养物。临用前去离子水中，制备成100毫克/毫升的储备溶液。
实施例5盐酸左旋咪唑溶液
将盐酸左旋咪唑，溶解在去离子水中，制备成100毫克/毫升的储备溶液，用0.2微米过滤器过滤。
实施例6、本发明的佐剂对猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的免疫增强试验
6.1.疫苗的配制按照表1的每头份量，猪繁殖与呼吸综合征抗原(按照中国专利CN101045917制备)灭活前含量为105.5TCID50/剂量，然后加入实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5配制的储备液，用pH＝7.0的磷酸盐缓冲定容至体积。对照疫苗不加佐剂，用pH＝7.0的磷酸盐缓冲定容至体积。
表1：组合物的配制表100ml
Figure GDA0002802737060000101
6.2.猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物中和抗体试验
将50日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪45只随机分成9组，5头/组，按照表2注射疫苗，对照组接种不含佐剂的对照疫苗，2ml/头在免疫后28天采集猪血清，用细胞中和试验检测PRRSV抗体效价，计算平均值，结果见表2。
6.3.测定免疫后外周血单个核细胞(PBMC)数
测定免疫后外周血单个核细胞(PBMC)评判不同免疫佐剂对细胞免疫的效果。免疫后21天，随机选3头无菌采集前腔静脉肝素抗凝血。取抗凝血2mL，加入等体积的D-Hank’s液，充分混匀。将稀释过的抗凝血沿试管壁缓慢温和地加在相同体积的猪淋巴细胞分离液的液面之上。用水平离心机以2000rpm离心15min，此时淋巴细胞局限地出现在上下两种液体的交界处。尽可能多地收集界面上的细胞，将其加入含有4mL D-Hank’s液的10mL新离心管中，充分混匀。用水平离心机以1800rpm离心10min,弃上清，倒置离心管，使上清流尽，加入5mL无菌NH4Cl.Tris，充分混匀细胞沉淀，静置10min。用水平离心机以1800rpm离心10min，小心弃上清，倒置离心管，尽量使上清流尽。向沉淀中加入1mL 10％RPIM 1640培养液，充分混匀。吸出5μL加入45μLPBS液中，混匀后取10μL加入10μL苔盼蓝混匀后进行计数。计算平均值，结果见表2
表2免疫原性试验动物分组、中和抗体和PBMC测定
组别 注射疫苗 免疫剂量 中和抗体检测 PBMC测定
1 疫苗1 2ml/头 1：70.1 46349
2 疫苗2 2ml/头 1：80.2 48261
3 疫苗3 2ml/头 1：70.5 45684
4 疫苗4 2ml/头 1：89.8 53597
5 疫苗5 2ml/头 1：93.4 48654
6 对比例1 2ml/头 1：43.9 18367
7 对比例2 2ml/头 1：16.2 12864
8 对比例3 2ml/头 1：10.4 13746
9 对比例4 2ml/头 1：44.6 22941
10 对比例5 2ml/头 1：59.1 14687
11 对比例6 2ml/头 1：16.4 28459
12 对比例7 2ml/头 1：50.6 18659
13 对照疫苗 2ml/头 1：7.2 8250
抗体试验结果表明，单用水包油乳剂、单用PICKCa和单用DDA作为佐剂，疫苗的中和抗体效价均低于疫苗组，其中水包油乳剂与206佐剂基本一致，而且其二种成分的组合也未见明显的提高，但三者组合疫苗的中和抗体效价提高明显，证明三者产生了协同作用，而左旋咪唑和草分枝杆菌培养物抗体可以进一步提高。同时测定免疫后外周血单个核细胞(PBMC)评判不同免疫佐剂对细胞免疫的效果也表明，本发明的佐剂对细胞免疫有协同作用。
实施例7、不同猪繁殖与呼吸综合征毒株的攻毒试验
7.1.疫苗A：实施例6制备的疫苗1制备抗原灭活前病毒含量为105.5TCID50/剂量；
疫苗B：繁殖与呼吸综合征抗原参照按照中国专利CN101045917制备病毒液收获后加上纯化浓缩步骤，纯化方法如下：通过离心使细胞成团，去掉或弃去上清。细胞团还可以经过洗涤。将细胞团重悬到0.05M三(羟甲基)氨基甲烷0.025M EDTA缓冲液中，其中包含0.5％曲通X-100，缓冲液的体积为浓集细胞的5倍。混合物在4℃搅拌2小时，10,000g离心1小时。上清液作为抗原。通过纯化，将抗原做10倍浓缩液作为抗原。佐剂同实施例6的疫苗1；
疫苗C：实施例6对比例7制备的疫苗灭活前病毒105.5TCID50/剂量。
疫苗D:实施例6制备的对比例2疫苗，灭活前病毒含量105.5TCID50/剂量
将43日龄PRRSV抗原抗体阴性仔猪50头随机分成10组，5头/组，按照表3注射疫苗，对照组接种DMEM培养基2ml/头在免疫后28天
表3免疫原性试验动物分组
Figure GDA0002802737060000121
Figure GDA0002802737060000131
免疫后28天攻毒，第A1组、第B1组、第C1组、D1和对照1用猪繁殖与呼吸综合征病毒HNjz15株攻毒，第A2组、第B2组、第C2组、第D2组和第对照2组用猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株攻毒，攻毒剂量均为105.0TCID50/头，观察临床症状见表4。
表4猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪后的攻毒情况
Figure GDA0002802737060000132
攻毒试验结果表明，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗组合物免疫仔猪可以增强对不同毒株的免疫保护，可以增强交叉保护作用。
实施例8、伪狂犬疫苗的配制和中和抗体检测
8.1.疫苗的配制按照表5每头份的量，在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入用杆状病毒表达的猪伪狂犬gB和gD抗原的混合物(gB和gD等摩尔比)80微克(参照CN104248757A制备)，然后加入佐剂组合物，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲定容至体积。
表5：组合物的配制表100ml
Figure GDA0002802737060000141
将21日龄PRV抗体阴性仔猪55头随机分成11组，5头/组，注射上述伪狂犬疫苗2ml/头，疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表6。并与第3周参照实施例7的6.3的方法进行PBMC。
表6猪伪狂犬灭活疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况
Figure GDA0002802737060000142
Figure GDA0002802737060000151
试验结果表明，伪狂犬抗原单用水包油乳剂、单用PICKCa和单用DDA作为佐剂，疫苗的中和抗体效价均低于206佐剂，而且其二种成分的组合也未见明显的提高，但三者组合疫苗的中和抗体效价提高明显，证明三者产生了协同作用。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种复合佐剂组合物，其特征在于，所述的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物和DDA；其中，所述水包油乳剂是由蔗糖酯L195 10g与吐温-8010g、兽用注射用白油40g、190g 0.01w/v％硫柳汞磷酸缓冲盐溶液混合制得，所述硫柳汞磷酸缓冲盐溶液pH为7.0，聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物为PICKCa，PICKCa以PICKCa溶液添加，150mL所述PICKCa溶液含有1mg/mLPICKCa，2.25g卡那霉素、0.555g氯化钙；DDA以DDA溶液添加，所述DDA溶液为15毫克DDA/毫升的乙醇溶液，
其中，所述PICKCa溶液含量为0.1mg/100ml所述复合佐剂组合物，所述水包油乳剂含量为1％V/V，所述DDA溶液含量为100ug/100ml所述复合佐剂组合物；或者
所述PICKCa溶液含量为0.3mg/100ml所述复合佐剂组合物,所述水包油乳剂含量为1％V/V,所述DDA溶液含量为150ug/100ml所述复合佐剂组合物；或者
所述PICKCa溶液含量为0.05mg/100ml所述复合佐剂组合物，所述水包油乳剂含量为0.5％V/V，所述DDA溶液含量为50ug/100ml所述复合佐剂组合物。
2.根据权利要求1所述的复合佐剂组合物，其特征在于，所述的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和左旋咪唑；其中，所述PICKCa溶液含量为0.1mg/100ml所述复合佐剂组合物，所述水包油乳剂含量为1％V/V，所述DDA溶液含量为100ug/100ml所述复合佐剂组合物，左旋咪唑以盐酸左旋咪唑溶液添加，所述盐酸左旋咪唑溶液为100毫克盐酸左旋咪唑/毫升，所述盐酸左旋咪唑溶液含量为1mg/100ml所述复合佐剂组合物。
3.根据权利要求1所述的复合佐剂组合物，其特征在于，所述的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA和草分枝杆菌培养物；其中，所述PICKCa溶液含量为0.1mg/100ml所述复合佐剂组合物，所述水包油乳剂含量为1％V/V，所述DDA溶液含量为100ug/100ml所述复合佐剂组合物，草分枝杆菌培养物以草分枝杆菌培养物储备溶液添加，所述草分枝杆菌培养物储备溶液含100毫克草分枝杆菌培养物/毫升，所述草分枝杆菌培养物储备溶液含量为0.03mg/100ml所述复合佐剂组合物。
4.根据权利要求1所述的复合佐剂组合物，其特征在于，所述的复合佐剂组合物包含水包油乳剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物、DDA、左旋咪唑和草分枝杆菌培养物；其中，所述PICKCa溶液含量为0.1mg/100ml所述复合佐剂组合物，所述水包油乳剂含量为1％V/V，所述DDA溶液含量为100ug/100ml所述复合佐剂组合物，左旋咪唑以盐酸左旋咪唑溶液添加，所述盐酸左旋咪唑溶液为100毫克盐酸左旋咪唑/毫升，所述盐酸左旋咪唑溶液含量为1mg/100ml所述复合佐剂组合物，草分枝杆菌培养物以草分枝杆菌培养物储备溶液添加，所述草分枝杆菌培养物储备溶液含100毫克草分枝杆菌培养物/毫升，所述草分枝杆菌培养物储备溶液含量为1mg/100ml所述复合佐剂组合物。
5.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包含权利要求1-4任一项所述的复合佐剂组合物和抗原。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的抗原为猪繁殖与呼吸综合征抗原。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的抗原为猪伪狂犬病毒抗原。
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