JP2000219637A - エリシペロスリクス・ルシオパシエ抗原及びワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は丹毒の予防又は抑制のための新規の
ワクチンの提供を目的とする。 【解決手段】 本発明はエリシペロスリクス・ルシオパ
シエ（Erysipelothrix rhusiopathiae) の抗原組成物及
びかかる抗原組成物を含むワクチン製剤に関する。本発
明の抗原は動物の丹毒に対する長期防御を供するうえで
有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はエリシペロスリクス
・ルシオパシエ（丹毒：Erysipelas) 感染症の予防又は
抑制のための抗原組成物及びワクチン製剤、並びにかか
る抗原組成物及びワクチン製剤の作製及び利用方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】丹毒は世界中に分布し、そしてヨーロッ
パ、アジア、オーストラリア並びに北米及び南米全体に
わたって経済的に重要な問題となっている。３ケ月〜３
才のブタが最も丹毒にかかり易い。冒されたブタは往々
にして膨潤且つ剛化した関節を有し、そして効率的に体
重増加しない。更に、その屠殺体は往々にして加工工場
で検査員により排除又は廃棄される。

【０００３】約１０年前、完全に殺菌した培養物から
Ｅ．ルシオパシエワクチンを作る慣習は必要でないこと
が示された。無菌濾液も同様にビルレント負荷に対して
ブタ及びマウスの双方を保護するのに機能する。日本及
び米国科学者によるその後発表された研究はこの発見を
確証し、そしてＥ．ルシオパシエが培養培地の中に、全
てのＥ．ルシオパシエ株に対してブタを免疫する万能免
疫原である抗原を遊離することを示した(Sawada and Ta
kahashi, 1987, Am, J. Vet. Res. 48 : 239-242; Gros
chupら、1991, Epidemiol. Infect. 107 : 637-649) 。
Groschupらは培養物中の６４〜６６kDa のタンパク質が
マウスをビルレントＥ．ルシオパシエの負荷に対して保
護することを示した。かかるタンパク質がブタをも保護
することが示されたため、ＵＳＤＡはこのタンパク質の
アッセイにおいて利用するためのこのタンパク質に対す
るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をワクチンメーカーに
提供している。

【０００４】ブタの丹毒を予防するのに有効なワクチン
は非常に所望されるが、多くの伝統的な丹毒ワクチンの
いずれも離乳したブタに対しては許容される保護を供し
ない。この問題は免疫力の持続の欠如にある。豚産業
は、離乳時に与えたときにブタを屠殺令、即ち、生後約
６ケ月までこの致命的な壊滅的病気に対して保護するワ
クチンを必要とする。ＵＳＤＡは新規のワクチンのライ
センスについての基準としてこの要件を指定している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明はＥ．ルシオパシエの抗原組成物及びか
かる抗原組成物の製法に関する。本発明は更にＥ．ルシ
オパシエの抗原組成物及びアジュバントを含むワクチン
製剤に関する。本発明は更に動物、好ましくは哺乳類又
は鳥類を種痘するために本発明の抗原組成物を利用する
方法に関する。特に、本発明はブタ、子ヒツジ、イヌ、
ウマ、ウシ又はヒトを本発明の抗原で種痘する方法に関
する。

【０００６】一の態様において、Ｅ．ルシオパシエ培養
物の流体画分由来の安定化抗原を述べる。一の観点にお
いて、安定化剤をＥ．ルシオパシエ培養物の上清液又は
濾液、好ましくは濃縮上清液又は濾液に加える。安定化
剤は抗原を吸着することができる。安定化剤の限定でな
い例は水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲ
ル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシ
ウムゲル及びみょうばんである。好適な観点において、
水酸化アルミニウムゲルを濃縮上清液に、水酸化アルミ
ニウムゲルの最終濃度が約１０容量％（即ち、例えば９
容量の上清液と１容量の水酸化アルミニウムゲルとを混
合することにより得られる１０容量％濃度）〜約４０容
量％、より好ましくは約３０容量％となるように加え
る。

【０００７】別の観点において、当該濃縮Ｅ．ルシオパ
シエ培養上清液又は濾液及び安定化剤を含んで成る抗原
製剤は、その抗原をワクチン製剤として利用するために
処方するとき、約１０倍〜約３０倍、好ましくは約２０
倍希釈し、かくして当該ワクチン製剤中の安定化剤の濃
度を約５容量％未満にまで下げる。

【０００８】別の態様において、Ｅ．ルシオパシエを培
養し、そして処理してＥ．ルシオパシエ抗原を含んで成
る上清液又は濾液を得る。一の観点において、Ｅ．ルシ
オパシエ培養物を例えばホルマリン又はベータープロピ
オラクトンの添加により不活性化させる。更なる観点に
おいて、Ｅ．ルシオパシエ培養液を例えば遠心分離によ
り細菌から分離させる。別の更なる観点において、この
上清液を例えば分子濾過により約１０倍に濃縮する。

【０００９】本発明の別の態様において、保存剤、例え
ばメルチオレートを、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）と共に又はそれ抜きで当該抗原に加える。本発明の
更なる態様において、本発明の抗原をアジュバント、例
えばレシチン、油及び１又は複数種の界面活性剤を含ん
で成るアジュバントに加える。本発明の更なる態様にお
いて、本発明の抗原、及びワクチンを動物の種痘に利用
する方法を述べる。

【００１０】本発明は丹毒を予防又は抑制する組成物及
び方法に関する。一の態様において、本発明はＥ．ルシ
オパシエの抗原及びかかる抗原の製法に関する。本発明
は更に本発明の抗原を含むワクチン製剤に関する。本発
明は更に動物、好ましくは哺乳類又は鳥類を種痘するた
めにＥ．ルシオパシエの抗原を利用する方法に関する。
最も好適な観点において、この哺乳類はブタ、子ヒツ
ジ、イヌ、ウマ、ウシ又はヒトから成る群から選ばれ
る。

【００１１】本発明はＥ．ルシオパシエ培養物から得た
抗原に関する。Ｅ．ルシオパシエの任意の株、例えば米
国特許第５，６２５，０３８号に記載の株が本発明の抗
原の起源でありうる。当該抗原の単離されうる培養物は
様々な方法で提供されうる。例えば、この培養物は純粋
又は実質的に純粋であってよい。より好ましくは、本発
明の抗原はＥ．ルシオパシエ培養物の上清液又は濾液か
ら得られる。最も好適な態様において、本発明の抗原は
Ｅ．ルシオパシエの純粋又は実質的に純粋な液体培養物
の上清液又は濾液から得られる。

【００１２】Ｅ．ルシオパシエは当業界公知の様々な方
法で培養してよい。細菌の培養について論ずる米国特許
第５，６２５，０３８；５，６１６，３２８；５，２２
５，１９４；４，９８１，６８５号を参照のこと。例え
ば、Ｅ．ルシオパシエは後述の実施例に記載の通りに培
養してよい。Ｅ．ルシオパシエは Sawada and Takahash
i, 1987, Am, J. Vet. Res. 48 : 239-242及びGroschup
ら、1991, Epidemiol.Infect. 107 : 637-649に記載の
通りに培養してもよい。原核細胞の培養及び処理につい
ての一般的なバックグランドは引用することでその内容
を本明細書に組入れるManiatis, ら、1982, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel,
ら1989,Current Protocols in Molecular Biology, Gre
ene publishing Associates andWiley Interscience, N
Y; Sambrook ら1989, Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, 2d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。

【００１３】好適な態様において、この培養物はホルマ
リン（約０．５容量％の最終濃度）により不活性化す
る。別の好適な態様において、本発明の抗原はＥ．ルシ
オパシエ培養物の上清液又は濾液から得る。好適な態様
において、培養上清液又は濾液を約１０倍に濃縮し、そ
して水酸化アルミニウム（好ましくはＲＥＨＹＤＲＡＧ
ＥＬ（商標））をこの濃縮上清液又は濾液に約３０容量
％の最終濃度となるように加え、この抗原を安定化す
る。別の好適な態様において、当該抗原及びアジュバン
トを含んで成るワクチン製剤を処方し、ここでこのアジ
ュバントは例えばこのワクチン製剤の約２５容量％を占
める。別の好適な態様において、チメロサール（約０．
０１容量％の最終濃度）とＥＤＴＡ（約０．０７容量％
の最終濃度）を保存剤としてこの抗原に添加する。本明
細書で「No. １アジュバント」と称する好適なアジュバ
ントは約２容量％のレシチン、約１８容量％の鉱物油及
び約８容量％の界面活性剤（例えば約５．６容量％のＴ
ｗｅｅｎ ８０と約２．４容量％のＳｐａｎ ８０）を
含んで成り、残りの容量は食塩水溶液（例えばＤｕｌｂ
ｅｃｃｏ ＰＢＳ）で占められる。このアジュバントは
引用することで本明細書に組入れる１９９９年１月２９
日出願の米国特許出願に記載されている。

【００１４】Ｅ．ルシオパシエの不活性化 本発明の抗原はＥ．ルシオパシエから得られ、それは当
業界公知の手段で、例えば液体培養物で供与されうる。
本発明の好適な態様において、抗原の単離されるＥ．ル
シオパシエ培養物は不活性化せしめてからワクチン製剤
の中に抗原として利用する。最も好適な態様において、
Ｅ．ルシオパシエ培養物は不活性化せしめてから細菌よ
り液体画分を分離する。Ｅ．ルシオパシエ培養物の不活
性化は様々な目的のため、例えば殺菌のため、又はプロ
テアーゼの不活性化のため、又は抗原の保存のために実
施する。

【００１５】本発明の抗原を含む培養物は当業界公知の
様々な手段で不活性化させることができる。例えば、こ
の培養物を不活性化剤、即ち、Ｅ．ルシオパシエを殺菌
できる試薬に曝露してよい。本発明の実施において有用
な不活性化剤は動物の免疫応答を誘導し、この動物を丹
毒から保護することを可能にする。当業界に公知の不活
性化剤、例えばホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベー
タープロピオラクトン又はこれらの試薬と似た性質を有
するその他の化学品を使用してよい。細菌の不活性化の
ために適当な化学品は、例えば細菌を特定の化学品と接
触させ、その結果その細菌が殺菌され、且つその抗原が
保護抗体を生産する能力について未だ有効であるかを例
えばその処理細菌で種痘したマウスを介して決定するこ
とにより、当業者により決定できる。細菌の不活性化に
ついては米国特許第５，２２５，１９４号も参照のこ
と。

【００１６】Ｅ．ルシオパシエ培養流体の分離及び濃縮 好適な態様において、本発明の抗原はＥ．ルシオパシエ
培養物の流体画分から得られる。Ｅ．ルシオパシエを培
養し、そしてその細菌を例えば液体培養液の遠心分離又
は濾過により培養液から分離させてよい。本発明の抗原
の単離のために有用なＥ．ルシオパシエの培養物は当業
界に公知の任意の方法で提供されうる。例えば、Ｅ．ル
シオパシエを培養液又は培地の中で増殖させ、細菌を急
速増殖、即ち対数増殖期にすることができうる。好適な
態様において、本発明の抗原の調製のために利用する培
養物は、その培養物の処理を開始する際、対数増殖期、
より好ましくは後期対数増殖期にあるものとする。

【００１７】好適な態様において、Ｅ．ルシオパシエ培
養物を処理して全ての又は実質的に全ての細菌をそれら
が増殖した培養液又は培地から分離する。例えば、約９
０％の細菌、より好ましくは約９５％の細菌、より好ま
しくは約９８％の細菌をその培養液又は培地から除いて
よい。Ｅ．ルシオパシエは培養液又は培地から当業界公
知の任意の手段で分離させることができる。例えば、
Ｅ．ルシオパシエを遠心分離にかけて細菌を培養液又は
培地から分離させることができうる。Ｅ．ルシオパシエ
菌を沈降させることのできる当業界公知の任意の遠心分
離が細胞を培養液又は培地から分離するのに適当であ
る。例えば、連続フロー遠心分離が利用されうる。細菌
をどのようにして培養培地から除くかのバックグランド
はManiatis,ら1982, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY; Ausubel, ら1989, Current Proto
colsin Molecular Biology, Greene publishing Associ
ates and Wiley Interscience, NY; Sambrook ら1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d. ed.,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har
bor, NYに記載されている。

【００１８】別の観点において、Ｅ．ルシオパシエは、
細菌を保持するが、本発明の抗原は保持できないフィル
ターで培養液又は培地を濾過することにより除くことが
できうる。培養液又は培地中の抗原から細菌を分離する
のに適当な数多くのフィルターが当業界において公知で
ある。例えば、細菌を流体画分から分離するのに有用な
フィルターは約０．１ミクロン〜約０．５ミクロン、よ
り好ましくは約０．２ミクロンの平均孔直径を有する。

【００１９】上記のＥ．ルシオパシエの培養物から得ら
れる流体画分は濃縮してよい。一の態様において、この
流体画分は約３〜３０倍、例えば約３倍、又は約６倍、
又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約３
０倍に濃縮してよい。この流体画分は当業界において公
知の任意の手段で濃縮してよい。好適な態様において、
この流体画分は中空ファイバー濾過を利用して濃縮して
よい。一の観点において、中空ファイバー濾過は約５，
０００キロダルトン〜約５０，０００キロダルトン、よ
り好ましくは約１０，０００キロダルトン〜約３０，０
００キロダルトンの分子量カットオフ値で実施する。細
菌培養物の流体画分の濃縮を論ずる米国特許第５，２２
５，１９４号を更に参照のこと。

【００２０】この流体画分は凍結乾燥により濃縮しても
よい。別の観点において、この流体画分は流体画分中の
タンパク質及びポリペプチドの沈殿、しかる後のその沈
殿物の再懸濁により濃縮してよい。タンパク質は当業界
において公知の任意の方法、例えばポリエチレングリコ
ール、エタノール又は硫酸アンモニウムによる沈殿を介
して流体画分から沈殿しうる。沈殿の後、その沈渣をワ
クチン製剤の調製のために適当な任意の溶液、例えば食
塩水溶液に再懸濁してよい。

【００２１】Ｅ．ルシオパシエ抗原の安定化 Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分から得られる抗原は
動物の丹毒を予防又は抑制するのに有効な免疫原であ
る。しかしながら、細菌の除去の後のかかる抗原の安定
性はかかる抗原をワクチン製剤に用いるときに深刻な問
題となる。本発明はこの問題を解決し、そして一部、
Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分の抗原が安定化剤の
添加により安定化されうることの発見に基づくものであ
る。

【００２２】当業界において公知の任意の安定化剤が本
発明の抗原の安定化に利用できうる。好適な態様におい
て、安定化剤はＥ．ルシオパシエ培養流体画分の抗原を
吸着することができる。適当な安定化剤はＥ．ルシオパ
シエ培養物の流体画分の抗原能力を維持せしめることが
でき、又は細菌の除去の後のその抗原能力の低下を遅ら
せることができる。かかる試薬の安定化効果は実験によ
り決定できる。例えば、不活性化Ｅ．ルシオパシエ培養
物の流体画分のサンプル２つを、一方は安定化剤として
のその用途を試験する化学品入りで、そして他方はそれ
抜きで３７℃で所定の期間、例えば約１４〜約２８日間
インキュベーションしてよい。次いでこれらのサンプル
を標準のマウス効能試験（９ＣＦＲ １１３．１１９
（ｃ））に従い、アジュバント、例えばNo. １アジュバ
ントを利用してマウスの種痘で試験する。未処理ワクチ
ンの与えられたグループ又は種痘を施していないコント
ロール動物より、かかる化学品で処理されたワクチンの
与えられたグループにおいて保護された動物の割合が高
くなることは、化学処理ワクチン中の抗原が安定化され
たことを示唆する。

【００２３】上記の実験は貯蔵のために通常利用される
よりも高い温度（３７℃）での加速安定試験を例示す
る。通常、抗原製剤は低温、例えば約２℃〜約８℃で保
存する。３７℃で２８日の安定は通常の低温保存でのよ
り長い期間、即ち、数年の期間にわたる安定性を示唆す
る。一の態様において、この抗原は本発明に従い低温で
約５年まで、より特別には低温で約３年まで安定であ
る。別の態様において、この抗原は本発明に従って低温
で少なくとも１年安定である。

【００２４】抗原を吸着することのできる当業界におい
て公知の様々な抗原、例えば水酸化アルミニウムゲル、
リン酸アルミニウムゲル、リン酸カルシウムゲル、水酸
化亜鉛／水酸化カルシウムゲル及びみょうばん（例えば
カリみょうばん）が安定化剤として有用である。好適な
態様において、水酸化アルミニウムゲル、例えばＲＥＨ
ＹＤＲＡＧＥＬ（商標）が安定化剤として使用される
（金属ゲル及びその用途について論じる米国特許第５，
６１６，３２８及び５，２３２，６９０号を参照のこ
と）。

【００２５】一の態様において、金属水酸化物ゲル、例
えば水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨＹＤＲＡＧ
ＥＬ）を抗原製剤の中に約１０〜約４０容量％、例えば
約１０容量％、又は約２０容量％、又は約３０容量％、
又は約４０容量％の最終濃度となるように加える。好適
な態様において、この水酸化アルミニウムゲル（例えば
ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）を抗原製剤の中に約３０容量％
の最終濃度となるように加える。

【００２６】当該安定化剤を含む抗原製剤はワクチン製
剤を処方するため、例えばアジュバント及び希釈剤、例
えば食塩水を加え、抗原製剤及び安定化剤が希釈される
ようにすることで、利用してよい。かかる希釈は動物に
おける当該ワクチン製剤の所望されない副作用を回避又
は実質的に回避するために有用でありうる。例えば、金
属水酸化物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル（例え
ばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）をワクチン製剤に加えること
により約５倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２
０倍、又は約２５倍、又は約３０倍に希釈する。好適な
態様において、水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨ
ＹＤＲＡＧＥＬ）を約３０容量％の最終濃度で含む抗原
製剤を、このワクチン製剤に添加することを介すること
により約２０倍希釈し、約１．５容量％の最終水酸化ア
ルミニウムゲル濃度にする。

【００２７】Ｅ．ルシオパシエの抗原を含んで成るワク
チン製剤 本発明の抗原は動物を免疫するためにワクチン製剤に使
用できうる。一の態様において、このワクチン製剤は本
発明の抗原及びアジュバントを含む。好適な態様におい
て、本発明のワクチン製剤のために有用なアジュバント
はレシチン、油及び界面活性剤を含んで成る。好適なア
ジュバントの配合されたワクチン製剤は約０．２５〜１
２．５容量％、より好ましくは約０．５〜約５容量％、
そして最も好ましくは約０．５〜１．２５容量％のレシ
チン、約１〜２３容量％、より好ましくは約３．５〜１
０容量％、そして最も好ましくは約４．５容量％の油、
及び約１．５〜約６容量％、より好ましくは約１．５〜
４容量％、そして最も好ましくは約２容量％の両親媒性
界面活性剤を含む。好ましくは、このアジュバントは２
種類の両親媒性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ及びＳｐ
ａｎ系界面活性剤を有し、その一方は当該ワクチン製剤
の水性相に主として存在し（例えばＴｗｅｅｎ ８
０）、そして他方は油相に存在する（例えばＳｐａｎ
８０）。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＳｐａｎ
８０を界面活性剤として用いるとき、Ｔｗｅｅｎ ８０
の濃度はＳｐａｎ ８０の濃度の約１．５〜約３倍、好
ましくは約２倍とする。好適なアジュバントは水性担体
溶液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（例えばＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ）を含む。ワクチン製剤のための
アジュバントに適当なレシチン及び油はＤＲＡＫＥＯＬ
（商標）５Lt鉱油中のレシチンの混合物である。レシチ
ンはGentral Soya, Fort Wayne, Indiana から入手でき
うる。Ｔｗｅｅｎ及びＳｐａｎ系界面活性剤はVan Wate
rs and Rogers, Omaha, Nebraskaから入手できうる。

【００２８】別の態様において、当業界において公知の
アジュバント、例えば、アジュバントについて論じてい
る米国特許第５，８４６，５２７；５，４１７，９７
１；５，２３２，６９０号に記載の油エマルション、水
酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、水酸化亜鉛カ
ルシウム、アブリジン、水酸化アルミニウム、油及びサ
ポニンを本発明のワクチン製剤に利用してよい。

【００２９】好適なワクチン製剤はそのアジュバント組
成物の容量を約１０〜５０容量％、より好ましくは約１
５〜３５容量％、より好ましくは約２０〜３０容量％、
そして最も好ましくは約２５容量％にすることで処方す
る。

【００３０】ワクチン製剤はそのまま、又は医薬もしく
は治療製剤の形態で被検体に投与してよい。当該抗原を
含んで成る医薬製剤は、慣用の混合、溶解、粉砕、糖衣
化、磨砕、乳化、封入、封鎖又は凍結乾燥工程により製
造できうる。医薬製剤は、医薬的に利用できる製剤へと
本発明の抗原を加工するのを助長する１又は複数の生理
学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は助剤を利用
して慣用の手段で配合されうる。

【００３１】全身用製剤には、注射、例えば皮下、皮
内、筋肉内又は腹腔内注射による投与のためにデザイン
されたものが挙げられる。

【００３２】注射のため、当該抗原は水性溶液、好まし
くは生理学的に適合するバッファー、例えばハンク溶
液、リンゲル溶液、リン酸緩衝食塩水、又は任意のその
他の生理食塩水の中に配合してよい。この溶液は処方
剤、例えば懸濁、安定化及び／又は分散剤を含みうる。
他方、このタンパク質は適当なビヒクル、例えば無菌パ
イロジェンフリー水で使用前に構築するための粉末形態
であってよい。

【００３３】上記の製剤に加えて、当該抗原はデポット
製剤として処方してもよい。かかる長期作用性製剤は移
植（例えば皮下式又は筋肉内式）、又は筋肉内注射によ
り投与してよい。かくして、例えば、当該抗原を適当な
ポリマー又は親水性材料（例えば、許容される油中のエ
マルションとして）又はイオン交換樹脂に配合するか、
又は微溶性誘導体、例えば微溶性塩として処方してよ
い。

【００３４】他方、その他の医薬デリバリーシステムを
採用できうる。リポソーム及びエマルションは抗原を搬
送するのに利用されうるデリバリービヒクルの周知の例
である。一定の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシド
を利用してよいが、通常多大な毒性が伴ってしまう。他
に、この抗原は持放システム、例えば治療又は種痘用試
薬を含む固体ポリマーの半透過性マトリックスを利用し
て導入されうる。様々な持放材料が確立されており、そ
して当業者に周知である。持放式カプセルはその化学的
性質に依存して、抗原を数週間から１００日以上にわた
り放出しうる。試薬の化学的性質及び生物学的安定性に
依存して、抗原の安定化のための更なる戦略が採用でき
うる。

【００３５】投与のための抗原の有効な量の決定は、特
に本明細書の開示を参照することで当業者の通常の能力
により行われる。

【００３６】有効用量はまずｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
で概算できる。例えば、当業界周知の技術を利用し、動
物モデルで剤型を処方し、免疫応答の誘導を達成するこ
とができる。当業者は本明細書に記載の結果に基づき全
ての動物種に対する投与を容易に最適化できる。例え
ば、ワクチンとして用いるなら、本発明の抗原は約２〜
３６週間にわたって約１〜約３回投与されうる。ブース
ター投与をその後定期的に付与してよい。その他のプロ
トコールが個々の動物に適しうる。適当な用量とは、上
記の通りに投与したとき、動物をＥ．ルシオパシエ感染
から少なくとも４〜１２ケ月保護するのに十分な免疫応
答を免疫動物において生起できる抗原の量とする。

【００３７】剤型中の抗原の量は不活性化時の培養物の
光学密度（Ｅ₆₂₅ ）で、不透明度単位として特定する。
不活性化時に光学密度が４．０なら、例えばこの培養物
から調製した１mlの培養上清液又は濾液は４不透明度単
位を含み、０．５mlでは２不透明度単位を含む、等々で
あり、それは不透明性の起源である細菌が除かれようと
関係ない。もし、例えば１ml当り５不透明度単位を含む
上清液流体を分子濾過により１２倍濃縮すると、その濃
縮流体は１ml当り６０不透明度単位の値を有するであろ
う。一般に、ワクチン剤型中の抗原の量は約１〜約１２
不透明度単位、好ましくは約２〜約４不透明度単位の範
囲でありうる。適当な剤型容量は注射のルート及び宿主
の大きさにより変わり、典型的には０．１〜約５mlであ
る。好ましくは、宿主がブタのとき、ブタは生後２週間
以上のものとする。

【００３８】

【実施例】以下に紹介する種痘研究は、No. １アジュバ
ントを有する本明細書に記載のワクチンを子ブタに２回
投与養生法で生後約３〜６週のブタに与えると、２回目
の種痘の２０週間後にビルレント負荷に対する有意な保
護が供されることが実証された。No. １アジュバントを
伴う抗原も、血清ＥＬＩＳＡにより示される通り、種痘
の２週間後に実質的な抗体応答も誘導するが、負荷時で
は、これらの力価は減少しており、従って個体の力価は
保護とは密に相関していなかった。サポニンアジュバン
ト中の同じように投与した同抗原は低めのＥＬＩＳＡ力
価を誘導し、そして２回目の種痘の２０週後においてブ
タをビルレント負荷から保護するには不適当であること
が証明された。

【００３９】当該負荷モデルは１０匹のコントロールブ
タが負荷の後に丹毒の臨床的徴候を示したという点で極
めて有効であった（表２）。３匹のブタが高温基準を満
たし、そして他の５匹はＥ．ルシオパシエ株陽性であっ
た。残りの２匹のコントロールブタは上記の基準のいず
れも満たさなかった。しかしながら、それらは数日間元
気がなく、そしてこの病気の特徴である転移性の皮膚損
傷を有しており、従って人道的に殺した。対照的に、N
o. １アジュバントを含むワクチンで種痘したグループ
では、２０匹のブタのうち１５匹が完全に保護されてい
た（表３）。

【００４０】No. １アジュバントを伴う本発明のＥ．ル
シオパシエ抗原を含む実験用ワクチンは、２回投与養生
法で生後約３〜６週の子ブタに与えると、２回目の種痘
の２０週間後のビルレント負荷による臨床的丹毒の発症
に対して有意な保護を供した。後述の表３を参照のこ
と。更に、サポニンアジュバントを伴う類似の実験用ワ
クチンは、同じ養生法に従って子ブタに与えたとき、２
回目の種痘の２０週間後でのビルレント負荷による臨床
的丹毒の発症に対する保護を供しなかった。最後に、本
発明の抗原を含む種痘は、使用するアジュバントに関係
なく、２回目の種痘の２週間後にピークとなる実体的な
血清応答を誘導した。

【００４１】本発明を下記の限定でない実施例により更
に説明する。

【００４２】実施例１．Ｅ．ルシオパシエ培養物 Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ ３３４２を脱イオン水中の
２．７５％の濃度の Difco Proteose Peptone, Difco Y
east Extract (0.55％), Tween 80 (0.2％), K₂HPO₄
(0.217％) 及び KH₂PO₄ (0.061％) を含む培地の中で培
養する。この培地のpHを５ＮのＮａＯＨで７．２に調整
する。この培地を最低１２２℃で３０〜９０分スチーム
滅菌する。オートクレーブ処理の後、無菌５０％デキス
トロース溶液を３％ｗ／ｗの最終濃度となるように加え
る。

【００４３】有効な種（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ）培
養物は冷凍保存物（マイナス７０℃）からマスター種標
本の冷凍試験管を取り出し、急速融解し、そしてその内
容物を培地フラスコに無菌的に移すことにより調製す
る。このフラスコを３７℃で１２〜３６時間振盪しなが
らインキュベーションし、そしてグラム染色により純度
を検定する。純粋であると認められたら、その培養物を
無菌グリセリン（１０％）と混合し、１mlの量づつで冷
凍試験管に分注し、そして冷凍保存する。

【００４４】生産培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄ
ｉｕｍ）を含む種容器に０．０１〜２％のマスター又は
有効種を接種する。１０〜１００リットルの生産培地を
含む種発酵槽を用いる場合、種フラスコ由来の１〜５％
の培養物で接種を行う。２００〜１０，０００リットル
の生産培地を含む生産発酵槽では種発酵槽由来の０．５
〜５％培養物を接種する。

【００４５】生産培養物は３７±２℃の設定値で撹拌し
ながらインキュベーションする。インキュベーション時
間は４〜２４時間で変えてよい。そのインキュベーショ
ン時間の間この培養物に１０Ｎの無菌水酸化ナトリウム
溶液を加えてpHを７．２±0.1 に維持する。増殖期の
間、デキストロースの定期的な添加を行う。

【００４６】回収の前に、この培養物を純度、形態及び
グラム反応について顕微鏡観察する。増殖は培養物の６
２５nmでの光学密度の測定により追跡する。培養物は６
２５nmで４．０以上の光学密度を有するときに回収す
る。

【００４７】実施例２．Ｅ．ルシオパシエワクチンの調
製 ホルマリン溶液を０．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度となる
ように培養物に添加し、この培養物を不活性化させた。
この培養物を無菌タンクに移し、そして３７±２℃のイ
ンキュベーターに最低２４時間（そして最大６０時間）
定常撹拌下に置いた。培養物は直ちに処理するのではな
く、２〜８℃で７日まで保存した。不活性化培養物を連
続フロー遠心分離を介して浄化した。その流体画分を更
なる処理のために保持し、そして細菌を捨てた。

【００４８】実験において、１０×の濃縮を、０．１容
量％の最終濃度のベータープロピオラクトン（「ＢＰ
Ｌ」）又は０．２容量％の最終濃度のホルマリンのいず
れかで不活性化した（３７℃で２４時間以上）Ｅ．ルシ
オパシエ培養物の濾液で行った。Ｅ．ルシオパシエの培
養濾液中に認められる６４〜６６kDのタンパク質 (Gros
chupら、1991, Epidemiol. Infect. 107 : 637-649及び
米国特許第５，６２５，０３８号）に特異的な酵素結合
免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施して、６４〜６
６kDa タンパク質の存在に基づき不活性化及び安定化の
効果を決定した。培養物のホルマリン不活性化がタンパ
ク質のＥＬＩＳＡアッセイ値を低下させるという先の発
見と一致して、ＢＰＬ濃縮物はホルマリン濃縮物の約４
倍のアッセイ値を有した。３７℃で１４日間インキュベ
ーションした後、ＢＰＬ濃縮物はホルマリン濃縮物につ
いての約４０％と比べ、その値の約８０％を失った。し
かしながら、双方の場合において、安定化剤としての３
０容量％のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬの事前添加は、以降に
示す通り、損失をほとんど防ぎ、そして事実上ホルマリ
ン製剤の場合その全てを保持せしめた。ブタでの小試験
は、ホルマリン不活性化培養物の流体画分がＢＰＬで不
活性化した培養物のそれより、ビルレントＥ．ルシオパ
シエによる負荷に対するブタの保護において有効である
ことを示した。

【００４９】当該流体を遠心分離後の中空ファイバー濾
過（見かけ上×１０，０００キロダルトンの分子量カッ
トオフ値）により６×〜２０×（通常は約１０×）に濃
縮した。この流体を濃縮の後に水酸化アルミニウムゲル
を添加することにより安定にした。

【００５０】免疫原を安定化するため、水酸化アルミニ
ウムゲルを撹拌しながら濃縮流体に最終的に３０容量％
（３０容量のゲル、対、７０容量の濃縮物）となるよう
にゆっくりと加えた。ワクチン中でのこの濃縮物の２０
倍希釈の後、Ａｌゲル含有量はわずか約１．５％にすぎ
ず、注射部位に陰性反応を及ぼすには足りなかった。１
０倍濃縮したＥ．ルシオパシエ培養流体画分中の全ての
保護タンパク質を吸着させるのに必要なＡｌゲルの量を
決定する滴定は、９５％超が３２容量％のＲＥＨＹＤＲ
ＡＧＥＬ（Reheis, Berkley Heights, New Jersey)に吸
着されることを示した。チメロサール（即ち、ＭＥＲＴ
ＨＩＯＬＡＴＥ（商標））（Dimportex,Spain; Flavine
Inc., Klosters, New Jerseyを介して輸入) を保存剤
としてこの製品に、約０．０１容量％の最終濃度となる
ように加えた。チメロサールの濃度は当該抗原組成物及
び本発明の抗原を含むワクチン製剤中で約０．０１ｗ／
ｖに保った。ＥＤＴＡ（Sigma, St. Louis, Missouri)
を約０．０７％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように加え
た。

【００５１】使用するアジュバントはNo. １アジュバン
トとした。１０００mlのNo. １アジュバントを２００ml
のフィルター除菌レシチン−油溶液（ＤＲＡＫＥＯＬ
（商標）鉱油中の１０％のレシチン）、オートクレーブ
処理Ｔｗｅｅｎ ８０（５６ml）及びＳｐａｎ ８０
（２４ml）、並びにリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏＰＢＳ）（７２０ml）から作った。このレシチン−油
溶液及びＳｐａｎ ８０を合わせ、そして無菌タンクの
中で室温で少なくとも１時間、乳化が完了するまで混合
した。食塩水及びＴｗｅｅｎ ８０を合わせ、そして無
菌タンクの中で室温で少なくとも１時間混合した。油混
合物をＲｏｓｓ乳化機を利用して水性混合物と乳化させ
た。乳化は全てのアジュバントが食塩水の中に添加され
るまで再循環により続いた。このエマルションをＧｏｕ
ｌｉｎプレスに室温で２回かけた。このアジュバントを
２〜８℃で保存した。

【００５２】５Ｌのワクチンを、１Ｌのアジュバントを
３Ｌの水性相に加えることにより作った。この水性相
は、２ml用量のワクチン当り３．２不透明度単位の最終
抗原含有量にするのに十分な安定化濃縮物と、その容量
を５Ｌにするのに十分な食塩水とを含んで成る。不透明
度単位は回収時の光学密度（Ｅ₆₂₅ ）×濃縮係数と定義
する。

【００５３】実施例３．ブタのＥ．ルシオパシエ種痘及
び負荷 Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ ３３４２の８番目の継代培養
物（ＭＳ＋８）をワクチンの製造に用いた。不活性化時
での培養物の光学密度（OD）から計算して、１用量レベ
ルの安定化、浄化Ｅ．ルシオパシエ抗原（３．２不透明
度単位〔OU〕）を利用した。１OUは１OD (６２５nmで決
定) を有する１mlの流体に相当する。No. １アジュバン
ト又はサポニン（０．０５ｗ／ｖ；Berghansen Chemica
l Company, Cincinnati, Ohio から入手）をアジュバン
トとして用いた。詳しくは、Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ
３３４２の培養物を５．２８のODになるまで増殖させ
た。この培養物を０．５％のホルマリンで２４時間不活
性化させた。不活性化の後、この細菌を遠心分離により
除去した。その流体画分を１０，０００kDa の見かけ上
分子量カットオフ値を有する限外濾過ユニットを利用し
て濃縮した。その流体画分を約１３．４倍濃縮した。そ
の抗原を、この濃縮材料にＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（３０
容量％）を加えることにより安定化させた。吸着した濃
縮物をワクチン配合まで４℃で保存した。ワクチンはア
ジュバントとしてNo. １アジュバント又は０．０５％の
サポニンで処方した。安定化抗原を食塩水（１５０mMの
塩化ナトリウム及び４mMのリン酸塩) に希釈し、最終濃
度とした。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．０
７％）及びチロメサール（０．０１％）を最終ワクチン
製剤に加えた。リン酸緩衝食塩水を偽薬として利用し
た。表１は処理グループ、ワクチン処理、並びに種痘及
び負荷を施した子ブタの数をまとめる。

【００５４】

【表１】 満足たる負荷が高い体温（少なくとも２日連続での４
０．９℃（１０５．６°Ｆ）以上）、死体解剖時での培
養物、及び／又はＥ．ルシオパシエによる感染症の特徴
的な臨床徴候により、コントロール動物において明示さ
れた。この病気の特徴と考えられる臨床徴候には突然
死、元気のなさ、腹部及び耳の充血、転移性皮膚損傷、
及び剛性又は関節巻き込み（ｊｏｉｎｔ ｉｎｖｏｌｖ
ｅｍｅｎｔ）が挙げられる。臨床的徴候は有するが、体
温基準に満たないブタは殺し、そして血液、脾臓及び肝
臓を培養してＥ．ルシオパシエの単離を試みた。

【００５５】Ｆｉｓｈｅｒの抽出試験を、種々のワクチ
ンで保護される動物のパーセンテージに差があるかを調
べるために利用した（ｐ＜０．０５）。色々の投与グル
ープをコントロールと比較するため、及び各々のグルー
プを他の全ての投与グループの平均値と比較するため、
事前対比を構築した。付与するワクチンのタイプ及び子
ブタの各グループの血清学的応答との関係をロジスチッ
ク回帰を利用して、生後２ケ月、３ケ月、４ケ月、５ケ
月のブタ、並びに負荷前（ｐｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）
血液について行った。負荷時期でのワクチン誘導力価と
疾患状態（保護／非保護）との関係をロジスチック回帰
を利用して評価した。５％の有意差レベルを真の関係の
宣言のために用いた。

【００５６】Ｅ．ルシオパシエに対して低い（＃８０
０）ＥＬＩＳＡ血清力価を有する２０匹の妊娠雌ブタ／
若い雌ブタをRiddell Farms, Albert City, IAから獲得
し、そしてUniversity of Nebraska Department of Vet
erinary and Biological Sciences の隔離室の中で飼育
した。

【００５７】ＥＬＩＳＡ血清力価は下記の通りにして完
全細胞直接抗原結合ＥＬＩＳＡで決定した。抗原コート
プレートの調製及びかかるプレートを利用するＥＬＩＳ
Ａの記載した米国特許第４，９１８，１６３号を参照の
こと。第一に、Ｅ．ルシオパシエを実施例１に記載の通
りに増殖させ、そして対数増殖期培養物から回収した。
６４０nmでの光学密度を記録し、そして種々の光学密度
を有する溶液から細菌のカウント数を介して樹立した表
を利用して細胞数／mlに換算した。生きた細菌をＰＢＳ
（Dulbecco PBS, Sigma, St. Louis, Missouri) に約
１．１×１０⁹ 細胞／mlの密度にまで希釈した。このＰ
ＢＳに希釈した生きた細菌をＥＬＩＳＡ用のプレートに
結合させた。プレートの準備のため、ＰＢＳ中の１００
μｌの０．１容量％のグルタルアルデヒド（Sigma, St.
Louis, Missouri) を各ウェルに加え、これらのウェル
にカバーをし、そしてそのプレートを３７℃で１時間イ
ンキュベーションした。ＰＢＳ中のグルタルアルデヒド
を各ウェルから取り出し、そしてそれらのウェルを吸収
タオルで乾かした。ＰＢＳ中の約１．１×１０⁹ 細胞／
mlの密度の生きた細菌１００μｌを各ウェルに加えた。
これらのプレートを２０００pmで５分、２２℃で遠心分
離した。次いで２００μｌのＰＢＳ（ＰＶＡ／ＰＢＳ）
中の１％のポリビニルアルコール（Aldrich, Milwauke
e, Wisconsin)を各ウェルに加え、これらのウェルにカ
バーをし、そしてこれらのプレートを４℃で一夜放置し
た。プレートのウェルの内容物を殺菌溶液に移し、そし
てウェルをＰＢＳで洗浄した。これらのウェルをガーゼ
でカバーし、そして室温で乾かした（約１時間）。

【００５８】ＥＬＩＳＡ手順を下記の通りにして結合細
菌完全細胞病原を有するプレートを利用して実施した。
第一に、陽性コントロールを含むブタ血清を１％のＰＶ
Ａ／ＰＢＳに希釈した。未知の血清全てを１：５０に希
釈し、そして陽性コントロールを１：２００で利用し
た。２００μｌづつの各サンプルをＡ列の行のウェルに
加えた。１００μｌの１％のＰＶＡ／ＰＢＳを残りのウ
ェルに加えた。各サンプルに基づく２倍系列希釈を列Ｂ
〜Ｈにかけて行った。ウェルにカバーをし、そして３７
℃で１時間インキュベーションした。次いで、ウェルを
ＰＢＳＴで３回洗浄した。１％のＰＶＡ／ＰＢＳ中に調
製した１００μｌの１：２０００の希釈率のヤギ抗ブタ
ＩｇＧ（ＨとＬ）ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ki
rkegaard and Perry, Gaitherburg, Maryland)を各ウェ
ルに加えた。これらのウェルに再びカバーをし、そして
３７℃で１時間インキュベーションした。これらのウェ
ルをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＡＢＴＳ基
質（Kirkegaard and Perry,Gaitherburg, Maryland よ
り入手した２，２′−アジノ−ジ−（３−エチルベンズ
チアゾリンスルホン酸））を各ウェルに加え、そしてこ
れらのプレートを室温で１０分インキュベーションし
た。これらのプレートをマイクロプレートシェーカー上
で１０秒振盪し、次いでプレートリーダーブラックを利
用して４０５〜４９０nmにて各ウェルの吸収を測定し
た。各未知の血清の終点力価は、その吸収が１：３２０
０の希釈率の陽性コントロールの吸収より大きい血清希
釈率とした。

【００５９】雌ブタを分娩の０〜１０日前に採血して、
そのＥ．ルシオパシエ抗体力価を決定した。子ブタを雌
ブタの血清力価及び分娩日を基準にランダムに分けた。
これらの雌ブタ／若い雌ブタ由来の５８匹の子ブタから
採血し、そして２種類の実験用Ｅ．ルシオパシエワクチ
ンのいずれか一方又は偽薬で生後約３週間目に種痘を施
した（表１に記載のグループ）。生後約４週で子ブタは
離乳した。生後約６週で子ブタから採血し、そして同じ
ワクチンで再種痘した。生後約２，３，４及び５ケ月で
全てのブタから採血した。生後約５．５ケ月目に、やせ
たブタ全てを研究から外した。生後約６ケ月で（２回目
の種痘の２０週間後）、ブタから採血し、そして４０匹
のブタにNational Veterinary Services Laboratory よ
り投与された培養物から増殖させたＥ．ルシオパシエの
ビルレント培養物２ml（２３７マウスＬＤ₅₀、１．７４
×１０⁹ コロニー形成単位／ml）で筋肉内負荷を施し
た。動物を負荷の２日前、負荷の日、及び負荷の７日後
に臨床疾患の徴候及び直腸温度について追跡した。高温
直腸温度の基準（４０．９℃）を満たす任意のコントロ
ール動物を研究から外し、そして注射ペニシリンで処置
した。病気の臨床徴候を有するが、高温直腸温度基準を
満たさない任意のコントロール動物を人道的に殺し、死
体解剖にかけ、そして全血、脾臓及び肝臓のサンプルを
Ｅ．ルシオパシエについて培養した。任意の死亡したコ
ントロール動物を死体解剖にかけ、そして脾臓及び肝臓
をＥ．ルシオパシエについて培養した。高温直腸温度の
基準（４０．９℃）及び／又は病気の臨床徴候を満たす
任意の種痘を施した動物を研究から外し、そして注射ペ
ニシリンで処置した。負荷の後に死亡した任意の種痘を
施した動物を死体解剖にかけ、そして脾臓及び肝臓のサ
ンプルをＥ．ルシオパシエについて培養した。Ｅ．ルシ
オパシエに対する抗体力価を上記のＥＬＩＳＡにより決
定し、そして抗体力価と臨床保護との相関を行った。

【００６０】ＥＬＩＳＡ力価は雌ブタから得た単一の血
液サンプル由来の血清及び子ブタからの７回の採血時期
由来の血液サンプル全てについて決定した。好気性細菌
培養（４８時間、３７℃、血液アガー）を死亡した又は
致死注射により殺したブタから得た血液並びに／又は脾
臓及び肝臓のサンプルに対して実施した。

【００６１】結果 コントロールブタのＥ．ルシオパシエ負荷の結果を表２
にまとめる。１０匹のブタ全てが丹毒について陽性であ
った。

【００６２】

【表２】

【００６３】No. １アジュバントを伴うワクチン（Ｔ０
２）を付与したブタのＥ．ルシオパシエ負荷のブタの結
果を表３にまとめる。２０匹のブタのうち１５匹（７５
％）が完全に保護された。

【００６４】

【表３】

【００６５】サポニンアジュバントを伴うワクチン（Ｔ
０３）を付与したブタのＥ．ルシオパシエ負荷の結果を
表４にまとめる。一匹のブタしか保護されなかった。

【表４】

【００６６】子ブタグループの幾何学的平均ＥＬＩＳＡ
力価（「ＧＭＴ」）を表５に示す。

【００６７】

【表５】

【００６８】子ブタは１回目の種痘時では非常に低い
Ｅ．ルシオパシエに特異的な抗体力価を有した。これら
の力価は５０〜２００未満の範囲にあった。コントロー
ルの子ブタでは、ＧＭＴは研究の間若干上昇し、ＥＬＩ
ＳＡが老齢のブタにあまり特異的でないことを示唆し
た。

【００６９】アジュバントとしてNo. １アジュバント又
はサポニンのいずれかを伴うワクチンは２回目の種痘の
２週間後（生後約２ケ月）にピークとなる統計学的に有
意な（ｐ＝０．０００１）血清応答を誘導した。双方の
グループの力価は経時的に降下し続け（生後約５ケ月ま
で）、No. １アジュバント中の抗原を受容した子ブタの
ＧＭＴは全時点においてサポニンアジュバント中の抗原
を受容した子ブタのＧＭＴより明らかに高かった。負荷
時において、No. １アジュバント中の抗原を受容したブ
タのＧＭＴはコントロールのＧＭＴの２倍より若干高
く、一方サポニンアジュバント中の抗原を受容したブタ
のＧＭＴはコントロールの２倍より若干低かった。負荷
後の臨床疾患からの保護は個々のＥＬＩＳＡ力価と相関
しなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、興味深い
観察はNo. １アジュバント中の抗原を付与したブタにお
ける２回目の種痘の２週間後に観察されたピーク力価に
あった。No. １アジュバント中の抗原で種痘を施した２
０匹の子ブタのうち、８匹が２８００以上のピーク力価
を有し（８／８が負荷から保護）、８匹が６４００のピ
ーク力価を有し（６／８が負荷から保護）、そして４匹
が３２００のピークを有し（１／４が負荷から保護）、
６４００以上の力価が長期保護の指標であることを示唆
した。

【００７０】まとめると、１０匹の無種痘コントロール
が感染した。No. １アジュバントを有するワクチンを与
えたブタのグループでは、２０匹のうち１５匹が保護さ
れた。アジュバントとしてのサポニンを有するワクチン
を与えたブタのグループでは、１０匹のうち１匹しか保
護されなかった。

【００７１】実施例４．Ａｌゲルによる抗原の安定化 前述の通りＡｌゲルによる抗原の処理を含んで、ワクチ
ンを実施例１〜３に記載の通りに調製した。ワクチンを
ブタで効能について試験した。ブタを筋肉内（ＩＭ）で
与える２回の２ml投与により種痘し、１回目の投与は約
３週目にて（離乳）、そして２回目の投与はその３週後
に施した。コントロールは偽薬としてリン酸緩衝食塩水
を受容した。免疫力に対して、生後約９週目においてビ
ルレントＥ．ルシオパシエの１Ｍ注射の負荷をかけた。
表６に示すように、種痘による保護は９週目に１００％
となった。このワクチンはブタを種痘する時には既に１
２ケ月経たものであった。この結果は保護抗原が有効に
安定化されたことを確証する。

【００７２】

【表６】

【００７３】備考：２０番のブタは排除した。それは非
常に気の荒い動物であり、その体温を計ることができな
いほどに凶暴に暴れた。負荷の後もこのブタは完全に健
康であり続けた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リーロイ アレン スウェアリンギン アメリカ合衆国，コネチカット 06385, ウォーターフォード，ボークスホール ス トリート エクステンション 653 (72)発明者 ブライアン トーマス スイーター アメリカ合衆国，ネブラスカ 68516，リ ンカーン，プラム クリーク ドライブ 7425

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エリシペロスリクス・ルシオパシエ（豚
   丹毒菌：Erysipelothrix rhusiopathie)培養物由来の流
   体画分及び安定化剤を含んで成る抗原組成物。
2. 【請求項２】 前記安定化剤が金属水酸化物、金属リン
   酸塩、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲ
   ル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシ
   ウムゲル又はみょうばんである、請求項１記載の抗原組
   成物。
3. 【請求項３】 前記エリシペロスリクス・ルシオパシエ
   培養物が不活性化されている、請求項１記載の抗原組成
   物。
4. 【請求項４】 前記エリシペロスリクス・ルシオパシエ
   培養物がホルマリン又はベータープロピオラクタンで不
   活性化されている、請求項３記載の抗原組成物。
5. 【請求項５】 前記流体画分が約３〜３０倍濃縮されて
   いる、請求項１記載の抗原組成物。
6. 【請求項６】 請求項１記載の抗原組成物及びアジュバ
   ント組成物を含んで成るワクチン製剤。
7. 【請求項７】 前記アジュバント組成物が約０．２５〜
   １２．５容量％のレシチン、約１〜２３容量％の油、及
   び約１．５〜６容量％の両親媒性界面活性剤を前記ワク
   チン製剤内に含んで成る、請求項６記載のワクチン製
   剤。
8. 【請求項８】 エリシペロスリクス・ルシオパシエ培養
   物由来の流体画分に安定化剤を添加することを含んで成
   る、抗原組成物の作製方法。
9. 【請求項９】 有効な量の請求項１記載の抗原組成物を
   ヒトを除く動物に投与することを含んで成る、動物の種
   痘方法。
10. 【請求項１０】 前記動物がブタである、請求項９記載
    の動物の種痘方法。
11. 【請求項１１】 有効な量の請求項６記載のワクチン製
    剤を動物に投与することを含んで成る、動物の種痘方
    法。