JP4714167B2 - エリシペロスリクス・ルシオパシエ抗原及びワクチン組成物 - Google Patents

Description

本発明はエリシペロスリクス・ルシオパシエ（丹毒：Erysipelas) 感染症の予防又は抑制のための抗原組成物及びワクチン製剤、並びにかかる抗原組成物及びワクチン製剤の作製及び利用方法に関する。

丹毒は世界中に分布し、そしてヨーロッパ、アジア、オーストラリア並びに北米及び南米全体にわたって経済的に重要な問題となっている。３ケ月〜３才のブタが最も丹毒にかかり易い。冒されたブタは往々にして膨潤且つ剛化した関節を有し、そして効率的に体重増加しない。更に、その屠殺体は往々にして加工工場で検査員により排除又は廃棄される。

約１０年前、完全に殺菌した培養物からＥ．ルシオパシエワクチンを作る慣習は必要でないことが示された。無菌濾液も同様にビルレント負荷に対してブタ及びマウスの双方を保護するのに機能する。日本及び米国科学者によるその後発表された研究はこの発見を確証し、そしてＥ．ルシオパシエが培養培地の中に、全てのＥ．ルシオパシエ株に対してブタを免疫する万能免疫原である抗原を遊離することを示した(Sawada and Takahashi, 1987, Am, J. Vet. Res. 48 : 239-242; Groschupら、1991, Epidemiol. Infect. 107 : 637-649) 。Groschupらは培養物中の６４〜６６kDa のタンパク質がマウスをビルレントＥ．ルシオパシエの負荷に対して保護することを示した。かかるタンパク質がブタをも保護することが示されたため、ＵＳＤＡはこのタンパク質のアッセイにおいて利用するためのこのタンパク質に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をワクチンメーカーに提供している。

ブタの丹毒を予防するのに有効なワクチンは非常に所望されるが、多くの伝統的な丹毒ワクチンのいずれも離乳したブタに対しては許容される保護を供しない。この問題は免疫力の持続の欠如にある。豚産業は、離乳時に与えたときにブタを屠殺令、即ち、生後約６ケ月までこの致命的な壊滅的病気に対して保護するワクチンを必要とする。ＵＳＤＡは新規のワクチンのライセンスについての基準としてこの要件を指定している。

本発明はＥ．ルシオパシエの抗原組成物及びかかる抗原組成物の製法に関する。本発明は更にＥ．ルシオパシエの抗原組成物及びアジュバントを含むワクチン製剤に関する。本発明は更に動物、好ましくは哺乳類又は鳥類を種痘するために本発明の抗原組成物を利用する方法に関する。特に、本発明はブタ、子ヒツジ、イヌ、ウマ、ウシ又はヒトを本発明の抗原で種痘する方法に関する。

一の態様において、Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分由来の安定化抗原を述べる。一の観点において、安定化剤をＥ．ルシオパシエ培養物の上清液又は濾液、好ましくは濃縮上清液又は濾液に加える。安定化剤は抗原を吸着することができる。安定化剤の限定でない例は水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル及びみょうばんである。好適な観点において、水酸化アルミニウムゲルを濃縮上清液に、水酸化アルミニウムゲルの最終濃度が約１０容量％（即ち、例えば９容量の上清液と１容量の水酸化アルミニウムゲルとを混合することにより得られる１０容量％濃度）〜約４０容量％、より好ましくは約３０容量％となるように加える。

別の観点において、当該濃縮Ｅ．ルシオパシエ培養上清液又は濾液及び安定化剤を含んで成る抗原製剤は、その抗原をワクチン製剤として利用するために処方するとき、約１０倍〜約３０倍、好ましくは約２０倍希釈し、かくして当該ワクチン製剤中の安定化剤の濃度を約５容量％未満にまで下げる。

別の態様において、Ｅ．ルシオパシエを培養し、そして処理してＥ．ルシオパシエ抗原を含んで成る上清液又は濾液を得る。一の観点において、Ｅ．ルシオパシエ培養物を例えばホルマリン又はベータープロピオラクトンの添加により不活性化させる。更なる観点において、Ｅ．ルシオパシエ培養液を例えば遠心分離により細菌から分離させる。別の更なる観点において、この上清液を例えば分子濾過により約１０倍に濃縮する。

本発明の別の態様において、保存剤、例えばメルチオレートを、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に又はそれ抜きで当該抗原に加える。本発明の更なる態様において、本発明の抗原をアジュバント、例えばレシチン、油及び１又は複数種の界面活性剤を含んで成るアジュバントに加える。本発明の更なる態様において、本発明の抗原、及びワクチンを動物の種痘に利用する方法を述べる。

本発明は丹毒を予防又は抑制する組成物及び方法に関する。一の態様において、本発明はＥ．ルシオパシエの抗原及びかかる抗原の製法に関する。本発明は更に本発明の抗原を含むワクチン製剤に関する。本発明は更に動物、好ましくは哺乳類又は鳥類を種痘するためにＥ．ルシオパシエの抗原を利用する方法に関する。最も好適な観点において、この哺乳類はブタ、子ヒツジ、イヌ、ウマ、ウシ又はヒトから成る群から選ばれる。

本発明はＥ．ルシオパシエ培養物から得た抗原に関する。Ｅ．ルシオパシエの任意の株、例えば米国特許第５，６２５，０３８号に記載の株が本発明の抗原の起源でありうる。当該抗原の単離されうる培養物は様々な方法で提供されうる。例えば、この培養物は純粋又は実質的に純粋であってよい。より好ましくは、本発明の抗原はＥ．ルシオパシエ培養物の上清液又は濾液から得られる。最も好適な態様において、本発明の抗原はＥ．ルシオパシエの純粋又は実質的に純粋な液体培養物の上清液又は濾液から得られる。

Ｅ．ルシオパシエは当業界公知の様々な方法で培養してよい。細菌の培養について論ずる米国特許第５，６２５，０３８；５，６１６，３２８；５，２２５，１９４；４，９８１，６８５号を参照のこと。例えば、Ｅ．ルシオパシエは後述の実施例に記載の通りに培養してよい。Ｅ．ルシオパシエは Sawada and Takahashi, 1987, Am, J. Vet. Res. 48 : 239-242及びGroschupら、1991, Epidemiol. Infect. 107 : 637-649に記載の通りに培養してもよい。原核細胞の培養及び処理についての一般的なバックグランドは引用することでその内容を本明細書に組入れるManiatis, ら、1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, ら1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook ら1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。

好適な態様において、この培養物はホルマリン（約０．５容量％の最終濃度）により不活性化する。別の好適な態様において、本発明の抗原はＥ．ルシオパシエ培養物の上清液又は濾液から得る。好適な態様において、培養上清液又は濾液を約１０倍に濃縮し、そして水酸化アルミニウム（好ましくはＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（商標））をこの濃縮上清液又は濾液に約３０容量％の最終濃度となるように加え、この抗原を安定化する。別の好適な態様において、当該抗原及びアジュバントを含んで成るワクチン製剤を処方し、ここでこのアジュバントは例えばこのワクチン製剤の約２５容量％を占める。別の好適な態様において、チメロサール（約０．０１容量％の最終濃度）とＥＤＴＡ（約０．０７容量％の最終濃度）を保存剤としてこの抗原に添加する。本明細書で「No. １アジュバント」と称する好適なアジュバントは約２容量％のレシチン、約１８容量％の鉱物油及び約８容量％の界面活性剤（例えば約５．６容量％のＴｗｅｅｎ ８０と約２．４容量％のＳｐａｎ ８０）を含んで成り、残りの容量は食塩水溶液（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ）で占められる。このアジュバントは引用することで本明細書に組入れる１９９９年１月２９日出願の米国特許出願に記載されている。

Ｅ．ルシオパシエの不活性化
本発明の抗原はＥ．ルシオパシエから得られ、それは当業界公知の手段で、例えば液体培養物で供与されうる。本発明の好適な態様において、抗原の単離されるＥ．ルシオパシエ培養物は不活性化せしめてからワクチン製剤の中に抗原として利用する。最も好適な態様において、Ｅ．ルシオパシエ培養物は不活性化せしめてから細菌より液体画分を分離する。Ｅ．ルシオパシエ培養物の不活性化は様々な目的のため、例えば殺菌のため、又はプロテアーゼの不活性化のため、又は抗原の保存のために実施する。

本発明の抗原を含む培養物は当業界公知の様々な手段で不活性化させることができる。例えば、この培養物を不活性化剤、即ち、Ｅ．ルシオパシエを殺菌できる試薬に曝露してよい。本発明の実施において有用な不活性化剤は動物の免疫応答を誘導し、この動物を丹毒から保護することを可能にする。当業界に公知の不活性化剤、例えばホルマリン（ホルムアルデヒド）、ベータープロピオラクトン又はこれらの試薬と似た性質を有するその他の化学品を使用してよい。細菌の不活性化のために適当な化学品は、例えば細菌を特定の化学品と接触させ、その結果その細菌が殺菌され、且つその抗原が保護抗体を生産する能力について未だ有効であるかを例えばその処理細菌で種痘したマウスを介して決定することにより、当業者により決定できる。細菌の不活性化については米国特許第５，２２５，１９４号も参照のこと。

Ｅ．ルシオパシエ培養流体の分離及び濃縮
好適な態様において、本発明の抗原はＥ．ルシオパシエ培養物の流体画分から得られる。Ｅ．ルシオパシエを培養し、そしてその細菌を例えば液体培養液の遠心分離又は濾過により培養液から分離させてよい。本発明の抗原の単離のために有用なＥ．ルシオパシエの培養物は当業界に公知の任意の方法で提供されうる。例えば、Ｅ．ルシオパシエを培養液又は培地の中で増殖させ、細菌を急速増殖、即ち対数増殖期にすることができうる。好適な態様において、本発明の抗原の調製のために利用する培養物は、その培養物の処理を開始する際、対数増殖期、より好ましくは後期対数増殖期にあるものとする。

好適な態様において、Ｅ．ルシオパシエ培養物を処理して全ての又は実質的に全ての細菌をそれらが増殖した培養液又は培地から分離する。例えば、約９０％の細菌、より好ましくは約９５％の細菌、より好ましくは約９８％の細菌をその培養液又は培地から除いてよい。Ｅ．ルシオパシエは培養液又は培地から当業界公知の任意の手段で分離させることができる。例えば、Ｅ．ルシオパシエを遠心分離にかけて細菌を培養液又は培地から分離させることができうる。Ｅ．ルシオパシエ菌を沈降させることのできる当業界公知の任意の遠心分離が細胞を培養液又は培地から分離するのに適当である。例えば、連続フロー遠心分離が利用されうる。細菌をどのようにして培養培地から除くかのバックグランドはManiatis, ら1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, ら1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook ら1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。

別の観点において、Ｅ．ルシオパシエは、細菌を保持するが、本発明の抗原は保持できないフィルターで培養液又は培地を濾過することにより除くことができうる。培養液又は培地中の抗原から細菌を分離するのに適当な数多くのフィルターが当業界において公知である。例えば、細菌を流体画分から分離するのに有用なフィルターは約０．１ミクロン〜約０．５ミクロン、より好ましくは約０．２ミクロンの平均孔直径を有する。

上記のＥ．ルシオパシエの培養物から得られる流体画分は濃縮してよい。一の態様において、この流体画分は約３〜３０倍、例えば約３倍、又は約６倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約３０倍に濃縮してよい。この流体画分は当業界において公知の任意の手段で濃縮してよい。好適な態様において、この流体画分は中空ファイバー濾過を利用して濃縮してよい。一の観点において、中空ファイバー濾過は約５，０００キロダルトン〜約５０，０００キロダルトン、より好ましくは約１０，０００キロダルトン〜約３０，０００キロダルトンの分子量カットオフ値で実施する。細菌培養物の流体画分の濃縮を論ずる米国特許第５，２２５，１９４号を更に参照のこと。

この流体画分は凍結乾燥により濃縮してもよい。別の観点において、この流体画分は流体画分中のタンパク質及びポリペプチドの沈殿、しかる後のその沈殿物の再懸濁により濃縮してよい。タンパク質は当業界において公知の任意の方法、例えばポリエチレングリコール、エタノール又は硫酸アンモニウムによる沈殿を介して流体画分から沈殿しうる。沈殿の後、その沈渣をワクチン製剤の調製のために適当な任意の溶液、例えば食塩水溶液に再懸濁してよい。

Ｅ．ルシオパシエ抗原の安定化
Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分から得られる抗原は動物の丹毒を予防又は抑制するのに有効な免疫原である。しかしながら、細菌の除去の後のかかる抗原の安定性はかかる抗原をワクチン製剤に用いるときに深刻な問題となる。本発明はこの問題を解決し、そして一部、Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分の抗原が安定化剤の添加により安定化されうることの発見に基づくものである。

当業界において公知の任意の安定化剤が本発明の抗原の安定化に利用できうる。好適な態様において、安定化剤はＥ．ルシオパシエ培養流体画分の抗原を吸着することができる。適当な安定化剤はＥ．ルシオパシエ培養物の流体画分の抗原能力を維持せしめることができ、又は細菌の除去の後のその抗原能力の低下を遅らせることができる。かかる試薬の安定化効果は実験により決定できる。例えば、不活性化Ｅ．ルシオパシエ培養物の流体画分のサンプル２つを、一方は安定化剤としてのその用途を試験する化学品入りで、そして他方はそれ抜きで３７℃で所定の期間、例えば約１４〜約２８日間インキュベーションしてよい。次いでこれらのサンプルを標準のマウス効能試験（９ＣＦＲ １１３．１１９（ｃ））に従い、アジュバント、例えばNo. １アジュバントを利用してマウスの種痘で試験する。未処理ワクチンの与えられたグループ又は種痘を施していないコントロール動物より、かかる化学品で処理されたワクチンの与えられたグループにおいて保護された動物の割合が高くなることは、化学処理ワクチン中の抗原が安定化されたことを示唆する。

上記の実験は貯蔵のために通常利用されるよりも高い温度（３７℃）での加速安定試験を例示する。通常、抗原製剤は低温、例えば約２℃〜約８℃で保存する。３７℃で２８日の安定は通常の低温保存でのより長い期間、即ち、数年の期間にわたる安定性を示唆する。一の態様において、この抗原は本発明に従い低温で約５年まで、より特別には低温で約３年まで安定である。別の態様において、この抗原は本発明に従って低温で少なくとも１年安定である。

抗原を吸着することのできる当業界において公知の様々な抗原、例えば水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル及びみょうばん（例えばカリみょうばん）が安定化剤として有用である。好適な態様において、水酸化アルミニウムゲル、例えばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（商標）が安定化剤として使用される（金属ゲル及びその用途について論じる米国特許第５，６１６，３２８及び５，２３２，６９０号を参照のこと）。

一の態様において、金属水酸化物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）を抗原製剤の中に約１０〜約４０容量％、例えば約１０容量％、又は約２０容量％、又は約３０容量％、又は約４０容量％の最終濃度となるように加える。好適な態様において、この水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）を抗原製剤の中に約３０容量％の最終濃度となるように加える。

当該安定化剤を含む抗原製剤はワクチン製剤を処方するため、例えばアジュバント及び希釈剤、例えば食塩水を加え、抗原製剤及び安定化剤が希釈されるようにすることで、利用してよい。かかる希釈は動物における当該ワクチン製剤の所望されない副作用を回避又は実質的に回避するために有用でありうる。例えば、金属水酸化物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）をワクチン製剤に加えることにより約５倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約２５倍、又は約３０倍に希釈する。好適な態様において、水酸化アルミニウムゲル（例えばＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ）を約３０容量％の最終濃度で含む抗原製剤を、このワクチン製剤に添加することを介することにより約２０倍希釈し、約１．５容量％の最終水酸化アルミニウムゲル濃度にする。

Ｅ．ルシオパシエの抗原を含んで成るワクチン製剤
本発明の抗原は動物を免疫するためにワクチン製剤に使用できうる。一の態様において、このワクチン製剤は本発明の抗原及びアジュバントを含む。好適な態様において、本発明のワクチン製剤のために有用なアジュバントはレシチン、油及び界面活性剤を含んで成る。好適なアジュバントの配合されたワクチン製剤は約０．２５〜１２．５容量％、より好ましくは約０．５〜約５容量％、そして最も好ましくは約０．５〜１．２５容量％のレシチン、約１〜２３容量％、より好ましくは約３．５〜１０容量％、そして最も好ましくは約４．５容量％の油、及び約１．５〜約６容量％、より好ましくは約１．５〜４容量％、そして最も好ましくは約２容量％の両親媒性界面活性剤を含む。好ましくは、このアジュバントは２種類の両親媒性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ及びＳｐａｎ系界面活性剤を有し、その一方は当該ワクチン製剤の水性相に主として存在し（例えばＴｗｅｅｎ ８０）、そして他方は油相に存在する（例えばＳｐａｎ ８０）。好ましくは、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＳｐａｎ ８０を界面活性剤として用いるとき、Ｔｗｅｅｎ ８０の濃度はＳｐａｎ ８０の濃度の約１．５〜約３倍、好ましくは約２倍とする。好適なアジュバントは水性担体溶液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ）を含む。ワクチン製剤のためのアジュバントに適当なレシチン及び油はＤＲＡＫＥＯＬ（商標）５Lt鉱油中のレシチンの混合物である。レシチンはGentral Soya, Fort Wayne, Indiana から入手できうる。Ｔｗｅｅｎ及びＳｐａｎ系界面活性剤はVan Waters and Rogers, Omaha, Nebraskaから入手できうる。

別の態様において、当業界において公知のアジュバント、例えば、アジュバントについて論じている米国特許第５，８４６，５２７；５，４１７，９７１；５，２３２，６９０号に記載の油エマルション、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、水酸化亜鉛カルシウム、アブリジン、水酸化アルミニウム、油及びサポニンを本発明のワクチン製剤に利用してよい。

好適なワクチン製剤はそのアジュバント組成物の容量を約１０〜５０容量％、より好ましくは約１５〜３５容量％、より好ましくは約２０〜３０容量％、そして最も好ましくは約２５容量％にすることで処方する。

ワクチン製剤はそのまま、又は医薬もしくは治療製剤の形態で被検体に投与してよい。当該抗原を含んで成る医薬製剤は、慣用の混合、溶解、粉砕、糖衣化、磨砕、乳化、封入、封鎖又は凍結乾燥工程により製造できうる。医薬製剤は、医薬的に利用できる製剤へと本発明の抗原を加工するのを助長する１又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は助剤を利用して慣用の手段で配合されうる。

全身用製剤には、注射、例えば皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射による投与のためにデザインされたものが挙げられる。

注射のため、当該抗原は水性溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンク溶液、リンゲル溶液、リン酸緩衝食塩水、又は任意のその他の生理食塩水の中に配合してよい。この溶液は処方剤、例えば懸濁、安定化及び／又は分散剤を含みうる。他方、このタンパク質は適当なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水で使用前に構築するための粉末形態であってよい。

上記の製剤に加えて、当該抗原はデポット製剤として処方してもよい。かかる長期作用性製剤は移植（例えば皮下式又は筋肉内式）、又は筋肉内注射により投与してよい。かくして、例えば、当該抗原を適当なポリマー又は親水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂に配合するか、又は微溶性誘導体、例えば微溶性塩として処方してよい。

他方、その他の医薬デリバリーシステムを採用できうる。リポソーム及びエマルションは抗原を搬送するのに利用されうるデリバリービヒクルの周知の例である。一定の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドを利用してよいが、通常多大な毒性が伴ってしまう。他に、この抗原は持放システム、例えば治療又は種痘用試薬を含む固体ポリマーの半透過性マトリックスを利用して導入されうる。様々な持放材料が確立されており、そして当業者に周知である。持放式カプセルはその化学的性質に依存して、抗原を数週間から１００日以上にわたり放出しうる。試薬の化学的性質及び生物学的安定性に依存して、抗原の安定化のための更なる戦略が採用できうる。

投与のための抗原の有効な量の決定は、特に本明細書の開示を参照することで当業者の通常の能力により行われる。

有効用量はまずｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで概算できる。例えば、当業界周知の技術を利用し、動物モデルで剤型を処方し、免疫応答の誘導を達成することができる。当業者は本明細書に記載の結果に基づき全ての動物種に対する投与を容易に最適化できる。例えば、ワクチンとして用いるなら、本発明の抗原は約２〜３６週間にわたって約１〜約３回投与されうる。ブースター投与をその後定期的に付与してよい。その他のプロトコールが個々の動物に適しうる。適当な用量とは、上記の通りに投与したとき、動物をＥ．ルシオパシエ感染から少なくとも４〜１２ケ月保護するのに十分な免疫応答を免疫動物において生起できる抗原の量とする。

剤型中の抗原の量は不活性化時の培養物の光学密度（Ｅ₆₂₅ ）で、不透明度単位として特定する。不活性化時に光学密度が４．０なら、例えばこの培養物から調製した１mlの培養上清液又は濾液は４不透明度単位を含み、０．５mlでは２不透明度単位を含む、等々であり、それは不透明性の起源である細菌が除かれようと関係ない。もし、例えば１ml当り５不透明度単位を含む上清液流体を分子濾過により１２倍濃縮すると、その濃縮流体は１ml当り６０不透明度単位の値を有するであろう。一般に、ワクチン剤型中の抗原の量は約１〜約１２不透明度単位、好ましくは約２〜約４不透明度単位の範囲でありうる。適当な剤型容量は注射のルート及び宿主の大きさにより変わり、典型的には０．１〜約５mlである。好ましくは、宿主がブタのとき、ブタは生後２週間以上のものとする。

以下に紹介する種痘研究は、No. １アジュバントを有する本明細書に記載のワクチンを子ブタに２回投与養生法で生後約３〜６週のブタに与えると、２回目の種痘の２０週間後にビルレント負荷に対する有意な保護が供されることが実証された。No. １アジュバントを伴う抗原も、血清ＥＬＩＳＡにより示される通り、種痘の２週間後に実質的な抗体応答も誘導するが、負荷時では、これらの力価は減少しており、従って個体の力価は保護とは密に相関していなかった。サポニンアジュバント中の同じように投与した同抗原は低めのＥＬＩＳＡ力価を誘導し、そして２回目の種痘の２０週後においてブタをビルレント負荷から保護するには不適当であることが証明された。

当該負荷モデルは１０匹のコントロールブタが負荷の後に丹毒の臨床的徴候を示したという点で極めて有効であった（表２）。３匹のブタが高温基準を満たし、そして他の５匹はＥ．ルシオパシエ株陽性であった。残りの２匹のコントロールブタは上記の基準のいずれも満たさなかった。しかしながら、それらは数日間元気がなく、そしてこの病気の特徴である転移性の皮膚損傷を有しており、従って人道的に殺した。対照的に、No. １アジュバントを含むワクチンで種痘したグループでは、２０匹のブタのうち１５匹が完全に保護されていた（表３）。

No. １アジュバントを伴う本発明のＥ．ルシオパシエ抗原を含む実験用ワクチンは、２回投与養生法で生後約３〜６週の子ブタに与えると、２回目の種痘の２０週間後のビルレント負荷による臨床的丹毒の発症に対して有意な保護を供した。後述の表３を参照のこと。更に、サポニンアジュバントを伴う類似の実験用ワクチンは、同じ養生法に従って子ブタに与えたとき、２回目の種痘の２０週間後でのビルレント負荷による臨床的丹毒の発症に対する保護を供しなかった。最後に、本発明の抗原を含む種痘は、使用するアジュバントに関係なく、２回目の種痘の２週間後にピークとなる実体的な血清応答を誘導した。

本発明を下記の限定でない実施例により更に説明する。

実施例１．Ｅ．ルシオパシエ培養物
Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ ３３４２を脱イオン水中の２．７５％の濃度の Difco Proteose Peptone, Difco Yeast Extract (0.55％), Tween 80 (0.2％), K₂HPO₄ (0.217％) 及び KH₂PO₄ (0.061％) を含む培地の中で培養する。この培地のpHを５ＮのＮａＯＨで７．２に調整する。この培地を最低１２２℃で３０〜９０分スチーム滅菌する。オートクレーブ処理の後、無菌５０％デキストロース溶液を３％ｗ／ｗの最終濃度となるように加える。

有効な種（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ）培養物は冷凍保存物（マイナス７０℃）からマスター種標本の冷凍試験管を取り出し、急速融解し、そしてその内容物を培地フラスコに無菌的に移すことにより調製する。このフラスコを３７℃で１２〜３６時間振盪しながらインキュベーションし、そしてグラム染色により純度を検定する。純粋であると認められたら、その培養物を無菌グリセリン（１０％）と混合し、１mlの量づつで冷凍試験管に分注し、そして冷凍保存する。

生産培地（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を含む種容器に０．０１〜２％のマスター又は有効種を接種する。１０〜１００リットルの生産培地を含む種発酵槽を用いる場合、種フラスコ由来の１〜５％の培養物で接種を行う。２００〜１０，０００リットルの生産培地を含む生産発酵槽では種発酵槽由来の０．５〜５％培養物を接種する。

生産培養物は３７±２℃の設定値で撹拌しながらインキュベーションする。インキュベーション時間は４〜２４時間で変えてよい。そのインキュベーション時間の間この培養物に１０Ｎの無菌水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを７．２±0.1 に維持する。増殖期の間、デキストロースの定期的な添加を行う。

回収の前に、この培養物を純度、形態及びグラム反応について顕微鏡観察する。増殖は培養物の６２５nmでの光学密度の測定により追跡する。培養物は６２５nmで４．０以上の光学密度を有するときに回収する。

実施例２．Ｅ．ルシオパシエワクチンの調製
ホルマリン溶液を０．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度となるように培養物に添加し、この培養物を不活性化させた。この培養物を無菌タンクに移し、そして３７±２℃のインキュベーターに最低２４時間（そして最大６０時間）定常撹拌下に置いた。培養物は直ちに処理するのではなく、２〜８℃で７日まで保存した。不活性化培養物を連続フロー遠心分離を介して浄化した。その流体画分を更なる処理のために保持し、そして細菌を捨てた。

実験において、１０×の濃縮を、０．１容量％の最終濃度のベータープロピオラクトン（「ＢＰＬ」）又は０．２容量％の最終濃度のホルマリンのいずれかで不活性化した（３７℃で２４時間以上）Ｅ．ルシオパシエ培養物の濾液で行った。Ｅ．ルシオパシエの培養濾液中に認められる６４〜６６kDのタンパク質 (Groschupら、1991, Epidemiol. Infect. 107 : 637-649及び米国特許第５，６２５，０３８号）に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施して、６４〜６６kDa タンパク質の存在に基づき不活性化及び安定化の効果を決定した。培養物のホルマリン不活性化がタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイ値を低下させるという先の発見と一致して、ＢＰＬ濃縮物はホルマリン濃縮物の約４倍のアッセイ値を有した。３７℃で１４日間インキュベーションした後、ＢＰＬ濃縮物はホルマリン濃縮物についての約４０％と比べ、その値の約８０％を失った。しかしながら、双方の場合において、安定化剤としての３０容量％のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬの事前添加は、以降に示す通り、損失をほとんど防ぎ、そして事実上ホルマリン製剤の場合その全てを保持せしめた。ブタでの小試験は、ホルマリン不活性化培養物の流体画分がＢＰＬで不活性化した培養物のそれより、ビルレントＥ．ルシオパシエによる負荷に対するブタの保護において有効であることを示した。

当該流体を遠心分離後の中空ファイバー濾過（見かけ上×１０，０００キロダルトンの分子量カットオフ値）により６×〜２０×（通常は約１０×）に濃縮した。この流体を濃縮の後に水酸化アルミニウムゲルを添加することにより安定にした。

免疫原を安定化するため、水酸化アルミニウムゲルを撹拌しながら濃縮流体に最終的に３０容量％（３０容量のゲル、対、７０容量の濃縮物）となるようにゆっくりと加えた。ワクチン中でのこの濃縮物の２０倍希釈の後、Ａｌゲル含有量はわずか約１．５％にすぎず、注射部位に陰性反応を及ぼすには足りなかった。１０倍濃縮したＥ．ルシオパシエ培養流体画分中の全ての保護タンパク質を吸着させるのに必要なＡｌゲルの量を決定する滴定は、９５％超が３２容量％のＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（Reheis, Berkley Heights, New Jersey)に吸着されることを示した。チメロサール（即ち、ＭＥＲＴＨＩＯＬＡＴＥ（商標））（Dimportex, Spain; Flavine Inc., Klosters, New Jerseyを介して輸入) を保存剤としてこの製品に、約０．０１容量％の最終濃度となるように加えた。チメロサールの濃度は当該抗原組成物及び本発明の抗原を含むワクチン製剤中で約０．０１ｗ／ｖに保った。ＥＤＴＡ（Sigma, St. Louis, Missouri) を約０．０７％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように加えた。

使用するアジュバントはNo. １アジュバントとした。１０００mlのNo. １アジュバントを２００mlのフィルター除菌レシチン−油溶液（ＤＲＡＫＥＯＬ（商標）鉱油中の１０％のレシチン）、オートクレーブ処理Ｔｗｅｅｎ ８０（５６ml）及びＳｐａｎ ８０（２４ml）、並びにリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ）（７２０ml）から作った。このレシチン−油溶液及びＳｐａｎ ８０を合わせ、そして無菌タンクの中で室温で少なくとも１時間、乳化が完了するまで混合した。食塩水及びＴｗｅｅｎ ８０を合わせ、そして無菌タンクの中で室温で少なくとも１時間混合した。油混合物をＲｏｓｓ乳化機を利用して水性混合物と乳化させた。乳化は全てのアジュバントが食塩水の中に添加されるまで再循環により続いた。このエマルションをＧｏｕｌｉｎプレスに室温で２回かけた。このアジュバントを２〜８℃で保存した。

５Ｌのワクチンを、１Ｌのアジュバントを３Ｌの水性相に加えることにより作った。この水性相は、２ml用量のワクチン当り３．２不透明度単位の最終抗原含有量にするのに十分な安定化濃縮物と、その容量を５Ｌにするのに十分な食塩水とを含んで成る。不透明度単位は回収時の光学密度（Ｅ₆₂₅ ）×濃縮係数と定義する。

実施例３．ブタのＥ．ルシオパシエ種痘及び負荷
Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ ３３４２の８番目の継代培養物（ＭＳ＋８）をワクチンの製造に用いた。不活性化時での培養物の光学密度（OD）から計算して、１用量レベルの安定化、浄化Ｅ．ルシオパシエ抗原（３．２不透明度単位〔OU〕）を利用した。１OUは１OD (６２５nmで決定) を有する１mlの流体に相当する。No. １アジュバント又はサポニン（０．０５ｗ／ｖ；Berghansen Chemical Company, Cincinnati, Ohio から入手）をアジュバントとして用いた。詳しくは、Ｅ．ルシオパシエ株ＣＮ ３３４２の培養物を５．２８のODになるまで増殖させた。この培養物を０．５％のホルマリンで２４時間不活性化させた。不活性化の後、この細菌を遠心分離により除去した。その流体画分を１０，０００kDa の見かけ上分子量カットオフ値を有する限外濾過ユニットを利用して濃縮した。その流体画分を約１３．４倍濃縮した。その抗原を、この濃縮材料にＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（３０容量％）を加えることにより安定化させた。吸着した濃縮物をワクチン配合まで４℃で保存した。ワクチンはアジュバントとしてNo. １アジュバント又は０．０５％のサポニンで処方した。安定化抗原を食塩水（１５０mMの塩化ナトリウム及び４mMのリン酸塩) に希釈し、最終濃度とした。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、０．０７％）及びチロメサール（０．０１％）を最終ワクチン製剤に加えた。リン酸緩衝食塩水を偽薬として利用した。表１は処理グループ、ワクチン処理、並びに種痘及び負荷を施した子ブタの数をまとめる。

満足たる負荷が高い体温（少なくとも２日連続での４０．９℃（１０５．６°Ｆ）以上）、死体解剖時での培養物、及び／又はＥ．ルシオパシエによる感染症の特徴的な臨床徴候により、コントロール動物において明示された。この病気の特徴と考えられる臨床徴候には突然死、元気のなさ、腹部及び耳の充血、転移性皮膚損傷、及び剛性又は関節巻き込み（ｊｏｉｎｔ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）が挙げられる。臨床的徴候は有するが、体温基準に満たないブタは殺し、そして血液、脾臓及び肝臓を培養してＥ．ルシオパシエの単離を試みた。

Ｆｉｓｈｅｒの抽出試験を、種々のワクチンで保護される動物のパーセンテージに差があるかを調べるために利用した（ｐ＜０．０５）。色々の投与グループをコントロールと比較するため、及び各々のグループを他の全ての投与グループの平均値と比較するため、事前対比を構築した。付与するワクチンのタイプ及び子ブタの各グループの血清学的応答との関係をロジスチック回帰を利用して、生後２ケ月、３ケ月、４ケ月、５ケ月のブタ、並びに負荷前（ｐｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）血液について行った。負荷時期でのワクチン誘導力価と疾患状態（保護／非保護）との関係をロジスチック回帰を利用して評価した。５％の有意差レベルを真の関係の宣言のために用いた。

Ｅ．ルシオパシエに対して低い（＃８００）ＥＬＩＳＡ血清力価を有する２０匹の妊娠雌ブタ／若い雌ブタをRiddell Farms, Albert City, IAから獲得し、そしてUniversity of Nebraska Department of Veterinary and Biological Sciences の隔離室の中で飼育した。

ＥＬＩＳＡ血清力価は下記の通りにして完全細胞直接抗原結合ＥＬＩＳＡで決定した。抗原コートプレートの調製及びかかるプレートを利用するＥＬＩＳＡの記載した米国特許第４，９１８，１６３号を参照のこと。第一に、Ｅ．ルシオパシエを実施例１に記載の通りに増殖させ、そして対数増殖期培養物から回収した。６４０nmでの光学密度を記録し、そして種々の光学密度を有する溶液から細菌のカウント数を介して樹立した表を利用して細胞数／mlに換算した。生きた細菌をＰＢＳ（Dulbecco PBS, Sigma, St. Louis, Missouri) に約１．１×１０⁹ 細胞／mlの密度にまで希釈した。このＰＢＳに希釈した生きた細菌をＥＬＩＳＡ用のプレートに結合させた。プレートの準備のため、ＰＢＳ中の１００μｌの０．１容量％のグルタルアルデヒド（Sigma, St. Louis, Missouri) を各ウェルに加え、これらのウェルにカバーをし、そしてそのプレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ中のグルタルアルデヒドを各ウェルから取り出し、そしてそれらのウェルを吸収タオルで乾かした。ＰＢＳ中の約１．１×１０⁹ 細胞／mlの密度の生きた細菌１００μｌを各ウェルに加えた。これらのプレートを２０００pmで５分、２２℃で遠心分離した。次いで２００μｌのＰＢＳ（ＰＶＡ／ＰＢＳ）中の１％のポリビニルアルコール（Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)を各ウェルに加え、これらのウェルにカバーをし、そしてこれらのプレートを４℃で一夜放置した。プレートのウェルの内容物を殺菌溶液に移し、そしてウェルをＰＢＳで洗浄した。これらのウェルをガーゼでカバーし、そして室温で乾かした（約１時間）。

ＥＬＩＳＡ手順を下記の通りにして結合細菌完全細胞病原を有するプレートを利用して実施した。第一に、陽性コントロールを含むブタ血清を１％のＰＶＡ／ＰＢＳに希釈した。未知の血清全てを１：５０に希釈し、そして陽性コントロールを１：２００で利用した。２００μｌづつの各サンプルをＡ列の行のウェルに加えた。１００μｌの１％のＰＶＡ／ＰＢＳを残りのウェルに加えた。各サンプルに基づく２倍系列希釈を列Ｂ〜Ｈにかけて行った。ウェルにカバーをし、そして３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。１％のＰＶＡ／ＰＢＳ中に調製した１００μｌの１：２０００の希釈率のヤギ抗ブタＩｇＧ（ＨとＬ）ペルオキシダーゼコンジュゲート（Kirkegaard and Perry, Gaitherburg, Maryland)を各ウェルに加えた。これらのウェルに再びカバーをし、そして３７℃で１時間インキュベーションした。これらのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μｌのＡＢＴＳ基質（Kirkegaard and Perry, Gaitherburg, Maryland より入手した２，２′−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））を各ウェルに加え、そしてこれらのプレートを室温で１０分インキュベーションした。これらのプレートをマイクロプレートシェーカー上で１０秒振盪し、次いでプレートリーダーブラックを利用して４０５〜４９０nmにて各ウェルの吸収を測定した。各未知の血清の終点力価は、その吸収が１：３２００の希釈率の陽性コントロールの吸収より大きい血清希釈率とした。

雌ブタを分娩の０〜１０日前に採血して、そのＥ．ルシオパシエ抗体力価を決定した。子ブタを雌ブタの血清力価及び分娩日を基準にランダムに分けた。これらの雌ブタ／若い雌ブタ由来の５８匹の子ブタから採血し、そして２種類の実験用Ｅ．ルシオパシエワクチンのいずれか一方又は偽薬で生後約３週間目に種痘を施した（表１に記載のグループ）。生後約４週で子ブタは離乳した。生後約６週で子ブタから採血し、そして同じワクチンで再種痘した。生後約２，３，４及び５ケ月で全てのブタから採血した。生後約５．５ケ月目に、やせたブタ全てを研究から外した。生後約６ケ月で（２回目の種痘の２０週間後）、ブタから採血し、そして４０匹のブタにNational Veterinary Services Laboratory より投与された培養物から増殖させたＥ．ルシオパシエのビルレント培養物２ml（２３７マウスＬＤ₅₀、１．７４×１０⁹ コロニー形成単位／ml）で筋肉内負荷を施した。動物を負荷の２日前、負荷の日、及び負荷の７日後に臨床疾患の徴候及び直腸温度について追跡した。高温直腸温度の基準（４０．９℃）を満たす任意のコントロール動物を研究から外し、そして注射ペニシリンで処置した。病気の臨床徴候を有するが、高温直腸温度基準を満たさない任意のコントロール動物を人道的に殺し、死体解剖にかけ、そして全血、脾臓及び肝臓のサンプルをＥ．ルシオパシエについて培養した。任意の死亡したコントロール動物を死体解剖にかけ、そして脾臓及び肝臓をＥ．ルシオパシエについて培養した。高温直腸温度の基準（４０．９℃）及び／又は病気の臨床徴候を満たす任意の種痘を施した動物を研究から外し、そして注射ペニシリンで処置した。負荷の後に死亡した任意の種痘を施した動物を死体解剖にかけ、そして脾臓及び肝臓のサンプルをＥ．ルシオパシエについて培養した。Ｅ．ルシオパシエに対する抗体力価を上記のＥＬＩＳＡにより決定し、そして抗体力価と臨床保護との相関を行った。

ＥＬＩＳＡ力価は雌ブタから得た単一の血液サンプル由来の血清及び子ブタからの７回の採血時期由来の血液サンプル全てについて決定した。好気性細菌培養（４８時間、３７℃、血液アガー）を死亡した又は致死注射により殺したブタから得た血液並びに／又は脾臓及び肝臓のサンプルに対して実施した。

結果
コントロールブタのＥ．ルシオパシエ負荷の結果を表２にまとめる。１０匹のブタ全てが丹毒について陽性であった。

No. １アジュバントを伴うワクチン（Ｔ０２）を付与したブタのＥ．ルシオパシエ負荷のブタの結果を表３にまとめる。２０匹のブタのうち１５匹（７５％）が完全に保護された。

サポニンアジュバントを伴うワクチン（Ｔ０３）を付与したブタのＥ．ルシオパシエ負荷の結果を表４にまとめる。一匹のブタしか保護されなかった。

子ブタグループの幾何学的平均ＥＬＩＳＡ力価（「ＧＭＴ」）を表５に示す。

子ブタは１回目の種痘時では非常に低いＥ．ルシオパシエに特異的な抗体力価を有した。これらの力価は５０〜２００未満の範囲にあった。コントロールの子ブタでは、ＧＭＴは研究の間若干上昇し、ＥＬＩＳＡが老齢のブタにあまり特異的でないことを示唆した。

アジュバントとしてNo. １アジュバント又はサポニンのいずれかを伴うワクチンは２回目の種痘の２週間後（生後約２ケ月）にピークとなる統計学的に有意な（ｐ＝０．０００１）血清応答を誘導した。双方のグループの力価は経時的に降下し続け（生後約５ケ月まで）、No. １アジュバント中の抗原を受容した子ブタのＧＭＴは全時点においてサポニンアジュバント中の抗原を受容した子ブタのＧＭＴより明らかに高かった。負荷時において、No. １アジュバント中の抗原を受容したブタのＧＭＴはコントロールのＧＭＴの２倍より若干高く、一方サポニンアジュバント中の抗原を受容したブタのＧＭＴはコントロールの２倍より若干低かった。負荷後の臨床疾患からの保護は個々のＥＬＩＳＡ力価と相関しなかった（ｐ＞０．０５）。しかしながら、興味深い観察はNo. １アジュバント中の抗原を付与したブタにおける２回目の種痘の２週間後に観察されたピーク力価にあった。No. １アジュバント中の抗原で種痘を施した２０匹の子ブタのうち、８匹が２８００以上のピーク力価を有し（８／８が負荷から保護）、８匹が６４００のピーク力価を有し（６／８が負荷から保護）、そして４匹が３２００のピークを有し（１／４が負荷から保護）、６４００以上の力価が長期保護の指標であることを示唆した。

まとめると、１０匹の無種痘コントロールが感染した。No. １アジュバントを有するワクチンを与えたブタのグループでは、２０匹のうち１５匹が保護された。アジュバントとしてのサポニンを有するワクチンを与えたブタのグループでは、１０匹のうち１匹しか保護されなかった。

実施例４．Ａｌゲルによる抗原の安定化
前述の通りＡｌゲルによる抗原の処理を含んで、ワクチンを実施例１〜３に記載の通りに調製した。ワクチンをブタで効能について試験した。ブタを筋肉内（ＩＭ）で与える２回の２ml投与により種痘し、１回目の投与は約３週目にて（離乳）、そして２回目の投与はその３週後に施した。コントロールは偽薬としてリン酸緩衝食塩水を受容した。免疫力に対して、生後約９週目においてビルレントＥ．ルシオパシエの１Ｍ注射の負荷をかけた。表６に示すように、種痘による保護は９週目に１００％となった。このワクチンはブタを種痘する時には既に１２ケ月経たものであった。この結果は保護抗原が有効に安定化されたことを確証する。

備考：２０番のブタは排除した。それは非常に気の荒い動物であり、その体温を計ることができないほどに凶暴に暴れた。負荷の後もこのブタは完全に健康であり続けた。

Claims (6)

1. エリシペロスリクス・ルシオパシエ（豚丹毒菌：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅ）培養物由来の流体画分並びにリン酸アルミニウムゲル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル及びみょうばんから成る群から選ばれる安定化剤を含んで成り、ここで前記エリシペロスリクス・ルシオパシエ培養物が不活性化されたものであり、さらにここで前記安定化剤が１０容量％〜４０容量％の量である、抗原組成物。
2. 前記エリシペロスリクス・ルシオパシエ培養物がホルマリン又はベータープロピオラクタンで不活性化されている、請求項１記載の抗原組成物。
3. 前記流体画分が３〜３０倍濃縮されている、請求項１又は２記載の抗原組成物。
4. エリシペロスリクス・ルシオパシエ培養物由来の流体画分にリン酸アルミニウムゲル、リン酸カルシウムゲル、水酸化亜鉛／水酸化カルシウムゲル及びみょうばんから成る群から選ばれる安定化剤を添加することを含んで成る抗原組成物の作製方法であって、ここで前記安定化剤が１０容量％〜４０容量％の量であり、さらにここで前記エリシペロスリクス・ルシオパシエ培養物が不活性化されたものである、方法。
5. 有効な量の請求項１又は２記載の抗原組成物をヒトを除く動物に投与することを含んで成る、動物の種痘方法。
6. 前記動物がブタである、請求項５記載の動物の種痘方法。