ES2301230T3 - Antigenos de erysipelothrix rhusiopathiae y composiciones de vacuna. - Google Patents
Antigenos de erysipelothrix rhusiopathiae y composiciones de vacuna. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición de antígeno que comprende i)una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae que está desactivado con formalina o con beta-propiolactona; y ii) un agente estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio, o un alumbre, en la que dicha composición de antígeno está exenta de E. rhusiopathiae.
Description
Antígenos de Erysipelothrix rhusiopathiae
y composiciones de vacunas.
El invento se refiere a composiciones de
antígenos y a formulaciones de vacunas para evitar o reprimir una
infección por Erysipelothrix rhusiopathiae (erisipela), y a
métodos para preparar y usar esas composiciones de antígenos y
formulaciones de vacunas.
La erisipela tiene una distribución mundial y
presenta una importancia económica en Europa, Asia, Australia así
como en América del Norte y del Sur. Los cerdos de 3 meses a 3 años
de edad son sumamente susceptibles a padecer erisipela. Los cerdos
afectados tienen con frecuencia articulaciones hinchadas y rígidas y
no ganan en peso eficientemente. También, sus carcasas se recortan
o rechazan con frecuencia por los inspectores en las instalaciones
de envasado.
Hace aproximadamente 10 años se demostró que era
innecesaria la práctica convencional de preparar vacunas contra
E. rhusiopathiae a partir de cultivos muertos enteros. Un
material filtrado exento de bacterias producía un efecto igual de
bueno para proteger tanto a cerdos como a ratones frente a un
estímulo virulento. La subsiguiente investigación publicada por
científicos del Japón y de los Estados Unidos de América (EE.UU.)
ha confirmado este hallazgo y ha demostrado que la E.
rhusiopathiae libera dentro del medio de cultivo un antígeno
que es un inmunógeno universal, puesto que inmuniza a los cerdos
frente a todas las cepas de E. rhusiopathiae (Sawada y
Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242;
Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol. Infect.
107:637-649). Groschup y colaboradores demostraron
que una proteína de 64 a 66 kDa presente en el cultivo protegía a
ratones frente a un estímulo con E. rhusiopathiae virulenta.
Habiéndose demostrado que dicha proteína protege también a los
cerdos, la USDA proporciona a los fabri-
cantes de vacunas un anticuerpo monoclonal (mAb) para esta proteína, con el fin de utilizarlo para analizar la proteína.
cantes de vacunas un anticuerpo monoclonal (mAb) para esta proteína, con el fin de utilizarlo para analizar la proteína.
Sato y colaboradores (1995) Veterinary
Microbiology 43, 173-182 describen la preparación de
una composición antigénica que comprende una fracción fluida del
material filtrado de cultivo de Erysipelothrix
rhusiopathiae.
Sato y colaboradores (1995) Veterinary
Microbiology 37, 381-387 mencionan una composición
de vacuna para proteger a cerdos, que comprende la fracción fluida
del medio de cultivo de Erysipelothrix rhusiopathiae,
adsorbida a alumbre, y bacterias formalinadas.
Aunque es muy deseable una vacuna eficaz para
evitar la erisipela en cerdos, ninguna de las muchas vacunas
tradicionales contra la erisipela proporciona una protección
aceptable para cerdos destetados. El problema es la falta de
duración de la inmunidad. La industria porcina requiere una vacuna
que, administrada durante la lactancia, proteja a los cerdos contra
esta enfermedad letal y devastadora hasta la edad oportuna para el
sacrificio, es decir aproximadamente los 6 meses. La USDA ha
especificado este requisito como una norma para otorgar licencias a
nuevas vacunas.
Se proporciona por lo tanto una composición de
antígeno, que comprende una fracción fluida procedente de un
cultivo de E. rhusiopathiae y un agente estabilizador, en la
que dicho cultivo de E. rhusiopathiae es desactivado con
formalina o con beta-propiolactona y un agente
estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un
metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un
gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido
de calcio o un alumbre, en que dicha composición de antígeno está
exenta de E. rhusiopathiae.
Se proporciona por lo tanto una composición de
vacuna, que comprende: una composición de antígeno que comprende a
su vez una fracción fluida procedente de un cultivo de E.
rhusiopathiae y un agente estabilizador, en la que dicho
cultivo de E. rhusiopathiae está desactivado; y una
composición de adyuvante.
Se proporciona por lo tanto un método de
producir una composición de antígeno, que comprende añadir un agente
estabilizador a una fracción fluida procedente de un cultivo de
E. rhusiopathiae, en la que dicho cultivo de E.
rhusiopathiae está desactivado.
Se proporciona por lo tanto el uso de una
composición de antígeno, que comprende una fracción fluida
procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae y un agente
estabilizador, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae
está desactivado, para la preparación una vacuna destinada a
proteger a un animal contra la erisipela, en que dicho animal es
preferiblemente un mamífero o un pájaro, y de modo sumamente
preferido un cerdo, un cordero, un perro, un caballo, una vaca o un
ser humano.
Cualquier cepa de E. rhusiopathiae puede
ser la fuente de antígenos para el invento, por ejemplo las cepas
descritas en la Patente de los EE.UU. Nº 5.625.038. El cultivo a
partir del que se pueden aislar los antígenos puede ser
proporcionado de una diversidad de maneras. Por ejemplo, el cultivo
puede ser puro o sustancialmente puro. Más preferiblemente, los
antígenos para el invento se obtienen a partir de un material
sobrenadante o filtrado de un cultivo de E. rhusiopathiae.
En una realización sumamente preferida, los antígenos para el
invento se obtienen a partir del material sobrenadante o filtrado de
un cultivo líquido puro o sustancialmente puro de E.
rhusiopathiae.
Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar
de una diversidad de maneras, como es conocido en la tecnología.
Véanse las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.625.038; 5.616.328;
5.417.971; 5.225.194; 4.981.685, que debaten la cultivación de
bacterias. Por ejemplo, las E. rhusiopathiae se pueden
cultivar tal como se ha descrito en los Ejemplos ilustrativos que
se presentan más adelante. Las E. rhusiopathiae se pueden
cultivar también como se describe en las citas de Sawada y
Takahashi, 1 987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242
y de Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol. Infect.
107:637-649. Los antecedentes generales acerca de la
cultivación y del tratamiento de células procarióticas se
proporcionan en las citas bibliográficas de Maniatis y
colaboradores, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel
y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Qreene publishing Associates and Wiley Interscience,
NY; Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.
En una realización preferida, el cultivo es
desactivado añadiendo formalina (en una concentración final de
aproximadamente 0,5% v/v). En otra realización preferida, los
antígenos para el invento se obtienen a partir del material
sobrenadante o filtrado de un cultivo de E. rhusiopathiae. Un
material sobrenadante o filtrado de cultivo, en una realización
preferida, es concentrado aproximadamente en 3 a 10 veces
(preferiblemente 10 veces) y se añade un gel de hidróxido de
aluminio (preferiblemente REHYDRAGEL®) al material sobrenadante o
filtrado concentrado en una concentración final de aproximadamente
30% v/v para estabilizar al antígeno. En otra realización
preferida, se formula una composición de vacuna que comprende el
antígeno y un adyuvante, constituyendo el adyuvante, por ejemplo,
aproximadamente 25% v/v de la composición de vacuna. En otra
realización preferida, se añaden a los antígenos timerosal (en una
concentración final de aproximadamente 0,01% v/v) junto con EDTA
(en una concentración final de aproximadamente 0,07% v/v) como
conservantes. Un adyuvante preferido, aquí citado como "Adyuvante
Nº 1" comprende aproximadamente 2% v/v de lecitina,
aproximadamente 18% v/v de un aceite mineral y aproximadamente 8%
v/v de un agente tensioactivo (p.ej. alrededor de 5,6% v/v de Tween
80 y alrededor de 2,4% v/v de Span 80), siendo el volumen remanente
de una solución salina (p.ej. PBS de Dulbecco). Este adyuvante se
describe en la Patente de los EE.UU. Nº 6572861, presentada el 24 de
Enero de 2000, intitulada "Adyuvantes para Uso en
Vacunas".
Los antígenos para el invento se obtienen a
partir de E. rhusiopathiae que se pueden proporcionar de
maneras conocidas en la tecnología, por ejemplo en un cultivo
líquido. En una realización preferida del invento, un cultivo de
E. rhusiopathiae a partir del cual se aisla un antígeno es
desactivado antes de usar el antígeno en una formulación de vacuna.
En una realización sumamente preferida, el cultivo de E.
rhusiopathiae es desactivado antes de separar la fracción
líquida con respecto de las bacterias. La desactivación del cultivo
de E. rhusiopathiae se lleva a cabo para una diversidad de
finalidades, por ejemplo para matar o aniquilar las bacterias o
para desactivar las proteasas, o con el fin de preservar y conservar
el antígeno.
Un cultivo que contiene los antígenos para el
invento puede ser desactivado de una diversidad de maneras conocidas
en la tecnología. Por ejemplo, el cultivo se puede exponer a un
agente desactivador, es decir a un agente que es capaz de aniquilar
a las E. rhusiopathiae. Un agente desactivador útil en la
práctica del invento permite que el antígeno para el invento
provoque una respuesta inmunitaria en un animal para proteger a
dicho animal con respecto de la erisipela. Se pueden utilizar
agentes desactivadores conocidos en la tecnología, por ejemplo
formalina (formaldehído), beta-propiolactona u otros
agentes químicos que tienen propiedades similares a las de estos
agentes. Los agentes químicos apropiados para la desactivación de
bacterias se pueden determinar por una persona que tenga
experiencia ordinaria en la tecnología, por ejemplo poniendo en
contacto las bacterias con un producto químico particular, y
determinando si las bacterias han sido aniquiladas y los antígenos
obtenidos con ello están todavía activos en su capacidad para
producir un anticuerpo protector por ejemplo, vacunando ratones con
las bacterias tratadas. También, véase la Patente de los EE.UU. Nº
5.225.1 94, que debate la desactivación de bacterias.
Los antígenos para el invento se obtienen a
partir de la fracción fluida de un cultivo de E.
rhusiopathiae. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar y
las bacterias se pueden separar con respecto del caldo de cultivo,
por ejemplo centrifugando o filtrando un cultivo líquido. Un cultivo
de E. rhusiopathiae útil para el aislamiento de un antígeno
para el invento se puede proporcionar de cualquier manera conocida
en la tecnología. Por ejemplo, las E. rhusiopathiae se pueden
hacer crecer en un caldo o medio de manera tal que las bacterias se
multipliquen rápidamente, es decir, en fase logarítmica. En una
realización preferida, el cultivo utilizado para preparar un
antígeno para el invento está en fase logarítmica, más
preferiblemente en fase logarítmica tardía, en el momento en el que
se inicia el tratamiento del cultivo.
En una realización preferida, un cultivo de
E. rhusiopathiae es tratado para separar la totalidad o
sustancialmente la totalidad de las bacterias con respecto del
caldo o medio en el que éstas estaban creciendo. Por ejemplo,
aproximadamente 90% de las bacterias se pueden retirar desde el
caldo o medio, más preferiblemente se retiran aproximadamente 95%
de las bacterias, lo más preferiblemente se retiran aproximadamente
98% de las bacterias. Las E. rhusiopathiae se pueden separar
con respecto del caldo o medio de cultivo de cualquier manera
conocida en la tecnología. Por ejemplo, un cultivo de E.
rhusiopathiae se puede centrifugar a fin de separar las
bacterias con respecto del caldo o medio. Cualquier centrífuga
conocida en la tecnología, que sea capaz de sedimentar las
bacterias E. rhusiopathiae es apropiada para separar las
células con respecto del caldo o medio. Por ejemplo, se puede
utilizar una centrífuga de circulación continua. Los antecedentes
acerca de cómo retirar bacterias desde un medio de cultivo se
proporcionan en la obra de Maniatis y colaboradores, 1982,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores,
1 989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene
publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook y
colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor NY.
En otro aspecto, las E. rhusiopathiae se
pueden retirar desde el medio o caldo de cultivo por filtración a
través de un filtro que retiene a las bacterias pero no retiene al
antígeno para el invento. Se conocen en la tecnología muchos
filtros que son apropiados para separar las bacterias con respecto
del antígeno en el caldo o medio. Por ejemplo, un filtro útil para
separar las bacterias con respecto de la fracción fluida tiene un
diámetro medio de poros de aproximadamente 0,1 micrómetros a
aproximadamente 0,5 micrómetros, más preferiblemente alrededor de
0,2 micrómetros.
La fracción fluida obtenida a partir de un
cultivo de E. Rhusiopathiae ("fracción fluida") como se
describe anteriormente, puede ser concentrada. En una realización,
la fracción fluida puede ser concentrada a 3 veces hasta 30 veces,
por ejemplo a aproximadamente 3 veces, o a aproximadamente 6 veces,
o a aproximadamente 10 veces, o a aproximadamente 15 veces, o a
aproximadamente 20 veces, o a aproximadamente 30 veces. La fracción
fluida puede ser concentrada de cualquier manera conocida en la
tecnología. En una realización preferida, la fracción fluida puede
ser concentrada utilizando una filtración con fibras huecas. En un
aspecto, la filtración con fibras huecas se lleva a cabo con un
corte de peso molecular de aproximadamente 5.000 kilodalton a
aproximadamente 50.000 kilodalton, más preferiblemente de alrededor
de 10.000 kilodalton a alrededor de 30.000 kilodalton. Véase
también la Patente de los EE.UU. Nº 5.225.1 94, que debate la
concentración de una fracción fluida de un cultivo bacteriano.
La fracción fluida puede también ser concentrada
mediante secado por congelación o liofilización. En otro aspecto,
la fracción fluida puede ser concentrada por precipitación de las
proteínas y de los polipéptidos en la fracción fluida, seguida por
resuspensión del material precipitado. Las proteínas se pueden
precipitar desde la fracción fluida utilizando cualquier método
conocido en la tecnología, por ejemplo mediante una precipitación
por polietilenglicol, etanol o sulfato de amonio. Después de la
precipitación, el sedimento puede ser vuelto a suspender en
cualquier solución que sea apropiada para la preparación de una
formulación de vacuna, por ejemplo en una solución salina.
Los antígenos obtenidos a partir de una fracción
fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae son inmunógenos
eficaces para evitar o reprimir la erisipela en un animal. Por
ejemplo, la carencia de estabilidad de esos antígenos a
continuación de la retirada de las bacterias constituye un grave
problema cuando se utilizan estos antígenos en una composición de
vacuna. El invento resuelve el problema y está basado, en parte, en
el descubrimiento de que los antígenos existentes en una fracción
fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae se pueden
estabilizar añadiendo un agente estabilizador.
Se puede utilizar cualquier agente estabilizador
conocido en la tecnología para estabilizar a los antígenos para el
invento. En una realización preferida, un agente estabilizador es
capaz de adsorber a un antígeno desde una fracción fluida de un
cultivo de E. rhusiopathiae. Un apropiado agente
estabilizador puede mantener el potencial antigénico de una
fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae o puede
decelerar de otra manera la degradación de su potencial antigénico
después de haberse retirado las bacterias. Tal efecto estabilizador
de un agente se puede determinar con experimentación. Por ejemplo,
se pueden incubar dos muestras de una fracción fluida de un cultivo
de E. rhusiopathiae desactivado a 37ºC durante un cierto
período de tiempo, por ejemplo de aproximadamente 14 a
aproximadamente 28 días, ensayándose una muestra con un agente
químico y otra sin ningún agente químico para su uso como un agente
estabilizador. Las muestras se ensayan luego en una vacunación de
ratones de acuerdo con el ensayo normalizado de potencia de ratones
(9 CFR 113.119(c)) utilizando un adyuvante, por ejemplo el
Adyuvante Nº 1. Una proporción de animales protegidos en el grupo
al que se ha administrado la vacuna tratada con el agente químico,
mayor que en el grupo al que se ha administrado la vacuna sin
tratar o que en los animales testigos sin vacunar, indica que ha
sido estabilizado el antígeno en la vacuna tratada
químicamente.
El experimento antes descrito ilustra un ensayo
de estabilidad acelerada a una temperatura (37ºC) más alta que la
que se utiliza normalmente para el almacenamiento. Normalmente, las
preparaciones de antígenos se almacenan a temperaturas frías, por
ejemplo de aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC. Una
estabilidad durante 28 días a 37ºC indica una estabilidad por un
período de tiempo más largo en almacenamiento en frío normal, es
decir por un período de tiempo de varios años. En una realización,
el antígeno es estabilizado a temperaturas frías durante hasta
aproximadamente 5 años de acuerdo con el presente invento, más
específicamente durante hasta aproximadamente 3 años a temperaturas
frías. En otra realización, el antígeno es estabilizado durante al
menos un año a temperaturas frías de acuerdo con el presente
invento.
Se conocen en la tecnología una diversidad de
agentes que son capaces de adsorber a un antígeno, por ejemplo son
útiles como agentes estabilizadores un gel de hidróxido de aluminio,
un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel
de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio y un alumbre (p.ej. un
alumbre de potasa). En una realización preferida, se utiliza un gel
de hidróxido de aluminio, por ejemplo, REHYDRAGEL® como agente
estabilizador. (Véanse las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.61
6.328 y 5.232.690, que debaten geles metálicos y sus usos).
En una realización, un gel de hidróxido de un
metal, por ejemplo un gel de hidróxido de aluminio (p.ej.
REHYDRAQEL®) es añadido hasta una concentración final de desde aproximadamente 10% v/v hasta aproximadamente 40% v/v, por ejemplo de aproximadamente 10% de v/v, o de aproximadamente 20% v/v, o de aproximadamente 30% v/v, o de aproximadamente 40% v/v en la preparación de antígeno. En una realización preferida, el gel de hidróxido de aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®) es añadido hasta una concentración final de aproximadamente 30% v/v en la preparación de antígeno.
REHYDRAQEL®) es añadido hasta una concentración final de desde aproximadamente 10% v/v hasta aproximadamente 40% v/v, por ejemplo de aproximadamente 10% de v/v, o de aproximadamente 20% v/v, o de aproximadamente 30% v/v, o de aproximadamente 40% v/v en la preparación de antígeno. En una realización preferida, el gel de hidróxido de aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®) es añadido hasta una concentración final de aproximadamente 30% v/v en la preparación de antígeno.
Una preparación de antígeno, que contiene el
agente estabilizador, se puede utilizar para formular una
composición de vacuna, por ejemplo añadiendo un adyuvante y un
diluyente tal como una solución salina, de manera tal que se
diluyan la preparación de antígeno y el agente estabilizador. Dicha
dilución puede ser útil para evitar, o evitar sustancialmente,
efectos colaterales indeseados de la formulación de vacuna en el
animal. Por ejemplo, una formulación de antígeno que contiene un
gel de un hidróxido de metal, por ejemplo un gel de hidróxido de
aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®), es diluida después de la adición a una
formulación de vacuna en aproximadamente 5 veces, o en
aproximadamente 10 veces, o en aproximada-mente 15
veces, o en aproximadamente 20 veces, o en aproximadamente 25
veces, o en aproximadamente 30 veces. En una realización preferida,
una formulación de antígeno que contiene un gel de hidróxido de
aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®) en una concentración final de
aproximadamente 30% v/v, es diluida mediante adición a la
formulación de vacuna en aproximadamente 20 veces, dando una
concentración final del gel de hidróxido de aluminio de
aproximadamente 1,5%.
Una composición de antígeno del invento se puede
utilizar en una composición de vacuna para inmunizar a un animal.
En una realización, la composición de vacuna contiene una
composición de antígeno del invento y un adyuvante. En una
realización preferida, un adyuvante útil para una composición de
vacuna del invento comprende una lecitina, un aceite y un agente
tensioactivo. Una composición de vacuna formulada con un adyuvante
preferido contiene una lecitina en una concentración de 0,25% a
12,5% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 0,5% hasta
alrededor de 5% y lo más preferiblemente desde alrededor de 0,5%
hasta alrededor de 1,25% v/v, un aceite en una concentración de 1%
a 23% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 3,5% hasta
alrededor de 10% y lo más preferiblemente de alrededor de 4,5%, y
un agente tensioactivo anfífilo en una proporción de 1,5% a 8% v/v,
más preferiblemente desde alrededor de 1,5% hasta alrededor de 4% y
lo más preferiblemente de alrededor de 2% v/v. Preferiblemente, el
adyuvante tiene 2 agentes tensioactivos anfífilos, por ejemplo
agentes tensioactivos Tween y Span, de los cuales uno está
predominantemente en la fase acuosa (p.ej., el Tween 80) de la
composición de vacuna y el otro está en la fase oleosa (p.ej., Span
80). Preferiblemente, cuando se utilizan como agentes tensioactivos
Tween 80 y Span 80, la concentración de Tween 80 es desde
aproximadamente 1½ hasta aproximadamente 3 veces más alta que la
concentración de Span 80, preferiblemente alrededor de 2 veces. Un
adyuvante preferido contiene una solución acuosa de un vehículo,
por ejemplo una solución salina tamponada con fosfato (PBS, de
Phosphate Buffered Saline) (p.ej. PBS de Dulbecco). Una
lecitina y un aceite apropiados para un adyuvante para las
composiciones de vacunas son una mezcla de lecitina en el aceite
mineral DRAKEOL® 5 Lt Mineral Oil. La lecitina se puede obtener de
Central Soya, Fort Wayne, Indiana. Véase también la Patente de los
EE.UU. Nº 5.084.269, que debate composiciones de adyuvantes. Los
agentes tensioactivos Tween y Span se pueden obtener de Van Waters
and Rogers, Omaha, Nebraska.
En otra realización, adyuvantes conocidos en la
tecnología, por ejemplo, emulsiones en aceites, hidróxido de
aluminio, dipéptidos muramílicos, hidróxido de zinc y calcio,
avridina, hidróxido de aluminio, aceites y saponinas se pueden
utilizar en una formulación de vacuna del invento, como se ha
descrito en las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.846.527; 5.41
7.971; 5.232.690, que debaten adyuvantes.
Se formula una composición de vacuna preferida,
en la que desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% de su
volumen es una composición de adyuvante, más preferiblemente desde
alrededor de 15% hasta alrededor de 35%, más preferiblemente desde
alrededor de 20% hasta 30% y lo más preferiblemente de alrededor de
25%.
Una formulación de vacuna se puede administrar a
un individuo por sí sola o en la forma de una composición
farmacéutica o terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que
comprenden los antígenos se pueden producir por medio de procesos
convencionales de mezclamiento, disolución, granulación, producción
de grageas, levigación, emulsionamiento, encapsulación,
atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se
pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más
vehículos, diluyentes, excipientes o agentes auxiliares
fisiológicamente aceptables, que facilitan el tratamiento de los
antígenos para el invento y su transformación en preparaciones que
se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es
dependiente de la vía de administración que se escoja.
Las formulaciones sistémicas incluyen las
destinadas a su administración por inyección, p.ej. por inyección
subcutánea, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.
Para su inyección, los antígenos se pueden
formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones
fisiológicamente compatibles, tales como una solución de Hanks, una
solución de Ringer, una solución salina tamponada con fosfato, o
cualquier otra solución salina fisiológica. La solución puede
contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores,
estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, las proteínas
pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo
apropiado, p.ej. agua estéril exenta de pirógenos, antes del
uso.
Además de las formulaciones que se han descrito
con anterioridad, los antígenos se pueden formular también como una
preparación de liberación retardada (de depósito). Tales
formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por.
implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por
inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los antígenos se pueden
formular con materiales poliméricos o hidrófobos apropiados (por
ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas
intercambiadoras de iones, o como derivados escasamente solubles,
por ejemplo como una sal escasamente soluble.
Alternativamente, se pueden emplear otros
sistemas de suministro de agentes farmacéuticos. Los liposomas y
las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de
suministro que se pueden utilizar para suministrar un antígeno. Se
pueden emplear también ciertos disolventes orgánicos tales como
dimetil-sulfóxido, aunque usualmente a costa de una
mayor toxicidad. Adicionalmente, los antígenos se pueden suministrar
utilizando un sistema de liberación prolongada, tales como matrices
semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente
terapéutico o de vacunación. Se han consagrado diversos materiales
de liberación prolongada y son bien conocidos por los expertos en
la tecnología. Las cápsulas de liberación prolongada, dependiendo de
su naturaleza química, pueden liberar los antígenos durante un
período desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo
de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del agente,
se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de
los antígenos.
La determinación de una cantidad eficaz del
antígeno para su administración está bien dentro de las aptitudes
de los expertos en la tecnología, especialmente a la vista de la
descripción detallada que aquí se proporciona.
Una dosis eficaz puede ser estimada inicialmente
a partir de análisis in vitro. Por ejemplo, se puede
formular una dosis en modelos con animales para conseguir una
inducción de una respuesta inmunitaria utilizando técnicas que son
bien conocidas en la tecnología. Una persona que tenga experiencia
ordinaria en la técnica podría optimizar con facilidad la
administración a todas las especies de animales basándose en los
resultados que aquí se describen. La cantidad y el intervalo de
dosificación se pueden ajustar individualmente. Por ejemplo, cuando
se utilizan como una vacuna, los antígenos para el invento se pueden
administrar en aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dosis durante
un período de tiempo de 2-36 semanas. Se pueden
administrar periódicamente después de ello revacunaciones.
Protocolos alternativos pueden ser apropiados para animales
individuales. Una dosis apropiada es una cantidad de antígeno que,
cuando se administra como antes se describe, es capaz de incitar
una respuesta inmunitaria en un animal inmunizado suficiente para
proteger al animal con respecto de una infección por E.
rhusiopathiae durante al menos 4 hasta 12 meses.
La cantidad de antígeno en una dosis es
especificada en términos de la densidad óptica (E_{625}) del
cultivo en desactivación, como unidades de opacidad. Si están en
desactivación, la densidad óptica es de 4,0, p.ej. un mililitro de
material sobrenadante o filtrado de cultivo, preparado a partir del
cultivo, contendrá cuatro unidades de opacidad, 0,5 ml contendrán 2
unidades de opacidad, etc., incluso aunque se haya eliminado la
fuente de opacidad, es decir las células bacterianas. Si un fluido
sobrenadante que contiene, p.ej., 5 unidades de opacidad por ml es
concentrada a 12 veces, por filtración molecular, el fluido
concentrado tendrá un valor de 60 unidades de opacidad por ml. En
general, la cantidad de antígeno en una dosis de vacuna puede
fluctuar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 unidades de
opacidad, preferiblemente entre alrededor de 2 y alrededor de 4
unidades de opacidad. El apropiado volumen de una dosis variará con
la vía de inyección y el tamaño del hospedante, típicamente desde
0,1 a alrededor de 5 ml. Preferiblemente, cuando el hospedante es
un cerdo, el cerdo tiene una edad de al menos dos semanas.
El estudio de vacunación presentado seguidamente
ha demostrado que una vacuna como aquí se describe con el Adyuvante
Nº 1, cuando se administra a cochinillos en un régimen de 2 dosis a
aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionaba una
protección significativa contra un estímulo virulento a las 20
semanas después de una segunda vacunación. El antígeno con el
Adyuvante Nº 1 inducía también sustanciales respuestas a
anticuerpos, como se muestra mediante los títulos según ELISA en
sueros a las dos semanas después de la vacunación, pero, en el
momento del estímulo, estos títulos habían menguado y los títulos
individuales no se correlacionan estrechamente con una protección.
El mismo antígeno en un adyuvante de saponina y administrado por la
misma vía inducía menores títulos según ELISA y demostraba ser
inadecuado para proteger a cerdos con respecto de un estímulo
virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación.
El modelo de estímulo funcionaba muy bien puesto
que la totalidad de los 10 cerdos testigos desarrollaron signos
clínicos de erisipela después de un estímulo (Tabla 2). Tres cerdos
cumplieron el criterio de temperatura elevada y otros cinco eran
positivos para un cultivo de E. rhusiopathiae. Los restantes
dos cerdos testigos no cumplieron ninguno de los anteriores
criterios; sin embargo, estuvieron deprimidos durante varios días y
tenían lesiones metastásicas en la piel, características de la
enfermedad, y por lo tanto fueron sacrificados eutanásicamente. En
contraste, en el grupo vacunado con la vacuna que contenía el
Adyuvante Nº 1, 15 de los 20 cerdos fueron protegidos por
completo
(Tabla 3).
(Tabla 3).
Una vacuna experimental que contenía un antígeno
de E. rhusiopathiae del invento con el Adyuvante Nº 1,
cuando se administró a cochinillos en un régimen de 2 dosis a
aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionó una
significativa protección contra el desarrollo de erisipela clínica
procedente de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una
segunda vacunación, véase la Tabla 3, infra. Además, una
vacuna experimental similar con un adyuvante de saponina, cuando se
administra a cochinillos de acuerdo con el mismo régimen, no
protege frente al desarrollo de erisipela clínica procedente de un
estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda
vacunación. Finalmente, una vacunación que contiene un antígeno para
el invento, independientemente del adyuvante utilizado, inducía una
sustancial respuesta serológica que presentaba un pico (valor
máximo) a las dos semanas después de la segunda vacunación.
Ejemplo
1
La cepa de E. rhusiopathiae, CN 3342, se
cultiva en un medio que contiene Peptona Difco Proteose en una
concentración de 2,75%, Extracto de Levadura Difco (0,55%), Tween 80
(0,2%), K_{2}HPO_{4} (0,217%) y KH_{2}PO_{4} (0,061%) en
agua desionizada. El pH del medio se ajusta a 7,2 con NaOH 5 N. El
medio se esteriliza con valor de agua a un mínimo de 122ºC durante
30 a 90 minutos. Después de tratar en autoclave, se añade una
solución de dextrosa al 50% estéril hasta una concentración final
de 3% p/v (peso/volumen).
Se preparan cultivos de siembra en trabajo
retirando un criotubo del lote de siembra madre procedente de un
almacenamiento congelado (a menos 70ºC), descongelándolo
rápidamente, y transfiriendo asépticamente su contenido a un matraz
de medio. El matraz se incuba a 37ºC durante 12 a 36 horas, con
agitación, y se comprueba en cuanto a pureza mediante tinción Gram.
Cuando se encontró que era puro, el cultivo se mezcló con glicerol
estéril (al 10%), se distribuyó dentro de criotubos en cantidades
de 1 ml, y se almacenó en estado congelado.
Recipientes de siembra que contienen medio de
producción se inoculan con 0,01 a 2% de material de siembra madre o
en trabajo. Fermentadores de siembra, cuando se usan, que contienen
de 10 a 100 litros del medio de producción, se inoculan con 1 a 5%
de un cultivo procedente de un matraz de siembra. Un termentador de
producción que contiene de 200 a 10.000 litros del medio de
producción, se inocula con 0,5 a 5% de un cultivo procedente del
termentador de siembra.
Los cultivos de producción se incuban a un punto
de ajuste de 37 + 2ºC con agitación. Los tiempos de incubación
varían desde 4 hasta 24 horas. Una solución estéril 10 N de
hidróxido de sodio se añade al cultivo a lo largo del período de
tiempo de incubación para mantener un pH de 7,2 \pm 0,1. Durante
la fase de crecimiento, se efectúan adiciones periódicas de
dextrosa.
Antes de cosechar, el cultivo se examina en
microscopio en cuanto a pureza, morfología de las células y reacción
a Gram. El crecimiento se vigila midiendo la densidad óptica del
cultivo a 625 nm. Los cultivos se cosechan cuando tienen una
densidad óptica de 4,0 o mayor a 625 nm.
Ejemplo
2
Una solución de formalina se añadió a cultivos
hasta una concentración final de 0,5% (v/v) para desactivar el
cultivo. El cultivo se transfirió a un depósito estéril y se colocó
en una incubadora a 37 \pm 2ºC durante un mínimo de 24 horas (y
un máximo de 60 horas) con agitación constante. Los cultivos que no
fueron tratados inmediatamente se almacenaron a 2 hasta 8ºC durante
hasta 7 días. El cultivo desactivado se clarificó por paso a través
de una centrífuga de circulación continua. La fracción fluida se
retuvo para tratamiento adicional, y las bacterias se
desecharon.
En un experimento, se produjeron concentrados a
10x (10 veces) en un material filtrado de cultivos de E.
rhusiopathiae desactivados o bien con
beta-propiolactona ("BPL"), a una concentración
final de 0,1% v/v, o formalina, a una concentración final de 0,2%
v/v (a 37ºC durante al menos 24 horas). Un análisis de
inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA de enzyme linked
immunosorbent assay) específico para la proteína de 64 a 66 kDa
encontrada en un material filtrado de cultivo de E.
rhusiopathiae (Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol.
Infect. 107:637-649 y Patente de los EE.UU. Nº
5.625.038) se llevó a cabo para determinar el efecto de
desactivación y estabilización en la presencia de la proteína de 64
a 66 kDa. De modo coherente con hallazgos anteriores, de que la
desactivación con formalina del cultivo disminuía el valor según el
análisis ELISA de la proteína, el concentrado con BPL tenía un
valor según análisis aproximadamente de 4 veces el del concentrado
de formalina. Después de incubación a 37ºC, durante 14 días, el
concentrado con BPL había perdido aproximadamente un 80% de su
valor, comparado con aproximadamente un 40% para el concentrado con
formalina. En ambos casos, sin embargo, la previa adición de
REHYDRAGEL®, al 30% v/v, como agente estabilizador, véase
seguidamente, impidió la mayor parte de la pérdida y virtualmente
la totalidad de ésta en el caso de la preparación con formalina. Un
pequeño estudio en cerdos indicó que la fracción fluida de cultivos
desactivados con formalina era más eficaz que la de cultivos
desactivados con BPL para proteger a cerdos frente al estímulo con
E. rhusiopathiae virulentas.
Los fluidos se concentraron, a 6x hasta 20x
(usualmente a alrededor de 10x) mediante filtración con fibras
huecas (corte nominal de pesos moleculares x 10.000 kilodalton)
después de una centrifugación. Los fluidos se estabilizaron después
de la operación de concentración mediante la adición de un gel de
hidróxido de aluminio.
Con el fin de estabilizar al inmunógeno, un gel
de hidróxido de aluminio se añadió lentamente con agitación a los
fluidos concentrados hasta un valor final de 30% (v/v) (30 volúmenes
de gel por 70 volúmenes de concentrado). Después de una dilución a
20 veces del concentrado, el contenido del gel de Al en la vacuna
era sólo de aproximadamente 1,5%, no suficiente para causar
reacciones negativas en el sitio de la inyección. Una valoración
para determinar la cantidad del gel de Al que se requería para
adsorber la totalidad de la proteína protectora en una fracción
fluida de cultivo de E. rhusiopathiae concentrada en 10
veces, puso de manifiesto que más de un 95% había sido adsorbido
por REHYDRAGEL® al 32% v/v (Reheis, Berkeley Heights, Nueva Jersey).
Se añadió timerosal (es decir, MERTHIOLATE®) (Dimportex, España,
importado por Flavine Inc., Klosters, Nueva Jersey) como conservante
al producto en una concentración final de aproximadamente 0,01%
(p/v). La concentración de timerosal se mantuvo en aproximadamente
0,01% p/v en la composición de antígeno y en una composición de
vacuna que contenía el antígeno para el invento. Se añadió EDTA
hasta una concentración final de aproximadamente 0,07% (p/v) (Sigma,
St. Louis, Missouri).
El adyuvante utilizado fue el Adyuvante Nº 1. Se
prepararon 1.000 mi del Adyuvante Nº 1 a partir de 200 mi de una
solución de lecitina en aceite, esterilizada en filtro (lecitina al
10% en el aceite mineral DRAKEOL®), Tween 80 (56 mi) y Span 80 (24
mi) tratados en autoclave y solución salina tamponada con fosfato
(PBS de Dulbecco) (720 mi). La solución de lecitina en aceite y el
Span 80 se combinaron y mezclaron dentro de un depósito estéril
durante al menos 1 hora a la temperatura ambiente, hasta que
estuviera completa la emulsificación. La solución salina y el Tween
80 se combinaron y mezclaron dentro de un depósito estéril durante
al menos 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de aceite se
emulsionó con la mezcla acuosa utilizando un emulsificador de Ross.
El emulsionamiento se continuó por recirculación hasta que se
hubiera añadido la totalidad del adyuvante a la solución salina.
Luego la emulsión se hizo pasar dos veces a través de una prensa
Gaulin a la temperatura ambiente. El adyuvante se almacenó a 2
hasta 8ºC.
5 l de la vacuna se prepararon añadiendo 1 l del
adyuvante a 3 l de la fase acuosa. La fase acuosa se componía de
suficiente cantidad de concentrado, estabilizado para dar un
contenido final de antígeno de 3,2 unidades de opacidad por dosis
de 2 ml de vacuna, más una suficiente cantidad de solución salina
para completar el volumen a 5 l. Las unidades de opacidad se
definen como la densidad óptica (E_{625}) al cosechar multiplicada
por el factor de concentración.
Ejemplo
3
El octavo subcultivo (MS+8) de E.
rhusiopathiae, cepa CN3342, se utilizó para producir las
vacunas. Se utilizó un nivel de dosis de antígeno de E.
rhusiopathiae clarificado y estabilizado (3,2 unidades de
opacidad ["UO"]), tal como se calculó a partir de la densidad
óptica (DO) del cultivo en desactivación. Una UO era equivalente a
1 mi de fluido con una DO (determinada a 625 nm) de uno. Se utilizó
como adyuvante el Adyuvante Nº 1 o saponina (al 0,05% p/v, obtenida
a partir de Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio).
Específicamente, un cultivo de E. rhusiopathiae, cepa CN3342,
se hizo crecer hasta una DO de 5,28. El cultivo se desactivó
durante 24 horas con formalina al 0,5%. Después de la desactivación,
las bacterias se retiraron por centrifugación. Luego la fracción
fluida se concentró utilizando una unidad de ultrafiltración con un
corte nominal de pesos moleculares de 10.000 kDa. La fracción fluida
se concentró a aproximadamente 13,4 veces. El antígeno se
estabilizó añadiendo REHYDRAGEL® (al 30% v/v) al material
concentrado. El concentrado adsorbido se almacenó a 4ºC hasta que
se realizase la formulación de la vacuna. Las vacunas se formularon
con el Adyuvante Nº 1 o con saponina al 0,05% como adyuvante. El
antígeno estabilizado se diluyó en solución salina (cloruro de
sodio 150 mM y fosfato 4 mM) hasta llegar a la concentración final.
Se añadieron etilendiamina-tetraacetato (EDTA,
0,07%) y timerosal (0,01%) a las formulaciones finales de vacunas.
Una solución salina tamponada con fosfato se utilizó como placebo.
La Tabla 1 recopila los grupos en tratamiento, los tratamientos con
vacunas y los números de cochinillos vacunados y estimulados.
Una estimulación satisfactoria se evidenció en
animales testigos por una alta temperatura corporal (40,9ºC
[105,6ºF] o mayor en por lo menos dos días consecutivos), por
cultivo a la autopsia, y/o por los signos clínicos característicos
de una infección con E. rhusiopathiae. Los signos clínicos
considerados característicos de la enfermedad incluían muerte
súbita, depresión, hiperemia del abdomen y de los oídos, lesiones
cutáneas metastásicas, y rigidez o complicación en articulaciones.
Los cerdos que tenían signos clínicos pero no cumplían el criterio
de temperatura se sacrificaron y la sangre, el bazo y el hígado se
cultivaron en intentos de aislar las E. rhusiopathiae.
El ensayo exacto de Fisher se utilizó para
determinar si había alguna diferencia en el porcentaje de animales
protegidos con diferentes vacunas (P <0,05). Se construyeron
contrastes a priori para comparar cada grupo de dosis con
testigos y para comparar cada grupo con el promedio de todos los
otros grupos de dosis. Las relaciones entre el tipo de vacuna
administrada y las respuestas serológicas de cada grupo de
cochinillos se comprobaron para los 2 meses de edad, los 3 meses de
edad, los 4 meses de edad, los 5 meses de edad, y extracciones de
sangre previas a la estimulación utilizando una regresión logística.
La relación existente entre los títulos, inducidos por vacunas en
el momento de una estimulación, con el estado de enfermedad
(protegidos/no protegidos) se determinó utilizando una regresión
logística. El nivel de significancia de 5% se utilizó para declarar
la relación real.
Veinte cerdas o lechonas embarazadas, que tenían
bajos títulos serológicos según ELISA (Nº 800) para E.
rhusiopathiae se obtuvieron de Riddell Farms, Albert City, IA y
se alojaron en habitaciones para aislamiento en el Departamento de
Ciencias Veterinarias y Biológicas de la Universidad de
Nebraska.
Los títulos serológicos según ELISA se
determinaron en un ELISA de fijación directa de antígenos a células
enteras, de la siguiente manera. Véase la Patente de los EE.UU. Nº
4.918.163, que describe la preparación de placas revestidas con
antígenos y un ELISA que usa dichas placas. En primer lugar, se
hicieron crecer las E. rhusiopathiae tal como se describe en
el Ejemplo 1 y se cosecharon a partir de un cultivo en fase
logarítmica. Se registró la densidad óptica a 640 nm y se convirtió
en células/ml utilizando una tabla establecida mediante recuentos
de bacterias a partir de soluciones con diferentes densidades
ópticas. Las bacterias vivas fueron diluidas en PBS (PBS de
Dulbecco, Sigma, St. Louis, Missouri) hasta una densidad de
aproximadamente 1,1 x 10^{9} células/ml. Las bacterias vivas
diluidas en PBS fueron fijadas a placas para el ELISA. Con el fin
de preparar las placas, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de
glutaraldehído al 0,1% v/v (Sigma, St. Louis, Missouri), los
pocillos fueron cubiertos y las placas se incubaron a 37ºC durante 1
hora. El glutaraldehído en se retiró de cada pocillo y los pocillos
se secaron con paños absorbentes. Se añadieron a cada pocillo 100
\mul de las bacterias vivas en PBS a una densidad de
aproximadamente 1,1 x 10^{9} células/ml. Las placas se
centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 minutos a 22ºC. Se añadieron a
cada pocillo luego 200 \mul de un poli(alcohol vinílico)
(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) al 1% en PBS (PVA/ PBS) los pocillos
se cubrieron y las placas se mantuvieron durante una noche a 4ºC.
El contenido de los pocilios de las placas se transfirió a una
solución de bactericida y los pocillos se lavaron con PBS. Los
pocillos se cubrieron con gasa y se secaron a la temperatura
ambiente (durante alrededor de 1 hora).
El proceso de ELISA se llevó a cabo de la
siguiente manera usando las placas con antígeno fijado de células
enteras de bacterias. En primer lugar, los sueros de cerdos se
diluyeron, incluyendo un testigo positivo, en PVA/PBS al 1%. Todos
los sueros desconocidos se diluyeron a 1:50 y el testigo positivo se
utilizó a razón de 1:200. 200 \mul de cada muestra se añadieron a
un pocillo en una columna de la fila A. Se añadieron a los pocillos
remanentes 100 \mul de PVA/PBS al 1%. Se realizaron diluciones en
serie a 2 veces con cada muestra en las filas B-H.
Los pocillos se cubrieron e incubaron durante 1 hora a 37ºC. Luego,
los pocillos se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de una dilución a 1:2.000 de IgG de cabra
anti-cerdo (H & L) de un conjugado con
peroxidasa (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) preparada
en PVA al 1% en PBS. Los pocillos se cubrieron de nuevo y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron 3 veces
con. PBST. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul del substrato ABTS
(2,2'-azino-di-(ácido
3-etil-benzotiazolina-sulfónico)
obtenido a partir de Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) y
las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 10
minutos. Las placas se agitaron durante 10 segundos sobre un
agitador de microplacas antes de leer la absorbancia de cada pocillo
a 405-490 nm utilizando un lector de placas dejado
como vacío. El título en el punto final de cada suero desconocido
fue la dilución del suero en la que la absorbancia era mayor que la
absorbancia de una dilución a 1:3.200 del testigo positivo.
Se extrajo sangre de las cerdas a los 0 hasta 10
días antes de parir, con el fin de determinar sus títulos de
anticuerpos de E. rhusiopathiae. Los cochinillos fueron
distribuidos aleatoriamente basándose en los títulos serológicos de
las cerdas* y las fechas de los partos. Se extrajo sangre de
cincuenta y ocho (58) cochinillos procedentes de estas cerdas o
lechonas y éstos se vacunaron aproximadamente a las 3 semanas de
edad con una de las dos vacunas experimentales de E.
rhusiopathiae o con el placebo (grupos enumerados en la Tabla
1). Aproximadamente a las 4 semanas de edad, los cochinillos se
destetaron. Aproximadamente a las 6 semanas de edad se extrajo
sangre de los cochinillos y éstos se volvieron a vacunar con la
misma vacuna. Aproximadamente a los 2 meses, 3 meses, 4 meses y 5
meses de edad se extrajo sangre de todos los cerdos. Aproximadamente
a los 5½ de meses de edad, todos los cerdos sobrantes se retiraron
del estudio. Aproximadamente a los 6 meses de edad (a las 20
semanas después de la segunda vacunación) se extrajo sangre de los
cerdos y 40 cerdos fueron estimulados intramuscularmente con 2 ml
de un cultivo virulento de E. rhusiopathiae (DL_{50} de
237 ratones, 1,74 x 10^ unidades formadoras de colonias/ml) que
habían crecido a partir de un cultivo proporcionado por el National
Veterinary Services Laboratory. Los animales se vigilaron en cuanto
a signos de enfermedad clínica y por la temperatura rectal durante
2 días antes de la estimulación, en el día de la estimulación y a
los 7 días a continuación de la estimulación. Cualquier animal
testigo que cumpliese el criterio de una temperatura rectal elevada
(40,9ºC) se sacó del estudio y se trató con penicilina inyectable.
Cualquier animal testigo que tuviera signos clínicos de enfermedad,
pero que no cumpliese el criterio de elevada temperatura rectal, se
sacrificó eutanásicamente, se le hizo la autopsia y se cultivaron
muestras de sangre entera, bazo e hígado en cuanto a E.
rhusiopathiae. Cualquier animal testigo que muriese fue sometido
a autopsia y muestras de bazo e hígado se cultivaron en cuanto a
E. rhusiopathiae. Cualquier animal vacunado que cumpliese el
criterio de elevada temperatura rectal (a 40,9ºC) y/o signos
clínicos de enfermedad, se sacó del estudio y se trató con
penicilina inyectable. Cualquier animal vacunado que muriese después
de la estimulación fue sometido a autopsia y las muestras de bazo e
hígado se cultivaron en cuanto a E. rhusiopathiae. Los
títulos de anticuerpos para E. rhusiopathiae se determinaron
por el ELISA antes descrito y se hizo una correlación de los
títulos de anticuerpos con la protección clínica.
Se determinaron los títulos según ELISA en los
sueros a partir de la única muestra de sangre obtenida de las
cerdas y de todas las muestras de sangre procedentes de los 7
períodos de extracción de muestras a partir de los cochinillos. Se
realizaron cultivos bacterianos aerobios (durante 48 horas, a 37ºC,
agar con sangre) en muestras de sangre y/o en bazos e hígados
obtenidos de cerdos que habían muerto o que fueron sacrificados por
inyección letal.
Resultados: Los resultados de una
estimulación con E. rhusiopathiae de cerdos testigos, se
recopilan en la Tabla 2. Los 10 cerdos eran positivos en cuanto a
erisipela.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la estimulación por E.
rhusiopathiae de cerdos a los que se administró la vacuna con
el Adyuvante Nº 1 (T02) se recopilan en la Tabla 3. 15 de los 20
cerdos (75%) estaban totalmente protegidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados de la estimulación por E.
rhusiopathiae de cerdos a los que se había administrado la
vacuna con adyuvante de saponina (T03) se recopilan en la Tabla 4.
Solamente fue protegido uno de los cerdos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos medios geométricos ("GMT"s)
según ELISA de grupos de cochinillos se enumeran en la Tabla 5.
Los cochinillos tenían títulos muy bajos de
anticuerpos, específicos para E. rhusiopathiae en el momento
de su primera vacunación. Estos títulos fluctuaban entre menos de 50
y 200. En cochinillos testigos. Los GMT subieron ligeramente en el
curso del estudio, indicando que el ELISA era menos específico en
cerdos más viejos.
Las vacunas con el Adyuvante Nº 1 o con saponina
como adyuvante indujeron una respuesta serológica significativa
estadísticamente (P = 0,0001) que tenía un máximo (pico) a las dos
semanas después de la segunda vacunación (aproximadamente a los 2
meses de edad). Los títulos en ambos grupos disminuyeron
constantemente en el curso del tiempo (hasta aproximadamente los 5
meses de edad) siendo los GMT de cochinillos que recibieron antígeno
en el Adyuvante Nº 1 observablemente mayores que los GMT de los
cochinillos que recibieron antígeno en el adyuvante de saponina en
todos los momentos. En el momento de la estimulación, los GMT de los
cerdos que recibieron el antígeno en el Adyuvante Nº 1 eran
ligeramente más de 2 veces mayores que los GMT de los testigos,
mientras que los GMT de los cerdos que recibieron antígeno en un
adyuvante de saponina eran ligeramente menos de 2 veces mayores que
los de los testigos. La protección con respecto de una enfermedad
clínica después de la estimulación no se correlaciona con el título
según ELISA individual (P >0,05). No obstante, una observación
interesante fue un título de pico observado a las dos semanas
después de la segunda vacunación en cerdos a los que se administró
antígeno en el Adyuvante Nº 1. De los 20 cochinillos vacunados con
antígenos en el Adyuvante Nº 1, ocho tenían unos títulos de pico
mayores que o iguales a 2.800 (8 de 8 estaban protegidos de la
estimulación), ocho tenían unos títulos de pico de 6.400 (6 de 8
estaban protegidos de la estimulación), y 4 tenían unos títulos de
pico de 3.200 (1 de 4 estaban protegidos de la estimulación)
sugiriendo que un título que fuese de 6.400 o mayor era un
indicador de una protección prolongada.
En resumen, todos los 10 testigos sin vacunar
resultaron infectados. En el grupo de cerdos a los que se administró
la vacuna con el Adyuvante Nº 1, fueron protegidos 15 de 20. En el
grupo de cerdos a los que se administró la vacuna con saponina como
adyuvante, se protegió sólo uno entre 10.
Ejemplo
4
Se preparó una vacuna de acuerdo con los
Ejemplos 1-3, lo que incluía tratar el antígeno con
un gel de Al tal como se ha descrito. La vacuna se ensayó en cuanto
a eficacia en cerdos. Los cerdos fueron vacunados con dos dosis de
2 mi administradas por vía intramuscular (IM) una dosis a
aproximadamente las 3 semanas (desde el destete) y la segunda dosis
3 semanas más tarde. Los testigos recibieron una solución salina
tamponada con fosfato como un placebo. La inmunidad fue estimulada
por la inyección IM de E. rhusiopathiae virulentas a una
edad de aproximadamente 9 semanas. Como se muestra en la Tabla 6, la
protección debida a la vacunación era de 100% a las 9 semanas. Esta
vacuna ya tenía 12 meses de antigüedad en el momento en que los
cerdos fueron vacunados. El resultado confirma que el antígeno
protector había sido estabilizado satisfactoriamente.
- Nota:
- El vigésimo cerdo fue excluido. Un animal muy díscolo, que forcejeaba tan violentamente cuando se le manipulaba, del que no se pudo determinar su temperatura en reposo. Después de la estimulación, este cerdo permaneció completamente sano.
Claims (7)
1. Una composición de antígeno que comprende
- i)
- una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae que está desactivado con formalina o con beta-propiolactona; y
- ii)
- un agente estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio, o un alumbre,
en la que dicha composición de antígeno está
exenta de E. rhusiopathiae.
2. La composición de antígeno de la
reivindicación 1, en la que dicha fracción fluida está concentrada a
3 veces hasta 30 veces.
3. La composición de vacuna que comprende la
composición de antígeno de la reivindicación 1 y una composición de
adyuvante.
4. La composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que la composición de adyuvante comprende
de 0,25% a 12,5% v/v de una lecitina, de 1% a 23% v/v de un aceite y
de 1,5% a 8% v/v un de agente tensioactivo anfífilo en dicha
composición de vacuna.
5. Un método de producir una composición de
antígeno, que comprende añadir un agente estabilizador a una
fracción fluida procedente de un cultivo de E.
rhusiopathiae, en la que dicho cultivo de E.
rhusiopathiae está desactivado, y las bacterias se separan con
respecto del caldo o medio, y la fracción fluida se retiene y las
bacterias se desechan.
6. Uso de la composición de antígeno de la
reivindicación 1 para la preparación de una composición de vacuna
para proteger a un animal contra la erisipela.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6 en
el que el animal es un cerdo.
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