MXPA00000173A - Antigenos de erysipelothrix rhusiopathiae y composiciones de vacunas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a composiciones estabilizadas de antígenos de Erysipelothrix rhusiopathiae y a formulaciones de vacunas que contienen dichas composiciones de antígenos. Los antígenos de la invención son eficaces para proporcionar una protección a largo plazo contra erisipela en animales.

Description

ANTiGENOS DE ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE Y COMPOSICIONES DE VACUNAS CAMPO DE LA INVENCIÓN El invención se refiere a composiciones de antígenos y formulaciones de vacunas para evitar o reprimir por Erysipelothrix rhusiopathiae (erisipela), y a métodos para preparar y usar esas composiciones de antígenos y formulaciones de vacunas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La erisipela tiene una distribución mundial y presenta una importancia económica en Europa, Asia, Austria así como en América del Norte y del Sur. Los cerdos de 3 meses a 3 años de edad son sumamente susceptibles a padecer erisipela. Los cerdos afectados tienen con frecuencia articulaciones hinchadas y rígidas y no ganan en peso eficientemente. También, sus carcasas se recortan o rechazan con frecuencia por los inspectores en las instalaciones de envasado. Hace aproximadamente 10 años se demostró que era innecesaria la práctica convencional de preparar vacunas contra E. rhusiopathiae a partir de cultivos muertos enteros. Un metal filtrado exento de bacterias producía un efecto igual de bueno para proteger tanto a cerdos como a ratones frente a un estímulo virulento. La subsiguiente investigación publicada por científicos del Japón y de los Estados Unidos de América (EE.UU.) ha confirmado este hallazgo y ha demostrado que las E. rhusiopathiae liberan dentro del medio de cultivo un antígeno que es un inmunógeno universal, puesto que inmuniza a los cerdos frente a todas las capas de E. rhusiopathiae (Sawada y Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48: 239-242; Groschup y colaboradores, 1991 , Epidemiol. Infecí. 107:637-649). Groschup y colaboradores demostraron que una proteína de 64 a 66 kDa presente en el cultivo protegía a ratones frente a un estímulo con E. rhusiopathiae virulenta. Habiéndose demostrado que dicha proteína protege también a los cerdos, la USDA proporciona a los fabricantes de vacunas un anticuerpo monoclonal (mAb) para esta proteína, con el fin de utilizarlo para analizar la proteína. Aunque es muy deseable una vacuna eficaz para evitar la erisipela en cerdos, ninguna de las muchas vacunas tradicionales contra la erisipela proporciona una protección aceptable para los cerdos destetados. El problema es la falta de duración de la inmunidad. La industria porcina requiere una vacuna que, administrada durante la lactancia, proteja a los cerdos contra esta enfermedad letal y devastadora hasta la edad oportuna para el sacrificio, es decir aproximadamente los 6 mese. La USDA ha especificado este requisito como una norma para otorgar licencias a nuevas vacunas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una composición de antígeno de E. rhusiopathiae y a métodos para preparar esta composición de antígeno. La invención se refiere también a una formulación de vacuna que contiene una composición de antígeno de E. rhusiopathiae y un adyuvante. La invención se refiere además a un método para utilizar una composición de antígeno de la invención con el fin de vacunar a un animal, preferiblemente a un mamífero o a una ave. En particular, la invención se refiere a un método de vacunar a un cerdo, un cordero, un perro, un caballo, una vaca o un ser humano con un antígeno de la invención. En una realización, se describen antígenos estabilizados procedentes de la fracción fluida de cultivos de E. rhusiopathiae. En un aspecto, se añade un agente estabilizador a un material sobrenadante o filtrado de E. rhusiopathiae, preferiblemente a un material sobrenadante o filtrado concentrado. Una agente estabilizador es un agente capaz de absorber el antígeno. Ejemplos no limitativos de agentes estabilizadores son un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, hidróxido de calcio e hidróxido de zinc y un alumbre. En un aspecto preferido, un gel de hidróxido de aluminio se añade a un material sobrenadante concentrado de manera tal que la concentración final del gel hidróxido de aluminio sea desde aproximadamente 10% v/v (es decir, una concentración de 10% de volumen por volumen, obtenida p.ej. mezclando 9 volúmenes del material sobrenadante con 1 volumen del gel de hidróxido de aluminio) hasta aproximamente 40% v/v, más preferiblemente alrededor de 30% v/v. En un aspecto, el antígeno que comprende el material sobrenadante o filtrado concentrado del cultivo de E. rhusiopathiae y el agente estabilizador se diluye desde aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 30 veces, preferiblemente alrededor de 20 veces, cuando el antígeno se formula para usarse en una composición de vacuna, disminuyendo de este modo la concentración del agente estabilizador en la composición de vacuna hasta menos de aproximadamente 5% v/v. En otra realización, las E. rhusiopathiae se cultivan y tratan para obtener un material sobrenadante o filtrado que comprende un antígeno de E. rhusiopathiae. En un aspecto, el cultivo de E. rhusiopathiae es deasactivado, por ejemplo, añadiendo formalina o beta-propiolactona. En un aspecto adicional, el caldo del cultivo de E. rhusiopathiae es separado con respecto de las bacterias, por ejemplo por centrifugación. Todavía en otro aspecto, el material sobrenadante es concentrado en aproximadamente 10 veces, por ejemplo, por filtración molecular. En otra realización de la invención, se añade un agente conservante al antígeno, por ejemplo, mertiolato, ya sea con o sin ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA). En una realización adicional de la invención, un antígeno de la invención se combina con un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante que comprende una lecitina, un aceite y uno o más agentes tensioactivos. En otra realización de la invención, se describen métodos en los que se usan los antígenos y las vacunas de la invención para vacunar a un animal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones y métodos para prevenir o reprimir la erisipela. En una realización, la invención se refiere a antígenos de E. rhusiopathiae y a métodos para preparar dichos antígenos. La invención se refiere además a formulaciones de vacunas que contienen un antígeno de la invención. La invención se refiere además a un método de usar un antígeno de E. rhusiopathiae para vacunar a un animal, preferiblemente a un mamífero, o a un ave. En un aspecto sumamente preferido, el mamífero se selecciona entre el grupo que consta de una cerdo, un cordero, un perro, un caballo, una vaca o un ser humano. La invención se refiere a antígenos obtenidos a partir de un cultivo de E. rhusiopathiae. Cualquier cepa de E. rhusiopathiae puede ser la fuente de antígenos para la invención, por ejemplo las cepas descritas en la patente de los EE.UU. No. 5.625.038. el cultivo a partir del que se pueden aislar los antígenos puede ser proporcionando de una diversidad de maneras. Por ejemplo, el cultivo puede ser puro o sustancialmente puro. Más preferiblemente, los antígenos de la invención se obtienen a partir de un material sobrenadante o filtrado de un archivo de E. rhusiopathiae. En una realización sumamente preferida, los antígenos de la invención se obtienen a partir del material sobrenadante o filtrado de un cultivo líquido puro o sustancialmente puro de E. rhusiopathiae. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar de una diversidad de maneras, como es conocido en la tecnología. Véanse las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.625.038; 5.616.328; 5.417.971 ; 5.225.194; 4.981.865, que debaten la cultivación de bacterias. Por ejemplo las E. rhusiopathiae se pueden cultivar tal como se ha descrito en los ejemplo ilustrativos que se presentan más adelante. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar también como se describe en al citas de Sawada y Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242 y de Groschup y colaboladores, 1991 , Epidemiol. Infecí. 107:637-649. Los antecedeníes generales acerca de la cullivación y del fraíamienfo de células procarióticas se presentan en las citas bibliográficas de Maniatis y colaboradores, 1982, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual. Cold Spring Harborn Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores, 1989, Current protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates y Wiley Interscience, NY Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, todas la cuales se incorporan a la presente por su referencia en su totalidad. En una realización preferida, el cultivo es desactivado añadiendo formalina (en una concentración final de aproximadamente 0.5% v/v). En otra realización preferida, los antígenos de la invención se obtienen a partir del material sobrenadante o filtrado de un cultivo de E. rhusiopathiae. Un material sobrenadante o filtrado de cultivo, en una realización preferida, es concentrado aproximadamente en 10 veces y se añade un gel de hidróxido de aluminio (preferiblemente REHYDRAGEL®) al material sobrenadante o filtrado concentrado en una concentración final de aproximadamente 30% v/v para estabilizar al antígeno. En otra realización preferida, se formula una composición de vacuna que comprende el antígeno y un adyuvante, constituyendo el adyuvante, por ejemplo, aproximadamente 25% v/v de la composición de vacuna. En otra realización preferida, se añaden a los antígenos timerosal (en una concentración final de aproximadamente 0.01 % v/v) junto con EDTA ( en una concentración final de aproximadamente 0.07% v/v) como conservantes. Un adyuvanten preferido, aquí citado como "Adyuvante No. 1" comprende aproximadamente 2% v/v de lecitina, aproximadamente 18% v/v de un aceite mineral y aproximadamente 8% v/v de un agente tensioactivo (p.ej. alrededor de 5.6% v/v de tween 80 y alrededor de 2.4% v/v de Span 80), siendo el volumen remanente de una solución salina (p.ej. PBS de Dulbecco). Este adyuvante se describe en la Solicitud de Patente de los EE.UU. No. de serie , presentada el 29 de Enero de 1999, intitulada "Adyuvantes para Uso de Vacunas" que se incorporan a la presente por su referencia.

DESACTIVACIÓN DE E. RHUSIOPATHIAE Los antígenos de la invención se obtienen a partir de E. rhusiopathiae que se pueden proporcionar de maneras conocidas en la tecnología, por ejemplo en un cultivo líquido. En una realización preferida de la invención, un cultivo de E. rhusiopathiae a partir del cual se aisla un antígeno es desactivado antes de usar al antígeno en una formulación de vacuna. En una realización sumamente preferida, el cultivo de E. rhusiopathiae es desactivado antes de separar la fracción líquida con respecto de las bacterias. La desactivación del cultivo de E. rhusiopathiae se lleva a cabo para una diversidad de finalidades, por ejemplo para matar o aniquilar las bacterias o para desactivar las proteasas, o con el fin de preservar y conservar el antígeno. Un cultivo que contiene los antígenos de la invención puede ser desactivado de una diversidad de maneras conocidas en la tecnología. Por ejemplo, el cultivo se puede exponer a un agente desactivador, es decir a un agente que es capaz de aniquilar a las E. rhusiopathiae. Un agente desactivador útil en la práctica de la invención permite que el antígeno de la invención provoque una respuesta inmunitaria en un animal para proteger a dicho animal con respecto de la erisipela. Se pueden utilizar agentes desactivadores conocidos en la tecnología, por ejemplo formalina (formaldehído), beta-propiolactona u otros agentes químicos que tienen propiedades similares a las de estos agentes. Los agentes químicos apropiados para la desactivación de bacterias se pueden determinar por una persona que tenga experiencia ordinaria en la tecnología, por ejemplo poniendo en contacto las bacterias con un producto químico particular, y determinando si las bacterias han sido aniquiladas y los antígenos obtenidos con ello están todavía activos en su capacidad para producir un anticuerpo protector por ejemplo, vacunando ratones con las bacterias tratadas. También véase la Patente de los EE.UU. No. 5.225.194, que debate la desactivación de bacterias.

SEPARACIÓN Y CONCENTRACIÓN DE UN FLUIDO DE CULTIVO DE E. RHUSIOPATHIAE En una realización preferida, los antígenos de la invención se obtienen a partir de la fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar y las bacterias se pueden separar con respecto del caldo de cultivo, por ejemplo centrifugando o filtrando un cultivo líquido. Un cultivo de E. rhusiopathiae útil para el aislamiento de un antígeno de la invención se puede proporcionar de cualquier manera conocida en al tecnología. Por ejemplo, las E. rhusiopathiae se pueden hacer crecer en un caldo o medio de manera tal que las bacterias se multipliquen rápidamente, es decir, en fase logarítmica. En una realización preferida, el cultivo utilizando para preparar un antígeno de la invención está en fase logarítmica, más preferiblemente en fase logarítmica tardía, en el momento en el que se inicia el tratamiento del cultivo. En una realización preferida, un cultivo de E. rhusiopathiae es tratado para separar la totalidad o sustancialmente la totalidad de las bacterias con respecto del caldo o medio en el que éstas estaban creciendo. Por ejemplo, aproximadamente 90% de las bacterias se pueden retirar desde el caldo o medio, más preferiblemente se retiran aproximadamente 95% de las bacterias, lo más preferiblemente se retiran aproximadamente 98% de las bacterias. Las E. rhusiopathiae se pueden separar con respecto del caldo o medio de cualquier manera conocida en la tecnología. Por ejemplo, un cultivo de E. rhusiopathiae se puede centrifugar a fin de separar las bacterias con respecto del caldo o medio.

Cualquier centrífuga conocida en la tecnología, que sea capaz de sedimentar las bacterias E. rhusiopathiae es apropiada para separar las células con respecto del caldo o medio. Por ejemplo, se puede utilizar una centrífuga de circulación continua. Los antecedentes acerca de cómo retirar bacterias desde un medio de cultivo se proporcionan en la obra de Maniatis y colaboradores, 1982, Molecular Cloninq. A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY, Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY. En otro aspecto, las E. rhusiopathiae se pueden retirar desde el medio o caldo de cultivo por filtración a través de un filtro que retiene a las bacterias pero no retiene al antígeno de la invención. Se conocen en la tecnología muchos filtros que son apropiados para separar las bacterias con respecto del antígeno en el caldo o medio. Por ejemplo, un filtro útil para separar las bacterias con respecto de la fracción fluida tiene un diámetro medio de poros de aproximadamente 0.1 micrómetros a aproximadamente 0.5 micrómetros, más preferiblemente alrededor de 0.2 micrómetros. La fracción fluida obtenida a partir de un cultivo de E. rhusiopathiae ("fracción fluida") como se describe anteriormente puede ser concentrada. En una realización, la fracción fluida puede ser concentrada a aproximadamente 3 veces hasta aproximadamente 30 veces, por ejemplo a aproximadamente 3 veces, o a aproximadamente 6 veces, o a aproximadamente 10 veces, o a aproximadamente 15 veces, o a aproximadamente 20 veces, o a aproximadamente 30 veces. La reacción fluida puede ser concentrada de cualquier manera conocida en la tecnología. En una realización preferida, la fracción puede ser concentrada utilizando una filtración con fibras huecas. En un aspecto, la filtración con fibras huecas se lleva a cabo con un corte de peso molecular de aproximadamente 5.000 kilodalton a aproximadamente 50.000 kilodalton, más preferiblemente de alrededor de 10.000 kilodalton a alrededor de 30.000 kilodalton. Véase también la Patente de los EE.UU. No° 5.225.194, que debate la concentración de una fracción fluida de un cultivo bacteriano. La fracción fluida puede también ser concentrada mediante secado por congelación o liofilización. En otro aspecto, la fracción fluida puede ser concentrada por precipitación de las proteínas y polipéptidos en la fracción fluida, seguida por resuspensión del material precipitado. Las proteínas se pueden precipitar desde la fracción fluida utilizando cualquier método conocido en la tecnología, por ejemplo mediante precipitación por polietilen-glicol, etanol o sulfato de amonio. Después de la precipitación, el sedimento puede ser vuelto a suspender en cualquier solución que sea apropiada para la preparación de una formulación de vacuna, por ejemplo en una solución salina.

Estabilización de un antíqeno de E. rhusiopathiae Los antígenos obtenidos a partir de una fracción de un cultivo de E. rhusiopathiae son inmunógenos eficaces para evitar o reprimir la erisipela en un animal. Por ejemplo, la carencia de estabilidad de esos antígenos a continuación de la retirada de las bacterias constituye un grave problema cuando se utilizan estos antígenos en una composición de vacuna. La invención resuelve el problema y está basado, en parte, en el descubrimiento de que los antígenos existentes en una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae se pueden estabilizar añadiendo un agente estabilizador. Se puede utilizar cualquier agente estabilizador conocido en la tecnología para estabilizar a los antígenos de la invención. En una realización preferida, un agente estabilizador es capaz de absorber a un antígeno desde una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae. Un apropiado agente estabilizador puede mantener el potencial antigénico de una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae o puede decelerar de otra manera la degradación de su potencial antigénico después de haberse retirado las bacterias. Tal efecto estabilizador de un agente se puede determinar con experimentación. Por ejemplo, se pueden incubar dos muestras de una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae desactivado a 37°C durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días, ensayándose una muestra con un agente químico y otra sin ningún agente químico para su uso como un agente estabilizador. Las muestras se ensayan luego en una vacunación de ratones de acuerdo con el ensayo normalizado de potencia de ratones (9 CFR 113.119(c)) utilizando un adyuvante, por ejemplo el adyuvante N° 1. Una proporción de animales protegidos en el grupo al que se ha administrado la vacuna tratada con el agente químico, mayor que en el grupo al que se ha administrado la vacuna sin tratar o que en los animales testigos sin vacunar, indica que ha sido estabilizado el antígeno en la vacuna tratada químicamente. El experimento antes descrito ¡lustra un ensayo de estabilidad acelerada a una temperatura (37°C) más alta que la que se utiliza normalmente para el almacenamiento. Normalmente, las preparaciones de antígenos se almacenan a temperaturas frías, por ejemplo de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. Una estabilidad durante 28 días a 37°C indica una estabilidad por un periodo de tiempo más largo en almacenamiento en frío normal, es decir por un periodo de tiempo de varios años. En una realización, el antígeno es estabilizado a temperaturas frías durante hasta aproximadamente 5 años de acuerdo con la presente invención, más específicamente durante hasta aproximadamente 3 años a temperaturas frías. En otra realización, el antígeno es estabilizado durante al menos un año a temperaturas frías de acuerdo con la presente invención. Se conocen en la tecnología una diversidad de agentes que son capaces de absorber a un antígeno, por ejemplo son útiles como agentes estabilizadores un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio y un alumbre (por ejemplo un alumbre de potasa). En una realización preferida, se utiliza un gel de hidróxido de aluminio, por ejemplo, REHYDRAGEL® como agente estabilizador. (Véanse las patentes de los EE.UU. N° 5.616.328 y 5.232.690, que debaten geles metálicos y sus usos).

En una realización, un gel de hidróxido de un metal, por ejemplo un gel de hidróxido de aluminio (por ejemplo REHYDRAGEL®) es añadido hasta una concentración final de desde aproximadamente 10% v/v hasta aproximadamente 40% v/v, por ejemplo de aproximadamente 10% v/v, o de aproximadamente 20% v/v, o de aproximadamente 30% v/v o de aproximadamente 40% v/v en la preparación de antígenos. En una realización preferida, el gel de hidróxido de aluminio (por ejemplo REHYDRAGEL®) es añadido hasta una concentración final de aproximadamente 30% v/v de la preparación de antígenos. Una preparación de antígenos, que contiene el agente estabilizador, se puede utilizar para formular una composición de vacuna, por ejemplo añadiendo un adyuvante y un diluyente tal como una solución salina, de manera tal que se diluyan la preparación de antígenos y el agente estabilizador. Dicha dilución puede ser útil para evitar, o evitar sustancialmente, efectos colaterales indeseados de la formulación de vacuna en el animal. Por ejemplo, una formulación de antígenos que contiene un gel de hidróxido de metal, por ejemplo un gel de hidróxido de aluminio (por ejemplo REHYDRAGEL®), es diluida después de la adición a una formulación de vacuna en aproximadamente 5 veces, o en aproximadamente 10 veces, o en aproximadamente 15 veces, o en aproximadamente 20 veces, o en aproximadamente 25 veces, o en aproximadamente 30 veces. En una realización preferida, una formulación de antígeno que contiene gel de hidróxido de aluminio (por ejemplo REHYDRAGEL®) en una concentración final de aproximadamente 30% v/v, es diluida mediante adición a la formulación de vacuna en aproximadamente 20 veces, dando una concentración final de gel de hidróxido de aluminio de aproximadamente 1.5%.

Composiciones de vacunas que comprenden antígenos de E. rhusiopathiae Un antígeno de la invención se puede utilizar en una composición de vacuna para inmunizar a un animal. Es una realización, la composición de vacuna contiene un antígeno de la invención y un adyuvante. En una realización preferida, un adyuvante útil para una composición de vacuna de la invención comprende una lecitina, un aceite y un agente tensioactivo. Una composición de vacuna formulada con un adyuvante preferido contiene una lecitina en una concentración de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 12.5% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 0.5% hasta alrededor de 5% y lo más preferiblemente desde alrededor de 0.5% hasta alrededor de 1.25% v/v, un aceite en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 23% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 3.5% hasta alrededor de 10% y lo más preferiblemente de alrededor de 4.5% y un agente tensioactivo anfífilo en una proporción de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 6% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 1.5% hasta alrededor de 4% y lo más preferiblemente de alrededor de 2% v/v. Preferiblemente, el adyuvante tiene 2 agentes tensioactivos anfífilos, por ejemplo agentes tensioactivos Tween y Span, de los cuales una está predominantemente en la fase acuosa (por ejemplo el Tween 80) de la composición de vacuna y el otro está en la fase oleosa (por ejemplo Span 80). Preferiblemente, cuando se utilizan como agentes tensioactivos Tween 80 y Span 80, la concentración de Tween 80 es desde aproximadamente 1>2 hasta aproximadamente 3 veces más alta que la concentración de Span 80, preferiblemente alrededor de 2 veces. Una adyuvante preferido contiene una solución acuosa de un vehículo, por ejemplo una solución salina tamponada con fosfato (PBS, de Phosphate Buffered Satine) (por ejemplo Dulbecco PBS). Una lecitina y un aceite apropiados para una adyuvante para las composiciones de vacunas son una mezcla de lecitina en el aceite mineral DRAKEOL® 5 It Mineral Oil. La lecitina se puede obtener de Central Soya, Fort Wayne, Indiana. Véase también la patente de los EE.UU. N° 5.084.269, que debate composiciones de adyuvantes. Los agentes tensioactivos Tween y Span se pueden obtener de Van Waters and Rogers, Omaha, Nebraska. En otra realización, adyuvantes conocidos en la tecnología, por ejemplo, emulsiones en aceites, hidróxido de aluminio, dipéptidos muramílicos, hidróxido de zinc y calcio, avridina, hidróxido de aluminio, aceites y saponinas se pueden utilizar en una formulación de vacuna de la invención, como se ha descrito en las patentes de los EE.UU. N° 5.846.527; 5.417.971; 5.232.690, que debaten adyuvantes. Se formula una composición de vacuna preferida, en la que desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% de su volumen es una composición adyuvante, más preferiblemente desde alrededor de 15% hasta alrededor de 35%, más preferiblemente desde alrededor de 20% hasta 30% y lo más preferiblemente de alrededor de 25%.

Una formulación de vacuna se puede administrar a un individuo por sí sola o en la forma de una composición farmacéutica o terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los antígenos se pueden producir por medio de procesos convencionales de mezclamiento, disolución, granulación, producción de grageas, levigación, emulsionamiento, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o agentes auxiliares fisiológicamente aceptables, que facilitan el tratamiento de los antígenos de la invención y su transformación en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la vía de administración que se escoja. Las formulaciones sistémicas incluyen las destinadas a su administración por inyección, por ejemplo por inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal. Para su inyección, los antígenos se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como una solución de Hanks, una solución de Ringer, una solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otra solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente las proteínas pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo apropiado, p.ej. agua estéril exenta de pirógenos, antes del uso.

Además de las formulaciones que se han descrito con anterioridad, los antígenos se pueden formular también como una preparación de liberación retardada (de depósito). Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los antígenos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos apropiados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas intercambiadoras de iones, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente soluble. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de suministro de agentes farmacéuticos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se puede utilizar para suministrar un antígeno. Se pueden emplear también ciertos disolventes orgánicos tales como dimetil-sulfóxido, aunque usualmente a costa de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los antígenos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación prolongada, tales como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico o de vacunación: Se han consagrado diversos materiales de liberación prolongada y son bien conocidos por los expertos en la tecnología. Las cápsulas de liberación prolongada, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los antígenos durante un período desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del agente, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de los antígenos.

La determinación de una cantidad eficaz del antígeno para su administración está bien dentro de las aptitudes de los expertos en la tecnología, especialmente a la vista de la descripción detallada que aquí se proporciona. Una dosis eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de análisis in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos con animales para conseguir una inducción de una respuesta inmunitaria utilizando técnicas que son bien conocidas en la tecnología. Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica podría optimizar con facilidad la administración a todas las especies de animales basándose en los resultados que aquí se describen. La cantidad y el intervalo de dosificación se puede ajustar individualmente. Por ejemplo, cuando se utilizan como una vacuna, los antígenos de la invención se pueden administrar en aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dosis durante un período de tiempo de 2-36 semanas. Se pueden administrar periódicamente después de ello revacunaciones. Protocolos alternativos pueden ser apropiados para animales individuales. Una dosis apropiada es una cantidad de antígeno que, cuando se administra como antes se describe, es capaz de incitar una respuesta inmunitaria en un animal inmunizado suficiente para proteger al animal con respecto de una infección por E. rhusiopathiae durante al menos 4 hasta 12 meses. La cantidad de antígeno en una dosis es especificada en términos de la densidad óptica (E62s) del cultivo en desactivación, como unidades de opacidad. Si están en desactivación, la densidad óptica es de 4.0, p.ej. un mililitro de material sobrenadante o filtrado de cultivo, preparado a partir del cultivo, contendrá cuatro unidades de opacidad, 0.5 ml contendrán 2 unidades de opacidad, etc., incluso aunque se haya eliminado la fuente de opacidad, es decir las células bacterianas. Si un fluido sobrenadante que contiene, p.ej., 5 unidades de opacidad por ml es concentrada a 12 veces, por filtración molecular, el fluido concentrado tendrá un valor de 60 unidades de opacidad por ml. En general, la cantidad de antígeno es una dosis de vacuna puede fluctuar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 unidades de opacidad, preferiblemente entre alrededor de 2 y alrededor de 4 unidades de opacidad. El apropiado volumen de una dosis variará con la vía de inyección y el tamaño del hospedante, típicamente desde 0.1 a alrededor de 5 ml. Preferiblemente, cuando el hospedante es un cerdo, el cerdo tiene una edad de al menos 2 semanas.

EJEMPLOS El estudio de vacunación presentado seguidamente ha demostrado que una vacuna como aquí se describe con el adyuvante N° 1 , cuando se administra a cochinillos en un régimen de 2 dosis a aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionaba una protección significativa contra un estimulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación. El antígeno con el adyuvante N° 1 inducía también sustanciales respuestas a anticuerpos, como se muestra mediante los títulos según ELISA en sueros a las dos semanas después de la vacunación pero, en ele momento del estímulo, estos títulos habían menguado y los títulos individuales no se correlacionan estrechamente con una protección. El mismo antígeno es, un adyuvante de saponina y administrado por la misma vía inducía menores títulos según ELISA y demostraban ser inadecuado para proteger a cerdos con respecto de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación. El modelo de estímulo funcionaba muy bien puesto que la totalidad de los 10 cerdos testigos desarrollan signos clínicos de erisipela después de un estímulo (Cuadro 2). Tres cerdos cumplieron el criterio de temperatura elevada y otros cinco eran positivos para un cultivo de E. rhusiopathiae. Los restantes dos cerdos testigos no cumplieron ninguno de los anteriores criterios; sin embargo, estuvieron deprimidos durante varios días y tenían metastásicas en la piel, características de la enfermedad, y por lo tanto fueron sacrificados eutanásicamente. En contraste, en el grupo vacunado con la vacuna que contenía el adyuvante N° 1 , 15 de los 20 cerdos fueron protegidos por completo (Cuadro 3). Una vacuna experimental que contenía un antígeno de E. rhusiopathiae de la invención con el adyuvante N° 1 , cuando se administró a cochinillos en un régimen de 2 dosis a aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionó una significativa protección contra el desarrollo de erisipela clínica procedente de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación, véase el Cuadro 3, infra. Además, una vacuna experimental similar con un adyuvante de saponina, cuando se administra a cochinillos de acuerdo con el mismo régimen, no protege frente al desarrollo de erisipela clínica procedente de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación. Finalmente, una vacunación que contiene un antígeno de la invención, independientemente del adyuvante utilizado, inducía una sustancial respuesta serológica que presentaba un pico (valor máximo) a las dos semanas después de la segunda vacunación. Habiendo sido descrito la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos por vía de ilustración y no de limitación.

EJEMPLO 1 Cultivo de E. rhusiopathiae La cepa de E. rhusiopathiae, CN 3342, se cultiva en un medio que contiene Peptona Difco Proteose en una concentración de 2.75%, Extracto de Levadura Difco (0.55%), Tween 80 (0.2%), K2HP04 (0.217%) y KH2P04 (0.061%) en agua desionizada. El pH del medio se ajusta a 7.2 con NaOH 5 N. El medio se esteriliza con valor de agua a un mínimo de 122°C durante 30 a 90 minutos. Después de tratar en autoclave, se añade una solución de dextrosa al 50% estéril hasta una concentración final de 3% p/v (peso/volumen). Se preparan cultivos de siembra en trabajo retirando un criotubo de lote de siembra madre procedente de un almacenamiento congelado (a menos 70°C), descongelándolo rápidamente, y transfiriendo asépticamente su contenido a un matraz de medio. El matraz se incuba a 37°C durante 12 a 36 horas, con agitación, y se comprueba en cuanto a pureza mediante tinción Gram. Cuando se encontró que era puro, el cultivo se mezcló con glicerol estéril (al 10%), se distribuyó dentro de criotubos en cantidades de 1 ml, y se almacenó en estado congelado. Recipientes de siembra que contienen medio de producción se inoculan con 0.01 a 2% de material de siembra madre o en trabajo. Fermentadores de siembra, cuando se usan, que contienen de 10 a 100 litros del medio de producción, se inoculan con 1 a 5% de un cultivo procedente de un matraz de siembra. Un fermentador de producción que contiene de 200 a 10.000 litros del medio de producción, se inoculan con 0.5 a 5% de un cultivo procedente del fermentador de siembra. Los cultivos de producción se incuban a un punto de ajuste de 37 ± 2°C con agitación. Los tiempos de incubación varían desde 4 hasta 24 horas. Una solución estéril 10 N de hidróxido de sodio se añade al cultivo a lo largo del período de tiempo de incubación para mantener un pH de 7.2 ± 0.1. Durante la fase de crecimiento, se efectúan adiciones periódicas de dextrosa. Antes de cosechar, el cultivo se examina en microscopio en cuanto a pureza, morfología de las células y reacción a Gram. El crecimiento se vigila miendo la densidad óptica del cultivo a 625 nm. Los cultivos se cosechan cuando tienen una densidad óptica de 4.0 mayor a 625 nm.

EJEMPLO 2 Preparación de una vacuna de E. rhusiopathiae Una solución de formalina se añadió a culíivos hasfa una conceníración final de 0.5% (v/v) para desacíivar el culfivo. El culfivo se íransfirió a un depósito esíéril y se colocó en una incubadora a 37 ± 2°C durante un mínimo de 24 horas (y un máximo de 60 horas) con agifación consíanle. Los cultivos que no fueron trafados inmediaíameníe se almacenaron a 2 hasfa 8°C durante hasta 7 días. El culíivo desacíivado se clarificó por paso a fravés de una cenírífuga de circulación coníinua. La fracción fluida se retuvo para tratamiento adicional, y las bacterias se desecharon. En un experimento, se produjeron concentrados a 10x (10 veces) en un material filtrado de culíivos de E. rhusiopathiae desacíivados o bien con beía-propiolactona ("BPL"), a una concentración final de 0.1 % v/v, o formalina, a una concentración final de 0.2% v/v (a 37°C durante al menos 24 horas). Un análisis de inmunosorbenfe enlazado a enzima (ELISA de enzyme linked immunosorbent assay) específico para la profeína de 64 a 66 kDa enconírada en un material filfrado de cultivo de E. rhusiopathiae (Groschup y colaboradores, 1991 , Epidemiol. Infecí. 107:637-649 y Patente de los EE.UU. N° 5.625.038) se llevó a cabo para determinar el efecto de desacfivación y esf abil ización en la presencia de la proteína de 64 a 66 kDa. De modo coherente con hallazgos anteriores de que la desactivación con formalina del culíivo disminuía el valor según el análisis ELISA de la profeína, el concentrado con BPL tenía un valor según el análisis aproximadamente de 4 veces el del concentrado de formalina. Después de incubación a 37°C, durante 14 días, el concentrado con BPL había perdido aproximadamente un 80% de su valor, comparado con aproximadamente un 40% para el concentrado con formalina. En ambos casos, sin embargo, la previa adición de REHYDRAGEL®, al 30% v/v, como agente estabilizador, véase seguidamente, impidió la mayor parle de la pérdida y virtualmenle la tofalidad de ésía en el caso de la preparación con formalina. Un pequeño esíudio en cerdos indicó que la fracción fluida de culfivos desacíivados con formalina era más eficaz que la de culíivos desactivados con BPL para proteger a cerdos frente al esíímulo con E. rhusiopathiae virulenfas. Los fluidos se conceníraron, a 6x hasía 20x (usualmente alrededor de 10x) mediante filtración con fibras huecas (corte nominal de pesos moleculares x 10.000 kilodalíon) después de la centrifugación. Los fluidos se estabilizaron después de la operación de concentración mediante la adición de un gel de hidróxido de aluminio. Con el fin de estabilizar al ¡nmunógeno, un gel de hidróxido de aluminio se añadió lentamente con agitación a los fluidos concentrados hasta un valor final de 30% (v/v) (30 volúmenes de gel por 70 volúmenes de concentrado). Después de dilución a 20 veces del concenírado, el contenido del gel de Al en la vacuna era sólo de aproximadamente 1.5% no suficiente para causar reacciones negafivas en el siíio de la inyección. Una valoración para determinar la cantidad del gel de Al que se requería para adsorber la tofalidad de la proteína protectora en una fracción fluida de culíivo de E. rhusiopathiae concentrada en 10 veces, puso de manifiesto que más de un 95% había sido adsorbido por REHYDRAGEL® al 32% v/v (Reheis, Berkeley Heights, Nueva Jersey). Se añadió íimerosal (es decir MERTHIOLATE®) (Dimportex, España, importado por Fiavine Inc., Kloslers, Nueva Jersey) como conservanfe al produelo en una conceníración final de aproximadamente 0.01 % (p/v). La concentración de timerosal se manfuvo en aproximadamente 0.01 % p/v en la composición de anlígenos y en una composición de vacuna que contenía el antígeno de la invención. Se añadió EDTA hasta una concentración final de aproximadamente 0.07% (p/v) (Sigma, St. Louis, Missouri). El adyuvante uíilizado fue el adyuvante N° 1. Se prepararon 1.000 ml del Adyuvante no. 1 a partir de 200 ml de una solución lecitina en aceite, esterilizada en filtro (lecilina al 10% en el aceite mineral DRAKEOL®), Tween 80 (56 ml) y Span 80 (24 ml) fralados en autoclave y solución salina lamponada con fosfato (PBS de Dulbecco) (720 ml). La solución de lecifina en aceite y el Span 80 se combinaron y mezclaron deníro de un depósito estéril durante al menos 1 hora a la temperatura ambiente, hasta que estuviera complete la emulsificación. La solución salina y el Tween 80 se combinaron y mezclaron dentro de un depósito estéril durante al menos 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de aceite se emulsionó con la mezcla acuosa utilizando un emulsificador de Ross. El emulsionamiento se continuó por recirculación hasta que se hubiera añadido la totalidad del adyuvante a la solución salina. Luego la emulsión se hizo pasar dos veces a través de una prensa Gaulin a la temperaíura ambiente. El adyuvante se almacenó a 2 hasta 8°C. 5 I de la vacuna se prepararon añadiendo 1 I del adyuvante a 3 I de la fase acuosa. La fase acuosa se componía de suficiente caníidad de concenírado esfabilizado para dar un contenido final de aníígeno de 3.2 unidades de opacidad por dosis de 2 ml de vacuna, más una suficiente caníidad de solución salina para compleíar el volumen a 5 I. Las unidades de opacidad se definen como la densidad ópíica (E625) al cosechar mulíiplicada por el factor de concentración.

EJEMPLO 3 Vacunación contra E. rhusiopathiae y estimulación de cerdos El octavo subculfivo (MS+8) de E. rhusiopathiae, cepa CN3342, se uíilizó para producir las vacunas. Se utilizó un nivel de dosis de antígeno de E. rhusiopathiae clarificado y estabilizado (3.2 unidades de opacidad ["UO"]), fal como se calculó a partir de la densidad ópíica (DO) del cultivo en desactivación. Una UO era equivalente a 1 ml de fluido con una DO (determinada a 625 nm) de uno. Se utilizó como adyuvante el adyuvante no. 1 o saponina (al 0.05% p/v, obtenida a partir de Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio). Específicamente, un cultivo de E. rhusiopathiae, cepa CN3342 se hizo crecer hasta una DO de 5.28. El cultivo se desactivó durante 24 horas con formalina al 0.5%. Después de la desactivación, las bacterias se reíiraron por centrifugación.

Luego la fracción fluida se conceníró ufilizando una unidad de ulírafiltración con un corte nominal de pesos moleculares de 10.000 kDa. La fracción fluida se concenfró a aproximadamente 13.4 veces. El aníígeno se esfabilizó añadiendo REHYDRAGEL® (al 30% v/v) al material concenfrado. El concentrado adsorbido se almacenó a 4°C hasta que se realizase la formulación de la vacuna. Las vacunas se formularon con el adyuvante no. 1 o con saponina al 0.05% como adyuvante. El aníígeno esíabilizado se diluyó en solución salina (cloruro de sodio 150 mM y fosfaío 4 mM) hasía llegar a la concentración final. Se añadieron etilendiamina-fefraaceíaío (EDTA, 0.07%) y timerosal (0.01%) a las formulaciones finales de vacunas. Una solución salina tamponada con fosfaío se uíilizó como placebo. El cuadro 1 recopila los grupos en fraíamienío, los íratamientos con vacunas y los números de cochinillos vacunados y esíimulados.

CUADRO 1 Cochinillos vacunados y estimulados por cada grupo en tratamiento (con vacuna) Una esíimulación satisfactoria se evidenció en animales testigos por una alta temperafura corporal (40.9°C [105.6°F] o mayor en por lo menos dos días consecuíivos), por cultivo a la autopsia, y/o por los signos clínicos caracterísíicos de una infección con E. rhusiopathiae. Los signos clínicos considerados caracferísficos de la enfermedad incluían muerte súbiía, depresión, hiperemia del abdomen y los oídos, lesiones cuíáneas meíasíásicas, y rigidez o complicación en articulaciones. Los cerdos que tenían signos clínicos pero no cumplían el criterio de femperaíura se sacrificaron y la sangre, el bazo y el hígado se culíivaron en intentos de aislar las E. rhusiopathiae. El ensayo exacto de Fisher se ufilizó para determinar si había alguna diferencia en el porceníaje de animales protegidos con diferentes vacunas (P<0.05). Se conslruyeron confrasfes a priori para comparar cada grupo de dosis con íesíigos y para comparar cada grupo con el promedio de todos los otros grupos de dosis. Las relaciones entre el tipo de vacuna administrada y las respuestas serológicas de cada grupo de cochinillos se comprobaron para los 2 meses de edad, los 3 meses de edad, los 4 meses de edad, los 5 meses de edad, y extracciones de sangre previas a la estimulación utilizando una regresión logística. La relación existente enfre los íííulos inducidos por vacunas en el momento de una esíimulación con el esíado de enfermedad (proíegidos/no protegidos) se determinó ufilizando una regresión logísfica. El nivel de significancia de 5% se uíilizó para delarar la relación real. Veinte cerdas o lechonas embarazadas, que tenían bajos íítulos serológícos según ELISA (no. 800) para E. rhusiopathiae se obtuvieron de Ridell Farms, Albert City, IA y se alojaron en habiíaciones para aislamiento en el Departamento de Ciencias Veterinarias y Biológicas de la Universidad de Nebraska. Los tííulos serológicos según ELISA se determinaron en un ELISA de fijación direcla de aníígenos a células enteras de la siguiente manera. Véase la patente de los E.U.A. no. 4.918.163, que describe la preparación de placas revestidas con antígenos y un ELISA que usa dichas placas. En primer lugar, se hicieron crecer las E. rhusiopathiae tal como se describe en el ejemplo 1 y se cosecharon a partir de un culíivo en fase logaríímica. Se registró la densidad óptica a 640 nm y se convirtió en células/ml utilizando una íabla esfablecida mediante recuentos de bacterias a partir de soluciones con diferentes densidades ópticas. Las bacterias vivas fueron diluidas en PBS (PBS de Dulbecco, Sigma, St. Louis, Missouri) hasta una densidad de aproximadamente 1.1 x 109 células/ml. Las bacterias vivas diluidas en PBS fueron fijadas a placas para el ELISA. Con el fin de preparar las placas, se añadieron a cada pocilio 100 µl de glufaraldehído al 0.1% v/v (Sigma, Sf. Louis, Missouri), los pocilios fueron cubiertos y las placas se incubaron a 37°C duraníe 1 hora. El glutaraldehído en PBS se retiró de cada pocilio y los pocilios se secaron con paños absorbentes. Se añadieron a cada pocilio 100 µl de las bacterias vivas en PBS a una densidad de aproximadamente 1.1x109 células/ml. Las placas se cenírifugaron a 2,000 rpm duraníe 5 minuíos a 22°C. Se añadieron a cada pocilio luego 200 µl de poli(alcohol vinílico) (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) al 1% en PBS (PVA PBS) los pocilios se cubrieron y las placas se manfuvieron durante una noche a 4°C. El contenido de los pocilios de las placas se transfirió a una solución de bactericida y los pocilios se lavaron con PBS. Los pocilios se cubrieron con gasa y se secaron a la temperafura ambiente (durante alrededor de 1 hora). El proceso de ELISA se llevó a cabo de la siguiente manera usando las placas con antígeno fijado de células enteras de bacterias. En primer lugar, los sueros de cerdos se diluyeron, utilizando un testigo positivo, en PVA/PBS al 1%. Todos los sueros desconocidos se diluyeron a 1 :50 y el testigo positivo se utilizó a razón de 1 :200. 200 µl de cada muestra se añadieron a un pocilio en una columna de la fila A. Se añadieron a los pocilios remanentes 100 µl de PVA/PBS al 1 %. Se realizaron diluciones en serie a 2 veces con cada muestra en las filas B-H. Los pocilios se cubrieron e incubaron durante 1 hora a 37°C. Luego, los pocilios se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron a cada pocilio 100 µl de una dilución a 1 :2.000 de IgG de cabra anti-cerdo (H & L) de un conjugado con peroxidasa (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) preparada en PVA al 1 % en PBS. Los pocilios se cubrieron de nuevo y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Los pocilios se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron a cada pocilio 100 µl del susfraío ABTS (2,2'-azino-di-(ácido 3-eíil-benzoíiazolina-sulfónico) obtenido a partir de Kirkegaard and Perry, Gaiíhersburg, Maryland) y las placas se incubaron a la íemperaíura ambiente duraníe 10 minutos. Las placas se agitaron durante 10 segundos sobre un agiíador de microplacas antes de leer la absorbancia de cada pocilio a 405-490 nm ufilizando un lector de placas dejado como vacío. El íííulo en el punto final de cada suero desconocido fue la dilución del suero en la que la absorbancia era mayor que la absorbancia de una dilución a 1 :3.200 del tesíigo posiíivo. Se extrajo sangre de las cerdas a los 0 hasta 10 días antes de parir, con el fin de determinar sus títulos de anticuerpos de E. rhusiopathiae. Los cochinillos fueron distribuidos aleatoriamente basándose en los tííulos serológicos de las cerdas* y las fechas de los partos. Se extrajo sangre de cincuenta y ocho (58) cochinillos procedentes de estes cerdas o lechonas y éstos se vacunaron aproximadameníe a las 3 semanas de edad con una de las dos vacunas experiménteles de E. rhusiopathiae o con el placebo (grupos enumerados en el cuadro 1). Aproximadamente a las 4 semanas de edad, los cochinillos se destefaron. Aproximadameníe a las 6 semanas de edad se extrajo sangre de los cochinillos y éstos se volvieron a vacunar con la misma vacuna. Aproximadamente a los 2 meses, 3 meses, 4 meses y 5 meses de edad se extrajo sangre de iodos los cerdos. Aproximadameníe a los 5 1/2 meses de edad, lodos los cerdos sobrantes se retiraron del esíudio. Aproximadamente a los 6 meses de edad (a las 20 semanas después de la segunda vacunación) se extrajo sangre de los cerdos y 40 cerdos fueron esíimulados intramuscularmente con 2 ml de un cultivo virulento de E. rhusiopathiae (DL50 de 237 ratones, 1.74x109 unidades formadoras de colonias/ml) que habían crecido a partir de un culfivo proporcionado por el Nalional Veterinary Services Laboratory. Los animales se vigilaron en cuanto a signos de enfermedad clínica y por la temperaíura rectal durante 2 días antes de la estimulación, en el día de la estimulación y a los 7 días a continuación de la estimulación. Cualquier animal tesíigo que cumpliese el criterio de una temperaíura recial elevada (40.9°C) se sacó del esíudio y se írató con penicilina inyectable. Cualquier animal testigo que tuviera signos clínicos de enfermedad pero que no cumpliese el criterio de elevada lemperaíura recial se sacrificó euíanásicamente, se le hizo la autopsia y se cultivaron muestras de sangre entera, bazo e hígado en cuanto a E. rhusiopathiae. Cualquier animal testigo que muriese fue sometido a autopsia y muestras de bazo e hígado se cultivaron en cuanto a E. rhusiopathiae. Cualquier animal vacunado que cumpliese el criterio de elevada temperatura retal (a 40.9°C) y/o signos clínicos de enfermedad se sacó del estudio y se trató con penicilina inyectable. Cualquier animal vacunado que muriese después de la estimulación fue sometido a la autopsia y las mueslras de bazo e hígado se cultivaron en cuanto a E. rhusiopathiae. Los títulos de anticuerpos para E. rhusiopathiae se determinaron por el ELISA antes descrito y se hizo una correlación de los títulos de anticuerpos con la protección clínica. Se determinaron los títulos según ELISA en los sueros a partir de la única muestra de sangre obtenida de las cerdas y de todas las muestras de sangre procedentes de los 7 periodos de extracción de muestras a partir de los cochinillos. Se realizaron culfivos bacterianos aerobios (durante 48 horas, a 37°C, agar con sangre) en muesíras de sangre y/o en bazos e hígados obtenidos de cerdos que habían muerto o que fueron sacrificados por inyección letal.

Resultados: Los resultados de una esfimulación con E. rhusiopathiae de cerdos íesíigos, se recopilan en el cuadro 2. Los 10 cerdos eran positivos en cuanto a erisipela.

CUADRO 2 Cerdos testigos (T01) estimulados con E. rhusiopathiae * 2 días - Elevación en la temperatura rectal por encima de 40.9°C en 2 días consecutivos. ** Signos clínicos - Los signos clínicos incluían depresión y/o lesiones metastásicas de la piel.

Los resultados de la estimulación por E. rhusiopathiae a los que se administró la vacuna con el Adyuvante N° 1 (T02) se recopilan en el cuadro 3.15 de los 20 cerdos (75%) estaban protegidos.

CUADRO 3 Resultados de una estimulación por E. rhusipathiae de cerdos a los gue se administró vacuna con el adyuvante N° 1 (TO2) * 2 días.- Elevación en la temperatura por encima de 40.3°C en 2 días consecutivos.

** Signos clínicos.- Los signos clínicos incluían depresión y/o lesiones metastáticas de la piel. Los resultados de la estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los que se había administrado la vacuna con adyuvante de saponina (T03) se recopilan en el cuadro 4. Solamente fue protegido uno de los cerdos.

CUADRO 4 Resultados de una estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los gue se administró vacuna con adyuvante de saponina (TO3) * 2 días.- Elevación en la temperatura rectal por encima de 40.3°C en 2 días conseculivos. ** Signos clínicos.- Los signos clínicos incluían depresión y/o tensiones metastásicas de la piel.

Los tííulos medios geométricos ("GMT"s) según ELISA de grupos e cochinillos se enumeran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Títulos ELISA medios geométricos de todos los grupos en tratamiento * 01 - placebo 02 - 3.2 unidades de opacidad de antígeno en Adyuvante N° 1 03 - 3.2 unidades de opacidad de antígeno en adyuvante con saponina. Los cochinillos tenían títulos muy bajos de anticuerpos, específicos para E. rhusiopathiae en el momento de su primera vacunación. Estos tííulos flucíuaban eníre menos de 50 y 200. En cochinillos testigos, los GMT subieron ligeramente en el curso de estudio, indicando que el ELISA era menos específico en cerdos más viejos. Las vacunas con el Adyuvante N° 1 o con saponina como adyuvante indujeron una respuesfa serológica significativa estadísticamente (P = 0.0001) que tenía un máximo (pico) a las dos semanas después de la segunda vacunación (aproximadamente a los 2 meses de edad). Los íítulos en ambos grupos disminuyeron constantemente en el curso de tiempo (hasta aproximadamente los 5 meses de edad) siendo los GMT de cochinillos que recibieron aníígeno en el Adyuvante N° 1 observablemente mayores que los GMT de los cochinillos que recibieron antígeno en el adyuvante de saponina en todos los momentos. En el momento de la estimulación, los GMT de los cerdos que recibieron el anfígeno en el Adyuvante N° 1 eran ligeramente más de 2 veces mayores que los GMT de los testigos mientras que los GMT de los cerdos que recibieron antígeno en un adyuvante de saponina eran ligeramente menos de 2 veces mayores que los testigos. La protección con respecto de una enfermedad clínica de la estimulación no se correlaciona con el título según ELISA individual (P > 0.05). No obstante, una observación interesante fue un título de pico observado a las dos semanas después de la segunda vacunación en cerdos a los que se administró antígeno en el Adyuvante N ° 1. De los 20 cochinillos vacunados con antígeno en el Adyuvante N° 1 , ocho tenían unos tílulos de pico mayores que o iguales a 2.800 (8 de 8 estaban protegidos de la estimulación, ocho tenían unos títulos de pico de 6.400 (6 de 8 estaban protegidos de la esíimulación), y 4 tenían unos íítulos de pico de 3.200 (1 de 4 estaban profegidos de la esíimulación) sugiriendo que un íííulo que fuese de 6.400 o mayor era un indicador de una protección prolongada. En resumen, iodos los 10 testigos sin vacunar resultaron infectados.

En el grupo de cerdos a los que se administró la vacuna con el Adyuvante N° 1 , fueron protegidos 15 de 20. En el grupo de cerdos a los que se administró la vacuna con saponina como adyuvante, se protegió sólo uno entre 10.

EJEMPLO 4 Estimulación de antígenos con el gel de Al Se preparó una vacuna de acuerdo con los ejemplos 1-3, lo que incluía traíar el antígeno con el gel de Al tal como se ha descrito. La vacuna se ensayó en cuanto a eficacia en cerdos. Los cerdos fueron vacunados con dos dosis de 2 ml adminislradas por vía iníramuscular (IM) una dosis a aproximadamente las 3 semanas (desde el destete) y la segunda dosis 3 semanas más tarde. Los tesíigos recibieron solución salina famponada con fosfato como un placebo. La inmunidad fue estimulada por la inyección IM de E. rhusiopathiae virulenfas a una edad de aproximadameníe 9 semanas. Como se muesfra en el cuadro 6, la protección debida a la vacunación era de 100% a las 9 semanas. Esta vacuna ya tenía 12 meses de antigüedad en el momento en que los cerdos fueron vacunados. El resultado confirma que el antígeno protector había sido estabilizado satisfactoriamente.

CUADRO 6 Protección de cerdos contra erisipela Nota: El vigésimo cerdo fue excluido. Un animal muy díscolo, que forcejeaba tan violeníameníe cuando se le manipulaba que no se pudo determinar su íemperatura en reposo. Después de la esfimulación, este cerdo permaneció completamente sano. La invención no ha de ser limitada en su alcance por las realizaciones dadas como ejemplos que se pretenden como ilustraciones de aspectos singulares de la invención, y cualesquiera aníígenos y composiciones de vacunas que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Desde luego, diversas modificaciones de la invención, además de las que se han descrito aquí, resultarán evidentes para los expertos en la tecnología a partir de la precedente descripción. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anejas. Todas las publicaciones aquí citadas se incorporan por referencia en su totalidad.

Claims (11)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de aníígeno que comprende una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae y un agente estabilizador.

2.- La composición de antígeno de la reivindicación 1 , en la que dicho agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio o un alumbre.

3.- La composición de aníígeno de la reivindicación 1 , en la que dicho culfivo E. rhusiopathiae está desactivado.

4.- La composición de antígeno de la reivindicación 3, en la que dicho cultivo E. rhusiopathiae está desactivado con formalina o con bela-propiolactona.

5.- La composición de anlígeno de la reivindicación 1 , en la que dicha fracción está concentrada en aproximadamente 3 veces hasta aproximadamente 30 veces.

6.- Una composición de vacuna que comprende una composición de antígeno de la reivindicación 1 y una composición de adyuvante.

7.- Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 6, en que la composición de adyuvante comprende de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 12.5% v/v de una lecitina, de aproximadameníe 1% hasla aproximadamente 23 v/v de un aceite y de aproximadamente 1.5% a aproximadamente 6% v/v de un agente tensioacíivo anfífilo en dicha composición de vacuna.

8.- Un método de preparar una composición de antígeno que comprende añadir un agente estabilizador a una fracción fluida procedente de un cultivo E. rhusiopathiae.

9.- El uso de la composición de antígeno de la reivindicación 1 , para la fabricación de una vacuna para evitar o controlar la infección de Erysipelothrix rhusiopathiae en un mamífero.

10.- El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el animal es un cerdo.

11.- El uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la composición comprende un adyuvante.