BRPI0509606B1 - emulsões de óleo-em-água microfluidizadas e composições para vacinas - Google Patents

Abstract

"emulsões de óleo-em-água microfluidizadas e composições para vacinas". a presente invenção refere-se emulsões de óleo-em-água em submícron úteis como um adjuvante para vacina para aumentar a imunogenicidade de antígenos. a presente invenção fornece ainda composições para vacina contendo um antígeno combinado com tais emulsões intrínseca ou extrinsecamente. são também fornecidos pela presente invenção processos de preparação das emulsões e vacinas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para EMULSÕES DE ÓLEO-EM-ÁGUA MICROFLUIDIZADAS E COMPOSIÇÕES PARA VACINAS.

Campo da Invenção

Esta invenção se refere de forma geral ao campo de vacinas e particularmente, às formulações adjuvantes para aumentar a resposta imunológica em animais veterinários. Em particular, a invenção se refere ao uso de uma emulsão de óleo-em-água em submícron como um adjuvante para vacina para aumentar a imunogenicidade dos antígenos. As formulações para emulsão de óleo-em-água em submícron, as composições para vacina contendo um antigeno incorporadas em tais emulsões, assim como os métodos de preparação das emulsões e das vacinas, são fornecidos pela presente invenção. A presente invenção fornece ainda composições contendo complexos formados por um glicosídeo de saponina e um esterol adequados para uso em vacinas.

Antecedentes da Invenção

As infecções bacterianas, virais, parasiticas e por micoplasma são bem espalhadas nos animais veterinários tal como gado, suíno e animal de companhia. As doenças causadas por estes agentes infecciosos são frequentemente resistentes à terapia farmacêutica antimicrobiana, não deixando meios eficientes de tratamento. Consequentemente, uma abordagem de vacina está sendo utilizada de forma crescente para controlar as doenças infecciosas nos animais veterinários. Pode-se tornar um agente patogênico infeccioso inteiro adequado para uso em uma formulação para vacina após a inativação química ou a manipulação genética apropriada. Alternativamente, uma subunidade de proteína do agente patogênico pode ser expressa em um sistema de expressão recombinante e purificada para uso em uma formulação para vacina.

Adjuvante geralmente se refere a qualquer material que aumenta a resposta imunológica humoral e/ou celular a um antigeno. As vacinas tradicionais são compostas da preparação bruta de microorganismos patogênicos mortos e as impurezas associadas com as culturas de microorganismos

• · · · · ♦ ·· · ·· ···· ♦····· * · ·· • · ··· ······«· ······ ······· ··*····· patogênicos poderíam atuar como adjuvantes para aumentar a resposta imunológica. Entretanto, quando preparações homogêneas de microorganismos patológicos ou subunidade de proteínas purificadas são utilizadas como antígenos para vacinação, a imunidade ativada por tais antigenos é fraca e a adição de certos materiais exógenos como adjuvante se torna necessária. Ainda, é oneroso produzir as vacinas sintéticas e de subunidades. Portanto, com o auxílio do adjuvante, uma dose menor de antígeno pode ser necessária para estimular a resposta imunológica, diminuindo assim o custo da produção de vacinas.

É sabido que os adjuvantes atuam em um número de formas diferentes para aumentar a resposta imunológica. Muitos adjuvantes modificam a rede de citocinas associada com a resposta imunológica. Estes adjuvantes imunomoduladores podem exercer seu efeito mesmo quando não estão junto com os antígenos. Em geral, os adjuvantes imunomoduladores causam uma regulação para mais geral de certas citocinas e uma regulação para menos concomitante de outras que levam a uma resposta de Th1 celular e/ou de Th2 humoral.

Alguns adjuvantes possuem a capacidade de preservar a integridade conformacional de um antígeno de forma que os antígenos podem ser eficientemente apresentados a células efetoras imunológicas apropriadas. Como um resultado desta preservação da conformação de antígenos pela formulação de adjuvante, a vacina teria uma maior vida de prateleira tal como a mostrada para os complexos de estímulo imunológico (ISCOMs). Ozel M. e outros; Quarternary Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J.of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989).

Alguns adjuvantes possuem a propriedade de retenção do antígeno na forma de um depósito no local da injeção. Como um resultado deste efeito de depósito o antígeno não é rapidamente perdido através da eliminação pelo fígado. Sais de alumínio e as emulsões de água-em-óleo atuam através deste efeito de depósito ao longo de uma duração mais curta. Por exemplo, pode ser obtido um depósito em longo prazo através da utilização do adjuvante completo de Freund (FCA) que é uma emulsão de água-em3 ♦· · ♦ · ·· ···*·· · · ·· • · · · ··· ·····«·· • · ·♦·♦·· ····«·· • 4 ······· · óleo. Ο FCA permanece tipicamente no local da injeção até a biodegradação permitir a remoção do antígeno pelas células apresentadoras de antígenos.

Com base em sua natureza física, os adjuvantes podem ser agrupados sob duas categorias muito amplas, a saber, adjuvantes particula5 dos e adjuvantes não particulados. Os adjuvantes particulados existem na forma de micropartículas. O agente imunogênico é capaz de incorporar ou de se associar às micropartículas. Os sais de alumínio, as emulsões de água-em-óleo, as emulsões de óleo-em-água, os complexos de estímulo imunológico, os lipossomos e as nano- e micropartículas são exemplos de adju10 vantes particulados. Os adjuvantes não particulados são geralmente imunomoduladores e são geralmente utilizados em associação com adjuvantes particulados. O dipeptídeo de muramila (um componente ativo com o adjuvante de uma peptidoglicana extraída de Mycobacteria), co-polímeros em blocos não iônicos, Saponinas (uma mistura complexa de triterpenóides ex15 traída do casca da árvore Quillaja saponaria), o Lipídeo A (um dissacarídeo de glicosamina com dois grupos fosfonatos e cinco ou seis cadeias de ácidos graxos geralmente com C12 até C16 de comprimento), as citocinas, os polímeros de carboidrato, os polissacarídeos derivatizados e as toxinas bacterianas tais como a toxina de cólera e a toxina lábil de E. coli (LT) são e20 xemplos de adjuvantes não particulados.

Alguns dos adjuvantes mais bem-conhecidos constituem uma combinação de imunomoduladores não particulados e materiais particulados que confeririam o efeito de depósito à formulação de adjuvantes. Por exemplo, o FCA combina as propriedades imunomoduladoras de componentes de 25 Mycobacterium tuberculosis junto com o efeito de depósito em curto prazo das emulsões de óleo.

As emulsões de óleo têm sido utilizadas como um adjuvante para vacina durante um período longo. Le Moignic e Pinoy descobriram em 1916 que uma suspensão de Salmonella typhimurium morta em óleo mineral 30 aumentava a resposta imunológica. Subsequentemente, em 1925, Ramon descreveu o óleo de amido como uma das substâncias que aumentam a resposta antitóxica para o toxóide da difteria. Entretanto, as emulsões de ·« · « ··· · · ·· · ·· • « · ··· » · · « · * · · ·· · · · ·· «»··«· · · ·· • * * ♦ ··· ··«····· • · ······ ····«··

Λ	• ··♦··♦·♦· óleo não se tornaram populares até 1937 quando Freund apareceu com sua formulação adjuvante conhecida agora como Adjuvante Completo de Freund (FCA). 0 FCA é uma emulsão de água-em-óleo composta de óleo mineral (parafina) misturado com Mycobateria morta e Arlacel A. Arlacel A é princi-
5	palmente monooleato de manida e é utilizado como um agente emulsificante. Embora o FCA seja excelente na indução de uma resposta de anticorpos, causa dor grava, formação de abscesso, febre e inflamação granulomatosa. Para evitar estas reações colaterais indesejáveis, foi desenvolvido o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). O IFA é similar ao FCA em sua composi-
10	ção exceto pela ausência de componentes micobacterianos. 0 IFA atua através da formulação de depósito no local da injeção e da liberação lenta do antígeno com estímulo de células produtoras de anticorpos.
	Uma outra abordagem para melhorar o FCA se baseava na noção de que a substituição do óleo mineral por um óleo biocompatível ajuda-
15	ria a eliminar as reações associadas com o FCA no local da injeção. Acreditava-se que a emulsão devia ser de óleo-em-água ao invés de água-emóleo, porque a última produz um depósito de longa duração no local da injeção. Hilleman e outros descreveram um adjuvante com base em óleo Adjuvante 65, que consiste em 86% de óleo de amendoim, 10% de Arlacel A
20	como emulsificante e 4% de monoestearato de alumínio com estabilizante. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman e Beale, 1983, em New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. e Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. Em humanos, o Adjuvante 65 era seguro e potente, mas exibia menos característica adjuvante que o IFA. Todavia, o uso do Adjuvan-
25	te 65 foi descontinuado por causa da capacidade de reação para o ser humano com certos lotes de vacina e da redução na característica adjuvante quando um emulsificante purificado ou sintético era utilizado no lugar de Arlacel A. As Patentes U.S. N25 5.718.904 e 5.690.942 ensinam que o óleo mineral na emulsão de óleo-em-água pode ser substituído por óleo que pode
30	ser metabolizado com a finalidade de aumentar o perfil de segurança. Além da característica adjuvante e da segurança, a aparência física de uma emulsão também é uma consideração comercial importante. A

• · »*·*· * · · · ·· • · ♦ · · ····· *·· • · ··«· «····* · β ·« ♦ ♦ · ··· »······· • ·»·♦·· ······* * · · «·· · · · aparência física depende da estabilidade da emulsão. A formação de creme, a sedimentação e a coalescência são indicadores da instabilidade da emulsão. A formação de creme ocorre quando as fases oleosa e aquosa da emulsão possuem gravidade específica diferente. A formação de creme tam5 bém ocorre quando o tamanho de gotícula inicial da emulsão é grande e as gotículas da emulsão não estão tendo qualquer movimento Browniano. Quando o tamanho da gotícula é grande, há uma tendência para a ruptura interfacial e as gotículas coalescem em partículas grandes. A estabilidade da emulsão é determinada por um número de fatores tais como a natureza e a quantidade de emulsificante utilizado, o tamanho da gotícula na emulsão e a diferença na densidade entre as fases oleosa e aquosa.

Os emulsificantes promovem a estabilização da gotícula dispersa através da redução da energia livre interfacial e da criação de barreiras físicas ou eletroestáticas à coalescência das gotículas. Os detergentes não 15 iônicos assim como iônicos foram utilizados como emulsificantes. Os emulsificantes não iônicos orientam a interface e produzem estruturas relativamente volumosas, que levam ao impedimento estérico das gotículas dispersas. Os emulsificantes aniônicos ou catiônicos induzem a formação de uma camada dupla elétrica através da atração de ions indicadores; as forças repul20 sivas das camadas duplas fazem com que as gotículas repilam uma das outras quando se aproximam.

Além do uso dos emulsificantes, a estabilidade da emulsão também pode ser conseguida através da redução do tamanho das gotículas da emulsão por meios mecânicos. Tipicamente os misturadores com propulsão, os rotores de turbina, os moinhos de colóides, os homogeneizadores e ultrasom foram utilizados para produzir emulsões. A microfluidização é uma outra maneira de aumentar a homogeneidade do tamanho das gotículas na emulsão. A microfluidização pode produzir uma emulsão fisicamente estável elegante com tamanho de partícula coerente na faixa de submícrons. Além de aumentar a estabilidade da emulsão, o processo de microfluidização permite a filtração terminal que é uma maneira preferida de garantir a esterilidade do produto final. Além disso, as partículas de óleo em submícron podem passar • ·· · · * ·· · · · • ·· ······ · · ·· ·· · · · ········ »·?«·· ······· ·······« dos locais de injeção para a linfa e então para os nodos linfáticos da cadeia de drenagem, para o sangue e para o baço. Isto reduz a probabilidade de estabelecer um depósito oleoso no local da injeção que pode produzir inflamação local e reação significativa no local da injeção.

Os microfluidizadores estão agora disponíveis comercialmente.

A formação da emulsão ocorre em um microfluidizador quando duas correntes fluidizadas interagem em altas velocidades dentro de uma câmara de interação. O microfluidizador é controlado por ar ou nitrogênio e pode operar a pressões internas no excesso de 137,89 MPa (20.000 psi). A Patente U.S.

N² 4.908.154 ensina o uso do microfluidizador para a obtenção de emulsões essencialmente livres de quaisquer agentes emulsificantes.

Um número de formulações adjuvantes de óleo-em-água em submícron foi descrito na literatura. A Patente U.S. N² 5.376.369 ensina uma formulação adjuvante para emulsão de óleo-em-água em submícron conhe15 cida como Formulação Adjuvante Syntax (SAF). SAF contém esqualeno ou esqualano como o componente de óleo, uma quantidade formadora de emulsão de polímero em bloco Pluronic L121 (polióxi-propileno-polioxietileno) e uma quantidade imunopotenciadora de muramildipeptídeo. O esqualeno é um precursor de hidrocarboneto linear do colesterol encontrado em muitos tecidos, notavelmente nos fígados de tubarões e outros peixes. O esqualano é preparado através da hidrogenação do esqualeno e é completamente saturado. Tanto o esqualeno quanto o esqualano podem ser metabolizados e possuem um bom registro de estudos toxicológicos. As emulsões de esqualeno ou de esqualano foram utilizadas em vacinas para câncer humano com efeitos colaterais suaves e uma eficácia desejável. Ver, por exemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93.

A Patente U.S. N² 6.299.884 e a Publicação de Patente Internacional WO 90/14837 ensinam que os co-polímeros em blocos de polióxi30 propileno-polioxietileno não são essenciais para a formação de emulsão de óleo-em-água em submícron. Além disso, estas referências ensinam o uso de óleo que pode ser metabolizado não tóxico e excluem expressamente o /6 uso de óleo mineral e óleos destilados de petróleo tóxicos em suas formulações para emulsão.

A Patente U.S. N^s 5.961.970 ensina ainda que outra emulsão de óleo-em-água em submícron pode ser utilizada como um adjuvante para va5 cina. Na emulsão descrita nesta patente, o componente hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste em um óleo triglicerídeo de cadeia média, um óleo vegetal e uma mistura dos mesmos. O tensoativo incluído nesta emulsão pode ser um tensoativo compatível biologicamente natural tal como fosfolipídio (por exemplo, lecitina) ou um tensoativo não natural farmaceutica10 mente aceitável tal como TWEEN-80. Esta patente também ensina a incorporação do antígeno na emulsão no momento em que a emulsão é formada, em contraste à mistura do antígeno com a emulsão após a emulsão ter sido independentemente e extrinsicamente formada.

A Patente U.S. N^s 5.084.269 ensina que uma formulação adju15 vante contendo lecitina em combinação com óleo mineral causa um decréscimo na irritação dentro do animal hospedeiro e simultaneamente induz maior imunidade sistêmica. A formulação adjuvante resultante da Patente U.S. N° 5.084.269 é utilizada comercialmente nas vacinas veterinárias sob o nome comercial AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® é constituída de 20 micelas - gotículas de óleo circundadas por lecitina. Estas micelas permitem que mais antígenos de células inteiras se ligem do que os adjuvantes com base em óleo tradicionais. Além disso, as formulações para vacina baseadas em AMPHIGEN® contêm um baixo conteúdo de óleo de 2,5 até 5% de óleo mineral, comparado com outras formulações para vacina contendo adjuvan25 tes oleosos, que tipicamente contêm de 10% até 20% de óleo. Seu baixo conteúdo de óleo toma esta formulação para vacina baseada em adjuvante menos irritante aos tecidos no local da injeção, resultando em menores lesões e menos ataque à pele. Em adição, o revestimento de lecitina ao redor das gotículas de óleo reduz adicionalmente as reações no local da injeção 30 resultando em uma vacina que é tanto segura quanto eficaz.

A formulação AMPHIGEN® é utilizada como um adjuvante em um número de vacinas veterinárias e há uma necessidade de manter a apa8

• · rência física do produto da vacina durante períodos de armazenamento curtos e longos assim como no momento da reconstituição. Em adição, um antígeno liofilizado é misturado com o adjuvante para formulação pré-produzido logo antes da injeção. Esta prática nem sempre garante que haja uma distri5 buição uniforme do antigeno dentro da emulsão de óleo-em-água e a aparência da emulsão pode não ser desejável. Além disso, após o repouso, a emulsão homogeneizada pode exibir separação de fases. Portanto, existe uma necessidade de um adjuvante para formulação estável que não exibe separação de fases após longo tempo de prateleira. Uma maneira de preve10 nir a separação de fases é reduzir o tamanho de gotículas e aumentar a homogeneidade das partículas da emulsão. Embora o processo de microfluidização de formulações para emulsão com base em óleo que podem ser metabolizadas tenha sido documentado, a microfluidização de emulsões de óleo-em-água tal como a formulação AMPHIGEN® ainda não foi realizada.

Na presente invenção, a microfluidização foi utilizada para a obtenção do tamanho de gotículas de óleo mineral circundadas por lecitina no tamanho em submícron. Inesperadamente, foi descoberto pelos presentes inventores que a microfluidização das formulações para vacina auxiliada por adjuvantes com uma emulsão de óleo-em-água compreendida de uma mis20 tura de lecitina e óleo não somente melhora a aparência física das formulações, mas também aumenta os efeitos de imunização das formulações. As formulações microfluidizadas também são caracterizadas por um melhor perfil de segurança.

Sumário da Invenção

Foi descoberto de forma inesperada pelos presentes inventores que a atividade do adjuvante e o perfil de segurança das emulsões de óleoem-água com base em óleo que não pode ser metabolizado podem ser melhorados através da microfluidização. Os antígenos incorporados nas emulsões microfluidizadas são estáveis mesmo quando os antígenos são intrinsi30 camente incorporados nas emulsões antes da microfluidização.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece formulações para emulsão de óleo-em-água em submícron úteis

como um adjuvante para vacina. As emulsões de óleo-em-água em submícron da presente invenção são compostas de um óleo que não pode ser metabolizado, pelo menos um tensoativo e um componente aquoso, em que o óleo é disperso no componente aquoso com um tamanho médio de gotículas 5 de óleo na faixa de submícron. Um óleo que não pode ser metabolizado preferido é o óleo mineral leve. Os tensoativos preferidos incluem lecitina, TWEEN®-80 e SPAN®-80.

Uma emulsão de óleo-em-água preferida fornecida pela presente invenção é composta de uma formulação AMPHIGEN®.

As emulsões de óleo-em-água da presente invenção podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras. As moléculas imunoestimuladoras preferidas incluem, por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamônio 15 (DDA).

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos de preparação de uma emulsão de óleo-em-água em submícron. De acordo com a presente invenção, os vários componentes da emulsão, incluindo o óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer 20 outro componente apropriado para uso na emulsão, são misturados juntos. A mistura é submetida a um processo de emulsificação primário para formar uma emulsão de óleo-em-água, que é então passada através de um microfluidizador para a obtenção de uma emulsão de óleo-em-água com gotículas menores que 1 mícron de diâmetro, preferencialmente com um tamanho 25 médio de gotículas menor que 0,5 mícron.

Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece composições para vacina que contêm um antígeno e uma emulsão de óleoem-água em submícron descrita anteriormente aqui. O antígeno é incorporado na emulsão extrinsicamente ou intrinsicamente, preferencialmente, in30 trinsicamente.

O antígeno que pode ser incluído nas composições para vacina da presente invenção pode ser um antígeno bacteriano, fúngico ou viral ou <51

uma combinação dos mesmos. O antígeno pode tormar a forma de uma preparação celular ou viral parcial ou total inativada ou a forma de moléculas antigênicas obtidas através da purificação de proteínas convencional, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece métodos de preparação de composições para vacina contendo um antígeno ou antígenos combinados com uma emulsão de óleo-em-água em submícron.

Na preparação das composições para vacina da presente invenção, o(s) antígeno(s) pode(m) ser combinado(s) intrinsicamente (por exem10 pio, antes da microfluidização) ou extrinsicamente (por exemplo, após a microfluidização) com os componentes da emulsão de óleo-em-água. Preferencialmente, o antígeno é combinado com os componentes da emulsão de óleo-em-água intrinsicamente.

Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece composições para vacina que contêm um antígeno microencapsulado e uma emulsão de óleo-em-água em submícron descrita anteriormente aqui, em que o antígeno microencapsulado é combinado com a emulsão extrinsicamente.

Foi descoberto de forma surpreendente que uma saponina e um 20 esterol, quando combinados em solução, se associam um com o outro para formar complexos na forma de micelas em hélice. De acordo com a presente invenção, estes complexos de micelas em hélice possuem atividades imunoestimuladoras e são especialmente úteis como adjuvantes nas composições para vacina.

Consequentemente, a presente invenção fornece composições para vacina contendo uma saponina e um esterol, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas em hélice. A presente invenção fornece ainda composições contendo uma saponina, um esterol e um antígeno, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de 30 micelas em hélice e em que o antígeno é misturado, mas não incorporado dentro das micelas em hélice.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 representa o processo para a preparação em batelada de composições não microfluidizadas para vacina. Neste processo os vários componentes de vacina são adicionados no recipiente de adição à esquerda 5 e, em última análise, bombeados no recipiente de mistura onde os componentes são misturados através de um meio mecânico simples.

A figura 2 representa o processo para preparação de composições microfluidizadas para vacina contendo antígeno incorporado intrinsicamente. Os vários componentes de vacina são adicionados no recipiente de 10 adição e transferidos para a unidade de mescla pré-emulsão para mistura através de um meio mecânico simples. Subsequentemente, a emulsão é passada através de um microfluidizador e é coletada na câmara pósmicrofluidização.

A figura 3 representa a distribuição de tamanho de gotículas da 15 vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada, da vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada e da preparação de vacina misturada na bancada.

A figura 4 mostra a ausência de separação de fases na preparação de vacina microfluidizada.

A figura 5 representa uma comparação da estabilidade dos antígenos intrinsicamente incorporados na preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) e três preparações de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada de controle (A904369, A904370 e A904371). Todas as quatro preparações de vacina 25 foram armazenadas a 4°C durante dois anos. Em pontos diferentes durante o armazenamento (0, 6, 12 ou 24 meses), todas as quatro formulações foram utilizadas para vacinar as vacas com três meses de idade. A vacinação foi feita nos Dias 0 e 21 com uma dose de vacina de 2 mL e o soro foi coletado duas semanas após a segunda vacinação. O título de anticorpo neutra30 lizante para o vírus BVD do Tipo II foi determinado em cada uma das amostras de soro. Os dados são mostrados na forma da média geométrica para 5 animais.

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' A figura 6 mostra a temperatura retal média em mínimos quadrados do gado antes e depois da administração de vacinas microfluidizadas e não microfluidizadas. T01: Grupo com placebo - dose única; T02: Grupo com placebo - Dose dupla; T03: Formulação não microfluidizada - Dose úni5 ca; T04: Formulação não microfluidizada - Dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - Dose única; T06: Formulação microfluidizada - Dose dupla.

A figura 7 representa os volumes médios de reação no local da injeção em mínimos quadrados observados no gado após a administração de formulações de vacina não microfluidizadas e microfluidizadas. T03: For10 mulação não microfluidizada - Dose única; T04: Formulação não microfluidizada - Dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - Dose única; T06: Formulação microfluidizada - Dose dupla.

A figura 8 representa a média geométrica dos títulos de IgG para o antígeno PauA recombinante de Streptococcus uberis após a vacinação 15 com as várias formulações de vacina contendo tanto o antígeno PauA recombinante quanto o antígeno de célula inteira de E. coli.

A figura 9 representa a média geométrica dos títulos de IgG para o antígeno de célula total de E. coli de Streptococcus uberis após a vacinação com as várias formulações de vacina contendo tanto o antígeno PauA 20 recombinante quanto o antígeno de célula total de E. coli.

As figuras 10A e 10B representam a distribuição dos tamanhos de partículas de uma formulação Amphigen Microfluidizada na produção inicial (figura 10A) e 22 meses após a produção (figura 10B).

A figura 11 é uma fotografia de microscopia eletrônica que mos25 tra as micelas em hélice formadas com com micelas longas de Quil A e cristais de colesterol.

A figura 12 é uma fotografia de microscopia eletrônica que mostra complexos imunogênicos em hélice formados por Quil A e colesterol na superfície do antígeno de BVD do Tipo I.

Descrição Detalhada da Invenção

Foi descoberto de forma inesperada pelos presentes inventores que a microfluidização das formulações de vacina auxiliadas por adjuvantes

com uma emulsão de óleo-em-água compreendida de uma mistura de lecitina e óleo mineral não somente melhora a aparência física das formulações de vacina, mas também aumenta os efeitos de imunização das formulações de vacina. As formulações microfluidizadas de vacina também são caracteri5 zadas por um maior perfil de segurança.

Com base nestas descobertas, a presente invenção fornece emulsões de óleo-em-água em submícron úteis como um adjuvante em composições para vacina. Também são fornecidos os métodos de produção destas emulsões de óleo-em-água em submícron através da utilização de um 10 microfluidizador. Além disso, a presente invenção fornece composições para vacina em submícron em que um antígeno é combinado com uma emulsão de óleo-em-água em submícron. São também fornecidos os métodos para a produção de tais composições para vacina. A presente invenção fornece ainda composições para vacina contendo antígenos microencapsulados 15 combinados com uma emulsão de óleo-em-água em submícron e métodos para a produção de tais vacinas.

Para esclarecimento da divulgação e não com a finalidade de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas subseções a seguir que descrevem ou ilustram certas características, modalidades ou aplicações da in20 venção.

Emulsões de Óleo-em-Áqua em Submícron

Em uma modalidade, a presente invenção fornece formulações para emulsão de óleo-em-água em submícron úteis como um adjuvante para vacina. As emulsões de óleo-em-água em submícron da presente invenção 25 aumentam a imunogenicidade de antígenos nas composições para vacina, são seguras para administração a animais e estáveis durante o armazenamento.

As emulsões de óleo-em-água em submícron da presente invenção são compostas de um óleo que não pode ser metabolizado, pelo menos 30 um tensoativo e um componente aquoso, em que o óleo é disperso no componente aquoso com um tamanho médio de gotículas de óleo na faixa de submícron.

Por submicron entende-se que as goticulas têm um tamanho menor que 1 pm (mícron) e a média ou o tamanho médio de goticulas de óleo é menor que 1 pm. Preferencialmente, o tamanho médio de goticulas da emulsão é menor que 0,8 pm; mais preferencialmente, menor que 0,5 pm; e ainda mais preferencialmente, menor que 0,4 pm ou aproximadamente 0,1-0,3 pm.

O tamanho de goticulas é definido como o tamanho de partícula com Diâmetro Médio do Volume (VMD) dentro de um volume de distribuição de tamanhos de partículas. O VMD é calculado através da multiplicação de cada diâmetro de partícula pelo volume de todas as partículas de tal tamanho e a soma. Este é então dividido pelo volume total de todas partículas.

O termo óleo que não pode ser metabolizado como utilizado aqui se refere aos óleos que não podem ser metabolizados pelo corpo do indivíduo animal ao qual a emulsão é administrada.

Os termos animal e indivíduo animal como utilizado aqui se referem a todos os animais não humanos, incluindo gado, ovelha e porcos, por exemplo.

Os óleos que não podem ser metabolizados adequados para uso nas emulsões da presente invenção incluem alcanos, alcenos, alcinos e seus ácidos e álcoois correspondentes, os éteres e os ésteres dos mesmos e misturas dos mesmos. Preferencialmente, os compostos individuais do óleo são compostos hidrocarbonetos leves, isto é, tais componentes possuem 6 até 30 átomos de carbono. O óleo pode ser preparado de forma sintética ou purificado de produtos de petróleo. Os óleos que não podem ser metabolizados preferidos para uso nas emulsões da presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafina e cicloparafinas, por exemplo.

O termo óleo mineral se refere a uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos do petrolato através de uma técnica de destilação. O termo é sinônimo de parafina liquefeita, petrolato líquido e óleo mineral branco. Pretende-se ainda que o termo inclua óleo mineral leve, isto é, óleo que é similarmente obtido através da destilação de petrolato, mas que possui uma gravidade específica ligeiramente menor que o óleo mineral

branco. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^a Edição (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, nas páginas 788 e 1323). O óleo mineral pode ser obtido de várias fontes comerciais, por exemplo, J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). O óleo mineral 5 preferido é o óleo mineral leve disponível comercialmente sob o nome DRAKEOL®.

Tipicamente, o componente de óleo das emulsões em submícron da presente invenção está presente em uma quantidade de 1% até 50% em volume; preferencialmente, em uma quantidade de 10% até 45; 10 mais preferencialmente, em uma quantidade de 20% até 40%.

As emulsões de óleo-em-água da presente invenção incluem tipicamente pelo menos um (isto é, um ou mais) tensoativo. Os tensoativos e os emulsificantes, cujos termos são utilizados de forma intercambiável aqui, são agentes que estabilizam a superfície das gotículas de óleo e mantêm as 15 gotículas de óleo dentro do tamanho desejado.

Os tensoativos adequados para uso nas presentes emulsões incluem tensoativos biologicamente compatíveis naturais e tensoativos sintéticos não naturais. Os tensoativos biologicamente compatíveis incluem compostos de fosfolipídios ou uma mistura de fosfolipídios. Os fosfolipídios pre20 feridos são fosfatidilcolinas (lecitina), tal como a lecitina de soja ou de ovo. A lecitina pode ser obtida na forma de uma mistura de fosfatídeos e triglicerídeos através da lavagem com água de óleos vegetais brutos e da separação e da secagem das gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido através do fracionamento da mistura em relação aos fosfolipídios 25 insolúveis em acetona e os glicolipídeos remanescentes após a remoção dos triglicerídeos e do óleo vegetal através da lavagem com acetona. Alternativamente, a lecitina pode ser obtida de várias fontes comerciais. Outros fosfolipídios adequados incluem fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Os fosfolipídios 30 podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados de forma convencional.

Os tensoativos sintéticos não naturais adequados para uso nas emulsões em submícron da presente invenção incluem tensoativos não iônicos com base em sorbitana, por exemplo, tensoativos de sorbitana substituídos por ácidos graxos (disponíveis comercialmente sob o nome SPAN® ou ARLACEL®), os ésteres de ácidos graxos de sorbitol polietoxilado (TWE5 EN®), ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos de fontes tal como óleo de mamona (EMULFOR); ácido graxo polietoxilado (por exemplo, ácido esteárico disponível sob o nome de SIMULSOL M-53), polímero isooctilfenol/formaldeído polietoxilado (TILOXAPOL), éteres de álcoois graxos de polioxietileno (BRIJ®); éteres não fenílicos de polioxietileno (TRITON® N), éteres isooctilfe10 nílicos de polioxietileno (TRITON® X). Os tensoativos sintéticos preferidos são os tensoativos disponíveis sob os nomes SPAN® e TWEEN®.

Os tensoativos preferidos para uso nas emulsões de óleo-emágua da presente invenção incluem lecitina, Tween-80 e SPAN-80.

Falando de forma geral, o tensoativo ou a combinação de tenso15 ativos, se dois ou mais tensoativos forem utilizados, está presente na emulsão em uma quantidade de 0,01% até 10% em volume, preferencialmente, 0,1% até 6,0%, mais preferencialmente 0,2% até 5,0%.

O componente aquoso constitui a fase contínua da emulsão e pode ser água, solução salina tamponada ou qualquer outra solução aquosa 20 adequada.

As emulsões de óleo-em-água da presente invenção podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras.

Acredita-se que as moléculas bioadesivas podem aumentar a distribuição e a ligação de antígenos na ou através da superfície mucosa alvo conferindo imunidade de mucosa. Os exemplos de moléculas bioadesivas adequadas incluem polímeros ácidos que não ocorrem naturalmente tais como o ácido poliacrílico e o ácido polimetacrílico (por exemplo, CARBO30 POL®, CARBOMER); polímeros ácidos naturais modificados sinteticamente tal como carboximetilcelulose; polímeros neutros naturais modificados sinteticamente tal como (hidroxipropil) metilcelulose; polímeros básicos que car17 regam amina tal como quitosana; polímeros ácidos que podem ser obtidos de fontes naturais tais como o ácido algínico, o ácido hialurônico, a pectina, a goma adragante e a goma caraia; e polímeros neutros que não ocorrem naturalmente, tal como polivinilálcool; ou combinações dos mesmos.

A expressão moléculas imunoestimuladoras, como utilizado aqui, se refere ás moléculas que aumentam a resposta imunológica protetora induzida por um componente antigênico em composições para vacina. Os materiais imunoestimuladores adequados incluem componentes de parede celular bacteriana, por exemplo, derivados de N-acetil muramil-L-alanil-D10 isoglutamina tais como murabutida, treonil-MDP e muramil tripeptídeo; glicosídeo de saponinas e derivados dos mesmos, por exemplo, Quil A, QS 21 e GPI-0100; colesterol; e compostos de amônio quaternário, por exemplo, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) e N,N-dioctadecil-N,N-bis (2hidroxietil) propanodiamina (avridina).

As saponinas são compostos glicosidicos que são produzidos como metabóligos secundários em uma ampla variedade de espécies de plantas. A estrutura química das saponinas confere uma faixa ampla de atividades farmacológicas e biológicas, incluindo alguma atividade imunológica potente e eficiente.

Estruturalmente, as saponinas consistem em qualquer aglicona ligada a uma ou mais cadeias de açúcares. As saponinas podem ser classificadas de acordo com sua composição de aglicona: Glicosídeos de triterpeno, Glicosídeos esteróides e Glicosídeos alcalóides esteróides.

A saponina pode ser isolada da casca de Quillaja saponaria. A saponina é conhecida há muito tempo como um imunoestimulador. Dalsgaard, K., Evaluation of its adjuvante activity with a special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease, Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978. Os extratos brutos de plantas contendo saponina aumentavam a potência de vacinas para a doença de pé e boca. En30 tretanto, os extratos brutos foram associados com efeitos colaterais adversos quando utilizados nas vacinas. Subsequentemente, Dalsgaard purificou parcialmente o componente ativo adjuvante da saponina por diálise, troca

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Μ t Η • · · · tônica e cromatografia por filtração em gel. Dalsgaard, K. e outros, Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines, Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974. Um componente ativo adjuvante purificado desta maneira é conhecido como Quil A. Em uma base em peso Quil A mostrou maior potência e exibia reações locais reduzidas quando comparado com a saponina bruta. Quil A é amplamente utilizado em vacinas veterinárias.

Análises adicionais de Quil A por cromatografia líquida em alta pressão (HPLC) revelaram uma mistura heterogênea de saponinas intima10 mente relacionadas e levaram à descoberta de QS21 que era um adjuvante potente com toxicidade reduzida ou mínima. Kensil C.R. e outros, Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex”, J. Immunol. 146: 431-437, 1991. Ao contrário da maior parte dos outros imunoestimuladores, QS 21 é solúvel em água e po15 de ser utilizado em vacinas com ou sem formulações do tipo emulsão. QS21 mostrou ativar uma resposta do tipo Th1 em camundongos estimulando a produção de anticorpos lgG2a e lgG2b e induziu CD8+ CTL específico ao antígeno (MHC de classe I) em resposta aos antígenos de subunidade. Estudos clínicos em humanos provaram sua propriedade adjuvante com um perfil toxicológico aceitável. Kensil, C.R. e outros, Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. Em Vacina Design: the subunit and Adjuvant Approach, Eds. Powell, M.F. e Newman, M. J. Plenum Publishing Corporation, Nova York. 1995, pp. 525-541.

A Patente U.S. N² 6.080.725 ensina os métodos de produção e 25 de utilização do conjugado saponina-lipófilo. Neste conjugado saponinalipófilo, uma porção de lipofílico tal como lipídeo, ácido graxo, polietileno glicol ou terpeno é ligado covalentemente a uma triterpeno saponina não acilada ou desacilada através de um grupo carbóxi presente no ácido 3-0glucurônico da triterpeno saponina. A ligação de uma porção de lipofílico ao 30 ácido 3-O-glucurônico de uma saponina tal como a desacilsaponina de Quillaja, luciosídeo P ou saponina de Gypsophila, saponaria e Acanthophyllum aumenta seus efeitos adjuvantes na imunidade humoral ou mediada por cé30 lulas. Adicionalmente, a ligação de uma porção de lipofilico ao resíduo do ácido 3-O-glucurônico da saponina não acilada ou desacilada fornece um análogo da saponina que é mais fácil de purificar, menos tóxico, quimicamente mais estável e possui propriedades adjuvantes equivalentes ou melhores que a saponina original.

GPI-0100 é um conjugado saponina-liófilo descrito na Patente U.S. N^s 6.080.725. GPI-0100 é produzido pela adição de amina alifática à desacilsaponina através do grupo carboxila do ácido glucurônico.

Compostos de amônio quaternário - Um número de bases nitrogenadas alifáticas foi proposto para uso como adjuvantes imunológicos, incluindo aminas, compostos de amônio quaternário, guanidinas, benzamidinas e tiourônios. Tais compostos específicos incluem brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) e N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propanediamina (avridina).

A Patente U.S. N² 5.951.988 ensina uma formulação adjuvante contendo sais de amônio quaternário tal como DDA em associação com um componente oleoso. Esta formulação é útil em associação com substâncias imunológicas conhecidas, por exemplo, antígenos virais ou bacterianos em uma composição de vacina, a fim de aumentar a resposta imunogênica. A composição também é útil sem um antígeno incorporado como uma formulação imunoestimuladora não específica.

A Patente U.S. N² 4.310.550 descreve o uso de N,N-alquil-N,Ν'bis (2-hidroxietil)-propanediamina superior e Ν,Ν-alquil-xililenodiaminas superiores formuladas com emulsão de gordura ou de lipídeo como um adjuvante para vacina. Um método de indução ou de aumento da resposta imunogênica de um antígeno no ser humano ou em um animal através da administração parenteral da formulação adjuvante é descrito na Patente U.S. N² 4.310.550.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece uma emulsão de óleo-em-água em submícron útil como adjuvante para vacina, que é composta de uma formulação AMPHIGEN®, com gotículas com um tamanho menor que 1 pm e um tamanho médio de gotículas de aproxima20 damente 0,25 μηη.

O termo formulação AMPHIGEN® como utilizado aqui se refere a uma solução formada através da mistura de uma solução oleosa de lecitina DRAKEOL® (Hidronics, Lincoln, NE) com solução salina na presença de TWEEN® 80 e SPAN® 80. Uma formulação AMPHIGEN® típica contém 40% de óleo mineral leve em volume (v/v), aproximadamente 25% p/v de lecitina, aproximadamente 0,18% de TWEEN 80 em volume (v/v) e aproximadamente 0,08% de Span 80 em volume (v/v).

Métodos de Preparação de Emulsões de Óleo-Em-Áqua em Submícron

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos de preparação das emulsões de óleo-em-água em submícron descritas anteriormente aqui.

De acordo com a presente invenção, os vários componentes da emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado para uso na emulsão, são combinados e misturados juntos.

A mistura formada é submetida a um processo de emulsificação, tipicamente através da passagem uma ou mais vezes através de um ou mais homogeneizadores ou emulsificantes para formar uma emulsão de óleo-emágua que possui uma aparência uniforme e um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,5 μτη. Qualquer homogeneizador ou emulsificante disponível comercialmente pode ser utilizado para esta finalidade, por exemplo, o emulsificante de Ross (Hauppauge, NY), o homogeneizador de Gaulin (Everett, MA).

A emulsão formada dessa maneira é então submetida à microfluidização para levar o tamanho de gotículas à faixa de submícron. A microfluidização pode ser conseguida através do uso de um microfluidizador comercial, tal como o modelo número 11OY disponível na Microfluidics, Newton, Mass; Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estes microfluidizadores operam forçando os fluidos através de pequenas aberturas sob alta pressão, de forma que duas correntes de fluidos interagem a

altas velocidades em uma câmara de interação para formar emulsões com gotículas de um tamanho em submícron.

O tamanho de gotículas pode ser determinado através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difração a laser, através do uso de instrumentos medidores disponíveis comercialmente. O tamanho pode variar dependendo do tipo de tensoativo utilizado, da proporção do tensoativo em relação ao óleo, da pressão de operação, da temperatura e similares. O versado na técnica pode determinar a combinação desejada destes parâmetros para a obtenção de emulsões com tamanho de gotículas desejado sem experimentos desnecessários. As gotículas das emulsões da presente invenção são menores que 1 pm de diâmetro, preferencialmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 pm e mais preferenciaimente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,5 μηη e ainda mais preferencialmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,3 pm.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a solução oleosa de lecitina DRAKEOL, que está disponível comercialmente na Hidronics (Lincoln, NE) e contém 25% de lecitina em óleo mineral leve, é combinada e misturada com solução salina assim como tensoativos TWEEN® 80 e SPAN® 80 para formar uma solução AMPHGEN® ou uma formulação AMPHIGEN®. A solução AMPHGEN® é então emulsificada com um emulsificante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm para formar uma emulsão de óleo-em-água. Subseqüentemente, a emulsão é passada uma vez através de um Microfluidizador operando a aproximadamente 31,02 + 3,44 MPa (4500 ± 500 psi). A emulsão de óleo-em-água microfluidizada possui gotículas com um tamanho menor que 1 pm, com um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,25 pm.

Composições Para Vacina Contendo Antígenos Incorporados em Emulsões de Óleo-Em-Áqua em Submícron

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece composições para vacina que contêm um(ou mais) antígeno(s) e uma emulsão de óleo-em-água em submícron descrita anteriormente aqui. Estas composi ções para vacina são caracterizadas por terem um maior efeito imunogênico e uma melhor aparência física (por exemplo, não é observada separação de fases após um período de armazenamento estendido). Em adição, as composições para vacina da presente invenção são seguras para a administração aos animais.

De acordo com a presente invenção, o antígeno pode ser combinado com a emulsão extrinsicamente ou preferencialmente, intrinsicamente. O termo intrinsicamente se refere ao processo em que o antígeno é combinado com os componentes da emulsão antes da etapa de microfluidização. O termo extrinsicamente se refere ao processo em que o antígeno é adicionado na emulsão após a emulsão ter sido microfluidizada. O antígeno adicionado extrinsicamente pode ser antígeno livre ou pode estar encapsulado em micropartículas como descrito adicionalmente aqui abaixo.

O termo antígeno como utilizado aqui se refere a qualquer molécula, composto ou composição que é imunogênica em um animal e é incluída na composição de vacina para ativar uma resposta imunológica protetora no animal ao qual a composição de vacina é administrada.

O termo imunogênico como utilizado em associação com um antígeno se refere à capacidade do antígeno de provocar uma resposta imunológica em um animal contra o antígeno. A resposta imunológica pode ser uma resposta imunológica celular mediada primariamente por células T citotóxicas ou uma resposta imunológica humoral mediada primariamente por células T helper, que por sua vez ativa as células B levando à produção de anticorpos.

Uma resposta imunológica protetora é definida como qualquer resposta imunológica, uma resposta imunológica mediada por anticorpo ou por célula ou ambos, que ocorre no animal que previne ou reduz de forma detectável a ocorrência ou elimina ou reduz de forma detectável a gravidade ou diminui de forma detectável a taxa de progressão, do distúrbio ou da doença causada pelo antígeno ou um agente patogênico contendo o antígeno.

Os antígenos que podem ser incluídos na composição de vacina da presente invenção incluem antígenos preparados partindo de bactérias

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patogênicas tais como Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimia hemolytica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelotríx rhusopathiae, Campilobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella enterica serovars, Leptospira spp.; fungos patogênicos tal como Candida; protozoários tais como Cryptosporídium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimería spp.-, helmintos tais como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, na forma de uma preparação de células totais ou parciais inativadas ou na forma de moléculas antigênicas obtidas através da purificação convencional de proteínas, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química. Os antígenos adicionais incluem vírus patogênicos tais como os herpesvírus-1,3,6 Bovinos, os vírus da diarréia viral Bovina (BVDV) dos tipos 1 e 2, o vírus parainfluenza Bovino, o vírus sincicial respiratório Bovino, o vírus da leucose bovina, o vírus rinderpest, o vírus da doença de pé e boca, a raiva, o vírus da febre suína, o vírus da febre suína Africana, os parvovírus Porcinos, o vírus PRRS, o circovírus Porcino, o vírus influenza, o vírus da doença vesicular suína, o vírus da febre de Techen, o vírus de Pseudorabies (Pseudorraiva), na forma de uma preparação viral total ou parcial inativada ou na forma de moléculas antigênicas obtidas através da purificação de proteínas convencional, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química.

A quantidade do antigeno deve ser tal que o antigeno que, em combinação com a emulsão de óleo-em-água, é eficiente na indução da uma resposta imunológica protetora em um animal. A quantidade precisa de um antigeno que será eficiente depende da natureza, da atividade e da pureza do antigeno e pode ser determinada por um versado na técnica.

A quantidade da emulsão de óleo-em-água presente nas composições para vacina deve ser suficiente para potencializar a imunogenicidade do(s) antígeno(s) nas composições para vacina. Quando desejável e apropriado, quantidades adicionais de tensoativo(s) ou tensoativo(s) adicio33 nal(is) podem ser adicionadas na composição de vacina em adição ao(s) tensoativo(s) fornecido(s) pela emulsão de óleo-em-água. Falando de forma geral, o componente oleoso está presente no volume final de uma composição de vacina em uma quantidade de 1,0% até 20% em volume; preferencialmente, em uma quantidade de 1,0% até 10%; mais preferencialmente, em uma quantidade de 2,0% até 5,0%. O tensoativo ou a combinação de tensoativos se dois ou mais tensoativos forem utilizados, está presente no volume final de uma composição de vacina em uma quantidade de 0,1% até 20% em volume, preferencialmente, 0,15% até 10%, mais preferencialmente 0,2% até 6,0%.

Em adição ao(s) antígeno(s) e à emulsão de óleo-em-água, a composição de vacina pode incluir outros componentes que são apropriados e desejáveis, tais como conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras (por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA)), como descrito anteriormente aqui em associação com a emulsão de óleo-em-água.

As composições para vacina da presente invenção podem também incluir um veículo aceitável na veterinária. O termo um veículo aceitável na veterinária inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardo da adsorção e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similares. Os agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina, entre outros.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece uma composição de vacina que inclui pelo menos um antígeno de BVDV do tipo I ou de BVDV do tipo II, incorporado intrinsicamente em uma emulsão de óleoem-água que possui gotículas de um tamanho menor que 1 pm, preferencialmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 pm, mais preferencialmente menor que 0,5 pm e ainda mais preferencialmente com um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,5 pm. O antígeno de BVDV « ·· · ·· • · · · * • ·· · ♦ ♦· ······· χ • · · · · · · >· · ♦ · do tipo I e/ou II está preferencialmente na forma de uma preparação viral inativada. A emulsão de óleo-em-água em submicron é preferencialmente composta de uma formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina inclui preferencialmente ainda Quil-A, colesterol e timerosol.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção fornece uma composição de vacina que inclui um antígeno de Leptospira e pelo menos um de um antígeno de BVDV do tipo I ou de BVDV do tipo II em uma emulsão de óleo-em-água. Os antígenos, preferencialmente na forma de preparação celular ou viral inativada, são incorporados intrinsicamente na emulsão de óleo-em-água que possui goticulas de um tamanho menor que 1 pm, preferencialmente com um tamanho médio de goticulas menor que 0,8 pm, mais preferencialmente menor que 0,5 pm e ainda mais preferencialmente com um tamanho médio de goticulas de aproximadamente 0,5 pm. A emulsão de óleo-em-água em submicron é preferencialmente composta de uma formulação AMPHIGEN (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina inclui ainda preferencialmente uma ou mais moléculas imunoestimuladoras selecionadas de Quil-A, colesterol, DDA, GPI-100 e hidróxido de alumínio (AIOH).

Ainda em uma outra modalidade preferida, a presente invenção fornece uma composição de vacina que inclui pelo menos um antígeno bacteriano, por exemplo, a proteína PauA recombinante de Streptococcus uberis ou uma preparação de células de E. coli ou uma combinação de ambos, em uma emulsão de óleo-em-água. O(s) antígeno(s) é(são) combinado(s) intrinsicamente com a emulsão de óleo-em-água que possui goticulas de um tamanho menor que 1 pm, preferencialmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 pm, mais preferencialmente menor que 0,5 pm e ainda mais preferencialmente com um tamanho médio de goticulas de aproximadamente 0,25 pm. A emulsão de óleo-em-água em submicron é preferencialmente composta de uma formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina inclui ainda preferencialmente uma ou mais moléculas

imunoestimuladoras selecionadas de Quil A, DDA e GPI-100.

As composições para vacina da presente invenção podem ser administradas a um animal através de rotas conhecidas, incluindo a rota oral, intranasal, mucosal, tópica, transdermal e parenteral (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração pode ser conseguida utilizando uma combinação de rotas, por exemplo, a primeira administração utilizando uma rota parental e subseqüentemente a administração utilizando uma rota mucosal. Métodos de Preparação de Composições para Vacina

Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece métodos de preparação de composições para vacina contendo um antígeno ou antígenos e uma emulsão de óleo-em-água em submícron.

Na preparação das composições para vacina da presente invenção, o(s) antígeno(s) pode(m) ser combinado(s) intrinsicamente ou extrinsicamente com os componentes da emulsão de óleo-em-água. Preferencialmente, o antígeno é combinado com os componentes da emulsão de óleoem-água intrinsicamente.

O antígeno pode ser obtido com os vários componentes da emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado, para formar uma mistura. A mistura é submetida a um processo primário de mistura, tipicamente através da passagem uma ou mais vezes por um ou mais homogeneizadores ou emulsificantes, para formar uma emulsão de óleo-em-água contendo o antígeno. Qualquer homogeneizador ou emulsificante disponível comercialmente pode ser utilizado para esta finalidade, por exemplo, o emulsificante de Ross (Hauppauge, NY), o homogeneizador de Gaulin (Everett, MA) ou Microfluidics (Newton, MA). Alternativamente, os vários componentes do adjuvante de emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensoativos e um componente aquoso podem ser combinados primeiramente para formar uma emulsão de óleoem-água através da utilização de um homogeneizador ou um emulsificante; e o antígeno é então adicionado a esta emulsão. O tamanho médio de gotículas da emulsão de óleo-em-água após a mescla primária é de aproxima33

damente 1,0-1,2 mícron.

A emulsão contendo o antígeno é então submetida à microfluidização para levar o tamanho de gotículas para a faixa de submícron. A microfluidização pode ser conseguida através do uso de um microfluidizador co5 mercial, tal como o modelo número 11OY disponível na Microfluidícs, Newton, Mass; Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food e Dairy, Inc., Hudson, Wis.).

O tamanho de gotículas pode ser determinado através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difração a laser, 10 através do uso de instrumentos medidores disponíveis comercialmente. O tamanho pode variar dependendo do tipo de tensoativo utilizado, da proporção de tensoativo em relação ao óleo, da pressão de operação, da temperatura e similares. Pode-se determinar uma combinação desejada destes parâmetros para a obtenção de emulsões com um tamanho de gotículas dese15 jado. As gotículas de óleo das emulsões da presente invenção são menores que 1 μίτι de diâmetro. Preferencialmente, o tamanho médio de gotículas é menor que 0,8 pm. Mais preferencialmente, o tamanho médio de gotículas é menor que 0,5 pm. Ainda mais preferencialmente, o tamanho médio de gotículas é de aproximadamente 0,1 até 0,3 pm.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, a solução oleosa de lecitina DRAKEOL®, que contém 25% de lecitina em óleo mineral leve, é combinada e misturada com tensoativos TWEEN® 80 e SPAN® 80 e solução salina para formar uma mistura que contém 40% de óleo mineral leve, lecitina, 0,18% de TWEEN® 80 e 0,08% de SPAN® 80. A mistura é 25 então emulsificada com um emulsificante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm para formar um produto de emulsão, que é também referido como uma formulação AMPHIGEN® ou uma solução AMPHIGEN®. Subseqüentemente, o(s) antígeno(s) desejado(s) é(são) combinado(s) com a solução AMPHIGEN® e quaisquer outros componentes 30 apropriados (por exemplo, moléculas imunoestimuladoras) com o auxílio de um emulsificante, por exemplo, um homogeneizador de Ross, para formar uma emulsão de óleo-em-água contendo o(s) antígeno(s). Tal emulsão é

passada uma vez através de um Microfluidizador operando a aproximadamente 6,89 + 3,44 MPa (10000 ± 500 psi). A emulsão de óleo-em-água microfluidizada possui gotículas de um tamanho menor que 1 pm, com o tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,25 pm.

Em uma outra modalidade preferida, antes da combinação de uma emulsão de óleo-em-água (por exemplo, uma formulação AMPHIGEN®) com um(ou mais) antígeno(s) desejado(s), o(s) antígeno(s) é(são) combinado(s) com um glicosídeo de saponina, por exemplo, Quil A, para formar uma mistura. Esta mistura de antígeno(s)-saponina é submetida à homogeneização, por exemplo, em um recipiente de homogeneização. Um esterol, por exemplo, colesterol, é então adicionado à mistura de antígeno(s)-saponina homogeneizada. A mistura contendo o(s) antígeno(s), saponina e esterol é então submetida à homogeneização adicional. A mistura de antigeno(s)-saponina-esterol homogeneizada é então combinada com uma emulsão de óleo-em-água (por exemplo, uma solução AMPHIGEN®) com o auxílio de um homogeneizador, por exemplo. A emulsão de óleo-em-água homogeneizada contendo o(s) antígeno(s), saponina e esterol é então submetida à homogeneização em alta pressão, tal como a microfluidização. Composições para Vacina Contendo Antíqenos Microencapsulados em uma Emulsão de Óleo-Em-Áqua em Submícron e Métodos de Preparação

Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece composições para vacina que contêm um antígeno encapsulado em micropartículas (ou antígeno microencapsulado), em que o antígeno microencapsulado é extrinsicamente incorporado em uma emulsão de óleo-em-água em submícron descrita anteriormente aqui.

Os métodos para absorção ou aprisionamento de antigenos em veículos particulados são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba e Robert Langer. Polimer microspheres for vaccine delivery. Em: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach. Eds. Michael F. Powell e Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, Nova York e Londres). Os veículos particulados podem apresentar várias cópias de um antígeno selecionado ao

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sistema imunológico em um indivíduo animal e promover o aprisionamento e a retenção de antígenos nos nodos linfáticos locais. As partículas podem ser fagocitadas por macrófagos e podem aumentar a apresentação do antígeno através da liberação de citocinas. Os veículos particulados também foram descritos na técnica e incluem, por exemplo, os derivados dos polímeros de metacrilato de polimetila, assim como os derivados de poli (lactídeos) e poli (lactídeo-co-glicolidas), conhecidos como PLG. Os polímeros de metacrilato de polimetila não são biodegradáveis enquanto as partículas de PLG podem ser biodegradados através da hidrólise não enzimática aleatória de ligações ésteres nos ácidos láctico e glicólico que são excretados ao longo das vias metabólicas normais.

As microesferas biodegradáveis também foram utilizadas para conseguir a liberação controlada das vacinas. Por exemplo, pode ser conseguida uma liberação contínua do antígeno ao longo de um período prolongado. Dependendo do peso molecular do polímero e a proporção de ácido láctico em relação ao glicólico no polímero, um polímero de PLGA pode ter uma taxa de hidrólise de alguns dias ou semanas até vários meses ou um ano. Uma liberação controlada lenta pode resultar na formação de altos níveis de anticorpos similares aos observados após várias injeções. Alternativamente, uma liberação pulsátil de antígenos da vacina pode ser conseguida através da seleção de polímeros com taxas diferentes de hidrólise. A taxa de hidrólise de um polímero depende tipicamente do peso molecular do polímero e da proporção de ácido láctico em relação ao glicólico no polímero. As microparticulas feitas de dois ou mais polímeros diferentes com taxas variáveis de liberação do antígeno fornecem liberações pulsáteis de antígenos e imitam regimes de várias doses de vacinação.

De acordo com a presente invenção, um antígeno, incluindo quaisquer um dos descritos anteriormente aqui, pode ser absorvido em um veículo polimérico particulado, preferencialmente um polímero PLG, através da utilização de qualquer procedimento conhecido na técnica (tal como um exemplificado no Exemplo 17), para formar uma preparação de antígeno microencapsulado. A preparação de antígeno microencapsulado é então

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misturada com e dispersa em uma emulsão de óleo-em-água em submícron, cuja emulsão foi descrita anteriormente aqui, para formar a composição de vacina.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece uma composição de vacina que contém um antígeno encapsulado em um polímero PLG, em que o antígeno microencapsulado é disperso extrinsicamente em uma emulsão de óleo-em-água microfluidizada que é composta de óleo mineral leve, lecitina, TWEEN80, SPAN80 e solução salina e possui um tamanho médio de gotículas menor que 1,0 pm.

Complexos Formados por uma Saponina e um Esterol

Em uma modalidade, a presente invenção fornece composições contendo uma saponina e um esterol, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas em hélice. De acordo com a presente invenção, estes complexos possuem atividades imunoestimuladoras.

Por imunoestimulação entende-se que os complexos podem aumentar a resposta imunológica induzida por um componente antigênico ou que os complexos podem induzir uma resposta imunológica independente de um componente imunogênico separado.

De acordo com a presente invenção, uma saponina preferida para uso em uma composição da presente invenção é Quil A.

Os esteróis preferidos para uso nas composições adjuvantes da presente invenção incluem beta-sitoesterol, estigmaesterol, ergoesterol, ergocalciferol e colesterol. Estes esteróis são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, o colesterol é divulgado no Merck Index, 11^a Ed., página 341, como um esterol que ocorre naturalmente encontrado na gordura animal. Mais preferencialmente o esterol é colesterol.

A proporção de saponina:esterol na composição está tipicamente na ordem de 1:100 até 5:1 em peso em relção ao peso. Preferencialmente, a proporção é de 1:1.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece composições para vacina contendo uma saponina, um esterol e um antígeno, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas em héli

ce e em que o antígeno é misturado, mas não é incorporado dentro das micelas em hélice.

Abaixo estão exemplos de modalidades específicas para a realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas com finalidades ilustrativas e não é pretendido que limitem o âmbito da presente invenção de forma alguma.

Exemplo 1

Preparação de uma Formulação AMPHIGEN®

Uma formulação AMPHIGEN® foi preparada em um processo em duas etapas. Na primeira etapa, 80 litros da solução oleosa de lecitina Drakeol, 116 litros de solução salina com o Toxóide do Tétano, 1,2 litro de SPAN 80 e 2,8 litros de Tween 80 foram misturados juntos e emulsificados utilizando um emulsificante de Ross. A solução oleosa de lecitina Drakeol continha 25% de lecitina de soja e 75% de óleo mineral. O produto emulsificado foi recirculado através do emulsificante de Ross durante um mínimo de 5 volumes ou um mínimo de 10 minutos. O produto emulsificado foi armazenado a 2-7°C durante um máximo de 24 horas para o processamento adicional. A emulsão do tanque com emulsificante de Ross foi transferida para um homogeneizador de Gaulin e foi homogeneizada durante 20 minutos sob uma pressão de 31,02 MPa (4500 psi). A solução oleosa de lecitina Drakeol a 40% resultante (posteriormente aqui a formulação AMPHIGEN® ou solução AMPHIGEN®) foi então distribuída em recipientes de carbóxi polipropileno esterilizados. A distribuição foi realizada dentro de uma capela de despejo de classe 100 localizada em um ambiente controlado de classe 10.000. Os recipientes foram armazenados a 2-7°C. Esta formulação AMPHIGEN® foi utilizada nos experimentos descritos aqui abaixo a não ser que seja indicado de outra maneira.

Exemplo 2

Mescla Primária Através da Homogeneização de Mistura Instantânea da Vacina para BVD.

O aparelho utilizado para este processo de homogeneização é mostrado na figura 1. Utilizando uma técnica asséptica ou válvulas de cru32

A · • ··

zamento de vapor dágua, uma garrafa contendo um antígeno de BVD do Tipo I (uma preparação viral inativada de BVD do Tipo I) foi ligada a porta lateral inferior no recipiente de mistura. Após a transferência do volume requerido do antígeno de BVD do Tipo I ter sido completada, a garrafa com BVD do Tipo I foi substituída pela garrafa contendo uma preparação viral inativada de BVD do Tipo II (uma preparação viral inativada de BVD do Tipo II). Após a tranferência da quantidade requerida de um antígeno de BVD do Tipo II ter sido completada, o homogeneizador de Ross foi ligado ao recipiente portátil e a recirculação foi iniciada em RPM máxima (3300 rpm). O recipiente de agitação foi mantido em velocidade média.

Utilizando uma técnica asséptica ou uma válvula de cruzamento de vapor dágua, uma garrafa contendo Quil-A a concentração de 50 mg/mL foi ligada na porta em linha do homogeneizador no recipiente de mistura. Uma quantidade requerida da solução de Quil-A foi passada no recipiente através da sucção em linha. Após a transferência da solução de Quil-A ter sido completada, a garrafa foi removida. Da mesma maneira, uma quantidade requerida de colesterol em solução de etanol (18 mg/mL) foi transferida para o recipiente de mistura. Subseqüentemente, uma quantidade requerida da formulação AMPHIGEN®, solução a 10% de timerosol e soluções diluídas do meio de Eagle Modificado Básico (BME) foram adicionadas no recipiente de mistura.

Uma vez que todas as adições estavam completas, a mistura foi mantida durante mais 15 minutos. A formulação resultante foi aliquotada em doses de 2 mL e representava uma vacina de BVD com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada. Cada dose da vacina continha 500 pg de Quil-A, 500 pg de Colesterol, 2,5% de formulação AMPHIGEN® e 0,009% de timerosol. A concentração de antígeno para duas cepas diferentes de BVD foi determinada em termos do título de ELISA para gp53.

Exemplo 3

Mistura Secundária por Microfluidizacão

A figura 2 ilustra o processo utilizado para a mistura secundária através da microfluidização. O microfluidizador foi esterilizado por vapor. Em

primeiro lugar, a câmara do módulo de processamento auxiliar foi instalada na unidade e a câmara para ensaio em branco foi instalada na secunda posição da câmara. O recipiente contendo a vacina de BVD completamente auxiliada pelo adjuvante preparada como descrito no Exemplo 2 foi conectado com o microfluidizador através da ligação de uma linha de transferência partindo da válvula de drenagem do recipiente de fornecimento até a entrada do microfluidizador. O gás nitrogênio foi conectado na entrada do filtro de ar do recipiente de fornecimento e o ajuste da pressão do recipiente foi fixado a 0,13 -/+ 0,03 MPa (20 +/- 5 PSI). A válvula de drenagem do recipiente de coleta foi conectada na linha de transferência partindo da saída do microfluidizador. Após fazer todas as conexões necessárias, as válvulas foram abertas e a microfluidização foi iniciada a uma pressão operacional de 68,94 +/- 3,44 MPa (10,000 +/- 500 PSI). O conteúdo inteiro da vacina foi passada através do microfluidizador uma vez e foi coletado na câmara pós-microfluidização. Esta preparação foi aliquotada em doses de 2 mL e representa a vacina de BVD com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada.

Exemplo 4

Preparação de uma Composição de Vacina Através da Mistura em Bancada.

A formulação AMPHIGEN® preparada como descrito no Exemplo 1 foi diluída a 2,5% com a adição de antígenos de BVD e a solução diluída. A solução resultante foi misturada na bancada utilizando um bastão de agitação ao invés de utilizar um homogeneizador. A preparação final continha a composição a seguir antígenos de BVD do Tipo 1 e do Tipo 2, 2,5% da formulação AMPHIGEN® (que contém óleo, lecitina, SPAN® e TWEEN®, como descrito no Exemplo 1) e solução salina. TWEEN 80 e SPAN 80 estão presentes na preparação final de vacina a 0,18% e 0,08% em volume, respectivamente.

Exemplo 5

Comparação da Distribuição do Tamanho de Gotículas Entre as Preparações de Vacina com Base na Formulação AMPHIGEN® Não Microfluidizadas e Microfluidizadas

A vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidi45

zada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a preparação feita através da mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, foram utilizadas para comparar o tamanho de gotículas das preparações de vacina. Dois mililitros da amostra de cada uma das preparações foram adicionados a um medidor de Difração a Laser Malvern 2000 e a distribuição do tamanho de gotículas foi determinada. Como mostrado na figura 3, os resultados indicam que a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada tinha o volume máximo de distribuição de partícula em torno de 0,1 mícron enquanto que a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada tinha o volume máximo de distribuição de partícula em tomo de 1 mícron.

Exemplo 6

Redução na Separação de Fases da Vacina.

Três preparações diferentes de vacina: a vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a vacina preparada através da mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, foram comparadas lado a lado para determinar as propriedades de separação de fases após armazenamento longo. Foi permitido que todas estas preparações ficassem em repouso a 4°C durante aproximadamente um mês e a separação de fases foi monitorada em termos de aparência de uma camada cremosa na superfície das preparações de vacina. Como mostrado na figura 4, não havia separação de fases na preparação com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada quando comparada com as duas outras preparações.

Exemplo 7

Preparação de Vacina para Gado Microfluidizada ou Não Microfluidizada contra o Vírus da Diarréia Viral Bovina

O antígeno viral do Vírus da Diarréia Bovina foi incorporado intrinsicamente na formulação AMPHIGEN® através da microfluidização. O termo intrinsicamente incorporado se refere ao processo através do qual o • · antígeno foi adicionado na formulação AMPHIGEN® antes da microfluidização. O antígeno foi submetido às forças físicas do processo de microfluidização junto com os componentes da formulação adjuvante. No grupo não microfluidizado de controle, a preparação de antígeno foi dispersa na formula5 ção AMPHIGEN® através de mistura.

A composição final das preparações tanto de controle quanto microfluidizadas era como a seguir: BVD do tipo I com um título de ELISA pós-inativação de 2535 UR/dose para gp53, BVD do Tipo II com um título de ELISA pós-inativação de 3290 UR/dose para gp53, Quil-A na concentração 10 de 1,25 mg/dose, colesterol na concentração de 1,25 mg/dose, a formulação AMPHIGEN® na concentração final de 2,5% e timerosol na concentração final de 0,009%. A dose de vacina era de 5 mL.

Exemplo 8

Estabilidade em Longo Prazo de Antígenos Virais de BVD Incorporados In15 trinsicamente na Preparação de Vacina com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizada

Este experimento foi realizado para determinar a estabilidade do antígeno incorporado intrinsicamente durante o armazenamento longo. O antígeno viral morto de BVD do Tipo II foi incorporado intrinsicamente na 20 formulação AMPHIGEN® durante o processo de microfluidização para a obtenção da preparação de vacina microfluidizada (A907505). Três outras preparações de vacina contendo o mesmo antígeno na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada (A904369, A904370 e A904371) serviram como o controle. Nas preparações não microfluidizadas, o antígeno foi misturado 25 com a formulação AMPHIGEN® e misturado através da mesclagem utilizando um homogeneizador de Ross. Todas as quatro preparações de vacina foram armazenadas a 4°C durante dois anos. Em pontos diferentes durante o armazenamento (0, 6, 12 ou 24 meses), todas as quatro formulações foram utilizadas para vacinar vacas com três meses de idade.

Nos dias 0 e 21, as vacas com três meses de idade foram vacinadas através da rota subcutânea com uma formulação de vacina de 2 mL. O soro dos animais vacinados foi coletado no dia 35 e a resposta sorológica

à vacina foi medida em termos do título de anticorpo através de ELISA BVDV-E2. Como mostrado na figura 5, a preparação de vacina microfluidizada exibiu um maior título de anticorpo em todos os pontos de tempo testados (0, 6, 12 e 24 meses), sugerindo que a estabilidade da preparação de antígeno não é perdida durante a incorporação intrínsica do antígeno durante o processo de microfluidização. Além disso, foi descoberto de forma surpreendente que a preparação de vacina microfluidizada induzia uma maior resposta imunológica em todos os pontos de tempo.

Exemplo 9

Redução no Aumento Induzido pela Vacina na Temperatura Retal Após a Microfluidização

As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas produzidas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar o gado no dia zero e a temperatura retal foi monitorada durante o período de um dia antes da vacinação até quatro dias após a vacinação. A dose de vacina era de 2 mL. Os grupos foram vacinados com uma dose única ou dupla da vacina. As temperaturas retais foram medidas e registradas diariamente no Dia -1 até o Dia 4, inclusive. As temperaturas retais no dia 0 foram medidas antes da administração do artigo de teste.

Como mostrado na figura 6, os resultados indicam que havia um aumento acentuado na temperatura retal em aproximadamente 24 horas após a vacinação nos animais vacinados com uma dose única ou dupla da formulação de vacina não microfluidizada. Entretanto, nos animais vacinados com formas microfluidizadas da vacina, o aumento na temperatura retal após a vacinação era somente mínimo e significativamente menor que nos animais vacinados com a formulação não microfluidizada (figura 6).

Exemplo 10

O Volume de Reação no Local da Injeção Foi Resolvido Mais Rápido Quando Vacinado com Formulações de Vacina Microfluidizadas.

As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas produzidas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar o gado no dia zero. Os animais incluídos no estudo eram gado de corte retro37 • *

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H8 cruzados. Havia três animais em cada um dos grupos de tratamento com placebo (T01 e T02). Havia seis animais em cada um dos grupos T03 até T06. A dose de vacina era de 2 mL e os grupos foram vacinados com uma ou duas doses da vacina no dia zero. No dia 0, o artigo de teste foi administrado à direita no pescoço. Os animais que receberam dose dupla (4 mL) do artigo de teste (T02, T04 e T06) receberam a dose dupla toda na forma de uma-única injeção em-um lado. A observação dos locais de injeção, incluindo a estimativa do tamanho de reação no local da injeção foi feita no lado direito do pescoço no Dia 0 até o Dia 4, inclusive e nos Dias 6, 9 e 14. No Dia 0 os locais de injeção foram observados antes da administração dos artigos de teste. Os grupos vacinados com uma ou duas doses do placebo não exibiam qualquer aumento significativo no volume de reação no local de injeção e, portanto, os dados não são mostrados na figura 7. No caso da formulação de vacina não microfluidizada, havia um aumento proporcional no volume de reação no local da injeção entre uma dose e duas doses de vacinação. Por outro lado, no caso da formulação de vacina microfluidizada, embora a dose única induzisse um volume de reação maior no local da injeção, a injeção com a segunda dose não causava qualquer aumento adicional. Além disso, no caso dos animais injetados com a formulação de vacina microfluidizada, o volume do local de reação do local de injeção era resolvido a uma taxa mais rápida quando comparada com aquela nos animais injetados com uma formulação de vacina não microfluidizada. Estes resultados são mostrados na figura 7.

Exemplo 11

Obtenção de Preparações de Vacina Com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizadas com Antígenos Virais de BVD e de Leptospira Incorporados Intrinsicamente e Moléculas Imunoestimuladoras Tais como Quil A e DDA

A cepa CSL de hardjo-bovis inativada com formalina foi formulada no adjuvante apropriado em contagens diretas de aproximadamente 1,4 x 10⁹ organismos/dose de 5 mL. A cepa T262 de Leptospira Pomona inativada com formalina foi formulada em aproximadamente 2400 Unidades Nefalomé-

» · • · ·» » ricas/dose de 5 mL. As unidades Nefaloméricas foram calculadas com base na medida nefalométrica do fluido de fermentação pré-processado. O vírus BVD do Tipo 1 foi formulado em um título de ELISA E2 de aproximadamente 3000 Unidades Relativas/dose de 5 mL. O vírus BVD do Tipo 2 foi formulado em um título de ELISA E2 de aproximadamente 3500 Unidades Relativas/dose de 5 mL. A Unidade Relativa foi calculada com base no titulo de ELISA E2 do volume de fluido pós-inativação pré-montagem. Tanto o Quil-A quanto o colesterol foram utilizados na concentração de 0,5 mg por dose. O Timerosol e a formulação AMPHIGEN® foram utilizados na concentração final de 0,009% e 2,5%, respectiva mente. O hidróxido de alumínio (Rehydragel LV) foi utilizado na concentração final de 2,0%. Quando o DDA foi utilizado como um imunomodulador, o DDA foi incluído dentro da formulação AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® (isto é, a solução estoque de lecitina Drakeol a 40%) continha 1,6 mg/mL de DDA e, quando diluída apropriadamente, a preparação final de vacina continha 2,5% de formulação AMPHIGEN® e 0,1 mg/mL de DDA.

Na preparação de formulações de vacina diferentes, frações de BVD, Leptos, Quil-A, colestrol, timerosol, a formulação AMPHIGEN® e a solução salina como um diluente foram adicionados a um homogeneizador de Silverson e misturados durante 15 minutos a 68,94 + 3,44 MPa (10.000 ± 500 RPM). Os componentes foram então microfluidizados através de uma tela de 200 microns a 68,94 MPa (10.000 psi).

Quando a formulação de vacina continha hidróxido de alumínio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de alumínio. Após a microfluidização ter sido completada, o hidróxido de alumínio foi adicionado e misturado com um bastão de agitação durante a noite a 4°C.

Exemplo 12

Preparação da Vacina Viral de BVD Para Estudos de Desafio

A preparação de vacina utilizada no experimento continha antígenos tanto do vírus BVD do Tipo 1 quanto do vírus BVD do Tipo 2. O antígeno BVD1-5960 foi utilizado no título de ELISA pós-inativação de 2535 UR/dose para gp53. O antígeno BVD2-890 foi utilizado no titulo de ELISA pós-inativação de 3290 UR/dose para gp53. O Quil A e o colesterol foram utilizados na concentração de 0,5 mg/mL. O Timersol e a formulação AMPHIGEN® foram utilizados na concentração final de 0,009% e 2,5%, respectivamente. Quando o DDA foi utilizado como um modulador imunológico, o DDA foi incluído dentro da formulação AMPHIGEN®. A solução estoque de AMPHIGEN® (40% da solução de lecitina Drakeol) continha quantidades variáveis de DDA e quando diluída de forma apropriada, a preparação final de vacina continha 2,5% da formulação AMPHIGEN® e a concentração de DDA variava de 0,5 mg/dose até 2,0 mg/dose. O gel de alumínio (Rehydragel-LV) foi utilizado na concentração final de 2%. GPI-0100 foi utilizado na faixa de 2, 3 e 5 mg/dose.

Todos os componentes foram adicionados a um homogeneizador de Silverson e misturados durante 15 minutos a 10.500 rpm e então microfluidizados através da passagem por uma câmara de 200 mícrons com 68,94 MPa (10.000 psi). Quando a preparação de vacina continha hidróxido de alumínio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de alumínio. Após a microfluidização ter sido completada, o hidróxido de alumínio foi adicionado e misturado com um bastão de agitação durante a noite a 4°C.

Exemplo 13

Proteção Contra o Desafio de Leptospira Após a Vacinação Com Uma Formulação de Vacina Com Amphigen Microfluídizada Com Antígenos de Leptospira Antígenos.

Tabela 1 - Grupos de Tratamento

Grupo de tratamento	Composição de adjuvante
T01	Solução Salina
T02	Quil-A, Colesterol e a formulação AMPHIGEN® (QAC)
T03	Quil-A, Colesterol, a formulação AMPHIGEN® e AIOH (QACAIOH)
T04	DDA, Colesterol e a formulação AMPHIGEN® (DDA)
T05	DDA, Colesterol, a formulação AMPHIGEN® e AIOH (DDAAIOH)

A Tabela 1 mostra a composição das formulações adjuvantes nas preparações de vacina testadas neste estudo. As preparações de vacina foram preparadas como descrito no Exemplo 11. Havia seis animais em cada grupo. Os novilhos de corte retrocruzados com aproximadamente sete meses de idade foram utilizados neste estudo. A vacinação foi feita no Dia 0 e no Dia 21 através da rota subcutânea com um volume de vacina de 5 mL. O desafio foi feito com a cepa 203 de L. hardjo-bovis do NADC {National agricultural Disease Center). O desafio foi feito durante os Dias 57-59 com um inóculo de 1 mL. O desafio foi administrado conjuntamente nos olhos e na vagina. O material de desafio continha 5,0 X 10⁶ de leptospiras/mL. A urina foi coletada semanalmente para cultura de lepto, FA e PCR. A coleta dos rins foi feita durante os Dias 112 e 113.

Tabela 2 - Resultados do Estudo do Desafio com Leptospira

Tratamento	Porcentagem de bezerros sempre positivos para Leptospira na urina e nos rins através de cultura	Porcentagem de bezerros sempre positivos para Leptospira na urina e nos fins através de FA	Porcentagem de bezerros sempre positivos para Leptospira na urina e nos rins através de PCR	Porcentagem de bezerros sempre positivos para Leptospira na urina e nos rins ao longo de todos os ensaios
Solução salina	100	83,3	83,3	100
QAC	0	0	0	0
QAC/AIOH	0	50,0	0	50,0
DDA	0	0	0	0
DDA/AIOH	0	33,3	16,7	50,0

A Tabela 2 mostra os dados do estudo de desafio com Leptospira. Na determinação da porcentagem da infecção por Leptospira no animal desafiado, foram utilizados os critérios a seguir. Se a cultura de rim fosse positiva apenas para uma amostra, o animal era considerado positivo para Leptospira. Se um animal fosse positivo em apenas uma amostra para FA ou PCR, o animal era considerado como sendo negativo. Se a amostra fosse positiva tanto para FA quanto para PCR em apenas uma amostra, era consi41

derado positivo para Leptospira.

Os resultados mostrados na Tabela 2 indicam que havia uma duração significativamente mais curta de trato urinário em todos os grupos de vacina com base em todos os três ensaios. Até onde a colonização urinária e renal era considerada, as eficiências das formulações contendo QAC e DDA sem AIOH podiam ser comparadas. O AIOH não aumentava e até mesmo reduzia as eficiências das vacinas contendo QAC ou DDA neste es tudo de desafio.

Tabela 3 - Faixa de Títulos de Aglutinação Microscópica No Dia da Média

Geométrica do Título Máximo Antes do Desafio (Dia 35)

Tratamento	L. Hardjo	L. pomona
Solução salina	<20	<20
QAC	160-640	1280-10240
QAC/AIOH	160-2560	8--10240
DDA	40-1280	320 - 2560
DDA/AIOH	320 - 640	1280-5120

As respostas sorológicas contra ambos os antígenos de Leptospira na formulação de vacina foram detectadas no animal vacinado e a resposta máxima foi observada no Dia 35. Não havia correlação entre a resposta sorológica e a proteção contra o desafio. A presença de gel de alumínio na formulação de vacina reduzia o nível de proteção embora a resposta sorológica fosse aumentada pela presença de gel de alumínio na vacina. Exemplo 14

Ativação da Resposta Imunológica para o Antigeno Viral de BVD e Proteção Contra o Desafio com o Vírus BVD do Tipo 2 Após a Imunização Com Uma Preparação de Vacina Microfluidizada Contendo a Formulação AMPHIGEN® e DDA.

Bezerros soronegativos com quatro até sete meses de idade foram utilizados neste experimento. Havia seis grupos diferentes e cada grupo tinha dez animais (Tabela 4). No Dia 0 e no Dia 21 cada animal recebeu uma dose subcutânea da vacina de 2 mL ou de placebo na lateral do pescoço aproximadamente no meio da distância entre a escápula e a cabeça.

Tabela 4 - Grupos de Tratamento

Tratamento	Composição adjuvante
T01	Solução salina
T02	Quil-A, AMPHIGEN® formulação e Chloesterol
T03	Formulação AMPHIGEN®, Choloesterol, DDA (0,5 mg/dose) eAIOH
T04	Formulação AMPHIGEN®, Colesterol e DDA (0,5 mg/dose)
T05	Formulação AMPHIGEN®, Colesterol e DDA (1,0 mg/dose)
T06	Formulação AMPHIGEN®, Colesterol e DDA (2,0 mg/dose)

Uma dose de 5 mL da preparação viral de desafio (aproximadamente 2,5 mL por narina) foi administrada de forma intranasal no Dia 44 do estudo. O vírus BVD do Tipo 2 não citopático, isolado N° 24515 (Ellis Strain), lote N° 46325-70 foi utilizado neste estudo como a cepa de desafio. As amostras retidas do material de desafio foram tituladas (duas réplicas por titulação) no momento em que o desafio foi iniciado e imediatamente após ter sido completado. O título médio de vírus vivo por dose de 5 mL era de 5,3 log-ιο FAID₅₀/5 mL antes do desafio e de 5,4 logio FAID₅₀/5 mL após o desafio (FAID é equivalente à TCID50).

Os animais foram monitorados diariamente partindo do Dia -3 até 0 Dia 58. Os escores clínicos da doença de 0, 1, 2 ou 3, baseados nos sinais clínicos que podiam ser atribuídos à infecção pelo BVD 2 foram obtidos para cada animal nos Dias 42 até 58. Os escores no Dia 44 foram registrados antes do desafio. As amostras de sangue (dois Tubos de Separação de Soro de 13 mL, SST) foram coletadas de cada animal nos Dias 0, 21, 35, 44 e 58 para a determinação dos títulos no soro de anticorpos de neutralização do vírus BVD do Tipo 1 e BVD do Tipo 2.

As amostras de sangue foram coletadas de cada animal no Dias 42 até 0 Dia 58, inclusive e a presença do vírus BVD na célula de revestimento de coágulo foi determinada. No Dia 44, foram obtidas amostras antes do desafio.

Para a determinação das contagens de células sangüíneas brancas, as amostras de sangue (um tubo de EDTA de 4 mL) foram coleta43

das de cada animal no Dia 42 até o Dia 58, inclusive. No Dia 44, as amostras foram obtidas antes do desafio.

A leucopenia foi definida como um decréscimo de 40% ou superior na contagem de WBC partindo da linha de base (média das contagens de WBC pré-desafio partindo de dois dias antes e no dia do desafio).

Os escores clínicos da doença foram utilizados para definir o estado da doença como a seguir; se o escore for < 1, então a doença = não; se o escore for > 2, então a doença = sim.

Como mostrado nas Tabelas 5 e 6, os grupo vacinados com vacinas contendo antígenos virais de BVD junto com a formulação AMPHIGEN®, Quil A ou DDA e microfluidizados, sofreram soroconversão com títulos de neutralização significativos do vírus no soro tanto para vírus BVD do Tipo 1 quanto BVD do Tipo 2. Em tais grupos havia ainda uma redução significativa na porcentagem de animais exibindo viremia após o desafio, enquanto no grupo de controle 100% dos animais eram virêmicos (Tabela 7). Em adição, nos grupos vacinados a freqüência da doença também foi significativamente reduzida (Tabela 8). Similarmente, a porcentagem de animais exibindo leucopenia também foi reduzida nos grupos de vacina e a redução da leucopenia era mais significativa no grupo contendo DDA que no grupo contendo Quil A (Tabela 9). No grupo de controle havia uma queda significativa no ganho de peso quando comparado com os grupos vacinados. (Tabela 10) Soroloqia

Antes da vacinação no Dia 0, todos os animais no estudo eram soronegativos (SVN <1:2) em relação aos anticorpos para os vírus BVD dos Tipos 1 e 2 (dados não mostrados). Quatorze dias após a segunda vacinação (Dia 35), todos os animais que foram administrados com o placebo (T01) permaneceram soronegativos em relação aos anticorpos para os vírus BVD dos Tipos 1 e 2; e todos os animais vacinados com os ITAs (Antígeno de Teste para Investigação) (T02, T03, T04, T05 e T06) eram soropositivos (SVN >1:8) em relação aos anticorpos para os vírus BVD dos Tipos 1 e 2. Um animal que foi administrado com a vacina auxiliada com adjuvante com a formulação AMPHIGEN® a 2 mg/dose de DDA tinha um título de SVN de 3

» · em relação aos anticorpos para o vírus BVD do Tipo 2 no Dia 35 (Tabelas 11 e12).

Antes do desafio no Dia 44, todos os controles (T01), exceto um, eram soronegativos (SVN <1:2) em relação aos anticorpos para os vírus

BVD dos Tipos 1 e 2 (dados não mostrados). Um controle (N°2497) era soropositivo (SVN = 10) em relação aos anticorpos para o vírus BVD do Tipo 1 e soronegativo em relação aos anticorpos para o vírus BVD do Tipo 2. Quatorze dias após o desafio, todos os animais no estudo eram soropositivos em relação aos anticorpos para os vírus BVD dos Tipos 1 e 2.

Tabela.5, Média Geométrica dos Títulos de Neutralização Viral no Soro do Vírus BVD do Tipo 1

Tratamento	Média Geométrica dos Títulos de SVN do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo
0	21	35	44	58
T01	Solução salina	<2	<2	<2	<2	23,9
T02	Amphigen, Quil A	<2	39,1	19824,5	14018,2	27554,5
T03	Amphigen, 0.5 mg DDA, Al	<2	51,8	32204,8	22381,1	23170,4
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	<2	27,0	14512,4	8932.0	21996,2
T05	Amphigen, 1,0 mg DDA	<2	26,7	11585,2	8194,6	20882,0
T06	Amphigen, 2.0 mg DDA	<2	23.5	8778,7	6769,3	16961,1

Tabela 6. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização do Vírus no Soro do Vírus BVD do Tipo 2

Tratamento	Média Geométrica dos Títulos de SNV do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo
0	21	35	44	58
T01	Solução salina	<2	<2	<2	<2	522,0
T02	Amphigen, Quil A	<2	8,9	2272,4	2048,2	24833,6
T03	Amphigen, 0,5 mg DDA, Al	<2	9,5	3565,7	2702,2	20881,8
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	<2	4,1	1260,7	989,1	18496,2
TOS	Amphigen, 1,0 mg DDA	<2	6,4	1398,8	1453,9	30047,8
T06	Amphigen, 2,0 mg DDA	<2	7,7	1673,2	1428,9 16384,0

Tabela 7. Isolamento do Vírus BVD Após o Desafio

Tratamento	Isolamento do Vírus BVD
Nos Dias do Estudo	Freqüência (%) de Animais Virê micos	Dias de LS Médio com Viremia
T01	Solução salina	47 até 58	10/10 (100,0)	10,4
T02	Amphigen, Quil A	50 até 53	1/10(10,0)	0,4
T03	Amphigen, 0,5 mg DDA, Al	—	0/10(0,0)	0,0
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	48, 50 até 52, 57	3/10(30,0)	0,5
T05	Amphigen, 1,0 mg DDA	49 até 51	2/10(20,0)	0,4
T06	Amphigen, 2,0 mg DDA	48 até 52	2/10(20,0)	0,5

Tabela 8. Sinais Clínicos da Doença de BVD Após o Desafio

T ratamento	Freqüência (%) com Doença	Freqüência (%) de Observações com Sinal Clínico da Doença de BVD	Total Obs.
0	1	2	3
T01	Solução salina	9/10 (90,0)	75 (46)	63 (37,5)	29 (17.3)	1 (0.6)	168
T02	Amphigen, Quil A	1/10 (10,0)	105 (61,8)	63 (37,1)	2(1,2)	0(0)	170
T03	Amphigen, 0,5 mg DDA, Al	2/10 (20,0)	99 (58,2)	67 (39.4)	4 (2,4)	0(0)	170
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	0/10 (0,0)	118 (69,4)	52 (30,6)	0(0)	0(0)	170
T05	Amphigen, 1,0 mg DDA	0/10 (0,0)	101 (59,4)	69 (40,6)	0(0)	0(0)	170
T06	Amphigen, 2,0 mg DDA	0/10 (0,0)	104 (61.2)	66 (38,8)	0(0)	0(0)	170

Tabela 9. Leucopenia Após o Desafio

Tratamento	Leucopenia
Freqüência (%) de Animais Leucêmicos	Dias de LS Médio com Leucemia
T01	Solução salina	10/10(100,0)	7,8
T02	Amphigen, Quil A	6/10(60,0)	1,2
T03	Amphigen, 0,5 mg DDA, Al	2/10(20,0)	0,2
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	4/10(40,0)	0,8
T05	Amphigen, 1,0 mg DDA	3/10(30,0)	0,9
T06	Amphigen, 2,0 mg DDA	2/10(30,0)	0,5

Tabela 10. Peso Corporal e Ganho de Peso Corporal Durante o Estudo

T ratamento	Ganho de Peso Corporal Médio (kg (lb.)) no Dia do Estudo	Ganho de Peso (kg (lb))
-1	43	50	58
T01	Solução salina	378,0	484,9	491,0	476,9	98,9
T02	Amphigen, Quil A	428,0	526,5	546,7	579,0	151,0
T03	Amphigen, 0,5 mg DDA, AIOH	410,5	514,4	534,2	579,0	168,5
T04	Amphigen, 0,5 mg DDA	373,7	472,3	492,6	538,1	164,4
T05	Amphigen, 1,0 mg DDA	358,9	451,4	478,9	507,1	148,2
T06	Amphigen, 2.0 mg DDA	408,0	513,3	533,9	560,3	151,6

Isolamento Viral

Como os dados mostrados na Tabela 13, durante o período de desafio (Dias 44 até 58), todos os dez animais no controle (T01) estavam virêmicos (o vírus BVD foi isolado em um ou mais dias). Nos grupos administrados com os ITAs, a freqüência de animais virêmicos era um, zero, três, dois e dois em cada grupo de dez (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e os grupos administrados com os ITA 10 era estatisticamente significativa (P<0,05). O número de dias em mínimos

quadrados de viremia também era significativamente maior (10,4 dias) para o controle quando comparado com o dos grupos administrados com os ITAs (0,0 até 0,5 dia).

Doença Clínica

Os animais com escores de sinais clínicos de 2 ou 3 foram considerados como demonstrando sinais da doença de BVD. Como mostrado na Tabela 14, a freqüência de animais com sinais clínicos da doença do vírus BVD era de nove até dez no controle (T01) e um, dois, zero, zero e zero de dez em cada um dos grupos administrados com os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e os grupos que foram administrados com os ITAs era estatisticamente significativa (P<0,05). Leucopenia

Como mostrado na Tabela 15, durante o período de desafio (Dias 44 até 58), todos os dez animais no controle (T01) eram leucêmicos (uma redução de 40% na contagem de células sangüíneas brancas partindo da linha de base pré-desafio, Dias 42-44). A freqüência de animais com leucemia era de seis, dois, quatro, três e dois dos dez animais em cada um dos grupos administrados com os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e o grupo administrado com a vacina que era auxiliada pelo adjuvante com a formulação AMPHIGNEN® a 0,5 mg/dose e hidróxido de alumínio (T03) era estatisticamente significativa (P<0,05). O número médio em mínimos quadrados de dias de leucemia era significativamente maior (7,8 dias) para o controle quando comparado com os grupos administrados com os ITAs (0,2 até 1,2 dia).

Exemplo 15

Ativação da Resposta imunológica Para o Antígeno Viral de BVD e Proteção Contra o Desafio com o Vírus BVD do Tipo 2 Após a Imunização com a Formulação de Vacina Microfluidizada Contendo GPI-0100.

Foi seguido um conjunto de condições experimentais que são descritas no Exemplo 14 e foi feita uma comparação direta entre Quil A e GPI-0100. Como mostrado nas Tabelas 11 e 12, os animais vacinados com os antígenos BVD na preparação com base na formulação AMPHIGEN® • » » • » microfluidizada contendo Quil A ou GPI-0100 tinham um título de anticorpo significativo para ambos os vírus BVD do Tipo 1 e BVD do Tipo 2. O título de anticorpos para o vírus BVD do Tipo 1 era muito mais alto que para o vírus BVD do Tipo 2. Entretanto, o desafio subseqüente com o vírus BVD do Tipo 2 mostrou uma forte proteção e a incidência da doença foi significativamente reduzida nos bezerros vacinados com a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada contendo GPI-0100.

Tabela 11. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização do Vírus no Soro do Vírus BVD do Tipo 1

T ratamento	Média geométrica do título de SVN
0	21	35	43	57
T01	Solução salina	<2	<2	<2	<2	35,5
T02	Amphigen, Quil A	<2	98,7	20171,0	12203,4	44762,4
T03	Amphigen, 2 mg GPI- 0100, AIOH	<2	84,6	10998,5	7383,2	25709,2
T04	Amphigen, 2 mg GPI- 0100	<2	106,0	18179,2	8933,2	28526,2
T05	Amphigen, 3 mg GPI- 0100	<2	62,9	15024,3	8780,1	19824,4
T06	Amphigen, 5 mg GPI0100	<2	71,1	12203,3	7512,0	16670,2

Tabela 12, Média Geométrica dos Títulos de Neutralização do Vírus no Soro do Vírus BVD do Tipo 2

Tratamento	Média Geométrica dos Títulos de SVN do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo
0	21	35	44	58
T01	Solução salina	<2	<2	<2	<2	14.7
T02	Amphigen, Quil A	<2	12,9	2312,0	1692,5	1663,4
T03	Amphigen, 2 mg GPI0100, AIOH	<2	13,2	1663,5	1116,8	1562,3
T04	Amphigen, 2 mg GPI- 0100	<2	20,5	2610,2	1978,2	2478,7
T05	Amphigen, 3 mg GPI- 0100	<2	11,4	1752,8	1305,2	2435,4
T06	Amphigen, 5 mg GPI- 0100	<2	12,0	3158,4	2120,2	1845,6

Tabela 13. Isolamento do Vírus BVD Após o Desafio

Tratamento	Isolamento do Vírus BVD
Frequência (%) de Animais Virêmicos	Dias de LS Médio com Viremia
T01	Solução salina	10/10(100,0)	8,4
T02	Amphigen, Quil A	3/10(30,0)	0,3
T03	Amphigen, 2 mg GPI-0100, AIOH	0/10 (0,0)	0,0
T04	Amphigen, 2 mg GPI-0100	1/10(10,0)	0,1
T05	Amphigen, 3 mg GPI-0100	3/10(30,0)	0,3
T06	Amphigen, 5 mg GPI-0100	2/10 (20,0)	0,2

Tabela 14. Sinais Clínicos da Doença de BVD Após o Desafio

Tratamento	Frequência (%) com Doença	Freqüência (%) de Observações com Escore Clínico da Doença de	Total Obs.
0	1	2
T01	Solução salina	5/10 (50,0)	103 (60,6)	55 (32,4)	12 (7,1)	170
T02	Amphigen, Quil A	5/10 (50,0)	115 (67,6)	48 (28,2)	7(4,1)	170
T03	Amphigen, 2 mg GPI-0100, AIOH	0/10(0,0)	128 (75,3)	42 (24,7)	0(0)	170
T04	Amphigen, 2 mg GPI-0100	0/10(0,0)	124 (72,9)	46 (27,1)	0(0)	170
T05	Amphigen, 3 mg GPI-0100	0/10(0,0)	104 (61,2)	66 (38,8)	0(0)	170
T06	Amphigen, 5 mg GPI-0100	0/10(0,0)	128 (75,3)	42 (24,7)	0(0)	170

6\ • ·

Tabela 15. Leucopenia Após o Desafio

Tratamento	Leucopenia
Freqüência (%) de Animais Leucopênicos	Dias de LS Médio com Leucopenia
T01	Solução salina	9/10(90,0)	8,7
T02	Quil A	6/10(60,0)	1,6
T03	2 mg GPI-0100, AIOH	7/10(70,0)	2,6
T04	2 mg GPI-0100	4/10(40,0)	1,5
T05	3 mg GPI-0100	7/10(70,0)	2,6
T06	5 mg GPI-0100	8/10(80,0)	2,9

Em conclusão, a segurança de cada vacina foi demonstrada através da ausência de reações adversas ou de mortalidade nos animais vacinados. A potência de cada vacina foi demonstrada através da soroconver são (títulos de anticorpos SVN para BVD-1 e BVD-2 >1:8) em 100% dos animais vacinados. A resistência satisfatória ao desafio foi demonstrada pela vacina auxiliada por adjuvante apenas com 2 mg de GPI-0100.

Exemplo 16

Preparação de Vacina Contendo Antígeno Microencapsulado em Emulsão de Óleo-Em-Água Microfluidizada

Três gramas de Trealose (Fluka) foram adicionados na água para produzir um estoque de solução de Trealose a 333 mg/mL. O antígeno PauA recombinante solubilizado em solução de SDS a 0,8% (SDS/rPauA) foi adicionado à solução de Trealose para a obtenção de uma concentração final de 494 pg de rPauA/mL. Na etapa seguinte 10 gramas do ácido polilactídeo glicólico (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) foram dissolvidos em 200 mL de Cloreto de Metileno (MeClz). A solução de PLG/MeCb resultante foi combinada com a solução de SDS-rPauA/trealose preparada na primeira etapa. A solução combinada foi submetida à microfluidização utilizando (Microfluidizador da Microfluidics Modelo M110EH) e a preparação microfluidizada foi seca por spray utilizando (Temco Spray Dryer Modelo SD-05). O material seco por spray foi coletado utilizando uma tela de 500 mícrons.

A concentração de rPauA neste material seco por spray foi <òSb quantificada utilizando uma análise de Western blot. 1,04 mg do material seco por spray foi dissolvido em 50 μΙ_ de acetona e centrifugado a 13.200 rpm à temperatura ambiente durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido. As frações de péletes do sobrenadante foram secas em uma capela de segurança biológica durante 2,5 horas. O pélete foi ressuspenso em 47,43 μΙ_ de solução de amostra (25 μΙ_ de tampão de amostra + 10 μ!_ de agente redutor + 65 pL de água). A fração do sobrenadante seco foi ressuspensa com 20 pL de solução de amostra. Na análise de western o PauA purificado foi utilizado como um padrão para quantificar o conteúdo de rPauA do material seco por spray.

Uma solução estoque de Manitol a 20% foi preparada através da dissolução de 100 gramas de manitol (Sigma) em 500 mL de Água para Injeção (WFI). A solução foi aquecida a 40°C com placa de aquecimento/agitador e resfriada a 30°C. A solução foi esterilizada por filtração através de um filtro esterilizado de 0,22 mícron (Millipore). Uma solução a 2,5% de Carboximetilcelulose foi preparada através da dissolução de 12,5 gramas de carboximetilcelulose (Sigma) em 500 mL de WFI e misturada durante a noite a 4°C. A solução foi autoclavada a 121°C.

O pó resultante da secagem por spray foi reconstituído em uma solução contendo 5% de manitol, 0,3% de carboximetil celulose e 1:5000 de timerosol. A solução final foi aliquotada em frascos de 3 mL e liofilizada utilizando um Liofilizador (USIFROID). O pó liofilizado representa o rPauA microencapsulado. O antígeno de proteína de subunidade microencapsulado é ressuspenso em 2 mL de emulsão de óleo-em-água microfluidizada contendo uma formulação AMPHIGEN® (tal como a emulsão microfluidizada descrita no Exemplo 20) e utilizado como uma vacina.

Exemplo 17

Preparação da Formulação de Vacina microfluidizada Contendo Tanto o Antígeno de Célula Total Bacteriana Quanto o Antígeno de Proteína Recombinante em Emulsão de Óleo-Em-Água

Foram feitas duas preparações de vacina contendo tanto a proteína PauA recombinante de Streptococcus uberís quanto as células bacteri52

• ··· · · ·· · ♦ ♦ • · · · · · · · · · · _ • · ·· ······ · · ·· • · ··· ········ ·«···· ♦·♦···♦ • · · · · · · · anas de Escherichia coli, adicionadas intrinsicamente às emulsões de óleoem-água como descrito nos Exemplos 2 e 3. O antígeno PauA recombinante estava na concentração de 100 μg por dose e as células de E. coli estavam na contagem final de 4 X 10⁹ por dose. As composições adjuvantes de emulsão das duas formulações de vacina são mostradas na Tabela 16.

Tabela 16 Formulações de vacina contendo tanto a proteína recombinante quanto as células totais de E. coli.

Tratamento	Antígeno	Adjuvante
T01	Placebo	Solução salina
T02	Pau A/E. coli	SEAM-14
T03	Pau A/E. coli	2,5% de Amphigen, 0,5 mg de GPI-0100, 0,5 mg de colesterol
T04	Pau A/E. coli	2,5% de Amphigen, 0,5 mg de brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), 0,5 mg de colesterol

Exemplo 18

Resposta Imunológica à Vacina Microfluidizada Contendo o rPauA e os Agentes Bacterianos de Células Totais em Emulsão de Óleo-Em-Água

Foram utilizadas neste experimento vacas de leite maduras. Os animais estavam no final de sua primeira ou segunda lactação no momento do envolvimento. Dois mL de cada formulação de vacina foram administrados subcutaneamente três vezes, uma vez no momento da ordenha (D-0), 28 dias depois (D=28) e novamente 4 até 10 dias após o nascimento do bezerro (C+4 - C+10). A primeira e a terceira doses foram administradas do lado esquerdo do pescoço e a segunda dose foi administrada do lado direito do pescoço. O sangue foi coletado antes de cada vacinação e aproximadamente 14 dias e 32 dias após a terceira vacinação. O título de anticorpos para E. coli e para o antígeno rPauA foi determinado por ELISA. Como mostrado na figura 8, os resultados indicam que o título de anticorpos para rPauA era maior no grupo vacinado com a formulação de vacina contendo GPI-0100 como um imunoestimulante e era máximo no dia 70 após a vacinação inicial. O título de anticorpos para o antígeno de E. coli é mostrado na

figura 9. O titulo de anticorpos para o antígeno de E. coli podia ser comparado em ambas as formulações de vacina, embora a presença de GPI-0100 como um imunoestimulante induzisse um título de anticorpos relativamente maior quando comparado com o da formulação com DDA como um imuno estimulante.

Exemplo 19

Análise da Atividade Viricida das Preparações de Vacina Com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizadas

A fim de determinar se a microfluidização inativa o vírus, foi determinada a atividade viricida de três preparações de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizadas. As três preparações continham três vírus infecciosos bovinos diferentes, a saber, o vírus da herpes bovina (BHV), o vírus parainfluenza 3 (PI3) e o vírus sincicial respiratório bovino (BRSV).

A detecção da atividade viricida nas três preparações de vacina foi realizada de acordo com os requerimentos da USDA 9CFR.113.35.

Os resultados mostrados na Tabela 16 indicam que a microfluidização das preparações de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não causa qualquer inativação significativa da preparação de vacina.

Tabela 16. Análise das Atividades Viricidas das Vacinas Microfluidizadas

Série	BRSV	BHV	PI3
A	0	0,2	0
AM200	-0,2	0	-0,2
AM75	0	-0,3	-0,3
AM75@37C	0,1	-0,3	-0,2
B	0	-0,1	-0,2
BM200	0	0	-0,2
BM75	-0,2	-0,5	0
BM75@37C	0,5	-0,5	0
C	0,1	-0,1	-0,2
CM200	-0,2	-0,1	-0,2
CM75	0,1	0,5	-0,2
CM75@37C	0,5	0,5	-0,2

• * • · « ·

• · • · ·· • · • V

A = Colesterol adicionado a 650 mL/min

B = Colesterol adicionado a 28 mL/mim

C = Colesterol adicionado a 5 mL/min

M200 = Microfluidizado com tela de 200 mícrons

M75 = Microfluidizado com tela de 75 mícrons

M75@37C = Fluidos aquecidos a 37°C antes da microfluidização

Um valor acima de 0,7 é um indicativo de efeito viricida.

Exemplo 20

Preparação de uma Formulação AMPHIGEN® Microfluidizada

Uma formulação AMPHIGEN® foi preparada através da combinação da solução oleosa de lecitina Drakeol (óleo mineral leve com 25% de lecitina) e TWEEN 80 (com a concentração final de 0,18%) e Span 80 (com a concentração final de 0,08%) com mistura durante 8-22 horas a 36 ± 1°C. A mistura oleosa foi então adicionada á solução salina com o auxílio de um emulsificante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm. Subseqüentemente, a mistura foi passada uma vez através de um microfluidizador com uma câmara de interação de 200 pm a 31,02 + 3,44 MPa (4500 ± 500 psi). As figuras 10 A e 10B mostram a estabilidade da formulação AMPHIGEN® microfluidizada. A distribuição do tamanho de partícula, que é medido pela difração a laser, no início, ponto de tempo inicial (figura 10A), era quase idêntica à distribuição do tamanho de partícula após 22 meses de armazenamento a 4°C (figura 10B).

Exemplo 21

Análise por Microscopia Eletrônica do Complexo Imunológico Quil A - Colesterol

A fim de determinar a natureza do complexo imunogênico formado por Quil A e colesterol, uma mistura destes dois componentes foi feita na presença ou na ausência de antígeno.

Em um béquer contendo 50 mL de tampão KR-Hals, o antígeno de BVD do Tipo I foi adicionado durante a agitação da solução com um bastão magnético. Depois disso, uma solução concentrada de Quil A (50 mg/mL) foi adicionada em gotas durante a agitação da solução para atingir ¢6

uma concentração final de 50 pg/mL. A adição de Quil A foi seguida pela adição de uma solução estoque de colesterol em etanol (18 mg/mL) até a concentração final de 50 pg/ml.

Em um segundo béquer, o Quil A e o colesterol foram adicionados da mesma maneira ao tampão de 50 mL sem qualquer antígeno de BVD do Tipo I.

Para a microscopia eletrônica de transmissão, 10 pL de cada amostra foram adsorvidos em grades de cobre de mescla 400 com uma plataforma de suporte de formvar/carbono (Electron Microscopy Sciences, Inc., Fort Washington, PA). As amostras foram coradas negativamente utilizando 10 pL de ácido fosfotúngstico a 2% filtrado, pH 5,2 como um agente de contraste. As amostras foram verificadas utilizando um Microscópio Elétrico de Transmissão JEOL 1230 (JEOL Inc., Tóquio, Japão) a uma voltagem de aceleração de 80 kV. A obtenção da imagem digital foi realizada em uma câmera Gatan BioScan 792. A microscopia do filme foi feita em um filme 4489 EM e impressa no papel Kodabrome II RC F3 (Eastman Kodak Company, Rochester, NY.).

Na solução contendo apenas colesterol e Quil A sem qualquer antígeno de BVD do Tipo I, foram detectadas micelas em hélice junto das micelas de Quil A e os cristais de colesterol (figura 11). As micelas em hélice estavam entremeadas e apareciam na forma de uma mescla. Na amostra contendo o antígeno de BVD do tipo I, foi descoberto que as micelas em hélice circundavam aleatoriamente certas áreas densas (figura 12). As áreas densas representam o antígeno de BVD do Tipo 1 e foi descoberto que o complexo imunogênico em hélice resultante da associação de Quil A e colesterol era adsorvido na superfície do antígeno de BVD do Tipo I antígeno.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um glicosídeo de saponina, um esterol e um antígeno, em que o dito glicosídeo de saponina e o dito esterol se associam um com o outro para formar complexos na forma de micelas em hélice e em que o dito antígeno está em mistura com, mas não integrado às ditas micelas em hélice.

2. Composição de vacina como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo aceitável na veterinária.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito veículo aceitável na veterinária é uma emulsão de óleo-em-água.

4. Composição de vacina como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito glicosídeo de saponina é um triterpenóide.

5. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito triterpenóide é Quil A.

6. Composição de vacina como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito esterol é colesterol.

7. Composição de vacina como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno compreende um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou uma combinação dos mesmos.

8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno compreende um antígeno de BVDV do tipo 1 ou do tipo 2.