TWI301067B

TWI301067B - Microfluidized oil-in-water emulsions and vaccine compositions

Info

Publication number: TWI301067B
Application number: TW94110524A
Authority: TW
Inventors: Paul Joseph Dominowski; Pamela Kay Klose; Richard Lee Krebs; Ramasamy Mannar Mannan
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2004-04-05
Filing date: 2005-04-01
Publication date: 2008-09-21
Also published as: NO341034B1; PL1742659T3; KR101143060B1; NZ550152A; US20050220814A1; KR20090007497A; AU2005230708A1; CA2561914A1; CN1997390B; EP1742659A1; AR048822A1; KR20090051129A; EP1742659B1; JP2011168605A; EP2269644A3; KR20080073376A; RU2006135121A; TW200600108A; JP2007531790A; RU2347586C2

Description

1301067 (1) 九、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明槪括地有關疫苗領域且特別者，有關佐物用以增強獸醫學動物的免疫回應。特別者，本發關次微米水包油乳化液作爲疫苗佐劑以增強抗原的性之用途。本發明提供次微米水包油乳化液調合物經摻加到此等乳化液中的抗原之疫苗組成物，以及乳化液與疫苗之方法。本發明也提供適合用於疫苗有由植物皂素糖苷和固醇所形成的複合物之組成物【先前技術】細菌、病毒、寄生蟲和微漿菌感染廣布於獸醫例如牛、豬和倍伴動物之中。由此等感染劑所引起常會抗拒抗微生物性藥學治療，而無有效的治療手此之故，正逐增地使用疫苗學作法來控制獸醫學動染病。一完整的傳染病原可在化學抑活化或恰當的縱之後變成適合用於疫苗調合物中。或者，可在重系統內表現該病原所含蛋白質亞單元且予以純化而苗調合物中。佐劑通常指可增加對抗原的體液及/或細胞免之任何物質。傳統疫苗係由被殺死的病原性微生物備物所構成，而與病理學性微生物的培養物相關聯可能作爲佐劑以增強免疫回應。不過，在使用病理物或經純化的蛋白質亞單元之均質製備物作爲疫苗劑調合明係有免疫原，包含製備該中，含學動物的疾病段。因物的傳基因操組表現用於疫疫回應之粗製的雜質學微生接種所 -5- (2) 1301067 用的抗原時，由此等抗原所引發的免疫性係不良者，因而有需要添加某些外源物質作爲佐劑。另外，合成型與亞單元型疫苗生產起來都是昂貴者。所以，藉助佐劑之下，可以需要較少劑量的抗原來刺激免疫回應，由是節省疫苗的生產成本。佐劑係已知有多種不同作用方式來增強免疫回應。許多種疫苗可改變與免疫回應相關聯的細胞介質網路。此等免疫調制性佐劑可在即使不與抗原一起之下施發彼等的效應。通常，免疫調制性佐劑會引起某些細胞介素的一般向上調節及其他細胞介素的同時向下調節，導致細胞Th 1及 /或體液Th2回應。某些佐劑具有保存抗原的構型整體性之能力使得該抗原可以有效地呈現給恰當的免疫效應細胞。由於此種由佐劑調合物保持抗原構型的結果，疫苗具有增長的存放期，例如由免疫刺激性複合物（ISCOMs )所顯示者。Ozel M·， et. al.; Quarternary Structure of the Immunestimmulating Complex ( Iscom ) ，J. of Ultrastruc. and Molec. S true. Res. 1 02, 240 - 248 ( 1 989 )。某些佐劑具有將抗原以積貯體（depot )形式保留在注射部位之性質。由於此積貯體的結果，抗原不會被肝廓清所迅速減失掉。鋁鹽和油包水乳液係透過此種積貯效應可作用較短的持續期。例如，可以使用呈油包水乳液的胡氏（Freund’s )完全佐劑（FCA )得到長期積貯。FCA典型地保留在注射部位直到生物降解促使抗原呈現細胞移除 -6- (3) Ι3Θ1067 抗原爲止。根據彼等的物理本質，佐劑可經分成兩非常廣的類別，亦即粒狀佐劑和非粒狀佐劑。粒狀佐劑係以微粒子形式存在。免疫原可與微粒子摻組成締合。鋁鹽、油包水乳液、水包由乳液、免疫刺激性複合物、微脂粒、及奈米-和微米粒子都是粒狀佐劑之例子。非粒狀佐劑通常都是免疫調制劑且彼等通常與粒狀佐劑配合使用。胞壁醯基二肽（一種由分枝菌（Mycobacteria )萃取出的肽聚醣之佐劑活性成分）、非離子性嵌段共聚物、植物皂素（從皂樹（ Quillaja saponaria)的樹皮萃取到之複雜類三萜混合物）、脂質A( —種葡萄糖胺二醣類，具有兩個磷酸基及5或6 個長度通常爲C12至C16的脂肪酸鏈）、細胞介素、醣聚合物、衍化多醣、和細菌毒素例如霍亂弧菌毒素與大腸桿菌（E. coli)易變毒素（LT)都是非粒狀佐劑之例子。某些最熟悉的佐劑爲非粒狀免疫調制劑與可賦與佐劑調合物積貯效應的粒狀材料之組合。例如，FCA即結合著結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)成分所具免疫調制性質與油乳液的短期積貯效應。油乳液被用爲疫苗佐劑已有長時間。Le Moignic和 Pinoy在1916年發現經殺死的傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium )在礦油中的懸浮液會增加免疫回應。隨後於1 925年，Ramon述及澱粉油作爲一種可增強對白喉類毒素（d i p h e r i a t ο X 〇 i d )的抗毒性回應之物質。不過，直到 1 93 7年，胡氏與其如今稱爲胡氏完全佐劑（FCA)出現爲

(4) 1301067 止，油乳液並未普遍使用。FCA爲一種礦油（石蠟油）混合經殺死的分枝菌和A r 1 a c e 1 A所構成的油包水乳液。 Arlacel A主要爲甘露糖醇—油酸酯且係用爲乳化劑。雖然 FC A可優良地誘發抗體回應，不過其會引起嚴重的疼痛，形成膿瘡、發熱與肉芽腫性發炎。爲了避免此等不良副反應，乃有發展出不完全性Freund’s佐劑（IFA ) 。IFA在組成上類似FCA，差別在於不含分枝菌成分。IFA係透過將調合物積貯在注射部位及經由刺激抗體產生性細胞減緩抗原釋出而作用。改良FCA的另一種作法係基於用生物相容性油替換礦油有助於消除與FCA在注射部位相關的反應之槪念。此外也相信該乳液應該爲水包油而非油包水，因爲後者會在注射部位產生長持續性積貯之故。Hilleman et al.，述及以油爲基質的佐劑 ''佐劑65 〃，包括86 %的花生油，10 % Arlacel A作爲乳化劑及4 % —硬脂酸鋁作爲安定劑。 Hilleman， 1 966， Prog. Med. Virol. 8 ： 131 — 1 83 ；

Hilleman and Beale，1 9 8 3 in New Approaches to Vaccine Development ( Eds. Bell， R. and Torrigiani， G.) ，

Schwabe，Basel。於人體內，佐劑65係安全有力者，但展現出比IFA較低的佐劑性。然而，佐劑65的使用仍終止，原因在於當使用經純化或合成的乳化劑取代Arlacel A之時，某些批疫苗會對人類產生反應原性（r e a c t 〇 g e n i c i t y )且減佐劑性。美國專利5,7 1 8,904和5,690,942都提及水包油乳液中的礦油可用可代謝性油取代以用於改良安全性型態 -8- (5) (5)•1301067 之目的。除了佐劑性與安全性之外，乳液的物理表觀也是一項重要的商業考慮。物理表觀取決於乳液的穩定性。乳皮化，沈著與聚結都是乳液不穩定性之指標。當乳液的油相和水相各具不同的比重時即發生乳皮化。當乳液的初始液滴尺寸爲大者且乳液液滴不具任何Brownian運動時也會發生乳皮化。當液滴尺寸大時，會有介面破裂之傾向且液滴會聚結成爲大粒子。乳液的不穩定性係由許多因素決定。例如所用乳化劑的本質和量，乳液所含液滴的尺寸，及在油相與水相之間的密度差異。乳化劑係經由減低介面自由能及對液滴聚結造出物理或靜電性障壁而促進分散液滴之穩定化。已有使用非離子性和離子性清潔劑（detergent )作爲乳化劑者。非離子性乳化劑係定位於介面且產生相當龐大的構造，導致分散液滴的立體避開。陰離子性或陽離子性乳化劑會經由吸引抗衡離子而誘發電雙層的形成；雙層排斥力會促使液滴在趨近時彼此排斥開。除了使用乳化劑之外，也可以透過使用機械手段減低乳液的乳滴尺寸而達到乳液的穩定性。典型地，已有使用葉輪混合器、渦輪轉子、膠體磨機、勻化器、和超音波處理器來製造乳液。微流化爲增加乳液中的液滴尺寸均一性之另一種方式。微流化可產生具有次微米範圍內的一致粒子尺寸之優美，物理穩定性乳液。除了增加乳液的穩定性之外，微流化方法可容許終端過濾，此爲確保最後產品的 -9 - (6) 1301067 無菌性之較佳方法。再者，次微米油粒子可以通過注射部位進入淋巴管，然後到洩液鏈的淋巴結、血液和脾。此可減低可能產生局部發炎和明顯注射部位反應的在注射部位建立油性積貯之可能性。微流化器爲如今可從商業上取用者。放微流化器內，需兩流化液流在交互作用室內以高速度交互作用時即發生乳液形成。微流化器係空氣或氮氣驅動者且可於超過 _ 20,000 ?3丨的內部壓力下操作。美國專利4,908，154提及使用微流化器獲得基本上不含任何乳化劑之乳液。文獻中業經述及許多種次微米水包油佐劑調合物。美國專利 5,376,369述及稱爲 Syntax Adjuvant Formulation ( SAF )的次微米水包油乳液佐劑調合物。SAF含有角鯊烯或角鯊烷作爲油成分，乳液形成性量的Pluronic L121 (聚氫化丙烯-聚氧化乙烯）嵌段共聚物及免疫強化性量的胞壁醯基二肽。角鯊烯爲在許多組織，特別顯著者爲在鯊魚 φ 和其他魚類的肝中，出現的膽固醇之線形烴先質。角鯊烷係經由將角鯊烯氫化製成且爲完全飽和者。角鯊烯和角鯊烷兩者都可代謝且具有良好的毒物學硏究記錄。角鯊烯或角鯊烷乳液業經用於人類癌疫苗中，具有溫和副作用且有合宜的效力。參看，例如，Anthony C· Allison，1 999, S qualene and Squalane emulsion as adjuvants，Methods 19 :87 — 93。美國專利6,299,844和國際專利公報WO 90/l 483 7提及聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物不是次微米水包、油乳 -10- (7) 1301067 液形成所必要者。再者，此等參考資料提及無毒性，可代謝性油且使用且明確地排除礦油和毒性石油蒸餾油在彼等的乳油調合物中之使用。美國專利5,961，970提及要用爲疫苗佐劑的又另一種次微米水包油乳液。於此專利中所述的乳液中，疏水性成分係選自由中鏈甘油三酸酯油、植物油和彼等的混合物所構成的群組之中。此乳液所包括的界面活性劑可爲天然生物相容性界面活性劑例如磷脂質（如卵磷脂）或藥學上可接受之非天然界面活性劑例如TWEEN - 80。此專利也提及在形成乳液之時將抗原摻加到乳液內，而非在乳液經獨立且外在地形成之後才將抗原與乳液混合。美國專利5,0 84,269述及含有卵磷脂與礦油的組合之佐劑調合物會促成宿主動物體內刺激之減低且同時可誘發增加的系統免疫性。從美國專利5,084,269所得的佐劑調合物在商業上用於商品名AMPHIGEN ®之下的獸醫用疫苗之中。該AMPHIGEN ®係由爲卵磷脂所包圍的微團—油液滴所構成。此等微團可使比傳統以油爲基質的佐劑更多的完整細胞抗原接著。再者，以AMPHIGEN ®爲基質的疫苗調合物含有2.5至5%礦油之低油含量，相對地，其他含油佐劑的疫苗調合物典型地含有從10%至20%之油。其低油含量使此種以佐劑爲基質之疫苗調合物對於注射部位的組織有較低的刺激性，導致較少病變及在屠宰時較少的修整。此外，包圍油液滴的卵磷脂包覆層會進一步減低注射部位反應，導致既安全又有效力之疫苗。 -11 - (8) (8)1301067 AMPHIGEN ®調合物係在許多獸醫學疫苗中用爲佐齊ί 且在短和長期貯存期間以及重調時都需要保持疫苗產品的物理外觀。此外，係在注射之前刻之將經冷凍乾燥的抗原與預先製成的佐劑調合物混合。此種作法不能總是確保抗原在水包油乳液中有均勻的分布且乳液的外觀可能不適宜。再者，於靜置之後，經勻化的乳液可能顯示出相分離現象。所以，對於在長存放期後不會顯示出相分離現象的穩定性佐劑調合物有其需要存在著。一種防止相分離的方法爲減低液滴尺寸及增加乳液的粒子均勻性。雖然以可代謝性油爲基底的乳液調合物之微流化方法已有記載，水包油乳液例如AMPHIGEN ®調合物的微流化則尙未進行過。於本發明中，係使用微流化使卵磷脂包圍的礦油液滴所具尺寸變成次微米尺寸。意外地，本案發明人發現使用卵磷脂和油的混合物所構成的水包油乳液佐助之疫苗調合物經微流化後不僅可改良調合物的物理外觀，而且可增強調合物的免疫化效應。微流化調合物也具有改良的安全性型態之特徵。【發明內容】本案發明人意外地發現以非可代謝性油爲基底的水包油乳液所具佐劑活性和安全性型態可透過微流化而改進。摻加到經微流化乳液中的抗原即使是該抗原在微流化之前就已內在地摻加在該乳液內，也具穩定性。綜上所述，於一具體實例中，本發明提供可用爲疫苗

-12- (9) 1301067 佐劑的次微米水包油乳液調合物。本發明次微米水包油乳化液係由非可代謝性油，至少一種界面活性劑，和一水性成分所構成，此處該油係經分散在該水性成分內而具有在次微米範圍內的平均油滴尺寸。較佳的非可代謝性油爲輕質礦油較佳的界面活性劑包括卵磷脂、TWEEN ® - 80和 SPAN ® - 80。由本發明提供的較佳水包油乳化液係包括 | AMPHIGEN ® 調合物。本發明水包油乳化液可包括恰當且合宜的加添成分，包括防腐劑、滲透劑、生物黏著性分子、和免疫調制性分子。較佳的免疫調制性分子包括，例如，Quil A、膽固醇、GPI - 0100、溴化二甲基二（十八烷基）銨（DDA)。於另一具體實例中，本發明提供製備次微米水包油乳化液之方法。根據本發明，係將乳液的各種成分，包括油，一或多種界面活性劑、水性成分和適用於乳液中的任何 φ 其他適當成分，混合在一起。對該混合物施以初步乳化程序以形成水包油乳液，然後將其通過微流化器以得到直徑小於1微米的液滴，較佳者平均液滴尺寸小於0.5微米，之水包油乳液。於又另一具體實例中，本發明提供疫苗組成物，其含一抗原和一上述次微米水包油乳液。該抗原係經由外在地或內在地，較佳者爲內在地摻加到該乳液之內。可以包括在本發明疫苗組成物內的抗原可爲細菌、真菌、或病毒抗原、或彼等的組合。該抗原可採經抑活化的 -13- (10) 1301067 完整或部份細胞或病毒製備物之形式，或採經由習用蛋白質純化，遺傳工程技術或化學合成所得抗原性分子之形式〇於另一具體實例中，本發明提供製備疫苗組成物之方法，該疫苗組成物含有一抗原或多種抗原組合著次微米水包油乳液。於製備本發明疫苗組成物之中，抗原可經內在地（例如，在微流化之前）或外在地（例如，微流化之後）與該水包油乳液的成分混配。較佳地，該抗原係與該水泡油乳液的成分內在地混配。於又另一具體實例中，本發明提供疫苗組成物，其包含經微封裝的抗原與上述次微米水包油乳液，此處該微封裝抗原係與該乳液外在地混配。令人訝異地發現，植物皂素與固醇，在溶液中混配之時，會彼此締合形成螺旋微團形式之複合物。根據本發明，此等螺旋微團複合物具有免疫刺激活性且特別可用在疫苗組成物中作爲佐劑。綜上所述，本發明提供含有植物皂素和固醇之疫苗組成物，其中該植物皂素和固醇形成呈螺旋微團形式之複合物。本發明也提供包含植物皂素、固醇和抗原之組成物，其中該植物皂素和該固醇形成呈螺旋微團形式之複合物，且其中該抗原係經與該螺旋微團摻合而非摻加到其內部。【實施方式】 -14- ⑧ (11) (11)1301067 發明詳細說明本案發明人意外地發現使用由卵磷脂和礦油的混合物所構成的水包油乳液佐輔的疫苗調合物經微流化後不僅可改進該疫苗調合物的外觀，而且可增強疫苗調合物的免疫化效用。微流化疫苗調合物也具有改進的安全性型態之特徵。根據此等發現，本發明提供可用在疫苗組成物中作爲佐劑之次微米水包油乳液。此外，也提供使用微流化器製造此等次微米水包油乳液之方法。再者，本發明提供次微米疫苗組成物，其中係將抗原與次微米水包油乳化液混配。也提供製造此等疫苗組成物之方法。本發明進一步提供含有與次微米水包油乳液混配的微封裝抗原之疫苗組成物及製造此等疫苗之方法。爲了揭示清晰起見，而非加以限制地，將本發明詳細說明部份成分下面數段，各說明或講解本發明某些特徵，具體實例或應用。次微米水包油乳化液於一具體實例中，本發明提供可用爲疫苗佐劑的次微米水包油乳液。本發明次微米水包油乳液可增強疫苗組成物中的抗原之免疫原性，可安全地投予動物且在貯存中具穩定性。本發明次微米水包油乳液係由不可代謝性油’至少一種界面活性劑，與水性成分所構成，此處該油係經分散在 ⑧ (12) (12)•1301067 水性成分中，具有在次微米範圍內的平均油滴尺寸。〜次微米〃意指液滴具有小於1微米的尺寸且平均油滴尺寸爲小於1微米。較佳者，該乳液的平均液滴尺寸爲小於〇 . 8微米；更佳者，小於0.8微米，且甚至更佳者，小於0.4微米，或約0.1 - 0.3微米。 ''平均液滴尺寸〃係經定義爲在一體積粒子尺寸分布內的體積平均直徑（VMD )粒子尺寸。VMD係經由將每一粒子直徑乘以該尺寸的所有粒子之體積後總和起來而計算的。然後將此和除以所有粒子的總體積。術語 > 非可代謝性油〃於用於本文中時係指不能被要投予乳液的動物受驗者身體所代謝之油。術語a動物〃和 > 動物受驗者〃於用於本文中係指所有非人類動物，包括例如，牛、綿羊、和豬。適用於本發明乳液中的非可代謝性油類包括烷類、烯類、炔類、和彼等的相應酸類和醇類，彼等的醚類和酯類，及彼等的混合物。較佳者，該油的個別化合物爲輕質烴化合物，亦即此等化合物具有6至30個碳原子。該油可經合成製備或從石油產品純化出。要用於本發明乳液中的較佳非可代謝性油包括例如，礦油、石蠟油、和環烷類。術語''礦油〃指的是從石油經由蒸餾技術得到的液體烴類混合物。該術語與''液化石蠟〃、 ''液體石鱲脂〃和 ''白礦油〃同義。該術語也意欲包括〜輕質礦油〃，亦即經由石蠟脂的蒸餾類似地得到，但具有比白礦油稍微較低的比重之油。參看，例如，Remington’s Pharmaceutical •16- ⑧ (13) (13)_1301067

Sciences， 18 th Editon ( Easton, Pa·: Mack Publishing Company，1990，pages 788 and 1323)。礦油可得自多個商業來源，例如 J. Τ· Baker ( Phillipsburg，PA ) 、USB

Corporation ( Cleveland, OH )。較佳的礦油爲可在商業上於名稱DRAKEOL ®之下取得之輕質礦油。典型地，本發明次微米乳液的油成分之含量爲從1至 50體積％ ;較佳者，其含量爲10至45體積％ ;更佳者，其含量爲從20至40體積％。本發明水包油乳液典型地包括至少一種（亦即，一或更多種）界面活性劑。界面活性劑和乳化劑，兩術語於本文中可互換地使用，爲可將油滴表面穩定化且將油滴保持在合意尺寸內之藥劑。適用於本發明乳液中的界面活性劑包括天然生物可相容的界面活性劑和非天然合成界面活性劑。生物相容性界面活性劑包括磷脂質化合物或磷脂質混合物。較佳的磷脂質爲磷脂醯膽鹼（卵磷脂），例如大豆或蛋的卵磷脂。卵磷脂可經由水洗粗植物油及分離和乾燥所得水合膠而得到磷脂和甘油三酸酯的混合物。精製產品可經由用丙酮洗滌該混合物移除甘油三酸酐和植物油後分部分離所留下的丙酮不溶性磷脂質和糖脂質而得。或者，可從多種商業來源取得卵磷脂。其他適當的磷脂質包括磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、心磷脂、和磷脂醯乙醇胺。磷脂可從天然來源離析出或以習用方式合成。適用於本發明次微米乳液中的非天然、合成型界面活 -17- ⑧ (14) (14)1301067 性劑包括以山梨糖醇酐爲基底的非離子界面活性劑，如經脂肪酸取代的山梨糖醇界面活性劑（可在商業上於 SPAN ®或ARLACEL ®名下取得）、聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯（TWEEN ® )，來自諸如箆麻油等來源的脂肪酸之聚乙二醇酯（EMULFOR ):聚乙氧基化脂肪酸（例如，可在SIMULSOL M — 53名下得到的硬脂酸）、聚乙氧基化異辛基苯酚/甲醛聚合物（TYLOXAPOL)、聚氧化乙烯脂肪醇醚類（BRIJ ®);聚氧化乙烯壬苯基醚（ TRITON®);聚氧化乙烯異辛基苯基醚（TRITON ® X ) 。較佳的合成型界面活性劑爲可在SPAN ®和TWEEN ®名下取得之界面活性劑。可用於本發明水包油乳液中的較佳界面活性劑包括卵碟脂、Tween — 80 和 SPAN — 80。一般而言，界面活性劑、或有用到二或更多種界面活性劑時，界面活性劑的組合，在乳液中的含量爲0 · 0 1至1 0 體積％，較佳者，0.1至6·0體積％，更佳者〇·2至5·0體積 %。水性成分係構成乳液的連續相且可爲水、緩衝食鹽水或任何其他適當的水溶液。本發明水包油乳液可包括恰當且合宜的加添成分’包括防腐劑、滲透劑、生物黏著性分子 '和免疫刺激性分子〇生物黏著性分子經認爲可增強抗原在目標黏膜表面之上或通過黏膜之輸送與接著而賦與黏膜免疫性。適當的生 -18- (15) 1301067 物黏著性分子之例子包括酸性非天然發生的聚合物例如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸（如，CARBOPOL®，CARBOMER );酸性經合成方式改質的天然聚合物例如羧甲基纖維素 ;中性經合成改質的天然聚合物例如（羥丙基）甲基纖維素；鹼性帶胺聚合物例如脫乙醯殻多糖；可得自天然來源的酸性聚合物例如海藻酸、玻尿酸、果膠、黃蓍膠、和刺梧桐膠；以及中性非天然發生的聚合物，例如聚乙烯醇；或彼等的組合。片語 ''免疫刺激性分子〃於用於本文中時係指可增強疫苗組成物中的抗原性成分所誘發的保護性免疫回應之彼等分子。適當的免疫刺激性物質包括細菌細胞壁成分，例如N-乙醯基胞壁醯基一 L 一丙胺醯基一 D—異榖胺醯胺的衍生物，例如murabutide、蘇胺醯基-MDP和胞壁醯基三肽；皂素糖苷和其衍生物，如Quil A，QS21和GPI— 0100 :膽固醇；和季鉸化合物，如，溴代二甲基二（十八烷基 )銨（DDA)和N，N-二—（十八烷基）—N，N—雙（2 —經基乙基）丙一胺（、、avridine/r )。皂素爲在廣多種植物物種中以二次代謝物產生的糖苷化合物。皂素的化學構造可賦與廣範圍的藥物學和生物學活性，包括某些強力有效的免疫學活性。在構造上’皂素係由接到一或更多糖鏈的任何糖苷配基所構成。皂素係根據彼等的糖苷配基組成而分類：三萜苷類、類固醇糖苷類、與類固醇植物鹼糖苷類。巷素可從官樹（Quillaja saponiria)的樹皮離析出。 -19- (16) 1301067 皂素長久以來即已知爲一種免疫刺激劑。Daisgaard K.，a Evaluation of its adjuvant activity with a special reference to the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease” ?Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978。含官素的植物粗萃取物可增強口足病疫苗之效力。不過，該粗萃取物在用於疫苗中時會伴隨著不良的副作用。隨後， Dalsgaard經由透析，離子交換和和膠濾層析術從皂素部份純化出佐劑活性成分。D a 1 s g a a r d，K · e t a 1.， vv Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaj a saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines〃 ,Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243 -254 1 974。以此種方式純化出的一種佐劑活性成分稱爲''Quil A〃。於重量基上，Quil A與粗皂素比較之下，顯示出增加的效力且展現出減低的局部反應。Quil A業經廣用於獸醫學疫苗中。以高壓液體層析術（HPLC)進一步分析Quil A揭露出多種密切相關的皂素之異質混合物且導致QS 21之發現，QS 21爲具有減低或最低毒性之強力佐劑。Kensil C. R. et·，、、Separation and characterization of saponins with adjusant activity from Qullaj a saponaria Molina cortex"， J. Immunol. 146: 43卜437，1991。不同於大部份其他免疫刺激劑者。QS2 1係水可溶且可用或不同乳液型調合物即可用於疫苗中。Q S 2 1業經證明可在小鼠體內誘發Th 1型回應，刺激IgG2a和IgG2b抗體之產生且在對亞單元抗原的回 -20- (17) 1301067 應中誘導出抗原一特異性CD 8 + CTL ( MHC class I )。於人體中的臨床硏究證明其具有可接受的毒物學型態之佐劑性。Kensil，C. R. et. al·，、、Structural and imunological charaterization of the vaccine adiuvant Q S 21 . In Vaccine Design: the subunit and Adjuvant Approach ” , Eds.

Powell, M. F. and Newman， M. J. Plenum Publishing Corporation, New York. 1 995，po. 525-54 1。美國專利6,080,725述及製造和使用皂素-親脂物共軛物之方法。於此種皂素-親脂物共軛物中，係將親脂物部份體例如脂質、脂肪酸、聚乙二醇或萜以共價鍵經由三萜皂素的3 - Ο -葡萄糖醛酸上所含羧基接到未經醯基化或經脫醯基化的三萜皂素上。親脂性部份體對皂素例如皂樹皮脫醯基皂素、lucyoside P，或得自絲石竹（ Gypsophila )，皂樹和刺葉石竹（Acanthophyllum )的皂素所含3 - Ο -葡萄糖醛酸之連接可增強彼等對體液和細胞媒介免疫性的佐輔效用。此外，親脂性部份體對無-或脫-醯基皂素所含3 - Ο-葡萄糖醛酸殘基的連接產生更容易純化，較低毒性’化學更穩定，且擁有與原皂素同等或更佳佐劑性質之皂類類似物。 GPI — 0100爲在美國專利6，080,725中述及的皂素—親脂物共軛體。GPI- 01 00係經由將脂族胺經由葡萄糖醛酸羧基加到脫醯基皂素而製成者。季銨化合物-有許多脂族含氮鹼經提出用爲免疫學佐劑，包括胺類、季銨化合物、胍類、苯甲脒類、和硫脲鐵 -21 - (18) 1301067 鹽類（thiouroniums )。特定的此等化合物包括溴化二甲基二一（十八烷基）銨（DDA )和N，N —二一（十八烷基）— N，N —雙（2 —羥基乙基）丙二胺（avridine" )° 美國專利5,951，988述及含季銨鹽例如DDA，配合油成分之佐劑調合物。此調合物可用來配合已知的免疫學物質，如病毒或細菌抗原而用於疫苗組成物中，以增強免疫原回應。該組成物也可在不摻加抗原之下用爲非特異性免疫刺激性調合物。美國專利4,310,550述及N，N —高碳數烷基—Ν，Ν’ — 雙（2-羥基乙基）一丙二胺及Ν，Ν-高碳數烷基一伸二甲苯二胺與脂肪或脂族乳液調合作爲疫苗佐劑之用途。於美國專利4,3 1 0,5 50中述及一種透過佐劑調合物的非經腸投予誘導或增強一抗原在人體或動物體內的免疫原回應之方法。於一較佳具體實例中，本發明提供可用爲疫苗佐劑之次微米水包油乳化液，其包括AMPIGEN ®調合物，具有小於1微米的尺寸及約0.2 5微米的平均液滴尺寸之液滴。術語''AMPHIGEN®調合物〃於用在本文中時係指經由將 DRAKE0L® 卵磷脂油溶液（Hydronics, Lincoln，ΝΕ )與食鹽水溶液在TWEEN ® 80和SPAN ® 80存在中混合而形成。一典型的AMP HI GEN ®調合物含有40體積％ ( v/ v )的輕質礦油，約2 5 % w / v卵磷脂，約0 · 1 8體積％ ( v /v) TWEEN 80 及約〇·〇8 體積％ ( v / v) Span 80。 -22- (19) 1301067 製備次微米水包油乳液之方法於另一具體實例中，本發明提供製備前文所述次微米水包油乳液之方法。根據本發明，係將乳液的各成分，包括油，一或多種界面活性劑，水性成分和適用於乳液中的任何其他成分，組合且混合在一起。對所形成的混合物施以乳化程序，典型地係經由通過一或更多個勻化器或乳化器一或更多次以形成具有均勻外觀和約〇 · 5微米的平均液滴尺寸之水包油乳液。任何市售勻化器或乳化器都可以用於此目的，例如Ross乳化器（ Hauppauge，NH) 、Gaulin句化器（Everett，ΜΑ)。然後對如此形成的乳液施以微流化以使液滴尺寸在次微米範圍內。微流化可經由使用商業微流化器例如可得自 Microfluidics，Newton，Mass的型號 110Υ ; Gaulin Model 3 OCD ( Gaulin, Inc. ? Everett, Mass.)；和 Rainnie Minilab Type 8.3 0H ( Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson，Wis )等而達到。此等微流化器係經由在高壓下迫使流體通過小孔而操作，使得兩流體流在一交互作用室以高速度交互作用以形成具有次微米尺寸的液滴之乳液。液滴尺寸可由技藝中已知的多種方法予以測定，例如雷射繞射，使用市售尺寸分析儀器。該尺寸可能依所用界面活性劑類型，界面活性劑對油的比例，操作壓力，溫度，等而變異。熟練者都可以在不過度的實驗下定出合意的 -23- (20) 1301067 此等參數之組合以得到具有合意液滴尺寸之乳液。本發明乳液的液滴具有小於1微米之直徑，較佳者具有小於0.8微米之平均液滴尺寸，且更佳者具有小於0 · 5微米之平均液滴尺寸，且甚至更佳者具有小於0.3微米之平均液滴尺寸〇於本發明一較佳具體實例中，係將DRAKEOL卵磷脂油溶液，此可在商業上得自Hydronics( Lincoln, NE)和含有25 %卵磷脂/輕質礦油，組合和混合食鹽水以及界面活性劑 TWEEN ® 80 和 SPAN ® 80，以形成、AMPHGEN ® 溶液"或'' AMPHIGEN ®調合物〃。AMPHGEN ®溶液則再與 Ross® 乳化器（Hauppauge，NY 1 1 78 8 )以約 3400 rpm 予以乳化而形成水包油乳液。隨後將該乳液通過以約4500 ±5 00 pis操作的微流化器一次。經微流化的水包油乳液具有尺寸小於1微米的液滴，及約〇 · 2 5微米的平均液滴尺寸含有經摻加在次微米水包油乳液內的抗原之疫苗組成物於另一具體實例中，本發明提供含有抗原和上述次微米水包油乳液之疫苗組成物。此等疫苗組成物的特徵在於具有增強的免疫原效用及改良的物理外觀（例如，在長期貯存之後沒有觀察到相分離現象）。此外，本發明疫苗組成物對於投予動物具安全性。根據本發明，可將抗原與乳液外在地，或較佳者，內在地混配。術語 ''內在地〃係指其中係在微流化步驟之前 - 24- (21) 1301067 將抗原與乳液成分混配之程序。術語〜外在地〃係指抗原係在乳液經微流化之後加入之程序。經外在地添加之抗原可爲游離抗原或其可經封裝在微粒子中，如下文要進一步說明者。術語 > 抗原〃在用於本文中時係指在動物體內具免疫原性的任何分子，化合物或組成物，且其係經包括在疫苗組成物內以誘發經投予該疫苗組成物的動物之保護性免疫回應。術語 > 免疫原性〃在與抗原相關地使用時係指該抗原在動物體內誘發對該抗原的免疫回應之能力。免疫回應可能爲主要由胞毒性T -細胞媒介的細胞性免疫回應，或爲主要由助手T -細胞媒介，轉而活化B -細胞導致抗體產生之體液免疫回應。 >保護性免疫回應〃係經定義爲在動物體內發生，可防止或可偵測地減低由抗原或含該抗原的致病原所引起的失調或疾病，或消除或可偵測地減低該疾病的嚴重性，或可偵測地減緩該疾病的進展速率，之任何免疫回應，可爲抗體或細胞媒介免疫回應，或兩者同時。可包括在本發明疫苗組成物中的抗原包括從致病性細菌例如豬肺炎枝原體（Mycoplasma hyopneumoniae)、嗜眠嗜血桿菌（Haemophilus somnus)、副豬嗜血桿菌（ Haemophilus parasuis)、支氣管炎博德特氏菌（ Bordetella bronchiseptica)、胸膜肺炎放線桿菌（ Actinobacillus pleuropneumonie )、多殺巴斯德氏菌（ -25- (22) 1301067

Pasteurella multocida ) 、Manheimia hemolytica、牛枝原體(Mycoplasma bovis) 、Mycoplasma galanacieum、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)、副結核分枝桿菌（ Mycobacterium paratuberculosis )、校菌屬（Clostridial spp)、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis)、豬鏈球菌 (Streptococcus suis)、金黃色葡萄球菌（

Staphylococcus aureus)、豬丹毒丹毒絲菌（

Ery sipelothrix rhusopathiae )、彎曲桿菌(Campylobacter spp )、壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum )、大腸桿菌(Escherichia coli) 、Salmonella enterica serovars、鈎端螺旋體屬（Leptospira spp);致病性真菌例如假絲酵母（Candida );原生動物例如小粒隱孢子蟲 ( Cryptosporidium parvm)、犬新孢蟲(Neospora canium )、鼠弓形體（Toxoplasma gondii)、艾美球蟲屬（ Eimeria spp );懦蟲例如胃腺蟲屬（Ostertagia)、古柏線蟲屬（Cooperia )、血矛線蟲屬（Haemonchus )、片形吸蟲屬（Fasciola)、等所製備的抗原，可呈經活化的完整或部份的細胞製劑的形式，或呈以習用蛋白質純化，遺傳工程技術或化學合成所得抗原性分子之形式。其他的抗原包括致病性病毒例如牛疱疹病毒- 1，3，6、牛病毒性腹瀉病毒（DVDV )型1和2、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒、豬瘟病毒、非洲豬瘟熱病毒、豬圓環病毒、流感病毒、豬水泡病毒、熱病毒（Techen fever virus)、僞狂犬 -26- ⑧ (23) 1301067 病病毒等，呈經抑制活化的完全或部份病毒製備物形式或呈經由習用的蛋白質純化’遺傳工程技術或化學合成得抗原性分子形式。抗原的量應該爲使得該抗原在與水包油乳液組合後可以有效地誘發動物體內的保護性免疫回應。正確的有抗原量決定於抗原的本質，活性與純度’且可由熟諳此者予以定出。疫苗組成物中的水包油乳液含量應該足以強化疫苗成物中的抗原之免疫原性。於合宜且恰當之時，除了水油乳液所提供的界面活性劑之外，可在疫苗組成物中加額外量的界面活性劑或其他界面活性劑。一般而言，在後體積的疫苗組成物中之油成分含量爲從1.0至20體積 ;較佳者，其含量爲0.15至10體積％，更佳者其含量 2.0%至5.0%。界面活性劑或若有用到多種界面活性劑，該等界面活性劑在最後體積疫苗組成物中的含量爲（至20體積％，較佳者，0.15至10%，更佳者0.2至6.0體 %。除了抗原和水包油乳液之外，該疫苗組成物可包括當且合宜的其他成分，例如防腐劑、滲透劑、生物黏著分子和免疫刺激性分子（例如，Quil A、膽固醇、GPI 〇1〇〇、溴化二甲基二一（十八烷基）銨（DDA )，如在文有關水包油乳液中所述及者。本發明疫苗組成物也可包括獸醫學上可接受之載劑術語 ''獸醫學上可接受之載劑〃包括任何及所有的溶劑所效技組包入最 % 爲時 ).1 積恰性刖 -27- (24) 1301067 分散介質、塗料、佐劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸附延緩劑、等。稀釋劑可包括水、食鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等。等張劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇、和乳糖、及其他者。安定劑包括，與其他一起者，白蛋白。於一較佳具體實例中，本發明提供一種疫苗組成物，其包括BVDV I型或BVDV II型抗原中至少一者，經內在地摻加到水包油乳液中，該乳液具有尺寸小於1微米之液滴，且較佳者具有小於0 · 8微米之平均液滴尺寸，更佳者小於0.5微米，且甚至更佳者有小於約〇.5微米之平均液滴尺寸。BVDV I及/或II型抗原較佳者係呈經活化病毒製備物之形式。該次微米水包油乳液較佳者係由AMP HI GEN ®調合物（亦即，一種含有輕質礦油、卵磷脂、TWEEN ® 80 、和SPAN ® 8 0的調合物）所構成。該疫苗組成物較佳者也包括QuilA、膽固醇、和硫柳隶（thimerosol)。於另一較佳具體實例中，本發明提供一種疫苗組成物，其包括在水包油乳液中的鈎端螺旋體抗原及BVDV I型或BVDV II型抗原中至少一者。較佳地呈經抑活化細胞或病毒製備的形式之抗原係經內在在摻加到具有尺寸小於i 微米的液滴之水包油乳液中，該乳液較佳地有小於〇. 8微米之平均液滴尺寸，更佳者小於〇 · 5微米，且甚至更佳者有約〇 · 5微米之平均液滴尺寸。該次微米水包油乳液較佳者係由AM PHI GEN調合物（亦即一種含有輕質礦油、卵磷脂、TWEEN ® 80、和SPAN ® 80之調合物）所構成。該疫 -28- ⑧ (25) 1301067 苗組成物較佳者也包括一或多種選自Quil-A、膽固醇、 00八、0?1—0100和氫氧化鋁（八1〇11)之中的免疫刺激性分子。於又另一較佳具體實例中，本發明提供一種疫苗組成物’其包括在水包油乳液中的至少一種細菌抗原，例如重組乳房鏈球菌P au A蛋白或大腸桿菌細胞製備物或兩者的組合。抗原係經內在地混配該水包油乳液，該乳液具有尺 0 寸小於1微米之液滴，且具有小於0.8微米，更佳者小於 0.5微米的平均液滴尺寸，且甚至更佳者有約0.25微米之平均液滴尺寸。該次微米水包油乳液較佳者係由 AMPHIGEN ®調合物（亦即，一種含有輕質礦油、卵磷脂、TWEEN ® 80和SPAN ® 80的調合物）所構成。該疫苗組成物較佳者也包括一或多種選自Quil A、DDA、和 GPI- 01 00中的免疫刺激性分子。本發明疫苗組成物可由已知途徑投予動物，包括經口 φ 、經鼻、經黏膜、局部、透皮、和非經腸（如，靜脈內、腹膜內、皮內、皮下或肌肉內）等途徑。可以使用途徑組合來達到投藥，例如使用非經腸途徑第一次投予及隨後使用黏膜途徑投予。製備疫苗組成物之方法於另一具體實例中，本發明提供製備含有一抗原或多抗原及次微米水包油乳液的疫苗組成物之方法° 於製備本發明疫苗組成物之中，可將抗原與水包油乳 -29- ⑧ (26) 1301067 液的成分內在地或外在地混配。較佳者，該抗原係與水包油乳液的成分內在地混配。抗原可與乳液的各成分，包括油、一或多種界面活性劑、水性成分和任何其他恰當成分混配，典型地係經由通過一或多個勻化器或乳化器一或多次以形成含有該抗原的水包油乳液。任何市售勻化器或乳化器都可用於此目的，例如 Ross乳化器（Hauppauge，NY ) 、Gaulin 勻化器（

Everett, ΜΑ )、或 Microfluidics ( Newton，ΜΑ )。或者，可將乳液佐劑的各種成分，包括油，一或多種界面活性劑、和水性成分，使用勻化器或乳化器混配形成水包油乳液；然後將抗原加到此乳液中。初步摻合後的水包油乳液所具平均液滴尺寸爲約1.0 — 1.2微米。然後，對含有抗原的乳液施以微流化以使液滴尺寸落於次微米範圍。微流化可使用商業微流化器達到，例如可得自 Micro fluidics, Newton，Mass 的型號 110Y ; Gaulin Model 30CD ( Gaulin，Inc·，Everett，Mass);及11&1111116 Minilab Type 8.30H ( Miro Atomizer Food and Dairy, Inc” Hudson, W i s ) ° 液滴尺寸可由技藝中已知的多種方法予以測定，例如雷射繞射，使用市售尺寸測定儀器。該尺寸可能依所用界面活性劑的類別、界面活性劑對油的比例、操作壓力、溫度、等而變異。吾人可定出此等參數的合意組合而得到具有合意液滴尺寸之乳液。本發明乳液的油滴具有小於1微米之直徑。較佳者，其平均液滴尺寸爲小於〇 · 8微米。更 -30- (27) 1301067 佳者，該平均液滴尺寸爲小於0.5微米。甚至更佳者，其平均液滴尺寸爲約0.1至0.3微米。於本發明一較佳具體實例中，係將含有25 %卵磷脂/ 輕質礦油的DRAKEOL ®卵磷脂油溶液與界面活性劑 TWEEN ® 8 0和SPAN ® 80和食鹽水組合和混合以形成含有 40% 輕質礦油，0.18%TWEEN®80，和 0.08%SPAN®80 的混合物。然後，用Ross ®乳化器（Hauppange，NY 1 1 78 8 )以約3400 rpm乳化該混合物以形成乳液產物，其他稱爲''AMPHIGEN®調合物〃或''AMPHIGEN®溶液" 。隨後，將合意的抗原與該AMPHIGEN ®溶液和可其他恰當成分（如，免疫刺激性分子）藉助乳化器，如Ross勻化器，予以混配而形成含抗原的水包油乳液。將此等乳液通過以1 0000± 5 00 psi操作的Microfluidizer—次。經微流化的水包油乳液具有尺寸小於1微米的液滴，及約0.25微米之平均液滴尺寸。於另一較佳具體實例中，將水包油乳液（如 AMPHIGEN ®調合物）與合意抗原混配之前，係將抗原與皂素糖苷，如Quil A，混配形成一混合物。對此抗原一皂素混合物施以勻化，例如在一勻化容器內。然後將固醇，例如膽固醇加到該經勻化的抗原-皂素混合物中。接著對含有抗原、皂素和固醇的混合物再施以勻化。之後，將經勻化的抗原-皂素-固醇混合物藉助，例如勻化器、與水包油乳液（如AMPHIGEN ®調合物）混配。最後，對勻化過的含抗原、皂素和固醇之水包油乳液施以高壓勻化，例 -31 -

(D (28) 1301067 如微流化。在次微米水包油乳液中含有微封裝抗原之疫苗組成物及其製備方法於又另一具體實例中，本發明提供疫苗組成物，其含有經封裝在微粒子內的抗原（或''微封裝抗原〃），其中該微封裝抗原係經外在地摻加在前述次微米水包油乳液內〇

I 將抗原吸收或包埋在粒狀載體內的方法係技藝中已知者。參閱，例如，Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications ( Justin Hanes，Masatoshi Chiba and Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. In: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach. Eds. Michael F. Powell and Mark J. Newman， 1995 Plenum Press，New York and London ) 〇粒狀載體可 φ 將多重所選抗原複本呈現給動物受驗者體內的免疫系統且促進抗原在局部淋巴結內的捕捉和持留。該等粒子可被巨噬細胞吞噬且可透過細胞介素釋放而增強抗原呈現。粒狀載體也已在技藝中述及且包括，例如，源自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物者，以及源自聚（乳交酯）和聚（乳交酯-共 -乙交酯），稱爲PLG者。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物係生物不可降解者，而PLG粒子可經由酯鍵的無規非-酵素性水解成爲乳酸和乙醇酸而沿著正常代謝途徑排泄掉。生物可降解的微球體也已被用來達到疫苗的控制釋放 -32- (29) 1301067 。例如，可以達到在長時間內的連續性抗原釋放。依聚合物的分子量及聚合物中乳酸對乙醇酸的比例而定，PLGA 聚合物可能具有從數天或數週到數個月或一年之水解速率。緩慢經控制的釋放可能導致類似於多重注射後觀察到者之局抗體含量之形成。或者，經由選擇各具不同水解速率的多種聚合物可以達到疫苗抗原的脈衝式釋放。聚合物的水解速率典型地係決定於聚合物的分子量及聚合物中乳酸對乙醇酸之比例。從二或多種各具不同抗原釋放速率的聚合物製成的微粒子可提供脈衝式抗原釋放且模擬疫苗接種的多劑投藥法。根據本發明，包括上文述及者中的任一者之抗原可經由使用技藝中已知的任何程序（例如在實施例1 7中例舉說明者）而吸收到粒狀聚合物載體之內，較佳者PLG聚合物內，而形成微封裝抗原製劑。然後將該微封裝抗原製劑與次微米水包油乳液混合且分散在該乳液內，該乳液係在上文中說明過者，因而形成疫苗組成物。於一較佳具體實例中，本發明提供一種疫苗組成物，其包含經封裝在PLC聚合物內之抗原，其中該微封裝抗原係經外在地分散在一經微流化的水包油乳液中，該乳液係由輕質礦油、卵磷脂、TWEEN 80、SPAN 80和食鹽水所構成，且具有小於1.0微米之平均液滴尺寸。以皂素和固醇形成的複合物於一具體實施例中，本發明提供含皂素和固醇之組成 -33- (30) 1301067 物，其中該皂素和該固醇形成呈螺旋微團形式之複合物。根據本發明，此等複合物具有免疫刺激活性。 ''免疫刺激〃意指該複合物可增強抗原性成分所誘發的免疫回應，或該複合物可誘發與分別的抗原性成分不相干之免疫回應。根據本發明，用於本發明組成物中的較佳皂素爲 Quil A。 | 用於本發明佐劑組成物中的較佳固醇包括yS -麥胚脂醇、豆脂醇、麥角固醇、麥角鈣化甾醇、和膽固醇。此等固醇都是技藝中熟知者，例如，膽固醇經揭示於Merck Index，11th Edn., page 341，爲在動物脂肪內發現的天然發生性固醇。最佳的固醇爲膽固醇。組成物中，皂素：固醇比例典型地係在1 : 1 00至5 : 1 重量對重量比之級次。較佳者，該比例爲1 : 1。於另一具體實例中，本發明提供疫苗組成物，其包含 φ 皂素、固醇和抗原，其中該皂素和抗原形成呈螺旋微團之形式，且其中該抗原係與該螺旋微團摻混但未摻加到其內〇下面爲實施本發明的特定具體實例之實施例。該等實施例係經提供只供示範說明目的所用，而無意在任何方面限制本發明的範圍。實施例1 AMPHIGEN ®調合物之製備 -34- (31) 1301067 以二步驟程序製備amphigen ®調合物，於第一步驟中，將80升的Drakeol卵磷脂油溶液，116升的破傷害類毒素食鹽水，1.2升 SPAN 80’和2.8升Tween 80使用Ross 乳化器混合在一起且予以乳化。該Drakeo1卵磷脂油溶液有25 %大豆卵磷脂和25 %礦油。將乳化過的產物循環通過 Ross乳化器最少5體積或最少10分鐘。將乳化產物貯存在2 一 7 °C下最長24小時以進一步處理。將得自Ross乳化器的乳液轉移到Gaul in勻化器且在45 00 psi的壓力下勻化20分鐘。然後將所得40% Drakeol卵磷脂油溶液（後文中'' AMPHIGEN ®調合物"或AMPHIGEN ®溶液)分配進入無菌聚丙烯羧基容器內。該配送係在Class 1 0,000控制環境中的class 100配送櫥內部實施的。將該等容器貯存在 2 — 7 °C下。此AMPHIGEN ®調合物係用於後文所述實驗中，除非另有不同指示。實施例2 BVD疫苗以快速摻合勻化進行初步摻合此勻化程序所用裝置經顯示於圖1之中。使用無菌技術或蒸汽轉換閥，將裝有BVD型I抗原（一種經抑活化的 BVD型I病毒製備物）接到摻合容器的底部側口。於完成所需體積皂BVD型I抗原之轉移之後，用裝有抑活化BVd 型II病毒製備物（一種經抑活化的BVD型II病毒製備物）的瓶子取代該BVD型I瓶子。於完成所需量的BVD型II抗原轉移之後，將Ross勻化器接到攜帶式容器且以最大rpμ ( -35- ⑧ (32) 1301067 3 3 0 rpm )起始循環。以中等速度保持容器攪動。使用無菌技術或蒸汽轉換閥，將裝有Quil-A ( 50毫克 /毫升之濃度）的瓶子接到摻合容器的勻化器線內（inline) 口。將所需量的 Quil-A溶液透過抽氣通到容器內。於完成Quil-A溶液的轉移之後，將瓶子移開。以此相同方式，將所需量的膽固醇/乙醇溶液（18毫克/毫升）轉移到摻合容器。隨後，將所需量的AMPHIGEN ®調合物，10 %硫柳汞溶液，和鹼性改質Eagles培養基（''BME〃）增充溶液加到摻合容器內。於添加完畢後，再繼續混合1 5分鐘。將所得調合物分液成2毫升劑而得未微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底之BVD疫苗。每一劑疫苗含有500微克Quil-A，500微克膽固醇，2.5% AMPHIGEN ®調合物和0.009 %硫柳汞。兩不同BVD株的抗原濃度皆以 gp5 3的ELIS A效價單位測定實施例3 以微流化進行二次摻合圖2示出透過微流化進行二次摻合所用程序。將微流化器蒸汽滅菌。首先將輔助處理模組室安裝在單元內且將空白室安裝在第二室的位置上。將按實施例2中所述製備的裝有完全佐輔BVD疫苗之容器經由將供給容器洩流閥的傳輸管線接到微流化器入口而連接到該微流化器。將氮氣連接到供給容器洩流閥且將容器壓力設定調整到20 + / -36- (33) 1301067 - 5 PSI。將收集容器洩流閥連接到來自微流化器出口的傳送管線。在完成所有需要的連接之後，將諸閥打開且以 10，000 +/ — 5 00 PSI的操作壓力起始微流化。將整個含量的疫苗通過微流化器一次且收集在後，微流化室內。將此製備的分液成2毫升劑而表經微流化的以AMPHIGEN ®調合物爲基底之BVD疫苗。實施例4 透過指式摻合製備疫苗組成物將按實施例1所述製成的AMPHIGEN ®調合物經由添加BVD抗原和增充液而稀釋劑到2.5 %。將所得溶液在枱上用攪拌棒取代勻化器予以摻合。最後製劑含有下列組成 :BVD型I和型II抗原，2.5% AMPHIGEN ®調合物（其中含有油、卵磷脂、SPAN ®和TWEEN ®，如實施例1中所述者），和食鹽水。TWEEN 80和SPAN 80在最後疫苗製劑中的含量分別爲0.18體積％和0.08體積％。實施例5 未微流化與經微流化的以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑之間的液滴尺寸分布之比較用按實施例2所述製成的未微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗，按實施例3中所述製成的經微流化以 AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗，及按實施例4所述透過枱面摻合製成的製劑，來比較疫苗製劑的液滴尺寸。將 -37- (34) 1301067 2毫升取自各製劑的樣品加到M a 1 v e r η 2 0 0雷射繞射儀內且測定液滴尺寸分布。如圖3中所示者，其結果指出經微流化的以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑具有約〇1 微米的最大粒子體積而未微流化的以AMP HI GEN ®調合物爲基底之疫苗製劑具有約1微米的最大粒子分布體積。實施例6 疫苗相分離現象之減低將三種不同的疫苗製劑：按實施例2中所述製成的未微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底之疫苗，按實施例3 中述製成的經微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗，和按實施例4中所述透過枱面摻合製成的疫苗，倂排地比較以測定在長期貯存之後彼等的相分離性質。將所有此等製劑靜置於4 °C下約一個月且就疫苗製劑頂部乳皮層出現監測相分離現象。如圖4中所示者，經微流化以 AMPHIGEN ®調合物爲基底的製劑與其他兩製劑比較之時，沒有相分離現象。實施例7 對抗牛病毒性腹瀉病毒的經微流化和未經微流化牛疫苗之製備將牛病毒性腹瀉病毒抗原透過微流化內在地摻加到 AMPHIGEN ®調合物之內。術語 ''內在地摻加〃指的是在微流化之前將抗原加到AMPHIGEN ®調合物內之程序。對 38· (35) 1301067 抗原與佐劑調合物成分一起施以微流化程序的物理力。於對照的未微流化組中，係將抗原製劑透過摻合分散到 AMPHIGEN®調合物內。對照製劑和微流化製劑兩者的最後組成如下：BVD型 I具有253 5 RU/劑的gp 53抑活化後ELISA效價，BVD型II 具有3290 RU/劑的gp 53抑活化後ELISA效價，Quil-A濃度爲1.2 5毫克/劑，膽固醇濃度爲1 · 2 5毫克/劑， AMPHIGEN®調合物最後濃度爲2.5%，且硫柳汞最後濃度爲0.009%。疫苗劑量爲5毫升。實施例8 經內在摻合的BVD病毒抗原在微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑中之長期穩定性此實驗係進行用來測定經內在地摻加之抗原在長期貯存中的穩定性。將殺死的:BVD型II病毒抗原在微流化程序中內在地摻加到AMPHIGEN ®調合物內以得到微流化疫苗製劑（A9075 05 )。三份含有相同抗原在未微流化 AMPHIGEN ®調合物中之其他疫苗製劑（A904369， A9043 70，和A9 043 7 1 )係用爲對照樣。於未微流化製劑中，係使用Ross勻化器將抗原與AMPHIGEN ®調合物透過摻合而混合。將所有4種疫苗製劑都貯存於4°C下兩年。於貯存期間的不同時點（0，6 ’ 12或24個月），使用四種調合物接種三個月大的母牛。於第〇天和第21天，以2毫升疫苗調合物透過皮下途徑 -39- (36) 1301067 疫苗接種三個月大的母牛。在第35天收集接種動物之血清，且就透過BVDV - EL ELISA的抗體效價測量對疫苗的血清學回應。如圖5中所示者，微流化疫苗製劑顯示出在所有試驗時點都有較高的抗體效價（於0，6，1 2和2 4個月處 )，可推斷抗原製劑的穩定性在微流化程序中抗原的內在摻加過程內沒有失去。再者，也令人課異地發現該微流化疫苗製劑可在所有時點誘發增強的免疫回應。實施例9 微流化後疫苗誘導直腸溫度增高之減低使用按實施例7中所述製成的微流化和未微流化疫苗製劑在第〇天疫苗接種牛且從疫苗接種前一天在疫苗接種後四天期間監測直腸溫度。疫苗劑量爲2毫升。諸組都是用單劑或雙劑予以疫苗接種。在包括第1天到第4天的期間每曰測量和記錄直腸溫度。第〇天的直腸溫度是在投予試驗物件之前測量。如圖6中所示者，結果指示出於用單劑或雙劑未微流化疫苗調合物接種的彼等動物體內，在接種後約24小時中直腸溫度有徒急上升。不過，於用微流化疫苗形式接種的動物體內，在接種後的直腸溫度上升係爲最小者且明顯低於用未微流化調合物接種的動物（圖6 )。實施例1 0 用微流化疫苗調合物接種時快速消散注射部位反應體積 -40- (37) (37)1301067 使用按實施例7中所述製造的微流化和未微流化疫苗製劑在第〇天接種牛隻。包括於此硏究中的動物爲雜交肉牛。每一無效對照劑處理組中（TO 1和T02 )，各有三頭動物。於T03至T06中每一組內各有六頭動物。疫苗劑量爲2毫升且各組係在第0天以一或二劑接種。於第0天，在各頸部接受試驗物件。接受雙劑（4毫升）試驗物件的動物（T02，T04，和T06 )係在一側以單一注射接受整個雙劑。在注射部位的觀察，包括在注射部位的反應尺寸之估測，係在包括第〇天至第4天，及第6，9和14天，於頸部右側進行。於第〇天，於投予試驗物件之前觀察注射部位。用一或雙劑無效對照劑接種的各組在注射部位反應體積上沒有顯示任何明顯增加，因而彼等數據沒有顯示在圖7之中。於未微流化疫苗調合物的情況中，在一劑與二劑疫苗接種之間的注射部位反應體積有成比例的增加。另一方面，在微流化疫苗調合物的情況中，雖然單劑誘導出較大的注射部位反應體積，用第二劑注射時則沒有引起任何進一步的增加。再者，於用微流化疫苗調合物注射動物的情況中，係以用未微流化疫苗調合物注射的動物更快的速率消散注射部位反應體積。此等結果皆顯示於圖7中。實施例1 1 使用經內在地摻加之BVD病原和鈎端螺旋體抗原及免疫刺激性分子例如Quil A和DDA製備微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底之疫苗製劑 -41 - ⑧ (38) 1301067 將經福馬林抑活化過的哈勒焦鈎端螺旋體（

Leptospira hardjo)牛株CSL以約1·4χ107生物/5毫升劑之直接計數調配在恰當的佐劑內。將經福馬來林抑活化過的波摩拿鈎端螺旋體（Leptospira Pomona)菌株Τ 262調配成約 2400 Nephalomeric單位 / 5毫升劑。Nephalomeric 卓元係根據預處理過的醱酵流體之ephalometric測量而計算的。BVD病毒型I係經調配成約3 000相對單位/ 5毫升劑之 E2 Elisa效價。BVD病毒型II型係經調配成約3 5 00相對單位/ 5毫升劑之E2 Eli as效價。相對單位係根據組裝前’抑活化後的主體流體之E2 Elisa效價而計算。Quil A和膽固醇兩者都是以〇. 5毫克每劑之濃度使用。硫柳汞和 AMP HI GEN ®調合物分別以0.009 %和2.5 %的最後濃度使用。氫氧化鋁（Rehydragel LV )係以2.0%的最後濃度使用。在使用DDA作爲免疫調制劑時，DDA係經包括 AMPHIGEN ®調合物之內。AMPHIGEN ®調合物（亦良卩， 40 % Drakeol —卵磷脂儲液）含有1.6毫克/毫升之DDA 且於經恰當地稀釋之時，最後疫苗製劑含有2 · 5 % AMPHIGEN ®調合物和0.1毫克/毫升的DDA。於不同疫苗調合物的製備中，係將各BVD部份， Leptos、Quil A、膽固醇、硫柳汞、AMPHIGEN®調合物、和作爲增充劑的食鹽水加到Silverson勻化器內並以 1 0,000±5 00 RPM混合15分鐘。然後將諸成分以1 0,000 psi 通過25 0微米篩網予以微流化。當疫苗調合物含有氫氧化鋁時，係在沒有氫氧化鋁之 -42- (39) 1301067 下進行微流化。於完成微流化之後，才加入氫氧化鋁並用攪拌棒在4 °C下混合整夜。實施例1 2 用於挑激硏究的BVD病毒疫苗之製備用於此實驗中的疫苗製劑含有來自BVD病毒型1和 BVD病毒型2兩者之病原。BVD 1 — 5960抗原係以25 3 5 RU /劑的gp 53抑活化後ELISA效價使用。BVD2 — 890抗原係以3290 RU/劑的gp 53抑活化後ELISA效價使用。Quil A 和膽固醇係以0.5毫克/毫升的濃度使用。硫柳汞和 AMPHIGEN ®調合物分gij以0.009 %和2.5 %的最後濃度使用，在使用DDA作爲免疫調制劑時，DDA係包括在 AMPHIGEN ® 調合物之內。AMPHIGEN ® 儲液(40 % Drakeol -卵磷脂溶液）含有不同量的DDA且在經恰當地稀釋時，最後疫苗製劑含有2.5的AMPHIGEN®調合物及從〇·5毫克/至2.0毫克/劑之DDA濃度。鋁膠（ Rehydragel-LV)係以2%的最後濃度使用。GPI— 0100係在2 · 3和5毫克/劑的範圍內使用。將所有成分加到Siloverson句化器內且以10,500 rpm 摻合15分鐘，然後經由以1〇,〇〇〇 psi通過200微米室予以微流化。當疫苗製劑含有氫氧化鋁之時，係在不含氫氧化鋁之下進行微流化。於完成微流化之後，加氫氧化鋁且用攪拌棒在4°C下混合整夜。 -43- ⑧ (40) 1301067 實施例1 3 用含鈎端螺旋體抗原和微流化A m p h i g e η疫苗調合物疫苗接種後對抗鈎端螺旋體挑激之保護表1 -處理組處理組佐劑組成 T01 食鹽水 T02 Quil A、膽固醇、和AMPHIGEN ®調合物（0Ac) T03 Quil A、膽固醇、AMPHIGEN ®調合物和A10H (QAC-A10H) T04 DDA、膽固醇、和AMPHIGEN®調合物（DDA) T05 DDA、膽固醇、AMPHIGEN®調合物、和A10H (DDA-A10H)

表1顯示出硏究中試驗用的疫苗製劑中所含佐劑調 φ 合物之組成。該等疫苗製劑係按實施例1 1中所述製備的。每一組有六頭動物。此硏究中使用約七個月大的雜種小母牛。疫苗接種係在第0天和第21天使用5毫升經皮下途徑完成的。挑激係用得自 NADC (National Agricultrue Disease Center )的哈勒焦鈎端螺旋體-牛株203實施。挑激係在第5 7 - 5 9天中使用1 —毫升菌種完成。挑激係在眼中與經陰道聯合投予。挑激物質含有5.0x1 06鈎端螺旋體/毫升。每週收集尿液供lepto培養，FA和PCR所用。腎採樣係在第1 12和1 13天中進行。 ⑧ (41) 1301067 表2 -鈎端螺旋體挑激研 :究之結果處理透過培養基在尿透過FA在尿透過PCR在尿跨所有檢定尿液和腎中有陽性液和腎中有陽液和腎中有陽液和腎中有陽鈎端螺旋體的牛性鈎端螺旋體性鈎端螺旋體性鈎端螺旋體隻百分比的牛隻百分比的牛隻百分比的牛隻百分比食鹽水 100 83.3 83.3 100 QAC 0 0 0 0 QAC/A10H 0 50.0 0 50.0 DDA 0 0 0 0 DDA/A10H 0 33.3 16.7 50.0

表2顯示出得自鈎端螺旋體挑激硏究之結果。於測定在受挑激動物中有鈎端螺旋體感染的百分比之中，使用下面的準則。若腎培養只對一樣品呈陽性，則該動物即視 φ 爲對鈎端螺旋體呈陽性。若一動物在FA或PCR任一者下只對一樣品呈陽性，則該動物即視爲陰性。若該樣品只在一樣品中對FA和PCR兩者呈陽性，則其視爲對鈎端螺旋體呈陽性。表2中的結果指明根據所有三種檢定在所有疫苗組中都有明顯較短的尿液流出期。於考慮到尿液和腎菌落培養時，不含A10H的含QAC -和DDA —調合物的效力係可相比者。於此挑激硏究中，A10H不會改良且甚至會減低含 QAC-或DDA-疫苗之效力。 •45- ⑧ (42) 1301067 表3 -於挑激前在峰値幾何平均效價之目的顯微鏡凝集效價範圍 _ 處理哈勒焦鈎端螺旋體波摩那鈎端螺旋體食鹽水 <20 <20 QAC 1 60 - 640 1 280 — 1 0240 QAC/A10H 1 60 - 2560 8 — 1 0240 DDA 40 — 1 280 320 — 25 60 DDA/A10H 320 — 640 1 280 - 5 1 20

對抗疫苗調合物中的兩種鈎端螺旋體抗原之血清學回應係在經接種疫苗的動物體內偵測且測得峰値回應係在第 3 5天。在血清學回應與對抗挑激的保護作用之間沒有相關聯。疫苗調合物中鋁凝膠之存在會減低保護水平，不過疫苗中鋁凝膠的存在可增強血清學回應。實施例1 4 在用含AMPHIGEN ®調合物和DDA的微流化疫苗製劑免疫化之後，對BVD病毒抗原與抗BVD型2病毒挑激的保護作用之誘發於此實驗中使用4至7個月大的血清陰性牛。有6個不同的組且每一組有1 0頭動物（表4 )。於第〇天和第2 1天，每一動物都在介於肩胛與後頭之間約中間處的側頸部接受 - 2 -毫升皮下疫苗劑或無效對照樣劑。 -46- (43) 1301067 轰土-處理組座1 里組佐劑組成 T01 食鹽水 T02 Quil A、AMPHIGEN ®調合物、和膽固醇 T03 AMPHIGEN®調合物、膽固醇、DDA(0.5毫克/劑）和 A10H T04 AMPHIGEN®調合物、膽固醇、和DDA(0.5毫克/ 劑） T05 AMPHIGEN®調合物、膽固醇、和DDA(1.0毫克/ 劑） T06 AMPHIGEN ®調合物、膽固醇、和DDA(2.〇毫克/ 劑）將5毫升劑量的挑激病毒製劑（約2 · 5毫升每鼻孔）在鲁硏究的第44天經鼻內投予。於此硏究中使用非細胞病變性 BVD 病毒型 2，離析物及 24515 (Ellis 株）、lot #46325 - 70作爲挑激株。在挑激起始及緊接在其完成之後，對保留的挑激物質樣品測定效價（每測定爲二重複樣）。在挑激前的每5毫升劑量之平均活病毒效價爲5 3 1〇giQFAID5() /5毫升且在挑激後爲。5.4 log1GFAID5()/5毫升（FAID等於 TCID50)。從第3天到第5 8天’每天監測動物。在第4 2至5 8天對每一動物製出根據可歸因於BVD 2傳染的臨床跡象之包括 -47- ⑧ (44) 1301067 0，1，2或3的臨床疾病計分。在挑激之前記錄第44天的計分。於第〇，2 1，3 5，44，和5 8天從每一動物採集血液樣品（兩份各1 3毫升血清分離管，S T T )用以測定b v D型1和 BVD型2病毒和抗體之血清效價。在包括第42天至第58天之間從每一動物採集血液樣品且測定在血塊黃層細胞中BVD病毒的存在。於第44天，取得挑激前之樣品。爲了測定白血球計數，乃在包括第4 2天到包括第5 8天之間從每一動物採集血樣（一 4 _毫升EDTA管）。於第44 天，取得挑激前之樣品。白血球減少係經定義爲WBC計數距基線（從挑激前的二天，及挑激當天，所得挑激前WBC計數之平均値）減少 4.0%或更大％之情形。使用臨床疾病計分按下述來定義疾病狀態，若計分S 1，則疾病=無；若計分爲> 2，則疾病=有。如表5和6中所示者，用含BVD病毒抗原加上 AMPHIGEN®調合物，Quil A或DDA且經微流化的疫苗接種過的諸組，都有血清轉換而對BVD型1和BVD型2兩病毒都有明顯的血清病毒和效價。於彼等組中，在挑激後顯示出病毒血症的動物之百分比也有明顯減低，而於對照組中，有1 00 %動物有病毒血症（表7 )。此外，於彼等疫苗接種組中，疾病頻率也經顯著地減低（表8 )。類似地，在疫苗組中，顯示白血球減少的動物之百分比也有減低且在含DD A的組中比在含Quil A的組中，有更顯著的白血球減 ⑧ -48- (45) 1301067 少症之減低情況（表9 )。於對照組中，在與疫苗接種組比較之下，在體重增量上有明顯的下降（表10)。血清學在第〇天疫苗接種之前，硏究中的所有動物對於對 BVD病毒型1和2的抗體都呈血清陰性（SVN< 1 : 2 )(數據未顯示出）。第二次疫苗接種（第3 5天）的十四天之後，投予無效對照劑的所有動物（T01 )對於針對BVD病毒型1和2的抗體都保持血清陰性；而用IT As (硏究用試驗抗原）疫苗接種過的所有動物（T02，T03，T04，T05和T06 )對於針對BVD病毒型1和2的抗體都呈血清陽性（SVN2 1:8)。使用以含2毫克/劑DDA的AMPHIGEN ®調合物佐輔的疫苗投予過的一頭動物在第35天對於針對BVD病毒型2的抗體具有3之SVN效價（表1 1和12 )。第4 4天挑激之前，除了一者之外的所有對照組（τ 0 1 )，對於針對BVD病毒型1和2的抗體都呈血清陰性（SVN <1:2)(數據未顯示出）。該一對照組（#2497 )對於針對BVD病毒型1的抗體呈血清陽性（SVN二10 )而對於針對BVD病拇型2的抗體呈血清陰性。挑激十四天後’硏究中的所有動物對於針對B V D病毒型1和2的抗體都呈血清陽性。 -49 - (46) 1301067 表5. BVD病毒型1幾何平均血清病毒中和效價

處理在第硏究天的BVDv型1幾何平均SVN效價 0 21 35 44 58 T01 食鹽水 < 2 <2 < 2 < 2 23.9 T02 Amphigen， Quil A <2 39.1 19824.5 14018.2 27554.5 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 <2 51.8 32204.8 22381.1 23170.4 T04 Amphigen， 0.5毫克 DDA <2 27.0 14512.4 8932.0 21996.2 T05 Amphigen， 1.0毫克 DDA <2 26.7 11585.2 8194.6 20882.0 T06 Amphigen， 2.0毫克 DDA <2 23.5 8778.7 6769.3 16961.1

(47) 1301067 (47)

表6. BVD病毒型2幾何平均血清病毒中和效價處理在第硏究天的BVDv型1幾何平均SVN效價 0 21 35 44 58 T01 食鹽水 <2 <2 <2 <2 522.0 T02 Amphigen, Quil A <2 8.9 2272.4 2048.2 24833.6 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 <2 9.5 3565.7 2702.2 20881.8 T04 Amphigen, 0.5毫克 DDA <2 4.1 1260.7 989.1 18496.2 T05 Amphigen， 1.0毫克 DDA <2 6.4 1 398.8 1453.9 30047.8 T06 Amphigen， 0毫克 DDA <2 7.7 1673.2 1428.9 16384.0 (48)1301067

表7.挑激後BVD病毒離析處理 BVD病毒離析於硏究天病毒血症動物頻率（％) 有病毒血症的 LS平均天數 T01 食鹽水第47至58天 10/10 10.4 (100.0) T02 Amphigen，Quil A 第50至53天 1/10 0.4 (10.0) T03 Amphigen, — 0/10 0.0 0.5 毫克 DDA’Al (〇.〇) T04 Amphigen, 第48,50至 3/10 0.5 0.5毫克 DDA 52,57 天 (30.0) T05 Amphigen，第49至51天 2/10 0.4 1.0毫克 DDA (20.0) T06 Amphigen, 第48至52天 20/10 0.5 2.0毫克 DDA (20.0) -52- (49)1301067

表8.挑激後BVD疾病臨床徵象處理患病頻率有BVD疾病臨床徵象的觀察件頻率（％) 總觀察數 (%) 0 1 2 3 T01 食鹽水 9/10 (90.0) 75 (46) 63 (37.5) 29 (17.3) 1 (0.6) 168 T02 Amphigen， Quil A 1/10 (10.0) 105 (61.8) 63 (37.1) 2 (1.2) 0 (〇) 170 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA9A1 2/10 (20.0) 99 (58.2) 67 (39.4) 4 (2.4) 0 (〇) 170 T04 Amphigen, 0.5毫克 DDA 0/10 (〇.〇) 118 (69.4) 52 (30.6) 0 (〇) 0 (〇) 170 T05 Amphigen， 1.0毫克 DDA 0/10 (0.0) 101 (59.4) 69 (40.6) 0 (〇) 0 (〇) 170 T06 Amphigen, 2.0毫克 DDA 0/10 (0.0) 104 (61.2) 66 (38.8) 0 (〇) 0 (〇) 170 -53- ⑧ (50) 1301067 (50)

表9 .挑激後的白血球減少處理白血球減少白血球減少的動物頻率（％) 有白血球減少的LS平均天數 T01 食鹽水 10/10(100.0) 7.8 T02 Amphigen,Quil A 6/10(60.0) 1.2 T03 Amphigen，0.5 毫克 DDA，A1 2/10(20.0) 0.2 T04 Amphigen，0.5 毫克 DDA 4/10(40.0) 0.8 T05 Amphigen，1.0 毫克 DDA 3/10(30.0) 0.9 T06 Amphigen，2.0毫克 DDA 2/10(30.0) 0.5

-54- ⑧ (51) 1301067 表1 ο.硏究期間的體重和體重增霉處理於第硏究天的平均體重< :磅）體重增量（磅）一 1 43 50 58 T01 食鹽水 378.0 484.9 491.0 476.9 98.9 T02 Amphigen， Quil A 428.0 526.5 546.7 579.0 151.0 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A10H 410.5 514.4 534.2 579.0 168.5 T04 Amphigen， 0.5毫克DDA 373.7 472.3 492.6 538.1 164.4 T05 Amphigen， 1.0毫克 DDA 358.9 451.4 478.9 507.1 148.2 T06 Amphigen， 20毫克DDA 408. 513.3 533.9 560.3 151.6 病毒離析如表13中所示數據，於挑激期間（第44天到58天），對照組中的所有動物（T0 1 )都有病毒血症（於一或更多天離析出病毒）。於投予IT As的組中，病毒血症動物的頻率於每一 10頭動物組（分別爲T02，T03，T04，T05和T06 )中分別爲1，〇，3，2和2。在對照組與投予IT As組之間的差異係具統計顯著性者（P $ 0.0 5 )。對照組的最小方均病毒血症天數（10.4天）相對於投予IT As組（0·0至0.5 -55- ⑧ (52) 1301067 天）也明顯較爲大。臨床疾病具有2或3的臨床徵象計分之動物皆視爲展現出BVD疾病徵象。如表14中所示者，有BVD病毒病臨床徵象的動物之頻率在對照組（T01 )中爲10中有9，而在投予IT As的組 (分別爲T02，T03，T04，T05和T06)中分別爲10中有1 ，2，0，0和0。對照組與投予IT As組之間的差異具有統計顯著性（PS 0·05 )。白血球減少症如表15中所示者，於挑激期間（第44天到第58天），對照組（Τ0 1 )中的所有1 〇隻動物都有白血球減少（相對於第42 - 44天的挑激前基線在白血球計數上有40%之減少 )。在投予1丁八8的每一組（分別爲丁02，丁03，丁04，丁05 和T06 )中10頭動物中有6，2，4，3和2頭之白血球減少動物頻率。對照組與用含0.5毫克/劑 DDA和氫氧化鋁的 Amphigen ®調合物佐輔的疫苗投予的組（T03 )之間的差異具統計顯著性（P S 0.05 )。對照組的最小方均白血病天數（7·8天）相對於投予ITAs組（0.2至1.2天）明顯較爲大0 實施例1 5 在用微流化含GPI - 01 00的疫苗調合物免疫化後BVD病毒 (53) (53)’1301067 抗原的免疫回應之誘發與對抗BVD型2病毒抗原的保護作用採用按實施例14中所述的一組實驗條件且對Quil A與 GPI — 0 1 00進行直接比較。如表1 1與1 2中所示者，用在含 Quil A與或GPI — 01 00的經微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的製劑內之BVD抗原疫苗接種過的動物都具有對 BVD型1和BVD型2病毒之明顯抗體效價。對BVD型1病毒的抗體效價遠高於對BVD型2病毒者。不過，用BVD型2病毒的隨後挑激顯示出強保護作用且在用含有GPI - 0 1 00的微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑接種過的牛中有明顯減低的疾病發生率。

-57- (§> (54)1301067 表11. BVD病毒型1幾何平均血清病毒中和效價

處理幾何平均SVN效價 0 21 35 43 57 T01 食鹽水 <2 <2 <2 <2 35.5 T02 Amphigen， Quil A <2 98.7 20171.0 12203.4 44762.4 T03 Amphigen， 2毫克 GPI-0100，A10H <2 84.6 10998.5 7383.2 25709.2 T04 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100 <2 106.0 18179.2 8933.2 28526.2 T05 Amphigen， 3 毫克 GPI-0100 <2 62.9 15024.3 8780.1 19824.4 T06 Amphigen， 5 毫克 GPI_0100 <2 71.1 12203.3 7512.0 16670.2 -58- ⑩ (55) 1301067 (55)

表12. BVD病毒型2幾何平均血清病毒中和效價處理 BVDv型I幾何z p均SVN效價（第硏究天） 0 21 35 44 58 T01 食鹽水 <2 <2 <2 <2 14.7 T0 2 Amphigen， Quil A <2 12.9 2312.0 1692.5 1663.4 T03 Amphigen， 2毫克 GPI-0100，A10H <2 13.2 1663.5 1116.8 1562.3 T04 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100 <2 20.5 2610.2 1978.2 2478.7 T05 Amphigen， 3 毫克 GPI-0100 <2 11.4 1752.8 1305.2 2435.4 TO 6 Amphigen， 5 毫克 GPI-0100 <2 12.0 3158.4 2120.2 1845.6

-59- (56) 1301067 (56)

表1 3 .挑激後的B V D病奉處理 bvd病毒離【析病毒血症動物頻率 (%) 有病毒血症的 LS平均天數 T01 食鹽水 10/10(100.0) 8.4 T02 Amphigen，Quil A 3/10(30.0 ) 0.3 T03 Amphigen，2毫克 GPI-01 ΟΟ,ΑΙΟΗ 0/10(0.0) 0.0 T04 Amphigen, 2 毫克 GPI-0100 1/10(10.0 ) 0.1 T05 Amphigen， 3毫克 GPI-0100 3/10(30.0 ) 0.3 T06 Amphigen， 5 毫克 GPI-0100 2/10(20.0 ) 0.2

-60- (57)1301067 表14.挑激後的BVD疾病床徵象

處理疾病頻伞有下示臨床疾病計分的觀察件頻率（％) 總觀察數 (%) 0 1 2 T01 食鹽水 5/10 (50.0) 103 (60.6) 55 (32.4) 12 (7.1) 170 T02 Amphigen, Quil A 5/10 (50.0) 115 (67.6) 48 (28.2) 7 (4.1) 170 T03 Amphigen， 2毫克 GPI-0100， AlOH 0/10 (〇.〇) 128 (75.3) 42 (24.7) 0 (〇) 170 T04 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100 0/10 (〇.〇) 124 (72.9) 46 (27.1) 0 (〇) 170 T05 Amphigen， 3 毫克 GPI-0100 0/10 (〇.〇) 104 (61.2) 66 (38.8) 0 (〇) 170 T06 Amphigen, 5 毫克 GPI-0100 0/10 (〇.〇) 128 (75.3) 42 (42.7) 0 (〇) 170 -61 - (58) 1301067 表1 5 ·挑激後的白血球減少處理白ffri球減少白血球減少動物頻率白血球減少的 (%) _ LS平均天數 Τ0 1 食鹽水 9/10(90.0 ) 8.7 T02 Quil A 6/10(60.0 ) 1.6 T03 2毫克 GPI-0100， 7/10(70.0) 2.6 AlOH T04 2 毫克 GPI-0100 4/10(40.0 ) 1.5 T05 3 毫克 GPI-0100 7/10(70.0 ) 2.6 T06 5 毫克 GPI-0100 8/10(80.0) 2.9

總之，每一疫苗的安全性都由經疫苗接種的動物之不含不良反應或無效致死而獲得證實。每一疫苗的效力都由 100%經疫苗接種的動物之血清轉換（對BVD — 1和BVD -φ 2的SVN抗體效價-1 : 8 )而獲證。對挑激的合格抗拒性也由只用2毫克GPI - 01 00佐助的疫苗得到證實。實施例1 6 在微流化水包油乳液中含微封裝抗原的疫苗製備將3克的海藻（Fluka)加到水中而得3 3 3毫克/毫升海藻糖溶液之儲液。將溶解化在0.8% SDS溶液中的重組 PauA抗原（SDS/rPauA)加到海藻糖溶液中而達494微克 rPauA/毫升之最後濃度。於下一步驟中，將10克聚乳交 -62- (ΰ (59) 1301067 醋乙酸酉旨（PLG-Resomer RE 503H，Boeringher Ingelheim )溶解在200毫升二氧甲烷（MeCl2 )中。將所得PLG/ MeCl2溶液與第一步驟中製備的SDS — rPauA/海藻糖溶液混配。對混配溶液使用得自M i c r 〇 f 1 u i d i c s Μ 〇 d e 1 Μ 1 1 0 E Η 的微流化器進行微流化且使用Temco Spray Dryer Model SD- 05將微流化製備物噴霧乾燥。使用500微米篩網收集噴霧乾燥物。 rPauA在噴霧乾燥物質中的濃度係使用西方氏點漬分析予以定量。將1.04毫克噴霧乾燥物溶解在50微升丙酮中且在室溫下以1 3,2 00 rpm離心10分鐘。取出上澄液。將上澄液與沈九部份置於生物安全櫥中乾燥2.5小時。將沈九再懸浮於47.43微升樣品溶液中（25微升樣品緩衝液+ 10 微升還原劑+ 65微升水）。經乾燥的上澄液部份係用20微升樣品溶液予以再懸浮。於西方氏析分中，使用經純化的 PauA作爲標準品以定量分析噴霧乾燥物質的rPauA含量。經由將100克甘露醇（Sigma)溶解在5 00毫升注射用水（MFI )中以製備20%甘露醇儲液。使用電熱板/攪拌器將溶液加熱到40°C，再冷卻至3(TC。將溶液無菌過濾經過0.22微米無菌過濾（Millipore )。將12.5克羧甲基纖維素（Sigma)溶解在5 00毫升MFI中且在4°C下混合整夜以製備2 · 5 %羧甲基纖維素溶液。將溶液在1 2 1 °C壓熱處理。將噴霧乾燥所得粉末在含5%甘露醇，0.3羧甲基纖維素，和1 : 5 000硫柳汞的溶液中重調。將最後溶液分液到3 毫升管瓶內且使用冷凍乾燥器（USIFRDID )予以冷凍乾 (60) (60)1301067 燥。將冷凍乾燥的粉末即表經微封裝的rPauA。將該微封裝亞單元蛋白質抗原再懸浮於2毫升含AMP HI GEN ®調合物的微流化水包油乳液（例如實施例20中所述乳液）之中且用爲疫苗。實施例1 7 同時含細菌全細胞抗原和重組蛋白質抗原於水包油乳液中的微流化疫苗調合物之製備製備兩種疫苗製劑，其包含經內在地加到如實施例2 和3中所述水包油乳液內之重組乳房鏈球菌PauA蛋白及大腸桿菌細菌細胞。該重組PauA抗原的濃度爲100微克每劑且大腸桿菌細胞的最後計數爲4x1 09/劑。兩疫苗調合物的乳液佐劑組成爲表1 6中所示者。表1 6.含重組蛋白和全大腸桿菌細胞兩者之疫苗調合物處理抗原佐劑 T01 無效對照樣食鹽水 T02 PauA/大腸桿菌 SEAM-14 T03 PauA/大腸桿菌 2.5% Amphigen，0.5毫克 GPI-0100,0.5毫克膽固醇 T04 PauA/大腸桿菌 2.5%八11^111§611，0.5毫克溴化二甲基二 (十八烷基）銨（DDA)，0.5毫克膽固醇 -64 - ⑧ (61) 1301067 實施例1 8 對於在水包油乳液中含有rPauA和完全細胞細菌抗原的微流化疫苗之免疫回應於此實驗中係使用成乳牛。於參與時，動物係在彼等的第一或第二泌乳期結束時。用二毫升的各疫苗調合物經皮下投予三次，一次係在缺奶時（D - 0 ) ，2 8天後（二 28)，极在產犢後4至10天（C+4 - C+10)再次投予。第一劑和第三劑係投予在頸左側而第二劑係投予在頸右側。於每一疫苗接種之前都採集血液及在第三次疫苗接種後的灼14天和32天再採血液。對大腸桿菌和rPauA抗原的抗體效價係透過ELIS A測定。如圖8中所示者，其結果指出於用含有GIP- 01 00作爲免疫刺激劑疫苗調合物疫苗接種的組中，對rPauA的抗體效價都較爲高且在初始疫苗接種後的第70天達到峰値。圖9顯示出對大腸桿菌抗原的抗體效價。兩疫苗調合物所得對大腸桿菌抗原的抗體效價係相當者，不過GPI - 0 1 00作爲免疫刺激劑的存在相對於 DDA作爲免疫刺激劑之調合物時，會誘導出相對較高的抗體效價。實施例1 9 微流化以AMP HI GEN ®調合物爲基質的疫苗製劑之殺病毒活性分析爲了測定微流化是否會抑活化病毒，乃測定三種經微流化以AMP HI GEN ®調合物爲基底的疫苗製劑之殺病毒活 -65- (62) ^ 1301067 性。該三種製劑各含三不同的牛傳染性病毒，亦即牛疱疹病毒（BHV )、副流感病毒3 ( PI3 )、和牛呼吸道胞合病毒（BRSV)。三種疫苗製劑中殺病毒活性的偵測係根據USD A 9CFR 、1 1 3.3 5的要求進行。表16中所示結果表明以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑之微流化不會引起疫苗製劑的任何明顯抑活化。

表1 6.微流化疫苗的殺病毒活性分析樣品系 BRSV BHV PI3 A 0 0.2 0 AM200 -0.2 0 -0.2 AM75 0 -0.3 -0.3 AM75@37C 0.1 -0.3 -0.2 B 0 -0.1 -0.2 BM200 0 0 -0.2 BM75 -0.2 -0.5 0 BM75@37C 0.5 -0.5 0 C 0.1 -0.1 -0.2 CM200 -0.2 -0.1 -0.2 CM75 0.1 0.5 -0.2 CM75@37C 0.5 0.5 -0.2

A=膽固醇，以650毫升/分添加 A =膽固醇，以28毫升/分添加 -66- ⑧ (63) 1301067 C =膽固醇，以5毫升/分添加 M200 =用200微米篩網微流化 M75=用75微米篩網微流化 M7 5@37C =微流化之前加熱到37°C的流體 0.7以上的値即爲殺病毒作用之指示。實施例2 0 微流化AMPHIGEN ®調合物之製備經由將DRAKEOL卵磷脂油溶液（含25 %卵磷脂的輕質礦油）與TWEEN 80 (最後濃度0.18%) Span 80 (最後濃度0 · 0 8 % )在3 6 ± 1 °C混合8 - 2 2小時予以混配以製備 AMPHIGEN ®調合物。然後將油混合物藉助Ross ®乳化器 (Hauppauge, NY 1 1 78 8 )以約 3400 rpm加到食鹽水中。隨後，將該混合物於4500±500 psi下通過有200微米交互作用室的微流化器一次。圖1 0 A和1 0 B顯示出微流化 AMPHIGEN ®調合物之穩定性。在起始，初時點（圖10A )以雷射繞射測量的粒度分布幾乎相同於在4 °C下貯存22 個月後（圖10B)的粒度分布。實施例2 1

Quil A-膽固醇免疫原複合物之電子顯微鏡分析爲了測定由Quil A和膽固醇形成的免疫原複合物所具本質’乃在含或不含抗原之下製出此兩成分的混合物。於一裝有50毫升KR— Hals緩衝液的燒杯中，在用磁 -67- (64) 1301067 棒攪拌該溶液之同時加入BVD型I抗原。其後，在攪拌該溶液之同時滴加濃Quil A儲液（50毫克/毫升）以達到50 微克/毫升之取後濃度。於Quil A添加之後，加入膽固醇 /乙醇儲液（18毫克/毫升）到50微克/毫升之最後濃度〇於第二燒杯中，以相同方式將Quil A和膽固醇加到不含任何BVD型I抗原的50毫升緩衝液中。用於透射電子顯微術時，將1 〇微升各樣品吸附到有 formvar /碳承載平台的400網目銅柵之上（Electron Microscopy Sciences, Inc., Fort Washington，PA) ° 使用 10微升經濾過的2%磷鎢酸，pH 5.2作爲對比劑將樣品負染色。使用JEOL 1 23 0透射電子顯微鏡（JEOL Inc.， Tokyo，Japan)以80 Kv加速電壓檢驗樣品。於Gatan BioScan 792攝影機上實施數位照像。在4489 EM底片上完成底片顯微術並印到Kodabrome II RC F3相紙上（ Eastman Kodak Company, Rochester, NY)。於只含膽固醇和Quil A而無任何BVD型I抗原的溶液中，偵測到螺旋微團加上Quil A微團和膽固醇晶體（圖1 1 )。螺旋微團係交纒著且呈現出網狀。於含BVD型I抗原的樣品中，發現螺旋微團隨機地包圍著某些密實部位（圖 12)。該等密實部位表BVD型I抗原且發現從Quil A和膽固醇締合所得螺旋免疫原性複合物係吸附在BVD型I抗原的表面之上。 -68- ⑧ (65) 1301067 【圖式簡單說明】圖1繪示出未微流化疫苗組成物的批式製備程序。於此程序中，係將各種疫苗成分加到左側的添加容器且於最後泵取到摻合容器內，於此處透過簡單機械手段將各成分混合在一起。圖2繪示出含有經內在摻加的抗原之微流化疫苗組成物之製備程序。將各種疫苗成分添加到添加容器。再傳送到預乳化液摻合單元中，透過簡單的機械手段予以混合。隨後’將乳液通過一'微流化器並收集在後-微流化室內。圖3繪示出未微流化的以AMP HI GEN ®調合物爲基底的疫苗，經微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗、和枱式摻合疫苗製劑之液滴尺寸分布。圖4顯示出在微流化疫苗製劑中沒有相分離現象。圖5繪示出經內在地摻加在微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑（A9075 05 )和三種對照用的未微流化以AMPHIGEN ®調合物爲基底的疫苗製劑（A9043 69 ，A904 3 70，和A9043 7 1 )之穩定性比較。所有四種疫苗製劑都貯存在4 °C下二年。於貯存中的不同時間點（〇，6 ，：12，或24個月），所有四種調合物都用來疫苗接種三個月大的母牛。疫苗接種係在第0天和第21天用2毫升疫苗劑量完成的且於第二次疫苗接種的二個星期後採取血清。測定每一血清樣品中的對BVD II型病毒之中和性抗體效價。將數據呈現爲5頭動物的幾何平均値。圖6顯示出在投予微流化與未微流化疫苗之前與之後 -69- (66) 1301067 ，牛的最小方均直腸溫度。το 1 :無效對照組一單劑； T02 :無效對照組—雙劑；T03 :未微流化調合物一單劑 ;T04 :未微流化調合物—雙劑；T05 :微流化調合物— 單劑；T 0 6 :微流化調合物—雙劑。圖7繪示出在投予未微流化和微流化疫苗調合物之後在牛中觀察到的最小方均注射部位反應體積。T03 :未微流化調合物—單劑；T04 :未微流化調合物—雙劑；T05 :微流化調合物-單劑；T06 :微流化調合物一雙劑。圖8繪示出在使用含重組PaiiA抗原和大腸桿劑完整細胞抗原的不同疫苗調合物疫苗接種之後，對來自乳房鏈球菌（Streptococcus uberis)的重組PauA抗原之幾何平均 IgG效價。圖9繪示出在用同時含重組PauA抗原和大腸桿菌完整細胞抗原的不同疫苗調合物疫苗接種之後，對來自乳房鏈球菌的大腸桿菌完整細胞抗原之幾何平均IgG效價。圖10和10B繪示出在初始製造時（圖10A)與製造後 22個月（圖10B )，微流化Amphigen調合物之粒度分布。圖11爲電子顯微相片，顯示出用長Quil A微團和膽固醇晶體形成之螺旋微團。圖12爲電子顯微相片，顯示出由Quil A和膽固醇在 BVD I型抗原表面上形成之螺旋免疫原性複合物。 -70-

Claims

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十、申請專利範圍附件2A : 第94 1 1 05 24號專利申請案 I 中文申請專利範圍替換本i 民國97年4月8日修正

1 · 一種疫苗組成物，其包含植物皂素糖苷和固醇，該植物皂素糖苷對固醇之含量比例係介於1 : 100至5 : 1 ( 重量/重量）之間，其中該植物皂素糖苷與該固醇係彼此締合以形成呈螺旋微團型式且具有免疫刺激活性之複合物，且該疫苗另包含免疫上有效量之抗原，其中該抗原係與該螺旋微團摻合而非整合至該螺旋微團內。 2 .如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其另包含獸醫學上可接受之載劑。 3 .如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中該獸醫學上可接受之載劑爲水包油乳化液。 4.如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該植物巷素糖苷爲一三廠。 5 .如申請專利範圍第4項之疫苗組成物，其中該類三萜爲Quil A。 6. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該固醇爲膽固醇。 7. 如申請專利範圍第1項之疫苗組成物，其中該抗原包含病毒抗原、細菌抗原或彼等之組合。 8. 如申請專利範圍第7項之疫苗組成物，其中該抗原包含牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)第I型或第II型抗原。 1301067 1 9. 一種水包油佐劑組成物，其包含於獸醫學上可接受之載劑中的Quil A和膽固醇，該Quil A對膽固醇之含量比例係介於1 : 100至5 : 1 (重量/重量）之間，其中該 Quil A與膽固醇係彼此締合以形成螺旋微團型式且具有免疫刺激活性之複合物，且該螺旋微團係經獸醫學上可接受之載劑微流化以形成次微米水包油乳化液。

i #1301067 * 附件 1 :第 94110524中文圖式替換本號專利申請案I一民國97年6月11日修正日修(更)正本j 一―,——J 846770 I®• 參

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