CN1997390A - 微流化水包油乳状液和疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用作疫苗佐剂以提高抗原免疫原性的亚微型水包油乳状液。本发明还提供了含有固有地或非固有地与这种乳状液结合的抗原的疫苗组合物。本发明还提供了制备乳状液和疫苗的方法。

Description

微流化水包油乳状液和疫苗组合物
技术领域
本发明大体上涉及疫苗领域，并特别涉及用于在动物体内提高免疫应答的辅佐制剂。具体而言，本发明涉及亚微型水包油乳状液作为疫苗佐剂以提高抗原免疫原性的用途。本发明提供了亚微型水包油乳状液制剂、含有并入这种乳状液中的抗原的疫苗组合物、以及这种乳状液和疫苗的制备方法。本发明还提供了包含由适用于疫苗的皂草糖苷和甾醇形成的络合物的组合物。
背景技术
细菌、病毒、寄生物和支原体传染广泛分布在动物中，例如牛、猪和宠物。由这些传染剂引起的疾病通常对杀菌剂药物治疗具有抵抗力，由此没有有效的治疗手段。因此，越来越多地使用疫苗学途径控制动物中的传染病。整个传染性病原体可以在化学灭活或适当基因操作之后适用于疫苗制剂。或者，病原体的蛋白质亚单位可以在重组表达系统中表达并提纯以用于疫苗制剂。
佐剂通常是指提高对抗原的体液和/或细胞免疫应答的任何材料。传统的疫苗是由灭活的致病微生物的粗制品构成的，并且与病理微生物的培养物共存的杂质可以充当提高免疫应答的佐剂。然而，当使用病理微生物或纯化蛋白质亚单位的均一制品作为疫苗接种的抗原时，这些抗原引发的免疫性差并因此必须添加佐剂之类的某些外源材料。此外，合成和亚单位疫苗的制造昂贵。因此，借助于佐剂，激发免疫应答需要较少剂量的抗原，由此节省疫苗的制造成本。
佐剂已知以许多不同的方式发挥作用以提高免疫应答。许多佐剂改变了与免疫应答相关的细胞因子网络。这些免疫调节佐剂即使没有与抗原结合，也可以发挥它们的效用。一般而言，免疫调节佐剂造成某些细胞因子的总体上调(general up-regulation)和其它细胞因子的伴生下调(concomitant down regulation)，从而产生细胞Th1和/或体液Th2应答。
一些佐剂具有保持抗原构造完整性的能力，由此可以有效地将抗原呈递给合适的免疫效应细胞。由于辅佐制剂对抗原构造的这种保持性，疫苗具有提高的贮存寿命，例如对免疫刺激复合物表现出的那样(ISCOMs)。Ozel M.等人；Quarternary Structure of theImmunestimmulating Complex(Iscom)，J.of Ultrastruc.and Molec.Struc.Res.102，240-248(1989)。
一些佐剂具有使抗原作为基地(depot)保存在注射部位的性能。由于这种基地效应，抗原不会通过肝脏清除迅速流失。铝盐和油包水乳状液通过这种基地效应作用较短的时间。例如，可以使用作为油包水乳状液的弗氏完全佐剂(FCA)获得长期基地。FCA通常保留在注射部位直至生物降解可以通过抗原呈递细胞去除抗原。
基于它们的物理性质，佐剂可以分成两大类，也就是粒状佐剂和非粒状佐剂。粒状佐剂以微粒形式存在。免疫原能够与微粒结合或并存。铝盐、油包水乳状液、水包油乳状液、免疫刺激复合物、脂质体以及纳米微粒和微粒是粒状佐剂的例子。非粒状佐剂通常是免疫调节剂，并且它们通常与粒状佐剂结合使用。胞壁酰二肽(从分枝杆菌中提取出的肽聚糖的佐剂活性组分)、非离子嵌段共聚物、皂草苷(从皂皮树的树皮中提取出的三萜系化合物的复合混合物)、脂质A(含有两个磷酸根基团和五个或六个通常C12至C16长度的脂肪酸链的葡糖胺的二糖)、细胞因子、碳水化合物聚合物、衍生的多糖、和细菌毒素(例如霍乱菌毒素和不耐大肠杆菌的毒素(LT))是非粒状佐剂的例子。
一些公知的佐剂是非粒状免疫调节剂和能够赋予辅佐制剂基地效应的粒状材料的结合。例如，FCA将结核杆菌组分的免疫调节性能与油乳剂的短期基地效应结合在一起。
油乳剂很早以前就用作疫苗佐剂。Le Moignic和Pinoy在1916年发现，灭活鼠伤寒沙门氏菌在矿物油中的悬浮液提高了免疫应答。随后在1925年，Ramon描述了作为增强对白喉类毒素的抗毒响应的物质之一的淀粉油。然而，油乳剂直至1937年才开始普及，当时Freund公布了他的现在被称作弗氏完全佐剂(FCA)的辅佐制剂。FCA是由与灭活分枝杆菌和失水山梨醇酯A(Arlacel A)混合的矿物(石蜡)油构成的油包水乳状液。Arlacel A主要是单油酸二缩甘露醇酯，并用作乳化剂。尽管FCA能够优异地诱发抗体反应，但其造成严重的疼痛、脓肿形成、发烧和肉芽肿性炎症。为了避免这些不合意的副反应，开发出不完全的弗氏佐剂(IFA)。IFA在组成上与FCA类似，只是不存在分枝杆菌组分。IFA通过基地配方在注射部位发挥作用，并在抗体生成细胞的刺激下减缓抗原释放。
另一种改进FCA的途径是基于下述概念一用生物相容油代替矿物油将有助于在注射部位消除与FCA相关的反应。乳状液也被认为应该是水包油型，而非油包水型，因为后者在注射部位产生长期基地。Hilleman等人描述了油基佐剂“Adjuvant65”，其是由86％花生油、10％作为乳化剂的Arlacel A和4％作为稳定剂的单硬脂酸铝构成。Hilleman，1966，Prog.Med.Virol.8：131-182；Hilleman和Beale，1983，在NewApproaches to Vaccine Development中(Eds.Bell，R.and Torrigiani，G.)，Schwabe，Basel。在人体中，Adjuvant 65是安全和有效的，但是与IFA相比表现出较低的辅助性。然而，由于使用纯化或合成乳化剂代替Arlacel A时许多疫苗对人类的反应原性和辅助性的降低，停止了Adjuvant65的使用。美国专利5,718,904和5,690,942提出，水包油乳状液中的矿物油可以被替换成可代谢油以改进安全性。
除了辅助性和安全性，乳状液的物理外观也是重要的商业考虑因素。物理外观取决于乳状液稳定性。乳状液分层、沉积和聚集是乳状液不稳定的指征。当乳状液的油相和水相具有不同的比重时，发生乳状液分层。当乳状液的初始液滴尺寸很大且乳状液滴没有任何布朗运动时，也会发生乳状液分层。当液滴尺寸很大时，存在界面破坏的趋势且液滴聚结成大粒子。乳状液的稳定性由许多因素决定，例如所用乳化剂的性质和量、乳状液中的液滴尺寸、和油相与水相之间的密度差。
乳化剂通过降低界面自由能和对液滴聚结产生物理或静电阻碍，促进分散的液滴的稳定性。已经使用非离子型和离子型洗涤剂作为乳化剂。非离子型乳化剂在界面上取向并产生相对松散(bulky)的结构，从而导致分散的液滴的空间空缺(steric avoidance)。阴离子或阳离子乳化剂通过吸引抗衡离子引发电双层的形成；这种双层推斥力使液滴在互相接近时互相推斥。
除了使用乳化剂，也可以通过用机械装置降低乳状液的液滴尺寸来实现乳状液稳定性。通常，使用推进式混合器、涡轮转子、胶体磨、均化器和超声波仪制造乳状液。微流化是提高乳状液中液滴尺寸均一性的另一种方式。微流化可以产生优异的物理稳定的乳状液，其具有亚微范围的一致粒度。除了提高乳状液的稳定性，微流化方法能够实现终端过滤，这是优选的确保最终产物无菌性的方式。此外，亚微型油粒子可以从注射部位进入淋巴，然后进入排泄链的淋巴结、血液和脾。这降低了在注射部位形成油状基地的可能性，其可能产生局部炎症和明显的注射部位反应。
微流化器现已市售。当两种流化流在互作用室中高速互相作用时，在微流化器中形成乳状液。微流化器是空气或氮气驱动的，并可以在超过20,000psi的内压下运行。美国专利4,908,154提出使用微流化器以获得基本不含任何乳化剂的乳状液。
在文献中已经描述了许多亚微型水包油辅佐制剂。美国专利5,376,369提出被称作Syntax Adjuvant Formulation(SAF)的亚微型水包油乳状液辅佐制剂。SAF包含作为油组分的角鲨烯或角鲨烷、乳状液形成量的Pluronic L121(聚氧丙烯-聚氧乙烯)嵌段共聚物和免疫增强量的胞壁酰二肽。角鲨烯是在许多组织中，尤其是在鲨鱼和其它鱼类肝脏中发现的线型烃前体。角鲨烷通过角鲨烯的氢化制备，并且是完全饱和的。角鲨烯和角鲨烷均可以进行新陈代谢并具有毒物学研究的良好记录。角鲨烯或角鲨烷乳状液已经以轻微的副作用和合意的效力用在人类癌症疫苗中。参看，例如，Anthony C.Allison，1999，Squaleneand Squalane emulsions as adjuvants，Methods19：87-93。
美国专利6,299,884和国际专利公开WO90/14837提出，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物对于亚微型水包油乳状液的形成不是必须的。此外，这些参考文献提出无毒可代谢油的使用，并明确排除矿物油和有毒石油馏分油在它们的乳状液制剂中的应用。
美国专利5,961,970提出用作疫苗佐剂的又一亚微型水包油乳状液。在该专利所述的乳状液中，疏水组分选自中链甘油三酯油、植物油和它们的混合物。该乳状液中包含的表面活性剂可以是天然的生物相容性表面活性剂，例如磷脂(例如卵磷脂)或药学可接受的非天然表面活性剂(例如TWEEN-80)。该专利还提出在形成乳状液时，在乳状液中加入抗原，而非在已经独立地和外源性地形成乳状液之后将抗原与乳状液混合。
美国专利5,084,269提出，包含与矿物油结合的卵磷脂的辅佐制剂导致宿主动物体内刺激的降低并同时引发提高的全身免疫。来自美国专利5,084,269的辅佐制剂商业上用于商品名为AMPHIGEN的兽用疫苗。AMPHIGEN制剂是由被卵磷脂包围的微胞-油滴构成的。这些微胞与传统的油基佐剂相比，能够与更完整的细胞抗原连接。此外，AMPHIGEN基疫苗制剂与包含油佐剂(通常包含10％至20％油)的其它疫苗制剂相比，包含低油含量的2.5至5％矿物油。其低油含量使这种佐剂基疫苗制剂对注射部位的组织较不刺激，从而产生较少损伤并在屠宰时需要较少修整。此外，油滴周围的卵磷脂涂层进一步降低了注射部位反应，从而产生既安全又有效的疫苗。
使用AMPHIGEN制剂作为许多兽用疫苗中的佐剂，并需要在短和长储存期内以及在重构时保持疫苗产品的物理外观。此外，就在注射之前，将冻干抗原与预制辅佐制剂混合。这种实践并不总是确保抗原在水包油乳状液中的均匀分布，并且乳状液的外观可能不合意。此外，在静置时，均匀乳状液可能表现出相分离。因此，需要在长贮存寿命中不会表现出相分离的稳定的辅佐制剂。防止相分离的一种方式是降低乳状液的液滴尺寸并提高粒子均一性。尽管文献中已经提出了可代谢油基乳状液制剂的微流化方法，但还没有进行AMPHIGEN制剂之类的水包油乳状液的微流化。
在本发明中，使用微流化使卵磷脂包围的矿物油液滴的尺寸达到亚微尺寸。意外地，本发明人已经发现，用由卵磷脂和油的混合物构成的水包油乳状液辅佐的疫苗制剂的微流化，不仅改进了制剂的物理外观，还提高了制剂的免疫效果。微流化制剂还以改进的安全性为特征。
发明内容
本发明人已经意外地发现，可以通过微流化改进不可代谢油基水包油乳状液的佐剂活性和安全性。即使抗原在微流化之前固有地并入乳状液中，并入微流化乳状液中的抗原也是稳定的。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了可用作疫苗佐剂的亚微型水包油乳状液制剂。本发明的亚微型水包油乳状液是由不可代谢的油、至少一种表面活性剂和水性组分构成的，其中该油以亚微米范围的平均油滴尺寸分散在水性组分中。优选的不可代谢油是轻质矿物油。优选的表面活性剂包括卵磷脂、TWEEN-80和SPAN-80。
本发明提供的优选水包油乳状液是由AMPHIGEN制剂构成的。
本发明的水包油乳状液可以包括适当和合意的附加组分，包括防腐剂、渗透剂、生物粘附分子和免疫刺激分子。优选的免疫刺激分子包括，例如Quil A、胆固醇、GPI-0100、溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)。
在另一实施方式中，本发明提供了制备亚微型水包油乳状液的方法。按照本发明，将乳状液的各种组分，包括油、一种或多种表面活性剂、水性组分和适合用在乳状液中的任何其它组分混合在一起。对该混合物进行初级乳化过程以形成水包油乳状液，然后使其通过微流化器以获得液滴直径小于1微米，优选平均液滴尺寸小于0.5微米的水包油乳状液。
在又一实施方式中，本发明提供了包含抗原和上述亚微型水包油乳状液的疫苗组合物。将抗原非固有地或固有地，优选固有地并入乳状液。
可以包含在本发明的疫苗组合物中的抗原可以是细菌、真菌或病毒抗原、或它们的结合。抗原可以呈现灭活的完整或部分细胞或病毒制品的形式，或通过传统的蛋白质提纯、基因工程技术或化学合成获得的抗原分子形式。
在进一步实施方式中，本发明提供了含有与亚微型水包油乳状液结合的一种或多种抗原的疫苗组合物的制备方法。
在制备本发明的疫苗组合物时，抗原可以固有地(例如在微流化之前)或非固有地(例如在微流化之后)与水包油乳状液的组分结合。优选地，抗原固有地与水包油乳状液的组分结合。
在又一实施方式中，本发明提供了包含微囊化抗原和上述亚微型水包油乳状液的疫苗组合物，其中该微囊化抗原非固有地与乳状液结合。
还意外地发现，皂草苷和甾醇在溶液中结合时，互相结合形成螺旋状微胞形式的复合物。按照本发明，这些螺旋状微胞复合物具有免疫刺激活性并尤其可用作疫苗组合物中的佐剂。
因此，本发明提供了包含皂草苷和甾醇的免疫组合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋状微胞形式的复合物。本发明还提供了包含皂草苷、甾醇和抗原的组合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋状微胞形式的复合物，并且其中抗原与螺旋状微胞混合但没有结合。
附图说明
图1描绘了用于非微流化疫苗组合物的分批制备的方法。在该方法中，在左方的加料容器中加入各种疫苗组分，并最终用泵送入掺合容器，在此将各组分通过简单机械装置混合在一起。
图2描绘了包含固有地并入的抗原的微流化疫苗组合物的制备方法。在加料容器中加入各种疫苗组分，并转移到预乳化掺合装置中以通过简单机械装置混合。随后，使乳状液经过微流化器并收集在后微流化室中。
图3描绘了非微流化AMPHIGEN制剂基疫苗、微流化AMPHIGEN制剂基疫苗和台式(bench)掺合疫苗制品的液滴尺寸分布。
图4表明在微流化疫苗制剂中不存在相分离。
图5描绘了固有地并入微流化AMPHIGEN制剂基疫苗制品(A907505)和三种对照的非微流化AMPHIGEN制剂基疫苗制品(A904369、A904370和A904371)中的抗原稳定性的比较。所有四种疫苗制品都在4℃储存2年。在储存过程中的不同时间点(0、6、12或24个月)，使用所有四种制剂为三月龄的母牛接种疫苗。以2毫升疫苗剂量在第0和第21天进行疫苗接种，并在第二次接种后两周收集血清。在每种血清样品中测定BVD II型病毒的中和抗体滴定度。以5个动物的几何平均值表示数据。
图6显示了施用微流化和非微流化疫苗之前和之后牛的最小均方直肠温度。T01：安慰剂组单剂量；T02：安慰剂组-双剂量；T03：非微流化制剂-单剂量；T04：非微流化制剂-双剂量；T05：微流化制剂-单剂量；T06：微流化制剂-双剂量。
图7描绘了在施用非微流化和微流化疫苗制剂后在牛体内观察到的最小均方注射部位反应。T03：非微流化制剂-单剂量；T04：非微流化制剂-双剂量；T05：微流化制剂-单剂量；T06：微流化制剂-双剂量。
图8描绘了用含有重组PauA抗原和大肠杆菌完整细胞抗原的各种疫苗制剂进行疫苗接种后，来自乳房链球菌的重组PauA抗原的几何平均IgG滴定度。
图9描绘了用含有重组PauA抗原和大肠杆菌完整细胞抗原的各种疫苗制剂进行疫苗接种后，来自乳房链球菌的大肠杆菌完整细胞抗原的几何平均IgG滴定度。
图10A和10B描绘了在最初制成的(图10A)和在制成后22个月(图10B)的微流化Amphigen制剂的粒度分布。
图11是表明用Quil A微胞和胆固醇晶体形成的螺旋状微胞的电子显微照片。
图12是表明通过Quil A和胆固醇在BVD I型抗原表面上形成的螺旋状免疫原复合物的电子显微照片。
具体实施方式
本发明人已经意外地发现，用由卵磷脂和矿物油的混合物构成的水包油乳状液辅佐的疫苗制剂的微流化，不仅改进了疫苗制剂的物理外观，还提高了疫苗制剂的免疫效用。微流化疫苗制剂还以改进的安全性为特征。
根据这些发现，本发明提供了可用作疫苗组合物佐剂的亚微型水包油乳状液。还提供了使用微流化器制造这些亚微型水包油乳状液的方法。此外，本发明提供了亚微型疫苗组合物，其中将抗原与亚微型水包油乳状液结合。还提供了制造这些疫苗组合物的方法。本发明进一步提供了包含与亚微型水包油乳状液结合的微囊化抗原的疫苗组合物和制造这些疫苗的方法。
为了清楚地公开本发明，且不是限制性的，将发明详述分成下列部分，它们描述或举例说明了本发明的某些特征、实施方式或应用。
亚微型水包油乳状液
在一个实施方式中，本发明提供了可用作疫苗佐剂的亚微型水包油乳状液制剂。本发明的亚微型水包油乳状液提高了疫苗组合物中抗原的免疫原性，可以安全地施用于动物并且在储存过程中稳定。
本发明的亚微型水包油乳状液是由不可代谢的油、至少一种表面活性剂和水性组分构成的，其中该油以亚微米范围的平均油滴尺寸分散在水性组分中。
“亚微型”是指液滴具有小于1微米的尺寸，并且平均油滴尺寸小于1微米。优选地，乳状液的平均液滴尺寸小于0.8微米；更优选小于0.5微米；进一步优选小于0.4微米，或大约0.1-0.3微米。
“平均液滴尺寸”定义为在粒度体积分布内的体积平均直径(VMD)粒度。将各个粒径乘以该尺寸的所有粒子的体积并求和，由此计算VMD。然后将其除以所有粒子的总体积。
本文所用的术语“不可代谢的油”是指不能被作为乳状液施用对象的动物身体代谢的油。
本文所用的术语“动物”和“动物对象”是指所有非人类动物，包括例如牛、羊和猪。
适用于本发明的乳状液中的不可代谢油包括链烷、链烯、炔和它们相应的酸和醇、它们的醚和酯、以及它们的混合物。优选地，油的各个化合物是轻质烃化合物，也就是说，这些组分含有6至30个碳原子。该油可以合成制备或由石油产物提纯。用于本发明的乳状液的优选的不可代谢油包括例如矿物油、石蜡油和环烷。
术语“矿物油”是指由矿脂经由蒸馏技术获得的液态烃混合物。该术语与“液化石蜡”、“液体矿脂”和“石蜡油”同义。该术语还要包括“轻质矿物油”，也就是类似地通过矿脂蒸馏获得但比重略低于石蜡油的油。参看，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1990，788和1323页)。矿物油可以由多种商业来源获得，例如J.T.Baker(Phillipsburg，PA)，USBCorporation(Cleveland，OH)。优选的矿物油是以名称DRAKEOL出售的轻质矿物油。
通常，本发明的亚微型乳状液的油组分存在量为1体积％至50体积％；优选10％至45％；更优选20％至40％。
本发明的水包油乳状液通常包括至少一种(也就是一种或多种)表面活性剂。表面活性剂和乳化剂是在本文中可以互换使用的术语，其是使油滴表面稳定并使油滴保持所需尺寸的试剂。
适用于本发明乳状液的表面活性剂包括天然的生物相容表面活性剂和非天然的合成表面活性剂。生物相容的表面活性剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂是磷脂酰胆碱(卵磷脂)，例如大豆或蛋卵磷脂(egg lecithin)。卵磷脂可以通过水洗粗制植物油并分离和干燥所得水合树胶，从而作为磷脂和甘油三酯的混合物获得。将通过丙酮洗涤去除甘油三酯和植物油后剩余的丙酮不溶的磷脂和糖脂的混合物分馏，由此可以获得精制产品。或者，可以由各种商业来源获得卵磷脂。其它合适的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。磷脂可以从天然来源中分离或照惯例合成。
适合在本发明的亚微型乳状液中使用的非天然合成表面活性剂包括脱水山梨糖醇基非离子表面活性剂，例如脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(以名称SPAN或ARLACEL市售)、聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN)、来自蓖麻油之类的来源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR)；聚乙氧基化脂肪酸(例如以名称SIMULSOL M-53获得的硬脂酸)、聚乙氧基化异辛基苯酚/甲醛聚合物(TYLOXAPOL)、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ)；聚氧乙烯nonphenyl醚(TRITONN)、聚氧乙烯异辛基苯醚(TRITONX)。优选的合成表面活性剂是以名称SPAN和TWEEN获得的表面活性剂。
优选用于本发明的水包油乳状液中的表面活性剂包括卵磷脂、Tween-80和SPAN-80。
一般而言，表面活性剂(或如果使用两种或多种表面活性剂，则是表面活性剂的组合)在乳状液中的存在量为0.01至10体积％，优选0.1％至6.0％，更优选0.2％至5.0％。
水性组分构成乳状液的连续相并可以是水、缓冲盐水或任何其它合适的水溶液。
本发明的水包油乳状液可以包括适当和合意的附加组分，包括防腐剂、渗透剂、生物粘附分子和免疫刺激分子。
生物粘附分子被认为可以提高在目标粘液表面上或透过目标粘液表面的抗原输送和粘附，以产生粘膜免疫性。合适的生物粘附分子的例子包括酸性非自然生成的聚合物，例如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸(例如CARBOPOL、CARBOMER)；酸性合成改性的天然聚合物，例如羧甲基纤维素；中性合成改性的天然聚合物，例如(羟丙基)甲基纤维素；含碱性胺的聚合物，例如脱乙酰壳多糖；可获自天然来源的酸性聚合物，例如藻酸、透明质酸、果胶、黄蓍胶、和刺梧桐树胶；和中性非天然生成的聚合物，例如聚乙烯基醇；或它们的混合物。
本文所用的短语“免疫刺激分子”是指提高由疫苗组合物中的抗原组分引发的保护性免疫应答的那些分子。合适的免疫刺激材料包括细菌细胞壁组分，例如N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺的衍生物，例如莫拉丁酯(murabutide)、苏氨酰基MDP和胞壁酰基三肽；皂草糖苷及其衍生物，例如Quil A、QS21和GPI-0100；胆固醇；和季铵化合物，例如溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)和N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺(“阿夫立定(avridine)”)。
皂草苷是在许多植物中作为二次代谢物产生的糖苷化合物。皂草苷的化学结构产生大范围的制药和生物活性，包括一些潜在和有效的免疫活性。
皂草苷在结构上由连接到一个或多个糖链上的任何糖苷配基构成。皂草苷可以按照它们的糖苷配基组成进行分类：三萜烯糖苷、类固醇糖苷、和甾体生物碱糖苷。
皂草苷可以从皂皮树的树皮中分离。皂草苷很早就是已知的免疫刺激剂。Dalsgaard，K.，“Evaluation of its adjuvant activity with a specialreference to the application in the vaccination of cattle againstfoot-and-mouth disease”，Acta. Vet.Scand.69：1-40 1978。包含皂草苷的植物粗提物提高了口蹄疫疫苗的效力。然而，这种粗提物用于疫苗时具有负面副作用。因此，Dalsgaard通过渗析、离子交换和凝胶过滤色谱法从皂草苷中部分提纯佐剂活性组分。Dalsgaard，K等人，“Saponinadjuvants III.Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina withadjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines”，Arch.Gesamte.Virusforsch.44：243-254 1974。由此提纯的佐剂活性组分被称作“QuilA”。在重量基础上，Quil A与粗制皂草苷相比，表现出提高的效力并表现出降低的局部反应。Quil A广泛用于兽用疫苗。
通过高压液相色谱法(HPLC)进行的Quil A的进一步分析，揭示了紧密相关的皂草苷的多相混合物，并发现了QS21-其是具有降低或最小毒性的有效佐剂。Kensil C.R.等人“Separation and characterizationof saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex，”J.Immunol.146：431-437，1991。与多数其它免疫刺激剂不同，QS21是水溶性的并可用在含有或不含乳状液型制剂的疫苗中。QS21已经表明在小鼠中引发Th1型应答，这激发IgG2a和IgG2b抗体以及响应亚单位抗原的诱发的抗原特异性CD8+CTL(MHC I类)的生成。人类临床研究已经证明其在可接受的毒理学特征下的辅助性。Kensil，C.R等人，“Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvantQS-21.In Vaccine Design：the subunit and Adjuvant Approach”，Eds.Powell，M.F.and Newman，M.J.Plenum Publishing Corporation，NewYork.1995，pp.525-541。
美国专利6,080,725描述了制造和使用皂草苷-亲脂体结合物的方法。在这种皂草苷-亲脂体结合物中，亲脂体部分(例如脂质、脂肪酸、聚乙二醇或萜烯)经由三萜烯皂草苷的3-O-葡糖醛酸上存在的羧基共价连接到非酰化或脱酰基化(desacylated)三萜烯皂草苷上。亲脂体部分与皂草苷(例如来自丝石竹(Gypsophila)、肥皂草和针珊瑚(Acanthophyllum)的Quillaja desacylsaponin、lucyoside P或皂草苷)的3-O-葡糖醛酸的连接提高了它们对体液和细胞介导的免疫性的辅佐效果。此外，亲脂体部分与非酰化或脱酰基皂草苷(desacylsaponin)的3-O-葡糖醛酸残基的连接产生更容易提纯、毒性较低、化学上更稳定、并具有与原始皂草苷相同或更好的佐剂性能的皂草苷类似物。
GPI-0100是美国专利6,080,725中描述的皂草苷-亲脂体结合物。经由葡糖醛酸的羧基，在脱酰基皂草苷中加入脂肪族胺，由此制造GPI-0100。
季铵化合物-已经提出了许多用作免疫学佐剂的脂肪族含氮碱，包括胺、季铵化合物、胍、苯甲脒和硫脲鎓。具体的这类化合物包括溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)和N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺(“阿夫立定”)。
美国专利5,951,988提出含有与油组分结合的季铵盐(例如DDA)的辅佐制剂。该制剂可以用于在疫苗组合物中与已知的免疫物质(例如病毒或细菌抗原)结合以提高免疫原性响应。该组合物还可以在不含结合抗原的情况下用作非特异性免疫刺激制剂。
美国专利4,310,550描述了与脂肪或脂质乳状液一起配制的N，N-高级烷基-N，N’-双(2-羟乙基)-丙二胺和N，N-高级烷基-亚二甲苯基二胺作为疫苗佐剂的用途。在美国专利4,310,550中描述了通过辅佐制剂的肠道外给药，在人或动物中引发或提高抗原的免疫原性响应的方法。
在优选实施方式中，本发明提供了可用作疫苗佐剂的亚微型水包油乳状液，其是由液滴尺寸小于1微米且平均液滴尺寸为大约0.25微米的AMPHIGEN制剂构成的。
本文所用的术语“AMPHIGEN制剂”是指通过将DRAKEOL卵磷脂油溶液(Hydronics，Lincoln，NE)与盐水溶液在存在TWEEN80和SPAN80的情况下混合而形成的溶液。典型的AMPHIGEN制剂含有40体积％的轻质矿物油(v/v)、大约25％w/v卵磷脂、大约0.18体积％的TWEEN80(v/v)和大约0.08体积％的Span80(v/v)。
制备亚微型水包油乳状液的方法
在另一实施方式中，本发明提供了制备上述亚微型水包油乳状液的方法。
按照本发明，将乳状液的各种组分，包括油、一种或多种表面活性剂、水性组分和适合用在乳状液中的任何其它组分结合并混合在一起。
对形成的混合物进行乳化过程，通常通过一次或多次穿过一个或多个均化器或乳化器，从而形成具有均一外观和大约0.5微米的平均液滴尺寸的水包油乳状液。为此可以使用任何市售的均化器或乳化器，例如Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)。
然后对由此形成的乳状液进行微流化以使液滴尺寸达到亚微范围。可以使用商业微流化器实现微流化，例如Microfluidics，Newton，Mass提供的型号11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass.)；和Rainnie Minilab Type8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.，Hudson，Wis.)。这些微流化器通过在高压下驱使流体经过小孔进行操作，由此两种流体流在互作用室中高速相互作用以形成具有亚微米尺寸液滴的乳状液。
可以通过本领域已知的各种方法，例如激光衍射、使用市售粒度测量仪，测定液滴尺寸。这种尺寸取决于所用表面活性剂的类型、表面活性剂与油的比例、操作压力、温度、和类似因素。技术人员无需过度实验，就可以确定这些参数的所需结合以获得具有所需液滴尺寸的乳状液。本发明的乳状液的液滴直径小于1微米，优选平均液滴尺寸小于0.8微米，更优选平均液滴尺寸小于0.5微米，进一步优选平均液滴尺寸小于0.3微米。
在本发明的优选实施方式中，将购自Hydronics(Lincoln，NE)并在轻质矿物油中含有25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液，与盐水以及表面活性剂TWEEN80和SPAN80合并并混合，从而形成“AMPHGEN溶液”或“AMPHIGEN制剂”。然后将AMPHGEN溶液用Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器以大约3400rpm乳化以形成水包油乳状液。随后，使乳状液一次通过以大约4500±500psi运行的微流化器。微流化的水包油乳状液含有尺寸小于1微米的液滴，其平均液滴尺寸小于0.25微米。
含有并入亚微型水包油乳状液中的抗原的疫苗组合物
在另一实施方式中，本发明提供了包含抗原和上述亚微型水包油乳状液的疫苗组合物。这些疫苗组合物以具有提高的免疫原效应和改进的物理外观(例如在长期储存后没有观察到任何相分离)为特征。此外，本发明的疫苗组合物可以安全地施用于动物。
按照本发明，抗原可以非固有地，或优选固有地与乳状液结合。术语“固有地”是指下述方法-其中抗原在微流化步骤之前与乳状液组分结合。术语“非固有地”是指下述方法-其中在乳状液已经微流化之后在乳状液中加入抗原。非固有地加入的抗原可以是游离抗原或者其可以如下进一步所述封装在微粒中。
本文所用的术语“抗原”是指在动物中产生免疫性并包含在疫苗组合物中以在作为疫苗组合物施用对象的动物体内产生保护性免疫应答的任何分子、化合物或组合物。
与抗原结合使用的术语“免疫原性”是指抗原在动物体内引起对该抗原的免疫应答的能力。免疫应答可以是主要由细胞毒素T-细胞介导的细胞免疫应答，或主要由helper T-细胞介导的体液免疫应答，这又反过来激活了B-细胞，由此导致抗体生成。
“保护性免疫应答”是指在动物体内产生的任何免疫应答，包括抗体和/或细胞介导的免疫应答，该免疫应答防止或可检测到地降低由抗原或含该抗原的病原体引起的紊乱或疾病的发生、或消除或可检测到地降低其严重程度、或可检测得地减缓其进展速度。
可以包含在本发明的疫苗组合物中的抗原包括由致病细菌(例如猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonie)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、溶血曼海姆菌(Manheimia hemolytica)、牛支原菌(Mycoplasma bovis)、Mycoplasma galanacieum、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、Clostridial spp.、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、猪链球菌(Streptococcus suis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、Erysipelothrix rhusopathiae、空肠弯曲杆菌(Campylobacterspp.)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、Salmonella enterica serovars、Leptospira spp.)；致病真菌(例如假丝酵母(Candida))；原生动物(例如隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、新包虫(Neospora canium)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、艾美虫属(Eimeria spp.))；蠕虫(例如奥斯特线虫(Ostertagia)、古柏线虫(Cooperia)、血矛线虫(Haemonchus)、片吸虫属(Fasciola))制成的抗原，它们是灭活的完整或部分细胞制品形式，或是通过传统的蛋白质提纯、基因工程技术或化学合成获得的抗原分子形式。其它抗原包括致病病毒，例如牛疱疹病毒-1，3，6、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)1和2型、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛白血病病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪细小病毒、PRRS病毒、猪圆环病毒、流感病毒、猪水疱病病毒、Techen fever病毒、假狂犬病病毒，它们是灭活的完整或部分细胞制品形式，或是通过传统的蛋白质提纯、基因工程技术或化学合成获得的抗原分子形式。
抗原的量应该使得抗原与水包油乳状液结合时有效诱发动物体内的保护性免疫应答。使抗原有效的精确量取决于抗原的性质、活性和纯度，并且可以由本领域技术人员确定。
疫苗组合物中存在的水包油乳状液的量应该足以加强疫苗组合物中抗原的免疫原性。当合意且适当时，除了水包油乳状液提供的表面活性剂外，还可以在疫苗组合物中加入附加量的表面活性剂或其它表面活性剂。一般而言，油组分在疫苗组合物最终体积中的存在量为1.0体积％至20体积％；优选1.0体积％至10体积％；更优选2.0体积％至5.0体积％。表面活性剂(或如果使用两种或多种表面活性剂，则是表面活性剂的组合)在疫苗组合物最终体积中的存在量为0.1体积％至20体积％，优选0.15体积％至10体积％，更优选0.2体积％至6.0体积％。
除了抗原和水包油乳状液，免疫组合物可以包括适当和合意的其它组分，例如上文对于水包油组合物所述的防腐剂、渗透剂、生物粘附分子、和免疫刺激分子(例如Quil A、胆固醇、GPI-0100、溴化二甲基双十八烷基铵(DDA))。
本发明的疫苗组合物还可以包括兽医可接受的载体。术语“兽医可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、杀菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延缓剂、和类似物。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、和类似物。等渗剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、和乳糖等。稳定剂包括清蛋白等。
在优选实施方式中，本发明提供了疫苗组合物，其包括至少一种BVDV I型或BVDV II型抗原，该抗原固有地并入水包油乳状液中，该水包油乳状液含有尺寸小于1微米的液滴并优选具有小于0.8微米，更优选小于0.5微米的平均液滴尺寸，进一步优选具有大约0.5微米的平均液滴尺寸。BVDV I型和/或II型抗原优选为灭活的病毒制品形式。亚微型水包油乳状液优选由AMPHIGEN制剂(也就是含有轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的制剂)构成。疫苗组合物优选还包括Quil-A、胆固醇和thimerosol。
在另一优选实施方式中，本发明提供了在水包油乳状液中包括钩端螺旋体抗原和至少一种BVDV I型或BVDV II型抗原的疫苗组合物。优选为灭活的细胞或病毒制品形式的抗原固有地并入水包油乳状液中，该水包油乳状液含有尺寸小于1微米的液滴并优选具有小于0.8微米，更优选小于0.5微米的平均液滴尺寸，进一步优选具有大约0.5微米的平均液滴尺寸的。亚微型水包油乳状液优选由AMPHIGEN制剂(也就是含有轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的制剂)构成。疫苗组合物优选还包括一种或多种选自Quil-A、胆固醇、DDA、GPI-100和氢氧化铝(AlOH)的免疫刺激分子。
在又一优选实施方式中，本发明提供了在水包油乳状液中包括至少一种细菌抗原(例如重组乳房链球菌PauA蛋白或大肠杆菌的细胞制品或二者的结合)的疫苗组合物。该抗原固有地与水包油乳状液结合，该水包油乳状液含有尺寸小于1微米的液滴，优选具有小于0.8微米，更优选小于0.5微米的平均液滴尺寸，进一步优选具有大约0.25微米平均液滴尺寸。亚微型水包油乳状液优选由AMPHIGEN制剂(也就是含有轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80和SPAN80的制剂)构成。疫苗组合物优选还包括一种或多种选自Quil-A、DDA和GPI-100的免疫刺激分子。
本发明的疫苗组合物可以通过已知途径施用到动物上，包括口服、鼻内、粘膜、局部、透皮和肠道外(例如静脉内、腹膜内、皮层内、皮下或肌肉内)途径。给药可以使用结合途径进行，例如，首先使用肠道外途径给药，然后使用粘膜途径给药。
制备疫苗组合物的方法
在又一实施方式中，本发明提供了含有一种或多种抗原和亚微型水包油乳状液的疫苗组合物的制备方法。
在制备本发明的疫苗组合物时，抗原可以固有地或非固有地与水包油乳状液的组分结合。优选地，抗原固有地与水包油乳状液的组分结合。
抗原可以与乳状液的各种组分结合，包括油、一种或多种表面活性剂、水性组分和任何其它适当的组分，从而形成混合物。对混合物进行初步掺合过程，通常通过一次或多次穿过一个或多个均化器或乳化器进行，从而形成含有抗原的水包油乳状液。为此可以使用任何市售均化器或乳化器，例如Ross乳化器(Hauppauge，NY)、Gaulin均化器(Everett，MA)或Microfluidics(Newton，MA)。或者，可以首先使用均化器或乳化器将乳状液佐剂的各种组分，包括油、一种或多种表面活性剂和水性组分结合以形成水包油乳状液；然后在该乳状液中加入抗原。初步掺合后水包油乳状液的平均液滴尺寸为大约1.0-1.2微米。
然后对含有抗原的乳状液进行微流化以使液滴尺寸达到亚微米范围。可以使用商业微流化器，例如Microfluidics，Newton，Mass提供的型号11OY；Gaulin Model 30CD(Gaulin，Inc.，Everett，Mass)；和RainnieMinilab Type8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy，Inc.，Hudson，Wis.)实现微流化。
可以通过本领域已知的各种方法，例如激光衍射、使用市售粒度测量仪，测定液滴尺寸。这种尺寸取决于所用表面活性剂的类型、表面活性剂与油的比例、操作压力、温度、和类似因素。人们可以确定这些参数的所需结合以获得具有所需液滴尺寸的乳状液。本发明的乳状液的油滴直径小于1微米。优选平均液滴尺寸小于0.8微米。更优选地，平均液滴尺寸小于0.5微米。进一步优选地，平均液滴尺寸为0.1至0.3微米。
在本发明优选的实施方式中，将在轻质矿物油中含有25％卵磷脂的DRAKEOL卵磷脂油溶液与表面活性剂TWEEN80和SPAN80和盐水溶液合并并混合以形成含有40％轻质矿物油、卵磷脂、0.18％TWEEN80和0.08％SPAN80的混合物。然后将该混合物以大约3400rpm用Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器乳化，以形成乳状液产物，其也称作“AMPHIGEN制剂”或“AMPHIGEN溶液”。随后，借助于乳化器，例如Ross均化器，将所需抗原与AMPHIGEN溶液和任何其它适当组分(例如免疫刺激分子)结合以形成包含抗原的水包油乳状液。使这种乳状液一次通过以大约10000±500psi运行的微流化器。微流化的水包油乳状液含有尺寸小于1微米的液滴，其平均液滴尺寸小于大约0.25微米。
在另一优选实施方式中，在将水包油乳状液(例如AMPHIGEN制剂)与所需抗原结合之前，将抗原与皂草糖苷(例如Quil A)结合以形成混合物。例如在均化容器中对这种抗原-皂草苷混合物进行均化。然后在均化的抗原-皂草苷混合物中加入甾醇，例如胆固醇。然后对含有抗原、皂草苷和甾醇的混合物进行进一步均化。然后，例如借助于均化器将均化的抗原-皂草苷-甾醇混合物与水包油乳状液(例如AMPHIGEN制剂)结合。然后对含有抗原、皂草苷和甾醇的均化的水包油乳状液进行高压均化，例如微流化。
含有在亚微型水包油乳状液中的微囊化抗原的疫苗组合物和制备方法
在又一实施方式中，本发明提供了包含封装在微粒中的抗原(或“微囊化抗原”)的疫苗组合物，其中微囊化抗原非固有地并入上述亚微型水包油乳状液中。
将抗原吸收或夹带在粒状载体中的方法是本领域已知的。参看，例如，Pharmaceutical Particulate Carriers：Therapeutic Applications(JustinHanes，Masatoshi Chiba and Robert Langer.Polymer microspheres forvaccine delivery.In：Vaccine design.The subunit and adjuvant approach.Eds.Michael F.Powell and Mark J.Newman，1995 Plenum Press，NewYork and London)。粒状载体可以将所选抗原的多种复制品呈递给动物对象体内的免疫系统，并有助于将抗原俘获并保留在局部淋巴结中。粒子可以被巨噬细胞吞噬，并可以通过细胞因子释放来提高抗原呈递。在该领域中已经描述了粒状载体，并其包括例如由聚甲基丙烯酸甲酯聚合物生成的那些，以及由聚(丙交酯)和聚(丙交酯-co-乙交酯)生成的被称作PLG的那些。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可生物降解的，而PLG粒子可以通过与乳酸和羟基乙酸(它们沿正常的代谢路径分泌)连接的酯键的无规非酶促水解进行生物降解。
还使用可生物降解的微球实现疫苗的受控释放。例如，可以实现较长时间的抗原连续释放。根据聚合物的分子量和聚合物中乳酸与羟基乙酸的比例，PLGA聚合物可以具有从数天或数周至数月或一年的水解速率。缓慢的受控释放可能导致与多次注射后观察到的情况类似形成高抗体含量。或者，可以通过选择具有不同水解速率的聚合物，实现疫苗抗原的脉动释放(pulsatile release)。聚合物的水解速率通常取决于聚合物的分子量和聚合物中乳酸与羟基乙酸的比例。由两种或多种具有不同抗原释放速率的聚合物构成的微粒，提供了抗原的脉动释放并模拟多剂疫苗接种方案。
按照本发明，可以使用本领域已知的任何程序(例如在实施例17中举例说明的程序)将抗原(包括上述任何抗原)吸收到粒状聚合物载体，优选PLG聚合物上，由此形成微囊化抗原制品。然后将微囊化抗原制品与如上所述的亚微型水包油乳状液混合并分散在该乳状液中，从而形成疫苗组合物。
在优选实施方式中，本发明提供了包含封装在PLG聚合物中的抗原的疫苗组合物，其中微囊化抗原非固有地分散在微流化的水包油乳状液中，该乳状液由轻质矿物油、卵磷脂、TWEEN80、SPAN80和盐水构成，并具有小于1.0微米的平均液滴尺寸。
由皂草苷和甾醇形成的复合物
在一个实施方式中，本发明提供含有皂草苷和甾醇的组合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋状微胞形式的复合物。按照本发明，这些复合物具有免疫刺激活性。
“免疫刺激”是指该复合物可以提高抗原组分所引发的免疫应答，或该复合物可以引发不依赖于单独抗原组分的免疫应答。
按照本发明，用于本发明的组合物中的优选皂草苷是Quil A。
优选用在本发明的佐剂组合物中的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、麦角钙化甾醇和胆固醇。这些甾醇在本领域内是公知的，例如，在Merck Index，11th Edn.第341页中公开了胆固醇作为在动物脂肪中发现的一种天然存在的甾醇。最优选地，甾醇是胆固醇。
组合物中皂草苷：甾醇的比例通常为大约1∶100至5∶1重量比。该比例优选为1∶1。
在另一实施方式中，本发明提供了含有皂草苷、甾醇和抗原的疫苗组合物，其中皂草苷和甾醇形成螺旋状微胞形式的复合物，且其中抗原与该螺旋状微胞混合但没有结合到其中。
下面是本发明的具体实施方式的实施例。这些实施例仅用于举例说明，而不是要以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
AMPHIGEN制剂的制备
以两步法制备AMPHIGEN制剂。在第一步中，将80升Drakeol卵磷脂油溶液、116升Tetanus Toxoid盐水、1.2升SPAN80和2.8升Tween80混合在一起，并用Ross乳化器乳化。Drakeol卵磷脂油溶液含有25％的大豆磷脂和75％的矿物油。乳化产物经过Ross乳化器再循环最少5体积或最短10分钟。将乳化产物在2-7℃储存最多24小时，以用于进一步处理。将来自Ross乳化器槽的乳液转移到Gaulin均化器中，并在4500psi的压力下均化20分钟。然后将所得40％Drakeol卵磷脂油溶液(以下称为“AMPHIGEN制剂”或“AMPHIGEN溶液”)分配到无菌的聚丙烯羧基(polypropylene carboxy)容器中。在位于class10,000受控环境中的class100分配通风橱(dispensing hood)内进行分配。将容器储存在2-7℃下。除非另行说明，在下述实验中使用该AMPHIGEN制剂。
实施例2
通过BVD疫苗的快速掺合均化进行的初步掺合
图1中显示了用于该均化法的装置。使用无菌技术或蒸汽转换阀，将装有BVD I型抗原(灭活的BVD I型病毒制品)的瓶子连接到掺合容器上的底部端。在完成所需体积的BVD I型抗原的转移后，用装有灭活的BVD II型病毒制品(灭活的BVD II型病毒制品)的瓶子代替BVD I型瓶子。当完成所需量的BVD II型抗原的转移后，将Ross均化器连接到便携容器上，并以最大RPM(3300rpm)引发再循环。容器搅拌保持在中速。
使用无菌技术或蒸汽转换阀，将装有浓度为50毫克/毫升Quil-A的瓶子连接到掺合容器上的均化器串联(in-line)端上。通过抽吸管(linesuction)将所需量的Quil-A溶液送入容器中。当完成Quil-A溶液的转移后，将瓶子移开。按照相同方式，将所需量的胆固醇乙醇溶液(18毫克/毫升)转移到混合容器中。随后，在掺合容器中加入所需量的AMPHIGEN制剂，10％thimerosol溶液和Basic Modified Eagles media(“BME”)填充剂溶液。
所有加料完成后，使混合再持续15分钟。将所得制剂等分成2毫升剂量，并代表非微流化AMPHIGEN制剂-基BVD疫苗。每剂疫苗含有500微克Quil-A、500微克胆固醇、2.5％AMPHIGEN制剂和0.009％thimerosol。根据gp53的ELISA滴度测定对这两种不同的BVD菌株的抗原浓度。
实施例3
通过微流化的二次掺合
图2描述了用于通过微流化进行二次掺合的方法。微流化器是蒸汽灭菌的。首先，将辅助处理组合室(auxiliary processing modulechamber)安装在该装置中，并在第二室位置上安装空白室。通过将来自供料容器排放阀的输送管路连接到微流化器入口，将含有如实施例2所述制成的完全辅助(fully adjuvanted)BVD疫苗的容器连接到微流化器上。将氮气连接到供料容器空气过滤器入口上，并将容器压力设置调节至20+/-5PSI。将收集器排放阀连接到来自微流化器出口的输送管路上。在进行所有必要的连接后，开启阀门，在10,000+/-500PSI的工作压力下开始进行微流化。全部疫苗一次通过微流化器，并收集在微流化后的室中。将该制品等分成2毫升剂量，并代表微流化的AMPHIGEN制剂-基BVD疫苗。
实施例4
经台式掺合制备疫苗组合物
添加BVD抗原和填充剂，由此将如实施例1中所述制成的AMPHIGEN制剂稀释至2.5％。在实验台上用搅拌棒混合所得溶液，而非使用均化器。最终制品含有下列成分：BVD1型和2型抗原，2.5％AMPHIGEN制剂(其如实施例1中所述含有油、卵磷脂、SPAN和TWEEN)和盐水。TWEEN80和SPAN80在最终疫苗制品中的存在量分别为0.18体积％和0.08体积％。
实施例5
非微流化和微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品之间液滴尺寸分布的比较
如实施例2中所述制成的非微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗、如实施例3中所述制成的微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗、以及如实施例4中所述通过台式掺合制成的制品，被用于比较疫苗制品的液滴尺寸。将来自各个制品的两毫升样品加入Malvern2000激光衍射计，并测定液滴尺寸分布。如图3中所示，结果表明，微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品具有0.1微米左右的最大粒子体积，而非微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品具有1微米左右的最大粒子分布体积。
实施例6
疫苗相分离的降低
将三种不同的疫苗制剂：如实施例2中所述制成的非微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗、如实施例3中所述制成的微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗、以及如实施例4中所述通过台式掺合制成的疫苗，一起比较以确定长时间储存时它们的相分离性能。使所有这些制品在4℃静置大约一个月，并根据疫苗制品顶部乳状层外观来监测相分离。如图4中所示，与其它两个制品比较时，在微流化AMPHIGEN制剂-基制品中不存在相分离。
实施例7
针对牛病毒性腹泻病毒的微流化和非微流化牛疫苗的制备
通过微流化法将牛病毒性腹泻病毒抗原固有地混入AMPHIGEN制剂中。术语“固有地混入”是指在微流化之前将抗原加入AMPHIGEN制剂中的方法。使抗原与辅佐制剂的组分一起受到微流化过程的物理力。在对照的非微流化组中，抗原制品通过掺合分散在AMPHIGEN制剂中。
对照的和微流化制品的最终组成如下：对gp53的灭活后ELISA滴度为2535 RU/剂的BVD I型、对gp53的灭活后ELISA滴度为3290RU/剂的BVD II型、浓度为1.25毫克/剂的Quil-A、浓度为1.25毫克/剂的胆固醇、最终浓度为2.5％的AMPHIGEN制剂、以及最终浓度为0.009％的thimerosol。疫苗剂量为5毫升。
实施例8
在微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品中的固有地混入的BVD病毒
抗原的长期稳定性
进行该试验以测定固有地混入的抗原在长期储存过程中的稳定性。灭活的BVD II型病毒抗原在微流化过程中固有地混入AMPHIGEN制剂中以获得微流化疫苗制品(A907505)。使用在非微流化AMPHIGEN制剂中含有相同抗原的三种其它疫苗制品(A904369、A904370和A904371)作为对照物。在非微流化的制品中，将抗原与AMPHIGEN制剂混合，并通过使用Ross均化器掺合以进行混合。所有四种疫苗制品在4℃下储存两年。在储存过程中不同的时间点(0、6、12或24个月)，使用所有四种制剂为三月龄母牛接种疫苗。
在第0天和21天时，经皮下途径用2毫升疫苗制剂给三个龄母牛接种疫苗。在第35天收集来自被接种疫苗的动物的血清，并根据经BVDV-E2 ELISA的抗体滴度，测量对疫苗的血清学响应。如图5所示，微流化疫苗制品在所有受试时间点(0、6、12和24个月)均表现出较高的抗体滴度，表明在微流化过程中固有地混入抗原时，抗原制品的稳定性没有损失。此外，还令人惊讶地发现，微流化疫苗制品在所有时间点均引发提高的免疫应答。
实施例9
微流化后，疫苗引发的直肠温度升高的减轻
使用如实施例7中所述制成的微流化和非微流化疫苗制品，在0天为牛接种疫苗，在从接种前一天至接种后四天的期间内监测直肠温度。疫苗剂量为2毫升。以单或双剂量疫苗对该组接种疫苗。在第1天至第4天(含第1天和第4天)每天测量并记录直肠温度。在施用试验制品前测量第0天时的直肠温度。
如图6所示，结果表明，在使用单或双剂量的非微流化疫苗制剂接种的那些动物中，在接种疫苗后大约24小时直肠温度急剧升高。但是，在用微流化形式的疫苗接种的动物中，接种疫苗后直肠温度的升高仅仅是最低程度的，且明显低于用非微流化制剂接种的动物(图6)。
实施例10
当用微流化疫苗制剂接种疫苗时，注射部位反应体积更快消解
如实施例7中所示制成的微流化和非微流化疫苗制品，用于在第0天为牛接种疫苗。本研究中包括的动物是杂交肉牛。在每个安慰剂治疗组(T01和T02)中有三只动物。在T03至T06的每一组中有六只动物。疫苗剂量为2毫升，在第0天用一或二剂疫苗对该组接种。在第0天，在右颈施用试验制品。接受双剂量(4毫升)试验制品的动物(T02、T04和T06)如单次注射那样在一侧接受全部双剂量。在第0天至第4天(含第0天和第4天)和第6、9与14天，在颈右侧观察注射部位，包括注射部位反应大小的估算。在第0天，在试验制品给药之前观察注射部位。用一或二剂量的安慰剂接种的组在注射部分反应体积方面没有表现出任何明显的增加，因此，这些数据没有显示在图7中。在非微流化疫苗制剂的情况下，在一剂量和二剂量接种之间，注射部位反应体积成比例增加。另一方面，在微流化疫苗制品的情况下，尽管单剂量导致较大的注射部位反应体积，但用第二剂量注射不会导致进一步的增加。此外，在用微流化疫苗制剂注射的动物中，与用非微流化疫苗制剂注射的动物相比，注射部位反应体积以较快的速度消解。这些结果显示在图7中。
实施例11
含有固有地混入的BVD病毒和钩端螺旋体抗原和免疫刺激分子(例如Quil-A和DDA)的微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品的制备
在适当的佐剂中，以大约1.4×109生物体/5毫升剂量的直接计数配制福尔马林灭活的钩端螺旋体hardjo-bovis菌株CSL。以大约2400Nephalomeric Units/5毫升剂量配制福尔马林灭活的钩端螺旋体Pomona菌株T262。基于预处理的发酵流体的nephalometric测量而计算Nephalomeric Units。以大约3000相对单位/5毫升剂量的E2 Elisa滴度配制BVD病毒1型。以大约3500相对单位/5毫升剂量的E2 Elisa滴度配制BVD病毒2型。基于在组合前(pre-assembly)、灭活后的批量(bulk)流体的E2 ELISA滴度来计算该相对单位。Quil-A和胆固醇均以每剂量0.5毫克的浓度使用。分别以0.009％和2.5％的最终浓度使用Thimerosol和AMPHIGEN制剂。以2.0％的最终浓度使用氢氧化铝(Rehydragel LV)。当使用DDA作为免疫调节剂时，DDA被包括在AMPHIGEN制剂中。该AMPHIGEN制剂(即，40％Drakeol-卵磷脂储液)含有1.6毫克/毫升DDA，并且在适当稀释时，该最终疫苗制品含有2.5％AMPHIGEN制剂和0.1毫克/毫升DDA。
在不同疫苗制品的制备中，将BVD部分、Leptos、Quil-A、胆固醇、thimerosol、AMPHIGEN制剂、和作为填充剂的盐水加入Silverson均化器中，并以10,000±500RPM混合15分钟。随后在10,000psi下经200微米筛将这些组分微流化。
当疫苗制剂含有氢氧化铝时，在无氢氧化铝的情况下进行微流化。在完成微流化后，加入氢氧化铝，并用搅拌子在4℃混合过夜。
实施例12
用于激发(challenge)研究的BVD病毒疫苗的制备
本实验中使用的疫苗制品含有来自BVD病毒1型和BVD病毒2型的抗原。以对于gp53为2535RU/剂的灭活后ELISA滴度使用BVD1-5960抗原。以对于gp53为3290RU/剂的灭活后ELISA滴度使用BVD2-890抗原。以0.5毫克/毫升的浓度使用Quil A和胆固醇。分别以0.009％和2.5％的最终浓度使用Thimerosol和AMPHIGEN制剂。当使用DDA作为免疫调节剂时，DDA被包括在AMPHIGEN制剂中。该AMPHIGEN储液(40％Drakeol-卵磷脂储液)含有变化量的DDA，且当适当稀释时，该最终疫苗制品含有2.5％AMPHIGEN制剂和浓度为0.5毫克/剂至2.0毫克/剂的DDA。以2％的最终浓度使用铝凝胶(Rehydragel-LV)。以2、3和5毫克/剂使用GPI-0100。
将所有组分加入Silverson均化器中，并以10,500rpm掺合15分钟，随后在10,000psi下经过200微米室而由此微流化。当疫苗制品含有氢氧化铝时，在无氢氧化铝的情况下进行微流化。在完成微流化后，加入氢氧化铝，并用搅拌子在4℃混合过夜。
实施例13
用含有钩端螺旋体抗原的微流化Amphigen疫苗制剂接种后，对钩端螺旋体激发的保护
表1-治疗组
治疗组 佐剂组成
T01 盐水
T02 Quil-A、胆固醇、和AMPHIGEN制剂(QAC)
T03 Quil-A、胆固醇、AMPHIGEN制剂和AlOH(QAC-AlOH)
T04 DDA、胆固醇、和AMPHIGEN制剂(DDA)
T05 DDA、胆固醇、AMPHIGEN制剂和AlOH(DDA-AlOH)
表1显示了在本研究中测试的疫苗制品中的辅佐制剂的组成。如实施例11所述制备疫苗制品。在每一组中有六只动物。在本研究中使用大约7月龄的肉用杂交小母牛。在第0天和21天，用5毫升疫苗体积经皮下途径进行疫苗接种。用来自NADC(National AgriculturalDisease Center)的L.hardjo-bovis菌株203进行激发。在第57-59天期间用1毫升接种体(innoculum)激发。在眼睛和阴道联合给药而激发。激发材料含有5.0×106钩端螺旋体/毫升。每周收集尿液用于lepto培养、FA和PCR。在第112和113天进行肾收集。
表2-钩端螺旋体激发研究的结果
处理 在培养中，在尿液和肾脏中对钩端螺旋体呈阳性的小牛百分比 在FA中，尿液和肾脏中对钩端螺旋体呈阳性的小牛百分比 在PCR中，尿液和肾脏中对钩端螺旋体呈阳性的小牛百分比 在所有化验中，尿液和肾脏中对钩端螺旋体呈阳性的小牛百分比
 盐水 100 83.3 83.3 100
 QAC 0 0 0 0
 QAC/AlOH 0 50.0 0 50.0
 DDA 0 0 0 0
 DDA/AlOH 0 33.3 16.7 50.0
表2显示了来自钩端螺旋体激发研究的数据。在测定被激发动物体内的钩端螺旋体感染百分比时，使用下列标准。如果肾脏培养物仅对一个样品呈阳性，则该动物被认为对钩端螺旋体是阳性的。如果动物仅在一个样品中对FA或PCR呈阳性，该动物被认为是阴性的。如果样品仅在一个样品中对FA和PCR均呈阳性，其被认为对钩端螺旋体是阳性的。
表2显示的结果表明，基于所有三个化验，在所有疫苗组中，尿的排泄持续时间明显较短。就尿和肾脏的移生(colonization)而言，不含AlOH而含QAC的制剂与不含AlOH而含DDA的制剂的效力相当。在本激发研究中，AlOH不会改进，甚至会降低含QAC或含DDA的疫苗的效力。
表3-激发前几何平均滴度峰值日(第35天)的镜检凝集滴度范围
处理  L.Hardjo  L.pomona
盐水  ＜20  ＜20
QAC  160-640  1280-10240
QAC/AlOH  160-2560  8--10240
DDA  40-1280  320-2560
DDA/AlOH  320-640  1280-5120
在接种的动物中检测针对疫苗制剂中的两种钩端螺旋体抗原的血清学响应，并在第35天记录峰值响应。在血清学响应和对激发的保护之间不存在相关性。疫苗制剂中铝凝胶的存在降低了保护水平，尽管铝凝胶在疫苗中的存在提高了血清学响应。
实施例14
在用含有AMPHIGEN制剂和DDA的微流化疫苗制品免疫后，引发对BVD病毒抗原的免疫应答和对BVD2型病毒激发的保护
在本实验中使用四至七月龄的血清反应阴性小牛。有六个不同的组，每个组有10只动物(表4)。在第0天和第21天，每只动物在肩胛骨和头部之间大致正中的侧颈处接受一剂2毫升皮下剂量的疫苗或安慰剂。
表4-治疗组
治疗组 佐剂组成
T01 盐水
T02 Quil-A、AMPHIGEN制剂、和胆固醇
T03 AMPHIGEN制剂、胆固醇、DDA(0.5毫克/剂)和AlOH
T04 AMPHIGEN制剂、胆固醇、和DDA(0.5毫克/剂)
T05 AMPHIGEN制剂、胆固醇、和DDA(1.0毫克/剂)
T06 AMPHIGEN制剂、胆固醇、和DDA(2.0毫克/剂)
在研究的第44天鼻内施用5毫升剂量的激发病毒制品(每鼻孔大约2.5毫升)。在本研究中使用Noncytopathic BVD病毒2型，isolate#24515(Ellis Strain)、lot#46325-70作为激发菌株。在激发开始及其刚完成时，滴定激发材料的保留样品(每次滴定重复两次)。每5毫升剂量的平均存活病毒滴度在激发前为5.3log10FAID50/5毫升，在激发后为5.4log10FAID50/5毫升(FAID等于TClD50)。
从第-3天至第58天每天监测动物。根据因BVD2感染导致的临床体征，在第42天至第58天对每只动物进行0、1、2或3的临床疾病评分。在激发前记录第44天的评分。在第0、21、35、44和58天从每只动物中采集血液样品(两个13毫升血清分离管，SST)以测定BVD1型和BVD2型病毒中和抗体的血清滴度。
在第42天至第58天(含第42天和第58天)，从每只动物中采集血液样品，并测定血沉棕黄层细胞(buffy coat cell)中BVD病毒的存在。在第44天，在激发前采集样品。
为了测定白细胞数量，在第42天至第58天(含第42天和第58天)从每只动物中采集血液样品(一个4毫升EDTA管)。在第44天，在激发前采集样品。
白细胞减少被确定为WBC数由基准线(激发前两天和激发当天的预激发WBC数的平均值)降低40％或更多。
临床疾病评分用于如下界定疾病的状况：如果评分≤1，那么无疾病，如果评分＞2，那么有疾病。
如表5和6所示，用含有BVD病毒抗原与AMPHIGEN制剂、Quil A或DDA并微流化的疫苗接种过的组，以对BVD1型和BVD2型病毒均较大的血清病毒中和滴度进行血清转化。在这些组中，在激发后表现出病毒血症的动物的百分比也显著降低，而在对照组中100％的动物都患上了病毒血症(表7)。此外，在这些接种过的组中，疾病的发病率也明显降低(表8)。类似地，在疫苗组中表现出白细胞减少的动物的百分比也降低，且与含Quil A的组相比，在含DDA的组中白细胞减少症更明显减少(表9)。在对照组中，与接种疫苗组相比，体重增长显著降低(表10)。
血清学
在第0天接种疫苗前，对BVD病毒1和2型的抗体而言，研究中的所有动物是血清反应阴性的(SVN＜1∶2)(数据未显示)。在第二次接种疫苗(第35天)后14天，对BVD病毒1和2型的抗体而言，施用安慰剂(T01)的所有动物均保持血清反应阴性；对BVD病毒1和2型的抗体而言，用ITAs(调查测试抗原(Investigational Test Antigen))接种的所有动物均为血清反应阳性(SVN≥1∶8)。在第35天，一只被施用如下疫苗的动物对BVD病毒2型的抗体具有3的SVN滴度，该疫苗被佐以AMPHIGEN制剂，其DDA为2毫克/剂(表11和12)。
在第44天激发前，所有对照动物(T01)，除一只以外，对BVD病毒1和2型的抗体均为血清反应阴性(SVN＜1∶2)(数据未显示)。一只对照动物(#2497)对BVD病毒1型的抗体是血清反应阳性的(SVN＝10)，对BVD病毒2型的抗体是血清反应阴性的。在激发后14天，所有研究中的动物对BVD病毒1和2型的抗体均是血清反应阳性的。
表5.BVD病毒1型几何平均血清病毒中和滴度
 处理 研究日BVDv1型几何平均SVN滴度
0  21 35  44  58
 T01 盐水 ＜2 ＜2 ＜2  ＜2  23.9
 T02 Amphigen，QuiI A ＜2  39.1 19824.5  14018.2  27554.5
 T03 Amphigen，0.5mgDDA，Al ＜2  51.8 32204.8  22381.1  23170.4
 T04 Amphigen，0.5mgDDA ＜2  27.0 14512.4  8932.0  21996.2
 T05 Amphigen，1.0mgDDA ＜2  26.7 11585.2  8194.6  20882.0
 T06 Amphigen，2.0mgDDA ＜2  23.5 8778.7  6769.3  16961.1
表6.BVD病毒2型几何平均血清病毒中和滴度
 处理 研究日BVDv1型几何平均SVN滴度
0  21  35  44  58
 T01  盐水 ＜2  ＜2  ＜2  ＜2  522.0
 T02  Amphigen，Quil A ＜2  8.9  2272.4  2048.2  24833.6
 T03  Amphigen，0.5mgDDA，Al ＜2  9.5  3565.7  2702.2  20881.8
 T04  Amphigen，0.5mg DDA ＜2  4.1  1260.7  989.1  18496.2
 T05  Amphigen，1.0mgDDA ＜2  6.4  1398.8  1453.9  30047.8
 T06  Amphigen，2.0mg DDA ＜2  7.7  1673.2  1428.9  16384.0
表7.激发后的BVD病毒分离
 处理  BVD病毒分离
研究日 患病毒血症动物的频率(％) 具有病毒血症的LSMean天数
 T01  盐水  47至58 10/10(100.0) 10.4
 T02  Amphigen，Quil A  50至53 1/10(10.0) 0.4
 T03  Amphigen，0.5mg DDA，Al  --- 0/10(0.0) 0.0
T04 Amphigen，0.5mg DDA  48，50至52，57 3/10(30.0) 0.5
 T05  Amphigen，1.0mg DDA  49至51 2/10(20.0) 0.4
 T06  Amphigen，2.0mg DDA  48至52 2/10(20.0) 0.5
表8.激发后BVD病的临床体征
处理  疾病发病率(％) 观察到BVD病临床体征的频率(％) 总共Obs.
0 1 2 3
T01 盐水  9/10(90.0) 75(46) 63(37.5) 29(17.3) 1(0.6) 168
T02 Amphigen，QuilA  1/10(10.0) 105(61.8) 63(37.1) 2(1.2) 0(0) 170
T03 Amphigen，0.5mgDDA，Al  2/10(20.0) 99(58.2) 67(39.4) 4(2.4) 0(0) 170
T04 Amphigen，0.5mg DDA  0/10(0.0) 118(69.4) 52(30.6) 0(0) 0(0) 170
T05 Amphigen，1.0mg DDA  0/10(0.0) 101(59.4) 69(40.6) 0(0) 0(0) 170
T06 Amphigen，2.0mg DDA  0/10(0.0) 104(61.2) 66(38.8) 0(0) 0(0) 170
表9.激发后的白血球减少症
 处理 白细胞减少症
患白细胞减少症的动物的频率(％) 具有白细胞减少症的LSMean天数
 T01  盐水 10/10(100.0) 7.8
 T02  Amphi gen，Quil A  6/10(60.0) 1.2
 T03  Amphigen，0.5mg DDA，Al  2/10(20.0) 0.2
 T04  Amphigen，0.5mg DDA  4/10(40.0) 0.8
 T05  Amphigen，1.0mg DDA  3/10(30.0) 0.9
 T06  Amphigen，2.0mg DDA  2/10(30.0) 0.5
表10.研究中的体重和体重增加
处理 研究日的平均体重(lb.)  体重增加(lb)
-1  43  50  58
 T01  盐水 378.0  484.9  491.0  476.9  98.9
T02  Amphigen，Quil A 428.0  526.5  546.7  579.0  151.0
T03  Amphigen，0.5mgDDA，AlOH 410.5  514.4  534.2  579.0  168.5
T04  Amphigen，0.5mg DDA 373.7  472.3  492.6  538.1  164.4
T05  Amphigen，1.0mg DDA 358.9  451.4  478.9  507.1  148.2
T06  Amphigen，2.0mg DDA 408.  513.3  533.9  560.3  151.6
病毒分离
如表13中所示的数据，在激发过程中(第44天至58天)，对照组(T01)中全部十只动物都患上了病毒血症(在一天或几天分离BVD病毒)。在施用ITAs的组中，患病毒血症的动物的频率在每组10只动物中为1、0、3、2和2(分别为T02、T03、T04、T05和T06)。对照组与施用ITAs的组之间的差别在统计学上是显著的(P≤0.05)。对对照组而言，与施用ITAs的组相比(0.0至0.5天)，病毒血症天数的最小均方也明显较高(10.4天)。
临床疾病
临床体征评分为2或3的动物被认为表现出BVD疾病的征兆。如表14中所示，具有BVD病毒病临床体征的动物的频率在对照组(T01)中为10只中的9只，而在施用ITAs的每一组中(分别为T02、T03、T04、T05和T06)为10只中的1、2、0、0和0只。对照组与施用ITAs的组之间的差别在统计学上是显著的(P≤0.05)。
白细胞减少
如表15中所示，在激发过程中(第44天至58天)，对照组(T01)中全部十只动物都患上了白细胞减少症(第42-44天，白细胞数量由激发前的基准线降低40％)。在施用ITAs的各组中(分别为T02、T03、T04、T05和T06)，患白细胞减少症的动物的频率为10只动物中的6、2、4、3和2只。对照组与施用了佐以0.5毫克/剂的AMPHIGEN制剂和氢氧化铝的疫苗的组(T03)之间的差别，在统计学上是显著的(P≤0.05)。对对照组而言，与施用ITAs的组相比(0.2至1.2天)，白细胞减少症天数的最小均方也明显较高(7.8天)。
实施例15
在用含有GPI-0100的微流化疫苗制剂免疫后，引发对BVD病毒抗原的免疫应答和对BVD2型病毒激发的保护
按照实施例14中所述的一套实验条件，直接比较Quil A与GPI-0100。如表11和12所示，用含有Quil A或GPI-0100的微流化AMPHIGEN制剂-基制品中的BVD抗原接种的动物，对BVD1型和BVD2型病毒都具有显著的抗体滴度。BVD1型病毒的抗体滴度远高于BVD2型病毒。然而，随后用BVD2型病毒进行的激发表现出强保护作用，并且用含有GPI-0100的微流化AMPHIGEN制剂-基疫苗制品接种的牛中明显降低了疾病发生率。
表11.BVD病毒1型几何平均血清病毒中和滴度
 处理 几何平均SVN滴度
0  21  35  43  57
 T01  盐水 ＜2  ＜2  ＜2  ＜2  35.5
 T02  Amphigen，Quil A ＜2  98.7  20171.0  12203.4  44762.4
T03  Amphigen，2mgGPI-0100，AlOH ＜2 84.6 10998.5 7383.2 25709.2
T04  Amphigen，2mgGPI-0100 ＜2 106.0 18179.2 8933.2 28526.2
T05  Amphigen，3mgGPI-0100 ＜2 62.9 15024.3 8780.1 19824.4
T06  Amphigen，5mgGPI-0100 ＜2 71.1 12203.3 7512.0 16670.2
表12.BVD病毒2型几何平均血清病毒中和滴度
 处理 研究日BVDv1型几何平均SVN滴度
0  21  35  44  58
 T01  盐水 ＜2  ＜2  ＜2  ＜2  14.7
 T02  Amphigen，Quil A ＜2  12.9  2312.0  1692.5  1663.4
T03  Amphigen，2mg GPI-0100，AlOH ＜2 13.2 1663.5 1116.8 1562.3
 T04  Amphigen，2mg GPI-0100 ＜2  20.5  2610.2  1978.2  2478.7
 T05  Amphjgen，3mg GPI-0100 ＜2  11.4  1752.8  1305.2  2435.4
 T06  Amphigen，5mg GPI-0100 ＜2  12.0  3158.4  2120.2  1845.6
表13.激发后的BVD病毒分离
 处理  BVD病毒分离
 患病毒血症动物的频率(％) 具有病毒血症的LSMean天数
 T01  盐水  10/10(100.0) 8.4
 T02  Amphigen，Quil A  3/10(30.0) 0.3
 T03  Amphigen，2mg GPI-0100，AlOH  0/10(0.0) 0.0
 T04  Amphigen，2mg GPI-0100  1/10(10.0) 0.1
 T05  Amphigen，3mg GPI-0100  3/10(30.0) 0.3
 T06  Amphigen，5mg GPI-0100  2/10(20.0) 0.2
表14.激发后BVD病的临床体征
处理 患病频率(％) 观察具有下列临床疾病评分的频率(％) 总共Obs.
0 1  2
 T01  盐水 5/10(50.0) 103(60.6) 55(32.4) 12(7.1) 170
 T02  Amphigen，Quil A 5/10(50.0) 115(67.6) 48(28.2) 7(4.1) 170
T03  Amphigen，2mgGPI-0100，AlOH 0/10(0.0) 128(75.3) 42(24.7) 0(0) 170
T04  Amphigen，2mgGPI-0100 0/10(0.0) 124(72.9) 46(27.1) 0(0) 170
T05  Amphigen，3mgGPI-0100 0/10(0.0) 104(61.2) 66(38.8) 0(0) 170
T06  Amphigen，5mgGPI-0100 0/10(0.0) 128(75.3) 42(24.7) 0(0) 170
表15.激发后的白细胞减少症
 处理  白细胞减少症
 患白细胞减少症的动物的频率(％) 患白细胞减少症的LSMean天数
 T01  盐水  9/10(90.0) 8.7
 T02  QuilA  6/10(60.0) 1.6
 T03  2mg GPI-0100，AlOH  7/10(70.0) 2.6
 T04  2mg GPI-0100  4/10(40.0) 1.5
 T05  3mg GPI-0100  7/10(70.0) 2.6
 T06  5mg GPI-0100  8/10(80.0) 2.9
总之，通过在接种动物中不存在副反应或死亡率，证明每种疫苗的安全性。通过在100％接种动物中的血清转化(对BVD-1和BVD-2的SVN抗体滴度＞1∶8)，验证每种疫苗的效力。仅用佐以2毫克GPI-0100的疫苗被验证具有令人满意的抗激发性。
实施例16
在微流化水包油乳状液中包含微囊化抗原的疫苗制品
将3克海藻糖(Fluka)加入水中以产生333毫克/毫升的海藻糖储液。在海藻糖溶液中加入溶于0.8％SDS溶液(SDS/rPauA)中的重组PauA抗原，以获得494μg rPauA/ml的最终浓度。在下一步骤中，将10克聚交酯羟基乙酸(PLG-Resomer RE 503H，Boeringher Ingelheim)溶于200毫升二氯甲烷(MeCl2)中。将所得PLG/MeCl2溶液与第一步骤中制成的SDS-rPauA/海藻糖溶液合并。使用来自MicrofluidicsModel M110EH的微流化器对合并的溶液进行微流化，并使用TemcoSpray Dryer Model SD-05将微流化制品喷雾干燥。使用500微米筛收集喷雾干燥后的材料。
使用蛋白质印迹分析(Western blot analysis)量化这种喷雾干燥材料中rPauA的浓度。将1.04毫克喷雾干燥材料溶于50微升丙酮，并在室温下以13,200rpm离心10分钟。去除上清液。将上清液和丸粒馏分(pellet fraction)在生物安全罩中干燥2.5小时。使丸粒再悬浮于47.43微升样品溶液(25微升样品缓冲剂+10微升还原剂+65微升水)中。将干燥的上清液馏分用20微升样品溶液再悬浮。在蛋白质印迹分析中，使用纯化PauA作为标准物以量化喷雾干燥材料中的rPauA含量。
将100克甘露醇(Sigma)溶于500毫升注射用水(WFI)中，由此制备20％甘露醇储液。将溶液用热板/搅拌器加热至40℃并冷却至30℃。将溶液通过0.22微米无菌滤器(Millipore)无菌过滤。将12.5克羧甲基纤维素(Sigma)溶于500毫升WFI中并在4℃混合过夜，以制备2.5％羧甲基纤维素溶液。将溶液在121℃高压灭菌。
将喷雾干燥产生的粉末在含有5％甘露醇、0.3％羧甲基纤维素和1∶5000thimerosol的溶液中重构。将最终溶液等分到3毫升瓶中并使用冷冻干燥器(USIFROID)冻干。冻干粉末代表微囊化rPauA。将微囊化亚单位蛋白抗原悬浮在包含AMPHIGENg制剂的2毫升微流化水包油乳状液中(例如实施例20中所述的微流化乳状液)，并用作疫苗。
实施例17
在水包油乳状液中包含细菌完整细胞抗原和重组蛋白抗原的微流化疫苗制剂的制备
制备既含重组乳房链球菌PauA蛋白又含大肠杆菌病毒细胞(它们如实施例2和3所述固有地加入水包油乳状液中)的两种疫苗制品。重组PauA抗原为100微克/剂的浓度，且大肠杆菌细胞的最终计数为4×109/剂。两种疫苗制剂的乳状液佐剂组成显示在表16中。
表16.含有重组蛋白和完整大肠杆菌细胞的疫苗制剂
处理  抗原  佐剂
T01  安慰剂  盐水
T02  Pau A/E.coli  SEAM-14
T03  Pau A/E.coli  2.5％Amphigen，0.5毫克GPI-0100，0.5毫克胆固醇
T04  Pau A/E.coli  2.5％Amphigen，0.5毫克溴化二甲基双十八烷基铵(DDA)，0.5毫克胆固醇
实施例18
对在水包油乳状液中含有rPauA和完整细胞细菌剂的微流化疫苗的免疫应答
在此实验中使用成熟奶牛。动物在登记时处于它们的第一或第二哺乳期的末端。对于每一疫苗制剂，皮下注射2毫升，注射三次，一次在干燥时(D-0)，28天后一次(D＝28)，产犊后4至10天再一次(C+4-C+10)。第一和第三剂在颈部左侧给药，第二剂在颈部右侧给药。在每次接种疫苗之前和在第三次接种疫苗之后大约14天和32天，采集血液。通过ELISA测定大肠杆菌和rPauA抗原的抗体滴度。如图8所示，结果表明，在用含有GPI-0100作为免疫刺激物的疫苗制剂接种的组中，rPauA的抗体滴度较高，并在初次接种后第70天达到峰值。对大肠杆菌抗原的抗体滴度表示在图9中。在两种疫苗制剂中，对大肠杆菌抗原的抗体滴度相当，尽管作为免疫刺激物的GPI-0100的存在，与含有DDA作为免疫刺激物的制剂相比，引发了相对较高的抗体滴度。
实施例19
微流化AMPHIGEN制剂基疫苗制品的杀病毒活性分析
为了确定微流化是否使病毒失活，测定三种微流化AMPHIGEN制剂基疫苗制品的杀病毒活性。这三种制品含有三种不同的牛传染病毒，也就是牛疱疹病毒(BHV)、副流感病毒3(PI3)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)。
按照USDA 9CFR.113.35要求，进行三种疫苗制品的杀病毒活性检测。
表16所示的结果表明，AMPHIGEN制剂基疫苗制品的微流化不会导致疫苗制品的明显失活。
表16.微流化疫苗的杀病毒活性分析
 系列  BRSV  BHV PI3
 A  0  0.2 0
 AM200  -0.2  0 -0.2
 AM75  0  -0.3 -0.3
 AM75@37C  0.1  -0.3 -0.2
 B  0  -0.1 -0.2
 BM200  0  0 -0.2
 BM75 -0.2  -0.5 0
 BM75@37C  0.5  -0.5 0
 C  0.1  -0.1 -0.2
 CM200 -0.2  -0.1 -0.2
 CM75  0.1  0.5 -0.2
 CM75@37C  0.5  0.5 -0.2
A＝以650毫升/分钟加入的胆固醇
B＝以28毫升/分钟加入的胆固醇
C＝以5毫升/分钟加入的胆固醇
M200＝用200微米筛微流化
M75＝用75微米筛微流化
M75@37C＝在微流化前加热至37℃的流体
高于0.7的值指示杀病毒效果。
实施例20
微流化AMPHIGEN制剂的制备
将DRAKEOL卵磷脂油溶液(含有25％卵磷脂的轻质矿物油)与TWEEN 80(最终浓度为0.18％)和Span80(最终浓度为0.08％)在36±1℃下混合8-22小时以结合，由此制备AMPHIGEN制剂。然后借助于Ross(Hauppauge，NY11788)乳化器以大约3400rpm将油混合物加入盐水中。随后使混合物一次经过微流化器，该微流化器带有在4500±500psi下的200μm互作用室。图10A和10B表明微流化AMPHIGEN制剂的稳定性。在开始时，起始时间点(图10A)通过激光衍射测得的粒度分布几乎等于在4℃储存22个月后的粒度分布(图10B)。
实施例21
Quil A-胆固醇免疫原性复合物的电子显微分析
为了测定通过Quil A和胆固醇形成的免疫原性复合物的性质，在存在或不存在抗原的情况下制造这两种组分的混合物。
在含有50毫升KR-Hals缓冲剂的烧杯中，用磁子搅拌溶液的同时加入BVD I型抗原。此后，在搅拌溶液的同时逐滴加入Quil A(50毫克/毫升)的浓缩储液以实现50微克/毫升的最终浓度。添加Quil A后，加入胆固醇在乙醇中的储液(18毫克/毫升)直至50微克/毫升的最终浓度。
在第二烧杯中，以相同方式在不含任何BVD I型抗原的50毫升缓冲剂中加入Quil A和胆固醇。
对于透射电子显微术，使10微升每种样品吸附到带有聚醋酸甲基乙烯脂/碳支承平台的400目铜网上(Electron Microscopy Sciences，Inc.，Fort Washington，PA)。使用10微升过滤的2％磷钨酸，pH5.2作为造影剂，将样品负性染色。使用JEOL1230透射式电子显微镜(JEOL Inc.，Tokyo，Japan)在80kV加速电压下检测样品。用Gatan BioScan792照相机进行数码成像。在4489EM膜上进行薄膜显微并打印到KodabromeII RC F3纸(Eastman Kodak Company，Rochester，NY)上。
在仅含胆固醇和Quil A而不含任何BVD I型抗原的溶液中，与QuilA微胞和胆固醇晶体一起检测螺旋状微胞(图11)。将螺旋状微胞缠绕并显示网状。在包含BVD I型抗原的样品中，发现螺旋形微胞无规环绕某些致密区(图12)。致密区代表BVD1型抗原，且发现由Quil A和胆固醇结合形成的螺旋状免疫原性复合物吸附在BVD I型抗原表面上。

Claims (8)

1.一种包括皂草糖苷、甾醇和抗原的疫苗，其中所述皂草糖苷和所述甾醇互相结合以形成螺旋状微胞形式的复合物，并且其中所述抗原与所述螺旋状微胞混合，但是没有结合到其中。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，进一步包括兽医可接受的载体。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述兽医可接受的载体是水包油乳状液。
4.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述皂草糖苷是三萜系化合物。
5.如权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述三萜系化合物是Quil A。
6.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述甾醇是胆固醇。
7.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述抗原包括病毒抗原、细菌抗原、或其组合。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述抗原包括BVDV 1型或2型抗原。
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