PT1742659E - Emulsões de óleo em água microfluidizadas e composições de vacinas - Google Patents

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Pamela Kay Klose
Richard Lee Krebs
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Description

1
DESCRIÇÃO
"EMULSÕES DE ÓLEO EM ÁGUA MICROFLUIDIZADAS E COMPOSIÇÕES DE VACINAS"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se de forma geral ao campo de vacinas e, particularmente, às formulações adjuvantes para aumentar a resposta imunológica em animais domésticos. Em particular, a invenção refere-se a uma composição de vacina que compreende um glicósido de saponina, um esterol e um antigénio, em que - na formação da dita composição de vacina - o dito esterol é adicionado ao dito glicósido de saponina, e em que o dito glicósido de saponina e o dito esterol associados um ao outro formam complexos na forma de micelas helicoidais; e em que o dito antigénio está misturado com as ditas micelas helicoidais, mas não integrado nelas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As infecções bacterianas, virais, parasiticas e por micoplasma estão bem espalhadas nos animais domésticos tais como gado, suino e animais de companhia. As doenças causadas por estes agentes infecciosos são frequentemente resistentes à terapêutica farmacêutica antimicrobiana, não deixando meios eficazes de tratamento. Consequentemente, uma abordagem de vacina está a ser utilizada de forma crescente para controlar as doenças infecciosas nos animais domésticos. Pode-se tornar um agente patogénico infeccioso inteiro adequado para utilização numa formulação de vacina após a inactivação quimica ou a manipulação genética apropriada. Alternativamente, uma subunidade de proteina do agente patogénico pode ser expressa num sistema de expressão recombinante e purificada para utilização numa formulação de vacina.
Adjuvante geralmente refere-se a qualquer material que 2 aumenta a resposta imunológica humoral e/ou celular a um antigénio. As vacinas tradicionais são compostas da preparação bruta de microorganismos patogénicos mortos e as impurezas associadas às culturas de microorganismos patogénicos poderiam actuar como adjuvantes para aumentar a resposta imunológica. No entanto, quando preparações homogéneas de microorganismo patológico ou subunidades de proteina purificada são utilizadas como antigénios para vacinação, a imunidade activada por tais antigénios é fraca e a adição de certos materiais exógenos como adjuvante torna-se necessária. Além disso, é oneroso produzir as vacinas sintéticas e de subunidades. Portanto, com o auxilio do adjuvante, uma dose menor de antigénio pode ser necessária para estimular a resposta imunológica, diminuindo assim o custo da produção de vacinas.
Sabe-se que os adjuvantes actuam de várias formas diferentes para aumentar a resposta imunológica. Muitos adjuvantes modificam a rede de citocinas associada à resposta imunológica. Estes adjuvantes imunomoduladores podem exercer o seu efeito mesmo quando não estão juntos com os antigénios. Em geral, os adjuvantes imunomoduladores produzem uma regulação positiva geral de certas citocinas e uma regulação negativa concomitante de outras que levam a uma resposta de Thl celular e/ou de Th2 humoral.
Alguns adjuvantes possuem a capacidade de preservar a integridade conformacional de um antigénio de forma que os antigénios podem ser eficientemente apresentados a células efectoras imunológicas apropriadas. Como um resultado desta preservação da conformação de antigénios pela formulação de adjuvante, a vacina teria uma maior vida útil tal como a mostrada para os complexos de estímulo imunológico (ISCOMs). Ozel M., et al.; Quarternary Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989).
Alguns adjuvantes possuem a propriedade de retenção do 3 antigénio na forma de um depot no local da injecção. Como um resultado deste efeito depot o antigénio não é rapidamente perdido por meio da depuração pelo figado. Sais de alumínio e as emulsões de água em óleo actuam através deste efeito depot ao longo de uma duração mais curta. Por exemplo, pode ser obtido um depot a longo prazo através da utilização de adjuvante completo de Freund (FCA) que é uma emulsão de água em óleo. 0 FCA permanece tipicamente no local da injecção até a biodegradação permitir a remoção do antigénio pelas células apresentadoras de antigénios.
Com base em sua natureza física, os adjuvantes podem ser agrupados em duas categorias muito amplas, a saber, adjuvantes particulados e adjuvantes não particulados. Os adjuvantes particulados existem na forma de micropartícuias. 0 agente imunogénico é capaz de incorporar-se ou de associar-se às micropartícuias. Os sais de alumínio, as emulsões de água em óleo, as emulsões de óleo em água, os complexos de estímulo imunológico, as lipossomas e as nano- e micropartículas são exemplos de adjuvantes particulados. Os adjuvantes não particulados são geralmente imunomoduladores e são geralmente utilizados em associação com adjuvantes particulados. 0 dipéptido de muramilo (um componente activo com o adjuvante de um peptidoglicano extraído de Mycobacteria) , co-polímeros em blocos não iónicos, Saponinas (uma mistura complexa de triterpenóides extraída da casca da árvore Quillaja saponaria), o lípido A (um dissacárido de glicosamina com dois grupos fosfonatos e cinco ou seis cadeias de ácidos gordos geralmente com C12 até Cl6 de comprimento) , as citocinas, os polímeros de hidrato de carbono, os polissacáridos derivatizados e as toxinas bacterianas tais como a toxina de cólera e a toxina lábil de E. coli (LT) são exemplos de adjuvantes não particulados.
Alguns dos adjuvantes mais bem conhecidos constituem uma combinação de imunomoduladores não particulados e 4 materiais particulados que confeririam o efeito depot à formulação de adjuvantes. Por exemplo, o FCA combina as propriedades imunomoduladoras de componentes de Mycobacterium tuberculosis juntamente com o efeito depot a curto prazo das emulsões de óleo.
As emulsões de óleo têm sido utilizadas como um adjuvante de vacina durante muito tempo. Le Moignic e Pinoy descobriram em 1916 que uma suspensão de Salmonella typhimurium morta em óleo mineral aumentava a resposta imunológica. Subsequentemente, em 1925, Ramon descreveu o óleo de amido como uma das substâncias que aumentam a resposta antitóxica para o toxóide da difteria. No entanto, as emulsões de óleo não se tornaram populares até 1937 quando Freund apareceu com a sua formulação adjuvante conhecida agora como Adjuvante Completo de Freund (FCA). 0 FCA é uma emulsão de água em óleo composta de óleo mineral (parafina) misturada com Mycobateria morta e Arlacel A. Arlacel A é principalmente monooleato de manida e é utilizado como um agente emulsionante. Embora o FCA seja excelente na indução de uma resposta de anticorpos, causa dor severa, formação de abscesso, febre e inflamação granulomatosa. Para evitar estas reacções colaterais indesejáveis, foi desenvolvido o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) . 0 IFA é similar ao FCA na sua composição excepto pela ausência de componentes micobacterianos. 0 IFA atua através da formulação depot no local da injecção e da libertação lenta do antigénio com estimulo de células produtoras de anticorpos.
Uma outra abordagem para melhorar o FCA era baseada na noção de que a substituição do óleo mineral por um óleo biocompativel ajudaria a eliminar as reacções associadas ao FCA no local da injecção. Acreditava-se que a emulsão devia ser de óleo em água ao invés de água em óleo, porque a última produz um depot de longa duração no local da injecção. Hilleman et al. descreveram um adjuvante com base 5 em óleo "Adjuvante 65", que consiste em 86 % de óleo de amendoim, 10 % de Arlacel A como emulsionante e 4 % de monoestearato de alumínio com estabilizante. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman e Beale, 1983, em New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. e Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. Em humanos, o Adjuvante 65 era seguro e potente, mas exibia menos característica adjuvante que o IFA. Não obstante, a utilização do Adjuvante 65 foi descontinuada por causa da capacidade de reacção para o ser humano com certos lotes de vacina e da redução na característica adjuvante quando um emulsionante purificado ou sintético era utilizado no lugar de Arlacel A. As Patentes US N° 5.718.904 e 5.690.942 ensinam que o óleo mineral na emulsão de óleo em água pode ser substituído por óleo que pode ser metabolizado com a finalidade de aumentar o perfil de segurança.
Além da característica adjuvante e segurança, a aparência física de uma emulsão também é uma consideração comercial importante. A aparência física depende da estabilidade da emulsão. A formação de creme, a sedimentação e a coalescência são indicadores da instabilidade da emulsão. A formação de creme ocorre quando as fases oleosa e aquosa da emulsão possuem gravidade específica diferente. A formação de creme também ocorre quando o tamanho de gotícula inicial da emulsão é grande e as gotículas da emulsão não estão tendo qualquer movimento Browniano. Quando o tamanho da gotícula é grande, há uma tendência para a ruptura interfacial e as gotículas coalescem em partículas grandes. A estabilidade da emulsão é determinada por um número de factores tais como a natureza e a quantidade de emulsionante utilizado, o tamanho da gotícula na emulsão e a diferença na densidade entre as fases oleosa e aquosa.
Os emulsionantes promovem a estabilização da gotícula dispersa através da redução da energia livre interfacial e 6 da criação de barreiras fisicas ou electroestáticas à coalescência das goticulas. Os detergentes não iónicos assim como iónicos foram utilizados como emulsionantes. Os emulsionantes não iónicos orientam a interface e produzem estruturas relativamente volumosas, que levam ao impedimento estérico das goticulas dispersas. Os emulsionantes aniónicos ou catiónicos induzem a formação de uma camada dupla eléctrica através da atracção de iões indicadores; as forças repulsivas das camadas duplas fazem com que as goticulas repilam uma à outra quando se aproximam.
Além da utilização dos emulsionantes, a estabilidade da emulsão também pode ser conseguida através da redução do tamanho das goticulas da emulsão por meios mecânicos. Tipicamente, os misturadores com propulsão, os rotores de turbina, os moinhos de colóides, os homogeneizadores e ultra-som foram utilizados para produzir emulsões. A microfluidização é uma outra maneira de aumentar a homogeneidade do tamanho das goticulas na emulsão. A microfluidização pode produzir uma emulsão fisicamente estável elegante com tamanho de partícula coerente no intervalo de submicrons. Além de aumentar a estabilidade da emulsão, o processo de microfluidização permite a filtração terminal que é uma maneira preferida de garantir a esterilidade do produto final. Além disso, as partículas de óleo em submícron podem passar dos locais de injecção para a linfa e então para os nodos linfáticos da cadeia de drenagem, para o sangue e para o baço. Isto reduz a probabilidade de estabelecer um depot oleoso no local da injecção que pode produzir inflamação local e reacção significativa no local da injecção.
Os microfluidizadores estão agora disponíveis comercialmente. A formação da emulsão ocorre num microfluidizador quando duas correntes fluidizadas interagem em altas velocidades dentro de uma câmara de 7 interacção. 0 microfluidizador é controlado por ar ou azoto e pode operar a pressões internas no excesso de 20.000 psi (= 137,89 MPa). A Patente US N° 4.908.154 ensina a utilização do microfluidizador para a obtenção de emulsões essencialmente livres de quaisquer agentes emulsionantes.
Um número de formulações adjuvantes de óleo em água em submícron foi descrito na literatura. A Patente US N° 5.376.369 ensina uma formulação adjuvante para emulsão de óleo em água em submícron conhecida como Formulação Adjuvante Syntax (FAS). FAS contém esqualeno ou esqualano como o componente de óleo, uma quantidade formadora de emulsão de polímero em bloco Pluronic L121 (polioxi-propileno-polioxietileno) e uma quantidade imunopotenciadora de muramildipéptido. O esqualeno é um precursor de hidrocarboneto linear do colesterol encontrado em muitos tecidos, notavelmente nos fígados de tubarões e outros peixes. 0 esqualano é preparado através da hidrogenação do esqualeno e é completamente saturado. Tanto o esqualeno quanto o esqualano podem ser metabolizados e possuem um bom registo de estudos toxicológicos. As emulsões de esqualeno ou de esqualano foram utilizadas em vacinas para câncer humano com efeitos colaterais suaves e uma eficácia desejável. Veja-se, por exemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93. A Patente US N° 6.299.884 e a Publicação de Patente Internacional WO 90/14837 ensinam que os co-polímeros em blocos de polioxi-propileno-polioxietileno não são essenciais para a formação de emulsão de óleo em água em submícron. Além disso, estas referências ensinam a utilização de óleo que pode ser metabolizado não tóxico e excluem expressamente a utilização de óleo mineral e óleos destilados de petróleo tóxicos nas suas formulações para emulsão. A Patente US N° 5.961.970 ensina ainda que outra 8 emulsão de óleo em água em submícron pode ser utilizada como um adjuvante de vacina. Na emulsão descrita nesta patente, o componente hidrofóbico é seleccionado a partir do grupo que consiste num óleo triglicérido de cadeia média, um óleo vegetal e uma mistura dos mesmos. 0 tensioactivo incluído nesta emulsão pode ser um tensioactivo natural biologicamente compatível, tal como fosfolípido (por exemplo, lecitina) ou um tensioactivo farmaceuticamente aceitável não natural, tal como TWEEN-80. Esta patente também nos ensina que incorpora o antigénio em emulsão no momento que a emulsão é formada, em contraste com a mistura antigénio com a emulsão após a emulsão ter sido independente e extrinsecamente formada. A Patente US N° 5.084.269 ensina que uma formulação adjuvante contendo lecitina em combinação com óleo mineral causa um decréscimo na irritação dentro do animal hospedeiro e simultaneamente induz maior imunidade sistémica. A formulação adjuvante resultante da Patente US N° 5.084.269 é utilizada comercialmente nas vacinas veterinárias sob o nome comercial AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® é constituída de micelas - gotículas de óleo circundadas por lecitina. Estas micelas permitem que mais antigénios de células inteiras se liguem do que os adjuvantes com base em óleo tradicionais. Além disso, as formulações para vacina baseadas em AMPHIGEN® contêm um baixo conteúdo de óleo de 2,5 até 5 % de óleo mineral, comparado com outras formulações para vacina contendo adjuvantes oleosos, que tipicamente contêm de 10 % até 20 % de óleo. Seu baixo conteúdo de óleo torna esta formulação de vacina baseada em adjuvante menos irritante aos tecidos no local da injecção, resultando em menores lesões e menos ataque à pele. Em adição, o revestimento de lecitina ao redor das gotículas de óleo reduz adicionalmente as reacções no local da injecção resultando numa vacina que é tanto segura quanto eficaz. 9 A formulação AMPHIGEN® é utilizada como um adjuvante num número de vacinas veterinárias e há uma necessidade de manter a aparência fisica do produto da vacina durante periodos de armazenamento curtos e longos assim como no momento da reconstituição. Em adição, um antigénio liofilizado é misturado com o adjuvante para formulação pré-produzido logo antes da injecção. Esta prática nem sempre garante que haja uma distribuição uniforme do antigénio dentro da emulsão de óleo em água e a aparência da emulsão pode não ser desejável. Além disso, após o repouso, a emulsão homogeneizada pode exibir separação de fases. Portanto, existe uma necessidade de um adjuvante para formulação estável que não exibe separação de fases após um longo tempo em armazenamento. Uma maneira de prevenir a separação de fases é reduzir o tamanho de goticulas e aumentar a homogeneidade das particulas da emulsão. Embora o processo de microfluidização de formulações para emulsão com base em óleo que podem ser metabolizadas tenha sido documentado, a microfluidização de emulsões de óleo em água tal como a formulação AMPHIGEN® ainda não foi realizada. 0 documento WO 96/33739 revela lipossomas, adicionando saponina de colesterol. 0 documento US 2003/095974 revela uma emulsão de água em óleo que contém colesterol e saponina. 0 documento US 5679354 revela uma composição de vacina que compreende um esterol e um glicósido de saponina montados numa matriz.
Como descrito no presente documento, a microfluidização foi utilizada para a obtenção do tamanho de goticulas de óleo mineral circundadas por lecitina no tamanho em submicron. Inesperadamente, descobriu-se pelos presentes inventores que a microfluidização das formulações para vacina auxiliada por adjuvantes com uma emulsão de óleo em água compreendida de uma mistura de lecitina e óleo não somente melhora a aparência fisica das formulações, mas 10 também aumenta os efeitos de imunização das formulações. As formulações microfluidizadas também são caracterizadas por um perfil de segurança melhorado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Descobriu-se de forma inesperada pelos presentes inventores que a actividade do adjuvante e o perfil de segurança das emulsões de óleo em água com base em óleo que não pode ser metabolizado podem ser melhorados através da microfluidização. Os antigénios incorporados nas emulsões microfluidizadas são estáveis mesmo quando os antigénios são intrinsecamente incorporados nas emulsões antes da microfluidização.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona formulações para emulsão de óleo em água em submicron úteis como um adjuvante de vacina. As emulsões de óleo em água em submicron descritas no presente documento são compostas de um óleo que não pode ser metabolizado, pelo menos um tensioactivo e um componente aquoso, em que o óleo é disperso no componente aquoso com um tamanho médio de goticulas de óleo no intervalo de submicron. Um óleo que não pode ser metabolizado preferido é o óleo mineral leve. Os tensioactivos preferidos incluem lecitina, TWEEN®-80 e SPAN®-80.
Uma emulsão de óleo em água preferida proporcionada pelo presente pedido é composta de uma formulação AMPHIGEN®.
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma composição de vacina que compreende um glicósido de saponina, um esterol e um antigeno, em que - na formação da dita composição de vacina o dito esterol é adicionado ao dito glicósido de saponina, e em que o dito glicósido de saponina e o dito esterol associados um ao outro formam complexos na forma de micelas helicoidais; e em que o dito antigénio está misturado com, mas não integrado dentro de, as ditas 11 micelas helicoidais. Preferivelmente, a composição de vacina compreende ainda um veiculo veterinariamente aceitável; mais preferivelmente o dito veiculo veterinariamente aceitável é uma emulsão de óleo em água.
De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, proporciona-se a composição de vacina de acordo com o primeiro aspecto; em que o dito glicósido de saponina é um glicósido de triterpenóide. Preferivelmente, o dito glicósido de triterpenóide é Quil A.
De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, proporciona-se a composição de vacina de acordo com o primeiro aspecto; em que o dito esterol é colesterol.
De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, proporciona-se a composição de vacina de acordo com o primeiro aspecto, em que o dito antigénio compreende um antigénio virai, um antigénio bacteriano, ou uma combinação dos mesmos. Preferivelmente, o dito antigénio compreende um antigénio do Virus da Diarreia Virai Bovina (BVDV) do tipo 1 ou do tipo 2.
As emulsões de óleo em água reveladas no presente documento podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras. As moléculas imunoestimuladoras preferidas incluem, por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA).
Numa outra forma de realização, o presente pedido proporciona métodos de preparação de uma emulsão de óleo em água em submicron. De acordo com o presente pedido, os vários componentes da emulsão, incluindo o óleo, um ou mais tensioactivos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado para utilização na emulsão, são misturados juntos. A mistura é submetida a um processo de emulsificação primário para formar uma emulsão de óleo em água, que é então passada através de um microfluidizador 12 para a obtenção de uma emulsão de óleo em água com gotículas menores gue 1 mícron de diâmetro, preferivelmente com um tamanho médio de gotículas menor gue 0,5 mícron.
Ainda numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições de vacina gue contêm um antigénio e uma emulsão de óleo em água em submícron descrita anteriormente no presente documento. O antigénio é incorporado na emulsão extrinsecamente ou intrinsecamente, preferivelmente, intrinsecamente. O antigénio que pode ser incluído nas composições de vacina da presente invenção pode ser um antigénio bacteriano, fúngico ou virai ou uma combinação dos mesmos. O antigénio pode tomar a forma de uma preparação celular ou virai parcial ou total inactivada ou a forma de moléculas antigénicas obtidas através da purificação de proteínas convencional, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química.
Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona métodos de preparação de composições de vacina contendo um antigénio ou antigénios combinados com uma emulsão de óleo em água em submícron.
Na preparação das composições de vacina da presente invenção, o(s) antigénio(s) pode(m) ser combinado(s) intrinsecamente (por exemplo, antes da microfluidização) ou extrinsecamente (por exemplo, após a microfluidização) com os componentes da emulsão de óleo em água. Preferivelmente, o antigénio é combinado com os componentes da emulsão de óleo em água intrinsecamente.
Ainda numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antigénio microencapsulado e uma emulsão de óleo em água em submícron descrita anteriormente no presente documento, em que o antigénio microencapsulado é combinado com a emulsão extrinsecamente.
Descobriu-se de forma surpreendente que uma saponina e 13 um esterol, quando combinados em solução, associam-se um ao outro para formar complexos na forma de micelas helicoidais. De acordo com a presente invenção, estes complexos de micelas helicoidais possuem actividades imunoestimuladoras e são especialmente úteis como adjuvantes nas composições de vacina.
Consequentemente, a presente invenção proporciona composições de vacina contendo uma saponina e um esterol, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas helicoidais. A presente invenção proporciona ainda composições contendo uma saponina, um esterol e um antigénio, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas helicoidais e em que o antigénio é misturado, mas não incorporado dentro das micelas helicoidais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 representa o processo para a preparação em lote de composições de vacina não microfluidizadas. Neste processo os vários componentes de vacina são adicionados no recipiente de adição à esquerda e, em última análise, bombeados no recipiente de mistura onde os componentes são misturados através de um meio mecânico simples. A figura 2 representa o processo para preparação de composições de vacina microfluidizadas contendo antigénio incorporado intrinsecamente. Os vários componentes de vacina são adicionados no recipiente de adição e transferidos para a unidade de mescla pré-emulsão para mistura através de um meio mecânico simples. Subsequentemente, a emulsão é passada através de um microfluidizador e é colhida na câmara pós-microfluidização. A figura 3 representa a distribuição de tamanho de goticulas da vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada, da vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada e da preparação de vacina misturada na 14 bancada. A figura 4 mostra a ausência de separação de fases na preparação de vacina microfluidizada. A figura 5 representa uma comparação da estabilidade dos antigénios intrinsecamente incorporados na preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) e três preparações de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada de controlo (A904369, A904370 e A904371). Todas as quatro preparações de vacina foram armazenadas a 4 °C durante dois anos. Em pontos diferentes durante o armazenamento (0, 6, 12 ou 24 meses), todas as quatro formulações foram utilizadas para vacinar as vacas com três meses de idade. A vacinação foi feita nos Dias 0 e 21 com uma dose de vacina de 2 ml e o soro foi colhido duas semanas após a segunda vacinação. O titulo de anticorpo neutralizante para o virus de BVD do Tipo II foi determinado em cada uma das amostras de soro. Os dados são mostrados na forma da média geométrica para 5 animais. A figura 6 mostra a temperatura rectal média em minimos quadrados do gado antes e depois da administração de vacinas microfluidizadas e não microfluidizadas. T01: Grupo com placebo - dose única; T02: Grupo com placebo -Dose dupla; T03: Formulação não microfluidizada - Dose única; T04: Formulação não microfluidizada - Dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - Dose única; T06:
Formulação microfluidizada - Dose dupla. A figura 7 representa os volumes médios de reacção no local da injecção em minimos quadrados observados no gado após a administração de formulações de vacina não microfluidizadas e microfluidizadas. T03: Formulação não microfluidizada - Dose única; T04: Formulação não microfluidizada - Dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - Dose única; T06: Formulação microfluidizada - Dose dupla. 15 A figura 8 representa a média geométrica dos títulos de IgG para o antigénio PauA recombinante de Streptococcus uberis após a vacinação com as várias formulações de vacina contendo tanto o antigénio PauA recombinante quanto o antigénio de célula inteira de E. coli. A figura 9 representa a média geométrica dos títulos de IgG para o antigénio de célula total de E. coli de Streptococcus uberis após a vacinação com as várias formulações de vacina contendo tanto o antigénio PauA recombinante quanto o antigénio de célula total de E. coli.
As figuras 10A e 10B representam a distribuição dos tamanhos de partículas de uma formulação Amphigen Microfluidizada na produção inicial (figura 10A) e 22 meses após a produção (figura 10B). A figura 11 é uma fotografia de microscopia electrónica que mostra as micelas helicoidais formadas com micelas longas de Quil A e cristais de colesterol. A figura 12 é uma fotografia de microscopia electrónica que mostra complexos imunogénicos em hélice formados por Quil A e colesterol na superfície do antigénio de BVD do Tipo I.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Descobriu-se de forma inesperada pelos presentes inventores que a microfluidização das formulações de vacina auxiliadas por adjuvantes com uma emulsão de óleo em água compreendida de uma mistura de lecitina e óleo mineral não somente melhora a aparência física das formulações de vacina, mas também aumenta os efeitos de imunização das formulações de vacina. As formulações microfluidizadas de vacina também são caracterizadas por um maior perfil de segurança.
Com base nestas descobertas, o presente pedido proporciona emulsões de óleo em água em submícron úteis como um adjuvante em composições de vacina. Também são proporcionados os métodos de preparação destas emulsões de 16 óleo em água em submícron através da utilização de um microfluidizador. Além disso, a presente invenção proporciona composições de vacina em submícron em que um antigénio é combinado com uma emulsão de óleo em água em submícron. São também proporcionados os métodos para a preparação de tais composições de vacina. A presente invenção proporciona ainda composições de vacina contendo antigénios microencapsulados combinados com uma emulsão de óleo em água em submícron e métodos para a preparação de tais vacinas.
Para esclarecimento da divulgação e não com a finalidade de limitação, a descrição pormenorizada da invenção é dividida nas subsecções a seguir que descrevem ou ilustram certas características, formas de realização ou aplicações da invenção.
Emulsões de Óleo em Água em Submícron
Numa forma de realização, o presente pedido proporciona formulações para emulsão de óleo em água em submícron úteis como um adjuvante de vacina. As emulsões de óleo em água em submícron descritas aumentam a imunogenicidade de antigénios nas composições de vacina, são seguras para administração a animais e estáveis durante o armazenamento.
As emulsões de óleo em água em submícron do presente pedido são compostas de um óleo que não pode ser metabolizado, pelo menos um tensioactivo e um componente aquoso, em que o óleo é disperso no componente aquoso com um tamanho médio de gotículas de óleo no intervalo de submícron. Por " submícron" entende-se que as gotículas têm um tamanho menor que 1 pm (mícron) e a média ou o tamanho médio de gotículas de óleo é menor que 1 pm.
Preferivelmente, o tamanho médio de gotículas da emulsão é menor que 0,8 pm; mais preferivelmente, menor que 0,5 pm; e ainda mais preferivelmente, menor que 0,4 pm ou 17 aproximadamente 0,1-0,3 ym. O "tamanho de gotículas" é definido como o tamanho de particula com Diâmetro Médio do Volume (VMD) dentro de um volume de distribuição de tamanhos de partículas. O VMD é calculado através da multiplicação de cada diâmetro de partícula pelo volume de todas as partículas de tal tamanho e a soma. Este é então dividido pelo volume total de todas partículas. O termo "óleo que não pode ser metabolizado" como utilizado no presente documento refere-se aos óleos que não podem ser metabolizados pelo corpo do indivíduo animal ao qual a emulsão é administrada.
Os termos "animal" e "indivíduo animal" como usado no presente documento referem-se a todos os animais não humanos, incluindo gado, ovelha e porcos, por exemplo.
Os óleos que não podem ser metabolizados adequados para utilização nas emulsões descritas no presente documento incluem alcanos, alcenos, alcinos e seus ácidos e álcoois correspondentes, os éteres e os ésteres dos mesmos e misturas dos mesmos. Preferivelmente, os compostos individuais do óleo são compostos hidrocarbonetos leves, isto é, tais componentes possuem 6 até 30 átomos de carbono. O óleo pode ser preparado de forma sintética ou purificado de produtos de petróleo. Os óleos que não podem ser metabolizados preferidos para utilização nas emulsões do presente pedido incluem óleo mineral, óleo de parafina e cicloparafinas, por exemplo. O termo "óleo mineral" refere-se a uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtidos do petrolato através de uma técnica de destilação. O termo é sinónimo de "parafina liquefeita", "petrolato líquido" e "óleo mineral branco". Pretende-se ainda que o termo inclua "óleo mineral leve", isto é, óleo que é similarmente obtido através da destilação de petrolato, mas que possui uma gravidade específica ligeiramente menor que o óleo mineral branco. 18
Veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, nas páginas 788 e 1323). Óleo mineral pode ser obtido a partir de várias fontes comerciais, por exemplo, J. T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). O óleo mineral preferido é o óleo mineral leve disponível comercialmente sob o nome DRAKEOL®.
Tipicamente, o componente de óleo das emulsões em submicron descritas no presente documento está presente numa quantidade desde 1 % até 5 0 % em volume; preferivelmente, numa quantidade de 10 % a 45; mais preferivelmente, numa quantidade desde 20 % até 40 %.
As emulsões de óleo em água do presente pedido incluem tipicamente pelo menos um (isto é, um ou mais) tensioactivo. Os tensioactivos e os emulsionantes, cujos termos são utilizados de forma intercambiável no presente documento, são agentes que estabilizam a superfície das gotículas de óleo e mantêm as gotículas de óleo dentro do tamanho desejado.
Os tensioactivos adequados para utilização nas presentes emulsões incluem tensioactivos biologicamente compatíveis naturais e tensioactivos sintéticos não naturais. Os tensioactivos biologicamente compatíveis incluem compostos de fosfolípidos ou uma mistura de fosfolípidos. Os fosfolípidos preferidos são fosfatidilcolinas (lecitina), tal como a lecitina de soja ou de ovo. A lecitina pode ser obtida na forma de uma mistura de fosfátidos e triglicéridos através da lavagem com água de óleos vegetais brutos e da separação e da secagem das gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido através do fraccionamento da mistura em relação aos fosfolípidos insolúveis em acetona e os glicolípidos remanescentes após a remoção dos triglicéridos e do óleo vegetal através da lavagem com acetona. Alternativamente, a lecitina pode ser obtida de 19 várias fontes comerciais. Outros fosfolipidos adequados incluem fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Os fosfolipidos podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados de forma convencional.
Os tensioactivos sintéticos não naturais adequados para utilização nas emulsões em submicron descritas incluem tensioactivos não iónicos com base em sorbitano, por exemplo, tensioactivos de sorbitano substituídos por ácidos graxos (disponíveis comercialmente sob o nome SPAN® ou ARLACEL®), os ésteres de ácidos graxos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos de fontes tal como óleo de mamona (EMULFOR); ácido graxo polietoxilado (por exemplo, ácido esteárico disponível sob o nome de SIMULSOL M-53), polímero isooctilfenol/formaldeído polietoxilado (TYLOXAPOL), éteres de álcoois graxos de polioxietileno (BRU®); éteres não fenílicos de polioxietileno (TRITON® N) , éteres isooctilfenílicos de polioxietileno (TRITON® X) . Os tensioactivos sintéticos preferidos são os tensioactivos disponíveis sob os nomes SPAN® e TWEEN®.
Os tensoativos preferidos para uso nas emulsões de óleo em água incluem lecitina, Tween-80 e SPAN-80.
De forma geral, o tensioactivo ou a combinação de tensioactivos, se dois ou mais tensioactivos forem utilizados, está presente na emulsão numa quantidade de 0,01 % a 10 % em volume, preferivelmente, 0,1 % a 6,0 %, mais preferivelmente 0,2 % a 5,0 %. O componente aquoso constitui a fase contínua da emulsão e pode ser água, solução salina tamponada ou qualquer outra solução aquosa adequada.
As emulsões de óleo em água do presente pedido podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras. 20
Acredita-se que as moléculas bioadesivas podem aumentar a distribuição e a ligação de antigénios na ou através da superfície mucosa alvo conferindo imunidade de mucosa. Os exemplos de moléculas bioadesivas adequadas incluem polímeros ácidos que não ocorrem naturalmente tais como o ácido poliacrílico e o ácido polimetacrílico (por exemplo, CARBOPOL®, CARBOMER); polímeros ácidos naturais modificados sinteticamente tal como carboximetilcelulose; polímeros neutros naturais modificados sinteticamente tal como (hidroxipropil) metilcelulose; polímeros básicos que carregam amina tal como quitosano; polímeros ácidos que podem ser obtidos de fontes naturais tais como o ácido algínico, o ácido hialurónico, a pectina, a goma adragante e a goma caraia; e polímeros neutros que não ocorrem naturalmente, tal como polivinilálcool; ou combinações dos mesmos. A frase "moléculas imunoestimuladoras", como utilizado no presente documento, refere-se às moléculas que aumentam a resposta imunológica protectora induzida por um componente antigénico em composições de vacina. Os materiais imunoestimuladores adequados incluem componentes de parede celular bacteriana, por exemplo, derivados de N-acetil muramil-L-alanil-D- isoglutamina tais como murabutida, treonil-MDP e tripéptido de muramilo; glicósido de saponinas e derivados dos mesmos, por exemplo, Quil A, QS 21 e GPI-0100; colesterol; e compostos de amónio quaternário, por exemplo, brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA) e N, N-dioctadecil-N,N-bis (2- hidroxietil) propanodiamina ("avridina").
As saponinas são compostos glicosídicos que são produzidos como metabolitos secundários numa ampla variedade de espécies de plantas. A estrutura química das saponinas confere uma série ampla de actividades farmacológicas e biológicas, incluindo alguma actividade imunológica potente e eficaz. 21
Estruturalmente, as saponinas consistem em qualquer aglicona ligada a uma ou mais cadeias de açúcares. As saponinas podem ser classificadas de acordo com a sua composição de aglicona: glicósidos de triterpeno, glicósidos de esteróides e glicósidos de alcaloides esteróides. A saponina pode ser isolada da casca de Quillaja saponaria. A saponina é conhecida há muito tempo como um imunoestimulador. Dalsgaard, K., "Evaluation of its adjuvante activity with a special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease", Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978. Os extractos brutos de plantas contendo saponina aumentavam a potência de vacinas para a doença de pé e boca. No entanto, os extractos brutos foram associados com efeitos colaterais adversos quando utilizados nas vacinas. Subsequentemente, Dalsgaard purificou parcialmente o componente activo adjuvante da saponina por diálise, troca iónica e cromatografia por filtração em gel. Dalsgaard, K. et ai., "Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaj a saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines", Arch. Gesamte. Virusforsch. 4.4: 243-254 1974. Um componente activo adjuvante purificado nesse sentido é conhecido como "Quil A". Com base em peso Quil A mostrou potência aumentada e apresentou reacções locais reduzidas em comparação com a saponina bruta. Quil A é amplamente utilizado em vacinas veterinárias.
Análises adicionais de Quil A por cromatografia liquida em alta pressão (HPLC) revelaram uma mistura heterogénea de saponinas intimamente relacionadas e levaram à descoberta de QS21 que era um adjuvante potente com toxicidade reduzida ou mínima. Kensil C. R. et al., "Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaj a saponaria Molina córtex," J. 22
Immunol. 146: 431-437, 1991. Ao contrário da maior parte dos outros imunoestimuladores, QS 21 é solúvel em água e pode ser utilizado em vacinas com ou sem formulações do tipo emulsão. QS21 mostrou activar uma resposta do tipo Thl em camundongos estimulando a produção de anticorpos IgG2a e IgG2b e induziu CD8+ CTL especifico ao antigénio (MHC de classe I) em resposta aos antigénios de subunidade. Estudos clínicos em humanos provaram sua propriedade adjuvante com um perfil toxicológico aceitável. Kensil, C.R. et al., "Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. Em Vaccine Design: the subunit and Adjuvant Approach," Eds. Powell, M.F. e Newman, M. J. Plenum Publishing Corporation, Nova Iorque. 1995, pp. 525-541. A Patente US N° 6.080.725 ensina os métodos de preparação e de utilização do conjugado saponina-lipófilo. Neste conjugado saponina-lipófilo, uma fracção lipofílica tal como lípido, ácido gordo, polietileno glicol ou terpeno é ligada covalentemente a uma triterpeno saponina não acilada ou desacilada através de um grupo carboxi presente no ácido 3-0- glucurónico da saponina triterpeno. A união de uma fracção lipofílica ao ácido 3-O-glucurónico de uma saponina, tal como desacilsaponina de Quillaja, luciósido P, ou saponina de Gypsophila, saponaria e Acanthophyllum melhora os seus efeitos adjuvantes sobre a imunidade humoral e imunidade mediada por células, além disso, a união de uma fracção lipofílica ao resíduo de ácido 3-0-glucurónico de não desacilsaponina ou desacilsaponina rende uma saponina análoga que é mais fácil de purificar, menos tóxica, mais estável quimicamente e possui propriedades adjuvantes igual ou melhor que a saponina original. GPI-0100 é um conjugado saponina-lipófilo descrito na Patente US 6.080.725. GPI-0100 é produzido pela adição de aminas alifáticas de desacilsaponina através do grupo carboxilo do ácido glucurónico.
Compostos de amónio quaternário.- Um número de bases 23 nitrogenadas alifáticas foi proposto para utilização como adjuvantes imunológicos, incluindo aminas, compostos de amónio quaternário, guanidinas, benzamidinas e tiourónios. Tais compostos específicos incluem brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA) e N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil) propanediamina ("avridina"). A Patente US N° 5.951.988 ensina uma formulação adjuvante contendo sais de amónio quaternário tal como DDA em associação com um componente oleoso. Esta formulação é útil em conjunto com substâncias imunológicas conhecidas, por exemplo, antigénios virais ou bacterianos numa composição de vacina, com a finalidade de aumentar a resposta imunogénica. A composição também é útil sem um antigénio incorporado como uma formulação imunoestimuladora não especifica. A Patente US N° 4.310.550 descreve a utilização de Ν,Ν-alquilo de cadeia longa-Ν,Ν'- bis (2-hidroxietil)-propanodiamina e Ν,Ν-alquilo de cadeia longa-xililenodiaminas formuladas com emulsão de gordura ou de lipido como um adjuvante de vacina. Um método de indução ou de aumento da resposta imunogénica de um antigénio no ser humano ou num animal através da administração parentérica da formulação adjuvante é descrito na Patente US N° 4.310.550.
Numa forma de realização preferida, o presente pedido proporciona uma emulsão de óleo em água em submicron útil como adjuvante de vacina, que é composta de uma formulação AMPHIGEN®, com goticulas com um tamanho menor que 1 pm e um tamanho médio de goticulas de aproximadamente 0,25 pm. O termo "formulação AMPHIGEN®", tal como é utilizado no presente documento refere-se a uma solução formada pela mistura de uma solução de óleo de lecitina DRAKEOL® (Hydronics, Lincoln, NE) com solução salina na presença de TWEEN® 80 e SPAN®80. Uma formulação AMPHIGEN® tipica contém 40 % de óleo mineral leve por volume (v/v) , cerca de 25 % 24 p/v de lecitina, 0,18 % de TWEEN 80 em volume (v/v) e cerca de 0,08 % de Span 80 em volume (v/v). Métodos de Preparação de Emulsões de Óleo em Água Submicron
Numa outra forma de realização, o presente pedido proporciona métodos de preparação das emulsões de óleo em água submicron descritas anteriormente no presente documento.
De acordo com o presente pedido, os vários componentes da emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensioactivos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado para utilização na emulsão, são combinados e misturados j untos. A mistura formada é submetida a um processo de emulsificação normalmente por passagem uma ou mais vezes por meio de um ou mais homogeneizadores ou emulsionantes para formar uma emulsão de óleo em água que tem uma aparência uniforme e um tamanho médio de goticula de cerca de 0,5 ym. Qualquer homogeneizador ou emulsionante comercialmente disponível pode ser usado para esse propósito, por exemplo, emulsionante Ross (Hauppauge, NY), homogeneizador Gaulin (Everett, MA). A emulsão formada dessa maneira é então submetida à microfluidização para levar o tamanho de goticulas ao intervalo de submicron. A microfluidização pode ser conseguida através da utilização de um microfluidizador comercial, tal como o modelo número 11 OY disponível na Microfluidics, Newton, Mass; Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estes microfluidizadores operam forçando os fluidos através de pequenas aberturas sob alta pressão, de forma que duas correntes de fluidos interagem a altas velocidades numa câmara de interacção para formar emulsões com goticulas de um tamanho em submicron. O tamanho de goticulas pode ser determinado através de 25 uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difracção a laser, através da utilização de instrumentos medidores disponíveis comercialmente. 0 tamanho pode variar dependendo do tipo de tensioactivo utilizado, da proporção do tensioactivo em relação ao óleo, da pressão de operação, da temperatura e similares. 0 perito na especialidade pode determinar a combinação desejada destes parâmetros para a obtenção de emulsões com tamanho de gotícuias desejado sem experiências desnecessárias. As gotículas das emulsões da presente invenção são menores que 1 ym de diâmetro, preferivelmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 ym e mais preferivelmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,5 ym e ainda mais preferivelmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,3 ym.
Numa forma de realização preferida do presente pedido, a solução oleosa de lecitina DRAKEOL, que está disponível comercialmente na Hidronics (Lincoln, NE) e contém 25 % de lecitina em óleo mineral leve, é combinada e misturada com solução salina assim como tensioactivos TWEEN® 80 e SPAN® 80 para formar uma "solução AMPHGEN®" ou uma "formulação AMPHIGEN®". A solução AMPHGEN® é então emulsificada com um emulsionante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm para formar uma emulsão de óleo em água. Subsequentemente, a emulsão é passada uma vez através de um Microfluidizador operando a aproximadamente 4500 ± 500 psi (= 31,02 ± 3,44 MPa). A emulsão de óleo em água microfluidizada possui gotículas com um tamanho menor que 1 ym, com um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,25 ym.
Composições de Vacina Contendo Antigénios Incorporados em Emulsões de Óleo em Água em Submicron
Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um (ou mais) antigénio(s) e uma emulsão de óleo em água em submicron 26 descrita anteriormente no presente documento. Estas composições de vacina são caracterizadas por terem um maior efeito imunogénico e uma melhor aparência fisica (por exemplo, não é observada separação de fases após um periodo de armazenamento estendido). Em adição, as composições de vacina da presente invenção são seguras para a administração aos animais.
De acordo com a presente invenção, o antigénio pode ser combinado com a emulsão extrinsecamente ou preferivelmente, intrinsecamente. 0 termo "intrinsecamente" refere-se ao processo em que o antigénio é combinado com os componentes da emulsão antes da etapa de microfluidização. 0 termo "extrinsecamente" refere-se ao processo em que o antigénio é adicionado na emulsão após a emulsão ter sido microfluidizada. 0 antigénio adicionado extrinsecamente pode ser antigénio livre ou pode estar encapsulado em microparticulas como descrito adicionalmente no presente documento a seguir. 0 termo "antigénio" como usado no presente documento refere-se a qualquer molécula, composto ou composição que é imunogénica num animal e é incluida na composição de vacina para activar uma resposta imunológica protectora no animal ao qual a composição de vacina é administrada. 0 termo "imunogénico" como utilizado em associação com um antigénio refere-se à capacidade do antigénio de provocar uma resposta imunológica num animal contra o antigénio. A resposta imunológica pode ser uma resposta imunológica celular mediada primariamente por células T citotóxicas ou uma resposta imunológica humoral mediada primariamente por células T auxiliares, que por sua vez activa as células B levando à produção de anticorpos.
Uma "resposta imunológica protectora" é definida como qualquer resposta imunológica, uma resposta imunológica mediada por anticorpo ou por célula ou ambos, que ocorre no animal que previne ou reduz de forma detectável a 27 ocorrência ou elimina ou reduz de forma detectável a gravidade ou diminui de forma detectável a taxa de progressão, do distúrbio ou da doença causada pelo antigénio ou um agente patogénico contendo o antigénio.
Os antigénios que podem ser incluídos na composição de vacina da presente invenção incluem antigénios preparados partindo de bactérias patogénicas tais como Mycoplasma hyopneumoníae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus Pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimia hemolytica, Mycoplasma bovís, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp.,
Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelotrix rhusopathiae, Campilobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella enterica serovars, Leptospira spp.; fungos patogénicos tal como Candida; protozoários tais como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp.; helmintos tais como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, na forma de uma preparação de células totais ou parciais inactivadas ou na forma de moléculas antigénicas obtidas através da purificação convencional de proteínas, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química. Os antigénios adicionais incluem vírus patogénicos tais como os herpesvírus-1,3, 6 Bovinos, os vírus da diarreia virai bovina (BVDV) dos tipos 1 e 2, o vírus parainfluenza Bovino, o vírus sincicial respiratório Bovino, o vírus da leucose bovina, o vírus rinderpest, o vírus da doença de pé e boca, a raiva, o vírus da febre suína, o vírus da febre suína Africana, os parvovirus Porcinos, o vírus PRRS, o circovírus porcino, o vírus influenza, o vírus da doença vesicular suína, o vírus da febre de Techen, o vírus de Pseudorabies (Pseudorraiva), na forma de uma preparação virai total ou parcial inactivada ou na forma de moléculas antigénicas obtidas através da purificação de proteínas 28 convencional, das técnicas de engenharia genética ou da síntese química. A quantidade do antigénio deve ser tal que o antigénio que, em combinação com a emulsão de óleo em água, é eficiente na indução da uma resposta imunológica protectora num animal. A quantidade precisa de um antigénio que será eficaz depende da natureza, da actividade e da pureza do antigénio e pode ser determinada por um perito na especialidade. A quantidade da emulsão de óleo em água presente nas composições de vacina deve ser suficiente para potencializar a imunogenicidade do(s) antigénio(s) nas composições de vacina. Quando desejável e apropriado, quantidades adicionais de tensioactivo(s) ou tensioactivo(s) adicional(is) podem ser adicionadas na composição de vacina em adição ao(s) tensioactivo(s) proporcionado (s) pela emulsão de óleo em água. De forma geral, o componente oleoso está presente no volume final de uma composição de vacina numa quantidade de 1,0 % até 20 % em volume; preferivelmente, numa quantidade de 1,0 % até 10 %; mais preferivelmente, numa quantidade de 2,0 % até 5,0 %. O tensioactivo ou a combinação de tensioactivos se dois ou mais tensioactivos forem utilizados, está presente no volume final de uma composição de vacina numa quantidade de 0,1 % até 20 % em volume, preferivelmente, 0,15 % até 10 %, mais preferivelmente 0,2 % até 6,0 %.
Em adição ao(s) antigénio(s) e à emulsão de óleo em água, a composição de vacina pode incluir outros componentes que são apropriados e desejáveis, tais como conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras (por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA)), como descrito anteriormente no presente documento em associação com a emulsão de óleo em água.
As composições de vacina da presente invenção podem 29 também incluir um veiculo veterinariamente aceitável. 0 termo "um veiculo veterinariamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes de retardo da adsorção e similares. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similares. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina, entre outros.
Em uma modalidade preferida, o presente pedido proporciona uma composição de vacina que inclui pelo menos um antigénio de BVDV do tipo I ou de BVDV do tipo II, incorporado intrinsecamente em uma emulsão de óleo em água que possui goticulas de um tamanho menor que 1 ym, preferivelmente com um tamanho médio de goticulas menor que 0,8 ym, mais preferivelmente menor que 0,5 ym e ainda mais preferivelmente com um tamanho médio de goticulas de aproximadamente 0,5 ym. 0 antigénio de BVDV do tipo I e/ou de BVDV do tipo II está preferivelmente na forma de uma preparação virai inactivada. A emulsão de óleo em água em submicron é preferivelmente composta de uma formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80) . A composição de vacina inclui preferivelmente ainda Quil-A, colesterol e timerosol.
Numa outra forma de realização preferida, o presente pedido proporciona uma composição de vacina que inclui um antigénio de Leptospira e pelo menos um de um antigénio de BVDV do tipo I ou de BVDV do tipo II numa emulsão de óleo em água. Os antigenos, preferivelmente na forma de preparação celular ou virai inactivada, são incorporados intrinsecamente na emulsão de óleo em água que possui goticulas de um tamanho menor que 1 ym, preferivelmente com 30 um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 μιη, mais preferivelmente menor que 0,5 ym e ainda mais preferivelmente com um tamanho médio de goticulas de aproximadamente 0,5 ym. A emulsão de óleo em água em submicron é preferivelmente composta de uma formulação AMPHIGEN (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80) . A composição de vacina inclui ainda preferivelmente uma ou mais moléculas imunoestimuladoras seleccionadas de Quil-A, colesterol, DDA, GPI-100 e hidróxido de alumínio (A10H).
Ainda numa outra forma de realização preferida, o presente pedido proporciona uma composição de vacina que inclui pelo menos um antigénio bacteriano, por exemplo, a proteína PauA recombinante de Streptococcus uberis ou uma preparação de células de E. coli ou uma combinação de ambos, numa emulsão de óleo em água. 0(s) antígeno(s) é(são) combinado(s) intrinsecamente com a emulsão de óleo em água que possui gotículas de um tamanho menor que 1 ym, preferivelmente com um tamanho médio de gotículas menor que 0,8 ym, mais preferivelmente menor que 0,5 ym e ainda mais preferivelmente com um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,25 ym. A emulsão de óleo em água em submicron é preferivelmente composta de uma formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80) . A composição de vacina inclui ainda preferivelmente uma ou mais moléculas imunoestimuladoras seleccionadas de Quil A, DDA e GPI-100.
As composições de vacina da presente invenção podem ser administradas a um animal através de vias conhecidas, incluindo a via oral, intranasal, mucosal, tópica, transdermal e parentérica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração pode ser conseguida utilizando uma combinação de vias, por exemplo, a primeira administração utilizando uma via parentérica e 31 subsequentemente a administração utilizando uma via mucosal. Métodos de Preparação de Composições de Vacina
Numa forma de realização adicional, a presente invenção proporciona métodos de preparação de composições de vacina contendo um antigénio ou antigénios e uma emulsão de óleo em água em submicron.
Na preparação das composições de vacina da presente invenção, o(s) antigénio(s) pode(m) ser combinado(s) intrinsecamente ou extrinsecamente com os componentes da emulsão de óleo em água. Preferivelmente, o antigénio é combinado com os componentes da emulsão de óleo em água intrinsecamente. 0 antigénio pode ser obtido com os vários componentes da emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensioactivos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado, para formar uma mistura. A mistura é submetida a um processo primário de mistura, tipicamente através da passagem uma ou mais vezes por um ou mais homogeneizadores ou emulsionantes, para formar uma emulsão de óleo em água contendo o antigénio. Qualquer homogeneizador ou emulsionante disponível comercialmente pode ser utilizado para este propósito, por exemplo, o emulsionante de Ross (Hauppauge, NY) , o homogeneizador de Gaulin (Everett, MA) ou Microfluidics (Newton, MA). Alternativamente, os vários componentes do adjuvante de emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensioactivos e um componente aquoso podem ser combinados primeiramente para formar uma emulsão de óleo em água através da utilização de um homogeneizador ou um emulsionante; e o antigénio é então adicionado a esta emulsão. 0 tamanho médio de goticulas da emulsão de óleo em água após a mescla primária é de aproximadamente 1,0-1,2 micron. A emulsão contendo o antigénio é então submetida à microfluidização para levar o tamanho de goticulas para a 32 faixa de submícron. A microfluidização pode ser conseguida através da utilização de um microfluidizador comercial, tal como o modelo número 110Y disponível na Microfluidics, Newton, Mass; Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). 0 tamanho de goticulas pode ser determinado através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difracção a laser, através da utilização de instrumentos medidores disponíveis comercialmente. 0 tamanho pode variar dependendo do tipo de tensioactivo utilizado, da proporção do tensioactivo em relação ao óleo, da pressão de operação, da temperatura e similares. Pode-se determinar uma combinação desejada destes parâmetros para a obtenção de emulsões com um tamanho de goticulas desejado. As goticulas de óleo das emulsões da presente invenção são menores que 1 pm de diâmetro. Preferivelmente, o tamanho médio de goticulas é menor que 0,8 pm. Mais preferivelmente, o tamanho médio de goticulas é menor que 0,5 pm. Ainda mais preferivelmente, o tamanho médio de goticulas é de cerca de 0,1 a 0,3 pm.
Numa forma de realização preferida do presente pedido, a solução de óleo de lecitina DRAKEOL®, que contém 25 % de lecitina em óleo mineral leve, é combinada e misturada com tensioactivos TWEEN® 80 e SPAN® 80 e solução salina para formar uma mistura que contém 4 0 % de óleo mineral leve, lecitina, 0,18 % de TWEEN® 80, e 0,08 % de SPAN® 80. A mistura é então emulsificada com um emulsionante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm para formar um produto de emulsão, que também é denominado como uma "formulação AMPHIGEN®" ou "solução AMPHIGEN®": Subsequentemente, o(s) antigénio(s) desejado(s) é(são) combinado(s) com a solução AMPHIGEN® e quaisquer outros componentes apropriados (por exemplo, moléculas imunoestimuladoras) com o auxilio de um emulsionante, por 33 exemplo, um homogeneizador de Ross, para formar uma emulsão de óleo em água contendo o(s) antigénio(s) . Tal emulsão é passada uma vez através de um Microfluidizador operando a aproximadamente 10000 ± 500 psi ( = 6,89 ± 3,44 MPa) . A emulsão de óleo em água microfluidizada possui gotículas com um tamanho menor que 1 ym, com um tamanho médio de gotículas de aproximadamente 0,25 ym.
Numa outra forma de realização preferida, antes da combinação de uma emulsão de óleo em água (por exemplo, uma formulação AMPHIGEN®) com o(s) antigénio(s) desejado(s), o(s) antigénio(s) é/são combinado(s) com um glicósido de saponina, por exemplo, Quil A, para formar uma mistura. Esta mistura de antigénio(s)-saponina é submetida à homogeneização, por exemplo, num recipiente de homogeneização. Um esterol, por exemplo, colesterol, é então adicionado à mistura de antigénio(s)-saponina homogeneizada. A mistura contendo o(s) antigénio(s), saponina e esterol é então submetida à homogeneização adicional. A mistura de antigénio(s)-saponina-esterol homogeneizada é então combinada com uma emulsão de óleo em água (por exemplo, uma solução AMPHIGEN®) com o auxilio de um homogeneizador, por exemplo. A emulsão de óleo em água homogeneizada contendo o(s) antigénio(s), saponina e esterol é então submetida à homogeneização em alta pressão, tal como a microfluidização.
Composições de Vacina Contendo Antigénios Microencapsulados numa Emulsão de Óleo em Água em Submícron e Métodos de Preparação
Ainda numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antigénio encapsulado em microparticulas (ou "antigénio microencapsulado") , em que o antigénio microencapsulado é extrinsecamente incorporado numa emulsão de óleo em água em submicron descrita anteriormente no presente documento.
Os métodos para absorção ou aprisionamento de 34 antigénios em veículos particulados são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba e Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. Em: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach. Eds. Michael F. Powell eMark J. Newman, 1995 Plenum Press, Nova Iorque e Londres). Os veículos particulados podem apresentar várias cópias de um antigénio seleccionado ao sistema imunológico num indivíduo animal e promover o aprisionamento e a retenção de antigénios nos nodos linfáticos locais. As partículas podem ser fagocitadas por macrófagos e podem aumentar a apresentação do antigénio através da libertação de citocinas. Os veículos particulados também foram descritos na técnica e incluem, por exemplo, os derivados dos polímeros de metacrilato de polimetilo, assim como os derivados de poli (láctidos) e poli (láctido-co-glicolidas), conhecidos como PLG. Os polímeros de metacrilato de polimetilo não são biodegradáveis enquanto as partículas de PLG podem ser biodegradados através da hidrólise não enzimática aleatória de ligações ésteres nos ácidos láctico e glicólico que são segregados ao longo das vias metabólicas normais.
As microesferas biodegradáveis também foram utilizadas para conseguir a libertação controlada das vacinas. Por exemplo, pode ser conseguida uma libertação contínua do antigénio ao longo de um período prolongado. Dependendo do peso molecular do polímero e a proporção de ácido láctico em relação ao glicólico no polímero, um polímero de PLGA pode ter uma taxa de hidrólise de alguns dias ou semanas até vários meses ou um ano. Uma libertação controlada lenta pode resultar na formação de altos níveis de anticorpos similares aos observados após várias injecções. Alternativamente, uma libertação pulsátil de antigénios da vacina pode ser conseguida através da selecção de polímeros com taxas diferentes de hidrólise. A taxa de hidrólise de 35 um polímero depende tipicamente do peso molecular do polímero e da proporção de ácido láctico em relação ao glicólico no polímero. As micropartículas feitas de dois ou mais polímeros diferentes com taxas variáveis de libertação do antigénio proporcionam libertações pulsáteis de antigénios e imitam regimes de várias doses de vacinação.
De acordo com o presente pedido, um antigénio, incluindo qualquer um dos descritos anteriormente no presente documento, pode ser absorvido num veículo polimérico particulado, preferivelmente um polímero de PLG, através da utilização de qualquer procedimento conhecido na técnica (tal como um exemplificado no Exemplo 17), para formar uma preparação de antigénio microencapsulado. A preparação de antigénio microencapsulado é então misturada com e dispersa numa emulsão de óleo em água em submícron, cuja emulsão foi descrita anteriormente no presente documento, para formar a composição de vacina.
Numa forma de realização preferida, o presente pedido proporciona uma composição de vacina que contém um antigénio encapsulado num polímero de PLG, em que o antigénio microencapsulado é disperso extrinsecamente numa emulsão de óleo em água microfluidizada que é composta de óleo mineral leve, lecitina, TWEEN80, SPAN80 e solução salina e possui um tamanho médio de gotículas menor que 1,0 ym.
Complexos Formados por uma Saponina e Esterol
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona composições contendo uma saponina e um esterol, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas helicoidais. De acordo com a presente invenção, estes complexos possuem actividades imunoestimuladoras.
Por "imunoestimulação" entende-se que os complexos podem aumentar a resposta imunológica induzida por um componente antigénico ou que os complexos podem induzir uma resposta imunológica independente de um componente 36 imunogénico separado.
De acordo com a presente invenção, uma saponina preferida para utilização numa composição da presente invenção é Quil A.
Os esteróis preferidos para utilização nas composições adjuvantes da presente invenção incluem beta-sitoesterol, estigmaesterol, ergoesterol, ergocalciferol e colesterol. Estes esteróis são bem conhecidos na técnica, por exemplo, o colesterol é revelado no Merck Index, 11a Ed., página 341, como um esterol de ocorrência natural encontrado na gordura animal. Mais preferivelmente o esterol é colesterol. A proporção de saponina:esterol na composição está tipicamente na ordem de 1:100 até 5:1 em peso em relação ao peso. Preferivelmente, a proporção é de 1:1.
Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona composições de vacina contendo uma saponina, um esterol e um antigénio, em que a saponina e o esterol formam complexos na forma de micelas helicoidais e em que o antigénio é misturado, mas não é incorporado dentro das micelas helicoidais. A seguir estão exemplos de formas de realização especificas para a realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas com finalidades ilustrativas e não é pretendido que limitem o âmbito da presente invenção de forma alguma. EXEMPLO 1
Preparação de uma Formulação AMPHIGEN®
Uma formulação AMPHIGEN® foi preparada num processo em duas etapas. Na primeira etapa, 80 litros da solução oleosa de lecitina Drakeol, 116 litros de solução salina com o Toxóide do Tétano, 1,2 litro de SPAN 80 e 2,8 litros de Tween 80 foram misturados juntos e emulsifiçados utilizando um emulsionante de Ross. A solução oleosa de lecitina Drakeol continha 25 % de lecitina de soja e 75 % de óleo 37 mineral. 0 produto emulsifiçado foi recirculado através do emulsionante de Ross durante um minimo de 5 volumes ou um minimo de 10 minutos. O produto emulsificado foi armazenado a 2-7 °C durante um máximo de 24 horas para o processamento adicional. A emulsão do tanque com emulsionante de Ross foi transferida para um homogeneizador de Gaulin e foi homogeneizada durante 20 minutos sob uma pressão de 4500 psi (= 31,02 MPa) . A solução oleosa de lecitina Drakeol a 40 % resultante (a seguir no presente documento a "formulação AMPHIGEN®" ou "solução AMPHIGEN®") foi então distribuída em recipientes de carboxi polipropileno esterilizados. A distribuição foi realizada dentro de uma capela de despejo de classe 100 localizada num ambiente controlado de classe 10.000. Os recipientes foram armazenados a 2-7 °C. Esta formulação AMPHIGEN® foi utilizada nas experiências descritas no presente documento a seguir a não ser que seja indicado de outra maneira. EXEMPLO 2
Mistura Primária Através da Homogeneização de Mistura Instantânea (Flashblend) da Vacina de BVD. O aparelho usado para este processo de homogeneização é mostrado na Figura 1. Utilizando uma técnica asséptica ou válvulas de cruzamento de vapor d'água, uma garrafa contendo um antigeno de BVD do Tipo I (uma preparação virai inactivada de BVD do Tipo I) foi ligada à porta lateral inferior no recipiente de mistura. Após a transferência do volume requerido do antigénio de BVD do Tipo I ter sido completada, a garrafa com BVD do Tipo I foi substituída pela garrafa contendo uma preparação virai inactivada de BVD do Tipo II (uma preparação virai inactivada de BVD do Tipo II) . Após a transferência da quantidade requerida de um antigénio de BVD do Tipo II ter sido completada, o homogeneizador de Ross foi ligado ao recipiente portátil e a recirculação foi iniciada em RPM máxima (3300 rpm) . A agitação do recipiente foi mantida em velocidade média. 38
Utilizando uma técnica asséptica ou uma válvula de cruzamento de vapor de água, uma garrafa contendo Quil-A a concentração de 50 mg/ml foi ligada à porta em linha do homogeneizador no recipiente de mistura. Uma quantidade requerida da solução de Quil-A foi passada no recipiente através da sucção em linha. Após a transferência da solução de Quil-A ter sido completada, a garrafa foi removida. Da mesma maneira, uma quantidade requerida de colesterol em solução de etanol (18 mg/ml) foi transferida para o recipiente de mistura. Subsequentemente, uma quantidade requerida da formulação AMPHIGEN®, solução a 10 % de timerosol e soluções diluidas do meio de Eagle Modificado Básico ("BME") foram adicionadas no recipiente de mistura.
Uma vez que todas as adições estavam completas, a mistura foi mantida durante mais 15 minutos. A formulação resultante foi aliquotada em doses de 2 ml e representava uma vacina de BVD com base na formulação AMPHIGEN® não microf luidizada. Cada dose da vacina continha 500 yg de Quil-A, 500 yg de Colesterol, 2,5 % de formulação AMPHIGEN® e 0,009 % de timerosol. A concentração de antigénio para duas estirpes diferentes de BVD foi determinada em termos do titulo de ELISA para gp53. EXEMPLO 3
Mistura Secundária por Microfluidização A figura 2 ilustra o processo utilizado para a mistura secundária através da microfluidização. O microfluidizador foi esterilizado por vapor. Em primeiro lugar, a câmara do módulo de processamento auxiliar foi instalada na unidade e a câmara para ensaio em branco foi instalada na secunda posição da câmara. O recipiente contendo a vacina de BVD completamente auxiliada pelo adjuvante preparada como descrito no Exemplo 2 foi ligado com o microfluidizador através da ligação de uma linha de transferência partindo da válvula de drenagem do recipiente de fornecimento até a entrada do microfluidizador. O gás azoto foi ligado na 39 entrada do filtro de ar do recipiente de fornecimento e o ajuste da pressão do recipiente foi fixado a 20 +/- 5 PSI (= 0,13 -/ + 0,03 MPa). A válvula de drenagem do recipiente de colheita foi ligada à linha de transferência da saida do microfluidizador.
Após fazer todas as ligações necessárias, as válvulas foram abertas e a microfluidização foi iniciada a uma pressão operacional de 10.000 +/- 500 PSI (= 68,94 +/- 3,44 MPa) . 0 conteúdo inteiro da vacina foi passado através do microf luidizador uma vez e foi colhido na câmara pós-microfluidização. Esta preparação foi aliquotada em doses de 2 ml e representa a vacina de BVD com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada. EXEMPLO 4
Preparação de uma Composição de Vacina Através da Mistura em Bancada (Bench Blend). A formulação AMPHIGEN® preparada como descrito no Exemplo 1 foi diluida a 2,5 % com a adição de antigénios de BVD e a solução diluida. A solução resultante foi misturada na bancada utilizando um bastão de agitação ao invés de utilizar um homogeneizador. A preparação final continha a composição a seguir: antigénios de BVD do Tipo 1 e do Tipo 2, 2,5 % da formulação AMPHIGEN® (que contém óleo, lecitina, SPAN® e TWEEN®, como descrito no Exemplo 1) e solução salina. TWEEN 80 e SPAN 80 estão presentes na preparação final de vacina a 0,18 % e 0,08 % em volume, respectivamente. EXEMPLO 5
Comparação da Distribuição do Tamanho de Goticulas Entre as Preparações de Vacina com Base na Formulação AMPHIGEN® Não Microfluidizadas e Microfluidizadas A vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a preparação feita 40 através da mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, foram utilizadas para comparar o tamanho de goticulas das preparações de vacina. Dois mililitros da amostra de cada uma das preparações foram adicionados a um medidor de Difracção a Laser Malvern 2000 e a distribuição do tamanho de goticulas foi determinada. Como mostrado na figura 3, os resultados indicam que a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada tinha ó volume máximo de distribuição de partícula em torno de 0,1 mícron enquanto que a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada tinha o volume máximo de distribuição de partícula em torno de 1 mícron. EXEMPLO 6
Redução na Separação de Fases da Vacina.
Três preparações diferentes de vacina: a vacina com base na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a vacina preparada através da mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, foram comparadas lado a lado para determinar as propriedades de separação de fases após armazenamento longo. Foi permitido que todas estas preparações ficassem em repouso a 4 °C durante aproximadamente um mês e a separação de fases foi monitorizada em termos de aparência de uma camada cremosa na superfície das preparações de vacina. Como mostrado na figura 4, não havia separação de fases na preparação com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada quando comparada com as duas outras preparações. EXEMPLO 7
Preparação de Vacina para Gado Microfluidizada ou Não Microfluidizada contra o Virus da Diarreia Virai Bovina O antigénio virai do Vírus da diarreia Bovina foi incorporado intrinsecamente na formulação AMPHIGEN® através da microfluidização. O termo "intrinsecamente incorporado" 41 refere-se ao processo através do qual o antigénio foi adicionado na formulação AMPHIGEN® antes da microfluidização. 0 antigénio foi submetido às forças físicas do processo de microfluidização junto com os componentes da formulação adjuvante. No grupo não microfluidizado de controlo, a preparação de antigénio foi dispersa na formulação AMPHIGEN® através de mistura. A composição final das preparações tanto de controlo quanto microfluidizadas era como a seguir: BVD do tipo I com um título de ELISA pós-inactivação de 2535 UR/dose para gp53, BVD do Tipo II com um título de ELISA pós-inactivação de 3290 UR/dose para gp53, Quil-A na concentração de 1,25 mg/dose, colesterol na concentração de 1,25 mg/dose, a formulação AMPHIGEN® na concentração final de 2,5 % e timerosol na concentração final de 0,009 %. A dose de vacina era de 5 ml. EXEMPLO 8
Estabilidade em Longo Prazo de antigénios Virais de BVD Incorporados Intrinsecamente na Preparação de Vacina com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizada
Esta experiência foi realizada para determinar a estabilidade do antigénio incorporado intrinsecamente durante o armazenamento longo. O antigénio virai morto de BVD do Tipo II foi incorporado intrinsecamente na formulação AMPHIGEN® durante o processo de microfluidização para a obtenção da preparação de vacina microfluidizada (A907505). Três outras preparações de vacina contendo o mesmo antigénio na formulação AMPHIGEN® não microfluidizada (A904369, A904370 e A904371) serviram como o controlo. Nas preparações não microfluidizadas, o antigénio foi misturado com a formulação AMPHIGEN® e misturado através da mesclagem utilizando um homogeneizador de Ross. Todas as quatro preparações de vacina foram armazenadas a 4 °C durante dois anos. Em pontos diferentes durante o armazenamento (0, 6, 12 ou 24 meses), todas as quatro formulações foram 42 utilizadas para vacinar vacas com três meses de idade.
Nos dias 0 e 21, as vacas com três meses de idade foram vacinadas através da rota subcutânea com uma formulação de vacina de 2 ml. 0 soro dos animais vacinados foi colhido no dia 35 e a resposta serológica à vacina foi medida em termos do titulo de anticorpo através de ELISA BVDV-E2. Como mostrado na figura 5, a preparação de vacina microfluidizada exibiu um maior titulo de anticorpo em todos os pontos de tempo testados (0, 6, 12 e 24 meses), sugerindo que a estabilidade da preparação de antigénio não é perdida durante a incorporação intrínseca do antigénio durante o processo de microfluidização. Além disso, descobriu-se de forma surpreendente que a preparação de vacina microfluidizada induzia uma maior resposta imunológica em todos os pontos de tempo. EXEMPLO 9
Redução no Aumento Induzido pela Vacina na Temperatura Rectal Após a Microfluidização
As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas produzidas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar o gado no dia zero e a temperatura rectal foi monitorizada durante o período de um dia antes da vacinação até quatro dias após a vacinação. A dose de vacina era de 2 ml. Os grupos foram vacinados com uma dose única ou dupla da vacina. As temperaturas rectais foram medidas e registradas diariamente no Dia -1 até o Dia 4, inclusive. As temperaturas rectais no dia 0 foram medidas antes da administração do artigo de teste.
Como mostrado na Figura 6, os resultados indicam que havia um aumento acentuado na temperatura rectal em aproximadamente 24 horas após a vacinação nos animais vacinados com uma dose única ou dupla da formulação de vacina não microfluidizada. No entanto, nos animais vacinados com formas microfluidizadas da vacina, o aumento na temperatura rectal após a vacinação era somente minimo e 43 significativamente menor que nos animais vacinados com a formulação não microfluidizada (Figura 6). EXEMPLO 10 O Volume de Reacção no Local da Injecção Foi Resolvido Mais Rápido Quando Vacinado com Formulações de Vacina Microfluidizadas.
As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas produzidas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar o gado no dia zero. Os animais incluídos no estudo eram gado de corte retrocruzados. Havia três animais em cada um dos grupos de tratamento com placebo (T01 e T02) . Havia seis animais em cada um dos grupos T03 até T06. A dose de vacina era de 2 ml e os grupos foram vacinados com uma ou duas doses da vacina no dia zero. No dia 0, o artigo de teste foi administrado à direita no pescoço. Os animais que receberam dose dupla (4 ml) do artigo de teste (T02, T04 e T06) receberam a dose dupla toda na forma de uma única injecção num lado. A observação dos locais de injecção, incluindo a estimativa do tamanho de reacção no local da injecção foi feita no lado direito do pescoço no Dia 0 até o Dia 4, inclusive e nos Dias 6, 9 e 14. No Dia 0 os locais de inj ecção foram observados antes da administração dos artigos de teste. Os grupos vacinados com uma ou duas doses do placebo não mostraram qualquer aumento significativo no volume de reacção do local da injecção e, portanto, esses dados não são mostrados na Figura 7. No caso da formulação de vacina não microfluidizada, não houve um aumento proporcional no volume de reacção do local da injecção entre a uma dose e duas doses de vacina. Por outro lado, no caso da formulação de vacina microfluidizada, embora a dose única induzisse um volume de reacção maior no local da injecção, a injecção com a segunda dose não causava qualquer aumento adicional. Além disso, no caso dos animais injectados com a formulação de vacina microfluidizada, o 44 volume do local de reacção do local de injecção era resolvido a uma taxa mais rápida quando comparada com aquela nos animais injectados com uma formulação de vacina não microfluidizada. Estes resultados são mostrados na figura 7. EXEMPLO 11
Obtenção de Preparações de Vacina Com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizadas com Antigénios Virais de BVD e de Leptospira Incorporados Intrinsecamente e Moléculas Imunoestimuladoras Tais Como Quil A e DDA A estirpe CSL de hardjo-bovis inactivada com formalina foi formulada no adjuvante apropriado em contagens directas de aproximadamente 1,4 x 109 organismos/dose de 5 ml. A estirpe T262 de Leptospira Pomona inactivada com formalina foi formulada em aproximadamente 2400 Unidades Nefaloméricas/dose de 5 ml. As unidades Nefaloméricas foram calculadas com base na medida nefalométrica do fluido de fermentação pré-processado. O virus de BVD do Tipo 1 foi formulado num titulo de ELISA E2 de aproximadamente 3000 Unidades Relativas/dose de 5 ml. O virus de BVD do Tipo 2 foi formulado num titulo de ELISA E2 de aproximadamente 3500 Unidades Relativas/dose de 5 ml. A Unidade Relativa foi calculada com base no titulo de ELISA E2 do volume de fluido pós-inactivação pré-montagem. Tanto o Quil-A quanto o colesterol foram utilizados na concentração de 0,5 mg por dose. O Timerosol e a formulação AMPHIGEN® foram utilizados na concentração final de 0,009 % e 2,5 %, respectivamente. O hidróxido de alumínio (Rehydragel LV) foi utilizado na concentração final de 2,0 %. Quando o DDA foi utilizado como um imunomodulador, o DDA foi incluído dentro da formulação AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® (isto é, a solução estoque de lecitina Drakeol a 40 %) continha 1,6 mg/ml de DDA e, quando diluída apropriadamente, a preparação final de vacina continha 2,5 % de formulação AMPHIGEN® e 0,1 mg/ml de DDA. 45
Na preparação de formulações de vacina diferentes, fracções de BVD, Leptos, Quil-A, colestrol, timerosol, a formulação AMPHIGEN® e a solução salina como um diluente foram adicionados a um homogeneizador de Silverson e misturados durante 15 minutos a 10.000 ± 500 RPM (= 68,94 ± 3,44 MPa) . Os componentes foram então microfluidizados através de uma tela de 200 microns a 10.000 RPM (= 68,94 MPa) .
Quando a formulação de vacina continha hidróxido de aluminio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de aluminio. Após a microfluidização ter sido completada, o hidróxido de aluminio foi adicionado e misturado com um bastão de agitação durante a noite a 4 °C. EXEMPLO 12
Preparação da Vacina Virai de BVD Para Estudos de Desafio A preparação de vacina usada nesta experiência continha antigénios de ambos os virus de BVD do Tipo 1 e virus de BVD do Tipo 2. O antigénio BVD2-890 foi utilizado no titulo de ELISA pós-inactivação de 2535 UR/dose para gp53. 0 antigénio BVD2-890 foi utilizado no titulo de ELISA pós-inactivação de 3290 UR/dose para gp53. O Quil A e o colesterol foram utilizados na concentração de 0,5 mg/ml. O Timersol e a formulação AMPHIGEN® foram utilizados na concentração final de 0,009 % e 2,5 %, respectivamente. Quando o DDA foi utilizado como um modulador imunológico, o D DA foi incluído dentro da formulação AMPHIGEN®. A solução estoque de AMPHIGEN® (40 % da solução de lecitina Drakeol) continha quantidades variáveis de DDA e quando diluída de forma apropriada, a preparação final de vacina continha 2,5 % da formulação AMPHIGEN® e a concentração de DDA variava de 0,5 mg/dose até 2,0 mg/dose. O gel de alumínio (Rehydragel-LV) foi utilizado na concentração final de 2 %. GPI-0100 foi utilizado no intervalo de 2, 3 e 5 mg/dose.
Todos os componentes foram adicionados a um homogeneizador de Silverson e misturados durante 15 minutos 46 a 10.500 rpm e então microfluidizados através da passagem por uma câmara de 200 mícrons com 10.000 RPM (= 68, 94 MPa) . Quando a preparação de vacina continha hidróxido de alumínio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de alumínio. Após a microfluidização ter sido completada, o hidróxido de alumínio foi adicionado e misturado com um bastão de agitação durante a noite a 4 °C. EXEMPLO 13
Protecção Contra o Desafio de Leptospira Após a Vacinação Com Uma Formulação de Vacina Com Amphigen Microfluidizada Com Antigénios de Leptospira.
Quadro 1 - Grupos de Tratamento
Grupo de tratamento Composição de adjuvante T01 Solução Salina T02 Quil-A, Colesterol e a formulação AMPHIGEN® (QAC) T03 Quil-A, Colesterol, a formulação AMPHIGEN® e A10H (OAC- A10H) T04 DDA, Colesterol e a formulação AMPHIGEN® (DDA) T05 DDA, Colesterol, a formulação AMPHIGEN® e A10H (DDA- A10H) 0 Quadro 1 mostra a composição das formulações adjuvantes nas preparações de vacina testadas neste estudo. As preparações de vacina foram preparadas como descrito no Exemplo 11. Houve seis animais em cada grupo. Os novilhos de corte retrocruzados com aproximadamente sete meses de idade foram utilizados neste estudo. A vacinação foi feita no Dia 0 e no Dia 21 através da rota subcutânea com um volume de vacina de 5 ml. O desafio foi feito com a estirpe 203 de L. hardjo-bovis do NADC (National agricultural Disease Center). O desafio foi feito durante os Dias 57-59 com um inoculo de 1 ml. O desafio foi administrado conjuntamente nos olhos e na vagina. 0 material de desafio continha 5,0 X 106 de leptospiras/ml. A urina foi colhida semanalmente para cultura de lepto, FA e PCR. A recolha dos 47 rins foi feita durante os Dias 112 e 113.
Quadro 2 - Resultados do Estudo d Lo Desafio com Leptospira Tratamento Percentagem de bezerros sempre positiva para Leptospira na urina e no rim através da Cultura Percentagem de bezerros sempre positiva para Leptospira na urina e no rim por FA Percentagem de bezerros sempre positiva para Leptospira na urina e no rim através de PCR Percentagem de bezerros sempre positiva para Leptospira na urina dos rins em todos os ensaios Solução salina 100 83,3 83,3 100 QAC 0 0 0 0 QAC/AIOH 0 50,0 0 50, 0 ADD 0 0 0 0 DDA/A10H 0 33,3 16, 7 50, 0 0 Quadro 2 mostra os dados do estudo de desafio com Leptospira. Na determinação da percentagem da infecção por Leptospira no animal desafiado, foram utilizados os critérios a seguir. Se a cultura de rim fosse positiva apenas para uma amostra, o animal era considerado positivo para Leptospira. Se um animal fosse positivo em apenas uma amostra para FA ou PCR, o animal era considerado como sendo negativo. Se a amostra fosse positiva tanto para FA quanto para PCR em apenas uma amostra, era considerado positivo para Leptospira.
Os resultados mostrados no Quadro 2 indicam que havia uma duração significativamente mais curta de tracto urinário em todos os grupos de vacina com base em todos os três ensaios. Até onde a colonização urinária e renal era considerada, as eficiências das formulações contendo QAC e DDA sem A10H podiam ser comparadas. 0 A10H não aumentava e até mesmo reduzia as eficiências das vacinas contendo QAC ou DDA neste estudo de desafio. 48
Quadro 3 - Intervalo de Títulos de Aglutinação Microscópica No Dia da Média Geométrica do Título Máximo Antes do
Desafio (Dia 35)
Tratamento L. Hardjo L. pomona Solução salina 20 20 QAC 160 - 640 1280 - 10240 QAC/A10H 160 - 2560 8- -10240 ADD 40 - 1280 320 - 2560 DDA/A10H 320 - 640 1280 - 5120
As respostas serológicas contra ambos os antígenos de Leptospira na formulação de vacina foram detectadas no animal vacinado e a resposta máxima foi observada no Dia 35. Não havia correlação entre a resposta serológica e a protecção contra o desafio. A presença de gel de alumínio na formulação de vacina reduzia o nível de protecção embora a resposta serológica fosse aumentada pela presença de gel de alumínio na vacina. EXEMPLO 14
Activação da Resposta Imunológica Para O Antigénio Virai de BVD e Protecção Contra o Desafio com O Vírus de BVD do Tipo 2 Após a Imunização Com Uma Preparação de Vacina Microfluidizada Contendo a Formulação AMPHIGEN® e DDA.
Bezerros seronegativos de quatro até sete meses de idade foram utilizados nesta experiência. Havia seis grupos diferentes e cada grupo tinha dez animais (Quadro 4) . No Dia 0 e no Dia 21 cada animal recebeu uma dose subcutânea da vacina de 2 ml ou de placebo na lateral do pescoço aproximadamente no meio da distância entre a escápula e a cabeça. 49
Quadro 4 - Grupos de Tratamento
Tratamento Composição adjuvante T01 Solução salina T02 Quil-A, formulação AMPHIGEN® e Colesterol T03 formulação AMPHIGEN®, Colesterol, DDA (0,5 mg / dose) e AlOH T04 formulação AMPHIGEN®, Colesterol, e DDA (0,5 mg / dose) T05 formulação AMPHIGEN®, Colesterol, e DDA (1,0 mg / dose) TO 6 formulação AMPHIGEN®, Colesterol, e DDA (2,0 mg / dose)
Uma dose de 5 ml da preparação virai de desafio (aproximadamente 2,5 ml por narina) foi administrada de forma intranasal no Dia 44 do estudo. 0 virus de BVD do Tipo 2 não citopático, isolado N° 24515 (Estirpe Ellis), lote N° 46325-70 foi utilizado neste estudo como a estirpe de desafio. As amostras retidas do material de desafio foram tituladas (duas réplicas por titulação) no momento em que o desafio foi iniciado e imediatamente após ter sido completado. O titulo médio de virus vivo por dose de 5 ml era de 5,3 logio FAID5o/5 ml antes do desafio e de 5,4 logio FAID50/5 ml após o desafio (FAID é equivalente à TCID50) .
Os animais foram monitorizados diariamente desde o Dia -3 até o Dia 58. Os escores clínicos da doença de 0, 1, 2 ou 3, baseados nos sinais clínicos que podiam ser atribuídos à infecção pelo BVD 2 foram obtidos para cada animal nos Dias 42 até 58. Os escores no Dia 44 foram registrados antes do desafio. As amostras de sangue (dois Tubos de Separação de Soro de 13 ml, SST) foram colhidas de cada animal nos Dias 0, 21, 35, 44 e 58 para a determinação dos títulos no soro de anticorpos de neutralização do vírus de BVD do Tipo 1 e BVD do Tipo 2.
As amostras de sangue foram colhidas de cada animal no Dias 42 até o Dia 58, inclusive e a presença do vírus de 50 BVD na célula de revestimento de coágulo foi determinada. No Dia 44, foram obtidas amostras antes do desafio.
Para a determinação das contagens de células sanguíneas brancas, as amostras de sangue (um tubo de EDTA de 4 ml) foram colhidas de cada animal no Dia 42 até o Dia 58, inclusive. No Dia 44, foram obtidas amostras antes do desafio. A leucopenia foi definida como um decréscimo de 40 % ou superior na contagem de WBC partindo da linha de base (média das contagens de WBC pré-desafio partindo de dois dias antes e no dia do desafio).
Os escores clinicos da doença foram utilizados para definir o estado da doença como a seguir; se o escore for < 1, então a doença = não; se o escore for > 2, então a doença = sim.
Como é mostrado nos Quadros 5 e 6, os grupos vacinados com vacinas contendo antigénios virais de BVD junto com a formulação AMPHIGEN®, Quil A ou DDA e microfluidizados, sofreram seroconversão com titulos de neutralização significativos do virus no soro tanto para virus de BVD do Tipo 1 quanto BVD do Tipo 2. Em tais grupos havia ainda uma redução significativa na percentagem de animais exibindo viremia após o desafio, enquanto no grupo de controlo 100 % dos animais eram virémicos (Quadro 7).
Além disso, nos grupos vacinados a frequência da doença também foi significativamente reduzida (Quadro 8). Similarmente, a percentagem de animais exibindo leucopenia também foi reduzida nos grupos de vacina e a redução da leucopenia era mais significativa no grupo contendo DDA que no grupo contendo Quil A (Quadro 9) . No grupo de controlo havia uma queda significativa no ganho de peso quando comparado com os grupos vacinados. (Quadro 10)
Serologia
Antes da vacinação no Dia 0, todos os animais no estudo eram seronegativos (SVN <1:2) em relação aos 51 anticorpos para os vírus de BVD dos Tipos 1 e 2 (dados não mostrados). Catorze dias após a segunda vacinação (Dia 35), todos os animais que foram administrados com o placebo (T01) permaneceram seronegativos em relação aos anticorpos para os vírus de BVD dos Tipos 1 e 2; e todos os animais vacinados com os ITAs (Antígeno de Teste para Investigação) (T02, T03, T04, T05 e T06) eram seropositivos (SVN >1:8) em relação aos anticorpos para os vírus de BVD dos Tipos 1 e 2. Um animal que foi administrado com a vacina auxiliada com adjuvante com a formulação AMPHIGEN® a 2 mg/dose de DDA tinha um título de SVN de 3 em relação aos anticorpos para o vírus de BVD do Tipo 2 no Dia 35 (Quadros 11 e 12).
Antes do desafio no Dia 44, todos os controlos (T01) , excepto um, eram seronegativos (SVN <1:2) em relação aos anticorpos para os vírus de BVD dos Tipos 1 e 2 (dados não mostrados). Um controle (N°2497) era seropositivo (SVN = 10) em relação aos anticorpos para o vírus de BVD do Tipo 1 e seronegativo em relação aos anticorpos para o vírus de BVD do Tipo 2. Catorze dias após o desafio, todos os animais no estudo eram seropositivos em relação aos anticorpos para os vírus de BVD dos Tipos 1 e 2.
Quadro 5. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização
Virai no Soro do Vírus de BVD do Tipo 1
Tratamento Média Geométrica dos Títulos de SVN do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo 0 21 35 44 58 T01 Solução salina <2 <2 <2 <2 23, 9 T02 Amphigen, Quil A 2 39, 1 19824,5 14018,2 27554,5 T03 Amphigen, de DDA, AI 0,5 mg <2 51,8 32204,8 22381,1 23170,4 T04 Amphigen, de DDA 0,5 mg <2 27,0 14512,4 8932,0 21996,2 T05 Amphigen, de DDA 1,0 mg <2 26, 7 11585,2 8194,6 20882,0 T06 Amphigen, de DDA 2,0 mg <2 23,5 8778,7 6769,3 16961,1 52Quadro 6. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização Virai no Soro do Vírus de BVD do Tipo 2
Tratamento Média Geométrica dos Títulos de SVN do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo 0 21 35 44 58 T01 Solução salina <2 <2 <2 <2 522,0 T02 Amphigen, Quil A <2 co KD 2272,4 2048,2 24833,6 T03 Amphigen, 0,5 mg de DDA, AI <2 LO σ\ 3565,7 2702,2 20881,8 T04 Amphigen, 0,5 mg de DDA <2 4,1 1260,7 989, 1 18496,2 T05 Amphigen, 1,0 mg de DDA <2 6, 4 1398,8 1453,9 30047,8 T06 Amphigen, 2,0 mg de DDA <2 7,7 1673,2 1428,9 16384,0
Quadro 7. Isolamento do Vírus de BVD Após o Desafio
Tratamento Isolamento do Vírus de BVD Nos Dias do Estudo Frequência (%) de Animais Virémicos Dias de LS Médio com Viremia T01 Solução salina 47 até 58 10/10 (100,0) 10, 4 T02 Amphigen, Quil A 50 até 53 1/10 (10,0) 0,4 T03 Amphigen, 0,5 mg de DDA, AI — 0/10 (0,0) O o T04 Amphigen, 0,5 mg de DDA 48, 50 até 52, 57 3/10 (30,0) 0,5 T05 Amphigen, 1,0 mg de DDA 49 até 51 2/10 (20,0) 0,4 T06 Amphigen, 2,0 mg de DDA 48 até 52 2/10 (20,0) LO O 53Quadro 8. Sinais Clinicos da Doença de BVD Após o Desafio
Tratamento Frequência (%) com Doença Frequência (%) de Observações com Sinal Clinico da Doença de BVD Obs. Total 0 1 2 3 T01 Solução salina 9/10 (90,0) 75 (46) 63 (37,5) 29 (17,3) 1 (0,6) 168 T02 Amphigen, Quil A 1/10 (10,0) 105 (61,8) 63 (37,1) 2 (1,2) 0(0) 170 T03 Amphigen, 0,5 mg de DDA, AI 2/10 (20,0) 99 (58,2) 67 (39, 4) 4 (2,4) 0(0) 170 T04 Amphigen, 0,5 mg de DDA 0/10 (0,0) 118 (69,4) 52 (30,6) 0(0) 0(0) 170 T05 Amphigen, 1,0 mg de DDA 0/10 (0,0) 101 (59,4) 69 (40, 6) 0(0) 0(0) 170 T06 Amphigen, 2,0 mg de DDA 0/10 (0,0) 104 (61,2) 66 (38,8) 0(0) 0(0) 170
Quadro 9. Leucopenia Após o Desafio
Tratamento Leucopenia Frequência (%) de Animais Leucémicos Dias de LS Médio com Leucemia T01 Solução salina 10/10 (100,0) 7,8 T02 Amphigen, Quil A 6/10 (60,0) 1,2 T03 Amphigen, 0,5 mg de DDA, AI 2/10 (20,0) 0,2 T04 Amphigen, 0,5 mg de DDA 4/10 (40,0) co o T05 Amphigen, 1,0 mg de DDA 3/10 (30,0) 0, 9 T06 Amphigen, 2,0 mg de DDA 2/10 (30,0) LO O 54
Quadro 10. Peso Corporal e Ganho de Peso Corporal Durante o
Estudo
Tratamento Ganho de Peso Corporal Médio (lb.) no Dia do Estudo Ganho de Peso (lb) -1 43 50 58 T01 Solução salina 378, 0 484,9 491,0 476, 9 98, 9 T02 Amphigen, Quil A 428, 0 526, 5 546, 7 579, 0 151,0 T03 Amphigen, 0,5 mg de DDA, A10H 410,5 514,4 534,2 579, 0 168, 5 T04 Amphigen, 0,5 mg de DDA 373,7 472,3 492,6 538,1 164,4 T05 Amphigen, 1,0 mg de DDA 358, 9 451,4 478, 9 507,1 148,2 T06 Amphigen, 2,0 mg de DDA 408 . 513, 3 533, 9 560, 3 151,6
Isolamento Virai
Como os dados mostrados no Quadro 13, durante o período de desafio (Dias 44 até 58), todos os dez animais no controlo (T01) estavam virémicos (o vírus de BVD foi isolado num ou mais dias). Nos grupos administrados com os ITAs, a frequência de animais virémicos era um, zero, três, dois e dois em cada grupo de dez (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controlo e os grupos administrados com os ITA era estatisticamente significativa (P<0,05). O número de dias em mínimos quadrados de viremia também era significativamente maior (10,4 dias) para o controlo quando comparado com o dos grupos administrados com os ITAs (0,0 até 0,5 dia) .
Doença Clínica
Os animais com escores de sinais clínicos de 2 ou 3 foram considerados como demonstrando sinais da doença de BVD. Como é mostrado no Quadro 14, a frequência de animais com sinais clínicos da doença do vírus de BVD era de nove até dez no controlo (T01) e um, dois, zero, zero e zero de dez em cada um dos grupos administrados com os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o 55 controlo e os grupos que foram administrados com os ITAs era estatisticamente significativa (P£0,05).
Leucopenia
Como é mostrado no Quadro 15, durante o período de desafio (Dias 44 até 58) , todos os dez animais no controlo (T01) eram leucémicos (uma redução de 40 % na contagem de células sanguíneas brancas partindo da linha de base pré-desafio, Dias 42-44). A frequência de animais com leucemia era de seis, dois, quatro, três e dois dos dez animais em cada um dos grupos administrados com os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente) . A diferença entre o controlo e o grupo administrado com a vacina que era auxiliada pelo adjuvante com a formulação AMPHIGNEN® a 0,5 mg/dose e hidróxido de alumínio (T03) era estatisticamente significativa (P^0,05). O número de dias em mínimos quadrados de viremia também era significativamente maior (7,8 dias) para o controlo quando comparado com o dos grupos administrados com os ITAs (0,2 até 1,2 dia). EXEMPLO 15
Activação da Resposta Imunológica Para o Antigénio Virai de BVD e Protecção Contra o Desafio com o Vírus de BVD do Tipo 2 Após a Imunização com a Formulação de Vacina Microfluidizada Contendo GPI-0100.
Foi seguido um conjunto de condições experimentais que são descritas no Exemplo 14 e foi feita uma comparação directa entre Quil A e GPI-0100. Como é mostrado nos Quadros 11 e 12, os animais vacinados com os antigénios BVD na preparação com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada contendo Quil A ou GPI-0100 tinham um título de anticorpo significativo para ambos os vírus de BVD do Tipo 1 e BVD do Tipo 2. O título de anticorpos para o vírus de BVD do Tipo 1 era muito mais alto que para o vírus de BVD do Tipo 2. No entanto, o desafio subsequente com o vírus de BVD do Tipo 2 mostrou uma forte protecção e a incidência da doença foi significativamente reduzida nos 56 bezerros vacinados com a preparação de vacina com base na formulação AMPHIGEN® microfluidizada contendo GPI-0100.
Quadro 11. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização Virai no Soro do Vírus de BVD do Tipo 1
Tratamento Média geométrica do titulo de SVN 0 21 35 43 57 T01 Solução salina <2 <2 <2 <2 35,5 T02 Amphigen, Quil A <2 98,7 20171,0 12203,4 44762,4 T03 Amphigen, 2 mg de GPI-0100, A10H <2 84,6 10998,5 7383,2 25709,2 T04 Amphigen, 2 mg de GPI-0100 <2 106, 0 18179,2 8933,2 28526,2 T05 Amphigen, 3 mg de GPI-0100 <2 62,9 15024,3 8780,1 19824,4 T06 Amphigen, 5 mg de GPI-0100 <2 71,1 12203,3 7512,0 16670,2
Quadro 12. Média Geométrica dos Títulos de Neutralização Virai no Soro do Vírus de BVD do Tipo 2_
Tratamento Média Geométrica dos Títulos de SVN do BVDv do Tipo 1 no Dia do Estudo 0 21 35 44 58 T01 Solução salina <2 <2 <2 <2 14,7 T02 Amphigen, Quil A <2 12,9 2312,0 1692,5 1663,4 T03 Amphigen, 2 mg de GPI-0100, A10H <2 13,2 1663,5 1116,8 1562,3 T04 Amphigen, 2 mg de GPI-0100 <2 20, 5 2610,2 1978,2 2478,7 T05 Amphigen, 3 mg de GPI-0100 . <2 11,4 1752,8 1305,2 2435,4 T06 Amphigen, 5 mg de GPI-0100 <2 12,0 3158,4 2120,2 1845,6 57
Quadro 13. Isolamento do Virus de BVD Após o Desafio 57 Tratamento Isolamento do Vírus de BVD Frequência (%) de Animais Virémicos Dias de LS Médio com Viremia T01 Solução salina 10/10 (100,0) 8,4 T02 Amphigen, Quil A 3/10 (30,0) 0,3 T03 Amphigen, 2 mg de GPI-0100, A10H 0/10 (0,0) O o T04 Amphigen, 2 mg de GPI-0100 1/10 (10,0) τ—1 O T05 Amphigen, 3 mg de GPI-0100 3/10 (30,0) 0, 3 T06 Amphigen, 5 mg de GPI-0100 2/10 (20,0) 0,2
Quadro 14. Sinais Clinicos da Doença de BVD Após o Desafio
Tratamento Frequência (%) com Doença Frequência (%) de Observações com Escore de Doença Clínica de Obs. Total 0 1 2 T01 Solução salina 5/10 (50,0) 103 (60,6) 55 (32,4) 12 (7,1) 170 T02 Amphigen, Quil A 5/10 (50,0) 115 (67,6) 48 (28,2) 7 (4,1) 170 T03 Amphigen, 2 mg de GPI-0100, A10H 0/10 (0,0) 128 (75,3) 42 (24,7) 0(0) 170 T04 Amphigen, 2 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 124 (72,9) 46 (27,1) 0(0) 170 T05 Amphigen, 3 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 104 (61,2) 66 (38,8) 0(0) 170 T06 Amphigen, 5 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 128 (75,3) 42 (24,7) 0(0) 170 58 58 Quadro 15. Leucopenia Após o Desafio Tratamento Leucopenia Frequência (%) de Animais Leucopénicos Dias de LS Médio com Leucopenia T01 Solução salina 9/10 (90,0) Γ ΟΟ T02 Quil A 6/10 (60,0) 1,6 T03 2 mg de GPI-0100, A10H 7/10 (70,0) 2,6 T04 2 mg de GPI- 0100 4/10 (40,0) 1,5 T05 3 mg de GPI-0100 7/10 (70,0) 2,6 T06 5 mg de GPI-0100 8/10 (80,0) 2,9
Em conclusão, a segurança de cada vacina foi demonstrada através da ausência de reacções adversas ou de mortalidade nos animais vacinados. A potência de cada vacina foi demonstrada através da seroconversão (títulos de anticorpos SVN para BVD-1 e BVD-2 >1:8) em 100 % dos animais vacinados. A resistência satisfatória ao desafio foi demonstrada pela vacina auxiliada por adjuvante apenas com 2 mg de GPI-0100. EXEMPLO 16
Preparação de Vacina Contendo Antigénio Microencapsulado em Emulsão de Óleo em Água Microfluidizada utilizando
Três gramas de Trealose (Fluka) foram adicionados na água para produzir um estoque de solução de Trealose a 333 mg/ml. O antigénio PauA recombinante solubilizado em solução de SDS a 0,8 % (SDS/rPauA) foi adicionado à solução de Trealose para a obtenção de uma concentração final de 494 yg de rPauA/ml. Na etapa seguinte 10 gramas do ácido poliláctido glicólico (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) foram dissolvidos em 200 ml de Cloreto de Metileno (MeCl2) . A solução de PLG/MeCl2 resultante foi combinada com a solução de SDS-rPauA/trealose preparada na primeira etapa. A solução combinada foi submetida à microfluidização utilizando (Microfluidizador da 59
Microfluidics Modelo M110EH) e a preparação microfluidizada foi seca por spray utilizando (Temco Spray Dryer Modelo SD-05) . O material seco por spray foi colhido utilizando uma tela de 500 microns. A concentração de rPauA neste material seco por spray foi quantificada utilizando uma análise de Western blot. 1,04 mg do material seco por spray foi dissolvido em 50 μΐ de acetona e centrifugado a 13.200 rpm à temperatura ambiente durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido. As fracções de péletes do sobrenadante foram secas numa capela de segurança biológica durante 2,5 horas. O pélete foi ressuspenso em 47,43 μΐ de solução de amostra (25 μΐ de tampão de amostra + 10 μΐ de agente redutor + 65 μΐ de água) . A fracção do sobrenadante seco foi ressuspensa com 20 μΐ de solução de amostra. Na análise de western o PauA purificado foi utilizado como um padrão para quantificar o conteúdo de rPauA do material seco por spray.
Uma solução estoque de Manitol a 20 % foi preparada através da dissolução de 100 gramas de manitol (Sigma) em 500 ml de Água para injecção (WFI). A solução foi aquecida a 40 °C com placa de aquecimento/agitador e resfriada a 30 °C. A solução foi esterilizada por filtração através de um filtro esterilizado de 0,22 micron (Millipore). Uma solução a 2,5 % de Carboximetilcelulose foi preparada através da dissolução de 12,5 gramas de carboximetilcelulose (Sigma) em 500 ml de WFI e misturada durante a noite a 4 °C. A solução foi autoclavada a 121 °C. O pó resultante da secagem por spray foi reconstituído numa solução contendo 5 % de manitol, 0,3 % de carboximetil celulose e 1:5000 de timerosol. A solução final foi aliquotada em frascos de 3 ml e liofilizada utilizando um Liofilizador (USIFROID). O pó liofilizado representa o rPauA microencapsulado. O antigénio de proteína de subunidade microencapsulada é ressuspenso em 2 ml de emulsão de óleo em água microfluidizada contendo uma 60 formulação AMPHIGEN® (tal como a emulsão microfluidizada descrita no Exemplo 20) e utilizado como uma vacina. EXEMPLO 17
Preparação da Formulação de Vacina Microfluidizada Contendo Tanto o Antigénio de Célula Total Bacteriana Quanto o Antigénio de Proteína Recombinante em Emulsão de Óleo em Água
Duas preparações de vacina foram feitas as quais continham ambas as proteínas recombinantes PauA de Streptococcus uberis e células bacterianas de Escheríchia coli, adicionadas intrinsecamente a emulsões de óleo em água como descrito nos Exemplos 2 e 3. O antigénio recombinante PauA estava na concentração de 100 yg por dose e as células de E. coli estavam na contagem final de 4 X 109 por dose. As composições adjuvantes de emulsão das duas formulações de vacina são mostradas no Quadro 16.
Quadro 16. Formulações de vacina contendo tanto a proteína recombinante quanto as células totais de E. coli.
Tratamento antigénio Adjuvante T01 Placebo Solução salina T02 Pau A/E. coli SEAM-14 T03 Pau A/E. coli 2,5 % de Amphigen, 0,5 mg de GPI-0100, 0,5 mg de colesterol T04 Pau A/E. coli 2,5 % de Amphigen, 0,5 mg de brometo de dimetildioctadecilamónio (DDA), 0,5 mg de colesterol EXEMPLO 18
Resposta Imunológica à Vacina Microfluidizada Contendo o rPauA e os Agentes Bacterianos de Células Totais em Emulsão de Óleo em Água
Foram utilizadas nesta experiência vacas de leite maduras. Os animais estavam no final de sua primeira ou segunda lactação no momento do envolvimento. Dois ml de cada formulação de vacina foram administrados 61 subcutaneamente três vezes, uma vez no momento da ordenha (D-0), 28 dias depois (D=28) e novamente 4 até 10 dias após o nascimento do bezerro (C+4 - C+10). A primeira e a terceira doses foram administradas do lado esquerdo do pescoço e a segunda dose foi administrada do lado direito do pescoço. O sangue foi colhido antes de cada vacinação e aproximadamente 14 dias e 32 dias após a terceira vacinação. O titulo de anticorpos para E. coli e para o antigénio rPauA foi determinado por ELISA. Como mostrado na figura 8, os resultados indicam que o titulo de anticorpos para rPauA era maior no grupo vacinado com a formulação de vacina contendo GPI-0100 como um imunoestimulante e era máximo no dia 70 após a vacinação inicial. O titulo de anticorpos para o antigeno de E. coli é mostrado na figura 9. O titulo de anticorpos para o antigeno de E. coli podia ser comparado em ambas as formulações de vacina, embora a presença de GPI-0100 como um imunoestimulante induzisse um titulo de anticorpos relativamente maior quando comparado com o da formulação com DDA como um imunoestimulante. EXEMPLO 19
Análise da Actividade Viricida das Preparações de Vacina Com Base na Formulação AMPHIGEN® Microfluidizadas A fim de determinar se a microfluidização inactiva o vírus, foi determinada a actividade viricida de três preparações de vacina com base ria formulação AMPHIGEN® microfluidizadas. As três preparações continham três vírus infecciosos bovinos diferentes, a saber, o vírus da herpes bovina (BHV) , o vírus parainfluenza 3 (PI3) e o vírus sincicial respiratório bovino (BRSV). A detecção da actividade viricida nas três preparações de vacina foi realizada de acordo com os requerimentos da USDA 9CFR.113.35.
Os resultados mostrados no Quadro 16 indicam que a microfluidização das preparações de vacina com base na formulação AMPHIGEN® não causa qualquer inactivação 62 significativa da preparação de vacina.
Quadro 16. Análise das Actividades Viricidas das Vacinas
Microfluidizadas
Serial BRSV BHV PI3 Ά 0 0,2 0 AM2 00 -0,2 0 -0,2 AM75 0 -0, 3 1 O CO AM75 0 37C 0,1 -0, 3 -0,2 B 0 τ—1 O 1 -0,2 BM200 0 0 -0,2 BM7 5 -0,2 -0, 5 0 BM75 0 37C 0,5 LO O 1 0 C 0,1 -0,1 -0,2 CM200 -0,2 -0,1 -0,2 CM7 5 0,1 0,5 Cs] O 1 CM75 0 37C 0, 5 0,5 -0,2 A = Colesterol adicionado a 650 ml/min B = Colesterol adicionado a 28 ml/mim C = Colesterol adicionado a 5 ml/min M200 = Microfluidizado com tela de 200 microns M75 = Microfluidizado com tela de 75 microns M75037C = Fluidos aquecidos até 37 °C antes da microfluidização Um valor acima de 0,7 é um indicativo de efeito viricida. EXEMPLO 20
Preparação de uma Formulação AMPHIGEN® Microfluidizada
Uma formulação AMPHIGEN® foi preparada através da combinação da solução oleosa de lecitina Drakeol (óleo mineral leve com 25 % de lecitina) e TWEEN 80 (com a concentração final de 0,18 %) e Span 80 (com a concentração final de 0,08 %) com mistura durante 8-22 horas a 36 ± 1 °C. A mistura oleosa foi então adicionada à solução salina com o auxilio de um emulsionante Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3400 rpm. Subsequentemente, a mistura foi passada uma vez através de um microfluidiza-dor com uma câmara de interação de 200 ym a 4500 ± 500 psi 63 (Ξ 31,02 + 3,44 MPa) . As figuras 10 A e 10B mostram a estabilidade da formulação AMPHIGEN® microfluidizada. A distribuição do tamanho de particula, que é medido pela difracção a laser, no inicio, ponto de tempo inicial (Figura 10A), era quase idêntica à distribuição do tamanho de particula após 22 meses de armazenamento a 4 °C (Figura 10B) . EXEMPLO 21
Análise por Microscopia electrónica do Complexo Imunológico Quil A - Colesterol
Com a finalidade de determinar a natureza do complexo imunogénico formado por Quil A e colesterol, uma mistura destes dois componentes foi feita na presença ou na ausência de antigénio.
Num béquer contendo 50 ml de tampão KR-Hals, o antigénio de BVD do Tipo I foi adicionado durante a agitação da solução com um bastão magnético. Depois disso, uma solução concentrada de Quil A (50 mg/ml) foi adicionada em gotas durante a agitação da solução para atingir uma concentração final de 50 pg/ml. A adição de Quil A foi seguida pela adição de uma solução estoque de colesterol em etanol (18 mg/ml) até a concentração final de 50 yg/ml.
Num segundo béquer, o Quil A e o colesterol foram adicionados da mesma maneira ao tampão de 50 ml sem qualquer antigénio de BVD do Tipo I.
Para a microscopia electrónica de transmissão, 10 (aL de cada amostra foram adsorvidos em grades de cobre de 400 mesh com uma plataforma de suporte de formvar/carbono (Electron Microscopy Sciences, Inc., Fort Washington, PA). As amostras foram coradas negativamente utilizando 10 μΐ de ácido fosfotúngstico a 2 % filtrado, pH 5,2 como um agente de contraste. As amostras foram verificadas utilizando um microscópio eléctrico de transmissão JEOL 1230 (JEOL Inc., Tóquio, Japão) a uma voltagem de aceleração de 80 kV. A obtenção da imagem digital foi realizada numa câmara Gatan 64
BioScan 792. A microscopia do filme foi feita num filme 4489 EM e impressa no papel Kodabrome II RC F3 (Eastman Kodak Company, Rochester, NY.) .
Na solução contendo apenas colesterol e Quil A sem qualquer antigénio de BVD do Tipo I, foram detectadas micelas helicoidais junto das micelas de Quil A e os cristais de colesterol (Figura 11). As micelas helicoidais estavam entremeadas e apareciam na forma de uma mescla. Na amostra contendo o antigénio de BVD do tipo I, foi descoberto que as micelas helicoidais circundavam aleatoriamente certas áreas densas (Figura 12) . As áreas densas representam o antigénio de BVD do Tipo 1 e foi descoberto que o complexo imunogénico em hélice resultante da associação de Quil A e colesterol era adsorvido na superfície do antigénio de BVD do Tipo I antigénio. 65
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.
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Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de vacina que compreende um glicósido de saponina, um esterol e um antigénio, em que - na formação da dita composição de vacina - o dito esterol é adicionado ao dito glicósido de saponina, e em que o dito glicósido de saponina e o dito esterol se associam um ao outro formando complexos sob a forma de micelas helicoidais; e em que o dito antigénio está misturado com as ditas micelas helicoidais, mas não está integrado nelas.
2. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda um veiculo veterinariamente aceitável.
3. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, em que o dito veiculo veterinariamente aceitável é uma emulsão de óleo em água.
4. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o dito glicósido de saponina é um glicósido de triterpenóide.
5. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 4, em que o dito glicósido de triterpenóide é Quil A.
6. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o dito esterol é colesterol.
7. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, em que o dito antigénio compreende um antigénio virai, um antigénio bacteriano ou uma combinação dos mesmos.
8. A composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, em que o dito antigeno compreende um antigeno de Vírus 2 da Diarreia Virai Bovina (BVDV) do tipo 1 ou do tipo 2.
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