ES2398235T3 - Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas - Google Patents

Abstract

Una emulsión submicrométrica microfluidizada de aceite en agua que comprende un aceite nometabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, estando disperso dicho aceite endicho componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0,5 μm.

Description

Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general al campo de las vacunas y, en particular, a formulaciones decoadyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria en animales veterinarios. En particular, la invención se refiereal uso de una emulsión submicrométrica de aceite en agua como un coadyuvante de vacunas para potenciar lacapacidad inmunógena de los antígenos. La presente invención proporciona formulaciones de emulsiones submicrométricas de aceite en agua, composiciones de vacunas que contienen un antígeno incorporado en dichaemulsión, así como procedimientos para preparar las emulsiones y vacunas.

Antecedentes de la invención

Las infecciones bacterianas, víricas, parasitarias y micoplásmicas están ampliamente difundidas en los animalesveterinarios tales como ganado vacuno, porcino y animales de compañía. Las enfermedades provocadas por estosagentes infecciosos son a menudo resistentes a la terapia farmacéutica antimicrobiana, sin dejar medios efectivosde tratamiento. En consecuencia, cada vez se usa más una estrategia de vacunación para controlar la enfermedad infecciosa en los animales veterinarios. Un patógeno infeccioso entero puede hacerse adecuado para su uso en una formulación de vacuna después de la inactivación química o manipulación genética apropiada. De forma alternativa,puede expresarse una subunidad proteínica del patógeno en un sistema de expresión recombinante y purificarsepara su uso en una formulación de vacuna.

Coadyuvante, en general, se refiere a cualquier material que aumenta la respuesta inmunitaria humoral y/o celular aun antígeno. Las vacunas tradicionales están compuestas por una preparación bruta de microorganismos patógenos inactivados y las impurezas asociadas a los cultivos de microorganismos patológicos podrían actuar comocoadyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria. Sin embargo, cuando se usan preparaciones homogéneas demicroorganismos patológicos o subunidades proteínicas purificadas como antígenos para la vacunación, la inmunidad provocada por dichos antígenos es deficiente y, por lo tanto, se hace necesaria la adición de ciertos materiales exógenos como coadyuvantes. Además, las vacunas sintéticas y de subunidades son caras de producir.Por lo tanto, con la ayuda de coadyuvantes, puede ser necesaria una dosis menor de antígeno para estimular larespuesta inmunitaria, reduciendo así en el coste de producción de las vacunas.

Se sabe que los coadyuvantes actúan de diferentes maneras para potenciar la respuesta inmunitaria. Muchoscoadyuvantes modifican la red de citocinas asociadas a la respuesta inmunitaria. Estos coadyuvantesinmunomoduladores pueden ejercer su efecto incluso cuando no están combinados con antígenos. En general, loscoadyuvantes inmunomoduladores provocan una regulación por aumento general de ciertas citocinas y una regulación por disminución concomitante de otras provocando una respuesta celular Th1 y/o humoral Th2.

Algunos coadyuvantes tienen la capacidad de preservar la integridad de la conformación de un antígeno de formaque los antígenos puedan presentarse de forma eficaz a las células efectoras inmunitarias apropiadas. Comoresultado de esta preservación de la conformación del antígeno por la formulación del coadyuvante, la vacunatendría una vida útil mayor que la mostrada por los complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Ozel M. y col.; Quaternary Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. And Molec. Struc. Res. 102, 240248 (1989).

Algunos coadyuvantes tienen la propiedad de retener el antígeno en forma de formulación de liberación prolongadaen el sitio de inyección. Como resultado de este efecto de liberación prolongada el antígeno no se pierderápidamente por aclaramiento hepático. Las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceite actúan a través deeste efecto de liberación prolongada con una duración menor. Por ejemplo, se puede obtener una formulación deliberación prolongada a largo plazo usando coadyuvante completo de Freund (FCA) que es una emulsión de agua en aceite. El FCA normalmente se mantiene en el sitio de inyección hasta que la biodegradación permite laseparación del antígeno por las células que presentan antígeno.

Basándose en su naturaleza física, los coadyuvantes pueden agruparse en dos categorías muy amplias, en concretocoadyuvantes particulados y coadyuvantes no particulados. Los coadyuvantes particulados existen en forma demicropartículas. El inmunógeno es capaz de incorporar o asociarse a las micropartículas. Sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, complejos inmunoestimuladores, liposomas ynanopartículas y micropartículas son ejemplos de coadyuvantes particulados. Los coadyuvantes no particulados son generalmente inmunomoduladores y se usan generalmente junto con coadyuvantes particulados. Muramil dipéptido (un componente activo-adyuvante de un peptidoglicano extraído de Mycobacteria), copolímeros de bloque no iónicos, saponinas (una mezcla compleja de triterpenoides extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria),Lípido A (un disacárido de glucosamina con dos grupos fosfato y cinco o seis cadenas de ácidos grasos generalmente de C12 a C16 de longitud), citocinas, polímeros de carbohidratos, polisacáridos derivatizados y toxinas bacterianas tales como la toxina del cólera y la toxina lábil de E. coli (LT) son ejemplos de coadyuvantes no particulados.

Algunos de los coadyuvantes mejor conocidos son combinaciones de inmunomoduladores no particulados y materiales particulados que podrían conferir un efecto de liberación prolongada a la formulación de coadyuvante. Porejemplo, FCA combina las propiedades inmunomoduladoras de componentes de Mycobacterium tuberculosis con el efecto depósito a corto plazo de las emulsiones en aceite.

Las emulsiones en aceite se han usado como coadyuvante de vacunas durante mucho tiempo. Le Moignic y Pinoyencontraron en 1916 que una suspensión de Salmonella typhimurium inactivados en aceite mineral aumentaba la respuesta inmunitaria. Subsiguientemente, en 1925, Ramon describió el aceite de almidón como una de las sustancias que aumentan la respuesta antitóxica al toxoide de la difteria. Sin embargo, las emulsiones en aceite nose hicieron populares hasta 1937 cuando Freund logró su formulación de coadyuvante que hoy se conoce comocoadyuvante Completo de Freund (FCA). El FCA es una emulsión de agua en aceite compuesta por aceite mineral(parafina) mezclado con Mycobacteria inactivadas y Arlacel A. Arlacel A es principalmente monooleato de manida y se usa como agente emulsionante. Aunque FCA es excelente para inducir una respuesta de anticuerpos, provoca undolor fuerte, formación de abcesos, fiebre e inflamación granulomatosa. Para evitar estas reacciones secundariasindeseables, se desarrolló el coadyuvante Incompleto de Freund (IFA). El IFA es similar al FCA en su composiciónexcepto por la ausencia de componentes de micobacteria. El IFA actúa mediante formulación de liberación prolongada en el sitio de inyección y liberación lenta del antígeno con estimulación de células productoras deanticuerpos.

Otra estrategia para mejorar FCA se basó en la noción de que la sustitución del aceite mineral por un aceitebiocompatible ayudaría a eliminar las reacciones asociadas a FCA en el sitio de inyección. Se creía también que laemulsión debería ser una de aceite en agua en lugar de agua en aceite porque ésta produce efecto de liberaciónprolongada de larga duración en el sitio de inyección. Hilleman y col. describieron un coadyuvante basado en aceite“Adjuvant 65”, que consiste en aceite de cacahuete al 86 %, Arlacel A al 10 % como emulsionante y monoestearato de aluminio al 4 % como estabilizante. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman y Beale, 1983, en NewApproaches to Vaccine Development (Editores Bell, R. y Torrigiani, G.), Schwabe, Basilea, Suiza. En los sereshumanos, el uso de Adjuvant 65 era seguro y potente, pero mostraba menos capacidad coadyuvante que IFA. Sin embargo, se suspendió el uso de Adjuvant 65 debido a la capacidad reactógena en el hombre con ciertos lotes devacunas y la reducción de la capacidad de coadyuvante cuando se usaba emulsionante purificado o sintético enlugar de Arlacel A. Las patentes de Estados Unidos nº 5.718.904 y 5.690.942 enseñan que el aceite mineral en laemulsión de aceite en agua puede sustituirse por aceite metabolizable con el fin de mejorar el perfil de seguridad.

Además de la capacidad coadyuvante y la seguridad, el aspecto físico de una emulsión es también una consideración comercial importante. El aspecto físico depende de la estabilidad de la emulsión. La separación de fases, sedimentación y coalescencia son indicadores de la inestabilidad de la emulsión. La separación de fasesocurre cuando las fases oleaginosa y acuosa de la emulsión tienen una gravedad específica diferente. También seda la separación de fases cuando el tamaño inicial de la gota de la emulsión es grande y las gotas de emulsión notienen movimiento Browniano. Cuando el tamaño de la gota es grande, hay una tendencia a la ruptura de la interfasey las gotas se fusionan en forma de partículas grandes. La estabilidad de la emulsión se determina mediante unnúmero de factores tales como la naturaleza y cantidad de emulsionante usado, el tamaño de la gota en la emulsióny la diferencia de densidades entre la fase oleaginosa y acuosa.

Los emulsionantes promueven la estabilización de gotas dispersas reduciendo la energía libre de la interfase y creando barreras físicas o electroestáticas a la coalescencia de las gotas. Se han usado detergentes no iónicos asícomo iónicos como emulsionantes. Los emulsionantes no iónicos se orientan en la interfase y producen estructurasrelativamente voluminosas, lo que conlleva al impedimento estérico de las gotas dispersas. Los emulsionantesaniónicos o catiónicos inducen la formación de una capa doble eléctrica atrayendo los contraiones; las fuerzas derepulsión de la capa doble provocan que las gotas se repelan las unas a las otras cuando se acercan.

Además de usar emulsionantes, puede lograrse también la estabilidad de la emulsión reduciendo el tamaño de lagota de la emulsión por medios mecánicos. Normalmente se han usado mezcladores de propulsores, rotores deturbina, molinos de coloides, homogeneizadores y aparatos de ultrasonidos para fabricar emulsiones. La microfluidización es otra forma de aumentar la homogeneidad del tamaño de la gota en la emulsión. La microfluidización puede producir una emulsión elegante, físicamente estable con un tamaño de partícula consistenteen el intervalo submicrométrico. Además de aumentar la estabilidad de la emulsión, el proceso de lamicrofluidización permite la filtración final que es una forma preferente de asegurar la esterilidad del producto final.Además, las partículas oleaginosas submicrométricas pueden pasar desde los sitios de inyección a los vasoslinfáticos y después a los nódulos linfáticos de la cadena de drenaje, sangre y bazo. Esto reduce la probabilidad deestablecer una formulación de liberación prolongada oleaginosa en el sitio de la inyección que puede producirinflamación local y una reacción significativa en el sitio de inyección.

Los microfluidizadores están ahora disponibles en el mercado. La formación de emulsiones ocurre en un microfluidizador al interactuar dos corrientes fluidizadas a velocidades elevadas dentro de una cámara de interacción. El microfluidizador es aire o nitrógeno impulsado que puede operar con presiones internas por encimade 137900 kPa. La patente de Estados Unidos 4.908.154 enseña el uso de un microfluidizador para obtener emulsiones esencialmente libres de cualesquiera agentes emulsionantes.

En la literatura se han descrito un número de formulaciones de coadyuvantes de aceite en agua submicrométricas.La patente de Estados Unidos 5.376.369 describe un coadyuvante de emulsión submicrométrica de aceite en aguaque se conoce como Syntax Adjuvant Formulation (SAF). SAF contiene escualeno o escualano como el componenteoleaginoso, una cantidad de polímero de bloque Plurónico L121 que forma emulsiones (polioxi-propilenpolioxietileno) y una cantidad inmunopotenciadora de muramil dipéptido. El escualeno es un precursor de colesterolde tipo hidrocarburo lineal que se encuentra en muchos tejidos, de forma notable en el hígado de tiburones y otrospeces. El escualano se prepara mediante hidrogenación de escualeno y está completamente saturado. Tantoescualeno como escualano pueden metabolizarse y tienen unos buenos antecedentes en estudios toxicológicos. Lasemulsiones de escualeno o escualano se han usado en vacunas contra el cáncer en humanos con efectos secundarios leves y con una eficacia deseable. Véase, por ejemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene andSqualane emulsions as adjuvants, Methods 19: 87-93.

La patente de Estados Unidos 6.299.884 y la publicación de patente internacional WO 90/14837 enseñan que loscopolímeros de bloque de polioxi-propilen-polioxietileno no son esenciales para la formación de emulsiones submicrométricas de aceite en agua . Además, estas referencias enseñan el uso de aceite metabolizable no tóxico y expresamente excluyen el uso de aceite mineral y aceites de derivados del petróleo tóxicos en sus formulaciones deemulsiones.

La patente de Estados Unidos 5.961.970 enseña otra emulsión submicrométrica de aceite en agua más para su usocomo coadyuvante en vacunas. En la emulsión que se describe en esta patente, el componente hidrófobo seselecciona del grupo que consiste en un aceite triglicérido de cadena media, un aceite vegetal y una mezcla de losmismos. El tensioactivo que se incluye en esta emulsión puede ser un tensioactivo biológicamente compatiblenatural tal como un fosfolípido (por ejemplo lecitina) o un tensioactivo no natural farmacéuticamente aceptable talcomo TWEEN-80. Esta patente enseña también la incorporación del antígeno a la emulsión en el momento en quese forma la emulsión, contrastando con la mezcla del antígeno con la emulsión después de que se ha formado laemulsión de forma independiente y extrínseca.

La patente de Estados Unidos 5.084.269 enseña que una formulación de coadyuvante que contiene lecitina combinada con aceite mineral provoca un descenso de la irritación en el animal hospedador y simultáneamenteinduce una inmunidad sistémica aumentada. La formulación del coadyuvante que resulta de la patente de Estados Unidos 5.084.269 se usa comercialmente en vacunas veterinarias con el nombre comercial AMPHIGEN®. La formulación de AMPHIGEN® está formada por micelas – gotas de aceite rodeadas de lecitina. Estas micelaspermiten que se unan más antígenos celulares completos que los coadyuvantes con base oleaginosa tradicionales.Además, las formulaciones de vacunas a base de AMPHIGEN® contienen un bajo contenido en aceite del 2,5 al 5 % de aceite mineral, comparado con otras formulaciones de vacunas que contienen coadyuvantes oleaginosos, quenormalmente contienen del 10 % al 20 % de aceite. Su bajo contenido en aceite hace que esta vacuna con base decoadyuvante sea menos irritante para los tejidos en el sitio de inyección, dando como resultado menos lesiones y que haya menos desechos al sacrificar. Además, el recubrimiento de lecitina que rodea las gotas de aceite reduceadicionalmente las reacciones en el sitio de inyección dando como resultado una vacuna que es tanto segura comoeficaz.

La formulación de AMPHIGEN® se usa como coadyuvante en un número de vacunas veterinarias y existe una necesidad de mantener el aspecto físico de la vacuna durante periodos de almacenamiento cortos y largos así comoen el momento de la reconstitución. Además, un antígeno liofilizado se mezcla con la formulación de coadyuvantepreparada previamente justo antes de la inyección. Esta práctica no asegura siempre que exista una distribuciónuniforme del antígeno en la emulsión de aceite en agua y el aspecto de la emulsión puede no ser deseable. Además,al reposar, la emulsión homogeneizada puede mostrar separación de fases. Por lo tanto, existe una necesidad deuna formulación de coadyuvante estable que no muestre separación de fases durante una vida útil larga. Una formade prevenir la separación de fases es reducir el tamaño de la gota y aumentar la homogeneidad de las partículas dela emulsión. Aunque se ha documentado el proceso de microfluidización de formulaciones en emulsión a base deaceite metabolizable, la microfluidización de las emulsiones de aceite en agua tales como la formulación de AMPHIGEN® no se ha realizado todavía.

En la presente invención, se ha usado la microfluidización para llevar el tamaño de las gotas de aceite mineralrodeadas de lecitina a tamaño submicrométrico. De forma inesperada, los presentes inventores han descubierto quela microfluidización de formulaciones de vacunas que tienen como coadyuvante una emulsión de aceite en aguaformada por una mezcla de lecitina y aceite no solo mejora el aspecto físico de las formulaciones, sino que potenciatambién los efectos inmunizadores de las formulaciones. Las formulaciones microfluidizadas se caracterizan también por un perfil de seguridad mejorado.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la actividad de coadyuvante y el perfil deseguridad de emulsiones con base oleaginosa de aceite en agua no metabolizables pueden mejorarse mediante lamicrofluidización. Los antígenos que se incorporan en emulsiones microfluidizadas son estables incluso cuando losantígenos se incorporan de forma intrínseca a las emulsiones antes de la microfluidización.

En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona formulaciones de emulsión submicrométricade aceite en agua útiles como un coadyuvante de vacuna. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención están compuestas por un aceite no metabolizable, al menos un tensioactivo y un componente acuoso, en el que el aceite está disperso en el componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite en elintervalo submicrométrico. Un aceite no metabolizable preferente es aceite mineral ligero. Tensioactivos preferentesincluyen lecitina, Tween-80 y SPAN-80.

Una emulsión de aceite en agua preferente proporcionada por la presente invención está compuesta por una formulación de AMPHIGEN®.

Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención pueden incluir componentes adicionales que sonapropiados y deseables, incluyendo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras preferentes incluyen, por ejemplo Quil A, colesterol, GPI0100, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA).

En otra realización, la presente invención proporciona procedimientos para preparar una emulsión submicrométricade aceite en agua. De acuerdo con la presente invención, se mezclan los diversos componentes de la emulsión,incluyendo el aceite, uno o más tensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente apropiado parasu uso en la emulsión. La mezcla se somete a un proceso de emulsionamiento primario para formar una emulsión deaceite en agua, que después se pasa por un microfluidizador para obtener una emulsión de aceite en agua de gotascon un diámetro inferior a 1 micra, preferentemente con un tamaño de gota medio inferior a 0,5 micras.

En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacuna que contienen un antígeno y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente. El antígeno se incorpora en la emulsión deforma extrínseca o intrínseca, preferentemente de forma intrínseca.

El antígeno que puede incluirse en las composiciones de la vacuna de la presente invención puede ser un antígeno bacteriano, fúngico o vírico o una combinación de los mismos. El antígeno puede tener forma de una preparacióninactivada de células o virus completos o parciales, o tomar la forma de moléculas antígenas obtenidas mediantepurificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química.

En una realización adicional, la presente invención proporciona procedimientos para preparar composiciones devacunas que contienen un antígeno o antígenos combinado(s) con una emulsión submicrométrica de aceite en agua.

Para preparar las composiciones de vacunas de la presente invención, el (los) antígeno(s) puede(n) combinarse deforma intrínseca (por ejemplo antes de la microfluidización) o de forma extrínseca (por ejemplo después de lamicrofluidización) con los componentes de la emulsión de aceite en agua. Preferentemente, el antígeno se combinacon los componentes de la emulsión de aceite en agua de forma intrínseca.

En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígenomicroencapsulado y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente, en las que el antígeno microencapsulado se combina con la emulsión de forma extrínseca.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el procedimiento para la preparación en lotes de composiciones de vacunas no microfluidizadas. En este procedimiento los diversos componentes de la vacuna se añaden al recipiente deadición de la izquierda y finalmente se bombean al vaso de mezclado donde los componentes se mezclan pormedios mecánicos simples.

La Figura 2 representa el procedimiento para la preparación de composiciones de vacunas microfluidizadas que contienen antígeno incorporado de forma intrínseca. Los diversos componentes de la vacuna se añaden alrecipiente de adición y se transfieren a la unidad de mezclado de la preemulsión para mezclar por mediosmecánicos simples. Subsiguientemente, se pasa la emulsión por un microfluidizador y se recoge en la cámara depost-microfluidización.

La Figura 3 representa la distribución del tamaño de las gotas de la vacuna basada en de la formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada, la vacuna basada en de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada y lapreparación de vacuna de mezclado en banco.

La Figura 4 muestra la ausencia de separación de fases en la preparación de vacuna microfluidizada.

La Figura 5 representa una comparación de la estabilidad de los antígenos que se incorporan de forma intrínsecaa la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) y tres preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizadas de control (A904369,A904370 y A904371). Las cuatro preparaciones de vacunas se almacenaron a 4 ºC durante dos años. Enmomentos diferentes durante el almacenamiento (0, 6, 12 ó 24 meses), se usaron las cuatro formulaciones paravacunar vacas de tres meses de edad. La vacunación se realizó el Día 0 y 21 con 2 ml de una dosis de vacuna y se recogieron los sueros dos semanas después de la segunda vacunación. Se determinó la valoración deanticuerpos neutralizadores para el virus de BVD Tipo II en cada una de las muestras de suero. Los datos sepresentan como la media geométrica de 5 animales.

La Figura 6 muestra la media por mínimos cuadrados de la temperatura rectal del ganado vacuno antes y después de la administración de vacunas microfluidizadas y no microfluidizadas. T01: Grupo placebo – Dosisúnica; T02: Grupo placebo – Dosis doble; T03: Formulación no microfluidizada – Dosis única; T04: Formulación nomicrofluidizada – Dosis doble; T05: Formulación microfluidizada – Dosis única; T06: Formulación microfluidizada – Dosis doble.

La Figura 7 muestra la media por mínimos cuadrados de los volúmenes de reacción en el sitio de inyección observados en el ganado vacuno después de la administración de vacunas microfluidizadas y no microfluidiizadas. T03: Formulación no microfluidizada – Dosis única; T04: Formulación no microfluidizada – Dosis doble; T05: Formulación microfluidizada – Dosis única; T06: Formulación microfluidizada – Dosis doble.

La Figura 8 representa la media geométrica de las valoraciones de IgG para antígeno PauA recombinante deStreptococcus uberis después de la vacunación con las diversas formulaciones de vacuna que contenían tantoantígeno PauA recombinante como antígeno de célula entera de E. coli.

La Figura 9 representa la media geométrica de las valoraciones de IgG para antígeno de células enteras de E. coli de Streptococcus uberis después de la vacunación con las diversas formulaciones de vacuna que conteníantanto antígeno PauA recombinante como antígeno de célula entera de E. coli.

Las Figuras 10A y 10B representan la distribución de tamaño de partícula de una formulación de Amphigenmicrofluidizada en la producción inicial (Figura 10A) y a los 22 meses después de la producción (Figura 10B).

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la microfluidización de formulaciones de vacunas que tienen como coadyuvantes una emulsión de aceite en agua compuestas por una mezcla de lecitina y aceite mineral no sólo mejora el aspecto físico de las formulaciones de vacunas, sino que también potencia losefectos inmunizadores de las formulaciones de vacunas. Las formulaciones de vacunas microfluidizadas se caracterizan también por un perfil de seguridad mejorado.

Basándose en estos descubrimientos, la presente invención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite enagua útiles como un coadyuvante en composiciones de vacunas. Se proporcionan también procedimientos parapreparar estas emulsiones submicrométricas de aceite en agua usando un microfluidizador. Además, la presenteinvención proporciona composiciones de vacunas submicrométricas en las que un antígeno se combina con unaemulsión submicrométrica de aceite en agua. También se proporcionan los procedimientos para preparar dichascomposiciones de vacunas. La presente invención proporciona además composiciones de vacunas que contienen antígenos microencapsulados combinados con una emulsión submicrométrica de aceite en agua y procedimientos para preparar dichas vacunas.

Para hacer más clara la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide enlas siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de lainvención.

Emulsiones submicrométricas de aceite en agua

En una realización, la presente invención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite en agua útiles comoun coadyuvante de vacunas. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención potencian la capacidad inmunógena de los antígenos de las composiciones de vacunas, son seguras para administrarse a animales y estables durante el almacenamiento.

Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención están compuestas por un aceite no metabolizable, al menos un tensioactivo y un componente acuoso, en los que el aceite está disperso en el componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite en el intervalo submicrométrico.

Por “submicrométrico” se quiere decir que las gotas son de un tamaño inferior a 1 μm (micrómetro) y el tamañomedio de gota de aceite es inferior a 1 μm. Preferentemente, el tamaño medio de gota de la emulsión es inferior a 0,8 μm; más preferentemente inferior a 0,5 μm; e incluso más preferentemente inferior a 0,4 μm o aproximadamente0,1-0,3 μm.

El “tamaño medio de la gota” se define como el tamaño de partícula del Diámetro Medio del Volumen (DMV) en una distribución de volumen de tamaños de partícula. EL DMV se calcula multiplicando cada diámetro de partícula por elvolumen de todas las partículas de ese tamaño y sumando. Esto se divide después entre el volumen total de todaslas partículas.

El término “aceite no metabolizable” como se usa en la presente memoria se refiere a aceites que no pueden sermetabolizados por el cuerpo del sujeto animal al que se administra la emulsión.

Los términos “animal” y “sujeto animal” como se usan en la presente memoria se refieren a todos los animales nohumanos, incluyendo ganado vacuno, ovejas y cerdos por ejemplo.

Los aceites no metabolizables adecuados para su uso en las emulsiones de la presente invención incluyen alcanos,alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, sus éteres y ésteres, y sus mezclas. Preferentemente,los compuestos individuales del aceite son compuestos de hidrocarburo ligeros, es decir, los componentes de esetipo tienen 6 a 30 átomos de carbono. El aceite puede prepararse o purificarse sintéticamente a partir de productosde petróleo. Los aceites preferentes no metabolizables para su uso en las emulsiones de la presente invenciónincluyen aceite mineral, aceite de parafina y cicloparafinas por ejemplo.

El término “aceite mineral” se refiere a una mezcla de hidrocarburos líquidos que se obtienen a partir de vaselinamediante una técnica de destilación. El término es sinónimo de “parafina líquida”, “vaselina líquida” y “aceite mineralblanco”. El término se pretende que incluya también “aceite mineral ligero”, es decir, aceite que se obtiene de formasimilar mediante destilación de vaselina pero que tiene una gravedad específica ligeramente menor que la vaselina.Véase, por ejemplo Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición (Easton, Pa.; Mack Publishing Company,1999, en las páginas 788 y 1323). El aceite mineral puede obtenerse a partir de diversas fuentes comerciales, porejemplo J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). El aceite mineral preferente es el aceite mineral blanco ligero disponible comercialmente con el nombre de DRAKEOL®.

Normalmente, el componente oleaginoso de las emulsiones submicrométricas de la presente invención está presente en una cantidad del 1 % al 50 % en volumen; preferentemente, en una cantidad del 10 % al 45; máspreferentemente en una cantidad del 20 % al 40 %.

Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención normalmente incluyen al menos un (es decir, uno o más)tensioactivo. Los tensioactivos y emulsionantes, términos que se usan de forma indistintamente en la presentememoria, son agentes que estabilizan la superficie de las gotas de aceite y mantienen las gotas de aceite dentro deltamaño deseado.

Tensioactivos adecuados para su uso en las presentes emulsiones incluyen tensioactivos biológicamentecompatibles naturales y tensioactivos sintéticos no naturales. Los tensioactivos biológicamente compatibles incluyencompuestos de fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos. Los fosfolípidos preferentes son fosfatidilcolinas (lecitina),tales como lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse como mezcla de fosfátidos y triglicéridos lavandoaceites vegetales crudos con agua, y separando y secando las gomas hidratadas resultantes. Un producto refinadopuede obtenerse fraccionando la mezcla para obtener los fosfolípidos y glucolípidos insolubles en acetona quepermanecen después de separar los triglicéridos y aceite vegetal lavando con acetona. De forma alternativa, puedeobtenerse lecitina de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o sintentizarse convencionalmente.

Tensioactivos sintéticos no naturales adecuados para su uso en las emulsiones submicrométricas de la presenteinvención incluyen tensioactivos no iónicos con base de sorbitan, por ejemplo tensioactivos de sorbitan sustituidoscon ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácidos grasos desorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes tales como aceite de ricino(EMULFOR); ácido graso polietoxilado (por ejemplo ácido esteárico disponible con el nombre de SIMULSOL M-53), polímero de isooctilfenol polietoxilado/formaldehído (TYLOXAPOL), éteres de alcoholes grasos de polioxietileno(BRIJ®); éteres de polioxietilen nonfenilo (TRITON®N), éteres de polioxietilen isooctilfenilo (TRITON®X). Tensioactivos sintéticos preferentes son los tensioactivos disponibles con el nombre de SPAN® y TWEEN®.

Tensioactivos preferentes para su uso en las emulsiones de aceite en agua de la presente invención incluyenlecitina, Tween-80 y SPAN-80.

En general el tensioactivo, o la combinación de tensioactivos si se usan dos o mas, está presente en la emulsión enuna cantidad del 0,01 % al 10 % en volumen, preferentemente del 0,1 % al 6,0 %, más preferentemente del 0,2 % al5,0 %.

El componente acuoso constituye la fase continua de la emulsión y puede ser agua, solución salina tamponada ocualquier otra solución acuosa adecuada.

Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención pueden incluir componentes adicionales que sonapropiados y deseables, incluyendo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras.

Se cree que las moléculas bioadhesivas pueden potenciar la administración y unión de antígenos sobre o a travésde la superficie mucosa diana confiriendo inmunidad mucosa. Ejemplos de moléculas bioadhesivas adecuadas incluyen polímeros ácidos no naturales tales como ácido poliacrílico y ácido polimetracrílico (por ejemplo CARBOPOL®, CARBOMER); polímeros naturales modificados sintéticamente ácidos tales como carboximetilcelulosa; polímeros naturales modificados sintéticamente neutros tales como (hidroxipropil)metilcelulosa;polímeros que portan aminas básicas tales como quitosan; polímeros ácidos que pueden obtenerse de fuentesnaturales tales como ácido algínico, ácido hialurónico, pectina, goma de tragacanto y goma de karaya; y polímerosneutros no naturales, tales como poli(alcohol vinílico); o sus combinaciones.

La expresión “moléculas inmunoestimuladoras”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a las moléculasque potencian la respuesta inmunitaria protectora inducida por un componente antígeno en las composiciones de lasvacunas. Los materiales inmunoestimuladores adecuados incluyen componentes de la pared celular bacteriana, porejemplo derivados de N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina tales como murabutida, treonil-MDP y muramil tripéptido; glucósidos de saponina y sus derivados, por ejemplo Quil A, QS 21 y GPI-0100; colesterol y compuestosde amonio cuaternario por ejemplo bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) y N,N-dioctadecil-N,N-bis(2hidroxietil)propanodiamina (“avridina”).

Las saponinas son compuestos glucosídicos que se producen como metabolitos secundarios en una gran variedadde especies vegetales. La estructura química de las saponinas confiere una amplia gama de actividades farmacológicas y biológicas, que incluyen alguna actividad inmunológica potente y eficaz.

Estructuralmente, las saponinas están constituidas por cualquier aglucona unida a una o más cadenas de azúcares.Las saponinas pueden clasificarse de acuerdo con su composición de agluconas: glucósidos triterpénicos, glucósidos esteroideos y glucósidos alcaloides esteroideos.

La saponina puede aislarse de la corteza de Quillaja saponaria. La saponina ha sido conocida desde hace mucho como un inmunoestimulador. Dalsgaard, K., “Evaluation of its adjuvant activity with special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease”, Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978. Los extractos brutos de plantas que contenían saponinas mejoraron la potencia de las vacunas contra la glosopeda. Sinembargo, los extractos brutos se asociaron a efectos secundarios adversos cuando se usaron en vacunas. Subsiguientemente, Dalsgaard purificó parcialmente el componente activo del coadyuvante de saponina mediantediálisis, intercambio de iones y cromatografía por filtración en gel. Dalsgaard, K. y col. “Saponin Adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines”, Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974. Un componente activo de coadyuvante purificado de esta forma seconoce como “Quil A”. En base al peso Quil A demostró una potencia aumentada y mostró reacciones locales reducidas cuando se comparó con saponina. Quil A se usa extensamente en vacunas veterinarias.

El análisis adicional de Quil A mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) reveló una mezcla heterogéneade saponinas muy similares y llevó al descubrimiento de QS21 que era un coadyuvante potente con una toxicidad mínima o reducida. Kensil C.R. y col., “Separation and characterization of saponins with adjuvant activity fromQuillaja saponaria Molina cortex”, J. Immunol. 146: 431-437, 1991. Al contrario que la mayoría de otros inmunoestimuladores, QS21 es soluble en agua y puede usarse en vacunas con o sin formulaciones tipo emulsión.Se ha demostrado que QS21 provoca una respuesta de tipo Th1 en ratones estimulando la producción deanticuerpos IgG2a e IgG2b e indujo CD8 + CTL (MHC clase I) específico de antígeno en respuesta a antígenossubunitarios. Los estudios clínicos en humanos han demostrado su capacidad como coadyuvante con un perfiltoxicológico aceptable. Kensil, C.R. y col., “Structural and immunological characterization of the vaccine adjuvant QS

21. In Vaccine Design: the subunit and Adjuvant Approach,” Editores Powell, M.F. y Newman, M.J. Plenum Publishing Corporation, New York 1995, páginas 525-541.

La patente de Estados Unidos 6.080.725 enseña los procedimientos de preparación y uso conjugado de saponinalipófilo. En este conjugado de saponina-lipófilo, un resto lipófilo tal como un lípido, ácido graso, polietilenglicol oterpeno se une covalentemente a una saponina triterpénica no acilada o desacilada mediante un grupo carboxi presente en el ácido 3-O-glucurónico de la saponina triterpénica. La unión de un resto lipófilo al ácido 3-Oglucurónico de una saponina tal como desacilsaponina de Quillaja, luciosida P o saponina de Gypsophila, saponaria y Acanthophyllum potencia sus efectos coadyuvantes sobre la inmunidad mediada humoral y celular. Además, launión de un resto lipófilo al resto de ácido 3-O-glucurónico de desacilsaponina o saponina no acilada proporciona un análogo de saponina que es más fácil de purificar, menos tóxico, químicamente más estable y posee propiedadescomo coadyuvante iguales o mejores que la saponina original.

GPI-0100 es un conjugado de saponina-lipófilo que se describe en la patente de Estados Unidos 6.080.725. GPI0100 se produce mediante la adición de una amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo del ácidoglucurónico.

Compuestos de amonio cuaternario – Se ha propuesto una serie de bases nitrogenadas alifáticas para su uso comocoadyuvantes inmunológicos, incluyendo aminas, compuestos de amonio cuaternario, guanidinas, benzamidinas y tiouronios. Compuestos de ese tipo específicos incluyen bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) N,N-dioctadecilN,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (“avridina”).

La patente de Estados Unidos 5.951.988 enseña una formulación de coadyuvante que contiene sales de amoniocuaternario tales como DDA en conjunción con un componente oleaginoso. Esta formulación es útil en conjuncióncon sustancias inmunológicas conocidas, por ejemplo antígenos víricos o bacterianos en una composición devacuna, para potenciar la respuesta inmunógena. La composición es también útil sin un antígeno incorporado como formulación inmunoestimuladora no específica.

La patente de Estados Unidos 4.310.550 describe el uso de N,N-alquilo superior-N,N’-bis(2hidroxietil)propanodiamina y N,N-alquilo superior-xililendiaminas formuladas con emulsión grasa o lipídica como coadyuvante de vacunas. En la patente de Estados Unidos 4.310.550 se describe un procedimiento para inducir o potenciar la respuesta inmunógena de un antígeno en el hombre o en un animal a través de la administraciónparenteral de la formulación de coadyuvante.

En una realización preferente, la presente invención proporciona una emulsión submicrométrica de aceite en aguaútil como coadyuvante de vacunas, que se compone de una formulación de AMPHIGEN®, con gotas de un tamañoinferior a 1 μm y un tamaño medio de gota de aproximadamente 0,25 μm.

La expresión “formulación de AMPHIGEN®”, tal como se usa en la presente memoria se refiere a una solución formada mezclando una solución de aceite de lecitina DRAKEOL® (Hydronics, Lincoln, NE) con solución salina en presencia de TWEEN® 80 y SPAN® 80. Una formulación típica de AMPHIGEN® contiene aceite mineral ligero al 40 % en volumen (v/v), aproximadamente 25 % p/v de lecitina, aproximadamente 0,18 % de TWEEN 80 en volumen(v/v) y aproximadamente 0,08 % de Span 80 en volumen (v/v).

Procedimientos para preparar emulsiones submicrométricas de aceite en agua

En otra realización, la presente invención proporciona procedimientos para preparar las emulsiones submicrométricas de aceite en agua que se han descrito anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceite, uno o mástensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente adecuado para su uso en la emulsión se combinan y mezclan los unos con los otros.

La mezcla formada se somete a un procedimiento de emulsionamiento, normalmente pasando una o más veces através de uno o más homogeneizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceite en agua que tiene unaspecto uniforme y un tamaño medio de gota de aproximadamente 0,5 μm. Para este fin puede usarse cualquierhomogeneizador o emulsionador comercial, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogeneizadorGaulin (Everett, MA).

La emulsión así formada se somete después a microfluidización para llevar el tamaño de gota al intervalosubmicrométrico. La microfluidización puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como el modelo denúmero 11OY disponible en Microfluidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); yRainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.). Estos microfluidizadores operanforzando los fluidos a través de pequeñas aperturas a presión elevada, de tal forma que las dos corrientes de fluidointeractúan a velocidades elevadas en una cámara de interacción para formar emulsiones con gotas de un tamañosubmicrométrico.

El tamaño de la gota puede determinarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, porejemplo, difracción por láser, usando instrumentos de medición disponibles en el mercado. El tamaño puede variardependiendo del tipo de tensioactivo usado, la relación entre tensioactivo y aceite, la presión de trabajo, temperaturay similares. Los expertos en la técnica pueden determinar la combinación deseada de estos parámetros paraobtener emulsiones con el tamaño de gota deseado sin experimentación excesiva. Las gotas de las emulsiones dela presente invención son inferiores a 1 μm de diámetro, preferentemente con un tamaño medio de gota inferior a 0,8 μm, y más preferentemente con un tamaño medio de gota inferior a 0,5 μm, e incluso más preferentemente con un tamaño medio de gota inferior a 0,3 μm.

En una realización preferente de la presente invención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL, que estádisponible en el mercado de Hydronics (LIncloln, NE) y contiene lecitina al 25 % en aceite mineral ligero, se combinay mezcla con solución salina así como con los tensioactivos TWEEN® 80 y SPAN® 80 para formar una “solución deAMPHIGEN®” o “formulación de AMPHIGEN®”. La solución de AMPHIGEN® se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm para formar una emulsión de aceite enagua. Subsiguientemente la emulsión se hace pasar una vez a través de un Microfluidizador que trabaja a aproximadamente 3.102,5+3.447,5 kPa. La emulsión de aceite en agua microfluidizada tiene gotas de un tamaño inferior a 1 μm, con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0,25 μm.

Composiciones de vacuna que contienen antígenos incorporados en emulsiones submicrométricas de aceite en agua

En otra realización, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígeno(s) y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente. Estas composiciones de vacunas secaracterizan porque tienen un efecto inmunógeno potenciado y un aspecto físico mejorado (por ejemplo no seobserva separación de fases después de un periodo de almacenamiento largo). Además, las composiciones devacunas de la presente invención son seguras para la administración a animales.

De acuerdo con la presente invención, el antígeno puede combinarse con la emulsión de forma extrínseca o,preferentemente, de forma intrínseca. El término “intrínsecamente” se refiere al procedimiento en el que el antígeno se combina con los componentes de la emulsión antes de la etapa de microfluidización. El término “extrínsecamente”se refiere al procedimiento en el que el antígeno se añade a la emulsión después de que la emulsión ha sidomicrofluidizada. El antígeno añadido de forma extrínseca puede ser antígeno libre o puede estar encapsulado enmicropartículas como se describe con más detalle a continuación.

El término “antígeno”, tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier molécula, compuesto ocomposición que es inmunógeno en un animal y se incluye en la composición de vacuna para provocar unarespuesta inmunitaria protectora en el animal al que se administra la composición de vacuna.

El término “inmunógeno”, tal como se usa en relación con un antígeno se refiere a la capacidad del antígeno deprovocar una respuesta inmunitaria en un animal contra el antígeno. La respuesta inmunitaria puede ser unarespuesta inmunitaria celular mediada primordialmente por linfocitos T citotóxicos, o una respuesta inmunitaria humoral mediada primordialmente por linfocitos T cooperadores, que a su vez activa linfocitos B que provocan laproducción de anticuerpos.

Una “respuesta inmunitaria protectora” se define como cualquier respuesta inmunitaria, ya sea respuesta inmunitariamediada por anticuerpos o células, o ambos, que ocurre en el animal que previene o reduce de forma detectable laaparición o elimina o reduce de forma detectable la gravedad, o ralentiza de forma detectable la velocidad deprogresión, del trastorno o enfermedad provocada por el antígeno o un patógeno que contiene el antígeno.

Los antígenos que pueden incluirse en la composición de vacuna de la presente invención incluyen antígenospreparados a partir de bacterias patógenas tales como Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus somnus,Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimiahemolytica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis,Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae,Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella enterica serovars, Leptospira spp.; hongos patógenos tales como Candida; protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp.; helmintos tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, ya sea en forma de una preparación de células enteras o parciales inactivadas o en forma de moléculas antígenas obtenidaspor purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Antígenos adicionalesincluyen virus patógenos tales como virus del herpes bovino 1, 3, 6, virus de diarrea vírica bovina (BVDV) tipos 1 y 2, virus de la pseudogripe bovina, virus sinticial respiratorio bovino, virus de leucosis bovino, virus de rinderpest, virusde la glosopeda, rabia, virus de la fiebre porcina, virus de la fiebre porcina africana, parvovirus porcino, virus PRRS,circovirus porcino, virus de la gripe, virus de enfermedad vesicular porcino, virus de fiebre de Techen, virus depseudorrabia, ya sea en forma de una preparación de virus completos o parciales inactivados, o en forma demoléculas antígenas obtenidas por purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesisquímica.

La cantidad del antígeno debe ser tal que el antígeno combinado con la emulsión de aceite en agua, sea eficaz para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal. La cantidad precisa para que un antígeno sea efectivo depende de la naturaleza, actividad y pureza del antígeno y puede ser determinada por los expertos en la técnica.

La cantidad de emulsión de aceite en agua presente en las composiciones de vacunas debe ser suficiente parapotenciar la capacidad inmunógena del (de los) antígeno(s) en las composiciones de vacunas. Cuando sea deseable y apropiado, pueden añadirse cantidades adicionales de tensioactivo(s) o tensioactivo(s) adicional(es) a la composición de vacuna además del (de los) tensioactivo(s) proporcionado(s) por la emulsión de aceite en agua. Deforma general, el componente oleaginoso está presente en el volumen final de una composición de vacuna en unacantidad del 1,0 % al 20 % en volumen; preferentemente en una cantidad del 1,0 % al 10 %; más preferentementeen una cantidad del 2,0 % al 5,0 %. El tensioactivo, o la combinación de tensioactivos si se usan dos o más tensioactivos, está presente en el volumen final de una composición de vacuna en una cantidad del 0,1 % al 20 % envolumen, preferentemente del 0,15 % al 10 %, más preferentemente del 0,2 % al 6,0 %.

Además del (de los) antígeno(s) y la emulsión de aceite en agua, la composición de vacuna puede incluir otroscomponentes que son apropiados y deseables, tales como conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo Quil A, colesterol, GPI-0100, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA)), como se ha descrito anteriormente en relación con la emulsión de aceite en agua.

Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden incluir también un vehículo veterinariamente aceptable. La expresión “un vehículo veterinariamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, mediosde dispersión, recubrimientos, coadyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentesantibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. Los diluyentespueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Agentes isotónicos pueden incluir clorurosódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre otros. Estabilizadores incluyen albúmina, entre otros.

En una realización preferente, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye al menosun antígeno de BVDV tipo I o BVDV tipo II, que se incorpora de forma intrínseca a un emulsión de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 μm, preferentemente con un tamaño medio de gota inferior a 0,8 μm, máspreferentemente inferior a 0,5 μm, e incluso más preferentemente con un tamaño medio de gota deaproximadamente 0,5 μm. El antígeno de BVDV tipo I y/o II está preferentemente en forma de una preparación víricainactivada. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferentemente está compuesta por una formulaciónde AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80).La composición de vacuna preferentemente incluye también Quil A, colesterol y timerosol.

En otra realización preferente, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye un antígeno de Leptospira y al menos un antígeno de BVDV tipo I o BVDV tipo II en una emulsión de aceite en agua. Los antígenos, preferentemente en forma de preparación celular o vírica inactivada, se incorporan de forma intrínseca a la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 μm;preferentemente con un tamaño medio de gota inferior a 0,8 μm, más preferentemente inferior a 0,5 μm, e incluso más preferentemente con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0,5 μm. La emulsión submicrométrica deaceite en agua preferentemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulaciónque contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferentementeincluye también una o más moléculas inmunoestimuladoras que se seleccionan de Quil-A, colesterol, DDA, GPI-100e hidróxido de aluminio (AlOH).

En otra realización preferente más, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye al menos un agente bacteriano, por ejemplo la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación celular de E. coli o una combinación de ambas en una emulsión de aceite en agua. El (los) antígeno(s)se combina(n) de forma intrínseca con la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de untamaño inferior a 1 μm, con un tamaño medio de gota inferior a 0,5 μm y preferentemente con un tamaño medio degota de aproximadamente 0,25 μm. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferentemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferentemente incluye también una o más moléculas inmunoestimuladoras que se seleccionan de Quil-A, DDA, GPI-100.

Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden administrarse a un animal por vías conocidas,incluyendo la oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo intravenosa, intraperitoneal,intradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración puede lograrse usando una combinación de vías, porejemplo la primera administración usando una vía parenteral y una administración posterior usando una vía mucosa.

Procedimientos de preparación de composiciones de vacunas

En una realización adicional, la presente invención proporciona procedimientos para preparar composiciones devacunas que contienen un antígeno o antígenos y una emulsión submicrométrica de aceite en agua.

Para preparar las composiciones de vacunas de la presente invención, el (los) antígeno(s) puede(n) combinarse deforma intrínseca o de forma extrínseca con los componentes de la emulsión de aceite en agua. Preferentemente, elantígeno se combina con los componentes de la emulsión de aceite en agua de forma intrínseca.

El antígeno puede combinarse con los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceite, uno o mástensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente apropiado para formar una mezcla. La mezcla sesomete a un procedimiento de mezclado primario normalmente pasando una o más veces a través de uno o máshomogeneizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceite en agua que contiene el antígeno. Puedeusarse cualquier homogeneizador o emulsionador comercial, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogeneizador Gaulin (Everett, MA) o Microfluidics (Newton, MA). De forma alternativa, los diversos componentesdel coadyuvante de la emulsión, incluyendo aceite, uno o más tensioactivos y un componente acuoso pueden combinarse primero para formar una emulsión submicrométrica de aceite en agua usando un homogeneizador oemulsionador; y el antígeno se añade después a esta emulsión. El tamaño medio de gota de la emulsión de aceiteen agua después del mezclado primario es de aproximadamente 1,0-1,2 micrómetros.

La emulsión que contiene el antígeno se somete después a microfluidización para llevar el tamaño de gota al intervalo submicrométrico. La microfluidización puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como elmodelo de número 11OY disponible en Microfluidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett,Mass.); y Rainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.).

El tamaño de la gota puede determinarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, porejemplo, difracción por láser, usando instrumentos de medición disponibles en el mercado. El tamaño puede variardependiendo del tipo de tensioactivo usado, la relación entre tensioactivo y aceite, la presión de trabajo, temperaturay similares. Se puede determinar una combinación deseada de estos parámetros para obtener emulsiones con untamaño de gota deseado. Las gotas de aceite de las emulsiones de la presente invención son inferiores a 1 μm endiámetro y el tamaño medio de gota es inferior a 0,5 μm. Preferentemente, el tamaño medio de gota está aproximadamente entre 0,1 μm y 0,3 μm.

En una realización preferente de la presente invención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL®, que contiene lecitina al 25 % en aceite mineral ligero, se combina y mezcla con solución salina así como los tensioactivosTWEEN® 80 y SPAN® 80 para formar una mezcla que contiene aceite mineral ligero al 40 %, TWEEN® 80 al 0,18% y SPAN® 80 al 0,08 %. La mezcla se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788)aproximadamente a 3400 rpm para formar un producto de emulsión que se denomina también “formulación deAMPHIGEN®” o “solución de AMPHIGEN®”. Subsiguientemente, el (los) antígeno(s) deseado(s) se combina con la solución de AMPHIGEN® y cualesquiera otros componentes adecuados (por ejemplo moléculas inmunoestimuladoras) con ayuda de un emulsionador, por ejemplo, homogeneizador Ross, para formar una emulsión de aceite en agua que contiene el (los) antígeno(s). Ésta emulsión se hace pasar una vez a través de unMicrofluidizador que trabaja aproximadamente 68.950+3.447,5 kPa. La emulsión de aceite en agua microfluidizadatiene gotas de un tamaño inferior a 1 μm, con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0,25 μm.

Composiciones de vacunas que contienen antígenos microencapsulados en una emulsión submicrométrica de aceite en agua y procedimientos de preparación

En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígenoencapsulado en micropartículas (o “antígeno microencapsulado”), en las que el antígeno microencapsulado seincorpora de forma extrínseca a una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente.

Los procedimientos para absorber o atrapar antígenos en vehículos particulados son notorios en la técnica. Véasepor ejemplo Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba y RobertLanger. Polymer microspheres for vaccine delivery. En: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach.Editores Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, Nueva York y Londres). Los vehículos particulados pueden presentar copias múltiples de un antígeno seleccionado al sistema inmunitario en un sujetoanimal y promover la captura y retención de antígenos en nódulos linfáticos locales. Las partículas pueden serfagocitadas por macrófagos y pueden potenciar la presentación de antígeno a través de la liberación de citocinas.También se han descrito en la técnica vehículos particulados e incluyen por ejemplo los que se derivan de polímerosde polimetilmetacrilato, así como los que se derivan de poli(lactidas) y poli(lactida-co-glucolidas), que se conocencomo PLG. Los polímeros de polimetilmetacrilato no son biodegradables mientras que las partículas de PLG pueden ser biodegradables por hidrólisis aleatoria no enzimática de enlaces éster a ácidos láctico y glicólico que se excretanpor rutas metabólicas normales.

También se han usado microesferas biodegradables para lograr la liberación controlada de vacunas. Por ejemplopuede lograrse una liberación continuada de antígeno durante un periodo prolongado. Dependiendo del pesomolecular del polímero y la relación entre ácido láctico y glicólico en el polímero, un polímero de PLGA puede teneruna velocidad de hidrólisis desde unos pocos días o semanas a varios meses o un año. Una liberación lentacontrolada puede dar como resultado la formación de niveles elevados de anticuerpos similares a los que seobservan tras inyecciones múltiples. De forma alternativa, puede lograrse una liberación pulsátil de antígenos devacunas seleccionando polímeros con velocidades diferentes de hidrólisis. La velocidad de hidrólisis de un polímeronormalmente depende del peso molecular del polímero y la relación entre ácido láctico y ácido glicólico en elpolímero. Las micropartículas que están formadas por dos o más polímeros diferentes con velocidades variables deliberación de antígenos proporcionan liberaciones pulsátiles de antígenos e imitan los regímenes de vacunación dedosis múltiples.

De acuerdo con la presente invención, un antígeno, incluyendo cualquiera de los que se describen anteriormente, puede absorberse sobre un vehículo polimérico particulado, preferentemente un polímero de PLG, usando cualquierprocedimiento conocido en la técnica (tal como el que se ejemplifica en el Ejemplo 17) para formar una preparaciónde antígeno microencapsulado. La preparación de antígeno microencapsulado se mezcla después y se dispersa enuna emulsión submicrométrica de aceite en agua, emulsión que ha sido descrita anteriormente, para formar lacomposición de vacuna.

En una realización preferente, la presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene unantígeno encapsulado en un polímero de PLG, en el que el antígeno microencapsulado está disperso de formaextrínseca en una emulsión de aceite en agua microfluidizada que está compuesta por aceite mineral ligero, lecitina,TWEEN80, SPAN80 y solución salina y tiene un tamaño medio de gota inferior a 1,0 μm.

A continuación están los ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Losejemplos se ofrecen únicamente con fines de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la presenteinvención en modo alguno.

Ejemplo 1

Preparación de una formulación de AMPHIGEN®

Se preparó una formulación de AMPHIGEN® en un procedimiento de dos etapas. En la primera etapa se mezclaron80 litros de solución de aceite de lecitina Drakeol, 116 litros de solución salina de Toxoide de ténanos, 1,2 litros de SPAN 80, y 2,8 litros de Tween 80 y se emulsionaron usando un emulsionador Ross. La solución de aceite delecitina Drakeol contenía lecitina de soja al 25 % y aceite mineral al 75 %. El producto emulsionado se hizo recircularpor el emulsionador Ross durante un mínimo de 5 volúmenes o un mínimo de 10 minutos. El producto emulsionado se almacenó a 2-7 ºC durante un máximo de 24 horas para procesamiento adicional. La emulsión del tanque delemulsionador Ross se transfirió a un homogeneizador Gaulin y se homogenizó durante 20 minutos a una presión de31027,5 kPa. La solución de aceite de lecitina Drakeol al 40 % (en lo sucesivo “formulación de AMPHIGEN®” o“solución de AMPHIGEN®”) se dispensó después en envases de carboxi polipropileno estériles. El dispensado serealizó dentro de un embudo de dispensado de clase 100 localizado en un ambiente controlado de clase 10.000. Losenvases se almacenaron a 2-7 ºC. Esta formulación de AMPHIGEN® se usó en los experimentos que se describena continuación a no ser que se indique lo contrario.

Ejemplo 2

Mezclado primario mediante homogenización por mezclado ultrarrápido de la vacuna contra BVD.

El aparato usado para este procedimiento de homogenización se muestra en la Figura 1. Usando técnica aséptica oválvulas de cruce de vapor, se unió un frasco que contenía un antígeno de BVD Tipo I (una preparación vírica de BVD Tipo I inactivada) al puerto de la parte inferior del vaso de mezclado. Después de completar la transferencia delvolumen requerido del antígeno de BVD Tipo I, se sustituyó el frasco de BVD Tipo I por el envase que contenía una preparación vírica de BVD Tipo II inactivada (una preparación vírica de BVD Tipo II inactivado). Después decompletar la transferencia de la cantidad requerida de un antígeno de BVD Tipo II, se unió el homogeneizador Rossal recipiente portátil y se inició la recirculación a RPM máximas (3300 rpm). La agitación del recipiente se mantuvo a velocidad media.

Usando técnica aséptica o válvulas de cruce de vapor, se unió un frasco que contenía Quil-A con una concentraciónde 50 mg/ml al homogeneizador al puerto en línea del vaso de mezclado. Se pasó una cantidad requerida de lasolución de Quil-A al recipiente a través de succión en línea. Después de completar la transferencia de solución deQuil-A, se retiró el frasco. Del mismo modo, se transfirió una cantidad requerida de colesterol en solución de etanol(18 mg/ml) al vaso de mezclado. Subsiguientemente, se añadieron al vaso de mezclado una cantidad requerida dela formulación de AMPHIGEN®, solución de timerosol al 10 % y soluciones de dilución de medio de Eagle Modificado Básico (“BME”).

Una vez se completaron las adiciones, se continuó mezclando durante otros 15 minutos. La formulación resultantese dividió en dosis alícuotas de 2 ml y representaba una vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN®no microfluidizada. Cada dosis de la vacuna contenía 500 μg de Quil-A, 500 μg de colesterol, formulación deAMPHIGEN® al 2,5 % y timerosol al 0,009 %. La concentración de antígeno para las dos cepas diferentes de BVDse determinó en términos de la valoración de ELISA para gp53.

Ejemplo 3

Mezclado secundario por microfluidización

La Figura 2 ilustra el procedimiento usado para la mezcla secundaria mediante microfluidización. El microfluidizadorse esterilizó al vapor. Primero se instaló la cámara del módulo de procesamiento auxiliar en la unidad y se instaló lacámara del blanco en la segunda posición de la cámara. Se conectó el vaso que contenía la vacuna de BVD contodos los coadyuvantes preparada como se describe en el Ejemplo 2 al microfluidizador uniendo una línea detransferencia desde la válvula de drenaje del vaso suministrador a la entrada del microfluidizador. Se conectó gasnitrógeno a la entrada del filtro de aire del vaso suministrador y se ajustó la presión de vaso a 138 +/- 34 kPa. Laválvula de drenaje del vaso de recogida se conectó a la línea de transferencia de la salida del microfluidizador.Después de realizar todas las conexiones necesarias, se abrieron las válvulas y se inició la microfluidización con una presión de trabajo de 68.950 +/- 3.447,5 kPa. El contenido completo de la vacuna se pasó a través delmicrofluidizador una vez y se recogió en la cámara post-microfluidización. Esta preparación se dividió en dosisalícuotas de 2 ml y representa la vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada.

Ejemplo 4

Preparación de una composición de vacuna mediante mezclado en banco

La formulación de AMPHIGEN® preparada como se describe en el ejemplo 1 se diluyó al 2,5 % añadiendo antígenos de BVD y el diluyente. La solución resultante se mezcló en el banco usando una barra de agitación enlugar de un homogeneizador. La preparación final contenía la siguiente composición: antígenos de BVD Tipo 1 y Tipo 2, formulación de AMPHIGEN® al 2,5 % (que contiene aceite, lecitina, SPAN® y TWEEN®, como se describeen el Ejemplo 1) y solución salina. TWEEN 80 y SPAN 80 están presentes en la preparación de vacuna final a 0,18% y 0,08 % en volumen respectivamente.

Ejemplo 5

Comparación de una distribución de tamaño de gotas entre las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada y no microfluidizada

Se usaron la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada preparada como se describe en elEjemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada preparada como se describe en elEjemplo 3 y la preparación preparada por mezcla en banco como se describe en el Ejemplo 4 para comparar eltamaño de gota de las preparaciones de vacunas. Se añadieron 2 ml de la muestra de cada una de las preparaciones a un difractómetro malvern 2000 Laser y se determinó la distribución del tamaño de gota. Como semuestra en la Figura 3, los resultados indican que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada tenía el volumen de partícula máximo alrededor de 0,1 micras mientras que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada tenía el volumen máximo dedistribución de partículas alrededor de 1 micra.

Ejemplo 6

Reducción en la separación de fases de la vacuna.

Se compararon tres preparaciones de vacuna diferentes: la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® nomicrofluidizada preparada como se describe en el Ejemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada preparada como se describe en el Ejemplo 3 y la vacuna preparada por mezcla en banco como sedescribe en el Ejemplo 4, para determinar sus propiedades de separación de fases después de almacenamientoprolongado. Todas estas preparaciones se dejaron reposar a 4 ºC durante aproximadamente un mes y la separaciónde fases se controló en términos de aparición de una capa cremosa en la parte superior de las preparaciones devacunas. Como se muestra en la Figura 4, no se produjo separación de fases en la preparación con base deformulación de AMPHIGEN® microfluidizada cuando se comparó con las otras dos preparaciones.

Ejemplo 7

Preparación de vacuna para ganado vacuno microfluidizada y no microfluidizada contra el virus de la diarrea vírica bovino

Se incorporó de forma intrínseca el antígeno vírico del virus de la diarrea bovino a la formulación de AMPHIGEN® mediante microfluidización. El término “incorporado de forma intrínseca” se refiere al procedimiento por el cual seañadió el antígeno a la formulación de AMPHIGEN® antes de la microfluidización. El antígeno se sometió a lasfuerzas físicas del procedimiento de microfluidización junto con los componentes de la formulación de coadyuvante. En el grupo control no microfluidizado, la preparación de antígeno se dispersó en la formulación de AMPHIGEN® mediante mezclado.

La composición final de las preparaciones control y microfluidifizada era la siguiente: BVD tipo I con una valoraciónELISA tras la inactivación de 2535 UR/dosis para gp53, BVD Tipo II con una valoración ELISA tras la inactivación de 3290 UR/dosis para gp53, Quil-A con la concentración de 1,25 mg/dosis, colesterol con una concentración de1,25 mg/dosis, la formulación de AMPHIGEN® con una concentración final de 2,5 % y timerosol con una concentración final de 0,009 %. La dosis de la vacuna era de 5 ml.

Ejemplo 8

Estabilidad a largo plazo de antígenos víricos de BVD incorporados de forma intrínseca en la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada

Este experimento se realizó para determinar la estabilidad del antígeno incorporado de forma intrínseca durante elalmacenamiento a largo plazo. Se incorporó de forma intrínseca el antígeno vírico de BVD Tipo II inactivado en laformación AMPHIGEN® durante el procedimiento de microfluidización para obtener una preparación de vacunamicrofluidizada (A907505). Otras tres preparaciones de vacunas que contenían el mismo antígeno en una formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada (A904369, A904370 y A904371) sirvió como control. En las preparaciones no microfluidizadas, el antígeno se mezcló con formulación de AMPHIGEN® y se mezcló usando unhomogeneizador Ross. Las cuatro preparaciones de vacunas se almacenaron a 4 ºC durante dos años. En momentos diferentes durante el almacenamiento (0, 6, 12 o 24 meses) se usaron las cuatro formulaciones paravacunar vacas de tres meses de edad.

Los días 0 y 21 se vacunaron vacas de tres meses de edad por vía subcutánea con una formulación de vacuna de 2ml. El suero de los animales vacunados se extrajo el día 35 y se midió la respuesta serológica a la vacuna entérminos de la valoración de anticuerpo mediante un ensayo ELISA de BVDV-E2. Como se muestra en la Figura 5, la preparación de vacuna microfluidizada mostró una valoración de anticuerpos más elevada en todos los tiemposanalizados (0, 6, 12 y 24 meses), sugiriendo que no se pierde la estabilidad de la preparación de antígeno durante laincorporación intrínseca del antígeno durante el procedimiento de microfluidización. Además, se encontró tambiénde forma sorprendente que la preparación de vacuna microfluidizada indujo una respuesta inmunitaria potenciada entodos los tiempos.

Ejemplo 9

Reducción del aumento de temperatura rectal inducida por la vacuna después de la microfluidización

Se usaron las preparaciones de vacunas microfluidizada y no microfluidizada tal como se han descrito en el Ejemplo7 para vacunar el ganado vacuno el día cero y se controló la temperatura rectal durante el periodo desde un díaantes de la vacunación hasta cuatro días después de la vacunación. La dosis de la vacuna era de 2 ml. Los gruposse vacunaron con una dosis única o doble de la vacuna. Se midieron las temperaturas rectales y se registrarondiariamente desde el Día 1 hasta el Día 4 inclusive. Se midieron las temperaturas rectales el día 0 antes de laadministración del artículo de experimentación.

Como se muestra en la Figura 6, los resultados indican que se dio un aumento brusco en la temperatura rectalaproximadamente en las 24 horas después de la vacunación en los animales vacunados con una dosis única odoble de la formulación de vacuna no microfluidizada. Sin embargo, en los animales vacunados con formas microfluidizadas de la vacuna, el aumento de la temperatura rectal tras la vacunación fue mínima ysignificativamente menor que en los animales vacunados con la formulación no microfluidizada (Figura 6).

Ejemplo 10

El volumen de reacción en el sitio de la inyección se resolvió más rápido cuando se vacunó con formulaciones de vacunas microfluidizadas

Se usaron las preparaciones de vacunas microfluidizadas y no microfluidizadas preparadas como se describe en elEjemplo 7 para vacunar el ganado vacuno el día cero. Los animales incluidos en este estudio eran ganado vacunode carne híbridos. Había tres animales en cada uno de los grupos de tratamiento con placebo (T01 y T02). Habíaseis animales en cada uno de los grupos T03 a T06. La dosis de vacuna era de 2 ml y los grupos se vacunaron conuna o dos dosis de la vacuna el día cero. En día 0, se administró el artículo de experimentación en el lado derechodel cuello. Los animales que recibieron la dosis doble (4 ml) del artículo de experimentación (T02, T04 y T06)recibieron la dosis doble completa en forma de inyección única en un lado. La observación de los sitios de inyección, incluyendo la estimación del tamaño de reacción en el sitio de inyección se realizó en el lado derecho del cuello delDía 0 al Día 4 inclusive, y los Días 6, 9 y 14. El Día 0 se observaron los sitios de inyección antes de la administraciónde los artículos de experimentación. Los grupos vacunados con una o dos dosis del placebo no mostraron aumentosignificativo del volumen de reacción en el sitio de inyección y por lo tanto esos datos no se muestran en la Figura 7.En el caso de la formulación de vacuna no microfluidizada, se dio un aumento proporcional del volumen de reacción

en el sitio de inyección entre la vacunación con una dosis y la de dos dosis. Por otra parte, en el caso de laformulación de vacuna microfluidizada, aunque la dosis única indujo un volumen de reacción en el sitio de inyecciónmayor, la inyección con la segunda dosis no provocó un aumento mayor. Sin embargo, en el caso de los animales alos que se inyectó formulación de vacuna microfluidizada, el volumen de reacción en el sitio de inyección se resolviócon una velocidad mayor cuando se comparó con el de los animales inyectados con una formulación de vacuna no microfluidizada. Estos resultados se muestran en la Figura 7.

Ejemplo 11

Preparación de preparaciones de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada con antígenos víricos BVD y Leptospira incorporados de forma intrínseca y moléculas inmunoestimuladorastales como Quil A y DDA

Se formuló Leptospira de la cepa hardjo-bovi CSL inactivado en formalina en el coadyuvante apropiado con recuentos directos de aproximadamente 1,4 x 109 organismos/dosis de 5 ml. La cepa de Leptospira Pomna T262 inactivada en formalina se formuló a aproximadamente 2400 Unidades nefalómeras/dosis de 5 ml. Las unidadesnefalómeras se calcularon basándose en la medición nefalométrica de fluido de fermentación procesadopreviamente. El virus BVD Tipo 1 se formuló con una valoración de Elisa E2 de aproximadamente 3000 Unidadesrelativas/dosis de 5 ml. El virus BVD Tipo 2 se formuló con una valoración por ELISA E2 de aproximadamente 3500Unidades relativas/dosis de 5 ml. La unidad relativa se calculó basándose en la valoración por ELISA E2 de fluido volumétrico tras la inactivación antes del ensamblado. Se usaron tanto Quil-A como colesterol con una concentración de 0,5 mg por dosis. Se usaron timerosol y la formulación de AMPHIGEN® con la concentración finaldel 0,009 % y el 2,5 % respectivamente. Se usó hidróxido de aluminio (Rehydragel Lv) con una concentración finaldel 2,0 %. Cuando se usó DDA como inmunomodulador, DDA se incluyó en la formulación de AMPHIGEN®. Laformulación de AMPHIGEN® (es decir, la solución madre de Drakeol-lecitina al 40 %) contenía 1,6 mg/ml de DDA y, cuando se diluía de forma apropiada, la preparación de vacuna final contenía el 2,5 % de formulación de AMPHIGEN® y 0,1 mg/ml de DDA.

En la preparación de diferentes formulaciones de vacunas se añadieron fracciones de BVD, Leptos, Quil-A,colesterol, timerosol, la formulación de AMPHIGEN® y solución salina como un agente diluyente a un homogeneizador Silverson y se mezcló durante 15 minutos a 10.000 + 500 rpm. Después se microfluidizaron los componentes con un tamiz de 200 micrómetros a 68.950 kPa.

Cuando la formulación de la vacuna contenía hidróxido de aluminio, la microfluidicación se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidización, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasta la mañana siguiente a 4 ºC.

Ejemplo 12

Preparación de vacuna de virus BVD para estudios de exposición

La preparación de vacuna que se usó en este experimento contenía antígenos del virus BVD Tipo 1 y el virus BVDTipo 2. Se usó antígeno BVD1-5960 con una valoración después de inactivación por ELISA de 2535 UR/dosis paragp53. Se usó el antígeno BVD2-890 con una valoración después de inactivación por ELISA de 3290 UR/dosis paragp53. Se usaron Quil-A y colesterol a la concentración de 0,5 mg/ml. Se usaron timersol y la formulación de AMPHIGEN® con una concentración final de 0,009 % y 2,5 % respectivamente. Cuando se uso DDA como inmunomodulador, DDA se incluyó en la formulación de AMPHIGEN®. La solución madre de AMPHIGEN® (solución de Drakeol-lecitina al 40 %) contenía cantidades variables de DDA y, cuando se diluía de forma adecuada, lapreparación final de vacuna contenía el 2,5 % de formulación de AMPHIGEN® y concentraciones de DDA quevariaban en el intervalo de 0,5 mg/dosis a 2,0 mg/dosis. Se usó gel de aluminio (Rehydragel-LV) con una concentración final de 2 %. Se usó GPI-0100 en el intervalo de 2, 3 y 5 mg/dosis.

Todos los componentes se añadieron a un homogeneizador Silverson y se mezclaron durante 15 minutos a 10.500rpm y después se microfluidizaron pasando por una cámara de 200 micras con 68.950 kPa. Cuando la preparaciónde la vacuna contenía hidróxido de aluminio, la microfluidización se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidización, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasta lamañana siguiente a 4 ºC.

Ejemplo 13

Protección contra exposición a Leptospira después de vacunación con una formulación microfluidizada de vacuna con Amphigen con antígenos de Leptospira Tabla 1 – Grupos de tratamiento

Grupo de tratamiento

Composición del coadyuvante

T01

Solución salina

T02

Quil-A, colesterol y la formulación de AMPHIGEN® (QAC)

T03

Quil-A, colesterol, la formulación de AMPHIGEN® y AIOH (QAC-AIOH)

T04

DDA, colesterol y la formulación de AMPHIGEN® (DDA)

T05

DDA, colesterol, la formulación de AMPHIGEN® y AIOH (DDA-AIOH)

La Tabla 1 muestra la composición de las formulaciones de coadyuvante en las preparaciones de vacunas analizadas en este estudio. Las preparaciones de vacunas se prepararon como se describe en el Ejemplo 11. Habíaseis animales en cada grupo. En este estudio se usaron novillos de carne híbridos de aproximadamente siete meses de edad. La vacunación se realizó el Día 0 y el Día 21 por vía subcutánea con un volumen de vacuna de 5 ml. Laexposición se realizó con L. Hardjo-bovis cepa 203 de NADC (Nacional Agricultural Disease Center). La exposiciónse realizó durante los días 57-59 con un inóculo de 1 ml. La exposición se administró de forma conjunta ocular y porvía vaginal. El material de exposición contenía 5,0 x 106 unidades de leptospira/ml. La orina se recogiósemanalmente para realizar un cultivo de lepto, FA y PCR. La recogida de los riñones se realizó durante los días 112 y 113.

Tabla 2 – Resultados del estudio de exposición a Leptospira

Tratamiento

Porcentaje de terneros con resultado positivo alguna vez de Leptospira en orina y riñón porcultivo Porcentaje de terneros con resultado positivo alguna vez de Leptospira en orina y riñón porFA Porcentaje de terneros con resultado positivo alguna vez de Leptospira en orina y riñón porPCR Porcentaje de terneros con resultado positivo alguna vez de Leptospira en orina y riñón en todos los ensayos

Solución salina

100 83,3 83,3 100

QAC

0 0 0 0

QAC/AIOH

0 50,0 0 50,0

DDA

0 0 0 0

DDA/AIOH

0 33,3 16,7 50,0

10 La Tabla 2 muestra los datos del estudio de exposición a Leptospira. Para determinar el porcentaje de infección porLeptospira en el animal expuesto, se usaron los siguientes criterios. Si el cultivo de riñón era positivo sólo en unamuestra, se considera que el animal es Leptospira positivo. Si un animal es positivo sólo en una muestra para FA oPCR, se considera que el animal es negativo. Si la muestra es positiva para FA y PCR sólo en una muestra, se

15 considera que es Leptospira positivo.

Los resultados que se muestran en la Tabla 2 indican que la duración de la eliminación urinaria en todos los gruposvacunados fue significativamente más corta basándose en los tres ensayos. En lo que se refiere a la colonizaciónurinaria y renal, las eficacias de las formulaciones que contenían QAC y DDA sin AIOH fueron comparables. AlOH

20 no mejoró e incluso redujo las eficacias de las vacunas que contenían QAC o DDA en este estudio de exposición.

Tabla 3 – Intervalo de valoración de aglutinación microscópica el día de valoración media geométrica máxima antes de la exposición (Día 35)

25 Se detectaron respuestas serológicas contra ambos antígenos de Leptospira de la formulación de vacuna en losanimales vacunados y la respuesta máxima se notó el Día 35. No existió correlación entre la respuesta serológica y

Tratamiento

L. Hardjo L. pomona

Solución salina

<20 <20

QAC

160 – 640 1280 – 10240

QAC/AIOH

160 – 2560 8 – 10240

DDA

40 – 1280 320 – 2560

DDA/AIOH

320 – 640 1280 – 5120

30 la protección contra la exposición. La presencia de gel de aluminio en la formulación de vacuna redujo el nivel de protección aunque potenció la respuesta serológica por la presencia de gel de aluminio en la vacuna.

Ejemplo 14

35 Provocación de respuesta inmunitaria al antígeno vírico de BVD y protección contra la exposición al virus BVD Tipo 2 tras la inmunización con una preparación de vacuna microfluidizada que contiene formulaciónde AMPHIGEN® y DDA.

En este experimento se usaron terneras seronegativas de cuatro a siete meses de edad. Había seis grupos

40 diferentes y cada grupo tenía diez animales (Tabla 4). El Día 0 y el Día 21 cada animal recibió una dosis subcutánea de 2 ml de la vacuna o placebo en el lado del cuello aproximadamente a medio camino entre la escápula y lacabeza.

Tabla 4 – Grupos de tratamiento

Grupo de tratamiento

Composición del coadyuvante

T01

Solución salina

T02

Quil-A, formulación de AMPHIGEN® y colesterol

T03

Formulación de AMPHIGEN®, colesterol, DDA (0,5 mg/dosis) y AIOH

T04

Formulación de AMPHIGEN®, colesterol y DDA (0,5 mg/dosis)

T05

Formulación de AMPHIGEN®, colesterol y DDA (1,0 mg/dosis)

T06

Formulación de AMPHIGEN®, colesterol y DDA (2,0 mg/dosis)

Se administró una dosis de 5 ml de preparación de exposición del virus (aproximadamente 2,5 ml por fosa) por víaintranasal el día 44 del estudio. En este estudio se usó virus BVD Tipo 2, cepa aislada nº 24515 (Cepa Ellis), lote nº46325-70 no citopático como cepa de exposición. Se valoraron muestras retenidas de material de exposición (doscopias por valoración) en el momento del inicio de la exposición e inmediatamente después de completarlo. Lavaloración de virus vivos media por dosis de 5 ml era de 5,3 log10 DIAF50/5 ml antes de la exposición y 5,4 log10 DIAF50/5 ml después de la exposición (DIAF es equivalente a DICT50).

Se realizó un seguimiento de los animales todos los días desde el Día 3 al día 58. Se asignaron puntuaciones deenfermedad clínica de 0, 1, 2, o 3 basándose en los signos clínicos atribuibles a la infección por BVD 2 para cadaanimal los Días 42 a 58. Las puntuaciones del Día 44 se registraron antes de la exposición. Se extrajeron muestras de sangre (dos tubos de separación de suero de 13 ml, SST) de cada animal los Días 0, 21, 35, 44 y 58 paradeterminar las valoraciones en suero de anticuerpos de neutralización de los virus BVD Tipo 1 y BVD tipo 2.

Se extrajeron muestras de sangre de cada animal del Día 42 al Día 58, inclusive, y se determinó la presencia devirus BVD en la capa leucocitaria. El Día 44 se obtuvieron muestras antes de la exposición.

Se extrajeron de cada animal muestras de sangre (un tubo de EDTA de 4 ml) para determinar la leucocitometría elDía 42 al Día 58, inclusive. El Día 44 se obtuvieron muestras antes de la exposición.

Leucopenia se definió como un descenso del 40 % o mayor de la leucocitometría desde el nivel inicial (leucocitometría anterior a la exposición media de dos días anteriores y del día de la exposición).

Se usaron las puntuaciones de enfermedad clínica para definir el estado de enfermedad de la forma siguiente; si lapuntuación es < 1, entonces enfermedad = no; si la puntuación es > 2, entonces enfermedad = si.

Como se muestra en las Tablas 5 y 6, los grupos que se vacunaban con vacunas que contenían antígenos víricos deBVD junto con la formulación de AMPHIGEN®, Quil A o DDA y microfluidizadas, se seroconvirtieron con valoraciones de neutralización de virus en suero significativas para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. En esosgrupos hubo también una reducción significativa del porcentaje de animales que mostraban viremia después de laexposición, mientras que en el grupo de control 100 % de los animales mostraban viremia (Tabla 7). Además, en los grupos vacunados la frecuencia de la enfermedad se redujo también de forma significativa (Tabla 8). De formasimilar, el porcentaje de animales que mostraban leucopenia se redujo también en los grupos vacunados y lareducción de la leucopenia fue más significativa en el grupo que contenía DDA que en el grupo que contenía Quil A(Tabla 9). En el grupo de control se dio un descenso significativo de la subida de peso comparado con los gruposvacunados. (Tabla 10).

Serología

Antes de la vacunación el Día 0, todos los animales del estudio eran seronegativos (SVN < 1:2) para anticuerposcontra virus de BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran los datos). Catorce días después de la segunda vacunación (Día 35) todos los animales a los que se administró placebo (T01) seguían siendo seronegativos para anticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2; y los animales vacunados con los ITA (Antígeno en experimentación de investigación) (T02, T03, T04, T05 y T06) eran seropositivos (SVN > 1:8) para anticuerpos contra el virus BVD, Tipos 1 y 2. Un animal alque se administró la vacuna con coadyuvante de formulación de AMPHIGEN® a 2 mg/dosis de DDA tenía una valoración de SVN de 3 para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 2 el Día 35 (no se muestran los datos).

Antes de la exposición el Día 44, todos los controles (T01) excepto uno, eran seronegativos (SVN <1:2) paraanticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran datos). Uno de los controles (nº 2497) era seropostivo(SVN = 10) para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 1 y seronegativo para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 2. Catorce días después de la exposición, todos los animales del estudio eran seropostivos para anticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2.

Tabla 5. Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Tipo 1

Tratamiento

Media geométrica de valoraciones de SVN contra el virus BVDTipo 1 en el Día del estudio

0

21 35 44 58

T01

Solución salina <2 <2 <2 <2 23,9

T02

Amphigen, Quil A <2 39,1 19824,5 14018,2 27554,5

T03

Amphigen, 0,5 mg de DDA, Al <2 51,8 32204,8 22381,1 23170,4

T04

Amphigen, 0,5 mg de DDA <2 27,0 14512,4 8932,0 21996,2

T05

Amphigen, 1,0 mg de DDA <2 26,7 11585,2 8194,6 20882,0

T06

Amphigen, 2,0 mg de DDA <2 23,5 8778,7 6769,3 16961,1

Tabla 6. Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Tipo 2

Tratamiento

Media geométrica de valoraciones de SVN contra el virus BVD Tipo 1 en el Día del estudio

0

21 35 44 58

T01

Solución salina <2 <2 <2 <2 522,0

T02

Amphigen, Quil A <2 8,9 2272,4 2048,2 24833,6

T03

Amphigen, 0,5 mg de DDA, Al <2 9,5 3565,7 2702,2 20881,8

T04

Amphigen, 0,5 mg de DDA <2 4,1 1260,7 989,1 18496,2

T05

Amphigen, 1,0 mg de DDA <2 6,4 1398,8 1453,9 30047,8

T06

Amphigen, 2,0 mg de DDA <2 7,7 1673,2 1428,9 16384,0

Tabla 7. Aislamiento de virus BVD después de la exposición

Tratamiento

Aislamiento de virus BVD

Días del estudio

Frecuencia (%) de animales con viremia Media por MCde Días de viremia

T01

Solución salina 47 a 58 10/10 (100,0) 10,4

T02

Amphigen,Quil A 50 a 53 1/10 (10,0) 0,4

T03

Amphigen,0,5 mg de DDA,Al -- 0/10 (0,0) 0,0

T04

Amphigen,0,5 mg de DDA 48, 50 a 52, 57 3/10 (30,0) 0,5

T05

Amphigen,1,0 mg de DDA 49 a 51 2/10 (20,0) 0,4

T06

Amphigen,2,0 mg de DDA 48 a 52 2/10 (20,0) 0,5

Tabla 8. Signos clínicos de enfermedad por BVD después de la exposición

Tratamiento

Frecuencia (%) con enfermedad Frecuencia (%) observaciones con signos clínicos de enfermedad por BVD Total Obs.

0

1 2 3

T01

Solución salina 9/10 (90,0) 75 (46) 63 (37,5) 29 (17,3) 1 (0,6) 168

T02

Amphigen,Quil A 1/10 (10,0) 105 (61,8) 63 (37,1) 2 (1,2) 0 (0) 170

T03

Amphigen,0,5 mg de DDA,Al 2/10 (20,0) 99 (58,2) 67 (39,4) 4 (2,4) 0 (0) 170

T04

Amphigen,0,5 mg de DDA 0/10 (0,0) 118 (69,4) 52 (30,6) 0 (0) 0 (0) 170

T05

Amphigen,1,0 mg de DDA 0/10 (0,0) 101 (59,4) 69 (40,6) 0 (0) 0 (0) 170

T06

Amphigen,2,0 mg de DDA 0/10 (0,0) 104 (61,2) 66 (38,8) 0 (0) 0 (0) 170

Tabla 9. Leucopenia tras la exposición

Tratamiento

Leucopenia

Frecuencia (%) de animales leucopénicos

Media por MC de Días deleucopenia

T01

Solución salina 10/10 (100,0) 7,8

T02

Amphigen,Quil A 6/10 (60,0) 1,2

T03

Amphigen,0,5 mg de DDA,Al 2/10 (20,0) 0,2

T04

Amphigen,0,5 mg de DDA 4/10 (40,0) 0,8

T05

Amphigen,1,0 mg de DDA 3/10 (30,0) 0,9

T06

Amphigen,2,0 mg de DDA 2/10 (30,0) 0,5

Tabla 10. Peso corporal y subida de peso corporal durante el estudio

Tratamiento

Peso corporal medio (kg.) en el Día del estudio Subida de peso (kg)

-1

43 50 58

T01

Solución salina 171,46 219,95 222,72 216,32 44,86

T02

Amphigen,Quil A 194,14 238,82 247,98 262,63 68,49

T03

Amphigen,0,5 mg de DDA,Al 186,20 233,33 242,31 262,63 76,43

T04

Amphigen,0,5 mg de DDA 169,51 214,24 223,44 244,08 74,57

T05

Amphigen,1,0 mg de DDA 162,80 204,76 217,23 230,02 67,22

T06

Amphigen,2,0 mg de DDA 185,07 232,83 242,18 254,15 68,77

Aislamiento de virus

5 Durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del grupo control (T01) sufrían viremia (se aíslovirus BVD uno o más días). En los grupos a los que se había administrado ITA, la frecuencia de los animales conviremia era uno, cero, tres, dos y dos en cada grupo de diez (T02, T03, T04, T05 y T06, respectivamente). Ladiferencia entre el control y los grupos a los que se había administrado los ITA era estadísticamente significativa (P <

10 0,05). La media por mínimos del número de días de viremia era también significativamente mayor (10,4 días) para el control comparado con los grupos a los que se había administrado los ITA (0,0 a 0,5 días).

Enfermedad Clínica

15 Se consideró que los animales con puntuaciones de señales clínicas de 2 o 3 demostraban signos de enfermedad por BVD. La frecuencia de los animales con signos clínicos de enfermedad por virus BVD era nueve de diez en elcontrol (T01) y uno, dos, cero, cero y cero de diez en cada uno de los grupos a los que se administraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respectivamente). La diferencia entre el control y los grupos a los que se administraronlos ITA era estadísticamente significativa (P < 0,05).

20 Leucopenia

Durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del control (T01) sufrían leucemia (una reduccióndel 40 % en la leucocitometría comparada con la inicial antes de la exposición, Días 42-44). La frecuencia de25 animales con leucemia era seis, dos, cuatro, tres y dos de los diez animales de cada uno de los grupos a los que se administraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respectivamente). La diferencia entre el control y los grupos a losque se administró la vacuna que tenía la formulación de AMPHIGEN® como coadyuvante a 0,5 mg/dosis e hidróxidode aluminio (T03) era estadísticamente significativa (P < 0,05). La media por mínimos cuadrados del número de días de leucemia era significativamente mayor (7,8 días) para el control comparado con los grupos a los que se

30 administraron los ITA (0,2 a 1,2 días).

Ejemplo 15

Provocación de respuesta inmunitaria al antígeno vírico de BVD y protección contra la exposición al virus 35 BVD Tipo 2 tras la inmunización con una formulación de vacuna microfluidizada que contiene GPI-0100.

Se siguió un grupo de condiciones experimentales como se describe en el Ejemplo 14 y se realizó una comparacióndirecta entre Quil A y GPI-0100. Como se muestra en las Tablas 11 y 12, los animales vacunados con antígenos deBVD en la preparación de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada que contenía Quil-A o GPI-0100 tenía una

40 valoración de anticuerpos significativa para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. La valoración de anticuerpos para el virus BVD Tipo 1 era muy superior a la de virus BVD Tipo 2. Sin embargo, la exposición subsiguiente a virus BVDTipo 2 demostró una fuerte protección y se redujo significativamente la incidencia de la enfermedad en las ternerasvacunadas con la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada que contenía GPI-0100 (Tablas 13-15).

Tabla 13. Aislamiento de virus BVD después de la exposición

Tratamiento

Aislamiento de virus BVD

Frecuencia (%) de animales con viremia

Media por MC de Díasde viremia

T01

Solución salina 10/10 (100,0) 8,4

T02

Amphigen,Quil A 3/10 (30,0) 0,3

T03

Amphigen,2 mg de GPI-0100AlOH 0/10 (0,0) 0,0

T04

Amphigen,2 mg de GPI-0100 1/10 (10,0) 0,1

T05

Amphigen,3 mg de GPI-0100 3/10 (30,0) 0,3

T06

Amphigen,5 mg de GPI-0100 2/10 (20,0) 0,2

Tabla 14. Signos clínicos de enfermedad por BVD después de la exposición

Tratamiento

Frecuencia (%) con enfermedad Frecuencia (%) observaciones con unapuntuación de enfermedad clínica de Total Obs.

0

1 2

T01

Solución salina 5/10 (50,0) 103 (60,6) 55 (32,4) 12 (7,1) 170

T02

Amphigen,Quil A 5/10 (50,0) 115 (67,6) 48 (28,2) 7 (4,1) 170

T03

Amphigen,2 mg de GPI-0100AlOH 0/10 (0,0) 128 (75,3) 42 (24,7) 0 (0) 170

T04

Amphigen,2 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 124 (72,9) 46 (27,1) 0 (0) 170

T05

Amphigen,3 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 104 (61,2) 66 (38,8) 0 (0) 170

T06

Amphigen,5 mg de GPI-0100 0/10 (0,0) 128 (75,3) 42 (24,7) 0 (0) 170

Tabla 15. Leucopenia tras la exposición

Tratamiento

LeucopeniaFrecuencia (%) de animales

Media por MC de Días leucopénicos

de leucopenia

T01 Solución salina

9/10 (90,0)

8,7

T02 Quil A

6/10 (60,0)

1,6

T03 2 mg de GPI-0100, AlOH

7/10 (70,0)

2,6

T04 2 mg de GPI-0100

4/10 (40,0)

1,5

T05 3 mg de GPI-0100

7/10 (70,0)

2,6

T06 5 mg de GPI-0100

8/10 (80,0)

2,9

En conclusión, se demostró la seguridad de cada vacuna por la ausencia de reacciones adversas de mortandad enlos animales vacunados. La potencia de cada vacuna se demostró por seroconversión (valoraciones de anticuerposde SVN contra BVD-1 y BVD-2 >1:8) en 100 % de los animales vacunados. Se demostró la resistencia satisfactoria a

15 la exposición por la vacuna con 2 mg de GPI-0100 sólo como coadyuvante.

Ejemplo 16

Preparación de vacuna que contiene antígeno microencapsulado en emulsión microfluidizada de aceite en 20 agua

Se añadieron tres gramos de Trehalosa (Fluka) a agua para obtener una solución madre de 333 mg/ml de soluciónde Trehalosa. Se añadió antígeno PauA recombinante solubilizado en solución de SDS al 0,8 % (SDS/rPauA) a lasolución de Trehalosa para obtener una concentración final de 494 μg de rPauA/ml. En la siguiente etapa se25 disolvieron 10 gramos de ácido polilactidaglicólico (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) en 200 ml de cloruro de metileno (MeCl2). La solución resultante de PLG/MeCl2 se combinó con la solución de SDSrPauA/trehalosa preparada en la primera etapa. La solución combinada se sometió a microfluidización usandoMicrofluidizador (de Microfluidics Modelo M110EH) y la preparación microfluidizada se desecó por pulverizaciónusando un secador por pulverización Temco Modelo SD-5). El material desecado por pulverización se recogió

30 usando un tamiz de 500 micrómetros.

La concentración de rPauA en este material desecado por pulverización se cuantificó usando un análisis portransferencia Western. Se disolvieron 1,04 mg de material desecado por pulverización en 50 μl de acetona y secentrifugó a 13.200 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante. Las fracciones de

5 sobrenadante y de sedimento se secaron en una campana de seguridad biológica durante 2,5 horas. Se resuspendió el sedimento en 47,43 μl de solución de muestra (25 μl de tampón de muestra + 10 μl de agentereductor + 65 μl de agua). La fracción de sobrenadante desecado se resuspendió con 20 μl de solución de muestra.En el análisis Western se usó PauA purificado como patrón para cuantificar el contenido de rPauA del materialdesecado por pulverización.

Se preparó una solución madre de manitol al 20 % disolviendo 100 gramos de manitol (Sigma) en 500 ml de aguapara inyectables (WFI). La solución se calentó a 40 ºC con placa calefactora/agitador y se enfrió a 30 ºC. La solución se esterilizó por filtración con un filtro estéril de 0,22 micras (Millipore). Se preparó una solución decarboximetilcelulosa al 2,5 % disolviendo 12,5 gramos de carboximetilcelulosa (Sigma) en 500 ml de WFI y se

15 mezcló hasta la mañana siguiente a 4 ºC. La solución se sometió a autoclave a 121 ºC.

El polvo resultante de la desecación por pulverización se reconstituyó en una solución que contenía manitol al 5 %, carboximetilcelulosa al 0,3 % y timerosol 1:5000. La solución final se dividió en alícuotas en viales de 3 ml y se liofilizó usando un Lyophilizer (USIFROID). El polvo liofilizado representa el rPauA microencapsulado. El antígeno desubunidad proteica microencapsulado se resuspendió en 2 ml de emulsión de aceite en agua microfluidizada quecontenía una formulación de AMPHIGEN® (tal como la emulsión microfluidizada que se describe en el Ejemplo 20) y que se usa como vacuna.

Ejemplo 17

25 Preparación de una formulación de vacuna microfluidizada que contiene antígeno bacteriano de células enteras y antígeno de proteína recombinante en emulsión de aceite en agua

Se prepararon dos preparaciones de vacunas que contenían proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante y células bacterianas de Escherichia coli, se añadieron de forma intrínseca a emulsiones de aceite en agua como sedescribe en los Ejemplos 2 y 3. El antígeno PauA recombinante estaba en una concentración de 100 μg por dosis y las células de E. coli daban un recuento final de 4 x 109 por dosis. Las composiciones de coadyuvantes en emulsión de las dos formulaciones de vacuna se muestran en la Tabla 16.

35 Tabla 16. Formulaciones de vacunas que contienen tanto proteína recombinante como células enteras de E. coli

Tratamiento

Antígeno Adyuvante

T01

Placebo Solución salina

T02

Pau A/E. coli SEAM-14

T03

Pau A/E. coli Amphigen al 2,5 %, 0,5 mg de GPI-0100, 0,5 mg de colesterol

T04

Pau A/E. coli Amphigen al 2,5 %, 0,5 mg de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), 0,5 mg de colesterol

Ejemplo 18

Respuesta inmunitaria a vacuna microfluidizada que contiene rPauA y agentes bacterianos de células enteras en emulsión de aceite en agua

En este experimento se usaron vacas lecheras maduras. Los animales estaban al final de su primera o segundalactancia en el momento de la admisión. Se administraron por vía subcutánea 2 ml de cada formulación de vacuna45 tres veces, una en el momento de secado (D - 0), 28 días después (D = 28) y de nuevo 4 a 10 días después del parto (C + 4 – C+10). La primera y tercera dosis se administraron en el lado izquierdo del cuello y la segunda seadministró en el lado derecho del cuello. Se extrajo sangre antes de cada vacunación y aproximadamente 14 días y 32 días después de la tercera vacunación. La valoración de anticuerpos para E. coli y el antígeno rPauA sedeterminaron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 8, los resultados indican que la valoración deanticuerpos para rPauA era superior en el grupo vacunado con la formulación de vacuna que contiene GPI-0100 como inmunoestimulante y era máxima el día 70 después de la vacunación inicial. La valoración de anticuerpos paraantígeno contra E. coli se muestra en la Figura 9. La valoración de anticuerpos contra antígeno de E. coli era comparable en ambas formulaciones de vacunas, aunque la presencia de GPI-0100 como inmunoestimulante indujo una valoración de anticuerpos relativamente mayor comparada con la formulación con DDA como

55 inmunoestimulante.

Ejemplo 19

Análisis de actividad viricida de las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN®microfluidizada

Para determinar si la microfluidización inactiva el virus, se determinó la actividad viricida de tres preparaciones devacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada. Las tres preparaciones contenían tres virusinfecciosos bovinos diferentes, específicamente virus del herpes bovino (BHV), virus de paragripe 3 (PI3), y virus

65 sintial respiratorio bovino (BRSV).

La detección de la actividad viricida de las tres preparaciones de vacunas se realizó de acuerdo con los requisitos dela USDA 9CFR-113.35.

Los resultados que se muestran en la Tabla 17 indican que la microfluidización de las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no provoca inactivación significativa de la preparación de vacuna.

Tabla 17. Análisis de actividades viricidas de vacunas microfluidizadas

Serie

BRSV BHV PI3

A

0 0,2 0

AM200

-0,2 0 -0,2

AM75

0 -0,3 -0,3

AM75 a 37C

0,1 -0,3 -0,2

B

0 -0,1 -0,2

BM200

0 0 -0,2

BM75

-0,2 -0,5 0

BM75 a 37C

0,5 -0,5 0

C

0,1 -0,1 -0,2

CM200

-0,2 -0,1 -0,2

CM75

0,1 0,5 -0,2

CM75 a 37C

0,5 0,5 -0,2

A = colesterol añadido a 650 ml/minutoB = colesterol añadido a 28 ml/minutoC = colesterol añadido a 5 ml/minutoM200 = microfluidizada con tamiz de 200 micras M75 = microfluidizada con tamiz de 75 micras M75 a 37C = fluidos calentados a 37 ºC antes de microfluidización Un valor por encima de 0,7 es indicador de efecto viricida.

Ejemplo 20

Preparación de una formulación de AMPHIGEN® microfluidizada

10 Se preparó una formulación de AMPHIGEN® combinando solución de aceite de lecitina DRAKEOL (aceite mineral ligero con lecitina al 25 %) y TWEEN 80 (con la concentración final de 0,18 %) y Span 80 (con la concentración final de 0,08 %) mezclando durante 8-22 horas a 36 + 1 ºC. La mezcla de aceite se añadió después a solución salina conayuda de un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm. Subsiguientemente lamezcla se pasó una vez por un microfluidizador con una cámara de interacción de 200 μm a 31.027,5+3.447,5 kPa .

15 Las Figuras 10 A y 10 B muestran la estabilidad de la formulación de AMPHIGEN® microfluidizada. La distribución del tamaño de partículas, medida por difracción de láser, en el momento inicial de partida (Figura 10A) era casi idéntico a la distribución de tamaño de partícula después de 22 meses de almacenamiento a 4 ºC (Figura 10B).

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una emulsión submicrométrica microfluidizada de aceite en agua que comprende un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, estando disperso dicho aceite endicho componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0,5 μm.

2. 2.

   La emulsión de la reivindicación 1, en la que dicho aceite es aceite mineral ligero y está en una cantidad del1 % al 50 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad del 0,01 % al 10 % v/v, y en la quedicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño medio de gota de aceite se encuentra entre 0,1μm y 0,5 μm.

3. 3.

   La emulsión de la reivindicación 1, en la que el aceite no metabolizable es aproximadamente el 40 % v/v deaceite mineral, el tensioactivo comprende aproximadamente el 10 % p/v de lecitina, aproximadamente el 0,18 % v/vde ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado y aproximadamente el 0,08 % v/v de tensioactivos de sorbitansustituidos con ácidos grasos, en la que dicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño mediode gota de aceite se encuentra entre 0,1 μm y 0,5 μm.

4. 4.

   Un procedimiento para preparar una emulsión submicrométrica de aceite en agua de la reivindicación 1,que comprende:

   (a)

   preparar una mezcla combinando un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso;

   (b)

   someter dicha mezcla a un procedimiento de emulsionamiento primario para producir una emulsión deaceite en agua que tiene un tamaño medio de gota de aceite de 1,0 μm a 1,1 μm; y

   (c)

   someter la emulsión de aceite en agua preparada en (b) a microfluidización para producir dicha emulsiónsubmicrométrica de aceite en agua, en el que la emulsión submicrométrica tiene un tamaño medio de gota de aceiteinferior a 0,5 μm.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho aceite es aceite mineral ligero y está en unacantidad del 1 % al 50 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad del 0,01 % al 10 % v/v y en el que dicho tamaño medio de gota de aceite de dicha emulsión submicrométrica está entre 0,1 μm y 0,5 μm.

6. 6.

   Una composición de vacuna que comprende una emulsión de aceite en agua de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un antígeno, estando dicho antígeno disperso en dicha emulsión.

7. 7.

   Una composición de vacuna que comprende una emulsión de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho antígeno está disperso en dicha emulsión y, además, en la que dicho aceite es aceite mineral ligero y está presenteen dicha composición de vacuna en una cantidad del 1 % al 20 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y estápresente en dicha composición de vacuna en una cantidad del 0,01 % al 10 % v/v, y en la que dicho tamaño mediode gota de aceite está entre 0,1 μm y 0,5 μm.

8. 8.

   La composición de vacuna de la reivindicación 6 o 7, en la que dicho antígeno es un antígeno vírico o unantígeno bacteriano.

9. 9.

   La composición de vacuna de la reivindicación 8, en la que dicho antígeno vírico comprende Virus deDiarrea Bovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en la que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de entreuna bacterina de Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli.

10. 10.

    Un procedimiento para preparar una composición de vacuna de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7,que comprende:

    (a)

    preparar una mezcla combinando un aceite no metabolizable de hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso;

    (b) añadir un antígeno a la mezcla formada en (a);

    (c)

    someter la mezcla que contiene dicho antígeno, que se forma en (b), a un procedimiento deemulsionamiento primario para producir una emulsión de aceite en agua que tiene un tamaño medio de gota deaceite de 1,0 μm a 1,1 μm; y

    (d)

    someter la emulsión formada en (c) a microfluidización para producir dicha composición de vacuna, en elque la composición tiene un tamaño medio de gota de aceite inferior a 0,5 μm.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígenobacteriano.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho antígeno vírico comprende Virus de DiarreaBovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en el que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de entre una bacterina de Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli.

13. 13.

    Una composición de vacuna que comprende un antígeno microencapsulado y una emulsión de aceite enagua de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho antígeno microencapsulado está disperso en dicha

    emulsión.

14. 14.

    Una composición de vacuna que comprende un antígeno microencapsulado y una emulsión de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho antígeno está disperso en dicha emulsión y, además, dicho aceite es aceite

    5 mineral ligero y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad del 1,0 % al 20 % v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 0,01 % a 10 %v/v, dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígeno bacteriano y está encapsulado en un vehículo particulado, y en la que dicho vehículo comprende ácido polilactidaglicólico.

    Figura 2

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5

    Media de mínimos cuadrados de Valoración de anticuerpos temperatura rectal ( ºC) neutralizadores

    Mes 0 Mes 6 Mes 12 Mes 24

    Figura 6

    Día del estudio

    Figura 7

    Media por mínimos cuadrados del volumen de reacción del sitio de inyección(cm3)

    Día del estudio

    Figura 8

    Figura 9

    Días del experimento

    Figura 10A

    % volumen

    Diámetro de partícula (μm)

    Figura 10B

    % volumen

    Diámetro de partícula (μm)