KR20060006909A

KR20060006909A - 미세 유동화된 수중 유적형 유화액 및 백신 조성물

Info

Publication number: KR20060006909A
Application number: KR1020057018729A
Authority: KR
Inventors: 폴 조셉 도미노스키; 파멜라 케이 클로스; 리차드 리 크렙스; 라마사미 만나 만난
Original assignee: 화이자 프로덕츠 인코포레이티드
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2006-01-20
Also published as: NO20054376D0; TW200509966A; AR043803A1; RU2009113834A; EP1613346B1; RU2005130646A; TWI353850B; AU2004226591A1; CN1767854A; PT1613346E; CN1767854B; US20040258701A1; HK1086484A1; CA2521051A1; CA2521051C; UY28256A1; MXPA05010697A; NZ542576A; NO20054376L; KR100720213B1

Abstract

본 발명은 항원들의 면역원성을 향상시키기 위한 백신 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 제공한다. 본 발명은 상기와 같은 유화액과 본질적으로 또는 비본질적으로 배합된 항원을 함유하는 백신 조성물을 또한 제공한다. 상기 유화액 및 백신의 제조 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다.

Description

미세 유동화된 수중 유적형 유화액 및 백신 조성물{MICROFLUIDIZED OIL-IN-WATER EMULSIONS AND VACCINE COMPOSITIONS}

본 발명은 일반적으로 백신 분야, 및 특히 수의학적 동물에서 면역 반응을 향상시키기 위한 항원보강제(adjuvant) 제형에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항원의 면역원성을 향상시키기 위한 백신 항원보강제로서 마이크론 이하(submicron) 수중 유적형 유화액의 용도에 관한 것이다. 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액 제형, 상기와 같은 유화액에 혼입된 항원을 함유하는 백신 조성물뿐만 아니라 상기 유화액 및 백신의 제조 방법이 본 발명에 의해 제공된다.

세균, 바이러스, 기생충 및 마이코플라스마 감염은 소, 돼지 및 친숙한 동물 등의 수의학적 동물에 널리 만연되어 있다. 이러한 감염 인자에 의해 야기된 질병들은 종종 항균 약제 요법에 내성이며, 이는 상기 치료 수단을 무력화한다. 결과적으로, 수의학적 동물들에서 감염성 질병을 억제하기 위해서 백신학적 접근법이 더욱더 사용된다. 전체 감염성 병원균을 화학적 불활성화 또는 적합한 유전자 조작 후에 백신 제형에 사용하기에 적합하게 만들 수 있다. 한편으로, 상기 병원균 의 단백질 서브유닛을 재조합 발현 시스템에서 발현시키고 백신 제형에 사용하기 위해 정제시킬 수 있다.

항원보강제는 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되며, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 항원보강제로서 작용할 수 있다. 그러나, 병원성 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하며 따라서 항원보강제로서 일부 외래 물질의 첨가가 필요해 진다. 더욱이, 합성 및 서브유닛 백신은 제조에 비용이 많이 든다. 따라서, 항원보강제의 도움으로 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다.

항원보강제는 면역 반응을 향상시키기 위해서 다수의 상이한 방식으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 다수의 항원보강제들은 면역 반응과 관련된 사이토카인 네트워크를 변경시킨다. 이러한 면역 조절성 항원보강제들은 이들이 항원과 함께하지 않는 경우에조차도 효과를 발휘할 수 있다. 일반적으로, 상기 면역 조절성 항원보강제들은 일부 사이토카인의 일반적인 상향 조절과 다른 것들의 동반되는 하향 조절을 일으켜 세포 Th1 및/또는 체액 Th2 반응을 유도한다.

일부 항원보강제는 항원들이 적합한 면역 작동 세포를 효율적으로 제공할 수 있도록 항원의 형태 보전성을 유지하는 능력을 갖는다. 이러한 항원보강제 제형에 의한 항원 형태의 보전 결과, 백신은 면역 자극 복합체(ISCOM)에 대해 입증된 것과 같은 증가된 저장수명을 갖게 될 것이다(Ozel M., et al., 면역자극 복합체(iscom)의 4원 구조, J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248(1989)).

일부 항원보강제는 주입 부위에 저장소(depot)로서 항원을 유지하는 성질을 갖는다. 이러한 저장 효과의 결과로서 상기 항원은 간 청소에 의해 급격히 상실되지 않는다. 알루미늄 염 및 유중 수적형 유화액은 보다 짧은 기간 동안 상기 저장 효과를 통해 작용한다. 예를 들어, 유중 수적형 유화액인 프로인트(Freund) 완전 항원보강제(FCA)를 사용함으로써 장기적인 저장소를 얻을 수 있다. FCA는 전형적으로는 생분해가 항원 제공 세포에 의한 항원의 제거를 허용할 때까지 주입 부위에 남아 있는다.

항원보강제는 그의 물리적 성질을 근거로 2 개의 매우 광범위한 범주, 즉 미립자 항원보강제와 비-미립자 항원보강제로 분류될 수 있다. 미립자 항원보강제는 마이크로 입자로서 존재한다. 면역원은 상기 마이크로 입자와 통합되거나 회합할 수 있다. 알루미늄 염, 유중 수적형 유화액, 수중 유적형 유화액, 면역 자극 복합체, 리포솜 및 나노- 및 마이크로 입자가 미립자 항원보강제의 예이다. 비-미립자 항원보강제는 일반적으로는 면역조절제이며 상기는 일반적으로 미립자 항원보강제와 함께 사용된다. 뮤라밀 다이펩타이드(마이코박테리아로부터 추출된 펩타이도글리칸의 항원보강제 활성 성분), 비-이온성 블록 공중합체, 사포닌(퀼라자 사포나리아 나무의 껍질로부터 추출한 트라이터페노이드의 복합 혼합물), 지질 A(2 개의 포스페이트 그룹, 및 일반적으로 C12 내지 C16 길이의 5 또는 6 개의 지방산 쇄를 갖는 글루코스아민의 다이사카라이드), 사이토카인, 탄수화물 중합체, 유도체화된 폴 리사카라이드, 및 세균 독소, 예를 들어 콜레라 독소 및 이 콜라이 민감 독소(LT)가 비-미립자 항원보강제의 예이다.

가장 잘 알려진 항원보강제 중 일부는 항원보강제 제형에 저장 효과를 부여할 수 있는 미립자 물질과 비-미립자 면역조절제와의 조합이다. 예를 들어, FCA는 오일 유화액의 단기 저장 효과와 함께 결핵균 성분의 면역 조절 성질을 겸비한다.

오일 유화액은 오랫동안 백신 항원보강제로서 사용되어 왔다. 1916년 르 모이니크와 피노이(Le Moignic and Pinoy)는 무기 오일 중의 죽은 살모넬라 타이피무륨의 현탁액이 면역 반응을 증가시킴을 발견하였다. 이어서 1925년에, 라몬(Ramon)은 디프테리아 변성독소에 대한 독성억제 반응을 증가시키는 물질들 중 하나로서 전분 오일을 개시하였다. 그러나, 상기 오일 유화액들은 1937년 프로인트가 현재 프로인트 완전 항원보강제(FCA)로서 알려진 항원보강제 제형을 드러낼 때까지 대중적이지 못하였다. FCA는 죽은 마이코박테리아 및 아를라셀 A와 혼합된 무기(파라핀) 오일을 포함하는 유중 수적형 유화액이다. 아를라셀 A는 주로 만나이드 모노올리에이트이며 유화제로서 사용된다. FCA는 항체 반응의 유도에 탁월하지만, 상기는 심한 통증, 농양 형성, 발열 및 육아종 염증을 일으킨다. 이러한 바람직하지 못한 부 반응들을 피하기 위해서, 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)가 개발되었다. IFA는 마이코박테리아 성분이 없음을 제외하고 그의 조성에 있어서 FCA와 유사하다. IFA는 주입 부위에서 저장 제형을 통해 작용하며 항체-생산 세포의 자극에 의해 항원의 방출을 늦춘다.

FCA를 개선시키는 또 다른 접근법은 상기 무기 오일을 생체 적합성 오일로 대체시켜 주입 부위에서 FCA와 관련된 반응들을 제거하는 것을 돕는다는 개념을 기본으로 하였다. 또한, 상기 유화액은 유중 수적형이기 보다는 수중 유적형이어야 하는 것으로 여겨졌는데, 그 이유는 상기 수중 유적형이 주입 부위에서 오래 지속되는 저장소를 생성하기 때문이다. 힐맨(Hilleman) 등은 86% 땅콩 오일, 유화제로서 10% 아를라셀 및 안정제로서 4% 알루미늄 모노스테아레이트로 이루어진 유성 항원보강제 "항원보강제 65"를 개시하였다(Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8:131-182; Hilleman and Beale, 1983, in New Approaches to Vaccine Development(Eds. Bell, R. and Torrigiani, G.), Schwabe, Basel). 인간에서, 항원보강제 65는 안전하고 효능이 있었으나 IFA보다는 적은 항원보강성을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 항원보강제 65의 사용은 인간의 경우 일부 많은 백신들에 대한 부반응, 및 정제된 또는 합성된 유화제를 아를라셀 A 대신에 사용하는 경우 항원보강성의 감소로 인해 중단되었다. 미국 특허 제 5,718,904 호 및 5,690,942 호는 수중 유적형 유화액 중의 무기 오일을 안전성 프로파일의 개선을 목적으로 대사 가능한 오일로 대체시킬 수 있음을 교시한다.

항원보강성과 안전성 이외에, 유화액의 물리적 외관이 또한 중요한 상업적인 고려사항이다. 물리적 외관은 유화액의 안정성에 따라 변한다. 크림화, 침강 및 합체는 유화 불안정성의 지표이다. 크림화는 유화액의 오일 및 수성 상들이 상이한 비중을 갖는 경우 일어난다. 크림화는 또한 유화액의 초기 소적 크기가 크고 상기 유화액 소적이 어떠한 브라운 운동도 갖지 않는 경우 일어난다. 상기 소적 크기가 큰 경우, 계면이 붕괴하고 소적들이 큰 입자로 합체하는 경향이 있다. 상 기 유화액의 안정성을 사용되는 유화제의 성질 및 양, 유화액 중의 소적의 크기, 및 오일과 수성상 사이의 밀도차 등과 같은 다수의 인자들에 의해 측정한다.

유화제는 계면 자유 에너지를 감소시키고 소적 합체에 대한 물리적 또는 정전기적 장벽을 생성시킴으로써 분산된 소적의 안정화를 촉진시킨다. 이온성뿐만 아니라 비이온성 세제가 유화제로서 사용되어 왔다. 비이온성 유화제는 계면을 향하며 비교적 부피가 큰 구조를 생성시키고, 이는 상기 분산된 소적의 입체 회피를 유발시킨다. 비이온성 또는 양이온성 유화제는 대이온들을 끌어당김으로써 전기적 이중 층의 형성을 유도하며; 상기 이중 층 반발력은 소적들이 접근할 때 서로 반발하게 한다.

상기 유화제를 사용하는 것 이외에, 유화액의 안정성을 또한 상기 유화액의 소적 크기를 기계적 수단에 의해 감소시킴으로써 성취할 수 있다. 전형적으로는 추진기 믹서, 터빈 로터, 콜로이드 밀, 균질화기 및 초음파기가 유화액의 제조에 사용되어 왔다. 미세유동화(microfluidization)는 유화액중의 소적 크기의 균일화를 증가시키기 위한 또 다른 방법이다. 미세유동화는 마이크론 이하 범위의 일관된 입자 크기를 갖는 훌륭하고 물리적으로 안정한 유화액을 생성시킬 수 있다. 상기 미세유동화 방법은 상기 유화액의 안정성을 증가시키는 것 이외에, 최종 생성물의 무반응을 보장하는 바람직한 방식인 종말 여과를 허용한다. 더욱이, 마이크론 이하의 오일 입자들은 주입 부위에서부터 림프관을 통해 배출 사슬인 혈액과 비장의 림프절로 통과할 수 있다. 이는 주입 부위에 국소 염증 및 중대한 주입 부위 반응을 생성시킬 수 있는 유성 저장소가 확립될 가능성을 감소시킨다.

미세유동화기는 현재 상업적으로 입수할 수 있다. 유화액 형성은 2 개의 유동화된 스트림이 상호작용 챔버 내에서 높은 속도로 상호작용함에 따라 미세유동화기에서 일어난다. 상기 미세유동화기는 공기 또는 질소 구동되며 20,000 psi를 초과하는 내부 압력에서 작동할 수 있다. 미국 특허 제 4,908,154 호는 임의의 유화제가 필수적으로 없는 유화액을 수득하기 위한 미세유동화기의 용도를 교시한다.

다수의 마이크론 이하의 수중 유적형 항원보강제 제형들이 문헌에 개시되었다. 미국 특허 제 5,376,369 호는 신택스 애주번트 포뮬레이션(Syntax Adjuvant Formulation)(SAF)으로서 공지된 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액 항원보강제 제형을 교시한다. SAF는 오일 성분으로서 스쿠알렌 또는 스쿠알란, 유화액 형성량의 플루로닉(Pluronic) L121(폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌) 블록 중합체 및 면역강화량의 뮤라밀다이펩티드를 함유한다. 스쿠알렌은 많은 조직들, 특히 상어 및 다른 어류의 간에서 발견되는 콜레스테롤의 선형 탄화수소 전구체이다. 스쿠알란은 스쿠알렌의 수소화에 의해 제조되며 완전히 포화된다. 스쿠알렌과 스쿠알란은 모두 대사될 수 있으며 독성학 연구 기록이 양호하다. 스쿠알렌 또는 스쿠알란 유화액은 순한 부작용과 바람직한 효능으로 인간 암 백신에 사용되어 왔다. 예를 들어 문헌[Anthony C. Allison, 1999, 항원보강제로서 스쿠알렌과 스쿠알란 유화액, Methods 19:87-93]을 참조하시오.

미국 특허 제 6,299,884 호 및 국제 특허 공보 WO 90/14873 호는 폴리옥시-프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체가 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 형성에 필수적이지 않음을 교시한다. 더욱이, 이들 참고문헌은 무독성의 대사성 오일의 용도를 교시하며 유화액 제형 중의 무기 오일 및 독성 석유 증류 오일의 용도는 명백히 제외한다.

미국 특허 제 5,961,970 호는 백신 항원보강제로서 사용되는 더욱 또 다른 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 교시한다. 상기 특허에 개시된 유화액에서, 소수성 성분은 중간쇄 트라이글리세라이드 오일, 식물성 오일 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 상기 유화액에 포함되는 계면활성제는 천연의 생물학적으로 적합한 계면활성제, 예를 들어 인지질(예: 레시틴) 또는 약학적으로 허용 가능한 비-천연 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN)-80일 수 있다. 상기 특허는 또한, 항원을 유화액이 독립적으로 및 비본질적으로 형성된 후에 상기 유화액과 혼합하는 것과 대조적으로, 항원을 유화액이 형성될 때 상기 유화액에 혼입시킴을 교시한다.

미국 특허 제 5,084,269 호는 무기 오일과 함께 레시틴을 함유하는 항원보강제 제형이 숙주 동물에서 자극을 감소시키고 동시에 전신 면역성의 증가를 유도함을 교시한다. 미국 특허 제 5,084,269 호로부터 생성된 항원보강제 제형은 암피젠(AMPHIGEN)(등록상표)이라는 상표명으로 수의학적 백신에 상업적으로 사용된다. 상기 암피젠(등록상표) 제형은 레시틴에 의해 둘러싸인 마이셀-오일 소적으로 구성된다. 상기 마이셀은 전 세포 항원들을 전통적인 유성 항원보강제보다 더 부착되게 한다. 더욱이, 상기 암피젠(등록상표)-기재 백신 제형은 전형적으로 10 내지 20%의 오일을 함유하는 오일 항원보강제를 함유하는 다른 백신 제형들에 비해, 무기 오일 2.5 내지 5%의 낮은 오일 함량을 함유한다. 상기 낮은 오일 함량은 상기 항원보강제 기재 백신 제형이 주입 부위에서 조직을 덜 자극하게 만들며, 이는 병변을 보다 적게 발생시키고 도살 시 손질 부위를 보다 적게 생성시킨다. 또한, 상기 오일 소적을 둘러싸는 레시틴 코팅층은 주입 부위 반응을 더욱 감소시켜 안전하고 효능 있는 백신을 생성시킨다.

상기 암피젠(등록상표) 제형은 다수의 수의학적 백신에 항원보강제로서 사용되며, 단기 및 장기적인 보관 기간 동안뿐만 아니라 재조시 백신 생성물의 물리적 외관을 유지시키는 것이 필요하다. 또한, 동결건조된 항원을 주입 직전에 미리 제조한 항원보강제 제형과 혼합한다. 이러한 실행이 수중 유적형 유화액 내에 항원의 균일한 분포를 항상 보장하는 것은 아니며 상기 유화액의 외관은 바람직하지 않을 수도 있다. 더욱이, 정치 시 상기 균질화된 유화액은 상 분리를 보일 수 있다. 따라서, 장기적인 저장 수명에 대해 상 분리를 보이지 않는 안정한 항원보강제 제형의 필요성이 존재한다. 상기 상 분리를 방지하는 한 가지 방법은 소적 크기를 감소시키고 유화액의 입자 동질성을 증가시키는 것이다. 대사 가능한 유성 유화액 제형의 미세유동화 방법이 문헌에 보고되었지만, 암피젠(등록상표) 제형과 같은 수중 유적형 유화액의 미세유동화는 아직 수행되지 않았다.

본 발명에서, 미세유동화를 사용하여 레시틴으로 둘러싸인 무기오일 소적의 크기를 마이크론 이하의 크기로 만들었다. 뜻밖에도, 본 발명자들에 의해, 레시틴과 오일의 혼합물을 포함하는 수중 유적형 유화액으로 항원보강된 백신 제형의 미세유동화가 상기 제형의 물리적 외관을 개선시킬 뿐만 아니라 상기 제형의 면역 효과도 향상시킴이 발견되었다. 미세유동화된 제형은 또한 개선된 안전성 프로파일 을 특징으로 한다.

발명의 요약

뜻밖에도 본 발명자들에 의해 대사될 수 없는 유성 수중 유적형 유화액의 항원보강제 활성 및 안전성 프로파일이 미세유동화를 통해 개선될 수 있음이 밝혀졌다. 미세유동화된 유화액에 혼입된 항원은 상기 항원이 미세유동화 전에 상기 유화액에 본질적으로 혼입되어 있을 때조차도 안정하다.

따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 백신 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액 제형을 제공한다. 본 발명의 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 대사될 수 없는 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수성 성분을 포함하며, 이때 상기 오일은 마이크론 이하 범위의 평균 오일 소적 크기로 수성 성분에 분산된다. 바람직한 대사될 수 없는 오일은 무기 경유이다. 바람직한 계면활성제로는 레시틴, 트윈-80 및 SPAN-80이 있다.

본 발명에 의해 제공된 바람직한 수중 유적형 유화액은 암피젠(등록상표) 제형을 포함한다.

본 발명의 수중 유적형 유화액은 적합하고 바람직한 추가의 성분들, 예를 들어 보존제, 삼투제, 생체 결합성 분자, 및 면역자극 분자를 포함할 수 있다. 바람직한 면역자극 분자에는 예를 들어 Quil A, 콜레스테롤, GPI-0100, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA)가 포함된다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 제 조 방법을 제공한다. 본 발명에 따라서, 오일, 하나 이상의 계면활성제, 수성 성분, 및 유화액에 사용하기에 적합한 임의의 다른 성분을 비롯한, 상기 유화액의 다양한 성분들을 함께 혼합한다. 상기 혼합물에 1 차 유화 공정을 가하여 수중 유적형 유화액을 제조하고, 이어서 이를 미세유동화기에 통과시켜 직경이 1 마이크론 미만, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.5 마이크론 미만인 소적을 갖는 수중 유적형 유화액을 수득한다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상술한 항원 및 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 항원은 비본질적으로 또는 본질적으로, 바람직하게는 본질적으로 유화액 중에 혼입된다.

본 발명의 백신 조성물에 포함시킬 수 있는 항원은 세균, 진균 또는 바이러스 항원, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 항원은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 또는 바이러스 제제의 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태를 취할 수 있다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액과 배합된 항원 또는 항원들을 함유하는 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물의 제조에서, 항원(들)을 상기 수중 유적형 유화액의 성분들과 본질적으로(예를 들어 미세유동화 전에) 또는 비본질적으로(예를 들어 미세유동화 후에) 배합시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원을 수중 유적형 유화액의 성분들과 본질적으로 배합시킨다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상술한 미세 캡슐화된 항원과 마이크 론 이하의 수중 유적형 유화액을 함유하는 백신 조성물을 제공하며, 이때 상기 미세캡슐화된 항원을 상기 유화액과 비본질적으로 배합시킨다.

도 1은 미세유동화되지 않은 백신 조성물의 배치 제조 방법을 도시한다. 상기 방법에서 다양한 백신 성분들을 좌측에 있는 첨가 용기에 가하고 최종적으로 블렌드 용기에 펌핑하여 상기 용기에서 상기 성분들을 간단한 기계적 수단을 통해 함께 혼합시킨다.

도 2는 본질적으로 혼입된 항원을 함유하는 미세유동화된 백신 조성물의 제조 방법을 도시한다. 상기 다양한 백신 성분들을 상기 첨가 용기에 가하고 간단한 기계적 수단을 통해 혼합시키기 위해 예비-유화액 블렌딩 유닛으로 옮긴다. 이어서, 상기 유화액을 미세유동화기에 통과시키고 미세유동화-후 챔버에 수거한다.

도 3은 미세유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신, 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 및 벤치 블렌드 백신 제제의 소적 크기 분포를 도시한다.

도 4는 미세유동화된 백신 제제에서 상 분리의 부재를 나타낸다.

도 5는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제(A907505) 및 3 개의 대조군, 즉 유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제(A904369, A904370, 및 A904371) 중에 본질적으로 혼입된 항원들의 안정성 비교를 도시한다. 상기 4 개의 백신 제제는 모두 2 년 동안 4 ℃에서 보관되었다. 상기 보관 중 상 이한 시점들(0, 6, 12 또는 24 개월)에서, 4 개의 제형을 모두 사용하여 3 개월 된 소를 백신접종하였다. 백신접종은 제 0 일째 및 21 일째에 백신 용량 2 ㎖을 사용하여 수행하였으며 2 차 백신접종 2 주 후에 혈청들을 수거하였다. BVD 유형 II 바이러스에 대한 중화 항체 역가를 각각의 혈청 샘플에서 측정하였다. 상기 데이터를 5 마리의 동물들에 대한 기하 평균으로서 나타낸다.

도 6은 미세유동화된 백신 및 미세유동화되지 않은 백신의 투여 전 및 투여 후의 소의 최소 제곱 평균 직장 온도를 나타낸다. T01: 위약 그룹-단일 용량; T02: 위약 그룹-2 중 용량; T03: 미세유동화되지 않은 제형-단일 용량; T04: 미세유동화되지 않은 제형-이중 용량; T05: 미세유동화된 제형-단일 용량; T06: 미세유동화된 제형-이중 용량.

도 7은 미세유동화되지 않은 백신 제형 및 미세유동화된 백신 제형의 투여에 이어 소에서 관찰된 최소 제곱 평균 주입 부위 반응 부피를 도시한다. T03: 미세유동화되지 않은 제형-단일 용량; T04: 미세유동화되지 않은 제형-이중 용량; T05: 미세유동화된 제형-단일 용량; T06: 미세유동화된 제형-이중 용량.

도 8은 재조합 PauA 항원과 이 콜라이 전 세포 항원을 모두 함유하는 다양한 백신 제형을 접종한 후에 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis)로부터의 재조합 PauA 항원에 대한 기하 평균 IgG 역가를 도시한다.

도 9는 재조합 PauA 항원과 이 콜라이 전 세포 항원을 모두 함유하는 다양한 백신 제형을 접종한 후에 스트렙토코커스 유베리스로부터의 이 콜라이 전 항원에 대한 기하 평균 IgG 역가를 도시한다.

도 10A 및 10B는 생산 초기(도 10A) 및 생산 후 22 개월째(도 10B)의 미세유동화된 암피젠 제형의 입자 크기 분포를 나타낸다.

뜻밖에도, 본 발명자들에 의해, 레시틴과 무기 오일의 혼합물을 포함하는 수중 유적형 유화액으로 항원보강된 백신 제형의 미세유동화가 상기 백신 제형의 물리적 외관을 개선시킬 뿐만 아니라 상기 백신 제형의 면역 효과도 향상시킴이 발견되었다. 미세유동화된 백신 제형은 또한 개선된 안전성 프로파일을 특징으로 한다.

이러한 발견들을 근거로, 본 발명은 백신 조성물에서 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 제공한다. 미세유동화기를 사용하는 상기 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 제조 방법을 또한 제공한다. 더욱 또한, 본 발명은 항원이 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액과 배합된 마이크론 이하의 백신 조성물을 제공한다. 상기와 같은 백신 조성물의 제조 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액과 배합된 미세캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물 및 상기와 같은 백신의 제조 방법을 또한 제공한다.

내용의 명확성을 위해, 비제한적으로, 본 발명의 상세한 설명을 하기의 서브 섹션들로 나누어 본 발명의 몇몇 특징, 실시태양 또는 용도를 개시 또는 예시한다.

마이크론 이하의 수중 유적형 유화액

하나의 실시태양에서, 본 발명은 백신 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액 제형을 제공한다. 본 발명의 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 백신 조성물에서 항원의 면역원성을 향상시키며, 동물 투여에 안전하고, 보관 기간 동안 안정하다.

본 발명의 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 대사될 수 없는 오일, 하나 이상의 계면활성제, 및 수성 성분을 포함하며, 이때 상기 오일은 상기 수성 성분에 마이크론 이하 범위의 평균 오일 소적 크기로 분산된다.

"마이크론 이하"는 소적들이 1 ㎛(마이크론) 미만의 크기를 갖고 평균 오일 소적 크기가 1 ㎛ 미만임을 의미한다. 바람직하게는, 상기 유화액의 평균 소적 크기는 0.8 ㎛ 미만; 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만; 훨씬 더 바람직하게는 0.4 ㎛ 미만 또는 약 0.1 내지 0.3 ㎛이다.

"평균 소적 크기"는 입자 크기의 부피 분포 내의 부피 평균 직경(VMD) 입자 크기로서 정의된다. 상기 VMD는 각각의 입자 직경에 상기 크기의 모든 입자들의 부피를 곱하고 합하여 산출된다. 이어서 상기를 모든 입자의 전체 부피로 나눈다.

본 발명에 사용된 "대사될 수 없는 오일"이란 용어는 유화액이 투여되는 동물 환자의 신체에 의해 대사될 수 없는 오일을 지칭한다.

본 발명에 사용된 "동물" 및 "동물 환자"는 모든 비인간 동물, 예를 들어 소, 양 및 돼지를 지칭한다.

본 발명의 유화액에 사용하기에 적합한 대사될 수 없는 오일에는 알케인, 알켄, 알카인, 및 이들의 상응하는 산 및 알콜, 이들의 에터 및 에스터, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 상기 오일의 개별적인 화합물들은 가벼운 탄화수소 화합물, 즉 탄소수 6 내지 30의 상기와 같은 성분들이다. 상기 오일을 합성에 의해 제조하거나 또는 석유 산물로부터 정제할 수 있다. 본 발명의 유화액에 사용하기에 바람직한 대사될 수 없는 오일로는 예를 들어 무기 오일, 파라핀 오일, 및 사이클로파라핀이 있다.

"무기 오일"이란 용어는 증류 기법을 통해 석유로부터 수득된 액체 탄화수소들의 혼합물을 지칭한다. 상기 용어는 "액화된 파라핀", "액체 석유" 및 "유동 파라핀"과 동의어이다. 상기 용어는 또한 "무기 경유", 즉 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 비중이 유동 파라핀보다 약간 더 낮은 오일을 포함하고자 한다. 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, pg. 788 및 1323]을 참조하시오. 무기 오일을 다양한 성업적 출처, 예를 들어 제이 티 베이커(J.T. Baker, Phillipsburg, PA), USB 코포레이션(Cleveland, OH)으로부터 수득할 수 있다. 바람직한 무기 오일은 DRAKEOL(등록상표)이라는 이름으로 상업적으로 입수할 수 있는 무기 경유이다.

전형적으로는, 본 발명의 마이크론 이하의 유화액의 오일 성분은 1 내지 50 부피%; 바람직하게는 10 내지 45 부피%; 보다 바람직하게는 20 내지 40 부피%의 양으로 존재한다.

본 발명의 수중 유적형 유화액은 전형적으로 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제 및 유화제(이들 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다)는 오일 소적의 표면을 안정화시키고 상기 오일 소적들을 목적하는 크기 내에서 유지시키는 작용제이다.

본 발명의 유화액에 사용하기에 적합한 계면활성제로는 천연의 생물학적으로 적합한 계면활성제 및 비-천연 합성 계면활성제가 있다. 생물학적으로 적합한 계면활성제에는 인지질 화합물 또는 인지질들의 혼합물이 포함된다. 바람직한 인지질은 포스파티딜콜린(레시틴), 예를 들어 대두 또는 달걀 레시틴이다. 레시틴을 생 식물성 오일을 수 세척하고 생성된 수화된 검을 분리 및 건조시킴으로써 포스파타이드와 트라이글리세라이드의 혼합물로서 수득할 수 있다. 상기 혼합물을 아세톤 세척에 의해 상기 트라이글리세라이드와 식물성 오일을 제거한 후 남는 당지질과 아세톤 불용성 인지질로 분별시켜 정제된 생성물을 수득할 수 있다. 한편으로, 레시틴을 다양한 상업적 출처로부터 수득할 수 있다. 다른 적합한 인지질로는 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 카디오리핀, 및 포스파티딜에탄올아민이 있다. 상기 인지질들을 천연 공급원으로부터 단리시키거나 또는 통상적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 마이크론 이하의 유화액에 사용하기에 적합한 비천연 합성 계면활성제에는 솔비탄 기재 비이온성 계면활성제, 예를 들어 지방산 치환된 솔비탄 계면활성제(SPAN(등록상표) 또는 ARLACEL(등록상표)이라는 이름으로 상업적으로 입수할 수 있다), 폴리에톡실화된 솔비톨의 지방산 에스터(트윈(등록상표)), 피마자유와 같은 공급원으로부터의 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스터(EMULFOR); 폴리에톡실화된 지방산(예를 들어 SIMULSOL M-53이라는 이름으로 입수할 수 있는 스테아르산), 폴리에톡실화된 아이소옥틸페놀/폼알데하이드 중합체(TYLOXAPOL), 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에터(BRIJ(등록상표)); 폴리옥시에틸렌 논페닐 에터(TRITON(등록상표) N), 폴리옥시에틸렌 아이소옥틸페닐 에터(TRITON(등록상표) X)가 포함된다. 바람직한 합성 계면활성제는 SPAN(등록상표) 및 트윈(등록상표)이라는 이름으로 입수할 수 있는 계면활성제이다.

본 발명의 수중 유적형 유화액에 사용하기에 바람직한 계면활성제는 레시틴, 트윈-80 및 SPAN-80을 포함한다.

일반적으로 말하자면, 상기 계면활성제, 또는 계면활성제들의 조합(2 개 이상의 계면활성제가 사용되는 경우)은 상기 유화액 중에 0.01 내지 10 부피%, 바람직하게는 0.1 내지 6.0 부피%, 보다 바람직하게는 0.2 내지 5.0 부피%의 양으로 존재한다.

상기 수성 성분은 상기 유화액의 연속 상을 구성하며 물, 완충 염수 또는 임의의 다른 적합한 수용액일 수 있다.

본 발명의 수중 유적형 유화액은 적합하고 바람직한 추가 성분들, 예를 들어 보존제, 삼투제, 생체 결합성 분자, 및 면역자극 분자를 포함할 수 있다.

생체 결합성 분자는 표적 점막 표면상에 또는 상기를 통해 항원의 전달 및 부착을 향상시켜 점막 면역성을 부여할 수 있는 것으로 여겨진다. 적합한 생체 결합성 분자의 예로는 산성 비천연 중합체, 예를 들어 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산(예: CARBOPOL(등록상표), CARBOMER); 산성의 합성에 의해 변경된 천연 중합체, 예를 들어 카복시메틸셀룰로즈; 중성의 합성에 의해 변경된 천연 중합체, 예를 들어 (하이드록시프로필)메틸셀룰로즈; 염기성의 아민-함유 중합체, 예를 들어 키토산; 천연 공급원으로부터 수득할 수 있는 산성 중합체, 예를 들어 알긴산, 하이아루론산, 펙틴, 검 트라가칸트, 및 카라야 검; 및 중성의 비천연 중합체, 예를 들어 폴리비닐알콜; 또는 이들의 조합이 있다.

본 발명에 사용된 "면역자극 분자"란 어구는 백신 조성물 중의 항원 성분에 의해 유도되는 보호 면역 반응을 향상시키는 분자들을 지칭한다. 적합한 면역자극 분자로는 세균 세포벽 성분, 예를 들어 N-아세틸 뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민의 유도체, 예를 들어 뮤라뷰타이드, 트레오닐-MDP 및 뮤라밀 트라이펩타이드; 사포닌 글라이코사이드 및 이들의 유도체, 예를 들어 Quil A, QS 21 및 GPI-100; 콜레스테롤; 및 4 급 암모늄 화합물, 예를 들어 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA) 및 N,N-다이옥타데실-N,N-비스(2-하이드록시에틸)프로판다이아민("아브라이딘")이 있다.

사포닌은 광범위하게 다양한 식물 종들에서 2 차 대사산물로서 생성되는 글리코사이드 화합물이다. 사포닌의 화학 구조는 광범위한 약물학적 및 생물학적 활성, 예를 들어 일부 강력하고 효능 있는 면역학적 활성을 부여한다.

구조적으로, 사포닌은 하나 이상의 당 쇄에 부착된 임의의 아글리콘으로 이루어진다. 사포닌을 그의 아글리콘 조성에 따라 트라이터펜 글리코사이드, 스테로이드 글리코사이드 및 스테로이드 알칼로이드 글리코사이드로 분류할 수 있다.

사포닌을 퀼라자 사포나리아의 껍질로부터 단리할 수 있다. 사포닌은 오랫동안 면역자극제로서 알려져 왔다(Daisgaard, K. "구제역에 대한 소의 백신 접종에 있어서 특정한 적용 기준에 의한 항원보강 활성의 평가", Acta. Vet. Scand. 69:1-40, 1978). 사포닌을 함유하는 식물의 생 추출물은 구제역 백신의 효능을 향상시켰다. 그러나, 상기 생 추출물은 백신에 사용시 불리한 부작용들과 연관되었다. 이어서, 다이스가드(Daisgaard)는 상기 항원보강 활성 성분을 투석, 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피에 의해 사포닌으로부터 부분 정제하였다(Daisgaard, K. et al., "사포닌 항원보강제 III. 퀼라자 사포나리아 모리나로부터의 구제역 백신에서 항원보강 활성을 갖는 물질의 단리", Arch. Gesamte. Virusforsch. 44:243-254 1974). 이와 같은 방식으로 정제된 항원보강 활성 성분은 "Quil A"로서 공지되어 있다. 중량 기준으로 Quil A는 사포닌과 비교 시 증가된 효능과 감소된 국소 반응을 나타내었다. Quil A는 수의학 백신에 널리 사용되고 있다.

고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 Quil A의 추가적인 분석은 밀접하게 관련된 사포닌들의 이종 혼합물을 밝혀내었으며 감소되거나 최소인 독성을 갖는 효능 있는 항원보강제인 QS21을 발견해냈다(Kensil C.R. et al., "퀼라자 사포나리아 몰리나 피층으로부터 항원보강 활성을 갖는 사포닌의 분리 및 특성화", J. Immunol. 146:431-437, 1991). 대부분의 다른 면역자극제와 달리, QS21은 수용성이며 유화액 유형의 제형과 함께 또는 상기 없이 백신에 사용될 수 있다. QS21은 마우스에서 Th1 유형 반응을 유도하여 IgG2a 및 IgG2b 항체의 생산을 자극하는 것으로 입증되었으며 서브유닛 항원에 대한 반응에서 항원-특이적 CD8+ CTL(MHC 등급 I)을 유도하였다. 인간에서 임상 연구는 허용 가능한 독성 프로파일을 갖는 그의 항원보강성을 입증하였다(Kensil, C.R. et al., "백신 항원보강제 QS-21의 구조 및 면역학적 특성화. 백신 디자인에서: 서브유닛과 항원보강제 접근", Eds. Powell, M.F. and Newman, M.J. Plenum Publishing Corporation, New York. 1995, pp. 525-541).

미국 특허 제 6,080,725 호는 사포닌-친지성 접합체의 제조 및 사용 방법을 교시한다. 상기 사포닌-친지성 접합체에서, 지질, 지방산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 터펜 등의 친지성 잔기는 트라이터펜 사포닌의 3-O-글루쿠론산 상에 존재하는 카복시 그룹을 통해 비-아실화되거나 데스아실화된 트라이터펜 사포닌에 공유 결합된다. 퀼라자 데스아실사포닌, 류사이오사이드 P 등과 같은 사포닌 또는 깁소필라, 사포나리아 및 아칸토필륨으로부터의 사포닌의 3-O-글루쿠론산에 대한 친지성 잔기의 결합은 체액 및 세포 매개된 면역성에 대한 이들의 항원보강 효과를 향상시킨다. 또한, 비- 또는 데스아실사포닌의 3-O-글루쿠론산 잔기에 대한 친지성 잔기의 결합은 정제하기 보다 용이하고, 덜 독성이며 화학적으로 보다 안정이고, 원래의 사포닌과 같거나 이보다 양호한 항원보강 성질을 갖는 사포닌을 생성시킨다.

GPI-0100은 미국 특허 제 6,080,725 호에 개시된 사포닌-친지성 접합체이다. GPI-0100은 글루쿠론산의 카복실 그룹을 통해 데스아실사포닌에 지방족 아민을 첨가함으로써 생산된다.

4 급 암모늄 화합물-다수의 지방족 질소 염기들, 예를 들어 아민, 4 급 암모늄 화합물, 구아니딘, 벤즈아미딘 및 티오유로늄이 면역학적 항원보강제로서 사용이 제안되었다. 구체적인 상기와 같은 화합물로는 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA) 및 N,N-다이옥타데실-N,N-비스(2-하이드록시에틸)프로판다이아민("아브리다인")이 있다.

미국 특허 제 5,951,988 호는 오일 성분과 함께 DDA와 같은 4 급 암모늄 염을 함유하는 항원보강제 제형을 교시한다. 상기 제형은 공지된 면역학적 물질, 예를 들어 백신 조성물 중의 바이러스 또는 세균성 항원과 함께, 면역원 반응을 향상시키는데 유용하다. 상기 조성물은 또한 비특이적인 면역자극 제형으로서 혼입된 항원 없이도 유용하다.

미국 특허 제 4,310,550 호에는 백신 항원보강제로서 지방 또는 지질 유화액과 함께 제형화된 N,N-고급 알킬-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판다이아민 및 N,N-고급 알킬-자일릴렌다이아민의 용도가 개시되어 있다. 상기 항원 제형의 비경구 투여를 통해 인간 또는 동물에서 항원의 면역원 반응을 유도 또는 향상시키는 방법이 미국 특허 제 4,310,550 호에 개시되어 있다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 1 ㎛ 미만의 크기 및 약 0.25 ㎛의 평균 소적 크기의 소적들을 갖는 암피젠(등록상표) 제형을 포함하는 백신 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 제공한다.

본 발명에 사용된 "암피젠(등록상표) 제형"이란 용어는 DRAKEOL(등록상표) 레시틴 오일 용액(Hydronics, Lincoln, NE)을 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80의 존재 하에서 염수 용액과 혼합함으로써 형성된 용액을 지칭한다. 전형적인 암피젠(등록상표) 제형은 40 부피%(v/v)의 무기 경유, 약 25% w/v의 레시틴, 및 약 0.18 부피%(v/v)의 트윈 80 및 약 0.08 부피%(v/v)의 Span 80을 함유한다.

마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 제조

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 개시된 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따라, 오일, 하나 이상의 계면활성제, 수성 성분 및 유화액에 사용하기 적합한 임의의 다른 성분을 포함한, 상기 유화액의 다양한 성분들을 배합하고 함께 혼합한다.

형성된 혼합물에, 전형적으로는 하나 이상의 균질화기 또는 유화기에 1 회 이상 통과시킴으로써 유화 공정을 가하여 균일한 외관 및 약 0.5 ㎛의 평균 소적 크기를 갖는 수중 유적형 유화액을 제조한다. 임의의 상업적으로 입수할 수 있는 균질화기 또는 유화기, 예를 들어 로스(Ross) 유화기(Hauppauge, NY), 가울린(Gaulin) 균질화기(Everett, MA)를 상기 목적에 사용할 수 있다.

이어서 상기와 같이 제조된 유화액을 미세유동화시켜 소적 크기를 마이크론 이하 범위로 만든다. 미세유동화는 상업적인 미세유동화기, 예를 들어 모델 번호 110Y(Microfluidics, Newton, Mass로부터 입수할 수 있음), 가울린 모델 30CD(Gaulin, Inc., Everett, Mass.); 및 레이니 미니랩(Rainnie Minilab) 유형 8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 미세유동화기들은 유체를 고압 하에서 작은 구멍을 통해 강제로 밀어넣어 2 개의 유체 스트림이 상호작용 챔버에서 고속으로 상호작용하여 마이크론 이하 크기의 소적들을 갖는 유화액을 형성시킴으로써 작동한다.

소적 크기를 당해 분야에 공지된 다양한 방법들, 예를 들어 상업적으로 입수할 수 있는 크기 측정 장치를 사용하여, 레이저 회절에 의해 측정할 수 있다. 상기 크기는 사용되는 계면활성제의 유형, 계면활성제 대 오일의 비, 작동 압력, 온도 등에 따라 변할 수 있다. 숙련가는 과도한 실험 없이도 목적하는 소적 크기를 갖는 유화액을 수득하기 위해서 상기 변수들의 목적하는 조합을 결정할 수 있다. 본 발명 유화액의 소적들은 직경이 1 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.8 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 0.3 ㎛ 미만이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 하이드로닉스(Hydronics, Lincoln, NE)로부터 상업적으로 입수할 수 있고 무기 경유 중 25% 레시틴을 함유하는 DRAKEOL 레시틴 오일 용액을 배합하고 염수뿐만 아니라 계면활성제 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80과 혼합시켜 "암피젠(등록상표) 용액" 또는 "암피젠(등록상표) 제형"을 제조한다. 이어서 상기 AMPHGEN(등록상표) 용액을 로스(등록상표)(Hauppauge, NY 11788) 유화기로 대략 3400 rpm에서 유화시켜 수중 유적형 유화액을 제조한다. 이어서 상기 유화액을 약 4500±500 psi에서 작동하는 미세유동화기에 1 회 통과시킨다. 상기 미세유동화된 수중 유적형 유화액은 1 ㎛ 미만의 소적 크기 및 약 0.25 ㎛의 평균 소적 크기를 갖는다.

마이크론 이하의 수중 유적형 유화액에 혼입된 항원을 함유하는 백신 조성물

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상술한 항원(들) 및 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 향상된 면역원 효과 및 개선된 물리적 외관(예를 들어 연장된 보관 기간 후에 상 분리가 관찰되지 않는다)을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 동물 투여에 안전하다.

본 발명에 따라, 항원을 유화액과 비본질적으로 또는 바람직하게는 본질적으로 배합시킬 수 있다. "본질적으로"란 용어는 항원을 미세유동화 단계 전에 유화액 성분들과 배합하는 과정을 지칭한다. "비 본질적으로"란 용어는 유화액을 미세유동화시킨 후에 항원을 상기 유화액에 가하는 과정을 지칭한다. 상기 비본질적으로 첨가된 항원은 자유 항원이거나 또는 본 원에서 추후 개시하는 바와 같이 미세입자로 캡슐화될 수 있다.

본 발명에 사용된 "항원"이란 용어는 동물에서 면역원성이고 백신 조성물에 포함되어 상기 백신 조성물이 투여되는 동물에서 보호 면역 반응을 유도하는 임의의 분자, 화합물 또는 조성물을 지칭한다.

항원과 관련하여 사용된 "면역원성"이란 용어는 항원이 동물에서 상기 항원에 대한 면역 반응을 유발시키는 능력을 지칭한다. 상기 면역 반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역 반응, 또는 주로 헬퍼 T-세포에 의해 매개되는 체액 면역 반응일 수 있으며, 이는 차례로 B-세포를 활성화시켜 항체가 생산되게 한다.

"보호성 면역 반응"은 동물에서 일어나는 임의의 면역 반응, 항체 또는 세포 매개된 면역 반응, 또는 이들 모든 사건을 방지 또는 검출 가능하게 감소시키거나, 또는 항원 또는 상기 항원을 함유하는 병원균에 의해 야기되는 질환 또는 질병의 중증도를 제거 또는 검출 가능하게 감소시키거나 상기 질환 또는 질병의 진행 속도를 검출 가능하게 늦추는 상기 사건들로서 정의된다.

본 발명의 백신 조성물에 포함시킬 수 있는 항원으로는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의, 마이코플라스마 하이포뉴모니아에, 해모필루스 솜누스, 해모필루스 파라수이스, 보르데텔라 브론치셉티카, 액티노바실러스 플레우로뉴모니아에, 파스테우렐라 뮬토시다, 만헤이미아 헤몰리티카, 마이코플라스마 보비스, 마이코플라스마 갈라나시에움, 마이코박테륨 보비스, 마이코박테륨 파라튜베르큘로시스, 클로스트리디알 스페시즈, 스트렙토코커스 유베리스, 스트렙토코커스 수이스, 스타필로코커스 아우레우스, 에리시펠로트릭스 루소파티아에, 캄필로박터 스페시즈, 퓨소박테륨 네크로포룸, 에스케리키아 콜라이, 살로넬라 엔테리카 세로바르스, 렙토스피라 스페시즈와 같은 병원성 세균; 칸디다와 같은 병원성 진균; 크립토스포리듐 파르븀, 네오스포라 카늄, 톡소플라스마 곤디, 에이메리아 스페시즈와 같은 원생동물; 오스테르타지아, 쿠페리아, 헤몬큐스, 파시올라와 같은 장내 기생충으로부터 제조된 항원이 있다. 추가적인 항원에는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의, 소 헤르페스바이러스-1,3,6, 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 유형 1 및 2, 소 파라인플루엔자 바이러스, 소 호흡기 합포체 바이러스, 소 백혈증 바이러스, 린더페스트 바이러스, 구제역 바이러스, 광견병, 돼지 열 바이러스, 아프리카 돼지 열 바이러스, 돼지 파르보바이러스, PRRS 바이러스, 돼지 써코바이러스, 인플루엔자 바이러스, 돼지 잔물집병 바이러스, 테첸열 바이러스, 의사광견병 바이러스 등의 병원성 바이러스가 포함된다.

상기 항원의 양은 상기 항원이 수중 유적형 유화액과 함께 동물에서 보호 면역 반응을 유도하기에 유효해야 하는 양이다. 유효하게 되는 항원의 정확한 양은 상기 항원의 성질, 활성 및 순도에 따라 변하며, 당해 분야의 숙련가에 의해 측정될 수 있다.

상기 백신 조성물 중에 존재하는 수중 유적형 유화액의 양은 상기 백신 조성물 중의 항원(들)의 면역원성을 강화하기에 충분해야 한다. 바람직하고 적합한 경우, 추가량의 계면활성제(들) 또는 추가적인 계면활성제(들)를 상기 수중 유적형 유화액에 의해 제공되는 계면활성제(들) 이외에 상기 백신 조성물에 가할 수 있다. 일반적으로 말하자면, 상기 오일 성분은 백신 조성물의 최종 부피 중에 1.0 내지 20 부피%; 바람직하게는 1.0 내지 10 부피%; 보다 바람직하게는 2.0 내지 5.0 부피%의 양으로 존재한다. 상기 계면활성제, 또는 계면활성제들의 조합(2 개 이상의 계면활성제가 사용되는 경우)은 상기 백신 조성물의 최종 부피 중에 0.1 내지 20 부피%, 바람직하게는 0.15 내지 10 부피%, 보다 바람직하게는 0.2 내지 6.0 부피%의 양으로 존재한다.

상기 항원(들) 및 수중 유적형 유화액 이외에, 상기 백신 조성물은 적합하고 바람직한 다른 성분들, 예를 들어 상기 수중 유적형 유화액과 과련하여 개시한 바와 같은 보존제, 삼투제, 생체 결합성 분자 및 면역자극 분자(예를 들어 Quil A, 콜레스테롤, GPI-0100, 다이메틸다이옥타데실암모늄 브로마이드(DDA))를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 희석제는 물, 염수, 덱스트로즈, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장성 작용제는 특히 염화 나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토오즈를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 크기가 1 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.8 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.5 ㎛인 소적들을 갖는 수중 유적형 유화액에 본질적으로 혼입된 BVDV 유형 I 및 BVDV 유형 II 항원 중 하나 이상을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 BVDV 유형 I 및/또는 II 항원은 바람직하게는 불활성화된 바이러스 제제의 형태이다. 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 바람직하게는 암피젠(등록상표) 제형(즉 무기 경유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80을 함유하는 제형)을 포함한다. 상기 백신 조성물은 바람직하게는 또한 Quil-A, 콜레스테롤 및 티메로솔을 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 수중 유적형 유화액 중에 렙토스피라 항원 및 BVDV 유형 I 및 BVDV 유형 II 항원 중 하나 이상을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 항원은 바람직하게는 불활성화된 세포 또는 바이러스 제제의 형태로 크기가 1 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.8 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.5 ㎛인 소적들을 갖는 수중 유적형 유화액에 본질적으로 혼입된다. 상기 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 바람직하게는 암피젠(등록상표) 제형(즉 무기 경유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80을 함유하는 제형)을 포함한다. 상기 백신 조성물은 바람직하게는 또한 Quil-A, 콜레스테롤, DDA, GPI-100 및 수산화 알루미늄(AlOH) 중에서 선택된 하나 이상의 면역자극 분자를 포함한다.

더욱 또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 수중 유적형 유화액 중에 하나 이상의 세균성 항원, 예를 들어 재조합 스트렙토코커스 유베리스 PauA 단백질 또는 이 콜라이의 세포 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 항원(들)을 크기가 1 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.8 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.25 ㎛인 소적들을 갖는 수중 유적형 유화액과 본질적으로 배합시킨다. 상기 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액은 바람직하게는 암피젠(등록상표) 제형(즉 무기 경유, 레시틴, 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80을 함유하는 제형)을 포함한다. 상기 백신 조성물은 바람직하게는 또한 Quil-A, DDA 및 GPI-100 중에서 선택된 하나 이상의 면역자극 분자를 포함한다.

본 발명의 백신 조성물을 공지된 경로, 예를 들어 경구, 비 내, 점막, 국소, 경피, 및 비경구(예를 들어 정맥 내, 복강 내, 피 내, 피하 또는 근육 내) 경로에 의해 동물에게 투여할 수 있다. 투여를 경로들의 조합, 예를 들어 먼저 비경구 경로를 사용하여 투여하고 이어서 점막 경로를 사용하여 투여하는 조합을 사용하여 수행할 수 있다.

백신 조성물의 제조 방법

추가의 실시태양에서, 본 발명은 항원 또는 항원들 및 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 함유하는 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물의 제조에서, 상기 항원(들)을 상기 수중 유적형 유화액의 성분들과 본질적으로 또는 비본질적으로 배합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원을 상기 수중 유적형 유화액의 성분들과 본질적으로 배합한다.

상기 항원을 상기 유화액의 다양한 성분들, 예를 들어 오일, 하나 이상의 계면활성제, 수성 성분 및 임의의 다른 적합한 성분과 배합시켜 혼합물을 제조할 수 있다. 상기 혼합물에, 전형적으로는 하나 이상의 균질화기 또는 유화기를 통해 1 회 이상 통과시킴으로써 1 차 블렌딩 공정을 가하여 상기 항원을 함유하는 수중 유적형 유화액을 제조한다. 임의의 상업적으로 입수할 수 있는 균질화기 또는 유화제, 예를 들어 로스 유화기(Hauppauge, NY), 가울린 균질화기(Everett, MA) 또는 마이크로플루이딕스(Microfluidics, Newton, MA)를 상기 목적에 사용할 수 있다. 한편으로, 오일, 하나 이상의 계면활성제 및 수성 성분을 포함한, 상기 유화액 항원보강제의 다양한 성분들을 균질화기 또는 유화기를 사용하여 먼저 배합하여 수중 유적형 유화액을 제조할 수 있으며, 이어서 항원을 상기 유화액에 가한다. 상기 1 차 블렌딩 후 수중 유적형 유화액의 평균 소적 크기는 대략 1.0 내지 1.2 마이크론이다.

이어서 상기 항원을 함유하는 유화액을 미세유동화시켜 소적 크기를 마이크론 이하 범위로 만든다. 미세유동화는 상업적인 미세유동화기, 예를 들어 모델 번호 110Y(Microfluidics, Newton, Mass로부터 입수할 수 있음), 가울린 모델 30CD(Gaulin, Inc., Everett, Mass.); 및 레이니 미니랩(Rainnie Minilab) 유형 8.30H(Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.)를 사용하여 수행할 수 있다.

소적 크기를 당해 분야에 공지된 다양한 방법들, 예를 들어 상업적으로 입수할 수 있는 크기 측정 장치를 사용하여, 레이저 회절에 의해 측정할 수 있다. 상기 크기는 사용되는 계면활성제의 유형, 계면활성제 대 오일의 비, 작동 압력, 온도 등에 따라 변할 수 있다. 목적하는 소적 크기를 갖는 유화액을 수득하기 위해서 상기 변수들의 목적하는 조합을 결정할 수 있다. 본 발명 유화액의 소적들은 직경이 1 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 평균 소적 크기가 0.8 ㎛ 미만, 보다 바람직하게는 0.5 ㎛ 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.1 내지 0.3 ㎛ 미만이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 무기 경유 중 25% 레시틴을 함유하는 DRAKEOL(등록상표) 레시틴 오일 용액을 배합하고 계면활성제 트윈(등록상표) 80 및 SPAN(등록상표) 80 및 염수 용액과 혼합시켜 40% 무기 경유, 레시틴, 0.18% 트윈(등록상표) 80 및 0.08% SPAN(등록상표) 80을 함유하는 혼합물을 제조한다. 이어서 상기 혼합물을 로스(등록상표)(Hauppauge, NY 11788) 유화기로 대략 3400 rpm에서 유화시켜 "암피젠(등록상표) 제형" 또는 "암피젠(등록상표) 용액"이라고도 칭하는 유화액 생성물을 제조한다. 이어서 목적하는 항원(들)을 유화기, 예를 들어 로스 유화기를 사용하여 암피젠(등록상표) 용액 및 임의의 다른 적합한 성분(예를 들어 면역자극 분자)과 배합시켜 상기 항원(들)을 함유하는 수중 유적형 유화액을 제조한다. 상기 유화액을 약 10000±500 psi에서 작동하는 미세유동화기에 1 회 통과시킨다. 상기 미세유동화된 수중 유적형 유화액은 1 ㎛ 미만의 소적 크기 및 약 0.25 ㎛의 평균 소적 크기를 갖는다.

마이크론 이하의 수중 유적형 유화액 중에 미세캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물 및 제조 방법

더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 미세입자로 캡슐화된 항원(또는 "미세캡슐화된 항원")을 함유하는 백신 조성물을 제공하며, 이때 상기 미세캡슐화된 항원은 상술한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액에 비본질적으로 혼입된다.

항원을 미립자 담체 중에 흡수 또는 포집하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[약학적 미립자 담체: 치료 용도(Justin Hanes, Masatoshi Chiba and Robert Langer. 백신 전달용 중합체 미소구. In: 백신 디자인. 서브유닛과 항원보강제 접근법. Eds. Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, New York and London]을 참조하시오. 미립자 담체는 동물 환자의 면역 체계에 소정 항원의 다수개의 사본을 제공하고 국소 림프절 중의 항원의 포집 및 유지를 증진시킬 수 있다. 입자들은 대식세포에 의해 포식되고 사이토카인 방출을 통해 항원 제공을 향상시킬 수 있다. 미립자 담체가 또한 당해 분야에 개시되었으며 여기에는 예를 들어 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체로부터 유도된 것뿐만 아니라 폴리(락타이드) 및 폴리(락타이드-코-글리코라이드)(PLG로서 공지됨)로부터 유도된 것들이 포함된다. 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체는 비생분해성인 반면 PLG 입자는 에스터 결합의 랜덤한 비-효소 가수분해에 의해 락트산 및 글리콜산으로 생분해될 수 있으며, 상기 산들은 통상적인 대사 경로를 따라 배설된다.

생분해성 미소구를 또한 백신의 조절된 방출을 달성하기 위해 사용하였다. 예를 들어, 연장된 기간에 걸친 항원의 연속 방출을 달성할 수 있다. 상기 중합체의 분자량 및 상기 중합체 중의 락트산 대 글리콜산의 비에 따라, PLGA 중합체는 수일 또는 수주 내지 수 개월 또는 수년의 가수분해 속도를 가질 수 있다. 느린, 조절된 방출은 수회 주입 후 관찰되는 것과 유사한 높은 수준의 항체를 형성시킬 수 있다. 한편으로, 백신 항원의 박동성 방출을 상이한 가수분해 속도를 갖는 중합체를 선택함으로써 성취할 수 있다. 중합체의 가수분해 속도는 전형적으로는 상기 중합체의 분자량 및 상기 중합체 중의 락트산 대 글리콜산의 비에 따라 변한다. 가변적인 항원 방출 속도를 갖는 2 개 이상의 상이한 중합체로부터 제조된 미세입자는 박동치는 항원 방출을 제공하며 백신 접종의 수회-용량 섭생을 모방한다.

본 발명에 따라, 상술한 것들 중 임의의 것을 포함하는 항원을 당해 분야에 공지된 임의의 과정(예를 들어 실시예 17에 예시된 과정)을 사용하여 미립자 중합체 담체, 바람직하게는 PLG 중합체에 흡수시켜 미세캡슐화된 항원 제제를 제조할 수 있다. 이어서 상기 미세캡슐화된 항원 제제를, 상술한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액과 혼합하여 상기 유화액 중에 분산시켜 백신 조성물을 제조한다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 PLG 중합체로 캡슐화된 항원을 함유하는 백신 조성물을 제공하며, 이때 상기 미세캡슐화된 항원을 무기 경유, 레시틴, 트윈80, SPAN80 및 염수를 포함하고 1.0 ㎛ 미만의 평균 소적 크기를 갖는 미세유동화된 수중 유적형 유화액에 비본질적으로 분산시킨다.

본 발명을 수행하기 위한 특정 실시태양들의 실시예를 하기에 개시한다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 하지 않는다.

실시예 1

암피젠(등록상표) 제형의 제조

암피젠(등록상표) 제형을 2 단계 공정으로 제조하였다. 첫 번째 단계에서, 80 리터의 드라케올(Drakeol) 레시틴 오일 용액, 116 리터의 파상풍 변성독소, 1.2 리터의 SPAN80 및 2.8 리터의 트윈80을 함께 혼합하고 로스 유화기를 사용하여 유화시켰다. 상기 드라케올 레시틴 오일 용액은 25% 대두 레시틴과 75% 무기 오일을 함유하였다. 유화된 생성물을 최소 5 부피에 대해 또는 최소 10 분 동안 로스 유화기를 통해 재순환시켰다. 상기 유화된 생성물을 추가의 가공을 위해 2 내지 7 ℃에서 최대 24 시간 동안 보관하였다. 상기 로스 유화기 탱크로부터의 유화액을 가울린 균질화기로 옮기고 4500 psi의 압력 하에서 20 분 동안 균질화시켰다. 이어서 생성된 40% 드라케올 레시틴 오일 용액(이후부터 "암피젠(등록상표) 제형" 또는 "암피젠(등록상표) 용액")을 멸균 폴리프로필렌 카복시 용기에 분배하였다. 상기 분배를 등급 10,000 조절된 환경 하에 배치된 등급 100 분배 후드 내부에서 수행하였다. 상기 용기를 2 내지 7 ℃에서 보관하였다. 상기 암피젠(등록상표) 제형을 달리 나타내지 않는 한 하기 개시하는 실험들에 사용하였다.

실시예 2

BVD 백신의 플래시블렌드 균질화에 의한 1 차 블렌딩

본 균질화 공정에 사용되는 장치를 도 1에 나타낸다. 무균 기법 또는 증기 교차 밸브를 사용하여, BVD 유형 I 항원(불활성화된 BVD 유형 I 바이러스 제제)을 함유하는 병을 블렌드 용기상의 바닥면 증기구에 부착시켰다. 필요한 부피의 BVD 유형 I 항원의 전달을 완료한 후에, 상기 BVD 유형 I 병을 불활성화된 BVD 유형 II 바이러스 제제(불활성화된 BVD 유형 II 바이러스 제제)를 함유하는 병으로 대체시켰다. 필요량의 BVD 유형 II 항원 전달을 완료한 후에, 로스 균질화기를 휴대용 용기에 부착시키고 최대 RPM(3300 rpm)에서 재순환을 개시시켰다. 용기 교반을 중간 속도로 유지시켰다.

무균 기법 또는 증기 교차 밸브를 사용하여, Quil-A를 50 ㎎/㎖ 농도로 함유하는 병을 블렌드 용기상의 균질화기 직렬 증기구에 부착시켰다. 필요량의 Quil-A 용액을 라인 흡입을 통해 상기 용기에 통과시켰다. Quil-A 용액의 전달을 완료한 후에, 상기 병을 제거하였다. 같은 방식으로, 필요량의 에탄올 용액 중의 콜레스테롤(18 ㎎/㎖)을 블렌드 용기로 옮겼다. 이어서, 필요량의 암피젠(등록상표), 10% 티메로솔 용액 및 기본 변경된 이글 배지("BME") 증량제 용액을 상기 블렌드 용기에 가하였다.

일단 모든 첨가가 완료되었으면, 추가로 15 분 동안 혼합을 계속한다. 생성된 제형을 2 ㎖ 용량으로 나누었으며 상기 제형은 비-미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 BVD 백신을 나타내었다. 각 용량의 백신은 500 ㎍의 Quil-A, 500 ㎍의 콜레스테롤, 2.5% 암피젠(등록상표) 제형 및 0.009% 티메로솔을 함유하였다. 상기 두 상이한 BVD 균주에 대한 항원 농도를 gp53에 대한 ELISA 역가의 항으로 측 정하였다.

실시예 3

미세유동화에 의한 2 차 블렌딩

도 2는 미세유동화를 통한 2 차 블렌딩에 사용되는 공정을 예시한다. 미세유동화기는 증기 살균되었다. 먼저 보조 가공 모듈 챔버를 상기 유닛에 장치하고 블랭크 챔버를 2 차 챔버 위치에 장치하였다. 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 충분히 항원보강된 BVD 백신을 함유하는 용기를, 공급 용기 배수 밸브에서부터 미세유동화기 유입구까지 전달 라인을 부착시킴으로써 미세유동화기에 연결시켰다. 질소 기체를 공급 용기 공기 필터 유입구에 연결시키고 용기 압력 세팅을 20 +/- 5 PSI로 조절하였다. 수거 용기 배수 밸브를 유동화기 유출구로부터의 전달 라인에 연결시켰다. 모든 필요한 연결을 이룬 후에, 밸브들을 개방하고 미세유동화를 10,000 +/- 500 PSI의 작동 압력에서 개시시켰다. 백신의 전체 함량을 상기 유동화기에 1 회 통과시키고 미세유동화-후 챔버에 수거하였다. 상기 제제를 2 ㎖ 용량으로 나누었으며 이는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 BVD 백신을 나타내었다.

실시예 4

벤치 블렌드를 통한 백신 조성물의 제조

실시예 1에 개시된 바와 같이 제조된 암피젠(등록상표) 제형을 BVD 항원 및 증량제를 첨가하여 2.5%로 희석하였다. 생성 용액을 균질화기 대산에 교반 봉을 사용하여 벤치에서 블렌딩하였다. 최종 제제는 하기의 조성을 함유하였다: BVD 유 형 1 및 유형 2 항원, 2.5% 암피젠(등록상표) 제형(실시예 1에 개시한 바와 같이, 오일, 레시틴, SPAN(등록상표) 및 트윈(등록상표)을 함유한다), 및 염수. 트윈 80 및 SPAN 80은 최종 백신 제제 중에 각각 0.18 및 0.08 부피%로 존재한다.

실시예 5

미세유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제와 미세유동화된 것 사이의 소적 크기 분포 비교

실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 미세유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신, 실시예 3에 개시된 바와 같이 제조된 미세유동화된 암피젠(등록상표) 및 실시예 4에 개시된 바와 같이 벤치 블렌드를 통해 제조된 제제를 사용하여 백신 제제들의 소적 크기를 비교하였다. 각 제제로부터 2 ㎖의 샘플을 멜버른 2000 레이저 회절 미터에 가하고 소적 크기 분포를 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 결과는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제가 대략 0.1 마이크론의 최대 입자 부피를 갖는 반면 미세유동화되지 않은 AMPHIGN(등록상표) 제형-기재 백신 제제는 대략 1 마이크론의 최대 입자 분포 부피를 가짐을 가리킨다.

실시예 6

백신 상 분리의 감소

3 개의 상이한 백신 제제, 즉 실시예 2에 개시된 바와 같이 제조된 미세유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신, 실시예 3에 개시된 바와 같이 제조된 미세유동화된 암피젠(등록상표) 및 실시예 4에 개시된 바와 같이 벤치 블렌드를 통해 제조된 제제를 차례로 비교하여 장기 보관 시 그들의 상 분리 성질을 측정하였다. 이들 제제를 모두 4 ℃에서 약 1 개월 동안 정치시켰으며 상 분리를 백신 제제 상단의 크림층의 외관에 관하여 모니터하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 다른 2 개의 제제와 비교 시 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 제제에서 상 분리는 없었다.

실시예 7

소 바이러스성 설사 바이러스에 대한 미세유동화 및 미세유동화되지 않은 소 백신의 제조

소 바이러스성 설사 바이러스 항원을 미세유동화를 통해 암피젠(등로상표) 제형에 본질적으로 혼입시켰다. "본질적으로 혼입된"이란 용어는 항원을 미세유동화 전에 암피젠(등록상표) 제형에 가하는 공정을 지칭한다. 상기 항원에 항원보강제 제형의 성분들과 함께 미세유동화 공정의 물리적인 힘을 가하였다. 대조용의 미세유동화되지 않은 그룹에서, 상기 항원 제제를 블렌딩을 통해 암피젠(등록상표) 제형에 분산시켰다.

상기 대조용 및 미세유동화된 제제의 최종 조성은 하기와 같다: gp53에 대해 2535 RU/용량의 후-불활성화 ELISA 역가를 갖는 BVD 유형 I, gp53에 대해 3290 RU/용량의 후-불활성화 ELISA 역가를 갖는 BVD 유형 II, 1.25 ㎎/용량 농도의 Quil-A, 1.25 ㎎/용량 농도의 콜레스테롤, 2.5% 최종 농도의 암피젠(등록상표), 및 0.009% 최종 농도의 티메로솔. 백신 용량은 5 ㎖이었다.

실시예 8

미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제에 본질적으로 혼입된 BVD 바이러스 항원의 장기 안정성

본 실험을 장기적인 보관 동안 본질적으로 혼입된 항원의 안정성을 측정하기 위해 수행하였다. 죽은 BVD 유형 II 바이러스 항원을 미세유동화 공정 중에 암피젠(등록상표) 제형에 본질적으로 혼입시켜 미세유동화된 백신 제제(A907505)를 수득하였다. 미세유동화되지 않은 암피젠(등록상표) 제형 중에 동일한 항원을 함유하는 3 개의 다른 백신 제제(A904369, A904370 및 A904371)를 대조군으로 사용하였다. 미세유동화되지 않은 제제에서, 상기 항원을 암피젠(등록상표) 제형과 혼합하고 로스 균질화기를 사용하여 블렌딩을 통해 혼합하였다. 4 개의 백신 제제를 모두 2 년 동안 4 ℃에서 보관하였다. 보관 기간 동안 상이한 시점들에서(0, 6, 12 또는 24 개월), 4 개의 제형을 모두 사용하여 3 개월 된 소를 백신 접종하였다.

0 일 및 21 일째에, 3 개월 된 소를 2 ㎖ 백신 제형을 사용하여 피하 경로를 통해 백신 접종하였다. 상기 백신 접종된 동물의 혈청을 35 일째에 수거하고, 상기 백신에 대한 혈청 반응을 BVDV-E2 ELISA를 통해 항체 역가의 항으로 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 미세유동화된 백신 제제는 시험된 시점들 모두에서(0, 6, 12 및 24 개월) 보다 높은 항체 역가를 보였으며, 이는 상기 항원 제제의 안정성이 미세유동화된 공정 동안 상기 항원의 본질적인 혼입 중에 상실되지 않음을 암시한다. 더욱이, 또한 놀랍게도 상기 미세유동화된 백신 제제가 모든 시점에서 향상된 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 9

미세유동화 후 백신 유발된 직장 온도 증가의 감소

실시예 7에 개시된 바와 같이 제조된 미세유동화 및 미세유동화되지 않은 백신 제제들을 사용하여 0 일째에 가축을 백신 접종하고 백신 접종 하루 전부터 백신 접종 후 4 일까지의 기간 동안 직장 온도를 모니터하였다. 백신 용량은 2 ㎖이었다. 상기 그룹들을 단일 또는 2 회 용량의 백신으로 백신 접종하였다. 직장 온도를 측정하고 제 -1 일에서부터 제 4 일까지 매일 기록하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 결과는 단일 또는 2 회 용량의 미세유동화되지 않은 백신 제형을 접종한 동물들에서 백신 접종 후 약 24 시간 동안 직장 온도가 가파르게 상승하였음을 가리킨다. 그러나, 미세유동화된 형태의 백신을 접종한 동물들에서, 상기 백신 접종에 이은 직장 온도 상승은 단지 미미할 뿐이며 미세유동화되지 않은 제형을 접종한 동물들에서보다 현저하게 더 낮다(도 6).

실시예 10

미세유동화된 백신 제형 접종 시 주입 부위 반응 부피가 보다 빠르게 분해되었다

실시예 7에 개시된 바와 같이 제조된 미세유도화 및 미세유동화되지 않은 백신 제제를 사용하여 0 일째에 가축을 백신 접종하였다. 본 연구에 포함된 동물들은 잡종 육우였다. 위약 처리군(T01 및 T02) 각각에 3 마리의 동물이 존재하였다. 그룹 T03 내지 T06 각각에는 6 마리의 동물들이 존재하였다. 백신 용량은 2 ㎖이었으며 상기 그룹들을 0 일째에 1 회 또는 2 회 용량의 백신으로 접종하였다. 0 일째에, 시험 제품을 우측 목에 투여하였다. 2 회 용량(4 ㎖)의 상기 시험 제품 (T02, T04 및 T06)을 투여한 동물들에게 한쪽에 1 회 주입으로서 총 2 회 용량을 제공하였다. 주입 부위에서의 반응 크기의 평가를 포함한, 주입 부위의 관찰을 제 0 일 내지 제 4 일, 및 제 6, 9 및 14 일에 목 우측에 대해 수행하였다. 0 일째에, 시험 제품을 투여하기에 앞서 주입 부위를 관찰하였다. 1 회 또는 2 회 용량의 위약을 백신 접종한 그룹들은 주입 부위 반응 부피의 어떠한 현저한 증가도 나타내지 않았으며 따라서 데이터를 도 7에 나타내지 않는다. 미세유동화되지 않은 백신 제형의 경우에 1 회 용량과 2 회 용량 백신 접종 사이에 주입 부위 반응 부피의 비례적인 증가가 있었다. 다른 한편으로, 미세유동화된 백신 제형의 경우, 단일 용량이 보다 큰 주입 부위 반응 부피를 유발시켰지만, 2 회 용량의 주입은 어떠한 추가적인 증가도 유발시키지 않았다. 더욱이, 미세유동화된 백신 제형을 주입한 동물의 경우에, 주입 부위 반응 부위 부피는 미세유동화되지 않은 백신 제형을 주입한 동물에 비해 보다 빠르게 분해되었다. 상기 결과를 도 7에 나타낸다.

실시예 11

본질적으로 혼입된 BVD 바이러스 및 렙토스피라 항원 및 Quil A 및 DDA와 같은 면역자극 분자를 갖는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제의 제조

포르말린-불활성화된 렙토스피라 하르죠-보비스 균주 CSL을 약 1.4 x 10⁹ 유기체/5 ㎖ 용량의 직접 카운트로 적합한 항원보강제로 제형화하였다. 포르말린-불활성화된 렙토스피라 포모나 균주 T62를 약 2400 네팔로머(Nephalomeric) 단위/5 ㎖ 용량으로 제형화하였다. 네팔로머 단위를 예비 처리한 발효 유체의 네팔로머 측정을 근거로 계산하였다. BVD 바이러스 유형 1을 약 3000 상대 단위/5 ㎖ 용량의 E2 ELISA 역가로 제형화하였다. BVD 바이러스 유형 2를 약 3500 상대 단위/5 ㎖ 용량의 E2 ELISA 역가로 제형화하였다. 상기 상대 단위는 예비 조립 후-불활성화 벌크 유체의 E2 ELISA 역가를 근거로 계산되었다. Quil-A 및 콜레스테롤을 용량당 5 ㎎의 농도로 사용하였다. 티메로솔 및 암피젠(등록상표) 제형을 각각 0.009% 및 2.5%의 최종 농도로 사용하였다. 수산화 알루미늄(Rehydragel LV)을 2.0%의 최종 농도로 사용하였다. DDA를 면역조절제로서 사용한 경우, DDA를 상기 암피젠(등록상표) 제형 내에 포함시켰다. 상기 암피젠(등록상표) 제형(즉 40% 드라케올-레시틴 모액)은 1.6 ㎎/㎖의 DDA를 함유하였고, 적합하게 희석된 경우 최종 백신 제제는 2.5% 암피젠(등록상표) 제형 및 0.1 ㎎/㎖의 DDA를 함유하였다.

상이한 백신 제형들의 제조에서, BVD 분획, 렙토스, Quil-A, 콜레스테롤, 티메로솔, 암피젠(등록상표) 제형, 및 증량제로서 염수를 실버슨(Silverson) 균질화기에 가하고 10,000 ± 500 RPM에서 15 분간 혼합하였다. 이어서 성분들을 10,000 psi에서 200 마이크론 스크린을 통해 미세유동화시켰다.

상기 백신 제형이 수산화 알루미늄을 함유하는 경우, 상기 미세유동화를 수산화 알루미늄 없이 수행하였다. 미세유동화가 완료된 후에, 수산화 알루미늄을 가하고 4 ℃에서 밤새 교반봉으로 혼합시켰다.

실시예 12

시험감염 연구를 위한 BVD 바이러스 백신의 제조

본 실험에 사용된 백신 제제는 BVD 바이러스 유형 1 및 BVD 바이러스 유형 2 모두로부터의 항원을 함유하였다. BVD1-5960 항원을 gp53에 대한 2535 RU/용량의 불활성화 후 ELISA 역가로 사용하였다. BVD2-890 항원을 gp53에 대한 3290 RU/용량의 불활성화 후 ELISA 역가로 사용하였다. Quil A 및 콜레스테롤을 0.5 ㎎/㎖의 농도로 사용하였다. 티메로솔 및 암피젠(등록상표) 제형을 각각 0.009% 및 2.5%의 최종 농도로 사용하였다. DDA를 면역 조절제로서 사용한 경우, DDA를 상기 암피젠(등록상표) 제형 내에 포함시켰다. 상기 암피젠(등록상표) 모액( 40% 드라케올-레시틴 용액)은 가변량의 DDA를 함유하였고, 적합하게 희석된 경우 최종 백신 제제는 2.5% 암피젠(등록상표) 제형 및 0.5 내지 2.0 ㎎/㎖ 범위의 DDA를 함유하였다. 알루미늄 겔(Rehydragel LV)을 2%의 최종 농도로 사용하였다. GPI-0100을 2, 3 및 5 ㎎/용량의 범위로 사용하였다.

모든 성분들을 실버슨 균질화기에 가하고 10,500 rpm에서 15 분 동안 블렌딩하고 이어서 10,000 psi로 200 마이크론 챔버에 통과시킴으로써 미세유동화시켰다. 상기 백신 제제가 수산화 알루미늄을 함유한 경우, 상기 미세유동화를 수산화 알루미늄 없이 수행하였다. 미세유동화가 완료된 후에, 수산화 알루미늄을 가하고 4 ℃에서 밤새 교반봉으로 혼합시켰다.

실시예 13

렙토스피라 항원을 갖는 미세유동화된 암피젠 백신 제형을 백신 접종한 후 렙토스피라 시험감염에 대한 보호

표 1은 본 연구에서 시험된 백신 제제들 중의 항원보강제 제형의 조성을 나타낸다. 상기 백신 제제들은 실시예 11에 개시된 바와 같이 제조되었다. 각각의 그룹에 6 마리의 동물들이 존재하였다. 약 7 개월된 육우 잡종 암소를 본 연구에 사용하였다. 백신접종을 5 ㎖ 백신 부피로 피하 경로를 통해 제 0 일 및 제 21 일에 수행하였다. 시험감염을 NADC(국립 농업 질병 센터)로부터의 엘 하르죠-보비스 균주 203을 사용하여 수행하였다. 시험감염을 1-㎖ 접종물로 제 57 일 내지 제 59 일 동안 수행하였다. 시험감염을 눈과 질에 연결 투여하였다. 시험감염 물질은 5.0 x 10⁶ 렙토스피라/㎖을 함유하였다. 렙토 배양, FA 및 PCR을 위해 소변을 매주 수거하였다. 신장을 제 112 일 및 제 113 일 중에 수거하였다.

표 2는 렙토스피라 시험감염 연구로부터의 데이터를 나타낸다. 시험감염된 동물에서 렙토스피라 감염 %를 측정함에 있어서, 하기의 기준을 사용하였다. 신장 배양물이 오직 하나의 샘플에 대해서만 양성인 경우, 그 동물을 렙토스피라에 대해 양성인 것으로 간주한다. 동물이 FA 또는 PCR에 대해서 오직 하나의 샘플에서만 양성인 경우, 그 동물을 음성인 것으로 간주한다. 샘플이 오직 하나의 샘플에서 FA와 PCR 모두에 대해 양성인 경우, 상기를 렙토스피라에 대해 양성인 것으로 간주하였다.

표 2에 나타낸 결과들은 3 개의 모든 분석에 근거한 모든 백신 그룹에서 소변 발산이 현저하게 더 짧게 지속되었음을 가리킨다. 소변 및 신장 콜로니 형성에 관한 한, AlOH가 없는 상기 QAC- 및 DDA-함유 제형의 효능들은 필적할만하였다. AlOH는 본 시험감염 연구에서 QAC- 및 DDA-함유 백신의 효능들을 개선시키지도 심지어 감소시키지도 못했다.

백신 제형 중의 렙토스피라 항원들 모두에 대한 혈청학적 반응들을 백신접종된 동물에서 검출하였으며 피크 반응이 제 35 일째에 주목되었다. 상기 혈청학적 반응과 시험감염에 대한 보호 사이에는 상관성이 없었다. 백신 제형 중의 알루미늄 겔의 존재는 상기 혈청학적 반응들이 상기 백신 중의 알루미늄 겔의 존재에 의해 향상되었지만, 보호 수준은 감소시켰다.

실시예 14

암피젠(등록상표) 제형 및 DDA를 함유하는 미세유동화된 백신 제제로 면역화 후 BVD 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 유도 및 BVD 유형 2 바이러스 시험감염에 대한 보호

4 내지 7 개월된 음성혈청반응의 송아지들을 본 실험에 사용하였다. 6 개의 상이한 그룹들이 존재하였으며 각 그룹은 10 마리의 동물들을 가졌다(표 4). 제 0 일 및 제 21 일에, 각각의 동물들에게 1 회 2 ㎖ 피하 용량의 백신 또는 위약을 견갑골과 목덜미 사이의 대략 중간쯤의 목 측부에 제공하였다.

5 ㎖ 용량의 시험감염 바이러스 제제(약 2.5 ㎖/콧구멍)를 연구 제 44 일째에 비 내 투여하였다. 비세포병원성 BVD 바이러스 유형 2, 단리물 #24515(Ellis 균주), 로트 #46325-70을 시험감염 균주로서 본 연구에 사용하였다. 계속 유지된 시험감염 물질 샘플을 시험 감염 개시 시 및 완료 즉시 적정하였다(적정 당 2 회 반복). 5 ㎖ 용량당 평균 생 바이러스 역가는 시험감염 전 5.3 log₁₀ FAID₁₀/5 ㎖이고, 시험감염 후 5.4 log₁₀ FAID₅₀/5 ㎖이었다(FAID는 TCID₅₀에 해당한다)

동물들을 제 3 일 내지 제 58 일째까지 매일 모니터하였다. BVD 2 감염에 기인한 임상적 징후를 근거로 0, 1, 2 또는 3의 임상 질병 점수를 작성하였다. 제 44 일째의 점수를 시험감염 전에 기록하였다. 혈액 샘플(2 회 13 ㎖ 혈청 분리 튜브, SST)을 BVD 유형 1 및 BVD 유형 2 바이러스 중화 항체의 혈청 역가를 측정하기 위해서 제 0, 21, 35, 44 및 58 일째에 각각의 동물에 대해 수거하였다.

혈액 샘플을 제 42 일 내지 제 58 일째에 각각의 동물로부터 수거하고, 백혈구연층 세포 중의 BVD 바이러스의 존재를 측정하였다. 제 44 일째에, 시험감염 전에 샘플들을 수득하였다.

백혈구 수를 측정하기 위해서, 혈액 샘플(1 회 4 ㎖ EDTA 튜브)을 각각의 동물로부터 제 42 일 내지 제 58 일째에 수거하였다. 제 44 일째에 샘플들을 시험감염 전에 수득하였다.

백혈구감소증을 기준선(시험감염 2 일 전부터 시험감염 일까지의 시험감염-전 WBC 수의 평균)으로부터 WBC 수의 40% 이상의 감소로서 정의하였다.

임상 질병 점수를 사용하여 하기와 같이 질병 상태를 규정하였다: 점수가 ≤1인 경우, 질병은 없고; 점수가 >2인 경우 질병이 있다.

표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 그룹들을 암피젠(등록상표) 제형, Quil A 또는 DDA와 함께 BVD 바이러스 항원을 함유하고, 미세유동화시켰으며, BVD 유형 1 및 BVD 유형 2 바이러스 모두에 대해 현저한 혈청 바이러스 중화 역가로 혈청전환된 백신으로 접종하였다. 또한 상기 그룹들에서 시험감염에 이어 바이러스혈증을 나타내는 동물 퍼센트가 현저하게 감소된반면, 대조용 그룹에서는 동물의 100%가 바이러스혈증이었다(표 7). 또한, 백신접종된 그룹에서 질병의 빈도가 또한 상당히 감소되었다(표 8). 유사하게, 백혈구감소증을 나타내는 동물의 %가 또한 백신 그룹에서 감소되었으며 상기 백혈구감소증의 감소는 Quil A를 함유하는 그룹에서보다 DDA를 함유하는 그룹에서 더욱 현저하였다(표 9). 대조용 그룹에서, 백신접종된 그룹에 비해 체중 증가가 현저히 떨어졌다(표 10).

혈청학

백신접종 전 제 0 일째에, 모든 연구 동물들은 BVD 바이러스 유형 1 및 2에 대한 항체에 대해 음성혈청반응(SVN<1:2)이었다(데이터 도시 안됨). 2 차 백신접종 후 14 일째에(제 35 일), 위약(T01)을 투여한 모든 동물들은 BVD 바이러스 유형 1 및 2에 대한 항체에 음성혈청반응을 유지하였으며; ITA(연구시험항원)(T02, T03, T04, T05 및 T6)를 백신 접종한 동물들은 모두 BVD 바이러스 유형 1 및 2에 대한 항체에 양성혈청반응(SVN≥1:8)이었다. DDA 2 ㎎/용량의 암피젠(등록상표) 제형으로 항원보강된 백신을 투여한 한 마리의 동물은 제 35 일째에 BVD 바이러스 유형 2에 대한 항체에 2의 SVN 역가를 가졌다(표 11 및 12).

시험감염 전 제 44 일째에, 하나를 제외한 모든 대조군(T01)은 BVD 바이러스 유형 1 및 2에 대한 항체에 음성혈청반응(SVN<1:2)이었다(현재 데이터 도시되어 있음). 상기 하나의 대조군(#2497)은 BVD 바이러스 유형 1에 대한 항체에 대해 양성혈청반응(SVN=10)이고 BVD 바이러스 유형 2에 대한 항체에 대해 음성혈청반응이었다. 시험감염 후 14 일째에 모든 연구 동물들은 BVD 바이러스 유형 1 및 2에 대한 항체에 양성혈청반응이었다.

바이러스 단리

시험감염 기간(제 44 일 내지 제 58 일) 동안 표 13에 나타낸 데이터로서, 대조용(T01) 동물 10 마리 모두 바이러스혈증이었다(BVD 바이러스가 하루 이상 단리되었다). ITA를 투여한 그룹에서, 바이러스혈증 동물의 빈도는 10 개의 각 그룹에서 1, 0, 3, 2 및 2(각각 T02, T03, T04, T05 및 T6)였다. 상기 대조군과 ITA를 투여한 그룹들 사이의 차이는 통계학적으로 유의수준이었다(P≤0.05). 바이러스혈증 일수의 최소 제곱 평균수는 또한 ITA를 투여한 그룹(0.0 내지 0.5 일)에 비해 대조군의 경우 상당히 더 컸다(10.4 일).

임상적 질병

2 또는 3의 임상 징후 점수를 갖는 동물들을 BVD 질병의 징후를 나타내는 것으로 간주하였다. 표 14에 나타낸 바와 같이, BVD 바이러스 질병의 임상 징후를 갖는 동물의 빈도는 대조군(T01)에서 10 중 9였고 ITA를 투여한 각 그룹(각각 T02, T03, T04, T05 및 T6)에서 10 중 1, 2, 0, 0 및 0이었다. 상기 대조군과 ITA를 투여한 그룹들 사이의 차이는 통계학적으로 유의수준이었다(P≤0.05).

백혈구 감소증

표 15에 나타낸 바와 같이, 시험감염 기간(제 44 일 내지 제 58 일) 동안 대조용(T01)c 동물 10 마리 모두 백혈병이었다(시험감염 전 기준선으로부터 백혈구 수가 40% 감소함, 제 42 일 내지 제 44일). 백혈병이 있는 동물의 빈도는 ITA를 투여한 각 그룹에서 6, 2, 4, 3 및 2(각각 T02, T03, T04, T05 및 T6)였다. 상기 대조군과 암피젠(등록상표) 제형 0.5 ㎖/용량으로 항원보강된 백신을 투여한 그룹 사이의 차이는 통계학적으로 유의수준이었다(P≤0.05). 백혈병 일수의 최소 제곱 평균수는 ITA를 투여한 그룹(0.2 내지 1.2 일)에 비해 대조군의 경우 상당히 더 컸다(7.8 일).

실시예 15

GPI-0100을 함유하는 미세유동화된 백신 제형으로 면역화 후 BVD 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 유도 및 BVD 유형 2 바이러스 시험감염에 대한 보호

실시예 14에 개시된 바와 같은 일련의 실험 조건들에 따라 Quil A와 GPI-0100 사이에 직접적인 비교를 수행하였다. 표 11 및 12에 나타낸 바와 같이, Quil A 또는 GPI-0100을 함유하는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 제제 중의 BVD로 백신 접종한 동물들은 BVD 유형 1 및 BVD 유형 2 바이러스 모두에 대해 상당한 항체 역가를 가졌다. BVD 유형 1 바이러스에 대한 항체 역가는 BVD 유형 2 바이러스의 역가보다 훨씬 더 높았다. 그러나, BVD 유형 2 바이러스에 의한 후속 시험감염은 강한 보호를 나타내었으며 질병 발병률이 GPI-0100을 함유하는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형-기재 백신 제제로 백신 접종한 송아지에서 현저하게 감소되었다.

결론적으로, 각 백신의 안전성은 백신접종된 동물에서 불리한 반응 또는 사망률의 부재에 의해 입증되었다. 각 백신의 효능은 백신접종된 동물의 100%에서 혈청 전환(BVD-1 및 BVD-2에 대한 SVN 항체 역가 >1:8)에 의해 입증되었다. 만족스러운 시험감염 내성이 단지 2 ㎎ GPI-0100으로 항원보강된 백신에 의해 입증되었다.

실시예 16

미세유동화된 수중 유적형 유화액 중의 미세캡슐화된 항원을 함유하는 백신 제제

3 g의 트레할로즈(Fluka)를 물에 가하여 트레할로즈 용액 333 ㎎/㎖의 모액을 수득하였다. 0.8% SDS 용액에 용해된 재조합 PauA 항원(SDS/rPauA)을 트레할로즈 용액에 가하여 494 ㎍ rPauA/㎖의 최종 농도를 얻었다. 다음 단계로 10 g의 폴리락타이드 글리콜산(PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim)을 염화 메틸렌 200 ㎖(MeCl2)에 용해시켰다. 생성된 PLG/MeCl2 용액을 상기 첫 번째 단계에서 제조된 SDS-rPauA/트레할로즈 용액과 배합시켰다. 상기 배합된 용액에 미세유동화기(Microfluidics Model M110EH)를사용하여 미세유동화시키고 상기 미세유동화된 제제를 템코(Temco) 분무 건조기(Model SD-05)를사용하여 분무 건조시켰다. 상기 분무 건조된 물질을 500 마이크론 스크린을 사용하여 수거하였다.

상기 분무 건조된 물질 중의 rPauA의 농도를 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 정량분석하였다. 분무 건조된 물질 1.04 ㎎을 아세톤 50 ㎕에 용해시키고 실온에서 10 분 동안 13,200 rpm에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하였다. 상기 상등액과 펠릿 분획을 2.5 시간 동안 생물학적 안전 후드에서 건조시켰다. 상기 펠릿을 47.43 ㎕의 샘플 용액(샘플 완충액 25 ㎕ + 환원제 10 ㎕ + 물 65 ㎕)에 재 현탁시켰다. 상기 건조된 상등액 분획을 샘플 용액 20 ㎕에 재 현탁시켰다. 상기 웨스턴 분석에서 정제된 PauA를 표준으로서 사용하여 상기 분무 건조된 무질의 rPauA 함량을 정량분석하였다.

만니톨(Sigma) 100 g을 주사용 수(WFI) 500 ㎖에 용해시켜 20% 만니톨 모액을 제조하였다. 용액을 핫 플레이트/교반기로 40 ℃로 가열하고 30 ℃로 냉각시켰다. 용액을 0.22 마이크론 멸균 필터(Millipore)를 통해 멸균 여과하였다. 2.5% 카복시메틸셀룰로즈 용액을 카복시메틸셀룰로즈(Sigma) 12.5 g을 WFI 500 ㎖에 용해시켜 제조하고 4 ℃에서 밤새 혼합하였다. 용액을 121 ℃에서 오토클레이브 처리하였다.

분무 건조로부터 생성된 분말을 5% 만니톨, 0.3% 카복시메틸 셀룰로즈 및 1:5000의 티메로솔을 함유하는 용액으로 재 조성하였다. 최종 용액을 3 ㎖ 바이알에 나누고 동결건조기(USIFROID)를 사용하여 동결건조시켰다. 상기 동결 건조된 분말은 미세캡슐화된 rPauA를 나타낸다. 상기 미세캡슐화된 서브유닛 단백질 항원을 암피젠(등록상표) 제형을 함유하는 미세유동화된 수중 유적형 유화액(예를 들어 실시예 20에 개시된 미세유동화된 유화액) 2 ㎖에 재 현탁시키고 백신으로 사용한다.

실시예 17

수중 유적형 유화액 중에 세균 전 세포 항원 및 재조합 단백질 항원을 함유하는 미세유동화된 백신 제형의 제조

재조합 스트렙토코커스 유베리스 PauA 단백질 및 에스케리키아 콜라이 세균 세포를 모두 함유하는 2 개의 백신 제제를 제조하고, 실시예 2 및 3에 개시된 바와 같은 수중 유적형 유화액에 본질적으로 첨가하였다. 상기 재조합 PauA 항원은 용량당 100 ㎍의 농도로 존재하고 이 콜라이 세포는 용량당 4 x 10⁹의 최종 수로 존재하였다. 상기 두 백신 제형의 유화액 항원보강제 조성을 표 16에 나타낸다.

실시예 18

수중 유적형 유화액 중에 rPauA 및 전 세포 세균 작용제를 함유하는 미세유동화된 백신에 대한 면역 반응

성숙한 젖소를 본 실험에 사용하였다. 동물들은 실험 참가 시 1 차 또는 2 차 수유기간의 끝에 있었다. 각 백신 제형 2 ㎖을 피하로 3 회, 즉 건조시 1 회(D-0), 28 일 후(D=28), 및 다시 새끼를 낳은 지 4 내지 10 일째(C+4 내지 C+10)에 피하 투여하였다. 상기 첫 번째 및 세 번째 용량을 좌측 목에 투여하고 두 번째 용량은 우측 목에 투여하였다. 각각의 백신 접종 전에 채혈하고 세 번째 백신접종 후 대략 14 일 및 32 일째에 채혈하였다. 이 콜라이 및 rPauA 항원에 대한 항체 역가를 ELISA를 통해 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 결과는 rPauA에 대한 항체 역가가 면역자극제로서 GPI-0100을 함유하는 백신 제형으로 백신접종된 그룹에서 더 놓았으며 초기 백신 접종 후 70 일째에 정점에 달하였다. 이 콜라이 항원에 대한 항체 역가를 도 9에 나타낸다. 이 콜라이 항원에 대한 항체 역가는 상기 두 백신 제형 모두에서 필적할만하였지만, 면역자극제로서 GPI-0100의 존재는 면역자극제로서 DDA를 갖는 제형에 비해 비교적 더 높은 항체 역가를 유도하였다.

실시예 19

미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형 기재 백신 제제의 바이러스박멸 활성에 대한 분석

미세유동화가 바이러스를 불활성화시키는지의 여부를 측정하기 위해서, 3 개의 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형 기재 백신 제제의 바이러스 박멸 활성을 측정하였다. 상기 3 개의 제제는 3 개의 상이한 소 감염성 바이러스, 즉 소 헤르페스 바이러스(BHV), 파라인플루엔자 바이러스 3(PI3) 및 소 호흡기 합포체 바이러스(BRSV)를 함유하였다.

상기 3 개의 백신 제제에서 바이러스 박멸 활성의 검출을 USDA 9CFR.113.35 요건에 따라 수행하였다.

표 17에 나타낸 결과들은 암피젠(등록상표) 제형 기재 백신 제제의 미세유동화가 상기 백신 제제의 어떠한 현저한 불활성화도 일으키지 않음을 가리킨다.

0.7을 초과하는 값은 바이러스 박멸 효과를 가리킨다.

실시예 20

미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형의 제조

DRAKEOL 레시틴 오일 용액(25% 레시틴을 갖는 무기 경유) 및 트윈 80(0.18%의 최종 농도를 가짐) 및 Span 80(0.08%의 최종 농도를 가짐)을 36±1 ℃에서 8 내지 22 시간 동안 혼합하면서 배합시켜 암피젠(등록상표) 제형을 제조하였다. 이어서 상기 오일 혼합물을 로스(등록상표)(Hauppauge, NY11788) 유화기를 사용하여 대략 3400 rpm에서 염수에 가하였다. 이어서 상기 혼합물을 4500±500 psi에서 200 ㎛ 상호작용 챔버를 갖는 미세유동화기에 1 회 통과시켰다. 도 10A 및 10B는 미세유동화된 암피젠(등록상표) 제형의 안정성을 나타낸다. 레이저 회절에 의해 측정된 바와 같이, 출발 시 초기 시점(도 10A)에서 입자 크기 분포는 22 개월의 4 ℃ 보관 후(도 10B)의 입자 크기 분포와 거의 동일하였다.

Claims

대사될 수 없는 탄화수소 경유(light oil), 계면활성제 및 수성 성분을 포함하는 백신 항원보강제(adjuvant)로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액으로서, 상기 오일이 상기 수성 성분 중에 분산되어 있고 평균 오일 소적 크기가 1 ㎛ 미만인 유화액.
제 1 항에 있어서,

오일이 무기 경유로서 1 내지 50% v/v의 양으로 존재하고, 계면활성제가 레시틴을 포함하며 0.01 내지 10% v/v의 양으로 존재하고, 오일이 수성 성분 중에 분산되어 있고, 평균 오일 소적 크기가 0.1 내지 0.5 ㎛인 유화액.
약 40% v/v의 무기 오일, 약 10% w/v의 레시틴, 약 0.18% v/v의 트윈(TWEEN)-80, 약 0.08% v/v의 SPAN-80, 및 수성 상을 포함하는 백신 항원보강제로서 유용한 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액으로서,

상기 오일이 상기 수성 상 중에 분산되어 있고, 평균 오일 소적 크기가 0.1 내지 0.5 ㎛인 유화액.
(a) 대사될 수 없는 탄화수소 경유, 계면활성제, 및 수성 성분을 배합시킴으로써 혼합물을 제조하고;

(b) 상기 혼합물에 1 차 유화 공정을 가하여 1.0 내지 1.1 ㎛의 평균 오일 소적 크기를 갖는 수중 유적형 유화액을 제조하고;

(c) 상기 (b)에서 제조된 수중 유적형 유화액에 미세유동화를 가하여 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액을 제조함을 포함하되,

상기 마이크론 이하의 유화액이 1 ㎛ 미만의 평균 오일 소적 크기를 갖는, 마이크론 이하의 수중 유적형 유화액의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,

오일이 무기 경유로서 1 내지 50% v/v의 양으로 존재하고, 계면활성제가 레시틴을 포함하며 0.01 내지 10% v/v의 양으로 존재하고, 마이크론 이하의 유화액의 평균 오일 소적 크기가 0.1 내지 0.5 ㎛인 방법.
수중 유적형 유화액 및 항원을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 항원이 상기 유화액 중에 분산되어 있고, 상기 유화액이 대사될 수 없는 탄화수소 경유, 계면활성제 및 수성 성분을 포함하며, 상기 유화액의 평균 오일 소적 크기가 1 ㎛ 미만인 백신 조성물.
제 6 항에 있어서,

오일이 무기 경유로서 1 내지 20% v/v의 양으로 존재하고, 계면활성제가 레시틴을 포함하며 0.01 내지 10% v/v의 양으로 존재하고, 평균 소적 크기가 0.1 내지 0.5 ㎛인 백신 조성물.
제 6 항에 있어서,

항원이 바이러스성 항원 또는 세균성 항원인 백신 조성물.
제 8 항에 있어서,

바이러스성 항원이 죽은 소 바이러스성 설사 바이러스 유형 1 또는 유형 2를 포함하고, 세균성 항원이 불활성화된 렙토스피라(Leptospira) 세균 백신, 재조합 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) PauA 단백질 및 이 콜라이(E. coli) 세포 제제 중 하나 이상을 포함하는 백신 조성물.
(a) 대사될 수 없는 탄화수소 경유, 계면활성제, 및 수성 성분을 배합시킴으로써 혼합물을 제조하고;

(b) 항원을 상기 (a)에서 제조된 혼합물에 가하고;

(c) 상기 (b)에서 제조된 항원을 함유하는 혼합물에 1 차 유화 공정을 가하여 1.0 내지 1.1 ㎛의 평균 오일 소적 크기를 갖는 수중 유적형 유화액을 제조하고;

(d) 상기 (c)에서 제조된 유화액에 미세유동화를 가하여 백신 조성물을 제조함을 포함하되,

상기 조성물이 1 ㎛ 미만의 평균 오일 소적 크기를 갖는, 상기 백신 조성물의 제조 방법.
제 10 항에 있어서,

오일이 무기 경유로서 백신 조성물 중에 1 내지 20% v/v의 양으로 존재하고, 계면활성제가 레시틴을 포함하며 백신 조성물 중에 0.01 내지 10% v/v의 양으로 존재하고, 평균 오일 소적 크기가 0.1 내지 0.5 ㎛인 방법.
제 10 항에 있어서,

항원이 바이러스성 항원 또는 세균성 항원인 방법.
제 12 항에 있어서,

바이러스성 항원이 죽은 소 바이러스성 설사 바이러스 유형 1 또는 유형 2를 포함하고, 세균성 항원이 불활성화된 렙토스피라 세균 백신, 재조합 스트렙토코커스 유베리스 PauA 단백질 및 이 콜라이 세포 제제 중 하나 이상을 포함하는 방법.
미세캡슐화된 항원 및 수중 유적형 유화액을 포함하는 백신 조성물로서, 상기 미세캡슐화된 항원이 상기 유화액 중에 분산되어 있고, 상기 유화액이 대사될 수 없는 탄화수소 경유, 계면활성제 및 수성 성분을 포함하고, 상기 유화액의 평균 오일 소적 크기가 1 ㎛ 미만인 백신 조성물.
제 14 항에 있어서,

오일이 무기 경유로서 1.0 내지 20% v/v의 양으로 존재하고, 계면활성제가 레시틴을 포함하며 0.01 내지 10% v/v의 양으로 존재하고, 항원이 바이러스성 항원 또는 세균성 항원이며 미립자 담체로 캡슐화되고, 상기 담체가 폴리락타이드 글리콜산을 포함하는 백신 조성물.