CN108159414B

CN108159414B - 动物疫苗用油包水佐剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN108159414B
Application number: CN201810034307.1A
Authority: CN
Inventors: 吴福文; 扶星星; 王永胜; 汪小芳
Original assignee: Sichuan Nuoshun Technology Co ltd
Current assignee: Sichuan Nuoshun Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN108159414A

Abstract

本发明公开了一种动物疫苗用油包水佐剂及其制备方法和用途，该动物疫苗用油包水佐剂按体积分数计，主要由以下原料制备而成：矿物油：74.5％‑76.5％；司盘80：13.0％‑15.5％；吐温80：1.5％‑2.5％；丙二醇脂肪酸酯：2.5％‑3.0％；羟基化羊毛脂：2.5％‑3.5％；单硬脂酸甘油酯：1.5％‑2.0％；聚氧乙烯(2EO)油醇醚：0.5％‑1.0％。利用本发明提供的佐剂，可以通过一步乳化法制备得到油包水型疫苗，生产工艺简单、成本低，且得到的油包水疫苗安全、有效、黏度低、副反应小、稳定性好，安全检验、效力检验均符合《中国兽药典》相关要求。

Description

动物疫苗用油包水佐剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制品类动物疫苗领域，涉及一种动物疫苗用油包水佐剂及其制备方法和用途。

背景技术

动物疫苗用油乳佐剂，是一种先于或与抗原同时使用，能够增强机体的非特异性免疫能力及抗原的免疫原性，而自身不具备抗原特性的物质。油乳佐剂疫苗是使用矿物油和乳化剂作为免疫增强剂的疫苗，该类佐剂能使抗原在注射部位持续稳定释放，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和聚集，提高疫苗的免疫效力，是目前国内外疫苗市场上产品最多的类型之一，油乳佐剂疫苗可以分为三种剂型：油包水(W/O)型、水包油(O/W)型、水包油包水(W/O/W)型。

油包水(W/O)型疫苗通常粘度较高，不易注射，在体内不易分散代谢，粘度高导致动物副反应大，但可以获得较高水平的免疫应答，且免疫保护期长。

现有的油包水佐剂主要依赖于法国赛比克公司提供，部分疫苗厂家也自配佐剂，国内也有许多公司生产矿物油佐剂。相比之下，进口佐剂的价格相对较高，而且不易获得；厂家自配的佐剂往往稳定性差，且质量参差不齐。

国产油包水佐剂，大多由油相和乳化剂构成，油相为矿物油，乳化剂为表面活性剂。表面活性剂又分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子表面活性剂，非离子表面活性剂具有亲水基和疏水基，亲水基易溶于水相，而疏水基易溶于油相，动物抗原大都具有亲水性，非离子表面活性剂则可以使水性抗原和油性佐剂完美的结合在一起。非离子型表面活性剂的种类很多，乳化作用的好坏与乳化剂的质量和各成分的配比相关。非离子表面活性剂不电离，以中性分子或者胶束状态存在，即形成油包水型中性分子胶束，具有理想的化学稳定性。法国赛比克矿物油佐剂含有甘露醇和油酸高度精炼的乳化剂，其价格昂贵，且不易获得。传统的国产矿物油佐剂所用乳化剂含有阴离子表面活性剂如硬脂酸铝、十二烷基硫酸钠和月桂酸钠，有的则含有阳离子表面活性剂如氯化苯甲羟铵、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷铵代吡啶等。与非离子表面活性剂相比，离子型表面活性剂具有以下缺陷：(1)在水相中易电离，和其他物质发生沉淀，从而导致不容易分布和代谢；(2)具有一定有细胞毒性。

生产佐剂所用的矿物油多为白油，白油为无多环芳烃化合物，黏度低、无色、无味和无毒性。Drakoce l-6VR、Marco l-52和Lipo l u l-4是国内外常用的白油。我国目前选用注射用白油7号或10号轻质矿物油，应符合《中国兽药典》注射用轻质矿物油的标准，特别注意该白油小鼠腹腔注射0.5ml或家兔皮下注射2.0ml观察60天，表现正常。近年来，一些学者用精制花生油与化学纯试剂研制成功了“佐剂-65”，其性能与矿物油佐剂相似，但制备花生油要求不含脂酶和酯酶，否则花生油降解释放的脂肪酸会产生毒性，更不能含有黄曲霉素，故其生产成本较高，质量难以控制，不常采用。

不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性，疫苗生产中主要有下面两种基本方法：

(1)剂在水中法：此法将乳化剂直接溶于水相中，在激烈搅拌下将过量油相加入，通过匀浆器或胶体磨在高速搅拌下得到较好的乳剂。专利CN201010273213.3公开的油乳剂疫苗为此类型佐剂制备疫苗，它将亲水性乳化剂溶于水相，亲油性乳化剂溶于油相，此法适用于疫苗厂家自行配制疫苗的情况，不便于大规模生产，且生产过程复杂，不适合市场推广。目前，国产类佐剂疫苗大部分采用此法制备乳液，意味着乳化时要单独处理水相和油相，为两步乳化法，给疫苗生产带来了不便。

(2)剂在油中法：此法将亲水性和亲油性乳化剂均溶于油相，将水相(抗原)直接加入油相(佐剂)，即可制备乳液。此方法将乳化剂溶于油相即为矿物油佐剂，通常油包水佐剂与抗原的乳化比例为体积比1:1，抗原用量相对较大，疫苗生产成本较高，且佐剂比例较小，达不到缓释抗原的作用。

水包油(O/W)型疫苗通常粘度较低，注射入体内易于分散，但是难以获得满意的免疫应答水平，疫苗市场一般不采用这种剂型。

水包油包水(W/O/W)型疫苗同时具备油包水(W/O)型和水包油(O/W)型疫苗的优点。常规做法是先制备油包水(W/O)型疫苗，再经过二次乳化，将抗原分散到水相中制备而成。该类型疫苗黏度低，易于注射，且免疫水平高，免疫保护期长。但其制备技术上难度较大，疫苗稳定性较差。

发明内容

基于疫苗市场需求，本发明的目的旨在，提供一种低粘度、稳定性好、易注射、副作用小、低价易得的动物疫苗用油包水佐剂。

本发明的另一目的旨在提供上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法。

本发明的第三个目的旨在提供上述动物疫苗用油包水佐剂在制备动物疫苗中的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

本发明提供的动物疫苗用油包水佐剂，其原料包含矿物油和一组乳化剂，矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级的非离子型表面活性剂；相比市场同类产品常用的离子型表面活性剂，非离子表面活性剂对细胞无毒性，在体内代谢完全无残留，动物注射后无局部不良反应。

上述动物疫苗用油包水佐剂，按体积分数计，主要由以下原料制备而成：

上述动物疫苗用油包水佐剂，各乳化剂的HLB值(亲水亲油平衡值)，除吐温80的值较大(HLB值为15)外，其它乳化剂的HLB值都在3-6(见表1所示)；有研究表明，HLB值越低，越容易形成油包水型乳液(各HLB值范围及其对应的应用见表2所示)。此外，多种亲油性乳化剂搭配使用，使形成的油包水乳液更稳定。矿物油白油为溶解乳化剂的基质，同时也具有免疫刺激效果，但是如果其含量过多，会导致乳液在保存时出油多。司盘80为主要的亲油性表面活性剂，吐温80为主要的亲水性表面活性剂，如果乳化剂比例过大会导致乳液粘度太低而使乳液易分层；乳化剂比例太小，则会导致乳化剂不足以吸附所有的水相和油相，进而出现出水出油的现象。因此，正确的乳化剂和适宜的配比决定了佐剂的质量，通过本发明提供的上述原料各组分的配比，适当调整油水比例，可以得到制备稳定乳液的佐剂。

表1：表面活性剂及其对应的HLB值

序号	化学成分	HLB值
			1	失水山梨醇单油酸酯(司盘80)	4.3
2	聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(吐温80)	15
			3	丙二醇脂肪酸酯	3.4
4	羟基化羊毛脂	4.0
			5	单硬脂酸甘油酯	3.8
6	聚氧乙烯(2EO)油醇醚	5.0

表2：各HLB值范围及其对应的应用

HLB值范围	应用
		3-6	W/O乳化剂
7-9	润湿剂
		8-18	O/W乳化剂
13-15	洗涤剂
		15-18	助溶剂

本发明进一步提供了上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，按照前面给出的原料组分的体积分数，通过以下步骤制备而成：

(1)在搅拌条件下，将矿物油加热至35-40℃；

(2)在搅拌条件下，向矿物油中加入司盘80、丙二醇脂肪酸酯和羟基化羊毛脂，并搅拌均匀，之后将所得混合液冷却至室温；

(3)在搅拌条件下，向冷却后的混合液中加入吐温80、单硬脂酸甘油酯和聚氧乙烯(2EO)油醇醚，并搅拌均匀，继后静置；

(4)将静置后的混合液经过滤即得动物疫苗用油包水佐剂。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所述步骤(1)中，首先将矿物油进行搅拌，搅拌转速为90-120转/分，在搅拌条件下再将矿物油加热到35-40℃，搅拌20-30分钟，这样能够使加热更充分和均匀。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所述步骤(2)中，一般在搅拌转速90-120转/分条件下搅拌20-30分钟，即可将矿物油和司盘80、丙二醇脂肪酸酯、羟基化羊毛脂搅拌均匀。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所述步骤(3)中，一般在搅拌转速90-120转/分条件下搅拌30-40分钟，即可将步骤(2)所得混合液与吐温80、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯(2EO)油醇醚搅拌均匀。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所述步骤(1)-(3)中，搅拌时间最好控制在30分钟，搅拌转速控制在90转/分。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所述步骤(4)中，静置后的混合液经0.22微米的薄膜过滤得到动物疫苗用油包水佐剂，用0.22微米滤膜过滤，除菌，制备的佐剂为无菌产品，可直接使用。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，所采用的原料、反应容器、过滤用器具以及与原料和所得产品接触的器具均符合医用要求。

上述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，还包括对反应容器、过滤用器具以及与原料和产品直接接触的器具进行清洗，原料、产品和包装材料等的检验以及对生产环境的控制等。

本发明进一步提供了上述动物疫苗用油包水佐剂在制备动物疫苗中的应用，即以抗原为原料制备动物疫苗。动物疫苗的制备过程为：在搅拌条件下，将佐剂与抗原混合乳化即得油包水型疫苗；在优选的实施方式中，是在高速搅拌(转速至少为1200转/分钟)佐剂的同时加入抗原，经过一段时间乳化即得到油包水型疫苗。通过本发明提供的油包水佐剂可以采用一步法制备疫苗，不仅制备简单，而且即开即用使用便捷。进一步地，佐剂与抗原的体积比为3：2配比，即可得到低粘度(粘度约40厘泊左右)的油包水型疫苗，大大减少了抗原用量少，降低了疫苗生产成本，且由于佐剂用量相对较大，增加了抗原的缓释作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所提供的动物疫苗用油包水佐剂，用于制备油包水型疫苗，我国是一个畜牧业大国，对兽用疫苗的需求量大，国内制备兽用疫苗主要依赖于进口佐剂，且进口佐剂的价格昂贵，不易获得，国内疫苗厂家也有自配佐剂，但质量参差不齐，且质量不稳定，不适合市场大规模推广，本发明提出一种优质国产佐剂，所用矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级非离子型表面活性剂，原料易得，价格较低，大大降低了疫苗厂家的生产成本，其性能等同于甚至优于进口佐剂，且低价易得，适用于各种家禽、家畜疫苗的制备，适于市场推广使用。

2、本发明提供的动物疫苗用油包水佐剂的制备及应用方法不同于专利申请号CN201010273213.3公开的油乳剂的制备及应用方法，其将亲水性乳化剂溶于水相中，将亲油性乳化剂溶于油相中，按照油相：水相＝2:1的体积比乳化，制备疫苗为两步乳化，生产过程复杂，此法适用于疫苗生产厂家自配疫苗，而不适合大规模生产及市场推广；本发明则采用一步法乳化制备疫苗，将亲水性和亲油性乳化剂溶于油相制备佐剂，只需将抗原和本佐剂按照适当比例乳化即可，疫苗生产工艺简单，非常适合市场推广使用；本发明佐剂制备疫苗推荐体积比佐剂：抗原＝3:2，这种配比下佐剂用量较大，增加了抗原的缓释作用及免疫持续效果，抗原用量相对较少，降低了生产成本，但单位剂量的疫苗免疫效果于优于其他佐剂。

3、本发明佐剂制备的油包水型疫苗安全、有效、黏度低、副反应小、稳定性好，安全检验、效力检验均符合《中国兽药典》相关要求。

附图说明

图1为本发明利用实施例1得到的动物用油包水佐剂制备的应用例的乳液粒度特征图。

图2为本发明利用市售油包水佐剂制备得到的应用对比例1的乳液粒度特征图。

图3为本发明利用法国赛比克油包水佐剂制备得到的应用对比例2的乳液粒度特征图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步描述：

实施例1-5

以下实施例所采用的原辅料、反应罐、过滤用器具以及与原料和所得产品直接接触的器具均符合医用要求；原辅料和包装材料的检验应符合要求；在生产操作前，对反应罐以及直接接触原辅料和产品的器具进行清洁；佐剂制备过程中控制生产环境符合要求，生产完后，对反应罐以及直接接触原辅料和产品的器具进行清洗；同时满足成品的检验符合要求以及生产环境清洁至符合要求。

实施例1：

本实施例制备动物疫苗用油包水佐剂的原料按体积分数计为：矿物油76.5％，司盘8013.0％，吐温80 2.0％，丙二醇脂肪酸酯3.0％，羟基化羊毛脂3.5％，单硬脂酸甘油酯1.5％，聚氧乙烯(2EO)油醇醚0.5％。矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级非离子型表面活性剂。

本实施例动物疫苗用油包水佐剂，按照以上原料组分的体积分数，通过以下步骤制备而成：

(1)将矿物油加入反应罐内进行搅拌，在搅拌条件下将矿物油加热到35℃，搅拌的转速控制为90转/分，搅拌时间为30分钟；

(2)向反应罐内依次加入称量好的司盘80、丙二醇脂肪酸酯、羟基化羊毛脂并搅拌均匀，搅拌的转述控制在90转/分，搅拌30分钟混合均匀后，将反应罐冷却至室温；

(3)向反应罐内冷却后的混合液中加入称量好的吐温80、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯(2EO)油醇醚并搅拌均匀，搅拌的转速控制为90转/分，搅拌40分钟混合均匀后静置；

(4)将静置后反应罐内的混合液体通过0.22微米的薄膜过滤，即可得到无菌动物疫苗用油包水佐剂。

实施例2：

本实施例制备动物疫苗用油包水佐剂的原料按体积分数计为：矿物油75.0％，司盘8013.5％，吐温80 2.5％，丙二醇脂肪酸酯3.0％，羟基化羊毛脂3.0％，单硬脂酸甘油酯2.0％，聚氧乙烯(2EO)油醇醚1.0％。矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级非离子型表面活性剂。

(1)将矿物油加入反应罐内进行搅拌，在搅拌条件下将矿物油加热到40℃，搅拌的转速控制为120转/分，搅拌时间为20分钟；

(2)向反应罐内依次加入称量好的司盘80、丙二醇脂肪酸酯、羟基化羊毛脂并搅拌均匀，搅拌的转述控制在120转/分，搅拌20分钟混合均匀后，将反应罐冷却至室温；

(3)向反应罐内冷却后的混合液中加入称量好的吐温80、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯(2EO)油醇醚并搅拌均匀，搅拌的转速控制为120转/分，搅拌30分钟混合均匀后静置；

实施例3：

实施例4：

本实施例制备动物疫苗用油包水佐剂的原料按体积分数计为：矿物油76.5％，司盘8014.0％，吐温80 1.5％，丙二醇脂肪酸酯2.5％，羟基化羊毛脂3.0％，单硬脂酸甘油酯1.5％，聚氧乙烯(2EO)油醇醚1.0％。矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级非离子型表面活性剂。

实施例5：

本实施例制备动物疫苗用油包水佐剂的原料按体积分数计为：矿物油74.5％，司盘8015.5％，吐温80 2.0％，丙二醇脂肪酸酯3.0％，羟基化羊毛脂2.5％，单硬脂酸甘油酯1.5％，聚氧乙烯(2EO)油醇醚1.0％。矿物油为注射级的白油，乳化剂为医药级非离子型表面活性剂。

应用例和应用对比例

对实施例1制备的油包水佐剂和市售同类油包水佐剂进行了乳化，以注射用水为安慰剂代替抗原进行乳化对比实验，如下：

1)材料：实施例1制备的油包水佐剂、市售油包水佐剂(江苏思普瑞生物科技有限公司生产的国产佐剂V1-1)、法国赛比克油包水佐剂(MONTANI DE^TM ISA 70VG)、注射用水，以上材料均已灭菌。

2)仪器：高速分散均质机(带反应釜)，与产品直接接触的部分均已灭菌。

3)方法：

①取实施例1制备的佐剂600ml于反应釜中，调节分散均质机至8000转/分，缓慢加入400ml注射用水，计时乳化20分钟，将反应后的乳化液放置4℃密封保存，即得本发明佐剂制备的油包水乳液(应用例1)。

②取市售油包水佐剂，按照其说明书方法，取佐剂500ml于反应釜中，调节分散均质机至8000转/分转速，加入500ml注射用水，计时乳化20分钟，将反应后的乳化液放置4℃密封保存，即得市售佐剂制备的油包水乳液(应用对比例1)。

③取法国赛比克油包水佐剂，按照其说明书方法，取佐剂700g于反应釜中，调节分散均质机至8000转/分转速，加入500g注射用水，计时乳化20分钟，将反应后的乳化液放置4℃密封保存，既得法国赛比克佐剂制备的油包水乳液(应用对比例2)。

④将上述三种乳液放至室温，分别检测其外观、剂型、粒度、粘度、离心稳定性，4℃保存稳定性、25℃保存稳定性、37℃保存稳定性、动物安全性，检测结果如表3所示。

从表3可以看出，本发明实施例1制备的油包水佐剂制备的乳液相比于应用对比例1和应用对比例2制备的乳液具有以下优势：(1)粒度小，且粒度大小分布均匀，有利于乳液保存的稳定性；(2)乳液4℃保存一年以上稳定，25℃保存8个月稳定，37℃保存30天稳定，具有良好的稳定性；(3)粘度小，易于注射；(4)动物注射后无因佐剂原因出现的局部或全身不良反应。因此，本发明动物疫苗用油包水佐剂性能较市售油包水佐剂性能好，与法国赛比克油包水佐剂的性能相当，在稳定性方面优于法国赛比克油包水佐剂，具有良好的应用前景。

综上所述，相比于常规油包水佐剂，利用本发明提供的油包水佐剂制备动物疫苗具有以下优势：

(1)粘度低、副反应小：

常规油包水型疫苗粘度较高，不易注射，在体内不易分散代谢，粘度高导致动物副反应大。

本发明佐剂采用注射级白油和食品级非离子型表面活性剂通过调节不同的配比，制备出一系列油包水佐剂，通过调节佐剂和抗原的配比和乳化方式制备的油包水型疫苗，黏度低，约为40厘泊左右。各乳化剂的HLB值在3-6，适合制备稳定的油包水型乳液，推荐佐剂与抗原＝3:2的体积比乳化，制备的乳液较佐剂：抗原＝1:1的乳液粘度小，较佐剂：抗原＝2:1的乳液稳定性好，解决了常规佐剂制备的疫苗粘度高的问题。粘度低的同时稳定性好，保持了可获得较高水平的免疫应答，且免疫保护期长的优势。该发明佐剂所包含的乳化剂为非离子型表面活性剂，区别于专利申请号CN201310128363公开的佐剂，其佐剂含有硬脂酸铝，易导致注射部位浮肿、肿胀、硬结和坏死等不良反应，本发明佐剂不含硬脂酸铝等离子型表面活性剂，无细胞毒性，所用乳化剂的代谢产物是机体代谢的正常产物，安全、对组织无不良反应。本发明油包水佐剂制备的乳液与常规油包水佐剂制备的乳液比较如表4所示。

表4：本发明油包水佐剂制备的乳液与常规油包水佐剂制备的乳液比较结果

(2)稳定性好：

本发明佐剂制备疫苗推荐佐剂和抗原体积比为3:2，制备的油包水型疫苗在4℃保存12个月以上稳定，37℃保存可在30天以内不破乳，室温保存8个月仅有少量出油，且出油量在可接受范围内，比国内外同类产品质量更稳定，也进一步证明了本发明佐剂制备的疫苗免疫保护期长的优势。本发明油包水佐剂制备的乳液与法国赛比克油包水佐剂制备的乳液稳定性比较如表5所示。

表5：本发明油包水佐剂制备的乳液与法国赛比克油包水佐剂制备的乳液比较结果

制备乳液的佐剂	4℃下保存稳定性	25℃下保存稳定性	37℃下保存稳定性
				本发明油包水佐剂	大于12个月	约8个月	约30天
法国赛比克油包水佐剂	约12个月	约6个月	约15天

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种动物疫苗用油包水佐剂，其特征在于按体积分数计，由以下原料制备而成：

矿物油： 74.5%-76.5%;

司盘80： 13.0%-15.5%;

吐温80： 1.5%-2.5%;

丙二醇脂肪酸酯： 2.5%-3.0%;

羟基化羊毛脂： 2.5%-3.5%;

单硬脂酸甘油酯： 1.5%-2.0%;

聚氧乙烯2EO油醇醚： 0.5%-1.0%。

2.权利要求1所述动物疫苗用油包水佐剂，其特征在于按体积分数计，所述矿物油74.5%，司盘80 15.5%，吐温80 2.0%，丙二醇脂肪酸酯3.0%，羟基化羊毛脂 2.5%，单硬脂酸甘油酯 1.5%，聚氧乙烯2EO油醇醚 1.0%。

3.权利要求1所述动物疫苗用油包水佐剂，其特征在于按体积分数计，所述矿物油75.0%，司盘80 13.5%，吐温80 2.5%，丙二醇脂肪酸酯3.0%，羟基化羊毛脂 3.0%，单硬脂酸甘油酯 2.0%，聚氧乙烯2EO油醇醚 1.0%。

4.权利要求1所述动物疫苗用油包水佐剂，其特征在于按体积分数计，所述矿物油76.5%，司盘80 13.0%，吐温80 2.0%，丙二醇脂肪酸酯3.0%，羟基化羊毛脂 3.5%，单硬脂酸甘油酯 1.5%，聚氧乙烯2EO油醇醚 0.5%。

5.权利要求1所述动物疫苗用油包水佐剂，其特征在于按体积分数计，所述矿物油76.5%，司盘80 14.0%，吐温80 1.5%，丙二醇脂肪酸酯2.5%，羟基化羊毛脂 3.0%，单硬脂酸甘油酯 1.5%，聚氧乙烯2EO油醇醚 1.0%。

6.权利要求1至5任一权利要求所述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，其特征在于按照原料组分的体积分数，通过以下步骤制备而成：

（1）在搅拌条件下，将矿物油加热至35-40℃；

（2）在搅拌条件下，向矿物油中加入司盘80、丙二醇脂肪酸酯和羟基化羊毛脂，并搅拌均匀，之后将所得混合液冷却至室温；

（3）在搅拌条件下，向冷却后的混合液中加入吐温80、单硬脂酸甘油酯和聚氧乙烯2EO油醇醚，并搅拌均匀，继后静置；

（4）将静置后的混合液经过滤即得动物疫苗用油包水佐剂。

7.根据权利要求6所述动物疫苗用油包水佐剂的制备方法，其特征在于所述搅拌条件为搅拌转速90-120转/分，搅拌时间20-30分钟。

8.权利要求1至5任一所述动物疫苗用油包水佐剂在制备动物疫苗中的应用，其特征在于在搅拌条件下，将佐剂与抗原混合乳化即得油包水型疫苗；所述佐剂与抗原的体积比为3：2。