BRPI0716548B1 - Vacina em emulsão, seu método de produção e método para preparação de uma bacterina leptospira tratada termicamente da vacina em emulsão - Google Patents
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Abstract
bacterinas tratadas termicamente e vacinas preparadas de tais bacterinas tratadas termicamente. a presente invenção refere-se a bacterinas tratadas termicamente, a um método para produção de bacterinas tratadas termicamente e a vacinas em emulsão preparadas de tais tratadas termicamente.
Description
[0001] Esta invenção refere-se, de modo geral, ao campo das vacinas e aos métodos para estabilização das vacinas em emulsão. Especificamente, esta invenção refere-se às bacterinas tratadas termicamente, a um método para produção de bacterinas tratadas termicamente e a vacinas em emulsão preparadas de tais bacterinas tratadas termicamente.
[0002] A vacinação vem sendo empregada crescentemente para controlar as doenças infecciosas nos animais. Os adjuvantes são frequentemente usados nas vacinas porque eles são capazes de aumentar a resposta humoral e/ou imune celular a um antígeno. As vacinas são frequentemente formuladas como emulsões porque a emulsão pode agir como um adjuvante e possui a propriedade de reter o antígeno como um depósito no sítio de injeção. Os emulsificantes são geralmente usados nas vacinas em emulsão. Além do uso desses emulsificantes, a estabilidade das vacinas em emulsão pode também ser obtida através da redução do tamanho da gotícula da emulsão por meios mecânicos.
[0003] A Patente US N° 5.084.269 refere-se a uma formulação adjuvante contendo lecitina em combinação com óleo mineral, que produz menos irritação dentro do animal hospedeiro e induz simultaneamente a imunidade sistêmica aumentada. As composições de acordo com a Patente US N° 5.084.269 estão em uso comercial sob a marca registrada AMPHIGEN®, uma marca registrada da Pfizer, Inc.
[0004] De modo geral, os antígenos bacterianos são instáveis quando aquecidos e mesmo a exposição breve às temperaturas elevadas pode reduzir a atividade dos antígenos. Por exemplo, vacinas contra antraz atuais podem perder toda atividade biológica com 48 horas a 37°C (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat e R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 6 de setembro de 2002; 295(5): 1058-62).
[0005] Esta invenção refere-se às bacterinas tratadas termicamente, a um método para produção de bacterinas tratadas termicamente e a vacinas em emulsão preparadas de tais bacterinas tratadas termicamente. O método compreende aquecimento da bacterina a uma temperatura de cerca de 35 a cerca de 80°C para formar a bacterina tratada termicamente.
[0006] Figura 1: Análise do tamanho da partícula de vacina prepara recentemente contendo bacterinas de Leptospira não-tratadas termicamente no dia 0
[0007] Figura 2: Análise do tamanho da partícula de vacina contendo bacterinas de Leptospira não-tratadas termicamente no dia 60
[0008] Figura 3: Análise do tamanho da partícula de vacina preparada recentemente contendo bacterinas de Leptospira tratadas termicamente no dia 0
[0009] Figura 4: Análise do tamanho da partícula de vacina contendo bacterinas de Leptospira tratadas termicamente no dia 60
[00010] Atividade antigênica aceitável - O termo "atividade antigênica aceitável" significa a capacidade de induzir uma resposta imune protetora nos animais vacinados após serem desafiados ou quando passam em um teste de potência codificada com organismo vivo homólogo.
[00011] Bacterina - O termo "bacterina" significa uma suspensão de bactérias mortas que podem ser usadas como um componente de uma vacina.
[00012] Emulsificante - O termo "emulsificante" significa uma substância usada para fabricação de uma emulsão mais estável.
[00013] Emulsão - O termo "emulsão" significa uma composição de dois líquidos imiscíveis onde gotículas pequenas de um líquido são suspensas em uma fase contínua de outro líquido.
[00014] Bacterina tratada termicamente - O termo "bacterina tratada termicamente" significa uma bacterina que foi tratada termicamente e que possui uma atividade da lipase de 50% ou menos em relação à atividade da lipase antes do tratamento térmico e possui atividade antigênica aceitável.
[00015] Emulsão de inversão - O termo "emulsão de inversão" significa uma emulsão de água em óleo.
[00016] Lipase - O termo "lipase"significa enzimas, esterases, lipases e fosfolipases, que podem causar rompimento de um emulsificante em uma vacina em emulsão.
[00017] Emulsão normal - O termo "emulsão normal" significa uma emulsão de óleo em água.
[00018] Emulsão de Óleo em Água - O termo "emulsão de óleo em água" significa uma emulsão onde pequenas gotículas de óleo são suspensas em uma fase de água contínua.
[00019] Temperatura ambiente - O termo "temperatura ambiente" significa uma temperatura de 18 a 25°C.
[00020] Emulsão de Água em Óleo - O termo "emulsão de água em óleo" significa uma emulsão na qual as gotículas de água são suspensas em uma fase de óleo contínuo.
[00021] Esta invenção refere-se às bacterinas com atividade de lipase reduzida, vacinas preparadas de tais bacterinas e um método para reduzir a atividade da lipase das bacterinas. Além dos componentes antigênicos, algumas bacterinas possuem atividade da lipase. Quando as bacterinas com atividade da lipase são incorporadas em uma emulsão, a lipase pode romper os emulsificantes usados para criar a emulsão. As vacinas em emulsão que contêm bacterinas possuindo atividade da lipase alta tendem a ser emulsões instáveis e aquelas que contêm bacterinas possuindo níveis baixos de lipase tendem a ser estáveis. Exemplos de bactérias que podem, quando mortas, produzir bacterinas possuindo atividade da lipase incluem Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii,espécies Treponema palladium e Leptospira,tais como os agentes patogênicos conhecidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona.
[00022] A lipase, que pode romper os emulsificantes usados para criar a emulsão, e assim causa a instabilidade da emulsão e rompimento, pode incluir uma ou mais enzimas de rompimento de emulsão, tais como, esterases, lipases e fosfolipases. Coletivamente, essas enzimas, esterases, lipases e fosfolipases são referidas como lipase. A atividade da lipase de uma bacteriana pode ser medida usando um substrato sintético denominado O-pivaloiloximetil umbeliferona (C- POM). A taxa de hidrólise causada pela lipase é medida pela atividade da lipase. A taxa de reação da hidrólise causada pela lipase nessa reação é monitorada por um aumento na intensidade de fluorescência do produto da atividade da lipase. A taxa de reação depende das condições de teste de hidrólise exatas escolhidas, de modo que as comparações dos níveis de atividade da lipase, conforme medidos por taxas de hidrólise sejam feitas usando dados produzidos pelas mesmas condições de teste. Os métodos da literatura são descritos em vários artigos, incluindo Kurioka S., e Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289, De Silva NS, e Quinn PA. (1987) J. Clin. Microbiol.25: 729- 731 e Grau, A. e Ortiz, A. (1998) Chem. Phys, of Lipids.91: 109-118.
[00023] Em uma vacina em emulsão, o rompimento da emulsão causa separação de fase dos componentes. Isso é indesejável porque quando existe uma separação de fase, as doses individuais removidas do recipiente não podem conter o mesmo nível de componentes de vacina. Além disso, a perda da emulsão pode conduzir a uma perda da atividade de adjuvante do emulsificante e conduzir a uma redução no efeito antigênico da vacina.
[00024] Os vírus vivos atenuados são frequentemente incluídos nas vacinas juntamente com as bacterinas. Tais vacinas são úteis porque uma vacina simples pode ser usada para criar imunidade às diferentes doenças com uma vacina. Se a atividade da lipase estiver presente na bacterina, isso causará a liberação do emulsificante da emulsão. Esse emulsificante livre pode interromper e inativar os vírus de vacina vivos, pelo que, conduzindo a uma perda da infectividade virótica.
[00025] Uma bacterina útil nas vacinas pode ser formada por cultivo da bactéria de interesse e então extermínio da bactéria para produzir uma bacterina contendo vários componentes bacterianos, incluindo componentes de parede da célula. As bactérias podem ser mortas por vários métodos incluindo exposição das mesmas a um composto, tal como, mertiolate, formalina, formaldeído, dietilamina, etilenoamina binária (BEI), beta propiolactona (BPL) e glutaraldeído. As combinações desses compostos podem ser usadas. Além disso, é possível exterminar as bactérias com radiação esterilizante.
[00026] Foi verificado agora que a atividade da lipase de uma bacterina possuindo tal atividade da lipase pode ser reduzida por tratamento térmico. Especificamente, a atividade da lipase de uma bacterina pode ser reduzida por aquecimento da bacterina a uma temperatura de cerca de 35 a cerca de 80°C para formar uma bacterina tratada termicamente, que possui atividade antigênica aceitável. O tratamento térmico é conduzido por um período de tempo suficiente, de modo que a atividade da lipase da bacterina tratada termicamente seja 50% ou menos em relação à encontrada na bacterina antes do tratamento térmico. Para boa estabilidade da vacina em emulsão, não é necessário que a atividade da lipase seja reduzida a zero. Verificou-se que as vacinas possuindo uma boa vida útil podem ser preparadas das bacterinas tratadas termicamente possuindo nível de atividade da lipase que é 50% ou menos que aquele nível de atividade da lipase antes do tratamento térmico.
[00027] Quando uma taxa de hidrólise de um substrato de teste tiver sido usada como uma medida da atividade da lipase de uma bacterina, então a taxa de hidrólise do substrato de teste antes do tratamento térmico é comparada à taxa de hidrólise após o tratamento térmico. O tratamento térmico é conduzido de modo a reduzir a taxa de hidrólise para 50% ou menos em relação aquela taxa de hidrólise que é observada para a bacterina fresca.
[00028] O método exato de medição do nível de atividade da lipase não é importante, à medida que o mesmo método seja usado para medir a atividade antes do tratamento térmico e a atividade após o tratamento térmico. Por exemplo, se a taxa de hidrólise de um substrato de teste for medida usando um substrato, um substrato diferente pode produzir uma taxa diferente. Contudo, se o mesmo substrato for usado para determinação da atividade inicial e determinação da atividade após tratamento, as taxas relativas ainda mostrarão o efeito do tratamento térmico.
[00029] Para as bacterinas compreendendo um ou mais dos que se seguem, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, existe um teste codificado para atividade antigênica (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104 e §113.105). Para essas espécies, a atividade antigênica aceitável é definida como a capacidade para induzir uma resposta imune protetora nos hamsters vacinados, tal que, quando os hamsters são desafiados com bactérias vivas homólogas, pelo menos 75% dos hamsters vacinados sobrevivem em um modelo onde pelo menos 80% dos hamsters não-vacinados não sobrevivem. No caso do antígeno, Leptospira hardjo, a atividade antigênica aceitável é definida como a capacidade de uma vacina de induzir uma titulação média geométrica de aglutinação sorológica contra Leptospira hardjo de > 40 em bezerros que foram vacinados com uma vacina compreendendo o antígeno bacteriano Leptospira hardjo. Para outras bacterinas, a atividade antigênica aceitável é definida como a capacidade de induzir uma resposta imune protetora em animais vacinados após serem desafiados ou quando passam em um teste de potência codificada com organismo vivo homólogo.
[00030] O tratamento térmico pode ser conduzido em uma faixa de temperaturas e por um período de tempo variável. De modo geral, o aquecimento pode ser realizado a uma temperatura de cerca de 35 a cerca de 80°C por cerca de 20 minutos a cerca de 24 horas. Quando a bacterina é aquecida a uma temperatura superior, tal como cerca de 75 a cerca de 80°C, o tempo de aquecimento está na extremidade menor da faixa de tempo. Quando o aquecimento é realizado a uma temperatura inferior, o aquecimento é realizado por um período de tempo mais longo. Outra combinação de temperatura e tempo é o aquecimento a uma temperatura de cerca de 60 a cerca de 70°C por cerca de 9 a cerca de 10 horas. Outra combinação de temperatura e tempo é o aquecimento a uma temperatura de cerca de 65 a cerca de 70°C por cerca de 5 a cerca de 8 horas. Outra combinação de temperatura e tempo é o aquecimento a uma temperatura de cerca de 65 a cerca de 70°C por cerca de uma hora. Outra combinação de temperatura e tempo é o aquecimento a uma temperatura de cerca de 55 a cerca de 65°C por cerca de 5 a cerca de 8 horas.
[00031] As bacterinas, após o tratamento térmico, possuem uma atividade da lipase mais baixa que as bacterinas preparadas recentemente, porém de outra forma podem ser formuladas da mesma forma que as bacterinas preparadas frescamente. Consequentemente, as bacterinas tratadas termicamente podem ser incorporadas às vacinas por métodos comuns de produção de vacinas. Esses métodos são bem conhecidos na técnica.
[00032] As vacinas em emulsão podem ser formadas por combinação da bacterina desejada com uma fase óleo e um emulsificante ou emulsificantes. A combinação é então submetida à agitação intensa para formar uma emulsão. Métodos de agitação apropriados incluem homogeneização e subsequente microfluidificação. Os conservantes e excipientes podem também ser incluídos na combinação antes da emulsificação.
[00033] As vacinas podem incluir ambos bacterianas e antígenos viróticos. Na preparação de uma vacina que inclui bacterinas e antígenos viróticos, as bacterinas, quaisquer antígenos viróticos a serem incluídos, o emulsificante ou emulsificantes e opcionalmente conservantes e excipientes são combinados com uma fase oleosa e emulsificados. Seguindo-se a formação da emulsão, o pH das formulações pode ser ajustado a um pH apropriado usando tanto soluções de NaOH quanto HCI. Para uso da vacina, é geralmente desejado que o pH esteja próximo ao neutro para evitar irritação no sítio de injeção. Um pH de cerca de 7,0 e cerca de 7,3 é comum.
[00034] Fases oleosas apropriadas para formação da vacina em emulsão incluem óleos não-metabolizáveis e óleos metabolizáveis. Os óleos não-metabolizáveis incluem óleos minerais, tais como, óleo mineral branco e óleo mineral leve. Os óleos metabolizáveis incluem óleos vegetais, óleos de peixe e glicerídeos de ácido graxo sintético.
[00035] Exemplos de emulsificantes que podem ser usados na preparação das vacinas em emulsão desta invenção são fosfolipídeos, ésteres de sorbitano, ésteres de sorbitano polietoxilados e derivados de manitol que são emulsificantes de vacina comuns. Os emulsificantes de fosfolipídeo incluem lecitina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinisitol, fosfatidilserina e lecitina, (por exemplo, tal como, AMPHIGEN®). Emulsificantes de éster sorbitano incluem monolaurato de sorbitano (por exemplo, Span® 20 e Arlacel® 20), mono-oleato de sorbitano (por exemplo, Span® 80 e Arlacel® 80), monopalmitato de sorbitano (por exemplo, Span® 40 e Arlacel® 40), e monoestearato de sorbitano (por exemplo, Span® 60 e Arlacel® 60). Os ésteres de sorbitano polietoxilados incluem monolaurato de polietóxi sorbitano (por exemplo, Tween® 20 e Tween® 21), mono-oleato de polietóxi sorbitano (por exemplo, Tween® 80), monopalmitato de polietóxi sorbitano (por exemplo, Tween® 40) e monoestearato de polietóxi sorbitano (por exemplo, Tween® 60). Emulsificantes derivados de manitol incluem éteres octadecanóicos de manitol. Span®, Arlacel® e Tween® são marcas registradas da ICI Americas. AMPHIGEN® é uma marca registrada da Pfizer, Inc. De modo geral, as vacinas são formuladas como óleo normal em emulsões de água, embora seja possível preparar água invertida em emulsões de óleo.
[00036] Vários adjuvantes, tais como, Quil A, colesterol, fosfato de alumínio e hidróxido de alumínio além de conservantes, tais como, mertiolate podem ser usados nas vacinas. Quil A é uma mistura purificada de quillaja saponina extraída da casca da árvore da América do Sul, Quillaja Saponaria Molina. Quil A atua diretamente no sistema imune para ativar um estado generalizado de sensibilidade. Agindo assim, ela induz tanto as respostas humorais quanto as respostas mediadas por célula. A cadeia lipofílica permite interação do antígeno e adjuvante a serem distribuídos no citosol para processamento de uma via endógena. Quil A é frequentemente usada como colesterol porque o colesterol elimina os efeitos colaterais menos desejáveis quando adicionado em proporções apropriadas. O colesterol forma complexos insolúveis com Quil A que formam estruturas semelhantes a hélices, conforme o colesterol se liga à Quil A, assim expondo as unidades de açúcar da molécula que ajudam a estimular a resposta imune.
[00037] É comum adicionar antígenos viróticos às vacinas contendo bacterinas. Uma vantagem dessa abordagem é que uma vacina podem ser usada para criar imunidade para várias doenças ao invés de requerer dosagens de várias vacinas diferentes para obter o mesmo resultado. Ambos os vírus mortos e vírus vivos atenuados podem ser usados nas vacinas. Entre os vírus que pode ser utilizados estão o herpesvirus aviário, herpesvirus bovino, herpesvirus canino, herpesvirus equino, vírus da rinotraqueite virótica felina, vírus da doença de Marek, herpervírus ovino, herpesvirus porcino, vírus da pseudorraiva, paramixovírus aviário, vírus sincicial respiratório bovino, vírus da cinomose canina, vírus da parainfluenza canina, parainfluenza bovina 3, parainfluenza ovina 3, vírus da Rinderpest, vírus da doença limítrofe, vírus da diarreia virótica bovina (BVD), vírus da febre suína clássica, vírus da leucose aviária, vírus da imunodeficiência bovina, vírus da leucemia bovina, vírus da anemia infecciosa eqüina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da leucemia felina, vírus da pneumonia progressiva ovina, vírus de adenocarcinoma pulmonar ovino, coronavirus canino, coronavirus bovino, coronavirus entérico felino, peritonite infecciosa felina, vírus, vírus da diarreia epidêmica porcina, vírus da encefalomielite hemaglutinante porcina, parvovirus porcino, vírus da gastroenterite transmissível, coronavirus de perus, vírus da febre transitória bovina, raiva, vírus da estomatite vesicular, vírus influenza aviário, vírus influenza eqüino, vírus influenza suíno, vírus influenza canino, vírus da encefalite equina do leste (EEE), vírus da encefalite equina venezuelana e vírus da encefalite equina do oeste.
[00038] Se a atividade da lipase estiver presente em uma bacterina, isso pode causar a liberação do emulsificante da emulsão. Esse emulsificante livre pode romper o envelope do vírus vivo e inativar os vírus da vacina vivos, pelo que conduzindo a uma perda da infectividade virótica. Consequentemente, o tratamento térmico da bacterina serve para estabilizar a emulsão e preservar seu efeito adjuvante, bem como preservar a infectividade virótica dos vírus.
[00039] Os exemplos que se seguem são providos com a finalidade apenas de ilustração adicional e não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada.
[00040] A turvação é determinada nas Unidades Nefelométricas (NU) por um método de difusão de luz. A intensidade da luz difundida pela amostra sob condições definidas é comparada à intensidade da luz difundida por uma suspensão de referência padrão. Quanto maior a intensidade da luz difundida, maior a turvação da amostra. Uma fonte de luz é direcionada para dentro da amostra e a difusão da luz é medida a 90° com relação à direção da fonte de luz. O instrumento é calibrado por medição da difusão da luz a partir de uma suspensão de formazina.
[00041] Água ultrafiltrada é preparada por filtração da água destilada através de um filtro de membrana possuindo um tamanho de poro de 0,2 pm. Uma primeira solução é preparada por dissolução de 1,00 g de sulfato de hidrazina, (NH2) H2SO4, em água ultrafiltrada e diluição com água ultrafiltrada para 100 ml_, em um frasco volumétrico. Uma segunda solução é preparada por dissolução de 10,00 g de hexametilenotetramina em água ultrafiltrada e diluição com água ultrafiltrada para 100 ml_ em um frasco volumétrico. A suspensão de formazina é preparada por mistura de 5,0 ml da primeira solução com 5,0 ml_ da segunda solução. A mistura repousa por 24 horas aproximadamente a 24°C. A mistura é diluída para 100 ml_ com água ultrafiltrada para formar uma suspensão de turvação mestra possuindo uma turvação de 400 NU. Uma suspensão de turvação de 40 NU de formazina é preparada por diluição de 10,00 mL da suspensão de turvação mestra para 100 mL com água ultrafiltrada. Soluções de calibração adicionais são preparadas por diluição da solução mestre.
[00042] A amostra a ser medida é diluída com água ultrafiltrada, de modo que a turvação cai para a faixa calibrada do nefelômetro. A turvação é medida e a turvação original é calculada usando a seguinte equação:
onde: M é a turvação da amostra diluída em NU D é o volume da água de diluição em ml_ O é o volume da amostra original, em ml_
[00043] A atividade da lipase foi determinada usando O-pivaloxime- tilumbeliferona como um substrato fluorgênico. A hidrólise catalisada da lipase desse substrato não-fluorescente produz um hidroximetiléter, que é instável sob condições aquosas. A decomposição do hidroximetiléter instável gera formaldeído e o produto fluorescente umbeliferona. O monitoramento da intensidade de fluorescência da umbeliferona uma microesfera produzida, como uma função do tempo, provê uma medição cinética sensível da atividade enzimática da lipase.
[00044] As soluções de O-pivaloximetilumbeliferona (Produto da Molecular Probes número P35901) foram preparadas em DMSO puro, em uma concentração-estoque de 5 mM; solução não-usada foi armazenada a -20°C, protegida da luz. A solução de 5 mM de O- pivaloximetilumbeliferona foi diluída para 750 pM usando 58 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0) e a solução resultante foi preaquecida para 37°C. A amostra de Leptospiraou tampão de controle/meio foi centrifugado por 10 minutos à temperatura ambiente a 6.500 X de gravidade para formar um pélete e um sobrenadante. As reações foram realizadas por combinação de 15 pL de 100 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0) com 15 pL do sobrenadante à temperatura ambiente a partir da amostra de Leptospiraou o tampão de controle/meio, nas cavidades de ensaio de placas de 96 cavidades de volume baixo (Corning 3393, superfície de não-ligação de poliestireno preto, meia-área); pré- incubação por 10 minutos a 37°C; então iniciando a reação por adição de 20 pL de 750 pM de O- pivaloximetilumbeliferona ou o tampão de controle/meio. As misturas de reação resultantes continham 53 mM de tampão TRIS-HCI (pH 8,0) e 0 ou 300 pM de O- pivaloximetilumbeliferona. A intensidade de fluorescência foi medida em intervalos de 30-45 segundos por um período de uma hora (Spectramax Gemini XS, 37°C, Àex = 360 nm, Àem=460 nm, PMT "meio" de ajuste de sensibilidade, 6 leituras por cavidade). A taxa de reação foi determinada da inclinação da curva de progresso resultante.
[00045] Uma mistura de leptospira exterminada com mertiolate contendo as espécies que se seguem Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo e Leptospira pomona foi preparado para formar uma bacterina. Seis amostras de uma bacterina foram armazenadas por toda a noite (aproximadamente 12 horas) a 4°C, 37°C, 45°C, 56°C, 65°C e 80°C. A amostra, armazenada a 4°C serviu como o controle não-tratado. As amostras armazenadas por 12 horas a 37°C, 45°C, 56°C, 65°C e 80 °C eram amostradas tratadas com aquecimento. Após o armazenamento, a taxa na qual um substrato de teste hidrolisou na presença de cada bacterina foi medida de acordo com o método do Procedimento 2. A taxa de hidrólise para uma amostra dividida pela taxa de hidrólise da amostra armazenada a 4°C multiplicada por 100 é a porcentagem da atividade da lipase original de cada bacterina que permanece após armazenamento. O gráfico que se segue mostra a temperatura de armazenamento e a porcentagem da atividade da lipase original que permanece após armazenamento.
[00046] Culturas de Leptospira canicola, Leptospira icteroha- emorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo e Leptospira pomona foram desenvolvidas. A turvação de cada cultura foi medida em unidades nefelométricas (NU). As bactérias foram mortas com mertiolate para formar bacterinas. Cada bacterina foi tratada a 65°C por 8 horas para reduzir a atividade da lipase. As bacterinas foram combinadas e então misturadas com AMPHIGEN®, adjuvantes, conservantes, e tampão de diluição, de modo que cada 5 mL de dose da vacina continham os componentes estabelecidos no gráfico a seguir. Concentrações de Antígenos
[00047] A formulação foi homogeneizada usando um homoge- neizador Silverson e microfluidificada usando um microfluidificador da Microfluidics. Seguindo-se ambas a homogeneização e a microflui- dificação, o pH da formulação foi ajustado para um pH de 7,0 a 7,3.
[00048] A vacina do Exemplo 2 foi administrada aos hamsters e ao gado para testar a potência usando modelos de animais de laboratório e hospedeiros-padrão. Os hamsters do teste foram então desafiados com uma dose de Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa ou Leptospira pomona de modo a testar a potência das vacinas. O número de sobreviventes foi medido como uma demonstração da eficácia. As titulações de aglutinação microscópica bovinas foram medidas contra Leptospira hardjo de modo a demonstrar a potência daquela fração da vacina no gado. A tabela que se segue mostra que as vacinas preparadas de bacterinas de Leptospira tratadas são capazes de produzir uma resposta antigênica que se encontra dentro dos critérios de eficácia.
[00049] Uma vacina foi preparada das bacterinas de Leptospira tratadas termicamente de acordo com o método do Exemplo 2. Uma vacina semelhante foi preparada de bacterinas de Leptospira não- tratadas termicamente de acordo com o método do Exemplo 2. Ambas as formulações de vacina foram armazenadas a 4°C por 60 dias. A análise do tamanho de partícula foi realizada para cada vacina, quando preparadas frescamente no dia 0 e novamente no dia 60 usando um difratrômetro a laser.
[00050] As figuras 1 a 4 mostram as distribuições de tamanho de partícula para cada vacina no dia 0 antes e após armazenamento por 60 dias.
[00051] A vacina preparada das bacterinas de Leptospira tratadas termicamente mostra retenção de tamanho de partícula indicando estabilidade em emulsão. A vacina preparada das bacterinas de Leptospira não-tratadas termicamente mostra um aumento no tamanho da partícula indicando rompimento em emulsão.
[00052] Seguindo-se o método do exemplo 2, as vacinas foram preparadas de bacterinas de Leptospira não-tratadas termicamente e bacterinas de Leptospira tratadas termicamente. Após 5 a 6 meses de envelhecimento, as vacinas foram testadas quanto à atividade viricida contra vírus BHV-1, vírus PI3 e vírus BRSV. O teste de atividade viricida foi realizado por rehidratação dos controles de ensaio viricida monovalentes (VAC) com o diluente contendo adjuvante a ser testado. Dois controles de ensaio viricida monovalentes foram rehidratados em cada volume de dose. Os dois VACs monovalentes rehidratados foram agrupados e incubados a 20-25°C por duas horas antes da titulação e incubação nas células para determinar a titulação virótica viva por TCID50 (50% da dose infecciosa de cultura de tecido). É insatisfatório ter-se uma perda de titulação virótica superior a 0,7 TCIDso/mL.
[00053] Os resultados dos ensaios viricidas mostrando perda de titulação virótica são listados na tabela a seguir:
[00054] A vacina fabricada com bacterinas de Leptospira não- tratadas termicamente mostra altos níveis de atividade viricida. A vacina fabricada com bacterinas de Leptospira tratadas termicamente era não- viricida.
Claims (12)
1. Vacina em emulsão, caracterizada pelo fato de que compreende (a) uma emulsão compreendendo um óleo e um ou mais emulsificantes, e (b) uma bacterina Leptospiratratada termicamente compreendendo uma suspensão de bactérias Leptospiramortas que apresentam uma atividade da lipase de 50% ou menos do que a atividade da lipase da bacterina antes do tratamento térmico, e que apresenta atividade antigênica aceitável; em que a referida bacterina Leptospiratratada termicamente é preparada por um método compreendendo aquecer a bacterina a uma temperatura de 60 a 70°C por 5 a 10 horas.
2. Vacina em emulsão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida bacterina Leptospiratratada termicamente é preparada por um método compreendendo aquecer a bacterina a uma temperatura de 65°C por 8 horas.
3. Vacina em emulsão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as bactérias Leptospiramortas são uma a cinco espécies de Leptospiraselecionadas do grupo consistindo em Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiaee Leptospira pomona.
4. Vacina em emulsão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda vírus vivos.
5. Vacina em emulsão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os vírus vivos são um a três vírus selecionados do grupo consistindo em vírus da rinotraqueite bovina (IBR), vírus parainfluenza 3 (PI3) e vírus sincicial respiratório bovino (BRSV).
6. Vacina em emulsão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda vírus mortos.
7. Vacina em emulsão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os vírus mortos são um ou dois vírus selecionados do grupo consistindo em diarreia virótica bovina do tipo 1 (BVD) e diarreia virótica bovina do tipo 2 (BVD).
8. Vacina em emulsão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma preparação de lecitina, Quil A e colesterol.
9. Método para preparação de uma bacterina Leptospira tratada termicamente da vacina em emulsão como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende (a) medir a atividade da lipase de uma bacterina; b) aquecer a bacterina a uma temperatura de 60 a 70°C por 5 a 10 horas; (c) medir a atividade da lipase de uma bacterina após tratamento térmico; (d) comparar a atividade da lipase da bacterina antes do aquecimento com a atividade da lipase da bacterina após aquecimento; e (e) selecionar uma bacterina tratada termicamente, em que a atividade da lipase após tratamento térmico é de 50% ou menos da atividade da lipase de uma bacterina antes do tratamento térmico.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a bacterina é aquecida a uma temperatura de 65°C por 8 horas.
11. Método de produção da vacina em emulsão, caracterizado pelo fato de que é como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
12. Vacina em emulsão, caracterizada pelo fato de que compreende bacterinas Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae e Leptospira pomona tratadas termicamente obtidas pelo aquecimento das bacterinas a uma temperatura de 65°C por 8 horas, e compreendendo ainda AMPHIGEN®, adjuvantes, conservantes e tampão de diluição de forma que a concentração das bacterinas é de 1200 NU/5 ml_ dose para todas as bacterinas Leptospira,exceto Leptospira hardjo, que está a 2400 NU/5 ml_ dose, em que a vacina em emulsão é homogeneizada e microfluidizada, e então o pH ajustado para pH 7 0 a 7 3.
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