CN101516393B - 热处理菌苗和由该热处理菌苗制备的乳液疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了热处理菌苗、生产热处理菌苗的方法及由该热处理菌苗制备的乳液疫苗。

Description

热处理菌苗和由该热处理菌苗制备的乳液疫苗
技术领域
本发明大体上涉及疫苗领域和使乳液疫苗稳定的方法。特别是，本发明涉及热处理菌苗(bacterin)、生产热处理菌苗的方法以及由该热处理菌苗制备的乳液疫苗。 
发明背景 
疫苗接种越来越多地用于控制动物的传染病。在疫苗中经常使用佐剂，因为它们能提高对抗原的体液和/或细胞免疫反应。疫苗通常被制成乳液，因为乳液能充当佐剂，并且具有将抗原在注入位置保持为贮存库(depot)的性质。在乳液疫苗中经常使用乳化剂。除使用乳化剂之外，也可通过用机械方法减小乳液的液滴尺寸来实现乳液疫苗的稳定性。 
美国专利5,084,269涉及一种含有与矿物油结合的卵磷脂的佐剂制剂，其对宿主动物产生更小的刺激，同时引起更强的系统免疫。根据美国专利5,084,269的组合物已经以商品名 
Figure G2007800337672D00011
(辉瑞公司的一项商标)投入商业应用。 
通常，细菌抗原在受热时不稳定，甚至短暂地暴露于较高温度也会降低抗原活性。例如，目前的炭疽疫苗在37℃经过48小时就会丧失全部生物活性(S.Sing，N.Ahuja，V.Chauhan，E.Rajasekaran，W.S.Mohsin，R.Bhat，以及R.Bhatnagar；Bioche.Biophys.Res.Commun.2002Sep.6；295(5)：1058-62)。 
发明内容
本发明涉及热处理菌苗、生产热处理菌苗的方法以及由该热处理菌苗制备的乳液疫苗。所述方法包括将菌苗加热至约35℃到约80℃的温度，以形成热处理菌苗。 
具体实施方式
定义 
可接受的抗原活性-术语“可接受的抗原活性”是指在接种疫苗的动物中，在受到同源活体微生物刺激之后或通过用同源活体微生物进行程式化效用测试(codified potency test)，引起保护性免疫反应的能力。 
菌苗-术语“菌苗”是指灭活细菌的悬浮液，其可用作疫苗的组分。 
乳化剂-术语“乳化剂”是指用于使乳液更稳定的物质。 
乳液-术语“乳液”是指两种不混溶液体的组合物，其中一种液体的小液滴悬浮在另一种液体的连续相中。 
热处理菌苗-术语“热处理菌苗”是指已经过热处理的菌苗，其脂肪酶活性为热处理前脂肪酶活性的50％或更低，并且具有可接受的抗原活性。 
逆乳液(invert emulsion)-术语“逆乳液”是指油包水乳液。 
脂肪酶-术语“脂肪酶”是指能够在乳液疫苗中引起乳化剂破乳(breakdown)的酶、酯酶、脂肪酶和磷脂酶。 
正乳液(normal emulsion)-术语“正乳液”是指水包油乳液。 
水包油乳液-术语“水包油乳液”是指其中小油滴悬浮在连续水相中的乳液。 
室温-术语“室温”是指18-25℃的温度。 
油包水乳液-术语“油包水乳液”是指其中水滴悬浮在连续油相中的乳液。 
说明 
本发明涉及具有降低的脂肪酶活性的菌苗、由该菌苗制备的疫苗以及降低菌苗的脂肪酶活性的方法。除抗原组分之外，某些菌苗具有脂肪酶活性。当将具有脂肪酶活性的菌苗引入乳液中时，脂肪酶可破坏用于构建乳液的乳化剂。包含具有高脂肪酶活性的菌苗的乳液疫苗趋向于变为不稳定的乳液，且包含具有低脂肪酶水平的菌苗的那些乳液疫苗趋向于稳定。灭活后可能会产生具有脂肪酶活性的菌苗的菌苗 例子包括：醋酸钙不动杆菌(Aceinetobacter calcoaceticus)、巴氏醋杆菌(Acetobacter paseruianus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、闪烁古生球菌(Arhaeglobus fulgidus)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophillus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、Bacillus thermocatenulatus、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)、颖壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)、猪肠弯曲杆菌(Campylobacter hyointestinalis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、染色粘性菌(Chromobacterium viscosum)、丹毒杆菌(Erysipelothrixrhusiopathieae)、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes  大肠杆菌Escherichia coli、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、细胞内罗松菌(Lawsonia intracellularis)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、Moraxellsa sp.、猪肺炎霉形体(Mycoplasmahyopneumoniae)、丝状支原体丝状亚种LC(Mycoplasma mycoides subsp.mycoides LC)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、昆虫病原线虫共生菌(Photorhabdus luminescens)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumaches)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、Pseudomnas wisconsinensis、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌C9(Pseudomonas fluorescens C9)、荧光假单胞菌SIKW1(Pseudomonasfluorescens SIKW1)、莓实极毛杆菌(Pseudomonas fragi)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、食油吸毛杆菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌B11-1种(Pseudomonas sp B11-1)、真养产碱杆菌(Alcaligeseutrophus)、南极耐冷菌(Psychrobacter immobilis)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyPhimurium)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)、钝钉螺旋藻(Spirlina platensis)、金黄色葡萄球菌(Staphlyoccocus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphyloccoccusepidermidis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates)、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、耐热嗜酸古细菌(Sulfolobus acidocaldarius)、Syechocystis sp.、霍乱弧 菌(Vibrio cholerae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、微小密螺旋体(Treponema minutum)、溃蚀密螺旋体(Treponema phagedenis)、屈曲密螺旋体(Treponemarefringens)、文氏密螺旋体(Treponema vincentii)、苍白密螺旋体(Treponema palladium)和钩端螺旋体属(Leptospira)[例如，已知的病原体犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospiragrippotyposa)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)和波摩那钩端螺旋体(LeptospiraPomona)]。 
可破坏用于构建乳液的乳化剂从而导致乳液不稳定和破乳的脂肪酶可包括一种或多种破乳酶，例如酯酶、脂肪酶和磷脂酶。这些酶、酯酶、脂肪酶和磷脂酶统称为脂肪酶。菌苗的脂肪酶活性可使用被称为O-新戊酰氧基甲基伞形酮(C-POM)的合成底物(substrate)来测量。由脂肪酶引起的水解速率是脂肪酶活性的量度标准。在该反应中由脂肪酶引起的水解的反应速率通过脂肪酶活性产物的荧光密度的升高来监测。反应速率取决于所选择的确切水解测试条件，因此当通过水解速率测量时，脂肪酶活性水平之间的比较应当使用在相同测试条件下得到的数据来进行。在若干论文中公开了文献方法，这些论文包括Kurioka S.和Matsuda M.(1976)Ana.Biochem.75：281-289；De Silva NS和Quinn PA.(1987)J.Clin.Microbiol.25：729-731；以及Grau，A.和Ortiz，A.(1998)Chem.Phys.of Lipids.91：109-118。 
在乳液疫苗中，乳液的破乳引起各组分的相分离。这是不希望的，因为当存在相分离时，从容器中取出的个别剂量可能不会含有相同含量的疫苗组分。此外，乳液的丧失会导致乳化剂的佐剂活性丧失，并导致疫苗的抗原效应降低。 
在疫苗中经常包括减毒活病毒及菌苗。这类疫苗是有用的，因为单一疫苗可用于以一种疫苗来产生对不同疾病的免疫。如果在菌苗中存在脂肪酶活性，其会导致乳化剂从乳液中释放出来。这种游离乳化剂能够破坏和灭活活体疫苗病毒，从而导致病毒感染力的丧失。 
可通过下述方法来形成在疫苗中有用的菌苗：培养目标细菌，随后将该细菌灭活以产生含有多种细菌组分(包括细胞壁组分)的菌苗。 细菌可通过多种方法灭活，包括将它们暴露于诸如硫柳汞、福尔马林、甲醛、二乙胺、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)和戊二醛之类的化合物。也可使用这些化合物的组合。此外，可以通过杀菌辐射来使细菌灭活。 
现在已经发现，可通过热处理来降低具有脂肪酶活性的菌苗的脂肪酶活性。具体地说，通过将菌苗加热至约35到约80℃的温度可降低菌苗的脂肪酶活性，以形成具有可接受的抗原活性的热处理菌苗。热处理进行一段足够长的时间，从而使热处理菌苗的脂肪酶活性为热处理前菌苗脂肪酶活性的50％或更低。为得到良好的乳液疫苗稳定性，无须将脂肪酶活性降至零。我们已经发现，可从其脂肪酶活性为热处理前脂肪酶活性水平的50％或更低的热处理菌苗来制备具有良好贮存期限的疫苗。 
当使用测试底物的水解速率作为菌苗脂肪酶活性的量度标准时，则将热处理前测试底物的水解速率与热处理后的水解速率进行比较。进行热处理以将水解速率降低至对新鲜菌苗观察到的水解速率的50％或更低。 
检测脂肪酶活性水平的确切方法并不重要，只要使用同一方法来检测热处理前的活性和热处理后的活性即可。例如，如果使用一种底物来测量测试底物的水解速率，那么一种不同的底物可能会产生不同的速率。然而，如果使用同一底物来进行初始的活性测定和处理后的活性测定，那么相对速率仍然能显示热处理的效果。 
对于包括以下犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体中的一种或多种的菌苗，存在对抗原活性的程式化测试(9CFR§113.101、§113.102、§113.103、§113.104和§113.105)。对于这些物种，可接受的抗原活性定义为在接种疫苗的仓鼠中诱导如下保护性免疫的能力：当仓鼠受到同源活体细菌刺激时，在模型中至少有75％的接种仓鼠存活，而至少80％的未接种仓鼠不能存活。在抗原为哈德焦钩端螺旋体的情况下，可接受的抗原活性定义为在已经用包括细菌抗原哈德焦钩端螺旋体的疫苗接种的小牛中，疫苗引起≥40的针对哈德焦钩端螺旋体的血清凝集几何平均滴定度的能力。对于其他菌苗，可接受的抗原活性定义为在接种疫苗的动物中、 在受到同源活体微生物刺激之后或通过用同源活体微生物进行程式化效用测试，引起保护性免疫反应的能力。 
热处理可在一定温度范围内进行，并且可持续不同的时间长度。通常，加热可在约35到约80℃的温度进行约20分钟到约24小时。当将菌苗加热至较高温度如约75到约80℃时，加热时间在时间范围的较短端。当加热在较低温度进行时，加热进行一段较长的时间。另一温度和时间的组合是在约60到约70℃加热约9到约10小时。另一温度和时间的组合是在约65到约70℃加热约5到约8小时。另一温度和时间的组合是在约65到约70℃加热约1小时。另一温度和时间的组合是在约55到约65℃加热约5到约8小时。 
在热处理之后，菌苗与新鲜制备的菌苗相比具有较低的脂肪酶活性，但也可以采用与新鲜制备的菌苗相同的方式配制。因此，热处理菌苗可通过生产疫苗的常规方法引入疫苗中。这些方法也是本领域公知的。 
乳液疫苗可通过将所需菌苗与油相和乳化剂或多种乳化剂混合来形成。随后可对该混合物进行剧烈搅拌以形成乳液。适合的搅拌方法包括均化并随后微流体化(microfluidizing)。在乳化前，还可向该混合物中加入防腐剂和赋形剂。 
疫苗也可同时包括菌苗和病毒抗原。在制备包括菌苗和病毒抗原的疫苗时，将菌苗、任何待加入的病毒抗原、乳化剂或多种乳化剂、以及可选的防腐剂和赋形剂与油相混合，并且乳化。在形成乳液之后，可使用NaOH溶液或HCl溶液将制剂的pH值调节至适当的pH值。对于疫苗用途，通常需要pH值接近中性以避免对注入部位的刺激。通常为约7.0到约7.3的pH值。 
适用于形成乳液疫苗的油相包括不可代谢的油类和可代谢的油类。不可代谢的油类包括矿物油(如石蜡油)和轻矿物油。可代谢的油类包括植物油、鱼油和合成脂肪酸甘油酯。 
可用于制备本发明的乳液疫苗的乳化剂的例子是磷脂、脱水山梨醇酯、聚乙氧基脱水山梨醇酯和甘露醇衍生物，它们是常用的疫苗乳化剂。磷脂乳化剂包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇(phosphatidylinisitol)、磷脂酰丝氨酸和卵磷脂(例如， )。 脱水山梨醇酯乳化剂包括脱水山梨醇单月桂酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D00071
20和 
Figure G2007800337672D00072
20)、脱水山梨醇单油酸酯(例如， 80和 80)、脱水山梨醇单棕榈酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D00075
40和 
Figure G2007800337672D00076
40)和脱水山梨醇单硬脂酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D00077
60和 
Figure G2007800337672D00078
60)。聚乙氧基脱水山梨醇酯包括聚乙氧基脱水山梨醇单月桂酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D00079
20和 
Figure G2007800337672D000710
21)、聚乙氧基脱水山梨醇单油酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D000711
80)、聚乙氧基脱水山梨醇单棕榈酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D000712
40)和聚乙氧基脱水山梨醇单硬脂酸酯(例如， 
Figure G2007800337672D000713
60)。甘露醇衍生物乳化剂包括甘露醇十八烷酸醚。 
Figure G2007800337672D000714
Figure G2007800337672D000715
和 
Figure G2007800337672D000716
是ICI Americas的商标。 
Figure G2007800337672D000717
是辉瑞公司的商标。疫苗通常配制为水包油型正乳液，虽然也可制备油包水型逆乳液。 
在疫苗中可使用诸如Quil A、胆固醇、磷酸铝和氢氧化铝之类的多种佐剂和诸如硫柳汞之类的防腐剂。Quil A是从南美皂皮树(SouthAmerican tree Quillaia Saponaria Molina)的树皮提取的皂树皮皂甙(quillaja saponin)的纯化混合物。Quil A直接作用于免疫系统上，以激活全身化(generalized)的敏感状态。通过这种作用，其同时诱导了体液介导和细胞介导的反应。亲脂性链允许抗原和待输送到细胞溶质中的佐剂的相互作用，以便通过内源方式进行。Quil A通常与胆固醇一起使用，因为当以适当比例加入胆固醇时消除了较不希望的副作用。胆固醇与Quil A形成不溶性复合物，当胆固醇与Quil A结合时其形成螺旋状结构，由此使分子的糖单元暴露，这有助于刺激免疫反应。 
向含有菌苗的疫苗中加入病毒抗原是很普遍的。这种方法的一个优点是一种疫苗可用于对若干疾病形成免疫性，而不需要使用多剂量的若干不同疫苗来实现相同的效果。灭活病毒和减毒活病毒均可用在疫苗中。可使用的病毒包括禽疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎病毒、马立克氏病病毒、羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、伪狂犬病病毒、禽副粘病毒、牛呼吸道合胞病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、牛副流感病毒3、羊副流感病毒3、牛瘟病毒、边境病病毒、牛病毒性腹泻(BVD)病毒、典型猪瘟病毒、禽白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、马传染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、猫白血病毒、羊进行性(progressive)肺炎病毒、羊肺腺癌病毒、 犬冠状病毒、牛冠状病毒、猫伤寒冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、传染性胃肠炎病毒、火鸡冠状病毒、牛暂时热病毒、狂犬病毒、水泡性口膜炎病毒、禽流感病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒和西方马脑炎病毒。 
如果菌苗具有脂肪酶活性，其可导致乳化剂从乳液中释放。这种游离的乳化剂可能会破坏活病毒的包膜，并使活体疫苗病毒失活，从而导致病毒感染性的丧失。因此，菌苗热处理能起到稳定乳液并保持其佐剂作用的效果，同时保持病毒的病毒感染性。 
为进一步说明的目的提供以下实施例，其并不用于限制所要求保护的发明范围。 
步骤 
步骤1浊度测定 
在浊度计单元(Nephelometric Units，NU)中通过光散射方法来测定浊度。将在给定条件下被样品散射的光的强度与被标准参照悬浮液散射的光的强度进行比较。散射光的强度越高，样品的浊度越大。使光源射向样品，并在与光源方向成90°的方向来检测光散射。通过检测福尔马肼(formazin)悬浮液的光散射来对设备进行校准。 
浊度计设备的校准 
通过用孔径为0.2μm的薄膜过滤器过滤蒸馏水来制备超滤水。将1.00g硫酸肼((NH2)·H2SO4)溶解在超滤水中，并在容量瓶中用超滤水稀释到100ml，从而制备第一溶液。将10.00g六亚甲基四胺溶解在超滤水中，并在容量瓶中用超滤水稀释到100ml，从而制备第二溶液。将5.0ml的第一溶液与5.0ml的第二溶液混合，从而制备福尔马肼悬浮液。将混合物在约24℃静置24小时。将混合物用超滤水稀释至100ml，以形成浊度为400NU的浊度悬浮液母液(stock turbiditysuspension)。将10.00ml的浊度悬浮液母液用超滤水稀释至100ml，以制备40NU的福尔马肼浊度悬浮液。通过稀释母液来制备其他校准溶液。 
浊度检测 
用超滤水稀释待检测样品，从而使浊度落入浊度计的校准范围内。测定浊度，并用以下公式来计算原始浊度： 
Figure G2007800337672D00091
其中：M是稀释样品的浊度(NU) 
D是稀释水的体积(mL) 
O是样品的原始体积(mL) 
步骤2脂肪酶活性 
使用O-新戊酰氧基甲基伞形酮作为荧光底物来测定脂肪酶活性。这种非荧光底物的脂肪酶催化水解产生了在水性条件下不稳定的羟甲基醚。不稳定羟甲基醚的分解产生了甲醛和荧光产物伞形酮。对所产生的伞形酮的荧光强度(其为时间的函数)的监测提供了对脂肪酶酶活性的灵敏的动态测量。 
在净DMSO中制备O-新戊酰氧基甲基伞形酮(分子探针产物号P35901)的溶液，母液浓度5mM；将不使用的溶液在-20℃避光保存。用58mM的TRIS-HCl缓冲液(pH 8.0)来将5mM的O-新戊酰氧基甲基伞形酮溶液稀释至750μM，并将所得溶液预热至37℃。将钩端螺旋体样品或对照缓冲液/基质在室温和6500倍重力下离心10分钟，形成团粒(pellet)和上清液。在低容积96孔板(Corning 3393，黑色聚苯乙烯不粘表面，半面积)的分析孔中将15μL 100mM的TRIS-HCl缓冲液(pH8.0)与15μL在室温下得自钩端螺旋体样品或对照缓冲液/基质的上清液混合以进行反应；在37℃预孵育10分钟；随后通过加入20μL 750μM的O-新戊酰氧基甲基伞形酮或对照缓冲液/基质来引发反应。所得反应混合物含有53mM的TRIS-HCl缓冲液(pH 8.0)和0或300μM的O-新戊酰氧基甲基伞形酮。经过1小时的时间，以30-45秒的间隔测量荧光强度(Spectramax Gemini XS，37℃，λex＝360nm，λem＝460nm，PMT灵敏度设定‘中等’，每孔读数6次)。从所得进程曲线的斜率来确定反应速率。 
实施例 
实施例1通过热处理来降低脂肪酶活性 
制备用硫柳汞灭活的钩端螺旋体池(pool)以形成菌苗，所述钩端螺旋体包括以下物种：犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体。将6个菌苗样品在4℃、37℃、45℃、56℃、65℃和80℃下存储过夜(约12小时)。在4℃存储的样品充当未处理的对照物。在37℃、45℃、56℃、65℃和80℃存储12小时的样品是热处理样品。存储后，根据步骤2的方法测量在各种菌苗存在下测试底物的水解速率。样品水解速率除以在4℃存储的样品的水解速率再乘以100，就是每种菌苗在存储后保留的原始脂肪酶活性百分比。下表显示了存储温度和存储后保留的原始脂肪酶活性百分比。 
  存储温度(12小时)  4℃   37℃   45℃   56℃   65℃   80℃
  原始脂肪酶活性百分比  100％   55.4％   32.5％   15.7％   10.8％   8.4％
实施例2试验疫苗制剂的制备 
使犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体的培养物生长。在浊度计单元中测量每种培养物的浊度(NU)。用硫柳汞将细菌灭活以形成菌苗。将每种菌苗在65℃热处理8小时以降低脂肪酶活性。将菌苗合并，随后与 
Figure G2007800337672D00101
佐剂、防腐剂和稀释缓冲剂混合，由此使每5ml剂量的疫苗含有下表中列出的组分。 
抗原浓度 
  组分   组分浓度/剂量
  犬钩端螺旋体   1200NU/5ml剂量
  出血黄疸钩端螺旋体   1200NU/5ml剂量
  流感伤寒钩端螺旋体   1200NU/5ml剂量
  哈德焦钩端螺旋体   2400NU/5ml剂量
  波摩那钩端螺旋体   1200NU/5ml剂量
使用Silverson均化器将该制剂均化，并使用来自Microfluidics的微流体化器来将其微流体化(microfluidize)。在均化和微流体化之后，将制剂的pH值调节至pH 7.0-7.3。 
实施例3在仓鼠和牛中进行的效用试验 
将实施例2的疫苗给予仓鼠和牛，以使用标准实验室模型和宿主动物模型来测试效用。随后用一定剂量的犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体或波摩那钩端螺旋体来刺激测试仓鼠，以测试疫苗的效用。测量存活体的数量作为功效的证明。针对哈德焦钩端螺旋体，测量牛镜检凝集滴定度来验证疫苗组分在牛中的效力。下表显示了由热处理钩端螺旋体菌苗制备的疫苗，其能产生通过效用标准的抗原反应。 
Figure G2007800337672D00111
实施例4疫苗的生理化学测试 
根据实施例2的方法由热处理的钩端螺旋体菌苗来制备疫苗。根据实施例2方法由未热处理的钩端螺旋体菌苗来制备类似疫苗。将两种疫苗制剂均在4℃存储60天。用激光衍射仪在第0天新鲜制备时对每种疫苗进行粒度分析，并在第60天时再次分析。 
下图显示了每种疫苗在第0天和存储60天之后的粒度分布。 
Figure G2007800337672D00121
含未热处理钩端螺旋体菌苗的新鲜制备的疫苗在第0天的粒度分析 
Figure G2007800337672D00122
含未热处理钩端螺旋体菌苗的疫苗在第60天的粒度分析 
含热处理钩端螺旋体菌苗的新鲜制备的疫苗在第0天的粒度分析 
Figure G2007800337672D00132
含热处理钩端螺旋体菌苗的疫苗在第60天的粒度分析 
由热处理钩端螺旋体菌苗制备的疫苗显示出粒度保持能力，表明乳液具有稳定性。由未热处理钩端螺旋体菌苗制备的疫苗显示出粒度上升，表明乳液破乳。 
实施例5杀病毒试验 
根据实施例2的方法由未热处理的钩端螺旋体菌苗和热处理的钩端螺旋体菌苗制备疫苗。在老化5-6个月后，测试疫苗对BHV-1病毒、PI3病毒和BRSV病毒的杀病毒活性。通过用待测的佐剂稀释液(adjuvanted diluent)使一价杀病毒分析对照物(VAC)再水合以进行杀病毒活性测试。以每剂量体积来使两种一价杀病毒分析对照物再水合。 在滴定和细胞接种以通过TCID50(50％组织培养感染剂量)测定存活病毒滴定度之前，将两种再水合的一价VAC合并(pooled)并在20-25℃孵育2小时。病毒滴定度损失超过0.7TCID50/ml是不可接受的。 
杀病毒试验结果显示的病毒滴定度损失如下表所示。 
Figure G2007800337672D00141
用未热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗显示更高的杀病毒活性水平。用热处理的钩端螺旋体菌苗制备的疫苗为非杀病毒性的。 

Claims (13)

1.一种乳液疫苗，其包括a)包含油和一种或多种乳化剂的乳液；和b)包含灭活钩端螺旋体细菌悬浮液的热处理钩端螺旋体菌苗，与热处理前菌苗的脂肪酶活性相比，所述菌苗的脂肪酶活性为50%或更低，并具有可接受的抗原活性；其中所述热处理钩端螺旋体菌苗通过包括将所述菌苗加热至60到70℃的温度并持续5到10小时的方法制得。
2.根据权利要求1所述的乳液疫苗，其中所述热处理钩端螺旋体菌苗通过包括将所述菌苗加热至65℃的温度并持续8小时的方法制得。
3.根据权利要求1或2所述的乳液疫苗，其中所述灭活的钩端螺旋体细菌是选自犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体的1-5种钩端螺旋体属物种。
4.根据权利要求1或2所述的乳液疫苗，其还包括活病毒。
5.根据权利要求4所述的乳液疫苗，其中所述活病毒是选自牛鼻气管炎(IBR)病毒、副流感3(PI3)病毒和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)中的1-3种病毒。
6.根据权利要求1或2所述的乳液疫苗，其还包括灭活病毒。
7.根据权利要求6所述的乳液疫苗，其中所述灭活病毒是选自1型牛病毒性腹泻(BVD)病毒和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒的1或2种病毒。
8.根据权利要求1所述的乳液疫苗，其还包括卵磷脂制剂、Quil A和胆固醇。
9.根据权利要求1或2所述的乳液疫苗，其中，
a)所述灭活的钩端螺旋体细菌是选自犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体的1-5种钩端螺旋体属物种;
b)所述疫苗还包括选自牛鼻气管炎(IBR)病毒、副流感3(PI3)病毒和牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的活病毒；和
c)所述疫苗还包括选自1型牛病毒性腹泻(BVD)病毒和2型牛病毒性腹泻(BVD)病毒的1或2种灭活病毒。
10.根据权利要求9所述的乳液疫苗，其还包括卵磷脂制剂、QuilA和胆固醇。
11.一种制备根据权利要求1所述的乳液疫苗的热处理钩端螺旋体菌苗的方法，所述方法包括下述步骤：
a)测量所述菌苗的脂肪酶活性；
b)将所述菌苗加热至60到70℃的温度并持续5到10小时；
c)测量热处理后所述菌苗的脂肪酶活性；
d)对加热前所述菌苗的脂肪酶活性与加热后所述菌苗的脂肪酶活性进行比较；和
e)选择下述热处理菌苗：其在热处理后的脂肪酶活性为热处理前该菌苗的脂肪酶活性的50%或更低。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述菌苗被加热至65℃的温度并持续8小时。
13.一种包含热处理犬钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体菌苗的乳液疫苗，其通过下述方式获得：使犬钩端螺旋体、出血黄疸钩端螺旋体、流感伤寒钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体和波摩那钩端螺旋体的培养物生长，在浊度计单元中测量每种培养物的浊度（NU），用硫柳汞将细菌灭活以形成菌苗，将每种菌苗在65℃热处理8小时，将菌苗合并，随后与
Figure FDA0000454217490000031
佐剂、防腐剂和稀释缓冲剂混合，以使除哈德焦钩端螺旋体之外的所有钩端螺旋体菌苗的浓度为1200NU/5ml剂量，哈德焦钩端螺旋体的浓度为2400NU/5ml剂量，其中使用Silverson均化器将所述乳液疫苗均化并使用来自Microfluidics的微流体化器使其微流体化，然后pH被调节至7.0-7.3。
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