KR101238486B1

KR101238486B1 - 열 처리된 박테린, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신

Info

Publication number: KR101238486B1
Application number: KR1020097004968A
Authority: KR
Inventors: 마크 데이비스 굿이어; 마이클 존 휘더; 라마사미 만나르 만난; 낸시 로이스 오이엔
Original assignee: 화이자 프로덕츠 인크.
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2013-03-04
Also published as: MEP7509A; US20080112970A1; DK2377550T3; NZ595748A; RS54981B1; JP2014088428A; RU2569457C2; RU2009108004A; AU2007297287B2; CO6160333A2; ES2432392T3; ES2535977T3; WO2008032158A2; SI2066340T1; EP2066340B1; RU2425692C2; PT2066340E; CL2007002621A1; EP2377550B1; TWI361077B

Abstract

열 처리된 박테린, 열 처리된 박테린의 제조 방법, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신을 개시한다.

열 처리된 박테린, 리파제 활성, 제조 방법, 에멀젼 백신, 안정성, 렙토스피라

Description

열 처리된 박테린, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신 {HEAT TREATED BACTERINS, AND EMULSION VACCINES PREPARED FROM SUCH HEAT TREATED BACTERINS}

본 발명은 일반적으로 백신 분야, 및 에멀젼 백신을 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 열 처리된 박테린, 열 처리된 박테린의 제조 방법, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신에 관한 것이다.

예방접종 (vaccination)은 동물에서 감염성 질병을 제어하기 위하여 사용이 증가되고 있다. 항원보강제 (adjuvant)는 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 증가시킬 수 있으므로 종종 백신에서 사용된다. 에멀젼이 항원보강제로서 작용할 수 있고, 항원을 주사 부위에서 데포 (depot)로서 보유하는 특성을 갖기 때문에, 백신은 종종 에멀젼으로서 제형화된다. 유화제 (emulsifier)가 에멀젼 백신에서 일반적으로 사용된다. 유화제를 사용하는 것 이외에, 에멀젼 백신의 안정성은 또한 기계적 수단에 의해 에멀젼의 액적 크기를 감소시키는 것을 통해 달성할 수 있다.

미국 특허 5,084,269는 레시틴을 광물유와 조합하여 함유하는 항원보강제 제형에 관한 것이고, 이는 숙주 동물 내에서 자극이 더 작고, 동시에 증가된 전신 면 역을 유도한다. 미국 특허 5,084,269에 따른 조성물은 상품명 AMPHIGEN(등록상표) (화이자, 인크. (Pfizer, Inc.)의 상표)로 상업적으로 이용가능하다.

일반적으로, 세균 항원은 가열될 때 불안정하고, 심지어 승온에 잠깐 동안 노출시킨 경우에도 항원의 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 현재의 탄저병 백신은 37℃에서 48시간에 모든 생물학적 활성을 소실할 수 있다 (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W.S. Mohsin, R. Bhat, and R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5):1058-62).

<발명의 개요>

본 발명은 열 처리된 박테린, 열 처리된 박테린의 제조 방법, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신에 관한 것이다. 상기 방법은 박테린을 약 35 내지 약 80℃의 온도로 가열하여 열 처리된 박테린을 형성하는 것을 포함한다.

정의

허용되는 항원 활성 - 용어 "허용되는 항원 활성"은 동종의 살아있는 유기체를 사용한 명문화된 (codified) 효력 시험을 통과함으로써 또는 시험접종된 (challenged) 후 예방접종한 동물에서 보호 면역 반응을 유도하는 능력을 의미한다.

박테린 - 용어 "박테린"은 백신의 성분으로서 사용될 수 있는 사멸 세균의 현탁액을 의미한다.

유화제 - 용어 "유화제"는 에멀젼을 보다 안정하게 만들기 위해 사용되는 물질을 의미한다.

에멀젼 - 용어 "에멀젼"은 하나의 액체의 소액적이 다른 액체의 연속 상 내에 현탁되는 2개의 비혼화성 액체들의 조성물을 의미한다.

열 처리된 박테린 - 용어 "열 처리된 박테린"은 열 처리되고, 열 처리 전의 리파제 활성의 50% 이하의 리파제 활성을 갖고, 허용되는 항원 활성을 갖는 박테린을 의미한다.

역 (invert) 에멀젼 - 용어 "역 에멀젼"은 유중수형 (water in oil) 에멀젼을 의미한다.

리파제 - 용어 "리파제"는 에멀젼 백신에서 유화제의 붕괴를 일으킬 수 있는 효소인 에스테라제, 리파제 및 포스포리파제를 의미한다.

정상 (normal) 에멀젼 - 용어 "정상 에멀젼"은 수중유형 (oil in water) 에멀젼을 의미한다.

수중유형 에멀젼 - 용어 "수중유형 에멀젼"은 오일의 소액적이 연속 수성상 내에 현탁되어 있는 에멀젼을 의미한다.

실온 - 용어 "실온"은 18 내지 25℃의 온도를 의미한다.

유중수형 에멀젼 - 용어 "유중수형 에멀젼"은 물 액적이 연속 오일상 내에 현탁되어 있는 에멀젼을 의미한다.

<상세한 설명>

본 발명은 감소된 리파제 활성을 갖는 박테린, 상기 박테린으로부터 제조된 백신, 및 박테린의 리파제 활성을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 항원성 성분에 추가로, 일부 박테린은 리파제 활성을 갖는다. 리파제 활성을 갖는 박테린을 에멀젼 내로 포함시키면, 리파제는 에멀젼을 생성하기 위해 사용된 유화제를 붕괴시킬 수 있다. 높은 리파제 활성을 갖는 박테린을 함유하는 에멀젼 백신은 불안정한 에멀젼이 되는 경향이 있고, 낮은 수준의 리파제를 갖는 박테린을 함유하는 것은 안정한 경향이 있다. 사멸될 때 리파제 활성을 갖는 박테린을 생산할 수 있는 세균의 예는 아세이네토박터 칼코아세티쿠스 (Aceinetobacter calcoaceticus), 아세토박터 파세루이아누스 (Acetobacter paseruianus), 에어로모나스 히드로필라 (Aeromonas hydrophila), 알리시클로바실러스 아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius), 아르해글로부스 풀지두스 (Arhaeglobus fulgidus), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실러스 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophillus), 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis), 바실러스 테르모카테눌라투스 (B. thermocatenulatus), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 부르크홀데리아 글루마에 (B. glumae), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니 (C. jejuni), 캄필로박터 히오인테스티날리스 (C. hyointestinalis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 크로모박테리움 비스코숨 (Chromobacterium viscosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티에애 (Erysipelothrix rhusiopathieae), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis), 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophilia), 모락셀사 종 (Moraxellsa sp .), 미코플라스마 히오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae), 미코플라스마 미코이데스 아종 미코이데스 엘씨 (Mycoplasma mycoides subsp . mycoides LC), 클로스트리듐 페르프린겐스 (Clostridium perfringens), 포토랍두스 루미네센스 (Photorhabdus luminescens), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 슈도모나스 위스콘시넨시스 (Pseudomnas wisconsinensis), 슈도모나스 아에루기노사 (P. aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스 (P. fluorescens) C9, 슈도모나스 플루오레센스 SIKW1, 슈도모나스 프라기 (P. fragi), 슈도모나스 루테올라 (P. luteola), 슈도모나스 올레오보란스 (P. oleovorans), 슈도모나스 종 B11-1, 알칼리게스 유트로푸스 (Alcaliges eutrophus), 사이크로박터 이모빌리스 (Psychrobacter immobilis), 리케챠 프로와제키이 (Rickettsia prowazekii), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 스피르리나 플라텐시스 (Spirlina platensis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphyolococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (S. epidermidis), 스타필로코쿠스 히이쿠스 (S. hyicus), 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 신나모네우스 (S. cinnamoneus), 스트렙토마이세스 엑스폴리아테스 (S. exfoliates), 스트렙토마이세스 스카비에스 (S. scabies), 술폴로부스 아시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius), 시에코시스티스 종 (Syechocystis sp .), 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트레포네마 미누툼 (T. minutum), 트레포네마 파게데니스 (T. phagedenis), 트레포네마 레프린겐스 (T. refringens), 트레포네마 빈센티이 (T. vincentii), 트레포네마 팔라듐 (T. palladium) 및 렙토스피라 종 (Leptospira sp.), 예를 들어 공지의 병원체 렙토스피라 카니콜라 (L. canicola), 렙토스피라 그립포티포사 (L. grippotyposa), 렙토스피라 하르디오 (L. hardjo), 렙토스피라 익테로해모라기애 (L. icterohaemorrhagiae) 및 렙토스피라 포모나 (L. pomona)를 포함한다.

에멀젼을 생성하기 위해 사용된 유화제를 붕괴시키고 따라서 에멀젼을 불안정하게 하고 붕괴시키는 리파제는 하나 이상의 에멀젼 파괴 효소, 예를 들어 에스테라제, 리파제 및 포스포리파제를 포함할 수 있다. 이들 효소, 에스테라제, 리파제 및 포스포리파제를 리파제로서 총칭한다. 박테린의 리파제 활성은 O-피발로일옥시메틸 움벨리페론 (C-POM)으로 불리는 합성 기질을 사용하여 측정할 수 있다. 리파제에 의해 유발된 가수분해 속도는 리파제 활성의 측정치이다. 상기 반응에서 리파제에 의해 유발된 가수분해의 반응 속도는 리파제 활성의 산물의 형광 강도의 증가에 의해 모니터링된다. 반응 속도는 선택된 정확한 가수분해 시험 조건에 좌우되기 때문에, 가수분해 속도에 의해 측정되는 리파제 활성 수준의 비교는 동일한 시험 조건에 의해 생성된 데이타를 사용하여 이루어져야 한다. 방법은 문헌 ([Kurioka S., and Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289], [De Silva NS, and Quinn PA. (1987) J. Clin. Microbiol. 25: 729-731] 및 [Grau, A., and Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91: 109-118])을 포함한 몇몇 문헌에 개시되어 있다.

에멀젼 백신에서, 에멀젼의 붕괴는 성분의 상 분리를 일으킨다. 상 분리가 있을 때 용기로부터 제거된 개별 용량이 동일한 수준의 백신 성분을 함유하지 않을 수 있기 때문에 이는 바람직하지 않다. 또한, 에멀젼의 손실은 유화제의 항원보강제 활성을 손실시키고, 백신의 항원 효과를 감소시킬 수 있다.

약독화 생 (live) 바이러스가 종종 박테린과 함께 백신 내에 포함된다. 하나의 백신을 사용하여 상이한 질병들에 대한 면역을 생성시키기 위해 단일 백신이 사용될 수 있기 때문에, 상기 백신은 유용하다. 박테린에 리파제 활성이 존재하면, 에멀젼으로부터 유화제를 방출시킬 것이다. 상기 유리 유화제는 생 백신 바이러스를 파괴하고 불활성화시켜, 바이러스 감염성을 손실시킬 수 있다.

백신에서 유용한 박테린은 관심있는 세균을 배양한 후, 세균을 사멸시켜 세포벽 성분을 포함한 다양한 세균 성분을 함유하는 박테린을 생산함으로써 형성할 수 있다. 세균은 이들을 메르티올레이트, 포르말린, 포름알데히드, 디에틸아민, 2원 (binary) 에틸렌아민 (BEI), 베타 프로피오락톤 (BPL) 및 글루타르알데히드와 같은 화합물에 노출시키는 것을 포함한 다양한 방법에 의해 사멸시킬 수 있다. 이들 화합물의 조합물을 사용할 수 있다. 또한, 멸균 방사선을 사용하여 세균을 사멸시키는 것이 가능하다.

본 발명에 이르러, 상기 리파제 활성을 갖는 박테린의 리파제 활성은 열 처리에 의해 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 박테린의 리파제 활성은 박테린을 약 35 내지 약 80℃의 온도로 가열하여 열 처리된 박테린을 형성함으로써 감소될 수 있고, 이는 허용되는 항원 활성을 갖는다. 열 처리는 열 처리된 박테린의 리파제 활성이 열 처리 전의 박테린에서 발견된 것보다 50% 이하가 되도록 충분한 시간 동안 수행된다. 우수한 에멀젼 백신 안정성을 위해, 리파제 활성이 0으로 감소될 필요는 없다. 본 발명자들은 저장 수명이 우수한 백신은 리파제 활성 수준이 열 처리 전의 리파제 활성 수준의 50% 이하인 열 처리된 박테린으로부터 제조될 수 있다는 것을 발견하기에 이르렀다.

시험 기질의 가수분해 속도가 박테린의 리파제 활성의 척도로서 사용되면, 열 처리 전의 시험 기질의 가수분해 속도를 열 처리 후의 가수분해 속도와 비교한다. 열 처리는 가수분해 속도를 신선한 박테린에 대해 관찰되는 가수분해 속도보다 50% 이하로 감소시키도록 수행된다.

열 처리 전의 활성과 열 처리 후의 활성을 측정하기 위해 동일한 방법이 사용된다면 리파제 활성 수준을 측정하는 정확한 방법 자체는 중요하지 않다. 예를 들어, 시험 기질의 가수분해 속도가 하나의 기질을 사용하여 측정되면, 상이한 기질은 상이한 속도를 생성시킬 수도 있다. 그러나, 초기 활성 결정 및 처리 후의 활성 결정을 위해 동일한 기질이 사용되면, 상대적인 속도는 여전히 열 처리의 효과를 보여줄 것이다.

렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 익테로해모라기애, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 포모나 중 하나 이상을 포함하는 박테린에 대해, 항원 활성에 대한 명문화된 시험이 존재한다 (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104 및 §113.105). 이들 종에 대해, 허용되는 항원 활성은 햄스터를 동종의 생 세균으로 시험접종할 때 예방접종하지 않은 햄스터의 적어도 80%가 생존하지 않는 모델에서 예방접종한 햄스터의 적어도 75%가 생존하도록, 예방접종한 햄스터에서 보호 면역 반응을 유도하는 능력으로서 규정된다. 항원 렙토스피라 하르디오의 경우에, 허용되는 항원 활성은 세균 항원 렙토스피라 하르디오를 포함하는 백신을 예방접종한 송아지에서 40 이상의 렙토스피라 하르디오에 대한 혈청 응집 기하 평균 역가를 유도하는 백신의 능력으로서 규정된다. 다른 박테린에 대해, 허용되는 항원 활성은 동종의 살아있는 유기체를 사용하는 명문화된 효력 시험을 통과함으로써 또는 시험접종된 후 예방접종한 동물에서 보호 면역 반응을 유도하는 능력으로서 정의된다.

열 처리는 일정 범위의 온도에 걸쳐 다양한 시간 동안 수행할 수 있다. 일반적으로, 가열은 약 35 내지 약 80℃의 온도에서 약 20분 내지 약 24시간 동안 이루어질 수 있다. 박테린이 보다 고온, 예를 들어 약 75 내지 약 80℃로 가열되면, 가열 시간은 시간 범위 중 짧은 한도이다. 가열이 보다 저온에서 이루어지면, 가열은 보다 긴 시간 동안 이루어진다. 온도 및 시간의 다른 조합은 약 60 내지 약 70℃의 온도에서 약 9 내지 약 10시간 동안 가열하는 것이다. 온도 및 시간의 다른 조합은 약 65 내지 약 70℃의 온도에서 약 5 내지 약 8시간 동안 가열하는 것이다. 온도 및 시간의 다른 조합은 약 65 내지 약 70℃의 온도에서 약 1시간 동안 가열하는 것이다. 온도 및 시간의 다른 조합은 약 55 내지 약 65℃의 온도에서 약 5 내지 약 8시간 동안 가열하는 것이다.

박테린은 열 처리 후에 새로 제조된 박테린보다 더 낮은 리파제 활성을 갖지만, 새로 제조된 박테린과 동일한 방식으로 제형화될 수 있다. 따라서, 열 처리된 박테린은 백신을 생산하는 통상적인 방식에 의해 백신 내로 포함될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.

에멀젼 백신은 목적하는 박테린을 오일상 및 유화제(들)과 조합함으로써 형성할 수 있다. 이어서, 조합물을 강하게 교반하여 에멀젼을 형성한다. 적합한 교반 방법은 균질화 (homogenization) 및 후속적인 마이크로플루다이제이션 (microfluidization)을 포함한다. 방부제 및 부형제를 또한 에멀젼화 전에 조합물에 포함시킬 수 있다.

백신은 박테린 및 바이러스 항원을 모두 포함할 수 있다. 박테린 및 바이러스 항원을 포함하는 백신을 제조하는데 있어서, 포함시킬 박테린, 임의의 바이러스 항원, 유화제(들) 및 선택적으로 방부제 및 부형제를 오일상과 조합하고, 에멀젼화시킨다. 에멀젼 형성 후, NaOH 또는 HCl의 용액을 사용하여 제형의 pH를 적절한 pH로 조정할 수 있다. 백신 용도를 위해, 주사 부위에서 자극을 피하도록 pH는 중성에 가까운 것이 일반적으로 바람직하다. pH 약 7.0 내지 약 7.3이 일반적이다.

에멀젼 백신 형성을 위한 적합한 오일상은 대사불가능 오일 및 대사가능 오일을 포함한다. 대사불가능 오일은 광물유, 예를 들어 백색 (white) 광물유와 경질 (light) 광물유를 포함한다. 대사가능 오일은 식물유, 어유 및 합성 지방산 글리세리드를 포함한다.

본 발명의 에멀젼 백신을 제조하는데 사용할 수 있는 유화제의 예는 일반적인 백신 유화제인 인지질, 소르비탄 에스테르, 폴리에톡시화 소르비탄 에스테르, 및 만니톨 유도체이다. 인지질 유화제는 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이니시톨, 포스파티딜세린 및 레시틴 (예, AMPHIGEN(등록상표))을 포함한다. 소르비탄 에스테르 유화제는 소르비탄 모노라우레이트 (예, Span(등록상표) 20 및 Arlacel(등록상표) 20), 소르비탄 모노올레에이트 (예, Span(등록상표) 80 및 Arlacel(등록상표) 80), 소르비탄 모노팔미테이트 (예, Span(등록상표) 40 및 Arlacel(등록상표) 40) 및 소르비탄 모노스테아레이트 (예, Span(등록상표) 60 및 Arlacel(등록상표) 60)를 포함한다. 폴리에톡시화 소르비탄 에스테르는 폴리에톡시 소르비탄 모노라우레이트 (예, Tween(등록상표) 20 및 Tween(등록상표) 21), 폴리에톡시 소르비탄 모노올레에이트 (예, Tween(등록상표) 80), 폴리에톡시 소르비탄 모노팔미테이트 (예, Tween(등록상표) 40) 및 폴리에톡시 소르비탄 모노스테아레이트 (예, Tween(등록상표) 60)을 포함한다. 만니톨 유도체 유화제는 만니톨 옥타데카논 에테르를 포함한다. Span(등록상표), Arlacel(등록상표) 및 Tween(등록상표)은 아이씨아이 아메리카스 (ICI Americas)의 상표이다. AMPHIGEN(등록상표)은 화이자, 인크.의 상표이다. 일반적으로, 백신은 정상 수중유형 에멀젼으로서 제형화되지만, 역 유중수형 에멀젼을 제조하는 것도 가능하다.

다양한 항원보강제, 예를 들어 퀼 (Quil) A, 콜레스테롤, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄, 및 방부제, 예를 들어 메르티올레이트를 백신 내에 사용할 수 있다. 퀼 A는 남아메리카 나무 키라야 사포나리아 모리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 수피로부터 추출한 키라야 (quillaja) 사포닌의 정제 혼합물이다. 퀼 A는 면역계에 직접 작용하여 전반적인 감수성 상태를 활성화시킨다. 이렇게 하여 체액 및 세포-매개 반응을 모두 유도한다. 친지성 사슬은 내인성 경로에서 처리하기 위해 세포질 내로 전달되도록 항원 및 항원보강제의 상호작용을 허용한다. 콜레스테롤은 적절한 비율로 첨가될 때 덜 바람직한 부작용을 제거하기 때문에, 퀼 A는 종종 콜레스테롤과 함께 사용된다. 콜레스테롤은 콜레스테롤이 퀼 A와 결합할 때 퀼 A와 함께 나선-유사 구조를 형성하는 불용성 복합체를 형성하여, 분자의 당 유닛을 노출시키고, 이는 면역 반응을 자극하는 것을 돕는다.

박테린을 함유하는 백신 내에 바이러스 항원을 첨가하는 것이 일반적이다. 상기 방법의 하나의 잇점은 동일한 결과를 달성하기 위해 몇몇 상이한 백신의 투여를 필요로 하는 대신에 몇몇 질병들에 대해 면역을 생성시키기 위해 하나의 백신을 사용할 수 있다는 점이다. 사 (killed) 바이러스 및 약독화 생 바이러스 모두가 백신에 사용될 수 있다. 사용할 수 있는 바이러스에는 조류 헤르페스 바이러스, 소 헤르페스 바이러스, 개 헤르페스 바이러스, 말 헤르페스 바이러스, 고양이 바이러스성 비기관염 바이러스, 마렉 (Marek) 병 바이러스, 양 헤르페스 바이러스, 돼지 헤르페스 바이러스, 위광견병 (Pseudorabies) 바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 개 홍역 바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 소 파라인플루엔자 3, 양 파라인플루엔자 3, 우역 바이러스, 보더 (Border) 병 바이러스, 소 바이러스성 설사 (BVD) 바이러스, 돼지 콜레라 (Classical swine fever) 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 양 진행성 폐렴 바이러스, 양 폐 선암종 바이러스, 개 코로나 바이러스, 소 코로나 바이러스, 고양이 장내 코로나 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 돼지 혈구응집성 뇌척수염 바이러스, 돼지 파르보바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 칠면조 코로나 바이러스, 소 일시 열 바이러스, 광견병, 수포성 구내염 바이러스, 조류 인플루엔자, 말 인플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 개 인플루엔자 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스 (EEE), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스 및 서부 말 뇌염 바이러스가 있다.

박테린에 리파제 활성이 존재하면, 에멀젼으로부터 유화제를 방출시킬 수 있다. 상기 유리 유화제는 생 바이러스 외피 (envelope)를 파괴하고 생 백신 바이러스를 불활성화시켜, 바이러스 감염성을 손실시킬 수 있다. 따라서, 박테린을 열 처리하면 에멀젼을 안정화시키고, 그의 항원보강제 효과를 보존하고, 바이러스의 바이러스 감염성을 보존하는 역할을 한다.

다음 실시예는 추가의 예시를 위해 제공되고, 청구된 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

절차

절차 1. 탁도 ( turbidity )의 결정

탁도는 광 산란법에 의해 네펠로법 탁도 단위 (Nephelometric Units; NU)로 결정한다. 규정된 조건 하에 샘플에 의해 산란된 빛의 강도를 표준 참조 현탁액에 의해 산란된 빛의 강도와 비교한다. 산란광의 강도가 클수록 샘플의 탁도가 더 높다. 광원을 샘플 내로 비추고, 광 산란을 광원 방향에 대해 90°에서 측정한다. 기구는 포르마진 현탁액으로부터 광 산란을 측정함으로써 보정한다.

비탁계 ( Nephelometer ) 기구의 보정

증류수를 공극 크기 0.2 ㎛의 멤브레인 필터를 통해 여과하여 초여과수를 제조한다. 부피 플라스크 내에서 1.00 g의 히드라진 술페이트 (NH₂) H₂SO₄를 초여과수에 용해시키고 초여과수로 100 ml로 희석시켜 제1 용액을 제조한다. 부피 플라스크 내에서 10.00 g의 헥사메틸렌테트라민을 초여과수에 용해시키고 초여과수로 100 ml로 희석시켜 제2 용액을 제조한다. 5.0 ml의 제1 용액을 5.0 ml의 제2 용액과 혼합하여 포르마진 현탁액을 제조한다. 혼합물을 24시간 동안 약 24℃에서 정치시킨다. 혼합물을 초여과수로 100 ml로 희석하여, 탁도가 400 NU인 원액 탁도 현탁액을 형성한다. 10.00 ml의 원액 탁도 현탁액을 초여과수로 100 ml로 희석하여 40 NU 포르마진 탁도 현탁액을 제조한다. 추가의 보정 용액은 원액을 희석하여 제조한다.

탁도의 측정

탁도가 비탁계의 보정된 범위 내에 있도록, 측정할 샘플을 초여과수로 희석한다. 탁도를 측정하고, 원래의 탁도를 다음 식을 사용하여 계산한다:

원래의 탁도 (NU) = {M x (D + O)}/O

식에서, M은 희석된 샘플의 탁도 (NU)이고,

D는 희석수의 부피 (mL)이고,

O는 원래의 샘플 부피 (mL)이다.

절차 2. 리파제 분석

리파제 활성은 형광 기질로서 O-피발록시메틸움벨리페론을 사용하여 결정하였다. 리파제는 상기 비-형광 기질의 가수분해를 촉매하여 수성 조건 하에 불안정한 히드록시메틸에테르를 생성시킨다. 불안정한 히드록시메틸에테르의 분해는 포름알데히드 및 형광 산물인 움벨리페론을 생성한다. 시간의 함수로서 생산된 움벨리페론의 형광 강도를 모니터링하면 리파제 효소 활성의 예민한 동적 측정을 제공한다.

O-피발록시메틸움벨리페론 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) 제품 번호 P35901) 용액을 순수 DMSO 내에 5 mM의 원액 농도로 제조하고; 미사용 용액을 -20℃에서 저장하고 차광하였다. 5 mM O-피발록시메틸움벨리페론 용액을 58 mM TRIS-HCl 버퍼 (pH 8.0)를 사용하여 750 μM로 희석하고, 생성되는 용액을 37℃로 예온하였다. 렙토스피라 샘플 또는 대조군 버퍼/배지를 10분 동안 실온에서 6500 X 중력에서 원심분리하여 펠렛 및 상등액을 형성하였다. 반응은 저부피 96 웰 플레이트 (Corning 3393, 흑색 폴리스티렌 비-결합 표면, 영역의 절반)의 분석 웰 내에서 15 ㎕의 100 mM TRIS-HCl 버퍼 (pH 8.0)을 렙토스피라 샘플 또는 대조군 버퍼/배지로부터의 실온에서의 상등액 15 ㎕과 합하고; 10분 동안 37℃에서 예비-인큐베이팅한 후; 20 ㎕의 750 μM O-피발록시메틸움벨리페론 또는 대조군 버퍼/배지를 첨가하여 반응을 개시함으로써 수행하였다. 생성되는 반응 혼합물은 53 mM TRIS-HCl 버퍼 (pH 8.0) 및 0 또는 300 μM O-피발록시메틸움벨리페론을 함유하였다. 형광 강도를 1-시간에 걸쳐 30-45초 간격으로 측정하였다 (Spectramax Gemini XS, 37℃, λ_ex= 360 nm, λ_em= 460 nm, PMT 감도 세팅 '중', 웰 당 6회 판독). 반응 속도는 생성되는 진행 곡선의 기울기로부터 결정하였다.

실시예 1. 열 처리에 의한 리파제 활성의 감소

렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 익테로해모라기애, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 하르디오 및 렙토스피라 포모나를 함유하는 메르티올레이트 사멸 렙토스피라의 풀 (pool)을 제조하여, 박테린을 형성하였다. 6개의 박테린 샘플을 밤새 (약 12시간) 4℃, 37℃, 45℃, 56℃, 65℃ 및 80℃에서 저장하였다. 4℃에서 저장한 샘플이 비-처리 대조군으로서 역할을 하였다. 12시간 동안 37℃, 45℃, 56℃, 65℃ 및 80℃에서 저장한 샘플이 열 처리된 샘플이었다. 저장 후, 시험 기질이 각각의 박테린의 존재 하에 가수분해되는 속도를 절차 2의 방법에 따라 측정하였다. 샘플에 대한 가수분해 속도 ÷ 4℃에서 저장된 샘플의 가수분해 속도 × 100은 저장 후에 남은 각각의 박테린의 원래 리파제 활성의 백분율이다. 다음 표는 저장 온도 및 저장 후에 남은 원래 리파제 활성의 백분율을 보여준다.

저장 온도 (12시간)	4℃	37℃	45℃	56℃	65℃	80℃
원래 리파제 활성의 %	100%	55.4%	32.5%	15.7%	10.8%	8.4%

실시예 2. 실험적 백신 제형의 제조

렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 익테로해모라기애, 렙토스피라 그립포티포사, 렙토스피라 하르디오 및 렙토스피라 포모나의 배양액을 성장시켰다. 각각의 배양액의 탁도를 네펠로법 탁도 단위 (NU)로 측정하였다. 세균을 메르티올레이트 를 사용하여 사멸시켜 박테린을 형성하였다. 각각의 박테린을 65℃에서 8시간 동안 열 처리하여 리파제 활성을 감소시켰다. 박테린을 조합한 후, 각각의 5 ml 용량의 백신이 하기 표에 기재된 성분을 함유하도록 AMPHIGEN(등록상표), 항원보강제, 방부제 및 희석 버퍼와 혼합하였다.

항원의 농도

성분	성분의 농도/용량
렙토스피라 카니콜라	1200 NU/5 ml 용량
렙토스피라 익테로해모라기애	1200 NU/5 ml 용량
렙토스피라 그립포티포사	1200 NU/5 ml 용량
렙토스피라 하르디오	2400 NU/5 ml 용량
렙토스피라 포모나	1200 NU/5 ml 용량

제형을 실버슨 (Silverson) 균질화기를 사용하여 균질화하고, 마이크로플루이딕스 (Microfluidics)의 마이크로플루다이저를 사용하여 마이크로플루다이징하였다. 균질화 및 마이크로플루다이제이션 후, 제형의 pH를 pH 7.0 내지 7.3으로 조정하였다.

실시예 3. 햄스터 및 소에서 효력 시험

실시예 2의 백신을 표준 실험실 및 숙주 동물 모델을 이용하여 효력을 시험하기 위해 햄스터 및 소에 투여하였다. 이어서, 백신의 효력을 시험하기 위해 시험 햄스터에게 렙토스피라 카니콜라, 렙토스피라 익테로해모라기애, 렙토스피라 그립포티포사 또는 렙토스피라 포모나의 용량을 시험접종하였다. 효능의 증명으로서 생존 동물의 수를 측정하였다. 소에서 백신 분획의 효력을 입증하기 위해 소 현미경하 응집 역가를 렙토스피라 하르디오에 대해 측정하였다. 하기 표는 열 처리된 렙토스피라 박테린으로부터 제조된 백신이 효능 기준을 통과하는 항원 반응을 생성시킬 수 있음을 보여준다.

렙토스피라 열 조건화	햄스터 생존				소 혈청학
렙토스피라 열 조건화	카니콜라	익테로해모라기애	그립포티포사	포모나	하르디오
65℃ (8시간)	10/10	10/10	10/10	10/10	통과
비처리	10/10	10/10	10/10	10/10	통과

실시예 4. 백신의 물리화학적 시험

백신을 실시예 2의 방법에 따라 열 처리된 렙토스피라 박테린으로부터 제조하였다. 유사한 백신을 실시예 2의 방법에 따라 열 처리되지 않은 렙토스피라 박테린으로부터 제조하였다. 두 백신 제형을 4℃에서 60일 동안 저장하였다. 각각의 백신에 대한 입도 분석을 새로 제조시의 제0일에 및 다시 60일에 레이저 회절장치를 사용하여 수행하였다.

아래 나타낸 도표는 60일 동안 저장하기 전 0일 및 저장한 후에 각각의 백신에 대한 입도 분포를 보여준다.

열 처리된 렙토스피라 박테린으로부터 제조된 백신은 에멀젼 안정성을 나타내는 입도 보유를 보여준다. 열 처리되지 않은 렙토스피라 박테린으로부터 제조된 백신은 에멀젼 붕괴를 나타내는 입도의 증가를 보여준다.

실시예 5. 살바이러스 분석

실시예 2의 방법에 따라, 열 처리되지 않은 렙토스피라 박테린 및 열 처리된 렙토스피라 박테린으로부터 백신을 제조하였다. 5 내지 6개월 숙성 후, BHV-1 바이러스, PI3 바이러스 및 BRSV 바이러스에 대한 백신의 살바이러스 활성을 시험하였다. 살바이러스 활성 시험은 시험할 항원보강된 희석제로 1가 살바이러스 분석 대조군 (VAC)을 재수화함으로써 수행하였다. 2개의 1가 살바이러스 분석 대조군을 각각의 용량 부피로 재수화하였다. 2개의 재수화된 1가 VAC를 모으고, 20-25℃에서 2시간 동안 인큐베이팅한 후, 적정하고, TCID₅₀ (50% 조직 배양액 감염 용량)에 의해 생 바이러스 역가를 결정하기 위해 세포 상에 접종하였다. 바이러스 역가 손실이 0.7 TCID₅₀/ml을 초과하는 것은 만족스럽지 않다.

바이러스 역가 손실을 보여주는 살바이러스 분석의 결과를 하기 표에 나열한다:

렙토스피라 열 조건화	바이러스 역가 손실 (TCID₅₀)
렙토스피라 열 조건화	BHV-1	PI3	BRSV
65℃에서 8시간	0.1	0.0	0.4
비처리	1.0	≥1.2	≥1.3

열 처리되지 않은 렙토스피라 박테린을 사용하여 제조된 백신은 높은 수준의 살바이러스 활성을 보여준다. 열 처리된 렙토스피라 박테린을 사용하여 제조된 백신은 살바이러스성이 아니었다.

Claims

에멀젼 및

리파제 활성이 열 처리 전의 박테린의 리파제 활성의 50% 이하인 사멸 렙토스피라(Leptospira) 세균의 현탁액을 포함하는 열 처리된 렙토스피라 박테린을 포함하는 백신으로서,

상기 에멀젼은 열 처리되지 않은 박테린을 포함하는 에멀젼에 비해 향상된 안정성을 갖는 백신.
제1항에 있어서, 사멸 렙토스피라 세균이 렙토스피라 카니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사 (L. grippotyposa), 렙토스피라 하르디오 (L. hardjo), 렙토스피라 익테로해모라기애 (L. icterohaemorrhagiae), 및 렙토스피라 포모나 (L. pomona)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1 내지 5개의 렙토스피라 종인, 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생 (live) 바이러스를 추가로 포함하는 백신.
제3항에 있어서, 생 바이러스가 소 비기관염 (IBR) 바이러스, 파라인플루엔자 3 (PI3) 바이러스, 및 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV)로 이루어지는 군 중에서 선택된 1 내지 3개의 바이러스인 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사 (killed) 바이러스를 추가로 포함하는 백신.
제5항에 있어서, 사 바이러스가 제1형 소 바이러스성 설사 (BVD), 및 제2형 소 바이러스성 설사 (BVD)로 이루어지는 군 중에서 선택된 1 또는 2개의 바이러스인 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 레시틴 제제, 퀼 A, 및 콜레스테롤을 추가로 포함하는 백신.
a) 박테린의 리파제 활성을 측정하고;

b) 박테린을 60 내지 70℃의 온도로 9 내지 10시간 동안, 65 내지 70℃의 온도로 5 내지 8시간 동안, 65 내지 70℃의 온도로 1시간 동안, 55 내지 65℃의 온도로 5 내지 8시간 동안, 또는 55 내지 70℃의 온도로 5 내지 8시간 동안 가열하고;

c) 열 처리 후의 박테린의 리파제 활성을 측정하고;

d) 가열 전의 박테린의 리파제 활성을 가열 후의 박테린의 리파제 활성과 비교하고;

e) 열 처리 후의 리파제 활성이 열 처리 전의 박테린의 리파제 활성의 50% 이하인 열 처리된 박테린을 선택하는 것

을 포함하는, 제1항에 기재된 백신의 열 처리된 렙토스피라 박테린의 제조 방법.
제8항에 있어서, 박테린을 55 내지 70℃의 온도로 5 내지 8시간 동안 가열시키는 방법.
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