TWI353850B - Microfluidized oil-in-water emulsions and vaccine - Google Patents

Description

1353850 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大致關於疫苗領域’特別是增強家㈣物之免疫 回應用之佐藥調配物。特別地，本發明關於次微米水包油 =液作為增強抗原免疫原性用之疫苗佐藥之用途。本發明 ，供次微米水包油乳液調配物、含抗原加人此乳液中之疫 苗組合物及此乳液與疫苗之製法。 【先前技術】 細菌、病毒、寄生蟲與支原體感染在家畜動物（如牛、豬 及寇物)中廣泛地傳染。這些感染物造成之疾病經常對抗微 生物醫藥治療有抗性’使得無有效之治療方法。結果，逐 漸使用疫苗病理方式控制家畜動物之感染疾病。在化學鈍 化或適當之基因操控後，全感染病原體可適當地用於疫苗 調配物。或者，病原體之蛋白質次單位可在重組表現系統 中表現且純化而用於疫苗調配物。 佐藥通常指增加對抗原之體液及/或細胞免疫回應之任 何材料。傳統疫苗係由已被殺死之病原微生物粗製品組 成，而且伴隨病原微生物培養之雜質可作為佐藥以增強免 疫回應。然而，在使用病原微生物或純化蛋白質次單位之 均質製品作為疫苗之抗原時，此抗原引發之免疫性不良， 而且加入特定外生材料作為佐藥因此為必要的。此外，合 成及次單位疫苗在製造上昂貴。因此，藉佐藥之助，僅需 要較劑量之抗原刺激免疫回應，因而節省疫苗之製造成 本0 91384.doc 1353850 · 已知佐藥以許多種方式作用以增強免疫回應。許多種佐 藥修改伴隨免疫回應之細胞活素網路。這些免疫調節性佐 藥可施展其效果，即使是在其不與抗原在一起時。免疫調 節性佐藥通常造成特定細胞活素之一般上調，及導致細胞 Thl及/或體液Th2回應之其他者之附帶下調。 一些佐藥具有保存抗原之構象整體性之能力，使得對適 當之免疫效應物細胞可有效地提出抗原。此種佐藥調配物 保存抗原構象之結果，疫苗可具有增加之儲存壽命，如免 疫刺激複合物（ISCOMs)所示。Ozel M.，等人：Quartemary

Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989)。 一些佐藥具有在注射位置處保留抗原成為貯藏所之性 質。此貯藏所效應之結果，抗原不因肝清除而快速地失去。 鋁鹽及油包水乳液經此貯藏所效應作用較短之時間。例 如，藉由使用Freirnd’s完整佐藥（FCA)可得長期貯藏所，其 為油包水乳液。FCA—般維持在注射位置處，直到生物降 解使得因抗原提出細胞而移除抗原。 基於其物理本性，佐藥可分成兩種非常廣義之類別，即， 粒狀佐藥及非粒狀佐藥。粒狀佐藥如微粒而存在。免疫原 可併入或結合此微粒。紹鹽、油包水乳液、水包油乳液、 免疫刺激複合物、微脂粒、及奈米與微米顆粒為粒狀佐藥 之實例。非粒狀佐藥通常為免疫調節劑且其通常結合粒狀 佐藥而使用。胞壁酿二肽（自分枝桿菌（My cobacteria)萃取之 肽聚糖之佐藥活性成分）、非離子性嵌段共聚物、皂角苷 91384.doc 1353850 (Saponins)(自皁樹（Quillaja saponaria)之樹皮萃取之複合混 合物）、脂質A(葡萄胺糖之二糖化物，其具有兩個磷酸基及 五或六個長度通常為C12至C16之脂肪酸鏈）、細胞活素、碳 水合物聚合物、衍生性多糖化物、及細菌毒素（如霍亂毒素 及大腸桿菌不穩定毒素（LT))為非粒狀佐藥之實例。 一些最為熟知之佐藥為非粒狀免疫調節劑與可影響佐藥 調配物之儲藏所效應之粒狀材料之組合。例如，FCA組合 結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)成分之免疫調節劑 性質與油乳液之短期儲藏所效應。 油乳液已長期作為疫苗佐藥。Le Moignic與Pinoy在1 916 年發現，已被殺死之鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium) 於礦物油中之懸浮液增加免疫回應。繼而在1925年，Ramon 敘述殿粉油作為一種增加對白喉（diphtheria)類毒素之抗毒 性反應之物質。然而油乳液不流行，直到1937年Freund提 出其現在已知為Freund's完整佐藥（FCA)之佐藥調配物。 FCA為一種由礦物油（鏈烷烴）油混合已被殺死之分枝桿菌 與山梨醇單油脂（Arlacel A)組成之油包水乳液。山梨醇單油 脂主要為二縮甘露醇單油酸酯且作為乳化劑。雖然FCA優 於誘發抗體回應，其造成嚴重之疼痛、膿腫形成、發燒、 及肉芽腫發炎。為了避免這些不欲之副作用，已發展不完 整Freund's佐藥（IFA)。IFA之組合物類似FCA，除了無分枝 桿菌成分。IFA經注射位置處之貯藏所調配物作用且隨抗體 產生細胞之刺激而緩慢地釋放抗原。 另一種改良FCA之方法係基於以生物相容性油取代礦物 91384.doc 1353850 油有助於在注射位置處排除伴隨FCA之反應之概念。亦據 ^此乳液應為水包油而非油包水，因為後者在注射位置處 產生長期持續之貯藏所。HiUeman等人敘述一種油係佐藥 Adjuvant 65"，其包括86%之花生油、1〇%之山梨醇單油脂 作為乳化劑、及4%之單硬脂酸鋁作為安定劑。HiUeman， 1966，Prog. Med. Virol. 8: 131_182; Hilleman 與 Beale， 1983，於New Approaches to Vaccine Development(編者 Bell， R.與 Torrigiani，G.)，Sehwabe，Base卜在人體中，Adjuvant 65 文全且強效，但是呈現較IFA低之佐藥性。不過Adjuvant Μ 之使用因與特定類疫苗對人類之致反應性，及在使用純化 或合成乳液取代山梨醇單油脂時之佐藥性降低而中止。美 國專利第5,718,904與5,690,942號教示，為了改良安全性外 形之目的，於水包油乳液中之礦物油可以可新陳代謝油取 代。 除了佐藥性及安全性，乳液之物理外觀亦為重要之商業 考®。物理外觀視乳液之安定性而定。乳化、沈積及凝聚 為乳液不安定之指標。乳化係在乳液之油與水相具有不同 之比重時發生。乳化亦在乳液之起初滴徑大且乳液滴不具 有任何布朗運動時發生。在滴徑大時有界面破裂之趨勢且 滴凝聚成大顆粒《乳液安定性係由許多因素決定，如所使 用乳化劑之本性及量、乳液中之滴徑大小、及油與水相間 之密度差。 乳化劑因降低界面自由能且對滴凝聚製造物理或靜電障 壁而促進分散滴之安定化 已使用非離子性及離子性界面 91384.doc 1353850 活性劑作為乳化劑。非離子性乳化劑在界面處定向且產生 相田大型之結構，其導致分散滴之立體迴避。陰離子性乳 化劑因吸引抗衡離子而誘發電雙層形成；此雙層斥力造成 滴在其接近時互斥。 除了使用乳化劑，亦可經由藉機械裝置降低乳液之滴徑 而侍到乳液安定性。一般而言，已使用推進混合器、渦輪 轉動器、膠體研磨機、均化機及超音波振盪器製造乳液。 微流體化為另一種增加乳液中滴徑均勻性之方式。微流體 化可產生具次微米範圍之一致粒度之溫和、物理上安定乳 液。除了增加乳液之安定性，微流體化之製程可在最後過 遽’其為確保最終產物無菌性之較佳方式。此外，次微米 油粒可自注射位置送入淋巴管然後至引流鏈之淋巴結、血 液及脾臟。如此降低在注射位置處建立油狀貯藏所（其可產 生局部發炎及顯著之注射位置反應）之可能性。 微流體化機現已市售。乳液形成係在微流體化機中因兩 個微流體化流在相互作用槽内以高速相互作用而發生。微 流體化機為空氣或氮驅動且可以超過2〇,〇〇〇 pSi之内壓操 作。美國專利第4,908，154號教示微流體化機用於得到本質 上無任何乳化劑之乳液之用途。 許多種次微米水包油佐藥調配物已敘述於文獻中。美國 專利第5,376,369號教示一種已知為結構佐藥調配物（3八1?) 之次微米水包油乳液佐藥調配物。SAF含鯊稀或f燒作為 油成分、乳液形成量之Pluronic L121(聚環氧丙烷-聚環氧乙 烷）嵌段聚合物、及免疫強效量之胞壁醯二肽。黛:婦為—種 91384.doc -10· 1353850 . 在許多組織中，特別是在f魚及其他魚類之肝臟中發現之 膽固醇之線形烴先質。I烷係藉由將t烯氫化而製備且完 王飽和。鯊烯與鯊烧均可新陳代謝且具有良好之毒理學研 九己錄。鯊烯或鯊烷乳液已用於人類癌症疫苗而具有溫和 之副作用及所需之效果。例如，參見Anth〇ny c AUis〇n， 1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19:87-93。 美國專利第6,299,884號及國際專利公告w〇 9〇/14837號 教示聚環氧丙烧-聚環氧乙烧嵌段共聚物對於次微米水包 油礼液之形成不重要。此外，這些參考資料教示非毒性可 新陳代謝油之用途，而且在其乳液調配物中明確地排除礦 物油及毒性石油蒸餾油之用法。 美國專利第5,961，970號教示另一種作為疫苗佐藥之次微 米水包油乳液。在此專利所述之乳液中，疏水性成分係選 自中鏈二甘油酯油、蔬菜油及其混合物組成之群組。包括 於此乳液中之界面活性劑可為天然之生物降解相容性界面 活性劑，如磷脂（例如，卵磷脂），醫藥可接受非天然界面活 性劑，如TWEEN-80。相對於在乳液已獨立地及外部地形成 後混合抗原與乳液，此專利亦教示在乳液形成時將抗原併 入乳液中。 美國專利第5,084,269號教示含卵磷脂組合礦物油之佐藥 調配物造成在宿主動物内之刺激性降低，同時誘發增加之 系統免疫性。由美國專利第5,084,269號得到之佐藥調配物 係以商標名AMPHIGEN®市售作為家畜疫苗。AMpmGEN⑧ 91384.doc 1353850 ‘ 調配物係由膠微粒-被印碟脂包圍之油滴製成。這些膠微粒 使較傳統油系佐藥更多之全部細胞抗原附著。此外，相較 於其他含油佐藥之疫苗調配物，其一般含1〇%至2〇%之油， AMPHIGEN®為主疫苗調配物含2·5至5%之礦⑯油之低油 量。其低油量使此佐藥為主疫苗調配物在注射位置處對組 織較不刺激，造成較少之損害及在屠宰時較少之修整。此 外，包圍油滴之卵磷脂塗層進一步減少注射位置反應而造 成安全且有效之疫苗。 AMPHIGEN®調配物作為許多種家畜疫苗之佐藥，而且 在短期及長期儲存期間及重組時需要維持疫苗產物之物理 外觀。此外，恰在注射前將親脂化抗原混合預製之佐藥調 配物°此實務並非始終確保抗原在水包油乳液内均勻分 布’而且乳液外觀可能未如所需。此外，仍有在長健存壽 命時不顯示相分離之安定佐藥調配物之需求。一種防止分 離之方式為降低乳液之滴徑及增加顆粒均勻性。雖然可新 陳代謝油為主乳液調配物之微流體化製程已見於文獻中， 如AMPHIGEN®之水包油調配物之微流體化尚未進行。 在本發明中，已使用微流體化使卵磷脂包圍之礦物油滴 之大小為次微米大小。出乎意料地，本發明人已發現，以 包含印磷脂與油之混合物之水包油乳液為佐藥之疫苗調配 物之微流體化不僅改良調配物之物理外觀，亦增強調配物 之免疫效果。微流體化調配物之特性亦為改良之安全性外 形。 【發明内容】 91384.doc -12- 1353850 . 本發明人已出乎意料地發現，水包油調配物為主之不可 新陳代謝性油之佐藥活性及安全性外形可經微流體化而改 良。併入微流體化乳液之抗原安定，即使是在抗原為在微

SlL體化刖内部地併入乳液中時。 - 因此，在一個具體實施例中，本發明提供可作為疫苗佐 ， 藥之次微米水包油乳液調配物。本發明之次微米水包油乳 . 液係由不可新陳代謝性油 '至少一種界面活性劑、及水性 成分組成，其中油係以次微米範圍之平均油滴徑分散於水 性成分中。較佳不可新陳代謝性油為輕礦物油。較佳界面 鲁 活性劑包括卵鱗脂、Tween_8〇與Span_8〇。 本發明提供之較佳水包油乳液係由AMPHIGEN@調配物 組成。 本發明之水包油乳液可包括適當及需要之另外之成分， 其包括防腐劑、滲透劑、生物黏著分子及免疫調節分子。 杈佳免疫調節分子包括，例如，Qun A、膽固醇、Gpi_〇i〇〇、 溴化二甲基二-十八碳銨（DDA)。 在另-個具體實施例中，本發明提供製備次微米水包油 · 乳液之方法。依照本發明，將各種乳液成分混合在一起， 其包括油、一或多種界面活性劑、水性成分及任何適用於 此乳液之其他成分。使此混合物接受主要乳化製程以形成 水包油礼液，然後將其送經微流體化機而得到具有直徑小 . 於1微米，較佳為平均滴徑小於〇5微米之滴之水包油乳液。 _ 在另一個具體實施例中，本發明提供含抗原及上述次微 米水^ /由乳液之疫田組合物。抗原係外部地或内部地併入 9l384.doc 13 1353850 乳液t ’較佳為内部地。 可包括於本發明之疫苗組合物之抗原可為細菌、真菌、 或病毒抗原或其組合。此抗原可為鈍化之全或部份細胞或 病毒製品之形式或藉習知蛋白質純化、基因工程技術或化 學合成而得之抗原分子之形式。 在進一步具體實施例中，本發明提供製備含抗原組合次 微米水包油乳液之疫苗組合物之方法。 在製備本發明之疫苗組合物時，抗原可内部地（例如，在 微流體化前）或外部地（例如，在微流體化後）組合水包油乳 液之成分。較佳為，抗原係内部地組合水包油乳液之成分。 在另一個具體實施例中，本發明提供含微封包抗原及上 述次微米水包油乳液之疫苗組合物，其中微封包抗原係外 部地組合乳液。 【實施方式】 本發明人已出乎意料地發現，以水包油乳液（包含卵磷脂 與礦物油之混合物）為佐藥之疫苗調配物之微流體化不僅 改良疫苗調配物之物理外觀，亦增強疫苗調配物之免疫效 果。微流體化疫苗調配物之特性亦為改良之安全性外形。 基於這些發現，本發明提供可在疫苗組合物中作為佐藥 之次微米水包油乳液。亦提供使用微流體化機製造這些次 微米水包油乳液之方法。此外，本發明提供其中抗原組合 次微米水包油乳液之次微米疫苗組合物。亦提供製造此疫 苗組合物之方法。本發明進一步提供含微封包抗原組合次 微米水包油乳液之疫苗組合物，及製造此疫苗之方法。 91384.doc -14· 1353850 為了揭示之明確性，而且不為限制之方式，本發明之詳 細說明分成以下敘述或描述本發明之特定特點、具體實施 例或應用之細目。 次微米水包油乳液 在一個具體實施例中，本發明提供可作為疫苗佐藥之次 微米水包油乳液調配物。本發明之次微米水包油乳液增強 疫苗組合物中抗原之免疫原性，對動物施打安全且在儲存 時安定》 本發明之次微米水包油乳液係由不可新陳代謝性油、至 少-種界面活性劑、及水性成分組成，其中油以次微米範 圍之平均油滴徑分散於水性成分中。 「次微米」表示滴為小於！ μηι(微米）之大小且平均 (average)或平均(叫油滴徑小於】㈣。較佳為乳液之 平均滴徑小於0.8微米；更佳為小於〇5微米；❿且甚至更 佳為小於0.4微米，或約o.loj微米。 「平均滴徑」定義為粒度之體穑公希 腹檟刀f内之體積平均直徑 (VMD)粒度。VMD係由各粒徑乘以士 | t 分τ仫孓以此大小之所有顆粒之體 積且加總而計算。然後將其除以所有顆粒之總體積。 在此使用之名詞「不可新陳代謝性油」指投以乳液之動 物病患身體無法新陳代謝之油。 在此使用之名詞「動物及「 」及動物病患」指所有非人類 之動物’例如，包括牛、羊、及豬 適合用於本發明乳液之不可新 j新陳代謝性油包括烷屬烴、 烯屬烴、炔屬烴、及其對應盘 應^與_、該與自旨及其混合物。 9I384.doc ，15· 1353850 較佳為，油之個別化合物為輕烴化合物，即，此成分具有6 至3 0個碳原子。油可合成地製備或由石油產物純化β用於 本發明乳液之較佳不可新陳代謝性油包括，例如，礦物油、 鏈烷烴油及環鏈烷烴。 名詞「礦物油」指經蒸餾技術得自石油之液態烴之混合 物。此名詞與「液態鏈烷烴」、「液態石油」及「白色礦物 油」同義。此名詞意圖包括「輕礦物油」，即，藉石油蒸餾 類似地得到’但是具有比白色礦物油稍低之比重之油。例 如，參見Remington 之 Pharmaceutical Sciences，第 18 版， (Easton，Pa.: Mack Publishing Company, 1990，第 788與 1323 頁）。礦物油可得自各種商業來源，例如，j T. Baker (Phillipsburg，PA)、USB Corporation (Cleveland，OH)。較 佳之礦物油為以商標名drakeol®市售之輕礦物油。 一般而§ ’本發明次微米乳液之油成分係以1%至5〇%體 積比之量；較佳為10%至45%之量；更佳為20❶/。至40%之量 存在。 本發明之水包油乳液一般包括至少一種（即，一或多種） 界面活性劑。界面活性劑與乳化劑（此名詞在此交替地使用） 為安定油滴表面且將油滴維持在所需大小内之試劑。 適合用於本發明之界面活性劑包括天然生物相容性界面 活性劑及非天然合成界面活性劑.生物相容性界面活性劑 包括磷脂化合物或磷脂之混合物。較佳之磷脂為磷脂醯膽 儉（㈣脂）’如大豆或蛋_脂β M脂可藉由將粗蔬菜油 水洗及將所得水合膠分離且乾燥，如磷脂與三甘油酯之混 91384.doc -16- 1353850 合物而得。精製產物可藉由在丙酮清洗而去除三甘油s旨及 蔬菜油後，分餾殘留之丙酮不溶性磷脂與糖脂之混合物而 得。或者，印磷脂可得自各種商業來源。其他適當之磷脂 包括磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、 心肌磷脂與磷脂醯乙醇胺。磷脂可自天然來源隔離或習知 地合成。 適合用於本發明次微米乳液之非天然合成界面活性劑包 括葡萄聚糖為主非離子性界面活性劑，例如，經脂肪酸取 代葡萄聚糖界面活性劑（以名稱SPAN®或ARLACEL®市 售）、聚乙氧化葡萄糖醇之脂肪酸酯（TWEEN®)、得自如蓖 麻油來源之脂肪酸之聚乙二醇酯（EMULFOR);聚乙氧化 脂肪酸（例如，名為SIMULSOL M-53之硬脂酸）、聚乙氧化 異辛酚/曱醛聚合物（TYLOXAPOL)、聚環氧乙烷脂肪醇醚 (BRIJ®);聚環氧乙烷非苯基醚（TRITON® N)、聚環氧乙烷 異辛基苯基醚（TRITON® X)。較佳之合成界面活性劑為名 為SPAN®與TWEEN®之界面活性劑。 用於本發明水包油乳液之較佳界面活性劑包括卵填脂、 Tween-80與 SPAN-80。 一般而言，如果使用二或更多種界面活性劑，則界面活 性劑或界面活性劑之組合係以0.01 %至10%，較佳為0.1%至 6.0%，更佳為0.2%至5.0%體積比之量存在於乳液中。 水性成分組成乳液之連續相且可為水、經緩衝鹽水或任 何其他適當之水溶液。 本發明之水包油乳液可包括適當且需要之另外之成分， 91384.doc -17- 1353850. 其包括防腐劑、滲透劑、生物黏著分子、及免疫調節分子。 據信生物黏著分子可增強抗原在目標黏膜表面上或通過 之輸送及附著而產生黏膜免疫性。適當生物黏著分子之實 例包括酸性非天然發生聚合物，如聚丙烯酸與聚甲基丙烯 酸（例如，CARBOPOL®、CARB〇MER);酸性經合成修改 天然聚合物’如羧甲基纖維素；天然經合成修改天然聚合 物’如（沒丙基）甲基纖維素；驗性帶胺聚合物，如殼聚糖； ί于自天然來源之酸性聚合物，如海藻酸、透明質酸、果膠、 只蓍耀·與梧桐膠；及中性非天然發生聚合物，如聚乙烯醇 或其組合。 在此使用之名詞「免疫調節分子」指增強疫苗組合物中 抗原成分鱗發之保護性免疫回應之分子。適當之免疫調節 材料包括細菌細胞壁成分，例如，Ν_乙醯基胞壁基_L_丙胺 酿基-D-異谷酿胺之衍生物，如murabutide、蘇胺酿基-MDP 與胞壁酿二肤，皂角普糖苦與其衍生物，例如，Quil A、 QS21與GPI-0100;膽固醇；及四級銨化合物，例如，溴化 二甲基二-十八碳基錄（DDA)與N，N-二-十八碳基-N，N-武（2-經乙基）丙二胺（"avridine")。 皂角苷為廣泛種類之植物物種中如二级代謝物而製造之 糖苷化合物。皂角苷之化學結構產生廣泛範圍之藥理及生 物活性，包括一些強效及有效之免疫學活性。 結構上’皂角苷包括任何附著於一或多個糖鏈之糖荅配 基。皂角苷可依照其糖苷配基組合物分類：三萜糖苷、類 固醇糖苷與類固醇生物礆糖苷。 9l384.doc -18 - 1353850 - 皂角苷可自皂樹之樹皮隔離。皂角苷長期已知為免疫刺 激劑。Dalsgaard, K.之"Evaluation of its adjuvant activity with a special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease1', Acta. Vet. Scand. 69:1-40 1978。含皂角苷之植物粗萃取物增強足部與口部疾 病疫苗之效用。然而，此粗萃取物在用於疫苗時帶有負面 影響。後來，Dalsgaard藉滲析、離子交換與凝膠過遽層析 術自皂角苷部份地純化佐藥活性成分。Dalsgaard, K.等人之 "Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines", Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974。以此方式純化之佐藥活性成 分已知為"Quil A”。以重量計，Quil A相較於皂角苷顯示增 加之效用且呈現降低之局部反應。Quil A廣泛地用於家畜疫 苗。 以高壓液態層析術（HPLC)進一步分析Quil A顯示一種密 切相關皂角苷之異質混合物且導致QS21之發現，其為具有 降低或最小毒性之強效佐藥。Kensil C.R.等人之"Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex," J. Immunol. 146: 431-437, 1991。不似大部份其他之免疫刺激劑，QS21為水溶性且可 用於有或無乳液型調配物之疫苗。QS21已顯示對老鼠引出 Thl型回應而刺激IgG2a與IgG2b抗體產生，及回應次單位抗 原而誘發抗原特異性CD8 + CTL(MHC第I類）。對人類之臨 91384.doc -19- 1353850 床研究已證明其佐藥性具有可接受之毒理學外形。Kensil, C.R.等人之”Structural and imunological charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit and Adjvuant Approach，”編者 Powell, M.F.與 Newman, M· J. Plenum Publishing Corporation，紐約，1995，第 525-54 1 頁。 美國專利第6,080,725號教示製造及使用皂角苷-親脂性 共軛物之方法。在此皂角苷-親脂性共軛物中，使親脂性部 份（如脂質、脂肪酸、聚乙二醇或萜烯）經存在於三萜烯皂角 苷之3-0-葡萄糖醛酸上之羧基共價地附著非醯化或去醯化 三萜烯皂角苷。親脂性部份對皂角苷（如皂樹去醯皂角苷、 lucyoside P、或得自絲石竹（Gypsophila)、肥皂草（saponaria) 與針珊蝴屬（Acanthophyllum)之皂角苦）之3-0-葡萄糖搭酸 之附著增強其對體液及細胞傳導免疫性之佐藥效果。此 外，親脂性部份對非或去醯基皂角苷之3-0-葡萄糖醛酸殘 基之附著產生比原始皂角苷較易純化、較無毒性、化學上 較安定、而且具相等或較佳佐藥性質之皂角苷同系物。 GPI-0100為美國專利第6,080,725號所述之皂角苷-親脂 性共軛物。GPI-0 100係藉由經葡萄糖醛酸之羧基將脂族胺 加入去醯基皂角苦而製造。 四級銨化合物-已提議許多種脂族氮系鹼作為免疫佐 藥，其包括胺、四級敍化合物、胍咬、苄腺、與thiouroniums。 此指定化合物包括溴化二曱基二-十八碳基銨（DDA)與N，N-二-十八碳基-N，N-貳（2-羥甲基）丙二胺（"avridine”）。 美國專利第5,951，988號教示含四級銨鹽（如DDA)組合油 91384.doc -20- 1353850 成分之佐藥調配物。此調配物可用於結合已知之免疫物 質，例如，疫苗組合物中之病毒或細菌抗原，以增強免疫 原性回應。此組合物亦可不併入抗原而作為非特異性免疫 刺激性調配物。 美國專利第4,310,550號敘述N，N-高碳烷基-N，N'-貳（2羥 乙基）丙二胺與N，N-高碳烷基-二曱苯二胺經脂肪或脂質乳 液調配成疫苗佐藥之用途。一種經由將佐藥調配物非經腸 胃施打而誘發或增強人類或動物中抗原之免疫原性回應之 方法敘述於美國專利第4,310,550號。 在較佳具體實施例中，本發明提供一種可作為疫苗佐藥 之次微米水包油乳液，其係由AMPHIGEN®調配物組成，具 有小於1微米之滴徑及約0.25微米之平均滴徑。 在此使用之名詞「AMPHIGEN®調配物」指藉由在 TWEEN® 80與SPAN® 80存在下，混合DRAKEOL®卵填月旨 油溶液（Hydronics，Lincoln, NE)與鹽水溶液而形成之溶 液。典型AMPHIGEN®調配物含40%體積比（v/v)之輕礦物 油、約25% w/v之卵磷脂、約0.1 8%體積比（v/v)之TWEEN 80、及約0.08% 體積比（v/v)之 Span 80。 製備次微米水包油乳液之方法 在另一個具體實施例中，本發明提供製備上述次微米水 包油乳液之方法。 依照本發明，將乳液之各種成分，包括油、一或多種界 面活性劑、水性成分及適合用於乳液之任何其他成分，組 合且混合在一起。 91384.doc -21- 1353850 . 使形成之混合物接受乳化製程，一般為藉由通過一或多 個均化器或乳化器一或多次以形成水包油乳液，其具有均 勻之外觀及約0.5微米之平均滴徑。任何市售均化器或乳化 器均可用於此目的，例如，Ross乳化器（Hauppauge, NY)、 顆粒均化器（Everett, ΜΑ)。 然後使如此形成之乳液接受微流體化以使滴徑為次微米 範圍。微流體化可使用市售微流體化機完成，如得自麻州 Newton之 Microfluidics之型號 1 ΙΟΥ ; Gaulin Model 30CD (Gaulin，Inc.，Everett，Mass.);及 Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.) ° 這些微流體化機係藉由將流體在高壓力下強制通過小穿 孔，使得兩個流體流在相互作用槽中以高速相互作用而形 成具次微米滴徑之乳液而操作。 滴徑可使用市售篩選儀器，藉此技藝已知之各種方法測 定，例如，雷射繞射。此大小視使用之界面活性劑型式、 界面活性劑對油之比例、操作壓力、溫度等而不同。熟悉 此技藝者無需不當之實驗可決定得到具所需滴徑之乳液之 這些參數之所需組合。本發明乳液之滴徑小於1微米，較佳 為平均滴徑小於0.8微米，而且更佳為平均滴徑小於0.5微 米，而且甚至更佳為平均滴徑小於0.3微米。 在本發明之較佳具體實施例中，將由Hydronics (Lincoln, NE)市售且相對礦物油含25°/。之卵磷脂之DRAKEOL卵磷脂 油溶液組合且混合鹽水及界面活性劑TWEEN® 80與 SPAN® 80，而形成「AMPHGEN®溶液」或「AMPHIGEN® 91384.doc -22- 1353850 調配物」。然後將AMPHGEN®溶液以Ross® (Hauppauge，Νγ 1 1 788)乳化器在3400 rpm乳化而形成水包油乳液。繼而使此 乳液通過以約4500±500 psi操作之微流體化機一次。此微流 體化水包油乳液具有小於1微米之滴徑，及約〇 2 5微米之平 均滴徑。 含抗原併入次微米水包油乳液中之疫苗组合物 在另一個具體實施例中，本發明提供含抗原與上述次微 米水包油乳液之疫苗組合物。這些疫苗組合物之特性為具 有增強之免疫原性效果及改良之物理外觀（例如，在長期儲 存後未觀察到相分離）。此外，本發明之疫苗組合物對動物 施打安全。 依照本發明，抗原可外部地或較佳為内部地組合乳液。 名詞「内部地」指其中在微流體化步驟前將抗原組合乳液 成分之製程。名詞「外部地」指其中在乳液已微流體化後 將抗原加入乳液之製程。外部地加入之抗原可為自由抗原 或可封包於微粒中，如以下進一步敘述。 在此使用之名詞「抗原」指在動物中為免疫原性，而且 包括於疫苗組合物中以在施打疫苗組合物之動物中引出保 護性免疫回應之任何分子、化合物或組合物。 在此結合抗原使用之名詞「免疫原性」指抗原在動物中 針對抗原引起免疫回應之能力。此免疫回應可為主要由細 胞毒性T-細胞傳導之細胞免疫回應，或主要由幫助者孓細 胞（其依序活化B-細胞導致抗體產生）傳導之黏膜免疫回應。 「保護性免疫回應」在此定義為在動物中發生，對於因 91384.doc -23· 1353850- 抗原或含抗原之病原造成之失能或疾病，防止或可偵測地 降低發生、或排除或可偵測地降低嚴重性、或可偵測地減 缓傳播速率之任何免疫回應，其為抗體或細胞傳導免疫回 應、或兩者。

可包括於本發明疫苗組合物之抗原包括由以下製備之抗 原：病原細菌，如豬關節支原體（Mycoplasma hyopneumoniae)、 嗜睡嗜血桿菌（Haemophilus somnus)、副豬嗜血桿菌 (Haemophilus parasuis)、支氣管敗血性,飽特菌（Bordetella bronchiseptica)、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumonie)、出血敗血性巴斯德菌（Pasteurella multocida)、溶血性Manheimia(Manheimiahemolytica)、牛 支原菌（Mycoplasma bovis) 、 galanacieum 支原菌 (Mycoplasma galanacieum)、牛結核分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)、副結核分枝桿菌（Mycobacterium paratuberculosis)、梭狀芽胞桿菌屬（Clostridial spp.)、乳鏈 球菌（Streptococcus uberis)、豬型鏈球菌（Streptococcus suis)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、紅斑丹毒 絲菌（Erysipelothrix rhusopathiae)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter spp.)、壞死梭形桿菌（Fusobacterium necrophorum)、大腸桿菌（Escherichia coli)、腸炎沙門菌 (Salmonella enterica serovars)、細螺旋體屬（Leptospira spp.);病原真菌，如念珠菌屬（Candida);原蟲，如隱擔孢 子蟲（Cryptosporidium parvum)、Neospora canium、鼠弓形 體（Toxoplasma gondii)、艾美球蟲屬（Eimeria spp·);螺蟲， 91384.doc -24- 1353-850 如月線蟲屬（Ostertagia)、庫珀線蟲屬（Cooperia) '血矛線蟲 屬（Haemonctrus)、片吸蟲屬（Fasci〇ia)，鈍化全或部份細胞 製品之形式，或藉習知蛋白質純化、基因工程技術或化學 合成而得之抗原分子之形式。另外之抗原包括病原病毒， 如牛疮疹病毒-1，3,6型、牛病毒性下痢病毒（BvdV)第1與2 型、牛田彳流行性感冒病毒、牛呼吸道融合病毒、牛白血病 病毒、牛痙病毒、食物及口部疾病病毒、狂犬病、豬瘟病 毒、非洲豬瘟病毒、豬小病毒、PRRS病毒、豬環狀病毒、 流行性感冒病毒、豬水病病毒、泰琛（Techen)熱病毒、假狂 犬病病毒，鈍化全或部份細胞製品之形式，或藉習知蛋白 質純化 '基因工程技術或化學合成而得之抗原分子之形式。 抗原量應使得組合水包油乳液之抗原對於在動物中誘發 保護性免疫回應有效。有效抗原之精確量視抗原之本性、 活性及純度而定，而且可由熟悉此技藝者決定。 存在於疫苗組合物中之水包油乳液之量應足以使疫苗組 合物中抗原之免疫原性增效。在希望及適當時，除了水包 油乳液提供之界面活性劑，額外量之界面活性劑或另外之 界面活性劑可加入疫苗組合物。一般而言油成分係以i 至20%體積比之量；較佳為1〇%至1〇%體積比之量；更佳 為2.0%至5.0%體積tti之量，存在於疫苗组合物之最終體 積。界面活性劑或界面活性劑之組合(如果使用二或更多種 界面活性劑）係以〇. 1 %至2〇%，較佳為〇丨5%至丨〇%，更佳為 0.2/。至6.0/。體積比之量，存在於疫苗組合物之最终體積。 除了抗原及水包油乳液，此疫苗組合物可包括適當及希 91384.doc I353«5〇. 望之其他成分，如以上關於水包油乳液所述之防腐劑滲 透劑、生物黏著分子、及免疫調節分子（如Quil A、膽固醇、 GPI-0100、溴化二曱基二十八碳銨（]31)八)）。 本發明之疫苗組合物亦可包括家畜可接受載劑。名詞「家 畜可接丈載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗料、 佐藥、女定劑、稀釋劑、防腐劑、殺菌與殺真菌劑、等滲 壓劑、吸附延遲劑等。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、 乙醇、甘油等。等滲壓劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖 醇、葡萄糖醇、與乳糖。安定劑包括酪蛋白。 在較佳具體實施例中，本發明提供一種疫苗組合物，其 包括内部地併入水包油乳液（其具有小於丨微米之滴徑，較 佳為平均滴徑小於〇·8微米，更佳為小於0.5微米，而且甚至 更佳為平均滴徑為約〇·5微米）中之BVDV第I型或BVDV第II 型抗原至少之一 ^ BVDV第1及/或^型抗原較佳為鈍化病毒 製品之形式。此次微米水包油乳液較佳為由AMPHIGEN® s周配物（即’含輕礦物油、卵磷脂、TWEEN® 80、與SPAN® 80之調配物）組成。此疫苗組合物較佳為亦包括Quii a、膽 固醇、與乙汞硫代柳酸鈉。 在另一個具體實施例中，本發明提供一種疫苗組合物， 其包括細螺旋體抗原及BVDV第I型或BVDV第II型抗原至 少之一於水包油乳液中。此抗原（較佳為鈍化細胞或病毒製 品之形式）係内部地併入水包油乳液（其具有小於1微米之滴 徑’較佳為平均滴徑小於0.8微米，更佳為小於〇.5微米，而 且甚至更佳為平均滴徑為約〇·5微米）中。此次微米水包油乳 91384.doc -26· 1353-850. 液較佳為由AMPHIGEN®調配物（即，含輕鑛物油、即鱗脂、 TWEEN® 80、與SPAN® 80之調配物）組成。此疫苗組合物 較佳為亦包括一或多種選自Quil_A、膽固醇、DDA、 GPI-100、與氫氧化鋁（Αι〇Η)之免疫刺激分子。 在另一個具體實施例中’本發明提供一種疫苗組合物， 其包括至少一種細菌抗原，例如，重組乳鏈球菌PauA蛋白 質或大腸桿菌之細胞製品或兩者之組合，於水包油乳液 中。此抗原係内部地併入水包油乳液（其具有小於1微米之 滴徑’較佳為平均滴徑小於0.8微米，更佳為小於〇5微米， 而且甚至更佳為平均滴徑為約〇·25微米）中。此次微米水包 油乳液較佳為由AMPHIGEN®調配物（即，含輕礦物油、卵 磷脂、TWEEN® 80、與SPAN® 80之調配物）組成。此疫苗 組合物較佳為亦包括一或多種選自Qui丨A、膽固醇、dd A、 與GPI-100之免疫刺激分子。 本發明之疫苗組合物可由已知途徑對動物施打，其包括 口服、鼻内、黏膜、局部、經皮膚、及非經腸胃（例如，靜 脈、腹膜内、真皮内 '皮下或肌内）途徑。施打可使用途徑 之組合完成，例如，首先使用非經腸胃途徑施打繼而使用 黏膜途徑施打。 製備疫苗組合物之方法 在進一步具體實施例中，本發明提供製備含抗原及次微 米水包油乳液之疫苗組合物之方法。 在製備本發明之疫苗組合物中，抗原可内部地或外部地 組合水包油乳液之成分。較佳為，抗原係内部地組合水包 91384.doc •27· 1353850 . 油乳液之成分。 抗原可組合乳液之各種成分，包括油、—或多種界面活 性劑、水性成分、及任何其他適當成分，而形成混合物。 此混合物接受主要摻合製程，其一般為通過一或多個均化 器或乳化器一或多次’以形成含抗原之水包油乳液。任何 市售均化器或乳化器均可用於此目的，例如，R〇ss乳化器 (Hauppauge，NY)、Gaulin 均化器（Everett，MA)或 Microfluidics (Newton，ΜΑ)。或者，可首先使用均化器或 乳化器組合乳液佐藥之各種成分，包括油、一或多種界面 活性劑、與水性成分，以形成水包油乳液；然後將抗原加 入乳液。主要摻合後之水包油乳液之平均滴徑為約1.〇_12 微米。 然後使含抗原之乳液接受微流體化以使滴徑為次微米範 圍。微流體化可使用市售微流體化機完成，如得自麻州

Newton之Micr0fiuidics之型號 11〇γ; Gaulill Model 30CD (Gaulm, lnc.，Everett，Mass );及 Rainnie 奶…讣 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.) 〇 滴徑可使用市售篩選儀器，藉此技藝已知之各種方法測 疋’例如’雷射繞射。此大小視使用之界面活性劑型式、 界面活（'生劑對油之比例、操作壓力、溫度等而不同。熟悉 此技藝者可決定得到具所需滴徑之乳液之這些參數之所需 組合。本發明乳液之油滴為直徑小於丨微米。較佳為平均滴 徑小於〇.8微米。更佳為平均滴徑小於0.5微米。甚至更佳為 平均滴徑為約〇. 1至0.3微米。 91384.doc 1353850 在本發明之較佳具體實施例中，將在礦物油中含25%之 卵磷脂之DRAKEOL®卵磷脂油溶液組合且混合界面活性劑 TWEEN® 80與SPAN® 80及鹽水溶液，而形成含40%之輕礦 物油、卵磷脂、0.1 8%之 TWEEN® 80、與 0.08%之 SPAN® 80 之混合物。然後將此混合物以Ross® (Hauppauge，NY 11788) 乳化器在3400 rpm乳化而形成乳液產物，其亦稱為 「AMPHIGEN®調配物」或「AMPHIGEN®溶液」。繼而藉 乳化器之助，例如，Ross均化器，將所需抗原組合 AMPHIGEN®溶液及任何其他適當成分（例如，免疫刺激分 子），而形成含抗原之水包油乳液。使此乳液通過以約10000 ±5 00 psi操作之微流體化機一次。此微流體化水包油乳液具 有小於1微米之滴徑，及約0.25微米之平均滴徑。 在次微米水包油乳液中含微封包抗原之疫苗组合物及製法 在另一個具體實施例中，本發明提供含封包於微粒中之 抗原（或「微封包抗原」）之疫苗組合物，其中微封包抗原係 外部地併入上述之次微米水包油乳液中。 吸收或捕捉粒狀載體中抗原之方法在此技藝為已知的。 例如，參見 Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications(Justin Hanes, Masatoshi Chiba and Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. In: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach。編者 Michael F. Powell與 Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, 紐約及倫敦）。粒狀載體可對動物病患之免疫系統提出所選 擇抗原之多份複製，而且促進抗原在局部淋巴結之捕捉及 9I384.doc •29· 1353850 . 保留°此顆粒可被巨噬細胞呑噬且可經細胞毒素釋放而增 強抗原出現《粒狀載體亦已敘述於此技藝且包括，例如， 衍生自聚甲基丙烯酸曱酯聚合物者、及衍生自聚（丙交酯） 與聚（丙交酯-共-乙交酯）者（其已知為PLG)。聚甲基丙烯酸 甲醋聚合物為不可生物降解’而PLG顆粒因酯鍵對沿正常 新陳代謝路徑分泌之乳酸及羥乙酸之隨機非酶水解而可生 物降解。 可生物降解微球亦用於完成疫苗之控制釋放。例如，可 元成長期間之抗原連續釋放。視聚合物之分子量及聚合物 中乳酸對羥乙酸之比例而定’ PLGA聚合物可具有數日或數 週至數個月或一年之水解速率。緩慢之控制釋放造成類似 在多次注射後所觀察到之高含量抗體之形成。或者，可藉 由選擇具不同水解速率之聚合物而完成疫苗抗原之脈動釋 放聚0物之水解速率一般視聚合物之分子量及聚合物中 礼醆對羥乙醆之比例而定。由二或更多種具不同抗原釋放 速率之不同聚合物製造之微粒提供抗原之脈動釋放且模擬 多劑量制度之接種。 依知本發明，抗原（包括任何上述者）可因使用此技藝已 知之任何步驟（如實例17所例示者）而被吸收至粒狀聚合物 載劑/較佳為PLG聚合物’而形成微封包抗原製品。然後 將此微封包抗原製品混合及分散於次微米水包油乳液，此 礼液已敘述於上，而形成疫苗組合物。 f較佳具體實施例中’本發明提供含封包於pLG聚合物 合物’其中微封包抗原係外部地分散於微 91384.doc -30- 1353850. 流體化水包油乳液中，其係由輕礦物油、卵磷脂、 TWEEN80、SPAN80與鹽水組成，而且具有小於1.0微米之 平均滴徑。 以下為進行本發明之指定具體實施例之實例。此實例僅 為了描述性目的而提供，而且絕不意圖限制本發明之範圍。 實例1 AMPHIGEN®調配物之製備 以二步驟製程製備一種AMPHIGEN®調配物。在第一步 驟中，將80公升之Dr akeol卵填脂油溶液、11 6公升之破傷風 類毒素鹽水、1.2公升之SPAN 80、及2.8公升之Tween 80混 合在一起且使用Ross乳化器乳化。Drakeol卵磷脂油溶液含 25%之大豆卵磷脂及75°/。之礦物油。使乳化產物經Ross乳化 器再循環最少5倍體積或最少10分鐘。乳化產物在2-7°C儲 存最多24小時以進一步處理。將得自Ross乳化器槽之乳液 轉移至Gaulin均化器且在45 00 psi之壓力下均化20分鐘。然 後將所得之40% Drakeol卵磷脂油溶液（以下稱為 「AMPHIGEN®調配物」或「AMPHIGEN®溶液」）分配至 無菌聚丙烯羧基容器中。分配係在位於10,〇〇〇級控制環境 中之100級分配通風櫥内實行。將此容器儲存在2-7°C。此 AMPHIGEN®調配物用於下述之實驗，除非另有指示。 實例2 將BVD疫苗急速摻合均化之主要摻合 用於此化製程之裝置示於圖1。使用防腐技術或蒸氣轉換 閥，將含BVD第I型抗原（鈍化BVD第I型病毒製品）之瓶附著 91384.doc -31 · 1353-850 至摻合容器之底側口。在轉移所需體積之BVD第I型抗原結 束後，以含鈍化BVD第II型病毒製品（鈍化BVD第II型病毒 製品）之瓶取代BVD第I型抗原瓶。在所需量BVD第II型抗原 轉移結束後，將Ross均化器附著至可攜式容器且以最大 RPM (3 3 00 rpm)開始再循環。容器攪拌係維持在中速。 使用防腐技術或蒸氣轉換閥，將含50毫克/毫升濃度之 Quil-A之瓶附著至摻合容器之均化器連線口。使所需量之 Quil-A溶液經線吸濾送至容器中。在Quil-A溶液轉移結束 後，將瓶移除。以相同之方式將所需量之膽固醇於乙醇溶 液（18毫克/毫升）轉移至摻合容器。繼而將所需量之 AMPHIGEN®調酉己物、1 0%之乙汞石荒代柳酸納溶液及驗性修 改Eagles介質（"BME")摻和溶液加入摻合容器。 一但所有之加成結束，則混合持續又1 5分鐘。將所得調 配物等分成2毫升劑量且示為未微流體化AMPHIGEN®調配 物為主BVD疫苗。各劑疫苗含500微克之Quil-A、500微克 之膽固醇、2.5%之AMPHIGEN®調配物及0.009%之乙汞硫 代柳酸鈉。以gp53之ELISA滴定濃度計，測定兩種不同BVD 菌株之抗原濃度。 實例3 微流體化之二次摻合 圖2描述用於經微流體化二次摻合之製程。將微流體化機 蒸氣殺菌。首先將輔助處理模組槽裝設於此單元中且將空 槽裝設於第二槽位置。將含如實例2所述而製備之完全佐藥 化BVD疫苗之容器藉由將來自供應容器排放閥之轉移線附 91384.doc -32- I353S50. 著至微流體化機入口而連接至微流體化機。將氮氣連接至 供應容器濾氣入口且將容器壓力設定調整至20 +/- 5 PSI。 將收集容器排放閥連接至來自微流體化機出口之轉移線。 在完成所有必要之連接後，將閥打開且以+/- 500 PSI 之操作壓力開始微流體化。使疫苗之全部内容物一次通過 微流體化機且在後微流體化槽中收集。將此製品等分成2毫 升劑量且示為微流體化AMPHIGEN®調配物為主B VD疫苗。 實例4 經實驗台摻合製備疫苗組合物 隹 藉由加入BVD抗原及摻和劑將如實例1所述而製備之 AMPHIGEN®調配物稀釋至2.5%。使用攪拌棒代替使用均 化器在實驗台上摻合所得溶液。最終製品含以下組合物： BVD第I型與第II型抗原，2.5%之AMPHIGEN®調配物（其含 油、卵磷脂、SPAN®、與TWEEN®，如實例1所述），及鹽 水。SPAN 80與TWEEN 80係各以0.18%及0.08%體積比存在 於最終疫苗製品。 實例5 1 未微流體化與微流體化AMPHIGEN®調配物為主BVD疫苗 製品之滴徑分布之比較 使用如實例2所述而製備之未微流體化AMPHIGEN®調 配物為主疫苗、如實例3所述而製備之微流體化 AMPHIGEN®調配物為主疫苗、及如實例4所述經實驗台掺 · 合而製造之製品，比較疫苗製品之滴徑。將2毫升得自各製 品之樣品加入Malvern 2000雷射繞射計且測定滴徑分布。如 91384.doc •33· 1353850 圖3所示，結果顯示微流體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗 製品具有約_〇· 1微米之最大顆粒體積，而未微流體化 AMPHIGEN®調配物為主疫苗製品具有約1微米之最大顆粒 分布體積。 實例6 疫苗相分離之降低 將三種不同之疫苗製品：如實例2所述而製備之未微流 體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗、如實例3所述而製備之 微流體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗、及如實例4所述經 實驗台摻合而製備之製品，並列比較以測定其在長期儲存 時之相分離性質。使所有這些製品在4°C靜置約1個月，而 且就疫苗製品上方之乳狀層外觀而言監測相分離。如圖4所 示，微流體化AMPHIGEN®調配物為主製品相較於其他兩種 製品無相分離。 實例7 對抗牛病毒性下痢病毒之微流體化及未微流體化疫苗之製 備 將牛病毒性下痢病毒抗原經微流體化内部地併入 AMPHIGEN®調配物中。名詞「内部地併入」指在微流體化 前將抗原加入AMPHIGEN®調配物之製程。使抗原與佐藥調 配物之成分接受微流體化製程之物理力。在對照未微流體 化組中，抗原製品係經摻合分散於AMPHIGEN®調配物。 對照及微流體化製品之最終組合物如下：對gp53具有 2535 RU/劑量之鈍化後ELISA滴定濃度之BVD第I型、對 91384.doc -34- 1353850 gp53具有3290 RU/劑量之鈍化後£1>18八滴定濃度之6¥0第 II型、1.25毫克/劑量之濃度之Quil A、1.25毫克/劑量之濃度 之膽固醇、2.5%之最終濃度之AMPHIGEN®調配物、及 0.009%之最終濃度之乙汞硫代柳酸鈉。疫苗劑量為5毫升。 實例8 微流體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗製品中内部地併入 BVD病毒抗原之長期安定性 進行此實驗以測定内部地併入抗原在長期儲存時之安定 性。在微流體化製程時將已被殺死之BVD第II型病毒抗原内 部地併入AMPHIGEN®調配物中，而得到微流體化疫苗製品 (A9075 05)。以三種含相同抗原於未微流體化AMPHIGEN® 調配物中之其他疫苗製品（A904369、A904370與A904371) 作為對照。在未微流體化製品中，將抗原混合AMPHIGEN® 調配物且使用Ross均化器經摻合混合。將所有四種疫苗製 品在4°C儲存2年。在儲存時之不同時間點（0、6、12、或24 個月），使用所有四種調配物對三個月大之乳牛接種。 在第0及21日，以2毫升疫苗調配物經皮下途徑對三個月 大之乳牛接種。在第35日收集得自接種動物之血清，及經 BVDV-E2 ELISA以抗體滴定濃度計，測量對疫苗之血清回 應。如圖5所示，微流體化疫苗製品在所有測試之時間點 (0、6、12、或24個月）顯示較高之抗體滴定濃度，提示在微 流體化製程時將抗原内部併入時不失去抗原製品之安定 性。此外，亦令人驚奇地發現，微流體化疫苗製品在所有 時間點誘發增強之免疫回應。 91384.doc •35· 1353850. 實例9 徵流趙化後疫苗誘發直腸溫度增加之降低 在第〇日使用如實例7所述而製造之微流體化及未微流體 化疫苗製品對牛接種’及在接種前1日至接種後4日之期間 時監測直腸溫度。疫苗劑量為2毫升。此組係以單或雙劑量 疫苗接種。在第1曰至第4日（含）每曰測量且記錄直腸溫度。 第0日之直腸溫度係在施打測試物品前測量。 如圖6所示，結果顯示以單或雙劑量未微流體化疫苗調配 物接種之動物之直腸溫度在接種後約24小時急劇上升。然 而’在以微流體化形式之疫苗接種之動物中，接種後之直 腸溫度上升僅極小且顯著地低於以未微流體化調配物接種 之動物（圖6)。 實例10 在以微流體化疫苗調配物接種時注射位置反應體積較快地 消退 在第〇日使用如實例7所述而製造之微流體化與未微流體 化疫描製品對牛接種。包括於此研究之動物為雜交肉牛。 各安慰劑治療組（T01與T02)有3隻動物^ T03至T06組各有6 隻動物。疫苗劑量為2毫升且各組係在第〇日以一或兩份劑 量之疫苗接種。在第0日，測試物品係在右頸施打。接受雙 倍劑量（4毫升）之測試物品之動物（τ〇2、T04與T06)係以一側 之單次注射接受全雙倍劑量。在第〇日至第4日（含），及第6、 9與14日，對頸之右側位置進行注射位置觀察，包括注射位 置之反應大小估計。在第〇日，在施打測試物品前觀察注射 91384.doc -36· 1353850. 位置。接種單或雙劑量安慰劑之組未顯示注射位置反應體 積之任何顯著增加，因此此資料未示於圖7。在未微流體化 疫苗調配物之情形，單劑量與雙劑量接種間有注射位置反 應體積之成比例增加。另一方面，在微流體化疫苗調配物 之情形，雖然單劑量誘發較大之注射位置反應體積，以第 二劑量注射未造成任何進一步之增加。此外，在以微流體 化疫苗調配物注射之動物之情形，在比較以未微流體化疫 苗調配物注射之動物時，注射位置反應體積以較快之速率 消退。這些結杲示於圖7。 實例11 以内部地併入BVD病毒與細螺旋體抗原及免疫刺激分子 (如Quil A與DDA)製備微流體化AMPHIGEN®調配物為主 疫苗製品 將經福馬林鈍化hardjo-bovis螺旋體菌株CSL以約1.4xl09 個組織/5毫升劑量之直接計數調配於適當佐藥中。將經福 馬林鈍化波摩那鉤端螺旋體菌株T262調配為約2400比濁單 位/5毫升劑量。比濁單位係基於處理前發酵流體之比濁測 量計算。BVD病毒第1型係調配為約3000相對單位/5毫升劑 量之E2 Elisa滴定濃度。BVD病毒第2型係調配為約3500相 對單位/5毫升劑量之E2 Elisa滴定濃度。相對單位係基於組 合前鈍化後整體流體之E2 ELISA滴定濃度計算。Quil-A及 膽固醇均以每劑0.5毫克之濃度使用。乙汞硫代柳酸鈉及 AMPHIGEN®調配物係各以0.009%及2.5%之最終濃度使 用。氫氧化鋁（Rehydragel LV)係以2.0%之最終濃度使用。 91384.doc •37· 1353850 在使用DDA作為免疫調節劑時，DDA包括於AMPHIGEN® 調配物内。AMPHIGEN®調配物（即，40% Drakeol-卵磷脂 原料溶液）含1.6毫克/毫升之DD A，而且在適當地稀釋時， 最終疫苗製品含2.5%之AMPHIGEN®調配物與0.1毫克/毫 升之DDA。 在不同疫苗調配物之製備中，將BVD部份、Leptos、 Quil-A、膽固醇、乙汞硫代柳酸鈉、AMPHIGEN®調配物、 及作為掺和劑之鹽水加入Silverson均化器且以10,000±500 RPM混合15分鐘。然後使成分於10,000 psi經200微米篩網 微流體化。 在疫苗調配物含氫氧化鋁時，微流體化係無氫氧化鋁而 進行。在微流體化結束時，加入氫氧化鋁且在4°C以攪拌棒 混合過夜。 實例12 攻擊研究之BVD病毒疫苗之製備 用於此實驗之疫苗含得自BVD病毒第1型與BVD病毒第2 型之抗原。使用對gp53為2535 RU/劑量之鈍化後ELIS A滴定 濃度之BVD1-5960抗原。使用對gp53為3290 RU/劑量之鈍 化後ELISA滴定濃度之BVD2-890抗原。Quil-A及膽固醇係 以0.5毫克/毫升之濃度使用。乙汞硫代柳酸鈉及AMPHIGEN® 調配物係各以0.009%及2.5%之最終濃度使用。在使用DDA 作為免疫調節劑時，DDA包括於AMPHIGEN®調配物内。 AMPHIGEN®原料溶液（40% Drakeol-卵構月旨溶液）含不同量 之DDA，而且在適當地稀釋時，最終疫苗製品含2.5%之 91384.doc -38- 1353-850 AMPHIGEN®調配物與範圍為0.5毫克/毫升至2.0毫克/毫升 之DDA。鋁膠（Rehydragel-LV)係以2%之最終濃度使用。 GPI-0100係以2、3與5毫克/劑量之範圍使用。 將所有成分加入Silverson均化器且以10,500 rpm摻合15 分鐘。然後以10,000 psi通過200微米槽而微流體化。在疫 苗調配物含氳氧化鋁時，微流體化係無氫氧化鋁而進行。 在微流體化結束時，加入氳氧化鋁且在4°C以攪拌棒混合過 夜。 實例13 以具細螺旋艘抗原之微流想化Amphigen疫苗調配物接種 後對抗細螺旋體攻擊之保護 表1 -治療組 治療組 佐藥纟且合物 T01 鹽水 T02 Quil-A、膽固醇、及 AMPHIGEN®調配物（QAC) T03 Quil-A、膽固醇、AMPHIGEN® 調配物、及 AlOH (QAC-AIOH) T04 DDA、膽固醇、及AMPHIGEN®調配物（DDA) T05 DDA、膽固醇、AMPHIGEN®調配物、及AlOH (DDA-AIOH) (DDA) 表1顯示在此研究中測試之疫苗製品中佐藥調配物之組 合物。疫苗製品係如實例11所述而製備。各組有6隻動物。 約七個月大之雜交小肉牛用於此研究。接種係以5毫升疫苗 體積經皮下途徑在第〇曰及第21曰完成。攻擊係以得自 NADC(國際農業疾病中心）之L. hardjo-bovis菌株203完 成。攻擊係在第57-59日時以1-毫升接種體完成。攻擊係在 眼睛及陰部共同地施打。攻擊材料含5.0x106個細螺旋體/ 91384.doc -39- 1353850. 毫升。母週收集尿以FA及PCR培養細螺旋體。在第112及113 日時進行腎收集。 ____表2-細螺旋體攻擊研究之結果 療 厶α '·/ 在腎細 養及對 培液曾 經尿中 為小體之、 分 旋性百 螺陽牛 比 尿中螺 在腎細 FA及對 經液曾 陽牛 為小b 體之h 旋性百 PC及對 比 體之分 經液曾旋性百

尿中螺陽牛 腎細為小 R 之在腎細為小 有中及對體之Μ 所驗液曾旋性Ρ 在檢尿中螺陽牛 水 鹽

C A Q

Η ο 11 A / c A Q

DDA DDA/A10H 33.3 16.7 50.0 表2顯示得自細螺旋體攻擊研究之資料。在測定受攻擊動 物之細螺旋體感染百分比時，使用以下之標準。如果一個 樣品之腎培養為陽性，則此動物視為對細螺旋體為陽性。 如果動物對FA或PCR僅一個樣品為陽性，則此動物視為陰 性。如果對FA與PCR僅一個樣品均為陽性，則此動物視為 陽性。 表2之結果顯示，基於所有三種檢驗，在所有疫苗組均有 顯著較短之尿液脫落期間。只要關於尿液與腎移生，無 AlOH之含QAC及DDA調配物之效率相似。在此攻擊研究 中，A10H未改良且甚至降低含QAC及DDA疫苗之效率。 91384.doc 40- I353S50 表3-攻擊前之最大幾何平均滴定濃度日（第35日）之顯微凝 集滴定濃度範圍 治療 L. Hardjo 波摩那鉤端螺旋體 鹽水 <20 <20 QAC 160-640 1280-10240 QAC/AIOH 160-2560 8-10240 DDA 40-1280 320-2560 DDA/AIOH 320 - 640 1280-5120 在接種動物中偵測對抗疫苗調配物中兩種細螺旋體抗原 之血清學回應，而且在第35曰記錄最大回應。血清學回應 與對抗攻擊之保護之間無關連。疫苗調配物中之鋁膠存在 降低保護程度，雖然血清學回應因疫苗中之鋁膠存在而增 強。 實例14 以含AMPHIGEN®調配物與DDA之微流體化疫苗製品免疫 後，誘出對BVD病毒抗原之免疫回應及對抗BVD第2型病毒 攻擊之保護 四至七個月大之血清陰性小牛用於此實驗。有六個不同 組且各組有十隻動物（表4)。在第0日及第21日，各動物在大 約肩胛骨與後頭中間之頸外側接受疫苗或安慰劑之一份2 毫升皮下劑量。 表4-治療組 治療組 佐藥組合物 T01 鹽水 T02 Quil-A、AMPHIGEN®調配物、及膽固醇 T03 AMPHIGEN®調配物、膽固醇、DDA(0.5毫克/劑量） 及 A10H T04 AMPHIGEN®調配物、膽固醇、及DDA(0.5毫克/劑 量） 91384.doc -41 - 1353.850. Τ05 AMPHIGEN®調配物、膽固醇、及DDA(l.〇毫克/劑 量） Τ06 ^MPHIGEN®調配物、膽固醇、及DDA(2.0毫克/劑 量） 在研究之第44曰’將5毫升劑量之攻擊病毒製品（每個鼻 孔約2.5毫升）鼻下施打。非細胞發病bvd病毒第2型，隔離 #24515(艾利斯菌株），批號#46325-70用於此研究作為攻擊 菌株。在開始攻擊時及結束時立即將攻擊材料之保留樣品 滴定（每種滴定重複兩次）。每5毫升劑量之平均存活病毒滴 定濃度為攻擊前5.3 log1() FAID5〇/5毫升及攻擊後5 4 1〇gi〇 FAID5〇/5 毫升（FAID 等於 tcid50) 自第3曰至第58曰每曰監測動物。在第42曰至第58曰，基 於歸因於B VD 2感染之臨床跡象，對各動物給予〇、1、2、 或3之臨床疾病分數。在第〇、21、35、料、與”曰自各動 物收集血液樣品（兩個13毫升血清分離管，SST)以測定 第1型與BVD第2型病毒中和抗體之血清滴定濃度。 在第42日至第58日（含）自各動物收集血液樣品且測定益 塗層細胞中则病毒之存在。在第44日，在攻擊前取得樣 品° 為了測定白血細胞數量，在第42日至第58日（含）自各動 物收集血液樣品（一個4毫升EDTAf)。在第44日，在攻擊前 取得樣品。 白細胞減少定義為WBC計數中對基線（自攻擊前2曰至攻 擊曰之攻擊前WBC計數之平均值）為桃或更大之減少。 使用臨床疾病分數如下界定疾病狀態：如果分數則 91384.doc 1353850. 疾病=否；如果分數>2，則疾病=是。 如表5與6所示，此組以含BVD病毒抗原與AMPHIGEN® 調配物、QuilA或DDA且微流體化之疫苗接種，對BVD第1 型及BVD第2型病毒均以顯著之血清病毒中和滴定濃度血 清轉化。在這些組中，攻擊後顯示病毒血症之動物百分比 亦顯著減少，而對照組為100%之動物為病毒血症（表7)。此 外，在接種組中，疾病頻率亦顯著地降低（表8)。類似地， 在接種組中，顯示白細胞減少之動物百分比亦減少，而且 白細胞減少之降低在含DDA組中比含Quil A組中更為顯著 (表9)。在對照組中，相較於接種組時，體重增加有顯著之 下降（表10)。 血清學 在第〇日接種前，此研究之所有動物對BVD第1與2型之抗 體為血清陰性（SVN<1:2)(資料未示）。第二次接種後14日（第 35曰），所有施打安慰劑之動物（T01)對BVD病毒第1與2型之 抗體仍為血清陰性；而且所有以ITAs(調查性測試抗原）接 種之動物（T02、T03、T04、T05、與T06)對BVD病毒第1與2 型之抗體均為血清陽性（SVN 2 1:8)。一隻施打以 AMPHIGEN®調配物及2毫克/劑量之DDA為佐藥之疫苗之 動物在第35天對BVD病毒第1與2型之抗體具有3之SVN滴 定濃度（表11與12)。 在第44曰攻擊前，所有對照（TO 1)，除了一隻，對BVD病 毒第1與2型之抗體均為血清陰性（SVN<1:2)(現在顯示資 料）。一隻對照（#2497)對BVD病毒第1型之抗體為血清陽性 91384.doc -43- 1353850 (SVN=1 0)且對BVD病毒第2型之抗體為血清陰性^攻擊後14 曰，此研究之所有動物對BVD病毒第1與2型之抗體均為血 清陽性。 表5. BVD病毒第1型幾何平均血清病毒中和滴定濃度 治療 研究日之BVDv第1型幾何平均SVN滴 定濃度 0 21 35 44 58 T01 鹽水 <2 <2 <2 <2 23.9 T02 Amphigen， Quil A <2 39.1 19824.5 14018.2 27554.5 T03 Amphigen， 0.5 毫克 DDA，A1 <2 51.8 32204.8 22381.1 23170.4 T04 Amphigen， 0.5毫克DDA <2 27.0 14512.4 8932.0 21996.2 T05 Amphigen， 1.0毫克DDA <2 26.7 11585.2 8194.6 20882.0 T06 Amphigen > 2.0毫克DDA <2 23.5 8778.7 6769.3 16961.1 表6. BVD病毒第2型幾何平均血清病毒中和滴定濃度 治療 研究日之BVDv第2型幾何平均SVN滴定 濃度 0 21 35 44 58 T01 鹽水 <2 <2 <2 <2 522.0 T02 Amphigen， Quil A <2 8.9 2272.4 2048.2 24833.6 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 <2 9.5 3565.7 2702.2 20881.8 T04 Amphigen， 0.5毫克DDA <2 4.1 1260.7 989.1 18496.2 T05 Amphigen > 1.0毫克DDA <2 6.4 1398.8 1453.9 30047.8 T06 Amphigen， 2.0毫克DDA <2 7.7 1673.2 1428.9 16384.0 91384.doc -44- 1353850. 治療 仁—ϋ V JJ涡每隔離 隔離 ---- A 1 研究日 病毒症動 物之頻率 (%) 患病毒灰症 之L S平均曰 數 丄(J1 鹽水 47至58日 10/10 (100.0) 10.4~~~~~ T02 Amphigen， Quil A W至53曰 1/10 (10.0) 074 ~~~~ 103 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 0/10 (0.0) 0.0 Γϋ4 Amphigen， 0.5毫克DDA 48、50至 $2、57 曰 3/10 (30.0) 0.5 — ΓΟί) Amphigen， 1.0毫克DDA 49至51曰 2/10 (20.0) 0.4 Τϋ6 Amphigen， 2.0毫克DDA 48至52日 2/10 (20.0) 0.5 表8.攻擊後之BVD疾病之臨床跡象 治療 患病之 頻率 (%) 觀察到BVD疾病之臨床跡象 之頻率（％) 總觀_ 察數 0 1 2 3 T01 鹽水 9/10 (90.0) 75 (46) 63 (37.5) 29 Π7.3) 1 (0.6) 168 T02 Amphigen， Quil A 1/10 (10.0) 105 (61.8) 63 (37.1) 2 (1.2) 0 (0) 170 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 2/10 (20.0) 99 (58.2) 67 (39.4) 4 (2.4) 0 (0) 170 T04 Amphigen， 0.5毫克 DDA 0/10 (0.0) 118 (69.4) 52 (30.6) 〇 (〇) 0 (0) 170 T05 Amphigen， 1.0毫克 DDA 0/10 (0.0) 101 (59.4) 69 (40.6) 〇 (〇) 〇(〇) 170 T06 Amphigen， 2.0毫克 DDA 0/10 (0.0) 104 (61.2) 66 (38.8) 〇 (〇) 0 (0) 170 91384.doc 45· 1353850. 表9.攻擊後之白細胞減少 治療 白細胞減少 白血病動物之頻率 (%) 患白血病之LS平均 曰數 Τ01 鹽水 10/10 (100.0) 7.8 T02 Amphigen， 〇uil A 6/10 (60.0) 1.2 T03 Amphigen， 0.5毫克 DDA，A1 2/10 (20.0) 0.2 T04 Amphigen， 0.5毫克DDA 4/10 (40.0) 0.8 T05 Amphigen， 1.0毫克DDA 3/10 (30.0) 0.9 T06 Amphigen， 2.0毫克DDA 2/10 (30.0) 0.5 表10.研究時之體重及體重增加 治療 研究日之平均體重（磅） 體重增 -1 43 50 58 加（碎） T01 鹽水 378.0 484.9 491.0 476.9 98.9 T02 Amphigen， Quil A 428.0 526.5 546.7 579.0 151.0 T03 Amphigen， 0.5 毫克 DDA， AlOH 410.5 514.4 534.2 579.0 168.5 T04 Amphigen， 0.5毫克DDA 373.7 472.3 492.6 538.1 164.4 i〇t> Amphigen， 1.0毫克DDA 358.9 451.4 478.9 507.1 148.2 lUb Amphigen， 2.0毫克DDA 408. 513.3 533.9 560.3 151.6 病毒隔離 如表13所不之資料’在攻擊期間（第44至5 8曰），對照（T〇 i) 之所有十隻動物為病毒血症（在一或更多曰隔離BVD病 f )。在施打ITAs之組中，各十隻之組（各為τ〇2、τ〇3、τ〇4、 91384.doc -46- 1353850. T05與T06)中病毒血症動物之頻率為一、零 '三、二及二隻。 對照與她打ITAs之組間之差異為統計上顯著（ρ $ 〇 〇5)。相 較於施打ITAs之組（〇.〇至〇·5曰），病毒血症曰數之最小平方 法平均數量亦顯著地大於（1 〇·4日）對照。 臨床疾病 具2或3之臨床跡象分數之動物視為展現bvd疾病之跡 象。如表14所示，具BVD病毒疾病臨床跡象之動物頻率在 對照（τοι)為十隻之九隻，及在施打ITAs之各組（各為τ〇2、 Τ03、Τ04、Τ05與Τ06)為十隻之一、二、零、零與零隻。對 照與施打ITAs之組間之差異為統計上顯著（ρ ^ 〇 〇5)。 白細胞減少 如表15所示’在攻擊期間（第44至58曰），對照（τ〇1)之所 有十隻動物為白血病（白血細胞數量對攻擊基線第42·44曰 減少40%)。患白血病之動物頻率在施打iTAs之各組（各為 T02、T03、T04、T05與T06)為十隻之為六、二、四、三與 二隻。對照與施打以0.5毫克/劑量之AMPHIGEN®調配物及 氫氧化鋁為佐藥之疫苗之組（T03)間之差異為統計上顯著（p S 0.05)。相較於施打ITAs之組（0.2至1.2日），白血病之最小 平方平均日數顯著地大於（7.8日）對照。 實例15 以含GPI-0100之微流體化疫苗調配物免疫後，誘出對bvd 病毒抗原之免疫回應及對抗BVD第2型病毒攻擊之保護 依照如實例14所述之一組實驗條件且進行Quii A與 GPI-0100間之直接比較。如表η與12所示以含Quii a或 91384.doc •47_ 1353850. GPI-0100之微流體化AMPHIGEN®調配物為主製品中之 BVD抗原接種之動物對BVD第1型與BVD第2型病毒均具有 顯著之抗體滴定濃度。BVD第1型病毒之抗體滴定濃度遠高 於BVD第2型病毒。然而，BVD第2型病毒之後續攻擊顯示 強烈保護，而且在以含GPI-0100之微流體化AMPHIGEN® 調配物為主疫苗製品接種之小牛之疾病發病率顯著地減 /Jn 。 表11. BVD病毒第1型幾何平均血清病毒中和滴定濃度 治療 幾何平均SVN滴定濃度 0 21 35 44 57 T01 鹽水 <2 <2 <2 <2 35.5 T02 Amphigen， Quil A <2 98.7 20171.0 12203.4 44762.4 T03 Amphigen， 2毫克 GPI-0100， AlOH <2 84.6 10998.5 7383.2 25709.2 T04 Amphigen， 2毫克 GPI-0100 <2 106.0 18179.2 8933.2 28526.2 T05 Amphigen， 3毫克 GPI-0100 <2 62.9 15024.3 8780.1 19824.4 T06 Amphigen， 5毫克 GPI-0100 <2 71.1 12203.3 7512.0 16670.2 91384.doc 48· 1353850. 病毒第^_型幾何平均血清病毒中和滴疮 治療 研究日之BVDv第1型幾 滴定濃度 0 21 35 44 58 T01 鹽水 <2 <2 <2 <2 14.7 T02 Amphigen > Quil A__ <2 12.9 2312.0 1692.5 1663.4 TU3 Amphigen » 2 毫克 GPI-0100， αιοη <2 13.2 1663.5 1116.8 1562.3 T04 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100 <2 20.5 2610.2 1978.2 2478.7 TO 5 Amphigen， 3毫克GPI-0100 <2 11.4 1752.8 1305.2 2435.4 T06 Amphigen， 5 毫克 GPI-0100 <2 12.0 3158.4 2120.2 1845.6 表13.攻擊後之BVD病毒隔離 治療 BVD病毒隔離 病毒血症動物之 頻率（％) 患病毒血症之 LS平均曰數 T01 鹽水 10/10 (100.0) 8.4 T02 Amphigen， Quil A 3/10 (30.0) 0.3 T03 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100， αιοη 0/10 (0.0) 0.0 T04 Amphigen » 2 毫克 GPI-0100 1/10 (10.0) 0.1 T05 Amphigen， 3 毫克 GPI-0100 3/10 (30.0) 0.3 T06 Amphigen， 5 毫克 GPI-0100 2/10 (20.0) 0.2 91384.doc 49- 1353850. 表14.攻擊後之BVD疾病之臨床跡象 治療 患病之 頻率 (%) 觀察到BVD疾病之臨 床跡象之頻率（％) 總觀 察數 0 1 2 T01 鹽水 5/10 (50.0) 103 (60.6) 55 (32.4) 12 (7.1) 170 T02 Amphigen，Quil A 5/10 (50.0) 115 (67.6) 48 (28.2) 1 (4.1) 170 T03 Amphigen，2毫克 GPI-0100，AlOH 0/10 (0.0) 128 (75.3) 42 (24.7) 0 (0) 170 T04 Amphigen， 2 毫克 GPI-0100 0/10 (0.0) 124 (72.9) 46 (27.1) 〇 (〇) 170 T05 Amphigen， 3 毫克 GPI-0100 0/10 (0.0) 104 (61.2) 66 (38.8) 0 (0) 170 T06 Amphigen， 5 毫克 GPI-0100 0/10 (0.0) 128 (75.3) 42 (24.7) 0 (0) 170 表15.攻擊後之白細胞減少 治療 白細胞減少 白細胞減少動物之 頻率（％) 白細胞減少之LS平 均曰數 T01 鹽水 9/10 (90.0) 8.7 T02 Quil A 6/10 (60.0) 1.6 T03 2毫克 GPI-0100， AlOH 7/10 (70.0) 2.6 T04 2毫克 GPI-0100 4/10 (40.0) 1.5 T05 3毫克 GPI-0100 7/10 (70.0) 2.6 T06 5毫克 GPI-0100 8/10 (80.0) 2.9 總之’接種動物無負面反應或死亡率證明各疫苗之安全 性。在100%之接種動物中之血清轉化（對BVD-1與BVD-2之 SVN抗體滴定濃度>1:8)證明各疫苗之效用。僅以2毫克 GPI-0100為佐藥之疫苗證明令人滿意之攻擊抗性。 91384.doc •50- 1353850. 實例16 含微封包抗原於微流體化水包油乳液中之疫苗製品 將3克之繭糖（Fluka)加入水中而得333毫克/毫升之繭糖 溶液之原料。將溶於0.8% SDS溶液之重組PauA抗原 (SDS/rPauA)加入繭糖溶液而得494微克rPauA/毫升之最終 濃度。在次一步驟中，將10克之聚丙交酯羥乙酸（卩1^-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim)溶於200毫升之二 氣甲烷（MeCl2)。將所得PLG/MeCl2溶液組合在第一步驟中 製備之SDS-rPauA/繭糖溶液。使此組合溶液接受微流體化 (使用得自Microfluidics Model Ml 10EH之微流體化機）且將 微流體化製品喷灑乾燥（使用Temco Spray Dryer Model SD-05)。使用500微米濾網收集喷灑乾燥材料。 使用Western印跡分析將此喷灑乾燥材料中之rPauA濃度 定量。將1.04毫克之喷灑乾燥材料溶於50微升之丙酮且在 室溫以1 3,200 rpm離心10分鐘。將上清液去除。使上清之小 球部份在生物安全性通風櫥中乾燥2.5小時。將小球再懸浮 於47.43微升之樣品溶液（25微升之樣品緩衝液+ 10微升之還 原劑+ 65微升之水）。將乾燥之上清部份以20微升之樣品溶 液再懸浮。在Western分析中，使用純化PauA作為標準品將 噴灑乾燥材料之rPauA含量定量。 藉由將100克之甘露糖醇（Sigma)溶於500毫升之注射用 水（WFI)中而製備20%甘露糖醇溶液。以加熱板/攪拌器將溶 液加熱至40°C且冷卻至30°C。使溶液經0.22微米滅菌濾器 (Millipore)滅菌過濾。藉由將12.5克之缓曱基纖維素（Sigma) 91384.doc -51 - 1353850. 溶於500毫升之冒^中，及在4〇c混合過夜，而製備25%羧 甲基纖維素溶液。使溶液在12pc熱壓。 由喷灑乾燥得到之粉末在含5%之甘露糖醇、〇 3%之羧甲 基纖維素與1:5〇〇〇之乙汞硫代柳酸鈉之溶液中重組。將最 終溶液等分至3毫升小瓶中且使用凍乾機（usifr〇id)凍 乾。凍乾粉末代表微封包rPauA^將微封包次單位蛋白質抗 原再懸浮於2毫升之含AMPHIGEN®調配物之微流體化水包 油乳液（如實例20所述之微流體化乳液）且作為疫苗。 實例17 含細菌全細胞抗原與重組蛋白質抗原於水包油乳液中之微 流體化疫苗調配物之製備 製造兩種疫苗製品’其含重組乳鏈球菌pauA蛋白質與大 腸桿菌細菌細胞，如實例2與3所述内部地加入水包油乳 液。將重組PauA抗原設為每劑量100微克之濃度，而且大腸 桿菌細胞為每劑量4χ1〇9個之最終數量。兩種疫苗之乳液佐 藥組合物示於表1 6。 D 6含重組蛋白質與全大腸桿菌細胞之疫苗調配物 治療 抗原 /、^、〜汾 ίτ 幽/jo 〜又 tty 口/勺 ψ/J 佐藥 T01 女慰劑 鹽水 T02 PauA/大腸桿菌 SEAM-14 T03 PauA/大腸桿菌 2.5% Amphigen，0.5 毫克 GPI-0100， 0.5毫克膽固醇 T04 PauA/大腸桿菌 2·5% Amphigen，0.5毫克溴化二甲基 二·十八碳基銨（DDA)，0.5毫克膽固 醇 實例18 對含rPauA與全細胞細菌劑於水包油乳液中之微流體化疫 91384.doc -52- 1353850. 苗之免疫回應 成年乳牛用於此實驗。登記之動物係在其第一或第二授 奶期結束時。將2毫升之各疫苗調配物皮下地施打三次，在 無奶時（D=0)，28日後（D=28)，及生產後4至10日（C+4-C+10) 再一次。第一及第三劑量係在頸之左側施打，及第二劑量 係在頸之右側施打。在各接種前及第三接種後約14日與32 曰收集血液。大腸桿菌及rPau A抗原之抗體滴定濃度係經由 ELIS A測定。如圖8戶斤示，結果顯示rPauA之抗體滴定濃度 高於以含GPI-0100作為免疫刺激劑之疫苗調配物接種之 組，而且在起初接種後第70日最高。大腸桿菌之抗體滴定 濃度示於圖9。大腸桿菌之抗體滴定濃度在兩種疫苗調配物 中相似，雖然相較於具DDA作為免疫刺激劑之調配物，作 為免疫刺激劑之GPI-0100之存在誘發相當高之抗體滴定濃 度。 實例19 微流體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗製品之殺病毒活性 之分析 為了測定微流體化是否將病毒鈍化，測定三種微流體化 AMPHIGEN®調配物為主疫苗製品之殺病毒活性。此三種製 品含二種不同之牛感染病毒，即’牛疮療病毒（BHV)、副流 行性感冒病毒3 (PI3)及牛呼吸道融合病毒（BRSV)。 三種疫苗製品中之殺病毒活性之偵測係依照USDA 9CFR. 113.35要求進行。 表17所示之結果顯示，AMPHIGEN®調配物為主疫苗製 91384.doc -53-

I35385Q 品之微流體化不造成疫苗製品之任何顯著鈍化。 表17微流體化疫苗之殺病毒活性之分析 序號 BRSV BHV PI3 A 0 0.2 0 AM200 -0.2 0 -0.2 AM75 0 -0.3 -0.3 AM75@37C 0.1 -0.3 -0.2 B 0 -0.1 -0.2 BM200 0 0 -0.2 BM75 -0.2 -0.5 0 BM75@37C 0.5 -0.5 0 C 0.1 -0.1 -0.2 CM200 -0.2 -0.1 -0.2 CM75 0.1 0.5 -0.2 CM75@37C 0.5 0.5 -0.2 A=膽固醇以650毫升/分鐘加入 B =膽固醇以28毫升/分鐘加入 C=膽固醇以5毫升/分鐘加入 M200=以200微米篩網微流體化 M75 =以75微米篩網微流體化 M75@37C =流體在微流體化前加熱至37°C 高於0.7之值為殺病毒效應之指標。 實例20 微流體化AMPHIGEN®調配物之製備 藉由組合DRAKEOL卵磷脂油溶液（具25%之卵磷脂之輕 礦物油）與TWEEN 80(最終濃度為0.1 8%)與Span 80(最終濃 度為0.08%)且在36±1°C混合8-22小時而製備AMPHIGEN® 調配物。然後藉Ross®(Hauppauge，NY 1178 8)乳化器之 助，在約3400 rpm將油混合物加入鹽水。繼而使混合物以 91384.doc •54-

I35385Q 4500±500 psi通過具200微米相互作用槽之微流體化機一 次。圖10A與10B顯示微流體化AMPHIGEN®調配物之安定 性。如雷射繞射所測量，開始時起初時間點之粒度分布（圖 10A)與4°C儲存22個月後之粒度分布（圖10B)幾乎完全相 同。 【圖式簡單說明】 圖1敘述非微流體化疫苗組合物之分批製備方法。在此方 法中’將各種疫苗成分加入左方之加成容器中且最後泵至 摻合容器中’其中成分係經簡單機械裝置混合在一起。 圖2敘述含内部地併入之病原之微流體化疫苗組合物之 製備方法。將各種疫苗成分加入加成容器中，而且轉移至 預先乳化摻合單位以經簡單機械裝置混合。繼而使乳液通 過微流體化機且在後微流體化槽中收集。 圖3敘述非微流體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗、微流 體化AMPHIGEN®調配物為主疫苗、及實驗台摻合物疫苗製 品之滴徑分布。 圖4顯示在微流體化疫苗製品中無相分離。 圖5敘述内部地併入微流體化AMPHIGEN®調配物為主 疫苗製品（A907505)、及三種對照、非微流體化AMPHIGEN® 調配物為主疫苗製品（A904369、A904370與A904371)中之 抗原安定性之比較。將所有四種疫苗製品在4°C儲存2年。 在儲存時之不同時間點（〇、6、12、或24小時），使用所有四 種調配物對三個月大之乳牛接種。接種在第0及21日以2毫 升疫苗劑量完成，而且在第二次接種後2週收集血清。在各 91384.doc -55· 1353850. 血清樣品中測定BVD第II型病毒之中和抗體滴定濃度。此資 料係以5隻動物之幾何平均值提出。 圖6顯示在牛施打微流體化及非微流體化疫苗前後之最 小平方法平均直腸溫度。T01:安慰組-單劑量；T02:安慰 組-雙劑量；T03:非微流體化調配物-單劑量；T04:非微 流體化調配物-雙劑量；T05 :微流體化調配物-單劑量； T06:微流體化調配物-雙劑量。 圖7敘述在牛施打非微流體化及微流體化疫苗調配物後 觀察到之最小平方法平均注射位置反應體積。T03 :非微流 體化調配物-單劑量；T04:非微流體化調配物-雙劑量； T05:微流體化調配物-單劑量；T06:微流體化調配物-雙 劑量。 圖8敘述在接種含重組PauA抗原與大腸桿菌全細胞抗原 之各種疫苗調配物後，得自乳鏈球菌（Streptococcus uberis) 之重組PauA抗原之幾何平均IgG滴定濃度。 圖9敘述在接種含重組PauA抗原與大腸桿菌全細胞抗原 之各種疫苗調配物後，得自乳鏈球菌（Streptococcus uberis) 之大腸桿菌全細胞抗原之幾何平均IgG滴定濃度。 圖10A及10B敘述微流體化Amphigen調配物在起初製造 (圖10A)及在製造後22個月（圖10B)之粒度分布。 91384.doc -56-

Claims (1)

1353850 十、申請專利範圍： 1. 一種作為疫苗佐藥 可代謝性油，其中 第093109274號專利申請案 中文申請專利範圍替換 1 . 1 ^ 之次微米水包油乳液，其包含輕烴不 該油為輕礦物油且其量為1 %至5〇〇a v/v ’界面活性劑，其中該界面活性劑包含卵磷脂且為 〇_〇l%il〇% v/v之量；及水性成分，其中該油係分散於 該水性成分中，且〇·!微米至〇·5微米間之平均油滴徑係使 用微流體化機達成。 2. 根據明求項1之作為疫苗佐藥之次微米水包油乳液，其中 不可代謝性油為約4〇。/❶ν/ν之礦物油，界面活性劑包含約 10/。w/v之卵磷脂、約〇 18% Wv 之 tween_8〇及約 〇 v/v之SPAN-80，其中該油係分散於該水性成分中且平均 油滴徑為0 · 1微米至〇 · 5微米間。 3. 一種製備次微米水包油乳液之方法，其包含： (a)藉由組合輕烴不可代謝性油、界面活性劑及水性成分 而製備混合物；其中該油為輕鑛物油且其量為1%至 50/。v/v且该界面活性劑包含卵磷脂且其量為〇 〇1%至 10% v/v ； (b) 使該混合物進行主要乳化製程而製造平均油滴徑為 1.0微米至1_1微米之水包油乳液；及 (c) 使在（b)中製備之水包油乳液進行微流體化而製造該 次微米水包油乳液，纟中次微米乳液具有〇1微米至 0.5微米間之油滴徑。 4· -種疫苗組合物，其包含根據請求項i之水包油乳液與抗 原’其中該抗原係分散於該乳液中。 91384-1000930.doc 1353850 5. 根據請求項4之疫苗組合物’其中該油為輕礦物油且以ι〇/。 至20% v/v之量存在於該疫苗組合物，該界面活性劑包含 印磷脂且以0.01%至10% v/v之量存在於該疫苗組合物， 及其申該平均滴徑為0.1微米至〇·5微米間。 6. 根據請求項4之疫苗組合物，其中該抗原為病毒抗原或細 ί抗原。

根據請求項6之疫苗組合物，其中該病毒抗原包含已被殺 死之牛病毒性下痛j病毒第1型或第2型，及其中該細菌抗 原包含至少一種鈍化細螺旋體（Leptospira)細菌、重組乳 鏈球菌（Streptococcus uberis) PauA蛋白質、或大腸桿菌製 品。 8· —種製備疫苗組合物之方法，其包含： (a) 藉由組合輕烴不可代謝性油、界面活性劑、及水性成 刀而製備混合物’其中該油為輕礦物油且以1 %至20% v/v之置存在於疫苗組合物’該界面活性劑包含彡卩磷脂 且以0·01 °/0至1 〇% v/v之量存在於該疫苗組合物； (b) 將抗原加入在（a)中形成之混合物； (c) 使在（b)中形成之含該抗原之混合物進行主要乳化製 程而製造具有1.0微米至丨」微米之平均油滴徑之水包 油乳液；及 (d) 使在（C)中形成之乳液接受微流體化而製造該疫苗組 合物’其中此組合物具有〇· 1微米至0 5微米間之油滴 徑。 9.根據請求項8之方法，其中該抗原為病毒抗原或細菌抗 91384-1000930.doc 1353850 原。 #據月求項9之方法，其中該病毒抗原包含已被殺死之牛 病毒性下痢病毒第】型或第2型，及其中該細菌抗原包含 至少一種鈍化細螺旋體（Lepi〇spira)細菌、重組乳鍵球菌 (Strept〇coccus ubeHs)―八蛋白質或大腸桿菌製品。 11. -種疫苗組合物，其包含微封包抗原及根據請求項工之水 包油乳液，其中該微封包抗原係分散於該乳液中。 12. 根據請求項11之疫苗組合物，其♦該油為輕礦物油且以 1.0%至20% v/v之量存在於該疫苗組合才勿，該界面活性劑 包含卵磷脂且以0.01%至10% v/v之量存在於該疫苗組^ 物’該抗原為病毒抗原且封包於粒狀載體中，及其中兮 載體包含聚丙交酯羥乙酸。 91384-1000930.doc