CN114569715A - 疫苗组合物、疫苗佐剂及其制备方法和制备系统 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种疫苗组合物、疫苗佐剂及其制备系统和制备方法，该制备方法包括制备水相液体；制备油相液体；将所述水相液体与所述油相液体混合均匀，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液，其中，所述制备方法还包括灭菌处理，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行任何的灭菌处理。

Description

疫苗组合物、疫苗佐剂及其制备方法和制备系统
技术领域
本申请涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种疫苗佐剂、疫苗佐剂的制备方法和制备系统以及包括该疫苗佐剂的疫苗组合物。
背景技术
疫苗佐剂是一种免疫增强剂，一般与抗原混合后注入机体，用于增强机体免疫系统对抗原的免疫应答效能。目前，业内已经提出了各种疫苗佐剂产品，但从业者大都是追求疫苗佐剂的新的配方方案及其对应的制备方案。
本申请的研发团队经过长期对疫苗佐剂研发活动的观察和分析后发现，虽然在某些情况中，通过改进疫苗佐剂的配方能够实现免疫应答效能的提升，但是仍然在很多情况中，即便是改进了疫苗佐剂的配方也依然不能获得良好的免疫应答效能，因此，疫苗佐剂的整体方案中还存在着其他并不为人所知且重要的普适性影响因素。
因此，如何发掘该普适性的影响因素，并提出一种具有普适性的疫苗佐剂的改进方案，成为本领域需要解决的技术问题。
发明内容
本申请的研发团队发现，在疫苗佐剂的制备过程中，必不可少的灭菌操作对疫苗佐剂中的水包油结构或油包水结构的液滴的电性有直接的影响。
具体来说，在传统的疫苗佐剂制备工艺中，当完成疫苗佐剂的制备后（其中已经形成有油包水结构或水包油结构的液滴），在对产品进行封装之前，需要进行后端的灭菌处理；之所以在后端进行灭菌处理，这是因为：为了尽可能确保最终产品具有足够的洁净度，因此灭菌处理与最终产品之间的工艺距离越近越好，这是本领域的惯常认识。
然而，由于本申请的研发团队发现：对疫苗佐剂成品进行灭菌处理后，疫苗佐剂产品容易出现分层，从而导致稳定性明显下降。经过艰苦的深入研究后，本申请的研发团队找到该问题的根源：这是因为传统的后端灭菌处理的操作方式，会对水包油结构或油包水结构的液滴的电性产生直接影响，进而导致液滴之间的聚集，从而使粒径相对较小的液滴彼此聚集为粒径相对较大的液滴，最终出现沉淀分层现象。
因此，如何在确保疫苗佐剂清洁度品质的前提下，避免上述问题的产生，成为本申请研发团队孜孜以求的研发目标，进而提出了本申请的解决方案。具体表述如下。
本申请提出了一种疫苗佐剂的制备方法，该制备方法包括：制备水相液体；制备油相液体；将所述水相液体与所述油相液体混合均匀，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液，其中，所述制备方法还包括灭菌处理，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行任何的灭菌处理。
优选的，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行有助于所述液滴之间产生静电吸附的任何操作。
优选的，在制备水相液体之前对制备水相液体的各组分进行灭菌处理；和/或在制备油相液体之前对制备油相液体的各组分进行灭菌处理；和/或在制备所述水相液体的过程中对该水相液体进行灭菌处理；和/或在制备所述油相液体的过程中对该油相液体进行灭菌处理。
优选的，在将所述水相液体与所述油相液体混合均匀，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液的整体过程中，在该整体过程的前部分时间内进行灭菌处理。
优选的，所述前部分时间占整体过程时间的1/3至1/2。
优选的，所述制备方法包括：将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内，以使具有所述水包油结构或油包水结构的液滴的所述乳液的Zeta电位高于-20mV。
优选的，所述离子调节剂包括一价阳离子调节剂和/或二价阳离子调节剂，其中：所述一价阳离子调节剂包括氯化钠或氯化钾水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钠或氯化钾的浓度为0.5至1.5mmol/L；所述二价阳离子调节剂包括氯化钙或氯化镁水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钙或氯化镁的浓度为0.5至1.5mmol/L。
优选的，该制备方法包括按照1:2至1:1的体积比将所述离子调节剂加入用于制备水相液体的缓冲液中。
优选的，所述液滴的直径不大于200nm。
优选的，制备水相液体包括：将表面活性剂加入缓冲液中，搅拌均匀，以获得pH值为6.0-8.0的水相液体；其中，所述缓冲液为枸橼酸盐缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、氨－氯化铵缓冲液、醋酸－醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液中的一种或几种，所述缓冲液的pH值为6.0-7.0；所述表面活性剂为吐温、吐温80、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、硬脂酸钠、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、十八烷基硫酸钠、磷脂、胆碱、蛋白质中的一种或几种。
优选的，制备油相液体包括：将角鲨烯加入到乳化剂中，分散均匀，以获得油相液体，其中，所述乳化剂为去水山梨糖醇三油酸酯（Span-85）、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、大豆磷脂、卵磷脂、普朗尼克、卡波姆、十二烷基硫酸钠中的一种或多种，所述角鲨烯为纯度不低于90%的注射用角鲨烯。
根据本申请的另一方面，提供了一种疫苗佐剂，其中，该疫苗佐剂由本申请所提供的上述制备方法制备。
优选的，该疫苗佐剂包括：去水山梨糖醇三油酸酯、角鲨烯、表面活性剂、枸橼酸钠和水，其中：山梨糖醇三油酸酯的浓度为0.1%至1%(w/v)； 角鲨烯的浓度为1-10%(v/v)；如吐温和/或吐温80的表面活性剂的浓度为0.3-0.7%(w/v)；枸橼酸钠的浓度为0-10mmol/L。
优选的，该疫苗佐剂包括：重量比为1.5-3.5%的鱼腥草多糖、0.2-0.55%的丙氨酸、0.8-2.2%的银杏叶黄、5-8%的聚乙烯蓖麻油、5-8%的Span80、2.5-5%的聚乙二醇、6-10%的角鲨烯、30-35%的注射用大豆油和25-50%的注射用水，各组分的重量百分含量之和为100%。
优选的，该疫苗佐剂包括：角鲨烯、柠檬酸盐或磷酸盐、离子调节剂， Tween-80、Span-85、TLR激动剂和水，其中：角鲨烯的浓度为1%-10%(v/v)；柠檬酸盐或磷酸盐的浓度为5-10mmol/L；包含氯化钠和/或氯化钾的离子强度调节剂的浓度为0.10Mol/L；Tween-80的浓度为0.3%-3%(v/v)；Span-85的浓度为0.5%(v/v)；TLR激动剂的浓度为0.001%至 0.01%(v/v)。
根据本申请的又一方面，提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括抗原和疫苗佐剂，该疫苗佐剂为本申请所提供的上述疫苗佐剂。
此外，本申请还提供了一种疫苗佐剂的制备系统，该制备系统通过实施上述疫苗佐剂的制备方法，用于制备疫苗佐剂。
在疫苗佐剂的制备时，将水相液体与油相液体搅拌混合的过程中，会逐渐形成油包水或水包油结构的液滴。根据本申请的技术方案，在形成水包油结构或油包水结构的液滴之后，不再进行任何的灭菌处理，从而避免后端灭菌处理对液滴电性的不利影响。该技术方案属于疫苗佐剂制备领域中具有普适性的影响因素。
本申请的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将结合实施方式来详细说明本申请的技术方案。
一、疫苗佐剂的制备方法
根据本申请的疫苗佐剂的制备方法包括：制备水相液体；制备油相液体；将所述水相液体与所述油相液体混合均匀，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液，其中，所述制备方法还包括灭菌处理，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行任何的灭菌处理。
上述技术方案属于疫苗佐剂制备领域中具有普适性的影响因素，因此对于水相液体和油相液体的制备均可采用传统已知的配方和工艺。本申请的技术方案的创新点在于，在将所述水相液体与所述油相液体混合均匀时而在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，至疫苗佐剂产品封装之前，不进行任何的灭菌处理，以防止灭菌处理对所形成的液滴的电性的不利影响。
所述灭菌处理可包括各种已知的灭菌处理方式，包括但不限于化学灭菌处理、射线灭菌处理、干热灭菌处理、湿热灭菌处理、温度灭菌处理、紫外线灭菌处理等。
优选情况下，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，至疫苗佐剂产品封装之前，不进行有助于所述液滴之间产生静电吸附的任何操作。例如，在制备水相液体和油相液体的过程中，按配方比例称取水相和油相的全部组分原料后，采用孔径（如0.22μm至0.45μm）分布均匀的微孔滤膜或滤棒作为过滤材料进行过滤（例如，0.45 um的滤膜或滤棒一般用于两次过滤的第一层滤膜，以防止0.22um滤膜堵塞）。
对于灭菌处理布置在疫苗佐剂工艺路线中的何种位置，将在下文中结合疫苗佐剂的制备过程进行解释说明。
1. 制备水相液体
制备水相液体的过程可以包括：将表面活性剂加入缓冲液中，搅拌均匀，以获得pH值为6.0-8.0的水相液体。可以按照预定的配方，量取制备水相液体的各个组分，优选情况下，可以对各个组分进行灭菌处理，再将各个组分搅拌混合。
所述水相液体的配方方案可以为各种传统已知的水相液体的配方方案。例如，所述缓冲液可以为枸橼酸盐缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、氨－氯化铵缓冲液、醋酸－醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液中的一种或几种，所述缓冲液的pH值优选为6.0-7.0，再优选为6.8左右，从而能够避免蛋白交联，增加表面抗原，提高免疫应答效果。
所述表面活性剂可以为适于疫苗佐剂制备的各种类型的表面活性剂，如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂等。例如可以为吐温、吐温80、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、硬脂酸钠、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、十八烷基硫酸钠、磷脂、胆碱、蛋白质中的一种或几种。
优选情况下，在完成水相液体的制备后且将其与油相液体混合之前，对该水相液体进行消毒处理，不会对后续产生的油包水或水包油结构的液滴造成不利影响。或者，也可以在制备所述水相液体的过程中对该水相液体进行灭菌处理。
2.制备油相液体
制备油相液体的过程包括：将角鲨烯加入到乳化剂中，分散均匀，以获得油相液体。可以按照预定的配方，量取制备油相液体的各个组分，优选情况下，可以对各个组分进行灭菌处理，再将各个组分搅拌混合。
所述油相液体的配方方案可以为各种传统已知的油相液体的配方方案。例如，所述角鲨烯可以为注射用角鲨烯，纯度大于90%，优选为92-98%，再优选为96%。所述乳化剂可以为各种适用制备疫苗佐剂的乳化剂，可以为阴离子型乳化剂、阳离子型乳化剂、非离子型乳化剂等，例如可以为去水山梨糖醇三油酸酯（Span-85）、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、大豆磷脂、卵磷脂、普朗尼克、卡波姆、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
与传统疫苗佐剂中多为铝佐剂、费氏佐剂和脂质体佐剂等其他佐剂不同，根据本申请的技术方案，所制得的水包油或油包水的角鲨烯乳剂佐剂中，充分乳化后形成的水包油或油包水乳液中包含粒径小于200nm的液滴，具有良好的安全性，可刺激巨噬细胞、粒细胞、单核细胞等分泌细胞因子，促进单核细胞分化成DC（树突状细胞dendritic cell, DC），并通过促吞噬作用促进抗原呈递细胞（APC）对抗原的摄取，还可刺激免疫部位的肌细胞，改变其基因表达谱，活化免疫相关基因，其增强免疫应答效果和安全性优于其他佐剂。
优选情况下，在完成油相液体的制备后且将其与水相液体混合之前，对该油相液体进行消毒处理，不会对后续产生的油包水或水包油结构的液滴造成不利影响。或者，也可以在制备所述油相液体的过程中对该油相液体进行灭菌处理。
3. 混合（剪切）、封装
在完成了水相液体和油相液体的制备之后，将其中的一者缓慢加入到另一者中（如将油相液体缓慢加入水相液体中），在保持于预定温度范围内（如50-70℃）的情况下，同时进行搅拌处理（搅拌速度例如可以为10000-20000r/min），以使二者充分均匀混合。
作为一种可选择的实施方式，可经过高压乳匀机的剪切处理，再经分散后，分别封装即可。高压乳均机可以采用市面上已知厂家所提供的类型或型号（如德国APV-2000型高压乳匀机），高压乳均机的工作参数可以根据工况而加以选择。作为其他可选择的实施方式，可采用合适的剪切装置来实现，该剪切装置例如可以为高速均质机、胶体磨或多功能高压配液罐等。
在将水相液体和油相液体混合的过程中，逐渐形成油包水结构或水包油结构的液滴，直至形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液，最终灌装于包装容器并封闭起来。在本申请的技术方案中，所述液滴的直径不大于200nm，优选不大于150nm，再优选不大于100nm。由于液滴粒径相对较小且粒径分布较为均匀，因此能够提高包封于其中的角鲨烯的分散度，可促进药物或抗原的吸收。
优选情况下，在将所述水相液体与所述油相液体混合，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液的整体过程中，在该整体过程的前部分时间内进行灭菌处理，以避免消毒处理对所产生的油包水或水包油结构的液滴造成不利影响。所述整体过程的起点可以定义为将水相液体和油相液体最开始接触混合时，终点可以定义为具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液完成制备（随时准备可以灌装于包装容器）时。优选情况下，所述前部分时间占整体过程时间的1/3至1/2。
在本申请的优选技术方案中，疫苗佐剂的制备方法还包括：将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内，以使具有所述水包油结构或油包水结构的液滴的所述乳液的Zeta电位高于-20mV。一般来说，Zeta电位绝对值越高,其粒子间的静电斥力也就越大,物理稳定性也就越好，不易产生液滴的聚集，但不易大于50mV，以免有明显的细胞毒性，甚至是组织毒性。所述离子调节剂可包括一价阳离子调节剂和/或二价阳离子调节剂，其中：所述一价阳离子调节剂包括氯化钠或氯化钾水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钠或氯化钾的浓度为0.5至1.5mmol/L；所述二价阳离子调节剂包括氯化钙或氯化镁水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钙或氯化镁的浓度为0.5至1.5mmol/L。
这是因为：佐剂中各物质的存在形态与溶液中的离子强度相关，为保证佐剂中各物质的存在形态均一稳定，需要保持溶液在合适的离子强度范围；通过固定疫苗佐剂体系中的离子强度，能保持体系中物质的电位稳定（尤其是所述液滴电位的稳定性），防止溶液由于离子活度差异而导致液滴的集聚，进而引起佐剂体系的不稳定。此外，在佐剂中各物质形成的均一体系作用于免疫应答的过程中，通过加入离子调节剂既可以减少离子的影响，还可以降低部分抗原的肽链发生扭曲，减少抗原在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来的问题，利用离子强度剂将抗原重新暴露出来或修正过来，起到了封闭了抗原，增强抗原体系的作用。
而且，通过将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内，以使具有所述水包油结构或油包水结构的液滴的所述乳液的Zeta电位高于-14mV，例如可以为-20mV至-50mV之间，优选为-30mV至-40mV之间，从而至少在一定程度上防止其液滴之间相互聚集，从而影响疫苗佐剂的品质。如上所述，离子调节剂可以加入水相液体中，也可以加入油相液体中，但最优选为直接加入水相液体和油相液体所混合而成的乳液中。作为一种可选择的实施方式，所述疫苗佐剂的制备方法包括按照1:2至1:1的体积比将所述离子调节剂加入用于制备水相液体的缓冲液中。
对于增加有离子调节剂的技术方案，可通过如下方式对乳液（尤其是乳液中的液滴）的电位进行检测：利用如Zeta电位仪 、BMI500型在线多参数离子浓度电位检测计进行检测。
二、疫苗佐剂
根据本申请的另一方面，还提供了一种疫苗佐剂，该疫苗佐剂由本申请所提供的上述制备方法制备获得。
根据本申请的技术方案所获得的注射用免疫佐剂可提高角鲨烯的分散度和溶解度，促进角鲨烯在人体内的吸收，提高其在体内的生物利用度。而且，还可以提高角鲨烯在免疫佐剂的稳定性。由于油包水或水包油结构的液滴粒径较小，因此疫苗佐剂为整体呈透明或半透明的液体（折光率可以为1.050-1.280），热力学较为稳定，易于制备和保存。此外，疫苗佐剂的相对密度（相对密度可以为0.905-1.095）相对低，注射时不会引起疼痛。水包油剂型可对角鲨烯起到保护作用，防止其被分解破坏。同时，由于角鲨烯得到良好的保护，进而可分散延长角鲨烯药物的释药时间，提高免疫应答效果，提高角鲨烯在体内的吸收率。
利用本申请所提供的疫苗佐剂的制备方案可以制备获得如下的疫苗佐剂，例如但不限于：
一种疫苗佐剂包括：去水山梨糖醇三油酸酯、角鲨烯、表面活性剂、枸橼酸钠和水，其中：山梨糖醇三油酸酯的浓度为0.1%至1%(w/v)； 角鲨烯的浓度为1-10%(v/v)；如吐温和/或吐温80的表面活性剂的浓度为0.3-0.7%(w/v)；枸橼酸钠的浓度为0-10mmol/L。
再一种疫苗佐剂包括：重量比为1.5-3.5%的鱼腥草多糖、0.2-0.55%的丙氨酸、0.8-2.2%的银杏叶黄、5-8%的聚乙烯蓖麻油、5-8%的Span80、2.5-5%的聚乙二醇、6-10%的角鲨烯、30-35%的注射用大豆油和25-50%的注射用水，各组分的重量百分含量之和为100%。
还一种疫苗佐剂包括：角鲨烯、柠檬酸盐或磷酸盐、离子调节剂， Tween-80、Span-85、TLR激动剂和水，其中：角鲨烯的浓度为1%-10%(v/v)；柠檬酸盐或磷酸盐的浓度为5-10mmol/L；包含氯化钠和/或氯化钾的离子强度调节剂的浓度为0.10Mol/L；Tween-80的浓度为0.3%-3%(v/v)；Span-85的浓度为0.5%(v/v)；TLR激动剂的浓度为0.001%至 0.01% (v/v)。所述TLR激动剂为天然的TLR激动剂或人工合成的TLR激动剂， TLR激动剂包括但不限于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、 TLR9。
三、疫苗组合物
本申请还提供了一种疫苗组合物，包括抗原和疫苗佐剂，该疫苗佐剂为根据本申请技术方案所提供的疫苗佐剂。上述疫苗组合物为注射用疫苗组合物，可用于人或其他动物。上述抗原包括但不限于各种病原微生物、细菌、病毒、细菌外毒素或类毒素或肿瘤抗原等，可以覆盖任何适用于疫苗抗原且能激发免疫反应的物质。
四、疫苗佐剂的制备系统
根据本申请的另一方面，还提供了一种疫苗佐剂的制备装置或系统，该制备系统通过实施本申请所提供的上述疫苗佐剂的制备方法，用于制备疫苗佐剂。
五、实施例和对比例
下面通过实施例与对比例的方式，对本申请技术方案进行示例性地说明，但不对本申请的保护范围构成限制。
1. 实施例1（前端灭菌，无离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
灭菌处理：在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，分别对水相液体和油相液体进行灭菌处理，维持20分钟；
混合剪切：向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液高压均质后，平均粒径可以达到100纳米以下，且粒径分布窄，油水包封率90％以上）剪切、分散，备用；
封装：经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
2. 对比例1（后端灭菌，无离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
3.对比例2（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钠或氯化钾溶液调节氯化钠或氯化钾的浓度至0.5mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
4. 对比例3（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钠或氯化钾溶液调节氯化钠或氯化钾的浓度至1.0mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
5. 对比例4（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钠或氯化钾溶液调节氯化钠或氯化钾的浓度至1.5mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
6.对比例5（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钙或氯化镁溶液调节氯化钙或氯化镁的浓度至0.5mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
7. 对比例6（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钙或氯化镁溶液调节氯化钙或氯化镁的浓度至1.0mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
8. 对比例7（后端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钙或氯化镁溶液调节氯化钙或氯化镁的浓度至1.5mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
9. 实施例2（前端灭菌，有离子调节）
水相液体的制备：将10mmol/L，pH6.0的枸橼酸钠缓冲液加入注射用水中，调节pH至6.7，随后加入作为表面活性剂的5g的吐温80，搅拌均匀，作为水相液体；
油相液体的制备：称取5g去水山梨糖醇三油酸酯（乳化剂），加入5ml角鲨烯，充分分散混匀，作为油相液体；
灭菌处理：在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，分别对水相液体和油相液体进行灭菌处理，维持20分钟；
混合剪切：
向水相中缓慢加入油相，在保持60℃温度条件下，边加边搅拌，旋转速度16000r/min，使其充分混匀；
离子调节：在水相和油相混匀液中，加入氯化钙或氯化镁溶液调节氯化钙或氯化镁的浓度至1.5mmol/L；
经过德国APV-2000型高压乳匀机（在1000bar压力和60℃温度条件下，对乳液进行均质）剪切、分散，准备进行灭菌处理；
灭菌处理：完成混合剪切处理后，在压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C的条件下，对制备获得的乳液进行灭菌处理，维持20分钟；
封装：经过灭菌处理后直接经自动灌装机无菌罐装、密封即得疫苗佐剂制剂产品。
10. 疫苗佐剂电位测试
在封装之前，对各个实施例和对比例所制得的疫苗佐剂乳液进行Zeta电位测试。
测试设备：BMI500型在线多参数离子浓度电位检测计。
测试过程：设定设备参数，如光源：633nm激光；溶剂介质：水；电位梯度：10v/cm；散射角：90°或自动；测定温度为25℃。完成参数设定后，自动实时采样分析。
测试结果如下表1：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
11. 疫苗佐剂评价（光照加速稳定性试验评价）
试验目的：评估光线照射对疫苗佐剂稳定性的影响。
试验对象：上述各实施例和对比例所制得的封装的疫苗佐剂制剂（玻璃瓶装）。
试验条件：分别准备上述各实施例和对比例所制得的疫苗佐剂制剂各10瓶，置于人工光照气候培养箱中，设定光照强度4500lX，空气湿度45%RH，温度25℃的环境条件，每隔一定时间段，分别观察角鲨烯疫苗佐剂制剂的性状。
试验结果如下表2所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
12. 疫苗佐剂评价（恒温加速稳定性试验评价）
试验目的：评估温度对疫苗佐剂稳定性的影响。
试验对象：上述各实施例和对比例所制得的封装的疫苗佐剂制剂（玻璃瓶装）。
试验条件：置于40℃恒温的电热式恒温干燥箱中。每隔一定时间段，分别观察角鲨烯注射液的性状。
试验结果如下表3所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
以上详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (17)

1.疫苗佐剂的制备方法，该制备方法包括：
制备水相液体；
制备油相液体；
将所述水相液体与所述油相液体混合，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液，
其中，所述制备方法还包括灭菌处理，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行任何的灭菌处理。
2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，在形成所述水包油结构或油包水结构的液滴之后，不进行有助于所述液滴之间产生静电吸附的任何操作。
3.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，
在制备水相液体之前对制备水相液体的各组分进行灭菌处理；和/或
在制备油相液体之前对制备油相液体的各组分进行灭菌处理；和/或
在制备所述水相液体的过程中对该水相液体进行灭菌处理；和/或
在制备所述油相液体的过程中对该油相液体进行灭菌处理。
4.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，在将所述水相液体与所述油相液体混合，以形成具有水包油结构或油包水结构的液滴的乳液的整体过程中，在该整体过程的前部分时间内进行灭菌处理。
5.根据权利要求4所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，所述前部分时间占整体过程时间的1/3至1/2。
6.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，该制备方法包括：将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内，以使具有所述水包油结构或油包水结构的液滴的所述乳液的Zeta电位高于-20mV。
7.根据权利要求6所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，所述离子调节剂包括一价阳离子调节剂和/或二价阳离子调节剂，其中：
所述一价阳离子调节剂包括氯化钠或氯化钾水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钠或氯化钾的浓度为0.5至1.5mmol/L；
所述二价阳离子调节剂包括氯化钙或氯化镁水溶液，将离子调节剂加入所述水相液体、油相液体或所述乳液内后，氯化钙或氯化镁的浓度为0.5至1.5mmol/L。
8.根据权利要求6所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，该制备方法包括按照1:2至1:1的体积比将所述离子调节剂加入用于制备水相液体的缓冲液中。
9.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，所述液滴的直径不大于200nm。
10.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，制备水相液体包括：将表面活性剂加入缓冲液中，搅拌均匀，以获得pH值为6.0-8.0的水相液体；
其中，所述缓冲液为枸橼酸盐缓冲液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液、氨－氯化铵缓冲液、醋酸－醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液中的一种或几种，所述缓冲液的pH值为6.0-7.0；
所述表面活性剂为吐温、吐温80、烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、硬脂酸钠、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、十八烷基硫酸钠、磷脂、胆碱、蛋白质中的一种或几种。
11.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的制备方法，其中，制备油相液体包括：将角鲨烯加入到乳化剂中，分散均匀，以获得油相液体，
其中，所述乳化剂为去水山梨糖醇三油酸酯（Span-85）、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖酯、大豆磷脂、卵磷脂、普朗尼克、卡波姆、十二烷基硫酸钠中的一种或多种，
所述角鲨烯为纯度不低于90%的注射用角鲨烯。
12.疫苗佐剂，其中，该疫苗佐剂由权利要求1-11中任意一项所述的制备方法制备。
13.根据权利要求12所述的疫苗佐剂，其中，该疫苗佐剂包括：去水山梨糖醇三油酸酯、角鲨烯、表面活性剂、枸橼酸钠和水，其中：
山梨糖醇三油酸酯的浓度为0.1%至1%(w/v)；
角鲨烯的浓度为1-10%(v/v)；
如吐温和/或吐温80的表面活性剂的浓度为0.3-0.7%(w/v)；
枸橼酸钠的浓度为0-10mmol/L。
14.根据权利要求12所述的疫苗佐剂，其中，该疫苗佐剂包括：重量比为1.5-3.5%的鱼腥草多糖、0.2-0.55%的丙氨酸、0.8-2.2%的银杏叶黄、5-8%的聚乙烯蓖麻油、5-8%的Span80、2.5-5%的聚乙二醇、6-10%的角鲨烯、30-35%的注射用大豆油和25-50%的注射用水，各组分的重量百分含量之和为100%。
15.根据权利要求12所述的疫苗佐剂，其中，该疫苗佐剂包括：角鲨烯、柠檬酸盐或磷酸盐、离子调节剂， Tween-80、Span-85、TLR激动剂和水，其中：
角鲨烯的浓度为1%-10%(v/v)；
柠檬酸盐或磷酸盐的浓度为5-10mmol/L；
包含氯化钠和/或氯化钾的离子强度调节剂的浓度为0.10Mol/L
Tween-80的浓度为0.3%-3%(v/v)；
Span-85的浓度为0.5%(v/v)；
TLR激动剂的浓度为0.001%至 0.01% (v/v)。
16.疫苗组合物，该疫苗组合物包括抗原和疫苗佐剂，该疫苗佐剂为权利要求12-15中任意一项所述的疫苗佐剂。
17.疫苗佐剂的制备系统，该制备系统通过实施权利要求1-11中任意一项所述的疫苗佐剂的制备方法，用于制备疫苗佐剂。
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