CN110368362B - 一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法，分别通过磷脂酰丝氨酸浓度的选择、长链甘油三酯（LCT）和中链甘油三酯（MCT）种类及应用比例的选择，水相、油相及混合相的制备；乳化剂种类及比例的选择，通过高压均质机均质制备，得出一种高稳定性的磷脂酰丝氨酸乳剂。本发明一改通常情况下磷脂酰丝氨酸片剂和软胶囊的剂型，可望提高产品的生物利用度及有效性，从而增加了磷脂酰丝氨酸的临床选择。

Description

一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂及营养食品制备领域，具体涉及一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸(简称，PS)是细胞膜双分子结构物质中的成分之一，是大脑细胞膜的重要组成部分。磷脂酰丝氨酸是能够调控细胞膜关键蛋白的功能状态的磷脂，具有修复损伤和改善大脑的功能。大量数据表明，PS可通过调控膜蛋白的信号通路从而调节神经元及神经胶质细胞的分化与成熟。PS还可通过调节神经递质的释放控制神经元的兴奋性，从而影响脑细胞活性。因此，PS成为“脑专一性物质”。近年来，科学家们对口服磷脂酰丝氨酸能够引起人类认知功能改善的研究表现出极大的兴趣，大量的临床试验和动物实验表明，口服磷脂酰丝氨酸可以提高与年龄相关的退行性记忆力减退、改善儿童多动症等症状。

目前，常见的磷脂酰丝氨酸制剂形式主要为片剂和软胶囊，乳剂形式存在的磷脂酰丝氨酸制剂并不常见。由于磷脂酰丝氨酸本身同时存在亲水和疏水的结构，使得磷脂酰丝氨酸具备了成为乳剂和脂质体的可能性。在通常情况下，水包油型乳剂(O/W)是药物制剂的主要手段之一，口服乳剂可以提高生物活性物质的生物利用率，增加产品的有效性，同时对吞咽困难的人群，可以通过鼻饲等方式进行给药。因此，乳剂的成功制备和应用，不仅可以提高产品的有效性，还可以降低原料成本、从而增加磷脂酰丝氨酸的临床选择。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法，包括如下步骤，

S1、油相选择：所述油相试剂选用不同链长的甘油三酯；

S2、乳化剂的选择和处理：乳清分离蛋白、吐温80，分别将乳清分离蛋白、T80或它们的混合物分散在10mM磷酸盐缓冲液中，确保其完全溶解和水化，并在4℃下搅拌过夜；

S3、油水混合相的制备：首先将磷脂酰丝氨酸加入到S1的油相中，在50℃-60℃的温度下搅拌10小时；按10:90的油水比例，将以上含磷脂酰丝氨酸油相和S2含有WPI/T80磷酸盐缓冲液水相进行充分混合制得油水混合相，搅拌以确保磷脂酰丝氨酸在含有不同链长的甘油三酯或按比例混合的WPI/T80乳化剂混合液中充分溶解，所述乳化剂混合液中WPI与T80按质量百分比混合比例分别为2.0：0.0、1.5：0.5、1.0：1.0、0.5：1.5、0.0：2.0；

S4、初乳的制备：将磷脂酰丝氨酸和LCT或MCT加入到S3形成的含有WPI/T80的乳化剂溶液中进行15-20分钟的剪切；

S5、PS乳剂的制备：在70MPa的压力下，将初乳液通过高压均质机均质得最终PS乳剂。

优选地，所述S1中油相试剂为具有长链甘油三酯-LCT的玉米油、具有中链甘油三酯-MCT的椰子油。

优选地，所述S2中磷酸盐缓冲液pH＝7.0。

优选地，所述S3中油相水相混合后在4℃搅拌过夜，并在室温下搅拌1-2小时确保磷脂酰丝氨酸在含有不同链长的甘油三酯或按比例混合的WPI/T80乳化剂混合液中充分溶解。

优选地，所述S4初乳的制备中加入乳化剂溶液中加入质量百分比为0.6％磷脂酰丝氨酸、10％LCT或10％MCT。

优选地，所述磷脂酰丝氨酸乳剂制备完成后加入质量百分比0.02％叠氮化钠以防止微生物生长。

优选地，当所述MCT制备的磷脂酰丝氨酸乳剂其乳化剂混合液中WPI与T80的比例为0.0：2.0，或是LCT制备的磷脂酰丝氨酸乳剂其乳化剂混合液中WPI与T80的比例为0.5：1.5时，制得的初乳在70MPa的压力下得到最终活性成分浓度为600PS mg/100ml的乳剂。

本发明的有益效果体现在：本发明提供了一种可制备稳定的水包油型磷脂酰丝氨酸乳液的工艺，以长链/中链甘油三酯为油相，乳清蛋白和聚氧化乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐温-80)为乳化剂，利用高压均质法制备稳定的磷脂酰丝氨酸乳剂，并通过对磷脂酰丝氨酸乳剂的粒径、电位、离心稳定常数等测定，揭示了磷脂酰丝氨酸乳剂在不同油相及不同乳化剂条件下对其物理稳定性的影响，为磷脂酰丝氨酸乳剂的工艺及放大提供理论参考及依据。提高了产品的有效性，且原料成本低、增加了磷脂酰丝氨酸的临床选择。

附图说明

图1：本发明实施例中LCT制备的PS乳剂贮存21天后粒径变化曲线图。

图2：本发明实施例中MCT制备的PS乳剂贮存21天后粒径变化曲线图。

图3：本发明实施例中LCT制备的PS乳剂的乳化剂浓度与离心稳定常数的关系示意图。

图4：本发明实施例中LCT制备的PS乳剂的乳化剂浓度与离心稳定常数的关系示意图。

具体实施方式

本发明揭示了一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法，包括如下步骤：

S1、油相选择：玉米油(长链甘油三酯-LCT)、椰子油(中链甘油三酯-MCT)。

S2、乳化剂的选择和制备：乳清分离蛋白(WPI)、吐温80(T80)，分别将WPI、T80或它们的混合物分散在10mM磷酸盐缓冲液(PB)中，pH＝7.0，确保其完全溶解和水化，并将样品在4℃下搅拌过夜。

S3、油水混合相的制备：首先将磷脂酰丝氨酸加入到油相中(不同链长的甘油三酯)，在50℃的温度下搅拌10小时，按10：90的油水比例，将油相(含磷脂酰丝氨酸)和水相(含有WPI/T80磷酸盐缓冲液)进行充分混合制得油水混合相，4℃搅拌过夜并在室温下搅拌1小时，以确保磷脂酰丝氨酸在分别含有不同链长的甘油三酯或按比例混合的WPI/T80乳化剂混合液中充分溶解，其中，WPI/T80的乳化剂溶液中WPI/T80比例分别为2.0：0.0、1.5：0.5、1.0：1.0、0.5：1.5、0.0：2.0％(w/w)。

S4、初乳的制备：将磷脂酰丝氨酸(0.6％，w/w)和LCT(10％w/w)或MCT(10％w/w)加入到含有WPI/T80的乳化剂溶液中(10mM Pb，pH＝7.0)进行15分钟的剪切(4000转/分，L5M-A，英国Silverson有限公司)。

S5、PS乳剂的制备：当所述乳化剂混合液中WPI与T80的比例为0.0：2.0时，在10150psi(70MPa)的压力下，将初乳液通过高压均质机(LLCD-3L，Phd Technology LLC，USA)均质4次得到。乳剂的最终活性成分浓度为600PSmg/100ml。制备后加入0.02％(w/w)叠氮化钠以防止微生物生长。

为进一步的对制备后的PS乳剂进行性能的确认，对制备后的PS乳剂物理性质及稳定性进行检测。

PS乳剂粒径的测定，采用Malvern Zetasizer Nano ZSP激光粒度分析仪测定粒度分布，测定温度25℃。样品制备后贮存于4℃，并在第7天、14天和21天进行粒径测量。

PS乳剂Zeta电位的测定，采用Malvern Zetasizer Nano ZSP分析仪测定PS乳剂的Zeta电位。重复3次，取平均值，测定温度25℃。

PS乳剂离心稳定常数的测定，乳剂的物理稳定性变化表现为分层、絮凝、破乳等现象。将乳剂在一定转速下离心一段时间，对乳剂的影响相当于自然静置较长时间对其产生影响。因此，用离心-紫外分光光度法测定的离心稳定常数ke可作为评价乳剂物理稳定性的指标。相同条件下，ke值越小，表明乳剂越稳定。取PS乳剂2mL置于离心管中，4000rpm离心15min，取离心前、后的乳剂下层各25μL置于10mL容量瓶中，用超纯水定容摇匀，以超纯水为空白，于波长500nm处测定其吸光度值，记为A0、A。以Ke＝(A-A₀)/A₀x 100％计算该乳剂的离心稳定常数。

统计学分析

乳液均质后立即进行各指标测定，所有数据均进行三组平行样测定，使用SPSS17.0(SAS Institute Inc.，Carry，NC，USA)系统进行数据显著分析。实验数据均以平均值Mean±标准偏差(SD)表示，采用ANOVA方法检测，然后进行Bonferroni事后比较检验。P值<0.05表示显着差异。

粒径分析

乳化体系形成后，乳化剂吸附在油水界面，稳定液滴使其不发生聚集，通过峰变化范围及峰面积观察乳液中液滴大小分布情况。本实施例比较了WPI，T80以及WPI-T80复合乳化剂对长链或中链甘油三酯制备PS乳剂粒径的影响。PS乳剂粒径大小及分布如表1所示，与LCT制备的PS乳剂相比，MCT制备的PS乳剂具有更小的平均乳滴粒径。此与长链或中链甘油三酯相本身的粘度与粒径有关，MCT油的粘度约25mPa·s，玉米油约60mPa·s，这使得PS乳液在MCT中更容易分散形成更小的乳滴颗粒。

表1：PS乳剂粒径大小及分布

LCT制备的PS乳剂在浓度为WPI(0.5％，w/w)-T80(1.5％w/w)的条件下，乳滴显示较小粒径，认为与乳清蛋白与吐温-80在乳滴表面的竞争吸附有关。此外，MCT制备的PS乳剂在浓度为T80(2.0％w/w)的条件下，乳滴显示较小粒径，认为与吐温-80迅速吸附到乳滴表面，降低乳滴表面张力有关。因此，本研究表明，在MCT作为油相制备PS乳剂时，提高吐温-80的浓度可以具有较高更快地降低乳滴表面张力，形成较小的液滴。乳清蛋白虽然也可有效的降低乳滴的自由能，从而降低表面张力，但由于扩散较慢并且对环境(如温度、pH值和离子强度)有强烈的依赖性，从而限制了乳清蛋白在胶体系统中的应用。因此，本实验研究显示，小分子表面活性剂吐温-80比乳清蛋白更快地吸附到乳滴表面，形成乳滴表面保护膜，减少乳滴的絮凝，形成粒径更小的乳液。

4℃条件下，PS乳剂贮存21天后粒径变化(Mean±SD)如图1所示。所有PS乳剂的粒径大小相近。ANOVA统计结果显示，所有乳剂的粒径大小没有显着差异，说明PS乳剂具有一定的稳定性。

Zeta电位的测定

由表2可以看出，吐温-80作为乳化剂后，无论是LCT或是MCT制备的PS乳剂，Zeta电位的变化都呈相同的趋势。随着添加比例的增加Zeta电势增大(绝对值，并且在添加量为(2％，w/w)时具有最大值。吐温-80是一种非离子型表面活性剂，乳滴表面的负电荷来自于吸附在乳滴表面上带负电荷的离子，如来自水相的OH^-，或是来自油相的游离脂肪酸。此外，本研究结果还观察到，由LCT制备的PS乳剂在同浓度的乳化剂条件下，Zeta电位明显高于MCT制备的PS乳剂，说明与乳清蛋白或是吐温-80吸附在LCT或是MCT油滴表面的量和状态有关。这表明，乳化剂分子与长链/中链甘油三酯发生了一定的结合，使得乳滴表面分子的微观结构发生了一系列的变化。

表2:吐温-80作为乳化剂后，LCT及MCT制备的PS乳剂Zeta电位显示

离心稳定常数的测定

大量数据表明，离心稳定常数可做为评价乳剂稳定的鉴别指标。离心稳定常数越小表明乳剂的稳定性越好。如图3所示，LCT制备的PS乳剂在乳化剂浓度为WPI(0.5％，w/w)-T80(1.5％，w/w)条件下具有较小的离心稳定常数，图4显示，MCT制备的PS乳剂在乳化剂浓度为T80(2.0％，w/w)条件下与其他浓度的乳化剂相比，有较小的离心稳定常数。这表明，当吐温-80的浓度适当增加时，离心稳定常数变小，说明与吐温-80吸附到乳滴表面有关，吐温-80可以为乳滴提供空间稳定作用，增加乳滴之间的排斥力，防止乳滴絮凝。因此，推断不同比例的乳化剂吸附到乳液表面后会发生重排，形成稳定的乳化膜，以稳定乳剂。

同时，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

S1、油相选择：所述油相试剂选用具有中链甘油三酯的椰子油；

S2、乳化剂的选择和处理：将吐温80分散在10 mM磷酸盐缓冲液中，确保其完全溶解和水化，并在4℃下搅拌过夜；

S3、油水混合相的制备：首先将磷脂酰丝氨酸加入到Sl的油相中，在50℃-60℃的温度下搅拌l0小时；按10：90的油水化例，将以上含磷脂酰丝氨酸油相和S2含有吐温80磷酸盐缓冲液水相进行充分混合制得油水混合相，搅拌以确保磷脂酰丝氨酸在吐温80乳化剂混合液中充分溶解；所述乳化剂混合液中吐温80的质量百分比为2.0%

S4、初乳的制备：将0.6%磷脂酰丝氨酸、10%中链甘油三酯加入到S3形成的含有吐温80的乳化剂溶液中进行15-20分钟的剪切；

S5、磷脂酰丝氨酸乳剂的制备：在70 MPa的压力下，将初乳液通过高压均质机均质得最终磷脂酰丝氨酸乳剂；

所述S2中磷酸盐缓冲液pH=7.0；

所述S3中油相水相混合后在4℃搅拌过夜，并在室温下搅拌1-2小时确保磷脂酰丝氨酸在吐温80乳化剂混合液中充分溶解；制得的初乳在70MPa的压力下得到最终磷脂酰丝氨酸活性成分浓度为600mg/100 ml的乳剂。

2.如权利要求1所述的一种磷脂酰丝氨酸乳剂的制备方法，其特征在于：所述磷脂酰丝氨酸乳剂制备完成后加入质量百分比0.02%叠氮化钠以防止微生物生长。

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