PT1616573E

PT1616573E - Vacina contra bordetella bronchiseptica

Info

Publication number: PT1616573E
Application number: PT05023118T
Authority: PT
Inventors: Don Alan Dearwester; Leroy Allen Swearingin; David Stewart Roberts
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2012-01-11
Also published as: EP1023904B1; BRPI0000126B8; EP1616573B1; BR0000126A; ATE533504T1; NZ502341A; DK1616573T3; US6814971B2; US7393535B2; TW585777B; ES2374628T3; BRPI0000126B1; NZ513202A; CA2296244A1; CN1126568C; CN1270838A; AU2004201021A1; AR055422A2; US20030175299A1; AR035474A1

Description

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DESCRIÇÃO "VACINA CONTRA BORDETELLA BRONCHISEPTICA"

Campo da invenção A invenção diz respeito a uma composição de antigénio que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica que foi inactivada por meio da adição de formalina e subsequente adição de glutaraldeido. A invenção também diz respeito a uma composição de vacina que compreende a referida composição de antigénio e um adjuvante.

Antecedentes da invenção 0 desenvolvimento de imunidade contra organismos infecciosos constitui uma ferramenta poderosa no controlo de doenças. Os antigénios que induzem imunidade contra infecção são conhecidos como imunogénios. 0 anticorpo protector por eles induzido pode colaborar com outras defesas naturais para inibir o processo infeccioso ou então podem neutralizar os produtos nocivos do organismo infeccioso, tais como toxinas.

Um meio eficaz para aumentar a resposta de anticorpos compreende a utilização de um adjuvante. Assim, inclui-se um adjuvante numa vacina como um aditivo ou um veiculo para aumentar a resposta contra o antigénio. Um adjuvante pode actuar por diferentes mecanismos, incluindo (1) reter o antigénio no organismo para provocar uma libertação lenta, (2) atrair as células do sistema imunitário para o local de injecção, (3) estimular as células do sistema imune para a sua proliferação e activação e (4) melhorar a dispersão de antigénio no corpo do recipiente. 2 Há diversos agentes com propriedades químicas diferentes que têm vindo a ser utilizados como adjuvantes, incluindo emulsões do tipo água-em-óleo e óleo-em-água, sais minerais, polinucleótidos e substâncias naturais. Um adjuvante, conhecido sob a designação comercial AMPHIGEN™, encontra-se descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 084 269. O adjuvante AMPHIGEN™ é constituído por lecitina isenta de óleo dissolvida num óleo, normalmente parafina leve líquida. Em preparações de vacina, o AMPHIGEN encontra-se disperso numa solução ou suspensão aquosa de antigénio de imunização sob a forma de uma emulsão de óleo-em-água.

Foram observados problemas aquando da utilização de um adjuvante AMPHIGEN™ de acordo com a patente de invenção norte-americana n° 5 084 269, anterior. Por exemplo, a lecitina no AMPHIGEN™ não é suficiente para a produção de uma emulsão estável do óleo, provocando assim um conjunto ou um depósito de óleo nos tecidos injectados. O óleo mineral não pode ser metabolizado ou removido por um animal. Assim sendo, o óleo torna-se uma fonte de inflamação e formação de feridas crónicas e graves. O emulsionamento do AMPHIGEN™ directamente na preparação de antigénio apresenta o risco de danificar o antigénio. Além disso, no caso da emulsão desejada não ser possível de formar, então o antigénio relevante deverá ser deitado fora.

No documento US 4 888169 encontra-se descrita uma composição de vacina que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica que foi inactivada pela adição de glutaraldeído, apenas. 3

No documento US 5 578 308 encontra-se descrita a inactivação (desintoxicação) da toxina de Bordetella purificada utilizando glutaraldeido e depois formalina na presença de aminoácidos.

Descrição abreviada da invenção A invenção diz respeito a uma composição de antigénio que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica que foi inactivada por meio da adição de formalina e subsequente adição de glutaraldeido. A invenção também diz respeito a uma composição de vacina que compreende a referida composição de antigénio e um adjuvante. Em particular, a invenção diz respeito à referida composição de vacina, em que o referido adjuvante está compreendido entre cerca de 0,25% e cerca de 12,5% volume/volume (v/v) de uma lecitina, entre cerca de 1% e cerca de 23% v/v de um óleo e entre cerca de 1,5% e 3,5% v/v pelo menos de um tensioactivo anfifilico.

De acordo com uma primeira variante, a invenção proporciona um método para a inactivação de uma cultura de Bordetella bronchiseptica que compreende a adição de formalina à referida cultura e subsequente adição de glutaraldeido à referida cultura.

De acordo com uma segunda variante, a invenção proporciona uma composição de Bordetella bronchiseptica que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica, formalina e glutaraldeido.

De acordo com uma terceira variante, a invenção proporciona uma vacina para a protecção de um mamifero contra uma infecção por Bordetella bronchiseptica que compreende entre cerca de 1 pg e cerca 100 mg por kg de 4 hospedeiro de uma quantidade de células de Bordetella bronchíseptica a partir uma cultura inactivada de acordo com o método anterior, a qual é eficaz para proteger o referido mamífero contra uma infecção por Bordetella bronchíseptica e um veículo fisiologicamente aceitável. De preferência, a vacina compreende entre cerca de 10 pg e cerca de 1 mg por kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchíseptica e mais preferencialmente entre cerca de 100 pg e cerca de 1 pg por kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchíseptica.

De acordo com uma quarta variante, a invenção proporciona uma vacina para a protecção de um mamífero contra uma infecção por Bordetella bronchíseptica que compreende entre cerca de 1 pg e cerca de 100 mg por kg de hospedeiro de uma quantidade de células de Bordetella bronchíseptica provenientes de uma cultura inactivada de acordo com o método anterior, que é eficaz para proteger o referido animal contra uma infecção por Bordetella bronchíseptica e um veículo fisiologicamente aceitável, em que a referida vacina compreende ainda entre cerca de 1 pg e cerca de 100 mg por kg de hospedeiro de uma quantidade de antigénios de Pasteurella multocida toxigénicos eficazes para proteger o mamífero contra uma infecção por Pasteurella multocida toxigénica. De preferência, a vacina compreende entre cerca de 10 pg e cerca de 1 mg por kg de hospedeiro de antigénios de Pasteurella multocida toxigénicos e mais preferencialmente entre cerca de 100 pg e cerca de 1 pg por kg de hospedeiro de antigénios de Pasteurella multocida toxigénicos. De preferência, a vacina de acordo com a quarta variante serve para a protecção de um porco contra uma infecção por Bordetella bronchíseptica 5 e/ou uma infecção por Pasteurella multocida toxigénica. A invenção proporciona ainda a utilização da vacina de acordo com a quarta variante para a preparação de uma vacina para proteger um porco contra uma infecção por Bordetella bronchíseptica e/ou uma infecção por Pasteurella multocida toxigénica. A invenção proporciona ainda a utilização da vacina de acordo com a quarta variante para a preparação de uma vacina para a protecção de um leitão contra rinite atrófica por meio de: a) vacinar um porco antes da procriação e durante a gravidez com uma quantidade da vacina de acordo com a quarta variante, a qual é eficaz para proporcionar anticorpos anti-Bordetella bronchíseptica e anticorpos anti-Pasteurella multocida toxigénica no colostro produzido pelo referido porco fêmea e b) proporcionar o colostro produzido pelo referido porco fêmea ao leitão nas 24 horas subsequentes ao nascimento do leitão. A invenção também proporciona uma vacina de acordo com a quarta variante para a protecção de um leitão contra rinite atrófica por meio de: a) vacinar um porco antes da procriação e durante a gravidez com uma quantidade da vacina de acordo com a quarta variante, a qual é eficaz para proporcionar anticorpos anti-Bordetella bronchíseptica e anticorpos anti-Pasteurella multocida toxigénica no colostro produzido pelo referido porco fêmea e b) proporcionar o colostro produzido pelo referido porco fêmea ao leitão nas 24 horas subsequentes ao nascimento do leitão. 6 0 adjuvante utilizado de acordo com a invenção compreende uma lecitina, um óleo e um tensioactivo anfifilico capazes de emulsionar o adjuvante, por exemplo, um tensioactivo Tween ou Span. De acordo com outro aspecto preferido, o tensioactivo é Tween 80, Tween 85, Span 80 ou Span 85. De acordo com outro aspecto, o adjuvante compreende uma lecitina, um óleo e dois tensioactivos anfifilicos capazes de emulsionar o adjuvante ou uma composição de vacina que contém o adjuvante. De acordo com um aspecto preferido, um dos dois tensioactivos é predominantemente encontrado na fase aquosa, por exemplo, Tween 80, e o outro tensioactivo é predominantemente encontrado na fase oleosa, por exemplo, Span 80. A lecitina é um fosfatideo. As preparações impuras de lecitina podem compreender triglicéridos. Para os propósitos da presente invenção, o termo "lecitina" compreende preparações purificadas e impuras. De acordo com um aspecto preferido, a lecitina é isenta de óleo.

Como óleos adequados refere-se um óleo mineral, por exemplo, óleo mineral leve DRAKEOL™.

De acordo com um outro aspecto, o adjuvante contém uma solução aquosa de veiculo, por exemplo, um tampão, água ou uma solução de soluto salino fisiologicamente aceitáveis.

De acordo com um aspecto preferido, o adjuvante contém uma lecitina, um óleo mineral, dois tensioactivos anfifilicos e uma solução aquosa de veiculo (v.g., soluto salino).

Descrição abreviada das figuras A figura 1 mostra um gráfico que ilustra a distribuição dos tamanhos das goticulas de uma emulsão 7 preparada conforme a seguir descrito. As linhas (a) e (b) mostram que cerca de 94% das goticulas possuem um diâmetro de 1 pm ou inferior.

Descrição minuciosa da invenção A invenção diz respeito a uma composição de antigénio que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica que foi inactivada por meio da adição de formalina e subsequente adição de glutaraldeido. A invenção também diz respeito a uma composição de vacina que compreende a referida composição de antigénio e um adjuvante. Em particular, a invenção diz respeito à referida composição de vacina, em que o referido adjuvante compreende entre cerca de 0,25% a cerca de 12,5% volume/volume (v/v) de uma lecitina, entre cerca de 1% a cerca de 23% v/v de um óleo e entre cerca de 1,5% a 3,5% v/v pelo menos de um tensioactivo anfifilico. O adjuvante é útil para aumentar a resposta imune contra um antigénio.

Em particular, é aqui descrito um adjuvante oleoso que é capaz de emulsionar uma formulação de vacina. Além do mais, é aqui descrito ainda um adjuvante que, no caso de ser utilizado numa formulação de vacina, é capaz de evitar substancialmente a inflamação ou a formação de cicatrizes no local de injecção, factores estes que são típicos de vacinas que contêm óleos minerais. Os adjuvantes utilizados de acordo com a invenção compreendem uma lecitina, um óleo e um tensioactivo anfifilico capaz de emulsionar o adjuvante ou uma composição de vacina que contém o adjuvante.

Concluiu-se que a adição de uma quantidade compreendida entre cerca de 1,5% v/v (isto é, 1,5% volume 8 por volume de concentração obtido por, por exemplo, mistura de 98,5 volumes de vacina que compreende o adjuvante com 1,5 volumes do tensioactivo anfifilico) a 3,5% v/v de um tensioactivo anfifilico a uma vacina que contém um adjuvante conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 084 269, é eficaz para emulsionar de um modo suficiente uma composição de vacina formulada com um tal adjuvante e para minimizar a irritação no local de injecção do animal vacinado.

De acordo com um aspecto, o adjuvante descrito contém uma lecitina, um óleo e um tensioactivo anfifilico. De acordo com um outro aspecto, o adjuvante contém uma lecitina, um óleo e um tensioactivo anfifilico capaz de emulsionar uma composição de vacina formulada com o referido adjuvante. De acordo com um aspecto preferido, são utilizados dois tensioactivos anfifilicos no adjuvante, por exemplo, um tensioactivo Tween e um tensioactivo Span.

Um adjuvante preferido, aqui designado como "adjuvante n° 1", compreende cerca de 2% v/v de lecitina, cerca de 18% v/v de óleo mineral e cerca de 8% v/v de tensioactivo (v.g., cerca de 5,6% v/v de Tween 80 e cerca de 2,4% v/v de Span 80), sendo o volume restante uma solução de soluto salino. De acordo com um aspecto preferido, formula-se uma composição de vacina que compreende um antigénio numa concentração de cerca de 75% v/v e um adjuvante, de preferência o adjuvante n° 1, numa concentração de cerca de 25% v/v da composição de vacina. Todas as concentrações aqui apresentadas em percentagem são indicadas em volume por volume, salvo quando indicadas no contexto de outro modo. 9

Tensioactivos úteis no adjuvante

Como tensioactivos úteis para o adjuvante utilizado na invenção refere-se tensioactivos anfifilicos e aceitáveis para utilização veterinária ou médica. Os especialistas na matéria podem determinar se um tensioactivo particular seja ou não aceitável para utilização médica ou veterinária. Um tensioactivo é anfifilico se uma parte da molécula de tensioactivo for hidrofóbica e uma parte for hidrofilica. Veja-se, as patentes de invenção norte-americanas nos 5 690 942; 5 376 369; 4 933 179 e 4 606 918, que descrevem tensioactivos que podem ser utilizados no adjuvante aqui descrito. Como exemplos de tensioactivos úteis no adjuvante refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um tensioactivo Tween e um tensioactivo Span. Os tensioactivos Tween e Span compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, monolaureato (Tween 20, Tween 21, Span 20), monopalmitato (Tween 40, Span 40), monoestearato (Tween 60, Tween 61, Span 60), triestearato (Tween 65, Span 65), monooleato (Tween 80, Tween 81, Span 80) e trioleato (Tween 85, Span 85) . De acordo com uma variante preferida, utiliza-se o Tween 80, Tween 85, Span 80 ou Span 85. É preferivel que o tensioactivo útil no adjuvante seja anfifilico e que possua um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico ("HLB") que seja preferencialmente pelo menos metade dos valores de HLB de todos os outros componentes do adjuvante. Mais preferencialmente, o tensioactivo possui um valor de HLB que está compreendido entre metade e cerca do dobro da soma dos valores de HLB de todos os componentes do adjuvante. Ainda mais preferencialmente, o tensioactivo possui um valor de HLB que é aproximadamente idêntico ao 10 valor de HLB de todos os outros componentes do adjuvante. Os valores de HLB encontram-se disponíveis para tensioactivos, lecitinas, óleos e soluções de veículo ou, se necessário, podem ser determinados por meio de experiências de rotina. Por exemplo, veja-se as patentes de invenção norte-americanas nos 4 504 275 e 4 261 925 e as referências aí citadas.

Os tensioactivos úteis no adjuvante possuem valores de HLB compreendidos entre cerca de 2 e cerca de 2 0 e de preferência entre cerca de 3 e cerca de 17. Como métodos para a determinação do valor de HLB de tensioactivos particulares refere-se os conhecidos na especialidade. Veja-se, por exemplo, as patentes de invenção norte-americanas nos 5 603 951, 4 933 179 e 4 606 918, que descrevem tensioactivos que possuem valores de HLB particulares. A concentração de um tensioactivo numa composição de vacina de acordo com a invenção formulada com o adjuvante está compreendida entre cerca de 1,5% e 3,5% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 3% v/v, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 2,5% e muito mais preferencialmente é de cerca de 2% v/v. no caso de se utilizar mais de um tensioactivo, então a soma das concentrações de todos os tensioactivos utilizados na composição de vacina formulada com o adjuvante também está compreendida entre cerca de 1,5% e 3.5%, mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 3%, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 2,5% e muito mais preferencialmente é de cerca de 2% v/v. A concentração de um tensioactivo no adjuvante também depende da concentração de adjuvante que é utilizada 11 numa composição de vacina. Por exemplo, uma composição de vacina pode ser formulada com o adjuvante de modo que cerca de 25% do volume da composição de vacina seja de adjuvante ("25% de adjuvante") e que os restantes cerca de 75% sejam preenchidos por ouros componentes, por exemplo, a composição de antigénio. De acordo com um aspecto, a concentração de tensioactivo em 25% de adjuvante está compreendida entre cerca de 6% e 14% v/v. Mais preferencialmente, a concentração de tensioactivo em 25% de adjuvante está compreendida entre cerca de 6% e cerca de 12%, ainda mais preferencialmente entre cerca de 6% e cerca de 10% e muito mais preferencialmente é de cerca de 8% v/v. A concentração do tensioactivo no adjuvante depende de factores diferentes. Por exemplo, quanto mais elevada for a concentração de óleo no adjuvante mais tensioactivo será necessário para emulsionar uma composição de vacina formulada com o adjuvante. Um outro factor que é útil para se determinar a concentração de tensioactivo é a concentração da lecitina. Quanto mais elevada for a concentração de lecitina no adjuvante, menos tensioactivo será necessário para a emulsionação.

No caso de o adjuvante ser utilizado numa composição de vacina numa concentração inferior a 25% v/v, então a concentração dos componentes adjuvantes no adjuvante deverá ser aumentada em conformidade. 0 veiculo aquoso constitui uma excepção uma vez que o veiculo compreende sempre o volume que restar não preenchido pelos outros componentes; assim, no caso de a concentração de todos os componentes com a excepção do veiculo aumentar, então a concentração do veiculo no adjuvante irá diminuir e vice-versa. Por exemplo, no caso de o adjuvante ser utilizado numa 12 concentração de cerca de 12,5% v/v numa composição de vacina, então a concentração dos componentes no adjuvante deverão ser o dobro da concentração dos componentes em 25% de adjuvante. De igual modo, no caso de o adjuvante ser utilizado numa composição de vacina numa concentração superior a 25% v/v, então a concentração dos componentes no adjuvante deverá diminuir em conformidade, por exemplo, quando o adjuvante é utilizado numa concentração de cerca de 50% v/v numa composição de vacina, então a concentração dos componentes no adjuvante é de cerca de metade da concentração dos componentes em 25% de adjuvante.

De acordo com uma variante, é possível utilizar dois tensioactivos anfifílicos no adjuvante. De preferência, os dois tensioactivos compreendem um tensioactivo que é mais concentrado numa fase aquosa do que numa fase oleosa do adjuvante ("tensioactivo hidrofílico") e um tensioactivo que é mais concentrado numa fase oleosa do adjuvante ("tensioactivo lipofílico"). Por exemplo, o Tween 80 está mais concentrado numa fase aquosa e o Span 80 está mais concentrado numa fase oleosa. Um tensioactivo hidrofílico preferido possui um valor de HLB compreendido entre cerca de 9 e cerca de 20 e um tensioactivo lipofílico preferido possui um valor de HLB compreendido entre cerca de 2 e cerca de 9. Veja-se as patentes de invenção norte-americanas nos 5 603 951, 4 933 179 e 4 606 918, que descrevem tensioactivos com valores de HLB nos intervalos úteis para o adjuvante.

No caso de se utilizar dois tensioactivos no adjuvante, então a concentração total combinada de ambos os tensioactivos numa composição de vacina formulada com o adjuvante está compreendida entre cerca de 1,5% e 3.5%, 13 mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 3%, ainda mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 2,5% e muito mais preferencialmente é de cerca de 2% v/v. a concentração de cada um dos dois tensioactivos utilizados no adjuvante pode ser diferente entre si. Por exemplo, no caso de se utilizar um tensioactivo hidrofilico e um tensioactivo lipofilico, por exemplo, Tween 80 e Span 80, então a concentração de Tween 80 pode ser cerca de 1,2X a cerca de 5X, mais preferencialmente cerca de 1,5X a cerca de 4X, ainda mais preferencialmente cera de 1,8X a cerca de 3X, muito mais preferencialmente cerca de 2X a cerca de 2,5X e ainda muito mais preferencialmente cerca de 2,3X superior à concentração de Span 80, de preferência quando utilizado num adjuvante com uma concentração de lecitina e de óleo conforme descrito para o adjuvante n° 1. A concentração do tensioactivo hidrofilico utilizado no adjuvante depende, em parte, do tamanho da fase aquosa, e a concentração do tensioactivo lipofilico depende, em parte, do tamanho da fase oleosa. De acordo com uma variante, o adjuvante, que é constituído por uma fase aquosa a 80% v/v e por uma fase oleosa a 20% v/v, pode conter um tensioactivo hidrofilico numa concentração até cerca de 4 vezes (isto é, 80/20) a concentração do tensioactivo lipofilico ou, por exemplo, até cerca de 2 vezes.

Componentes não tensioactivos do adjuvante

Para além de um tensioactivo anfifilico, o adjuvante contém uma lecitina e um óleo. De acordo com um outro aspecto, o adjuvante contém uma solução aquosa de veiculo. 14

Qualquer lecitina conhecida na especialidade é útil para o adjuvante. Como lecitina refere-se uma mistura de fosfatideos. No caso de estar sob a forma de um extracto impuro, a lecitina também pode conter triglicéridos. As lecitinas podem ser de origem vegetal ou animal. Além do mais, as lecitinas podem ser obtidas sinteticamente. Como exemplos de lecitinas refere-se as descritas nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 690 942, 5 597 602 e 5 084 269. De acordo com uma variante preferida, o teor em triglicéridos numa lecitina utilizada no adjuvante é reduzido em comparação com a sua fonte natural, isto é, a lecitina é des-oleada. Há diversos modos conhecidos na especialidade para des-olear uma lecitina, por exemplo, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 597 602. A concentração de lecitina numa composição de vacina formulada com o adjuvante está compreendida entre cerca de 0,25% e cerca de 12,5% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 10% v/v, ainda mais preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 7,5%, muito mais preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 5%, ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 2,5% e muito mais preferencialmente entre cerca de 0,5% e cerca de 1,25% v/v. A concentração de lecitina no 25% de adjuvante é pelo menos de cerca de 1% v/v e de preferência pelo menos de cerca de 2% v/v. De acordo com outro aspecto, a concentração de lecitina no 25% de adjuvante está compreendida entre cerca de 1% e cerca de 50% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 2% e cerca de 40% v/v, ainda mais preferencialmente entre cerca de 2% e cerca de 15 30% v/v, muito mais preferencialmente entre cerca de 2% e cerca de 20% v/v, ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 2% e cerca de 10% v/v e muito mais preferencialmente entre cerca de 2% e cerca de 5% v/v. A concentração de lecitina no adjuvante com uma concentração superior ou inferior é determinada conforme a seguir exemplificado. 0 adjuvante utilizado na invenção contém um óleo, por exemplo, um óleo descrito nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 814 321 e 5, 084,269. De acordo com um aspecto preferido, o adjuvante contém um óleo mineral, por exemplo, DRAKEOL™. De acordo com um outro aspecto, é utilizada uma mistura de óleos. O óleo pode ser fornecido para a preparação do adjuvante sob a forma de um óleo puro ou como uma mistura que contém o óleo e outros componentes, por exemplo, lecitina. A concentração de óleo numa composição de vacina com o adjuvante está compreendida entre cerca de 1% e cerca de 23% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 1,5% e cerca de 20% v/v, ainda mais preferencialmente entre cerca de 2,5% e cerca de 15%, muito mais preferencialmente entre cerca de 3,5% e cerca de 10%, ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 3,5% e cerca de 7,5%, mais preferencialmente entre cerca de 4% e cerca de 6% v/v e mais preferencialmente é de cerca de 4,5%. A concentração de óleo num 25% de adjuvante é pelo menos de cerca de 5% v/v, de preferência pelo menos de cerca de 8% v/v e mais preferencialmente pelo menos de cerca de 12% v/v. De acordo com um outro aspecto, a concentração em óleo num 25% de adjuvante está compreendida entre cerca de 4% e cerca de 92% v/v, mais 16 preferencialmente entre cerca de 6% e cerca de 80% v/v, ainda mais preferencialmente entre cerca de 10% e cerca de 60% v/v, muito mais preferencialmente entre cerca de 14% e cerca de 40% v/v, ainda muito mais preferencialmente entre cerca de 14% e cerca de 30% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 16% e cerca de 24% e muito mais preferencialmente é de cerca de 18%. A concentração em óleo no adjuvante com uma concentração superior ou inferior é determinada conforme a seguir exemplificado.

De acordo com uma outra variante, é utilizado um veiculo aquoso no adjuvante, por exemplo, soluto salino (v.g.r soluto salino tamponado com fosfato), tris-HCl, tampão de citrato-fosfato, tampões de Hepes, outros tampões farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na especialidade ou água. De preferência, o valor de pH do veiculo é fisiologicamente aceitável, por exemplo, entre 6 e 8 e mais preferencialmente aproximadamente 7. De preferência, o veículo aquoso utilizado no adjuvante preenche o volume que não é necessário para qualquer um dos outros componentes.

De preferência, o adjuvante é proporcionado numa concentração compreendida entre cerca de 2X e cerca de 10X a concentração após formulação do adjuvante na composição de vacina, mais preferencialmente entre cerca de 2X e cerca de 8X, ainda mais preferencialmente entre cerca de 3X e cerca de 6X e muito mais preferencialmente cerca de 4X.

Utilizações dos adjuvantes

Os adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imune contra um antigénio de uma formulação em vacina. Os adjuvantes podem ser utilizados com antigénios provenientes de qualquer bactéria ou provenientes de 17 qualquer vírus, desde que o antigénio não seja destruído ou desnaturado. Os antigénios utilizados na invenção são antigénios de Bordetella bronchiseptica e antigénios das estirpes toxigénicas de Pasteurella multocida.

De acordo com uma variante preferida, o adjuvante é utilizado numa composição de vacina que contém antigénios provenientes de uma cultura de B. bronchiseptica que foi inactivada por meio da adição de formalina na fase log, de preferência na fase log tardia, e subsequente adição de glutaraldeído. Para além de matar as células bacterianas, o propósito desta nova e única inactivação é tornar não tóxica a endotoxina e exotoxina de B. bronchiseptica, mantendo os antigénios de células de B. bronchiseptica eficazes na promoção da resposta imune desejada. A formalina é adicionada numa concentração à cultura de B. bronchiseptica compreendida entre cerca de 0,2% v/v e cerca de 1% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 0,4% v/v e cerca de 0,8% v/v e ainda mais preferencialmente de cerca de 0,6% v/v. O glutaraldeído é adicionado decorridos entre cerca de 10 minutos e cerca de 40 minutos após a adição de formalina à cultura, mais preferencialmente entre cerca de 15 minutos e cerca de 30 minutos e mais preferencialmente decorridos cerca de 20 minutos. O glutaraldeído é adicionado numa concentração à cultura de B. bronchiseptica compreendida entre cerca de 0,2% v/v e cerca de 1% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 0,4% v/v e cerca de 0,8% v/v e ainda mais preferencialmente de cerca de 0,6% v/v. Antes de se adicionar o glutaraldeído à cultura, este possui uma concentração compreendida entre cerca de 10% v/v e cerca de 50% v/v, mais preferencialmente entre cerca de 15% v/v e cerca de 35% v/v e ainda mais preferencialmente 18 de cerca de 25% v/v. Após a adição de formalina e de glutaraldeído à cultura de B. bronchiseptica, mantém-se a mistura resultante a incubar sob agitação a uma temperatura compreendida entre cerca de 32°C e cerca de 42°C, mais preferencialmente entre cerca de 35°C e cerca de 39°C e ainda mais preferencialmente a cerca de 37°C. Mantém-se a mistura a incubar durante cerca de 12 horas a cerca de 60 horas, mais preferencialmente entre cerca de 24 horas e cerca de 48 horas. Todos os outros passos de processamento para a preparação de uma composição de antigénio da invenção a partir de uma cultura de B. bronchiseptica encontram-se descritos no exemplo 7, infra, e nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 019 388 e 4 888 169.

Composições de vacina que compreendem adjuvantes e sua administração O adjuvante aqui descrito podem ser utilizado numa formulação em vacina para imunizar um animal. De acordo com uma variante, a formulação em vacina contém o adjuvante e um antigénio. As proporções óptimas de cada componente na formulação em vacina podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria. A formulação em vacina pode ser administrada a um sujeito per se ou sob a forma de uma composição farmacêutica ou terapêutica. As composições farmacêuticas que compreendem o adjuvante e um antigénio podem ser preparadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, polimento, emulsionação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de um modo convencional utilizando um ou vários veículos, 19 diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis, que facilitem o processamento dos antigénios da invenção em preparações que possam ser utilizadas farmaceuticamente. Uma formulação adequada depende da via de administração seleccionada. Para propósitos da presente memória descritiva, a expressão "veículo fisiologicamente aceitável" compreende os veículos que são aceitáveis para utilização em seres humanos ou animais sem apresentarem efeitos secundários relativamente nocivos (em relação à patologia que se pretende tratar), bem como diluentes, excipientes ou auxiliares que sejam, de igual modo, aceitáveis.

Como formulações sistémicas refere-se as concebidas para administração por injecção, v.g., injecção por via subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intraperitoneal.

Para injecção, as preparações de vacina podem ser formuladas sob a forma de soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringer, soluto salino tamponado com fosfato ou qualquer outro tampão de soluto salino fisiológico. A solução pode conter agentes auxiliares de formulação, tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Em alternativa, as proteínas podem estar sob a forma de pós para constituição com um veiculo adequado, v.g., água estéril isenta de pirogénio, antes da sua utilização. A determinação de uma quantidade eficaz de uma formulação em vacina para administração faz parte das capacidades dos especialistas na matéria, em particular à luz da descrição minuciosa aqui apresentada. 20

Uma dose eficaz pode ser estimada, inicialmente, a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para se atingir a indução de uma resposta imune utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade. Um especialista na matéria poderá optimizar rapidamente a administração para todas as espécies animais com base nos resultados aqui descritos. A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente. Por exemplo, no caso de ser utilizada como vacina, as formulações em vacina da invenção podem ser administradas em cerca de 1 a 3 doses durante um periodo entre 1 e 36 semanas. De preferência, são administradas 1 ou 2 doses em intervalos de cerca de 3 semanas a cerca de 4 meses, sendo possível administrar posterior e periodicamente vacinações de reforço. Há protocolos alternativos que podem ser adequados para animais individuais. Uma dose adequada designa uma quantidade da formulação em vacina que, quando administrada conforme descrito antes, é capaz de promover uma reposta imune num animal imunizada que seja suficiente para proteger o animal de infecção pelo menos durante 4 a 12 meses. De um modo geral, a quantidade de antigénio presente numa dose está compreendida entre cerca de 1 pg e cerca de 100 mg por kg de hospedeiro, tipicamente entre cerca de 10 pg e cerca de 1 mg e preferencialmente entre cerca de 100 pg e cerca de 1 pg. O intervalo de dose adequada irá variar consoante a via de injecção e o tamanho do paciente, mas está normalmente compreendido entre cerca de 0,1 mL e cerca de 5 mL.

Após a descrição da invenção, os exemplos seguintes são apresentados a título ilustrativo e não limitativo. 21

Exemplo 1. Utilização de um adjuvante que contém óleo e lecitina 0 exemplo seguinte descreve a utilização de um adjuvante que contém lecitina des-oleada dissolvida num óleo ("adjuvante de óleo-lecitina"), normalmente um óleo mineral (parafina leve liquida) em vacinas para utilização veterinária. Veja-se a patente de invenção norte-americana n° 5 084 269, que descreve um adjuvante de óleo-lecitina. Uma preparação de vacina utilizando um adjuvante de óleo-lecitina é uma emulsão de óleo-em-água.

Todas as percentagens de concentrações são aqui apresentadas em volume por volume, salvo quando indicado de outro modo. Os valores em percentagem, salvo quando indicado de outro modo, de um adjuvante de óleo-lecitina dizem respeito à concentração de uma mistura de lecitina (10% da mistura) e de um óleo veiculo (DRAKEOL™) (90% da mistura) num veiculo aquoso (fase contínua). Por exemplo, um adjuvante de óleo-lecitina a 20% contém 2% v/v de lecitina (Central Soya, Fort Wayne, Indiana), 18% v/v de DRAKEOL™ 5 (Penreco, Karns City, Pennsylvania) e 80% v/v de uma solução de soluto salino (em que o teor em soluto salino é reduzido se forem adicionados outros componentes, por exemplo, tensioactivos). Os valores em percentagem de um adjuvante de óleo-lecitina numa composição de vacina, isto é, após diluição da solução de adjuvante com a solução de antigénio, dizem respeito à concentração de uma mistura de lecitina (10% da mistura) e de um óleo de veículo (DRAKEOL™) (90% da mistura) numa preparação de vacina que compreende o adjuvante e uma solução que contém um antigénio, salvo indicado no contexto de outro modo. Em todos os casos no qual seja adicionado um tensioactivo a 22 uma composição de adjuvante, os valores em percentagem para a concentração de tensioactivo dizem respeito à concentração total de todos os tensioactivos adicionados ao adjuvante ou à preparação de vacina, salvo que indicado no contexto de outro modo.

No caso de se utilizar um adjuvante de óleo-lecitina como adjuvante em formulações em vacina, então concluiu-se que este não emulsiona as preparações aquosas sem se adicionar tensioactivos suplementares, tais como a lecitina no adjuvante de óleo-lecitina são é suficiente para a emulsionação. Assim sendo, as vacinas preparadas utilizando o adjuvante de óleo-lecitina inadequadamente disperso formaram um conjunto ou um depósito principalmente de óleo mineral nos tecidos nos locais de injecção. Este óleo não pode ser metabolizado ou removido pelo animal injectado e permanece assim como fonte de inflamação ou cicatrização crónica e grave.

Também se concluiu que a adição de tensioactivos a uma formulação em vacina que compreende um adjuvante de óleo-lecitina e um antigénio para se emulsionar a formulação não constitui uma solução adequada. Foram encontrados problemas durante a adição do óleo e dos tensioactivos à formulação em vacina antes da emulsionação, uma vez que o antigénio poderia ser danificado e, se não se alcançasse uma emulsão adequada, que a formulação teria de ser deitada fora incluindo o antigénio importante.

Foram testadas composições de adjuvante diferentes que compreende um adjuvante de óleo-lecitina em combinação com tensioactivos para emulsionar as formulações em vacina. 23

Exemplo 2. Utilização de um adjuvante que contém um tensioactivo numa concentração reduzida 0 exemplo seguinte descreve a utilização de uma emulsão que contém 40% de óleo-lecitina e 2% de tensioactivos sintéticos, isto é, Tween 80 e Span 80 (Van Water and Rogers, Omaha, Nebraska) em soluto salino tamponado com fosfato. Este adjuvante foi preparado de um modo asséptico e em separado do antigénio. A emulsão foi adicionada à preparação de antigénio sem emulsionação suplementar. Os tensioactivos sintéticos auxiliaram o adjuvante de óleo-lecitina a se dispersar como uma emulsão grosseira relativamente estável. A emulsão de adjuvante foi adicionada à preparação aquosa de antigénio à razão de um para oito, diminuindo o teor em adjuvante de óleo-lecitina de 40% para 5% e o teor em tensioactivos de 2% combinado até 0,25%. 0 adjuvante foi utilizado em diversas vacinas. Concluiu-se que devido à emulsão ser grosseira e não muito estável, as goticulas de óleo possuem a tendência de coalescer e de se separar como um depósito permanente e irritante de óleo nos tecidos injectados. Um outro problema observado com este adjuvante foi o facto de se agregar com gel AI. Há diversas vacinas que contêm gel AI para diversos fins, por exemplo, como adjuvante ou para estabilizar um antigénio ou para ligar endotoxinas. 0 adjuvante de óleo-lecitina possui uma carga negativa que faz com que este se ligue ao gel AI carregado positivamente para se formar agregados grosseiros.

Estes agregados são ligeiramente difíceis para passar através de uma agulha hipodérmica e muito irritantes para os tecidos injectados. 24

Exemplo 3. Utilização de um adjuvante que contém um tensioactivo numa concentração elevada

Efectuou-se a emulsão de um adjuvante de óleo-lecitina (5% v/v) na preparação de antigénio com o auxilio dos tensioactivos Tween 80 e Span 80, conforme descrito antes, mas com uma concentração total em tensioactivo de 8% na composição de vacina. A emulsão era muito fina e estável. Apresentava praticamente a clareza de uma solução e em repouso não formava um creme. Ao microscópio, com uma amplificação máxima (resolução de 0,2 micron), a maior parte das goticulas eram demasiado pequenas para serem visíveis. Assim, esta era uma microemulsão. Concluiu-se que este adjuvante, quando utilizado numa formulação em vacina, estar praticamente isento de reactividade no local de injecção e, quando se adicionava gel Al, não se detectava qualquer agregação de óleo e gel. Como resultado do seu elevado teor em tensioactivo, este adjuvante é fácil de emulsionar, atractivo em termos de aparência, estável, não reactivo com gel Al e praticamente isento de efeitos de irritação no local de vacinação. No entanto, apesar destas vantagens, esta emulsão apresentou uma potência ligeiramente inferior em comparação com a versão grosseira preparada com uma concentração reduzida de tensioactivos.

Exemplo 4. Utilização de um adjuvante que contém um tensioactivo numa concentração média

Foi efectuada uma tentativa para se encontrar uma emulsão de adjuvante que seja aceitável sob o ponto de vista de suavidade e bastante potente como adjuvante. Utilizou-se um adjuvante de óleo-lecitina a 20% nestas 25 experiências e concluiu-se que uma emulsão de adjuvante de óleo-lecitina a 20% é mais fácil de preparar do que uma emulsão de adjuvante de óleo-lecitina a 40%. A sua adição a vacinas a uma taxa de um para quatro, para se obter uma concentração em óleo final de 5%, deixaria 75% do volume da dose para antigénios. Experiências preliminares revelaram que uma emulsão submicron suave (a maior parte das goticulas possuia um diâmetro inferior a um micron, ver figura 1) podia ser preparada com 20% de óleo e 16% dos tensioactivos Tween 80 e Span 80.

Foram preparadas duas emulsões para os ensaios. Uma delas continha um adjuvante de óleo-lecitina a 20% e 16% de tensioactivos Tween 80 e Span 80. A sua diluição à razão de um para quatro, proporcionou uma emulsão que compreende 5% de adjuvante de óleo-lecitina e 4% de tensioactivos na preparação em vacina. Preparou-se a outra emulsão com 40% de adjuvante de óleo-lecitina e 2% de tensioactivos Tween 80 e Span 80. A sua diluição na razão de um para oito, proporcionou uma emulsão com 5% de adjuvante de óleo-lecitina e 0,25% de tensioactivos.

Adicionou-se gel AI (REHYDRAGEL™ proveniente de Reheis, Berkeley Heights, New Jersey) numa concentração de 10% a amostras de cada emulsão. Na emulsão com 0,25% de tensioactivos o óleo e o gel AI agregaram-se e separaram-se para forma uma camada espessa no topo da coluna de liquido (formação de creme) . Pelo contrário, na emulsão com 4% de tensioactivos, não se observou agregação ou formação de creme. Com 4% de tensioactivos, o gel AI sedimentou no fundo do tubo deixando as goticulas de óleo dispersas no fluido sobrenadante. 26

Exemplo 5. Inchaço nos locais de injecção durante a utilização de um adjuvante que contém um tensioactivo com uma concentração média

As preparações em vacina foram testadas em porcos para se determinar se tinha lugar o inchaço do local de injecção quando se utilizou um adjuvante com uma concentração média de tensioactivo. As preparações em vacina que continham 5% de adjuvante de óleo-lecitina 0,25% ou 4% de tensioactivos não provocaram qualquer inchaço em porcos no local de injecção. Quando se adicionou gel AI à preparação em vacina numa concentração de 10%, a preparação com 0,25% de tensioactivos provocou inchaços graves no local da injecção ao passo que a preparação com 4% de tensioactivos não provocou praticamente inchaço.

Foram realizadas experiências para se determinar o intervalo de concentrações de tensioactivos que são eficaz para prevenir a agregação com gel AI e inchaço no local de injecção. Quando se utiliza uma concentração de 1,5% de tensioactivo na vacina, observa-se uma ligeira agregação de óleo e de gel AI. A agregação foi muito superior para concentrações inferiores de tensioactivo. Para concentrações de 2% e 4% de tensioactivo, não se observou agregação. O inchaço induzido em porcos pelas preparações em vacina que contêm 0,5% ou uma quantidade inferior de tensioactivos foi superior às 2 e 4 semanas após a vacinação do que o induzido pelas preparações com 1% ou uma quantidade superior de tensioactivos. Seis semanas após a vacinação, foi evidente que uma quantidade de 1,5% de tensioactivos era a quantidade mínima para se evitar inchaços crónicos. 27

Exemplo 6. Adjuvantes com propriedades úteis in vitro e in vivo

Foram realizados ensaios para se descobrir um adjuvante que não reaja com gel AI e que não dê origem a reactividade no animal após a vacinação. Determinou-se que um adjuvante de óleo-lecitina a 20% que contém 8% de tensioactivos, dando origem a uma preparação em vacina com 5% de adjuvante de óleo-lecitina e 2% de tensioactivo, era suficiente para evitar a reactividade in vitro com gel Al e a irritação dos tecidos no local de vacinação. Não foi tão evidente a relação entre a concentração de tensioactivo e a potência do adjuvante. Foram verificadas indicações ocasionais que 4% de tensioactivos na vacina era uma quantidade excessiva, v.g., na indução de aglutinina para E. coli K99 e neutralização da antitoxina para a toxina de P. multocida de tipo D.

Assim, determinou-se que a concentração óptima de tensioactivos era de 8% num adjuvante de óleo-lecitina a 20%, resultando em 2% de tensioactivos na composição de vacina. Tal proporcionou uma emulsionação razoavelmente fácil e uma boa estabilidade no armazenamento a frio. Nas vacinas com 5% de adjuvante de óleo-lecitina, 2% de tensioactivos constituiu o valor ideal para a potência do adjuvante e para a ausência de irritação nos tecidos injectados.

Determinou-se o tamanho das goticulas na emulsão submicron de um adjuvante de óleo-lecitina a 20% com 8% de tensioactivos. Os 8% de tensioactivo consistiam em 5,6% de Tween 80 na fase aquosa e 2,4% de Span 80 na fase oleosa. Cerca de 94% de todas as goticulas possuíam um diâmetro inferior a 1 mícron, veja-se a figura 1. 28

Preparou-se uma solução de reserva de 1000 mL de 20% de adjuvante de óleo-lecitina com 8% de tensioactivos a partir de 200 mL de uma solução de lecitina-óleo esterilizada por filtração (10% de lecitina em óleo mineral DRAKEOL™) , submeteu-se a autoclave com Tween 80 (56 mL) e Span 80 (24 mL) e soluto salino tamponado com fosfato (720 mL) (Dulbecco PBS). Combinou-se a solução de lecitina-óleo e Span 80 e misturou-se num tanque estéril pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente até se completar a emulsionação. Combinou-se o soluto salino e o Tween 80 e misturou-se num tanque estéril pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente. Emulsionou-se a mistura oleosa na mistura aquosa utilizando um emulsionador. Manteve-se a emulsionação por recirculação até se ter adicionado todo o adjuvante ao soluto salino. Fez-se então passar a emulsão duas vezes através de um homogeneizador à temperatura ambiente. Armazenou-se o adjuvante a uma temperatura compreendida entre 2°C e 8°C.

Exemplo 7. Vacina contra rinite atrófica utilizando um adjuvante que contém um tensioactivo numa concentração média

Utilizou-se o adjuvante, conforme descrito no exemplo 4 com uma concentração média de tensioactivos, numa vacina para rinite atrófica que continha antigénios de Bordetella bronchiseptica e de Pasteurella multocida toxigénicos. Preparou-se uma vacina bacterina-toxóide Bordetella bronchiseptica-Pasteurella multocida a partir de células de B. bronchiseptica e do toxóide de P. multocida.

Preparou-se células de B. bronchiseptica, estirpe 2-9 NADL, conforme descrito nas patentes de invenção norte- 29 americanas nos 5 019 388 e 4 888 169, com a excepção de no final do ciclo de crescimento, as culturas terem sido continuamente misturadas e se ter adicionado a solução de formalina numa concentração final de 0,6%. Vinte minutos após a adição de formalina, adicionou-se uma solução de glutaraldeido a 25% numa concentração final de 0,6%. Agitou-se a cultura durante 24 a 48 horas a uma temperatura de 37°C ± 2°C para se completar a inactivação e desintoxicação (veja-se o quadro 1). Depois, arrefeceu-se os fluidos de cultura até 15°C ou inferior para processamento. As culturas inactivadas não processadas imediatamente foram armazenadas a uma temperatura compreendida entre 2°C e 8°C até um máximo de 14 dias. Após a inactivação, separou-se as bactérias a partir do fluido de cultura por centrifugação. Deitou-se fora o sobrenadante e colocou-se novamente em suspensão as células em soluto salino tamponado com fosfato em aproximadamente um décimo do volume original. Armazenou-se a suspensão concentrada a uma temperatura compreendida entre 2o e 8°C. O tratamento de B. bronchiseptica com dois aldeídos inactiva a endotoxina e a exotoxina, antecipando outros tratamentos para segurança.

Preparou-se o toxóide de P. multocida em duas formas diferentes, conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas nos 5 536 496 e 5 695 769. De acordo com uma das formas, a toxina é transformada em toxóide dentro das células bacterianas por meio da adição de formaldeído à cultura; o toxóide permanece dentro das células. De acordo com a outra forma, as células vivas são mecanicamente perturbadas e a toxina é extraída. A toxina é transformada em toxóide por meio da exposição a um pH elevado, conforme 30 descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 536 496. Ambas as formas de toxóide são tratadas com gel AI para controlar a endotoxina livre por meio de um processo patenteado, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 616 328 (veja-se o quadro 1) . Uma sinergia entre as duas formas do toxóide de pasteurella dá origem a respostas anti-toxina que excedem em larga escala a soma das respostas para cada forma quando utilizadas por si sós, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 695 769.

Quadro 1: tratamento de células durante a preparação da vacina bacterina-toxóide de Bordetella bronchiseptica- -Pasteurella multocida

Antigénio Inactivador Concentração Intervalo de temperatura alvo Tempo (min./Max.) B. bronchiséptica Formalina Glutaraldeido 0, 6% 0, 6% 37°C ± 2°C 24-48 horas Célula de P. multocida ligada ao toxóide Formalina 0, 4% U) -J o O 1+ NJ o O 5 dias Célula de P. multocida isenta de toxóide NaOH 5 N pH 10 ± 0,2 15°C ± 2°C 1 a 6 horas

Adicionou-se o adjuvante descrito no exemplo 4 para se obter concentrações de 5% de adjuvante de óleo-lecitina e 2% de tensioactivos na formulação em vacina.

Efectuou-se um ensaio para se determinar a dose de imunização minima da vacina para rinite atrófica que demonstrou as propriedades adjuvantes do adjuvante com uma concentração média de tensioactivos. Vacinou-se porcos 31 fêmea grávidos com duas doses de 2 mL num intervalo de 4 semanas. 0 parto teve lugar cerca de 2 semanas após a segunda dose. Com um mês de idade, os seus porcos foram submetidos a um estímulo grave, constituído por culturas virulentas de B. bronchiseptica e de P. multocida administradas sequencialmente por via intranasal. Os porcos nascidos a partir dos 7 porcos fêmeas vacinados apenas com placebo desenvolverem rinite atrófica grave. As crias dos 7 porcos fêmeas aos quais se tinha administrado a vacina que continha uma dose completa de antigénios estavam fortemente protegidos pelo anticorpo materno ainda em circulação. Aos porcos que se tinha administrado vacinas que continham 1/2 ou 1/8 da dose de antigénios não proporcionaram às suas crias uma protecção satisfatória. 32

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição us 5084269 A [0004] [0005] [0023] [0037] [0040] [0054] us 4888169 A [0006] [0046] [0073] us 5578308 A [0007] us 5690942 A [0026] [0037] us 5376369 A [0026] us 4933179 A [0026] [0028] [0033] us 4606918 A [0026] [0028] [0033] us 4504275 A [0027] us 4261925 A [0027] us 5603951 A [0028] [0033] us 5597602 A [0037] us 5814321 A [0040] us 5019388 A [0046] [0073] us 5536496 A [0074] us 5695769 A [0074] us 5616328 A [0074]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição de antigénio que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica que foi inactivada por meio da adição de formalina e subsequente adição de glutaraldeído.

2. Composição de vacina que compreende a composição de antigénio de acordo com a reivindicação 1 e um adjuvante.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 2, em que o referido adjuvante compreende entre cerca de 0,25% e cerca de 12,5% volume/volume (v/v) de uma lecitina, entre cerca de 1% e cerca de 23% v/v de um óleo e entre cerca de 1,5% e 3,5% v/v de pelo menos de um tensioactivo anfifilico.

4. Método para a inactivação de uma cultura de Bordetella bronchiseptica que compreende a adição de formalina à referida cultura e subsequente adição de glutaraldeído à referida cultura.

5. Composição de Bordetella bronchiseptica que compreende uma cultura de Bordetella bronchiseptica, formalina e glutaraldeído.

6 . Vacina para a protecção de um mamífero contra uma infecção por Bordetella bronchiseptica que compreende entre cerca de 1 pg a cerca de 100 mg por kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica provenientes de uma cultura inactivada de acordo com o método descrito na reivindicação 4, eficaz para a protecção do referido 2 mamífero contra uma infecção por Bordetella bronchiseptica, e um veículo fisiologicamente aceitável.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 6, que compreende entre cerca de 10 pg a cerca de 1 mg por kg do hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, que compreende entre cerca de 100 pg a cerca de 1 pg por kg de hospedeiro de células de Bordetella bronchiseptica.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 6, que compreende ainda entre cerca de 1 pg a cerca de 100 mg por kg do hospedeiro de antigénios de Pasteurella multocída toxigénica, eficaz para a protecção de um mamífero contra uma infecção por Pasteurella multocída toxigénica.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 9, que compreende entre cerca de 10 pg a cerca de 1 mg por kg do hospedeiro de antigénios de Pasteurella multocída toxigénica.

11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, que compreende entre cerca de 100 pg a cerca de 1 pg por kg do hospedeiro de antigénios de Pasteurella multocída toxigénica.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 9 para a protecção de um porco contra uma infecção por Bordetella bronchiseptica e/ou uma infecção por Pasteurella multocída toxigénica. 3

13. Utilização de uma vacina de acordo com a reivindicação 9 para a preparação de uma vacina para proteger um porco contra uma infecção por Bordetella bronchiseptica e/ou uma infecção por Pasteurella multocida toxigénica.

14. Utilização de uma vacina de acordo com a reivindicação 9 para a preparação de uma vacina para a protecção de um leitão contra rinite atrófica por meio de: a) vacinar um porco antes do parto e durante a gravidez com uma quantidade da vacina de acordo com a reivindicação 9, a qual é eficaz para proporcionar anticorpos anti-Bordetella bronchiseptica e anticorpos anti-Pasteurella multocida toxigénica no colostro produzido pelo referido porco fêmea e b) proporcionar o colostro produzido pelo referido porco fêmea ao leitão nas 24 horas subsequentes ao nascimento do leitão.

15. Vacina de acordo com a reivindicação 9 para a protecção de um leitão contra rinite atrófica, por meio de: a) vacinar um porco antes do parto e durante a gravidez com uma quantidade da vacina de acordo com a reivindicação 9, a qual é eficaz para proporcionar anticorpos anti-Bordetella bronchiseptica e anticorpos anti-Pasteurella multocida toxigénica no colostro produzido pelo referido porco fêmea e b) proporcionar o colostro produzido pelo referido porco fêmea ao leitão nas 24 horas subsequentes ao nascimento do leitão.