TW585777B - Adjuvants for use in vaccines and vaccines comprising the same - Google Patents

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 A7 __ B7 五、發明說明（1 ) 發明範圍 本發明係關於佐劑。特定言之，本發明係關於內含水 包油乳狀液及界面活性劑之佐劑。本發明之佐劑適用於各 種疫苗調製劑，包括內含細菌或病毒成分的疫苗。 發明背景 控制疾病的一種強效方法是對感染性生物體產生免疫 力能引發抗感染免疫力之抗原即爲免疫原。其所引發之 保護抗體能與其他天然的防禦系統共同合作抑制感染，或 其可中和感染生物體中有害的產物（例如毒素）。 提高抗體反應的有效方法係使用佐劑。疫苗內之佐劑 可作爲添加劑或載劑以強化對抗原之反應。佐劑能經不同 機制來作用，包括（1 )在身體內捕捉抗原引起緩慢釋放 ，（2 )吸引免疫系統細胞到注射位點，（3 )刺激免疫 系統細胞增殖及活化，及（4 )改進抗原在接受者體內之 分散效應。 許多具有多種化學性質的藥劑可作爲佐劑，包括：油 乜水及水包油乳狀液、礦物鹽類、多核苷酸及天然的物質 。其中一種佐劑（商標爲AMPHIGENTM )係描述於 U.S. Patent No. 5,084,269。AMPHIGENtm 佐係由溶於油（ --般爲輕液體石蠟）中之脫脂的卵磷脂組成。疫苗製劑 AMPHIGEN丁M係分散於一種免疫抗原之水溶液或懸浮液中作 爲水包油乳狀液。 依據上述之 U.S.Patent No. 5,084,269 使用 AMPHIGENtm ----ll· I ΙΊ----------訂 -------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -4- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 A7 B7 五、發明說明（2) 佐劑則觀察到一些問題。例如，AMPHIGENtm內含之卵磷月旨 不足以產生穩定的油乳狀液，因此在注射組織內導致油類 堆積或儲存。由於礦物油無法被動物代謝或移除。因而此 油類往往是造成嚴重的慢性炎症及結疤的原因。直接在免 疫性的製劑中乳化AMPHIGENtm有破壞抗原的危險。同時若 無法形成所欲求之乳狀液，便必須拋棄此種貴重抗原。 因而急於需求一種有效且能解決上述問題之動物（包 括人類）用疫苗之佐劑。 發明摘要 本發明係關於一種用以增進動物對抗原免疫反應之佐 劑。特定言之，本發明係關於能在一種疫苗組合物中形成 水包油乳狀液之佐劑。本發明亦關於一種佐劑，在作爲疫 苗調製劑使用時，其在接種位點上引起的炎症及結疤最小 。本發明進一步的係關於內含本發明佐劑之疫苗調製劑。 最後，本發明係關於使用本發明佐劑進行接種之方法。 在具體實施例之一中，本發明之佐劑內含卵磷脂、油 及兩性界面活性劑（其能乳化佐劑），例如：Tween或 Span界面活性劑。在其他較佳的特色中，界面活性劑爲 Tween 80、Tween 85、Span 80 或 Span 85。 另一具體實施例中，本發明佐劑包含卵磷脂、油及兩 種兩性界面活性劑（其能乳化佐劑）或一種含佐劑之疫苗 組合物。於較佳的特色中，兩種界面活性劑其中之一主要 係位於水相，例如Tween 80，而另一種界面活性劑主要係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ^1 ϋ ϋ ·£ IT n ϋ ϋ I a^i I a^i I 一 δπ ϋ I— I ·ϋ ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5- 585777 A7 B7 五、發明說明（3) 位於油相，例如Span 80。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卵磷脂爲一種磷脂酸鹽。卵磷脂粗製劑包括三酸甘油 酯。在本發明中 ''卵磷脂〃包括經純化的製劑及粗製劑。 於較佳的特色中，卵磷脂爲脫脂的卵磷脂。 適用的油類包括礦物油，例如DRAKE〇LTM輕礦物油。 於進一步的具體實施例中，本發明佐劑內含一種水溶 性載體溶液，例如：生理上可接受的緩衝溶液、水或生理 食鹽水溶液。 較佳的具體實施例中，本發明佐劑內含卵磷脂、礦物 油、兩種兩性界面活性劑及一種水溶性載體溶液（例如： 生理食鹽水）。 本發明另一具體實施例係說明利用福馬林及戊二醛將 支氣管敗血性波得氏桿菌（'' B . b r ο n c h i s e p t i c a 〃 ）培養液 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 去活化之方法。於另一特色中，其所用的支氣管敗血性波 得氏桿菌培養液係經福馬林及戊二醛去活化。於另一特色 中，其所用的支氣管敗血性波得氏桿菌培養液抗原組合物 係經福馬林及戊二醛去活化。另一特色中，其所用的疫苗 組合物內含由經福馬林及戊二醛去活化之支氣管敗血性波 得氏桿菌培養液組成之抗原組合物。 圖形簡述 圖1描述以下乳狀液製劑中液滴大小之分佈圖。線（ a )及（b )顯示約9 4 %液滴之直徑爲1微米或以下。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -6- 585777 A7 _ B7 五、發明說明（4 ) 發明之詳細說明 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於一種用以增進抗原免疫反應之佐劑。特 定言之，本發明係關於能乳化疫苗調製劑之油狀佐劑。此 外’本發明係關於用於疫苗調製劑之佐劑，其能在注射位 點上確實的避免由內含礦物油之疫苗引起的典型炎症或結 _。本發明佐劑內含卵磷脂、油及兩性界面活性劑（能乳 化佐劑）或一種內含佐劑之疫苗組合物。 本發明係基於硏究發現，將約1 · 5 % V / V (即 1· 5%體積/體積濃度，例如混合98·5體積內含佐 劑之疫苗與1 · 5 %體積兩性界面活性劑）至3 · 5 % v / v之兩性界面活性劑添加於u.S. Patent N〇.5,084,269 提及之內含佐劑之疫苗中即能有效地將內含佐劑之疫苗組 合物乳化，且可將接種動物注射位點上之過敏降到最小。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具體實施例之一中，本發明佐劑含有卵磷脂、油及一 種兩性界面活性劑。具體實施例之一中，本發明佐劑含有 卵磷脂、油及一種兩性界面活性劑（能將內含本發明佐劑 之疫苗組合物乳化）。於另一較佳的具體實施例中，本發 明佐劑使用兩種兩性界面活性劑，例如Tween及Span界面 活性劑。 較佳的佐劑稱爲'' Ν ο · 1佐劑〃，內含約2 % v / v卵磷脂、約1 8 % v / v礦物油、及約8 % v / v界面 活性劑（例如：約5 · 6 % v / v Tween 80及約2 · 4 % v / v Span 80 )，其餘的體積是生理食鹽水溶液。於較 佳的特色中’疫苗組合物內含之抗原濃度約7 5 % v / v 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 Α7 Β7 五、發明說明（5) ，而佐劑（較佳者爲Ν ο · 1佐劑）之濃度約2 5 % v / v疫苗組合物。若未特別說明，則所有濃度百分比係用體 積/體積表示。 本發明佐劑中使用之界面活性劑 本發明佐劑中使用之界面活性劑爲兩性及獸醫或醫學 上可接受的界面活性劑。一般熟悉此技藝的專業人士可判 定是否爲獸醫或醫學上可接受的特定界面活性劑。界面活 性劑分子中一部份爲疏水性及一部份爲親水性即爲兩性界 面活性劑。參見 U.S. Patent Nos. 5,690,942; 5,376,369; 4,93 3，179及4,606,9 1 8，其係描述可用於本發明佐劑之界面 活性劑。本發明佐劑使用的界面活性劑之實施例，包括（ 但非限於）：Tween界面活性劑及Span界面活性劑。

Tween及Span界面活性劑，包括（但非限於）：單月桂酸 酯（Tween20，Tween 21，Span 20)、單棕欄酸鹽（

Tween 40、Span 40)、單硬脂酸鹽（Tween 60、

Tween 61、Span 60)、三硬脂酸鹽（Tween 65、

Span 65 )、單油酸酯（Tween 80 、 Tween 81 、 Span 80 )及三油酸酯（T w e e n 8 5、S p a n 8 5 )。較佳的具體實施 例中使用 Tween 80、Tween 85、Span 80或 Span 85。 適用於本發明佐劑之界面活性劑以兩性界面活性劑較 佳，且其親水性一親脂性平衡値（H L B 〃 ）以至少約 爲佐劑中所有其他成分之H L Β總合値之一半較佳。更佳 之界面活性劑其H L Β値約爲佐劑中所有其他成分之 H L Β總合値之一半至約兩倍。更佳之界面活性劑其 ------L---Ί--裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -8- 585777 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__一 五、發明說明（6 ) H L B値約爲所有其他佐劑成分η L B總合値大約相同。 各界面活性劑、卵磷脂、油及載體溶液之H L Β値均易於 查得，視須要可由一般實驗測定。例如，參見U.S. Patent

Nos. 4,504,275及4,26 1,9 25及本文之參考文獻。 本發明佐劑使用之兩性界面活性劑其H L B値約2至 約2 0 ’較佳者約3至約1 7。測定特定界面活性劑 H L Β値之方法爲已知的技藝。參見，例如：u.S. Patents

Nos· 5,603,95 1;4,933，179 及 4,606,9 1 8，其係描述具有特定 H L B値的界面活性劑。 在內含本發明佐劑之疫苗組合物中，界面活性劑濃度 約1 · 5 %至3 · 5 % ν / ν，較佳者約1 · 5 %至約3 % ν / ν，更佳者約1 · 5 %至約2 · 5 %，及最佳者約 2 % ν / ν。當使用一種以上之界面活性劑時，所有含本 發明佐劑之疫苗組合物中其界面活性劑濃度總合約1 · 5 %至3 · 5 %，較佳者約1 · 5 %至約3 %，更佳者約 1 · 5 %至約2 · 5 %，及最佳者約2 % ν / ν。 本發明佐劑中界面活性劑濃度亦視疫苗組合物所用之 佐劑濃度而定。例如，疫苗組合物可與本發明佐劑調配， 約2 5 %疫苗組合物之體積爲佐劑2 5 %佐劑〃）而 其餘大約7 5 %爲其他成分，例如抗原組合物。其中， 2 5 %佐劑中之界面活性劑濃度約6 %至1 4 % ν / ν。 較佳者，2 5 %佐劑中之界面活性劑濃度約6 %至約1 2 %，更佳者約6 %至約1 0 %，及最佳者約8 % ν / ν。 本發明佐劑中界面活性劑之濃度視不同之因素而定。 ------卜丨丨；-丨•裝--------訂---------^9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -9 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 Α7 Β7 五、發明說明（7 ) 例如，佐劑中若含較高濃度的油即須用更多之界面活性劑 乳化含本發明佐劑之疫苗組合物。用於判定界面活性劑濃 度之另一因素爲卵磷脂濃度。佐劑若含較高濃度的卵磷脂 ，則需較少之界面活性劑進行乳化。 當疫苗組合物中使用之本發明佐劑濃度少於2 5 % v / v時，佐劑成分中之佐劑濃度必須增加。水溶性載體則 例外，因爲此載體包含其他成分之外之體積；因此若所有 成分（除了載體外）之濃度增加，則佐劑中載體濃度將會 降低，反之亦然。例如疫苗組合物中使用之佐劑其濃度約 爲12.5%7/7時，其成分中佐劑之濃度約是25% 佐劑濃度之兩倍。同樣地，當疫苗組合物使用之本發明佐 劑濃度大於2 5 % v / v時，佐劑之濃度成分必須降低， 例如當疫苗組合物中使用之佐劑濃度約5 0 % v / v時， 其佐劑成分之濃度約爲2 5 %佐劑下濃度成分的一半。 具體實施例之一中，本發明佐劑中兩種兩性界面活性 劑均可使用。較佳者，兩種界面活性劑包括一種在水相佐 劑中較油相佐劑中濃的界面活性劑親水性的界面活性 劑〃）及一種在油相佐劑中較濃的界面活性劑（a親脂的 界面活性劑〃）。例如，Tween 80在水相中較濃，

Span 80在油相中較濃。較佳的親水性的界面活性劑其 H L B値約9至約2 0，較佳的親脂的界面活性劑H L B 値約 2 至約 9。參見 U.S. Patent Nos. 5,603,95 1; 4,933，179 及4,606,9 1 8 ，描述本發明佐劑H L B値範圍之界面活性劑 丨丨丨丨t丨—I i丨！丨丨丨訂·！丨丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -10- 585777 A7 __ B7 五、發明說明（8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當本發明佐劑使用兩種界面活性劑時，內含本發明佐 劑之疫苗組合物中兩種界面活性劑之總濃度約爲1 . 5 % 至3 · 5 %，較佳者約1 · 5 %至約3 %，更佳者約 1 · 5 %至約2 · 5 %，最佳者約2 % v / v。本發明佐 劑所用之兩種界面活性劑其濃度各不相同。例如，當使用 親水性的界面活性劑及親脂的界面活性劑（例如Tween 80 及Span 80 )時，Tween 80之濃度爲Span 80濃度之約 1 · 2 X至約5 X，較佳者約1 · 5 X至約4 X，更佳者 約1 · 8 X至約3 X，再佳者約2 X至約2 · 5 X，最佳 者約2 · 3 X，較佳者使用之佐劑內含卵磷脂，該油之濃 度如N 〇 . 1佐劑。 本發明佐劑中使用的親水性界面活性劑其濃度需視水 相的大小而定，親脂性界面活性劑之濃度則視油相的大小 而定。具體實施例之一中，本發明佐劑由8 0 % v / v水 相及2 0 % v / v油相組成，含親水性界面活性劑之濃度 多至約親脂性界面活性劑濃度之4倍（即8 0 / 2 0 )， 或例如多至約2倍。 本發明佐劑中非界面活性劑之成分 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 除兩性界面活性劑之外，本發明佐劑內含卵磷脂及油 類。另一特色中，本發明佐劑內含一種水溶性載體溶液。 本發明佐劑中可使用任何一種技藝上已知的卵磷脂。 卵磷脂係指磷脂酸鹽混合物。當使用粗萃取物時，卵磷脂 亦可含三酸甘油酯。卵磷脂可取自植物或動物。此外，卵 磷脂可爲合成的卵磷脂。卵磷脂之實施例係描述於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -11 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 A7 B7 五、發明說明（9 ) U.S. Patent Nos· 5,690,942; 5,597,602 及 5,084,269。較佳 的具體實施例中，其使用之本發明佐劑中卵磷脂之三酸甘 油酯含量低於天然來源，即卵磷脂爲脫脂的卵磷脂。許多 技_上已知的方法均可將卵憐脂脫脂，例如描述於 U.S. Patent No. 5,597,602。 內含本發明佐劑之疫苗組合物其卵磷脂濃度介於約 〇· 25%至約12 · 5%v/v ，較佳者約〇 · 5%至 約1 0 % v / v，更佳者約〇 · 5 %至約7 · 5 %，更佳 者約0 . 5 %至約5 %，更佳者約〇 · 5 %至約2 · 5 % ’最佳者約0 · 5 %至約1 · 2 5 % v / v。 2 5 %佐劑其卵磷脂濃度至少約1 % v / v，較佳者 至少約2 % v / v。另一特色中，2 5 %佐劑中卵磷脂之 濃度約1 %至約5 0 % v / v，較佳者約2 %至約4 0 % v / v ’更佳者約2 %至約3 0 % v / v，更佳者約2 % 至約2 0 % v / v，更佳者約2 %至約1 0 % v / v，最 佳者約2 %至約5 % v / v。本發明佐劑中之卵磷脂濃度 其較高或較低濃度係依據上述原則。 本發明佐劑內含油類，例如描述於U.S. Patent Nos. 5,814,321; 5,084,269之油類。在較佳特色中，本發明佐劑 內含礦物油，例如DRAKE〇LTM。在另一特色見）使用油類 '混合物°製備本發明佐劑之油類可爲純油類或內含油及其 他成分（例如卵磷脂）之混合物。 內含本發明佐劑之疫苗組合物其油濃度約1 %至約 23%v/v，較佳者約1 · 5%至約20%v/v，更 ------U---Ί--1^-裝--------訂------ ----着 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -12- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585777 Α7 r— . _ B7 五、發明說明（10) 佳者約2 · 5 %至約1 5 %，更佳者約3 · 5 % t 〇約 1 0 %，更佳者約3 · 5 %至約7 · 5 %，甚至更佳者約 4 %至約6 % v / v，最佳者約4 · 5 %。 2 5 %佐劑其油濃度至少約5 % v / v，較佳者至少 約8%v/v，更佳者至少約1 。另一特色中 ’ 2 5 %佐劑內之油濃度約4 %至約9 2 % v / v，較佳 者約6 %至約8 0 % v / v，更佳者約1 〇 %至約6 〇 % v / v，更佳者約1 4 %至約4 0 % v / v，更佳者約 1 4 %至約3 0 % v / v，甚至更佳者約1 6 %至約2 4 % ’最佳者約1 8 %。本發明佐劑中之油濃度其較高或較 低濃度係依據上述原則。 另一具體實施例中，本發明佐劑係使用水溶性載體， 例如：生理食鹽水（例如磷酸鹽一緩衝的生理食鹽水）、 三羥甲基氨基甲烷-HC 1 、檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝溶液 、Hepes緩衝溶液、其他技藝上已知的醫藥學上可接受的緩 衝溶液或水。載體之p Η較佳者爲生理上可接受的，例如 介於6至8，最佳者約7。當本發明佐劑使用水溶性載體 時’載體水溶液所佔有之體積以不影響其他成分較佳。 本發明佐劑之較佳濃度約爲疫苗組合物調製後其所含 佐劑濃度之2 X至約1 Ο X，較佳者約2 X至約8 X，更 佳者約3 X至約6 X，最佳者約4 X。 本發明佐劑之用途 本發明使用之佐劑均可增進對疫苗調製劑抗原之免疫 反應。本發明佐劑可與源自任何細菌或任何病毒之抗原一 I I I I L ^ I ΙΊ I 1111111 — — — — — — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -13- 585777 A7 B7 五、發明說明（11) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 起使用，而不會破壞或使抗原變性。抗原之實施例（並非 限制）爲紅斑丹毒絲菌抗原、支氣管敗血性波得氏桿菌抗 原、產毒素的出血敗血性巴氏桿菌抗原、引起新生兒腹篇 之大腸桿菌品系的抗原、肺炎放射桿菌抗原、溶血巴斯德 氏菌抗原、或任何上述抗原之組合。本發明佐劑亦可用於 含描述於 U.S. Patent Nos. 5,6 1 6,328 及（and) 5,084,269 之抗 原的疫苗組合物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳的具體實施例中，本發明佐劑係用於內含取自紅 斑丹毒絲菌紅斑丹毒絲菌〃）培養液之抗原的疫苗調 製劑。較佳的特色中，紅斑丹毒絲菌培養係以添加福馬林 (最終濃度約0 · 5%v/v)、及在37 °C下反應24 小時而去活化，用離心或過濾移除細胞。將培養上淸液（ 較佳的具體實施例）濃縮約1 〇倍，在濃縮上淸液中添加 氫氧化鋁凝膠（較佳者REHYDRAGELTM )使最終濃度約 3 〇%v/v以穩定抗原。另一較佳的具體實施例中，含 E D T A (最終濃度約〇 · 〇 7 % v / v )之局部抗菌劑 (最終濃度約 0 · 0 l%v / v) ( Dimportex，Spain,由 Flavine Inc., Kloster，New Jersey 進口）可添加抗原作爲防 腐劑。另一較佳的具體實施例中，疫苗組合物之配方包括 抗原及本發明佐劑（例如Ν ο · 1佐劑），佐劑包括，例 如約2 5 % v / v之疫苗組合物。較佳的紅斑丹毒絲菌抗 原係描述於 U.S. Patent Application Serial No·?，申請日期 爲1月2 9日，1 9 9 9 ，名稱爲 '紅斑丹毒絲菌抗原及 疫苗組合物〃，全文在此倂入參考文獻。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -14- 585777 A7 B7 五、發明說明（12 ) 另一較佳的具體實施例中，使用本發明佐劑之疫苗組 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 合物內含來自支氣管敗血性波得氏桿菌培養液之抗原，其 係在對數相（較佳者爲對數相晚期）中加入福馬林，接著 加入戊二醛去活化。除了死菌之外，本新穎的及獨特的去 活化方法係用以製作不具毒性之內毒素及支氣管敗血性波 得氏桿菌外毒素，使支氣管敗血性波得氏桿菌細胞之抗原 能有效的引起所欲求之免疫反應。可在支氣管敗血性波得 氏桿菌培養液中添加福馬林，其濃度約0 · 2 % V / V至 約1 % v / v，更佳者約〇 · 4 % v / v至約〇 · 8 % v / v、最佳者約〇 · 6 % v / v。在培養液添加福馬林約 1〇分鐘至約4 0分鐘後再添加戊二醛，更佳者約1 5分 鐘至約3 0分鐘，最佳者約2 0分鐘。在支氣管敗血性波 得氏桿菌培養液中添加之戊二醛濃度約0 · 2 % v / v至 約1 % v / v，更佳者約〇 · 4 % v / v至約0 · 8 % v /v，最佳者約〇 · 6%v/v。戊二醛在加入培養液前 ，其濃度約1 0%ν/ν至約5 0%ν/ν，更佳者約 1 5%v/v 至約 35%v/v，最佳者約 25%v/v 。支氣管敗血性波得氏桿菌培養液中添加福馬林及戊二醛 之後，將其產生的混合物在約3 2 °C至約4 2 °C下攪拌反 應，更佳者約3 5 t：至約3 9 °C，最佳者約3 7 °C。混合 物反應約1 2小時至約6 0小時，更佳者約2 4小時至約 4 8小時。從支氣管敗血性波得氏桿菌培養液中製備本發 明抗原組合物之所有其他製作步驟描述於本文之實施例7 ，及 U.S. Patent Nos. 5,0 1 9,388 及 4,8 88，169。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585777 A7 B7 五、發明說明（13) 含本發明佐劑之疫苗組合物及其投用方法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明佐劑可用於疫苗調製劑以便對動物進行免疫反 應。具體實施例中，疫苗調製劑含育本發明佐劑及抗原。 疫苗調製劑中各成分之最適比例可由熟悉此技藝的專業人 士以熟知的技藝測定。 疫苗調製劑本身可投用在患者身上或以醫藥學或治療 學組合物的形式投用。醫藥學組合物內含本發明之佐劑及 抗原，可用常見的裝置混合、溶解、造粒、製成糖衣藥九 、均勻攪拌、乳化、封包、陷入（entrapping )或經冷凍乾 燥處理。醫藥學組合物可用常見的方法，使用一種或多種 生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或能強化本發明抗 原功效之佐劑調製成製劑，其可用於醫藥學上。適當的調 製劑視其選用之投藥路徑而定。在此目的下， ''生理上可 接受的載體〃包含可用於人類或動物身上而無有害副作用 (相對於治療的症狀）之載體，稀釋劑、賦形劑或佐劑亦 爲可接受的藥劑。 全身性的調製劑包括注射用製劑，例如皮下、真皮內 、肌肉內或腹腔內注射。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 注射時，疫苗製劑可用水溶液調製，較佳者爲生理上 相容的緩衝溶液，例如Hanks、溶液、林格氏溶液、磷酸鹽 緩衝的生理食鹽水、或任何其他生理食鹽水緩衝溶液。溶 液可含配方藥劑，例如：懸浮、安定及/或分散劑。此外 ，蛋白質可爲粉末形式，在使用前與適當載劑（例如：滅 菌之無熱原水）組合完成。 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 585777 A7 B7 五、發明說明（14 ) 測定疫苗調製劑之有效投藥量係爲熟悉此技藝的專業 人士熟知的技藝，尤其是在本文詳細揭示的指點下。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 有效劑量可以活體外測定開始估算。例如，劑量可使 用許多技藝上已知的方法依動物模式調製以誘發免疫反應 。一般熟悉此技藝的專業人士可輕易的依據本文描述之結 果定出對所有動物之最佳投藥方法。可個別調整其劑量及 區間。例如當作爲疫苗時，本發明疫苗調製劑可投用約1 至3個劑量、爲期1 一 3 6週。較佳者投用1或2個劑量 、爲期約3週至約4個月，及在此後週期性的接種追加劑 。另外之方法可適用於個別的動物。適當劑量之疫苗調製 劑（以上述方法投用時）能引起經免疫動物的免疫反應， 其足以在至少4至1 2個月內保護動物免於受到感染。一 般而言，劑量內之抗原量約1微微克至約1 〇 〇毫克/公 斤寄主，典型的抗原量約1 0微微克至約1毫克，及較佳 者約1 0 0微微克至約1微克。適當的劑量範圍需視注射 路徑及病人之大小而定，一般係介於約〇 . 1毫升至約毫 升。 本發明將用以下實施例說明，其係旨在說明而非用以 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 限制本發明之範圍。 實施例1 · 使用內含油類及卵磷脂之佐劑 以下實施例描述於獸醫疫苗中使用溶於油內之佐劑， 佐劑內含有脫脂卵磷脂油-卵磷脂佐劑〃），一般係 用礦物油（輕液態石鱲）。參見U.S. Patent No. 5,084,269 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -17- 585777 A7 B7 五、發明說明（15) ’其中係描述油-卵磷脂佐劑。使用油-卵磷脂佐劑之疫 苗製劑係爲水包油乳狀液。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 若未經特別指明，本文中所有百分比濃度係爲體積/ 體積。若未經特別指明，油-卵磷脂佐劑之％値係指卵磷 脂（1 0 %混合物）與載體油（DRAKEOLTM ) ( 9 0 %混 合物）混合物在水溶性載體（連續相）中之濃度。例如， 2〇％油一卵磷脂佐劑內含2 % v / v之卵磷脂（Central Soya，Fort Wayne，Indiana)，1 8 % v / v DRAKE〇Ltm 5 (Penreco，Karns City，Pennsylvania )及 8 0%v/v 生 理食鹽水溶液（若其他成分，例如界面活性劑含量增加， 則生理食鹽水含量便降低）。若未經特別指明，疫苗組合 物中油-卵磷脂佐劑百分比値（即用抗原溶液稀釋佐劑溶 液）係指中卵磷脂（1 0 %之混合物）與載體油（ DRAKEOLT M ) ( 9 0 %之混合物）之混合物在疫苗製劑（ 包含佐劑及內含抗原之溶液）中之濃度。在佐劑組合物中 添加界面活性劑時，若未經指明，界面活性劑之濃度百分 比値均爲佐劑或疫苗製劑中所有添加之界面活性劑總濃度 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當油-.卵磷脂佐劑係作爲疫苗調製劑之佐劑時，頃發 現若不添加額外之界面活性劑（例如：油-卵磷脂佐劑中 之卵磷脂）便不足以乳化水溶性製劑。因此，使用由分散 力不佳的油-卵磷脂佐劑製成的疫苗時，會在組織注射位 點上形成以礦物油爲主的儲藏池或儲藏處。受注射之動物 由於無法代謝或移除此種油類，因而會引起嚴重的慢性炎 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585777 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（16 ) 症及結疤。 亦據測定，在疫苗調製劑（包括油-卵磷脂佐劑及抗 原）中加入界面活性劑以乳化調製並非適當的解決方案。 當疫苗調製劑乳化前加入油及界面活性劑則可能損害抗原 ，若無法形成適當的乳狀液，則必須丟棄包括珍貴抗原之 調製劑。 測試內含不同佐劑之組合物，其中由油一卵磷脂佐劑 與界面活性劑混合來乳化疫苗調製劑。 實施例2. 使用內含低濃度界面活性劑之佐劑 以下實施例係描述使用內含4 0 %油一卵磷脂及2 % 合成界面活性劑（即Tween 80及Span 80 ( Van Water & Roger 、 Omaha, Nebraska ))之憐酸鹽緩衝生理食鹽水乳 狀液。此佐劑係在無菌狀況下且與抗原分別製備。將乳狀 液加入抗原製劑中並未引起進一步的乳化反應。合成的界 面活性劑幫助油-卵磷脂佐劑分散成粗而相當穩定的乳狀 液。將佐劑乳狀液以一比八之比率加入水溶性免疫製劑中 使油-卵磷脂佐劑含量從4 0 %降低至5 %，界面活性劑 從合并之2%降低至0·25%。 佐劑可用於許多疫苗上。頃發現由於乳狀液顆粒粗大 且並不是非常穩定，因此油滴極易於聯合再分開而在注射 組織上形成永久具刺激性之油儲藏。此佐劑之另一問題是 會與鋁凝膠聚集。許多疫苗因爲不同目的而所以含有鋁凝 膠，例如作爲佐劑或用以穩定抗原或與內毒素結合。油- ------h ——1 丨裝--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -19- 585777 A7 B7 五、發明說明（17) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 卵磷脂佐劑帶有負電價，可與引起正電價之鋁凝膠結合形 成粗聚集物。此類聚集物雖然看不見，但難以通過皮下注 射針，且對注射組極具有刺激性。 實施例3 . 使用內含高濃度界面活性劑之佐劑 將油一卵磷脂佐劑（5 % v / v )在免疫性的製劑中 由上述Tween 80及Span 80界面活性劑協助下乳化，疫苗 組合物中界面活性劑之總濃度爲8 %。乳狀液非常細而且 穩定。幾乎是澄淸的溶液，而非乳膏狀。在顯微鏡最大放 大率（解析度0 · 2微米）下，多數之液滴因太小而無法 看見。因此，此爲微乳狀液。此佐劑用於疫苗調製劑時， 事實上在注射處無反應性，且當加入鋁凝膠後亦無可偵測 得的油類及凝膠凝聚。此種高含量之界面活性劑造成佐劑 易於乳化，外觀上吸引人、穩定、不與鋁凝膠反應，且事 實上在接種位點無刺激效應。不過此類乳狀液雖具有這些 優點，不過其與低濃度界面活性劑之粗乳狀液比較之下其 佐劑功效略低。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例4 · 使用內含中等濃度界面活性劑之佐劑 0的在製作既平滑且有完整佐劑功效之佐劑乳狀液。 用2 0 %油-卵磷脂佐劑進行此類實驗，發現2 0 %油一 卵磷脂佐劑乳狀液較4 0 %油-卵磷脂佐劑乳狀液容易製 作。以一比四之比例加入疫苗（最終油類濃度爲5 % )中 可使抗原佔7 5 %之劑量體積。由初步的實驗顯示一種平 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585777 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（18) 滑的次乳狀液（大多數液滴之直徑小於1微米，參見圖1 )可用2 0%油類及1 6% Tween 80及Span 80之界面活 性劑製備成。 製備兩種乳狀液進行測定。一種內含2 0 %油-卵磷 脂佐劑及1 6 % Tween 80及Span 80界面活性劑。經一比 四倍稀釋後形成的疫苗製劑爲內含5 %油一卵磷脂佐劑及 4 %界面活性劑之乳狀液。其他乳狀液係用4 0 %油-卵 磷脂佐劑及2 % Tween 80及Span 80界面活性劑製備。經 一比八稀釋後形成含5 %油一卵磷脂佐劑及0 · 2 5 %界 面活性劑之乳狀液。 添加鋁凝膠（REHYDRAGELTM 得自 Rehei，Berkeley Height, New Jersey )至各乳狀液樣品（1 〇 %之濃度）。 在含0 · 2 5 %界面活性劑之乳狀液中，油及鋁凝膠會凝 聚並分離而在液體管柱（乳膏化）頂端形成厚層。相反的 ，含有4 %界面活性劑之乳狀液則無凝聚或乳膏化的現象 。含4 %界面活性劑時，鋁凝膠會沈積在試管底部，而油 滴則分散在上淸液之液體中。 實施例5 . 用內含中等濃度界面活性劑佐劑時注射位點 之腫脹情形 以疫苗製劑對豬隻進行測試，測定當用內含中等濃度 界面活性劑之佐劑注射時，注射位點是否發生腫脹。內含 5 %油一卵磷脂佐劑及0 · 2 5 %或4 %界面活性劑之疫 苗製劑在注射位點並不會使豬隻腫脹。當鋁凝膠以1 〇 % (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂--- 禮- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -21 - 585777 A7 B7 五、發明說明（19) 之濃度加入疫苗製劑中時，含0 · 2 5 %界面活性劑之製 劑會引起注射位點嚴重腫脹，而用4 %界面活性劑時則無 腫膜之結果。 進行實驗以測定有效的預防與鋁凝膠之凝聚及注射位 點腫脹之界面活性劑濃度範圍。當疫苗使用1 · 5 %界面 活性劑濃度時，觀察到油及鋁凝膠輕微的凝聚。在較低界 面活性劑濃度下凝聚現象增加。在2 %及4 %界面活性劑 濃度下則無凝聚。內含0 · 5 %或更少界面活性劑之疫苗 製劑於接種後2及4週所引發的豬隻腫脹情形較之由1 % 或更多界面活性劑製劑所引發的腫脹情形嚴重。接種6週 後，証實1 · 5 %界面活性劑是避免慢性腫脹的最小濃度 實施例6 · 含有用之活體外及活體中性質之佐劑 進行測定發現佐劑不會與鋁凝膠反應且動物不會在接 種後導致反應性。測定由2 0 %油-卵磷脂佐劑（含8 % 界面活性劑）產生之接種製劑（含5 %油-卵磷脂佐劑及 2 %界面活性劑）發現彼足以避免活體外與鋁凝膠之反應 性及對組織接種位點之刺激。界面活性劑濃度與佐劑間之 關係的証據則較不淸楚。有些跡象顯示疫苗中含4 %界面 活性劑是過度的，例如對大腸桿菌K 9 9誘發凝集素，及 對D型出血敗血性巴氏桿菌毒素之中和抗毒性。 因此在2 0 %油-卵磷脂佐劑中測出界面活性劑的最 適濃度爲8 %，其產生的疫苗組合物含有2 %界面活性劑 ------^卜 —裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂--- # 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -22- 585777 A7 B7 五、發明說明（2Q) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 。因此產生易於乳化及具冷藏穩定性之疫苗組合物。含 5 %油-卵磷脂佐劑、2 %界面活性劑之疫苗則具有理想 之佐劑功能且對注射組織無刺激性。 測定含8 %界面活性劑之2 0 %油—卵磷脂佐劑中次 微米乳狀液液滴大小。8 %界面活性劑係由5 . 6 %

Tween 80之水相及2 · 4% Span 80之油相組成。液滴中 約9 4 %少直徑於1微米，參見圖1。 含8 %界面活性劑之2 0 %油一卵磷脂佐劑之 1 0 0 0毫升標準溶液係用2 0 0毫升濾膜一滅菌之卵磷 脂一油溶液（1 0 %卵磷脂溶於DRAKE〇LTM礦物油）、高 壓滅菌之Tween 80 ( 5 6毫升）及Span 80 ( 2 4毫升） 、磷酸鹽緩衝生理食鹽水（7 2 0毫升）（Dulbecco PBS )製備妥。合并卵磷脂-油溶液及Span 80並在室溫下之滅 菌桶內混合至少1小時直至乳化完全爲止。合并生理食鹽 水及Tween 80，在室溫下滅菌混合至少1小時。在水溶性 混合物中使用乳化劑乳化油混合物。再用循環攪拌持續乳 化薄至所有佐劑加入生理食鹽水中爲止。然後乳狀液在室 溫下通過均質器兩次。佐劑係儲存在2至8 °C。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例7 · 用岡含中等濃度界面活性劑之佐劑製作萎縮 性鼻炎疫苗 將描述於實施例4之佐劑與中等濃度之界面活性劑製 成萎縮性鼻炎疫苗（內含支氣管敗血性波得氏桿菌抗原及 產毒素的出血敗血性巴氏桿菌）。用支氣管敗血性波得氏 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 585777 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（21) 桿菌及出血敗血性巴氏桿菌類毒素製成支氣管敗血性波得 氏桿菌-出血敗血性巴氏桿菌疫苗-類毒素疫苗。 支氣管敗血性波得氏桿菌（品系2 — 9 N A D L ) 之製備方法係描述於U.S. Patent Nos. 5,019,388及 4，8 8 8，1 6 9 ’除了生長循環終止時不同之外，將培養物連續 混合，添加福馬林溶液直至最終濃度爲0 · 6 %。加入福 馬林後在2 0分鐘內添加2 5 %戊二醛溶液直至最終濃度 〇· 6%。培養物在37±2t：下攪拌24至48小時直 至完全去活化及解毒爲止（參見表1 )。然後將培養液冷 卻在1 5 2 °C下或更低進行製備。未使用之去活化的培養 物則儲存在2至8 2 °C下多至1 4天。去活化後，將培養 液離心以分離細菌。倒掉上淸液，將細胞再懸浮於磷酸鹽 緩衝生理食鹽水（大約原始體積的十分之一）。濃縮懸浮 液儲存在2至8 2 °C下。將支氣管敗血性波得氏桿菌用兩 種醛類處理去活化內毒素及外毒素，以增加使用上之安全 性。 出血敗血性巴氏桿菌類毒素係製備成兩種不同之形式 ，描述於 U.S. Patent Nos. 5,536,496 及 5,695,769。其中一 種形式中，毒素爲含細菌（添加甲醛至培養物）的類毒素 :類毒素位於細胞內。另一形式中，將活菌用機械破壞並 萃取毒素。此毒素爲在高p Η下具有毒性，描述於 U.S. Patent 5,536,496。將此二形式之類毒素用鋁凝膠處理 以專利的方法控制內毒素之釋放，描述於U.S. Patent 5,6 1 6,3 2 8.(參見表1 )。兩種巴斯德桿菌屬類毒素形式間 (請先閱讀背面之注意事 4 •項再填 裝--------訂— 寫本頁) 砉- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -24 - 585777 A7 B7 五、發明說明（22 ) 之協同作用所導致之抗毒素反應遠超過各別形式單獨使用 之反應總合，描述於U.S. Patent 5,695,769。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表1 :處理細胞製作支氣管敗血性波得氏桿菌-出血敗血 性巴氏桿菌疫苗-類毒素疫苗 抗原 去活化劑 濃度 目標溫度範圍 時間 (最小/最大） 支氣管敗血性波得氏桿菌 福馬林 0.6% 37 ± 2 °C 24-48小時 戊二醛 0.6% 出血敗血性巴氏桿菌細胞 福馬林 0.4% 37 ± 2 °C 5天 -結合的類毒素 不含出血敗血性巴氏桿菌 5N NaOH pH 10 土 0.2 15 ± 2 〇C 1至6小時 之類毒素 添加描述於實施例4之佐劑以產生5 %油卵磷脂佐劑 及2 %界面活性劑濃度之疫苗調製劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用實驗測定萎縮性鼻炎疫苗最小免疫劑量以說明含中 等濃度界面活性劑之油-卵磷脂佐劑之佐劑性質。在4週 內對懷孕的母豬接種2毫升之劑量兩次。第二次給藥後約 2週生產。在一個月大的年齡下，對產下之小豬隻進行鼻 腔內的刺激（含劇毒的支氣管敗血性波得氏桿菌及出血敗 血性巴氏桿菌培養物）。僅用安慰劑接種之七隻母豬產下 之小豬會產生嚴重的萎縮性鼻炎。以內含完整抗原劑量疫 苗注射之七隻母豬其所產下之小豬則完全受到循環系統中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -25 - 585777 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（23) 來自母體的抗體保護。注射內含1/2或1/8抗原劑量 疫苗之母豬則對產下之小豬無另人滿意之保護力。 實施例8 · 使用含中等濃度界面活性劑佐劑之丹毒疫苗 用描述於實施例4含中等濃度界面活性劑之佐劑製作 內含紅斑丹毒絲菌抗原之丹毒絲菌疫苗。疫苗中使用之抗 原，其製備方法係將紅斑丹毒絲菌培養物用0 · 5 %福馬 林去活化至少2 4小時。將去活化的培養液離心至澄淸， 以分子篩過濾濃縮約十倍。在濃縮物中添加3 0 %濃度之 鋁凝膠（REHYDRAGELTM )以增進穩定性。疫苗內含預吸 附的濃縮物，其含量爲每2毫升劑量內含至少3 . 2濁度 甲·位（〇U )，以去活化培養物之光學密度（0 D )計算 。（〇D乘以最終濃度因子而得到〇 U /毫升之數値）。 進行丹毒接種測定內含油-卵磷脂佐劑與中等濃度界 面活性劑疫苗之功效。添加描述於實施例4之佐劑至最終 濃度爲2 5 % v / v，最終之卵磷脂一油濃度爲5 %。加 入西莫羅素（Thimerosal) ( 0 . 0 1 % w/v)、 EDTA(〇.〇7% w/v)作爲保存劑。 對豬隻測試依據此配方製成之疫苗功效兩次。各例子 中，豬隻肌肉內（I Μ )接種2毫升劑量兩次，一個劑量 在斷奶後約3週，第二個劑量在3週之後。控制組則以磷 酸鹽緩衝生理食鹽水作爲安慰劑注射。其中一個硏究在約 第9週大時用I Μ注射劇毒的紅斑丹毒絲菌以刺激免疫性 ，另一個硏究則在第6個月大時進行。如表2，在第9週 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------l·--ί--裝-----1--訂---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -26- 585777 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7___ 五、發明說明（24 ) 接種者其保護力爲1 Ο 0%，在第6個月（屠宰年齡）大 時接種者其保護力爲7 5 %。此類結果顯示在飼育期疫苗 可對丹毒提供命人滿意之保護。 用於在第9週刺激之疫苗已存放1 2個月之久。此結 果證實成功的穩定了具有保護性的抗原。 表2 :保護猪隻對抗丹毒 刺激年齢 控制組 (被保護/刺激） 施打疫苗組 (被保護/刺激） 9週 0/10 19/19 6個月 0/10 15/20 註：在第9週刺激接種組中，排除第2 0隻豬。該豬 爲非常難以對待的動物，掙扎猛烈因此無法測定其溫度。 刺激後此豬完全健康。 本發明並非限於用以說明本發明單一的特色之具體實 施例所列舉之範圍，任何具相當效力之佐劑均屬於本發明 之範圍，除了本文之描述外，熟悉此技藝之士在參閱前述 之本文及圖示後可變化本發明。此變化屬於以下之申請專 利範圍之內。 所有引用之文獻，全文在此并入參考文獻。 丨丨丨I*‘丨It—丨丨丨丨丨—丨丨矿-丨···丨！ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -27-

Claims (1)

1. 公告本 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 附件：IA :第88 1 23 144號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國93年3月18日修正 1·一種疫苗組合物，其包括〇.25%至12.5 %v/v之卵磷脂、1%至23%v/v之油類、1.5 %至3 · 5 % v / v之至少一種兩性界面活性劑及細菌抗 原。 2 ·如申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其中該油 類爲礦物油，該卵磷脂爲脫脂的卵磷脂。 3 .如申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其並包括 一種水溶性載體。 4 ·如申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其中該抗 原係選自：紅斑丹毒絲菌抗原、支氣管敗血性波得氏桿菌 抗原、出血敗血性巴氏桿菌抗原、引起新生兒腹瀉的大腸 桿菌品系之抗原、肺炎放射桿菌抗原、溶血巴斯德氏菌抗 原及其組合。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 ·如申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其中使用 兩種兩性界面活性劑。 6 .如申請專利範圍第5項之疫苗組合物，其中使用 一種親水性界面活性劑及一種親脂性界面活性劑。 7 .如申請專利範圍第5項之疫苗組合物，其中該卵 磷脂之濃度爲0 · 5%v/v ’其中該油之濃度爲4 · 5 % v / v，且其中該兩性界面活性劑之濃度爲2 % v / v 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585777 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 〜 — 〇 8 ·如申請專利範圍第5項之疫苗組合物，其並包括 一種水溶性載體。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 · 一種佐劑組合物，當用該佐劑調製成疫苗組合物 時’其係包括0.25%至12.5%7/^之卵磷脂， 1%至23%v/v之油類及1·5%至3·5%v/v 之至少一種兩性界面活性劑。 1 0 · —種製作疫苗組合物之方法，其包括將申請專 利範圍第9項之佐劑組合物加入至包含細菌抗原之抗原組 合物中。 1 1 ··如申請專利範圍第1 〇項之方法，其中該抗原 係選自：紅斑丹毒絲菌抗原、支氣管敗血性波得氏桿菌抗 原、出血敗血性巴氏桿菌抗原、引起新生兒腹瀉的大腸桿 菌品系之抗原、肺炎放射桿菌抗原、溶血巴斯德氏菌抗原 及其組合。 1 2 .如申請專利範圍第4項之疫苗組合物，其中該 抗原係依序以添加福馬林及戊二醛去活化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 2 _