ES2326793T3 - Vacuna combinada que comprende toxoide de toxina dermonecrotica producida por bordetella bronchiseptica. - Google Patents
Vacuna combinada que comprende toxoide de toxina dermonecrotica producida por bordetella bronchiseptica. Download PDFInfo
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Abstract
Una vacuna combinada que consta de: a) un toxoide de toxina dermonecrótica producido por Bordetella bronchiseptica, teniendo al menos 3''75x10 5 de dosis mínima necrotizante (DMN)/mg de proteína antes de la destoxicación, obtenible por tratamiento con un reactivo químico de una toxina dermonecrótica purificada, a fin de que la toxina dermonecrótica sea privada de la actividad de dicha toxina dermonecrótica, aunque conservando la inmunogenicidad, en donde la toxina dermonecrótica purificada se prepara poniendo en contacto una solución conteniendo toxina dermonecrótica, producida por Bordetella bronchiseptica, con un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa o un gel cromatográfico al que está unida covalentemente una molécula sulfatada, o un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural de alto peso molecular o un polímero sintético de alto peso molecular al que está unido un grupo sulfopropilo, para de ese modo fabricar la toxina dermonecrótica absorbida sobre el gel, y eluyendo la toxina dermonecrótica adsorbida a partir del gel; y b) un toxoide de toxina dermonecrótica producido por Pasteurella multocida.
Description
Vacuna combinada que comprende toxoide de toxina
dermonecrótica producida por Bordetella bronchiseptica.
La presente invención se refiere a un
medicamento para la profilaxis de enfermedades infecciosas porcinas.
Más concretamente, la presente invención tiene que ver con una
mezcla de toxoides perfeccionada constando de una toxina
dermonecrótica producida por Bordetella bronchiseptica, y de
un toxoide de toxina dermonecrótica producido por Pasteurella
multocida.
La rinitis atrófica (de ahora en adelante
mencionada también como "RA") es una enfermedad crónica
respiratoria porcina que tiene una infectividad sumamente potente,
siendo los síntomas principales la atrofia de concha, hipoplasia,
epistaxis, retorcimiento del hocico e inducción de otras
enfermedades respiratorias, y otros. Se sabe que esta enfermedad
está causada por una Bordetella bronchiseptica toxigénica (de
ahora en adelante mencionada también como "Bb") y una
Pasteurella multocida toxigénica (de ahora en adelante
mencionada también como "Pm"), las cuales infectan la mucosa
del tracto respiratorio superior. La Bb posee hemaglutinina y
fimbrias como factor de adherencia y, de este modo, se une
fácilmente a la mucosa nasal mientras que la Pm no tiene tal factor
de adherencia y, por lo tanto, difícilmente coloniza por sí misma.
De acuerdo con esto, para el establecimiento de una infección por
Pm, es necesario un factor de predisposición que cause una lesión
en la mucosa nasal, dicho factor siendo típicamente Bb. Se sabe que
los factores patológicos implicados en la causa de lesión en la
mucosa nasal son una citotoxina traqueal y una toxina
dermonecrótica. En una infección experimental, se infecta un cerdo
con Bb, y varios días después, seguido por infección intranasal con
Pm, para causar una RA grave como se observa en una granja de
campo.
La Bordetella incluye B.
pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica,
B. avium, y otras, las cuales producen una diversidad de
substancias biológicamente activas. La toxina dermonecrótica Bb (de
ahora en adelante mencionada también como "TBb") es una de
tales substancias, y está producida por cualquier Bordetella.
Se descubrió que la TBb, teniendo actividades biológicas tales como
actividad necrótica hemorrágica, actividad para causar atrofia de
concha, actividad para causar hipoplasia, actividad letal, actividad
vasoconstrictora en el músculo liso, actividad para causar la
interrupción de la circulación sanguínea local, actividad para
causar atrofia esplénica, actividad para inhibir la producción de
anticuerpos y otras, juega un papel importante en la Bordetelosis.
Además, se descubrió que la TBb también juega un papel importante en
la formación de un foco neumónico en lechones [Roop II, R. M. y
col., Infect. Immun., 55, págs. 217-222 (1987)].
Por otra parte, una parte de la Pasteurella
multocida o una parte de la Pasteurella atípica producen
toxina dermonecrótica Pm (de ahora en adelante mencionada también
como "TPm"). Se descubrió que la TPm, teniendo actividades
biológicas tales como actividad necrótica hemorrágica, actividad
para causar atrofia de concha, actividad para causar hipoplasia,
actividad letal, actividad para causar la interrupción de la
circulación sanguínea local, actividad para causar atrofia
esplénica y otras, juega un papel importante en el comienzo de la
enfermedad por la Pm toxigénica. Además, se descubrió que la TPm
está estrechamente relacionada con la formación de un foco
neumónico en cerdos mediante la Pm toxigénica [Iwatsu, S. y Sawada,
T.; Jpn. J. Vet. Sci., 50, págs. 1.200-1.206
(1988)]. Aunque ambas TBb y TPm no son secretadas dentro de un medio
de cultivo sino que se acumulan dentro de células bacterianas, son
liberadas fuera de las células bacterianas, en un sobrenadante de
cultivo, debido a la bacteriolisis después de un cultivo de larga
duración. En el proceso in vivo, la toxina dermonecrótica se
liberó fuera de las células bacterianas debido a la bacteriolisis,
afectando al cuerpo viviente.
Bajo las circunstancias mencionadas
anteriormente, todavía no queda claro el papel de la toxina
dermonecrótica en la protección en el cuerpo viviente y, para
aclarar el mecanismo de la protección, existe la necesidad de
desarrollar un procedimiento para la preparación a gran escala de
toxina dermonecrótica y desarrollar un toxoide de toxina
dermonecrótica para su uso en la profilaxis de la enfermedad. Sin
embargo, ha sido difícil purificar toxina dermonecrótica debido a
sus propiedades, esto es, la inestabilidad al calor, la
autoaglutinación fácilmente originada a medida que proceden los
procesos de purificación, la formación de un complejo con
substancias derivadas de células bacterianas tales como lípidos,
proteínas ácidas, substancias hidrófobas, etc. Además, puesto que
la TBb y la TPm no interreaccionan inmunológicamente entre sí a
pesar de su semejanza en actividades biológicas, ha sido
conveniente, con la mayor seriedad, desarrollar una mezcla de
toxoides TBb-TPm que sea segura y eficaz desde el
punto de vista de la industria veterinaria y de reproducción de
cerdos.
Hasta ahora, un procedimiento conocido para
purificar parcialmente toxina dermonecrótica a partir de una
solución conteniendo toxina dermonecrótica bacteriana, especialmente
a partir de un extracto celular bacteriano de Bordetella,
incluye un proceso que utiliza cromatografía de intercambio iónico
[Kume, K. y col., Infect. Immun., 52 (4), págs.
370-377 (1986)]. Sin embargo, este proceso
demuestra, desventajosamente, escasa reproducibilidad. También se
conoce un proceso para purificar parcialmente toxina dermonecrótica,
el cual utiliza diálisis, una ultracentrifugación por gradiente de
sacarosa, y una cromatografía por filtración en gel [Endoh, M. y
col., Microbiol. Immunol., 30, (7), págs. 659-673
(1986)]. Sin embargo, este proceso muestra también,
desventajosamente, escasa reproducibilidad y, además, no proporciona
un suficiente grado de purificación a pesar de las muchas
etapas.
Otro ejemplo incluye un proceso que utiliza un
tratamiento con un agente eliminador de ácidos nucleicos,
cromatografía de intercambio aniónico, y cromatografía por adsorción
sobre hidroxiapatito [Horiguchi, Y. y col., Microbiol. Pathogen.,
6, págs. 361-368 (1989)]. Sin embargo, este
procedimiento es también desventajoso porque requiere un reactivo
caro, un agente eliminador de ácidos nucleicos, y supone muchas
etapas. También hay un procedimiento que utiliza un agente
eliminador de ácidos nucleicos, diálisis, y cromatografía de
intercambio catiónico [Horiguchi, Y. y col., FEMS Microbiol.
Letters, 66, págs. 39-44 (1990)]. Aunque este
procedimiento muestra alta reproducibilidad y puede proporcionar
toxina dermonecrótica con pureza relativamente alta, también
requiere, desventajosamente, un reactivo caro como en el
procedimiento anterior.
Todavía otro ejemplo es un proceso que utiliza
precipitación de un electrolito y cromatografía de afinidad por
ligando de colorante [Zhang Y. L. y Sekura R. D., Infect. Immun.,
59, (10), págs. 3.754-3.759 (1991)]. Aunque este
proceso muestra una alta reproducibilidad, proporciona,
desventajosamente, un grado de purificación insuficiente.
Las vacunas para RA inactivadas reportadas hasta
aquí incluyen tres tipos, esto es, una vacuna inactivada sencilla
para Bb, una vacuna inactivada sencilla para Pm, y una vacuna
inactivada combinada para Bb/Pm, cada una habiendo sido estudiada o
puesta en uso práctico.
Una vacuna inactivada para Bb incluye una
constando de bacterias muertas inactivadas con formalina,
glutaraldehído, etc., complementada con gel de aluminio o un
adyuvante oleoso [Goodnow, R.A., Vet. Med. Small Anim. Clin., 72,
págs. 1.210-1.212 (1977); Nakase, Y. y col., Proc.
Int. Pig Vet. Soc. Congr., 8, (1976); Giles, C.J. y Smith, I.M.,
Vet. Bull. (Londres), 53, págs. 327-338 (1983)].
También se descubrió que una proteína de 68 kDa, que está presente
en la membrana externa de la Bb y tiene actividad de adenilato
ciclasa, exhibe actividad profiláctica contra la rinitis atrófica
[Montaraz, J.A. y col., Infect. Immun., 47, págs.
744-755 (1985)]. También se conoce una vacuna de
componentes constando de hemaglutinina fibrosa, producida por Bb,
como componente principal [Hansen, G.R. y col.; In Atrophic rhinitis
in pigs (Ed. Peterson, K.B. y Nielsen, N.C.), Communication of the
European Communities, Luxemburgo, págs. 89-97
(1983), y Ohgitani, T. y col., Vaccine, 9, págs.
653-658 (1991)]. También se ha informado de que no
es eficaz una vacuna complementada con toxina dermonecrótica para
proporcionar una antitoxina [Soderlind, O. y Bergstrom, G., Proc.
Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 175 (1984); Marel, C.M. von der y
col., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr., pág. 170 (1984)].
Por otra parte, una vacuna inactivada simple
para Pm incluye toxoide Pm [Pedersen, K.B. y Barfod, K., Nord. Vet.
Med., 31, págs. 293-302 (1982), Foged, N.T. y col.,
Vet. Rec., 125, págs. 7-11 (1989)], la cual ha sido
estudiada o puesta en uso práctico.
Una vacuna inactivada combinada para Bb/Pm
incluye (1) una mezcla de Bb muertas con bacterias tipo PmD muertas
productoras de TPm, la cual mezcla esta adicionalmente complementada
con bacterias no productoras de TPm, o una mezcla de Bb y toxoide
TPm [Barfod, K. y Pedersen, K.B., Nord. Vet. Med., 36, págs.
337-345 (1984); Baalsrud, K.J., Acta Vet. Scand.,
28, págs. 305-311 (1987); de Jong, M.F. y
col., Vet. Quart., 9, págs. 49-59 (1987); Kobisch,
M. y Pennings, A., Vet. Rec., 124, págs. 57-61
(1989)], con el fin de profilaxis de únicamente RA; (2) una mezcla
de Bb muerta con bacterias tipo PmD muertas productoras de TPm y
bacterias tipo PmA muertas [Ostle, A.G. y col., Vet. Med., págs.
772-775 (1986)], con el fin de profilaxis de RA y
neumonía; y (3) una mezcla de Bb muerta con bacterias tipo PmA
muertas, Erysipelothrix insidiosa muertas y toxoide TPm
[Jayappa, H. y col., Int. Pig Vet. Soc. Congr., pág. 44 (1988)], con
el fin de profilaxis de otras enfermedades así como RA y neumonía,
habiendo sido puesta en uso práctico cualquiera de (1) a (3).
Puesto que la TBb juega un importante papel en
la atrofia de concha y la formación de focos neumónicos por
infección con Bb, Zoop II, R.M. y col. han indicado la necesidad de
toxoide TBb [Infect. Immun., 55, págs.
217-222 (1987)]. Sin embargo, nunca se refieren a
una combinación de toxoides TBb y TPm. Chanter, N. y col., han
propuesto que es más eficaz una combinación de toxoide TPm con la
importante toxina de Bb puesto que la lesión en la mucosa nasal
porcina, inducida por la actividad cooperativa de TBb y TPm,
proporciona entornos favorables a la propagación de Bb y Pm [Res.
Vet. Sci., 47, págs. 48-53 (1989)].
Sin embargo, todavía no ha sido perfeccionada
con éxito la producción de un anticuerpo neutralizador de TBb con
una vacuna que conste de una fracción teniendo actividad TBb
[Soderlind, O. y Bergstrom, G., Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr.,
pág. 175 (1984); Marel, C.M. von der y col., Proc. Int. Pig Vet.
Sci. Congr., pág. 170 (1984)]. Por otra parte, Nakai y col.
revelaron que la producción de un anticuerpo neutralizador se
intensifica en cerdos y ratones con un toxoide TBb sumamente
purificado [The 111th Japan Veterinary Society, resumen de la
conferencia, pág. 183 (1991)]. Sin embargo, tampoco se refieren a
una combinación de dicho toxoide TBb y toxoide TPm.
Por Elias y col., Jap. J. Vet. Sci. vol. 52,
1990, páginas 677-688, y Horiguchi y col., FEMS
Microbiology Letters vol. 66, 1990, páginas 39-43,
se han descrito métodos para la purificación de toxina
dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica, la
destoxificación y formulación de la TBb purificada en una
composición para la obtención de anticuerpos en conejos.
En Kobisch y col., Vet. Record vol. 124, nº 3,
1989, págs. 57-61, se investiga una vacuna para la
terapia de la rinitis atrófica, constando de una bacterina de Bb
combinada con toxina dermonecrótica de Pm toxoidada, comercializada
bajo el nombre Nobi-Vac AR-T.
WO-A-91/19419 revela un tipo similar
de vacuna de combinación.
Los presentes inventores han estudiado, con la
mayor seriedad, para averiguar un método para purificar eficazmente
toxina dermonecrótica y, por consiguiente, han encontrado (1) que se
puede obtener fácilmente una toxina dermonecrótica parcialmente
purificada, con un contenido reducido de endotoxina, con un
relativamente alto índice de recuperación, conduciendo una
cromatografía en una solución conteniendo toxina dermonecrótica,
obtenida a partir de Bordetella bronchiseptica, utilizando un
gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa o un gel
cromatográfico al que está unida covalentemente una molécula
sulfatada, tal como un gel de éster de sulfato de celulosa, un gel
de absorción con heparina inmovilizada o un gel de absorción con
alquilo sulfatado inmovilizado, (2) que se puede obtener fácilmente
una toxina dermonecrótica sumamente purificada, con un
relativamente alto índice de recuperación, conduciendo
adicionalmente una diálisis, una cromatografía de intercambio
catiónico y una cromatografía por filtración en gel en la anterior
toxina dermonecrótica parcialmente purificada, utilizando un gel
cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa o un gel
cromatográfico al que está unida covalentemente una molécula
sulfatada, (3) que se mejora sumamente la respuesta inmune en la
toxina dermonecrótica, parcialmente purificada, utilizando un gel
cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa o un gel
cromatográfico al que está unida covalentemente una molécula
sulfatada, comparada con la toxina dermonecrótica en el extracto
celular bacteriano de Bordetella sin purificar.
Además, los presentes inventores han confirmado
que un producto de una fracción de toxina dermonecrótica, reducido
de toxicidad, con un tratamiento químico puede ser utilizado
eficazmente y con seguridad para la profilaxis de la rinitis
atrófica en cerdos, dicha fracción de toxina dermonecrótica siendo
preparada poniendo en contacto dicho extracto celular bacteriano de
Bordetella con un gel cromatográfico sulfatado mediante
sulfatación directa o un gel cromatográfico al que está unida
covalentemente una molécula sulfatada, para de ese modo fabricar la
toxina dermonecrótica absorbida sobre el gel y separada de
contaminantes, seguido por elución de la toxina dermonecrótica del
gel.
Para que la infección por Pm se establezca en
cerdos, es necesaria una preinfección de Bb como factor causante de
la lesión en la mucosa nasal en cerdos. Cuando los cerdos sean
inmunizados con antitoxina para Bb, se puede reducir la
colonización de Pm en la mucosa nasal y la atrofia de concha por
infección por Bb y Pm. Sin embargo, puesto que se puede ver una
notable variabilidad en los efectos de individuo a individuo, se
reveló que el toxoide TBb solo no es suficiente para una vacuna
inactivada contra la RA.
Basado en los descubrimientos mencionados antes,
los presentes inventores han estudiado, con la mayor seriedad, para
desarrollar una mezcla de toxoides, y por consiguiente, han
descubierto que una mezcla de toxoides preparada mezclando un
toxoide obtenido a partir de toxina purificada hasta una actividad
específica de 37.000 DMN/mg de proteína o más, a partir de un
extracto celular bacteriano de Bordetella utilizando un gel
de éster de sulfato de celulosa, etc., con un toxoide obtenido a
partir de TPm producido por PM toxigénica, puede ser utilizado
eficazmente y con seguridad para la profilaxis de la rinitis
atrófica en cerdos. De este modo, se proporciona una mezcla de
toxoides conforme a la presente invención, como se define por las
reivindicaciones adjuntadas.
Una dosis mínima necrotizante (DMN), como se
utiliza aquí, es tal que 1 DMN se define como la cantidad mínima de
toxina dermonecrótica que produce una mancha necrótica de no menos
de 5 mm de diámetro, un día después de la inyección intracutánea a
una cobaya, en presencia de 1 \mug/ml de un lipopolisacárido (por
ejemplo, uno derivado de E. coli, serotipo 0111:B4).
La Fig. 1 muestra un cromatograma en una etapa
de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente
invención.
La Fig. 2 muestra un cromatograma en una etapa
de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente
invención.
La Fig. 3 muestra un cromatograma en una etapa
de un método para purificar toxina dermonecrótica según la presente
invención.
La Fig. 4 muestra los resultados del análisis de
una fracción de toxina dermonecrótica obtenida mediante un método
para purificar toxina dermonecrótica según la presente
invención.
La Fig. 5 muestra los resultados de un ensayo de
potencia, en ratones, de un toxoide obtenido según la presente
invención.
La Fig. 6 muestra los resultados de un ensayo de
eficacia, en una cerda embarazada, de un toxoide obtenido según la
presente invención.
La Fig. 7 muestra los resultados del estudio en
la línea de protección de un anticuerpo neutralizador de TBb.
La presente solicitud describe un método para
purificar parcialmente toxina dermonecrótica, el cual comprende el
poner en contacto una solución conteniendo toxina dermonecrótica con
un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa, o con
un gel cromatográfico al que está unido covalentemente una molécula
sulfatada, para de ese modo fabricar la toxina dermonecrótica
adsorbida sobre el gel, seguido por la elución de la misma a partir
del gel. La presente invención también proporciona un toxoide TBb
derivado de TBb obtenido mediante dicho método para purificar
parcialmente toxina dermonecrótica, y una mezcla de toxoides que se
prepara mezclando dicho toxoide TBb con un toxoide derivado de TPm
producido por Pm toxigénica, dicha mezcla de toxoides siendo segura
y eficaz para la profilaxis de la rinitis atrófica en cerdos.
Una solución conteniendo toxina dermonecrótica,
como la utilizada aquí como materia de partida, incluye un extracto
celular bacteriano de Bb. La materia de partida de la presente
invención también incluye un extracto de células en donde el TBb se
expresa mediante una técnica de ingeniería genética. Un extracto
preferido utilizado aquí es un extracto celular bacteriano de Bb.
La Bb se cultiva de una manera habitual mediante un cultivo en agar
en medio Bordet-Gengou, medio Macconkey, y otros, o
mediante un cultivo en reposo, un cultivo en agitación, o un
cultivo rotatorio de aireación en un medio líquido tal como un medio
de peptona [Horiguchi, Y. y col., Microb. Pathogen., 6, págs.
361-368 (1989)], medio Cohen-Willer,
medio Stenner-Scholte, y otros. El cultivo
bacteriano en medio agar es suspendido en un tampón de inicio de un
gel de éster de sulfato de celulosa, utilizando una varilla
Conradi, etc. El cultivo bacteriano en medio líquido, después de
recuperar células bacterianas mediante centrifugación, es
suspendido en un tampón de inicio de un gel de éster de sulfato de
celulosa.
La suspensión obtenida de células bacterianas
puede ser purificada mediante el método de Kume, K. y col. [Infect.
Immun. 52 (4), págs. 370-377 (1986)], mediante el
método de Endoh, M. y col. [Microbial. Immunol., 30 (7),
págs. 659-673 (1986)], mediante el método de
Horiguchi, Y. y col. [Microbial. Pathogen., 6, págs.
361-368 (1988) o FEMS Microbiol. Letters, 66, págs.
39-44 (1990)], mediante el método de Zhang Y.L. y
Sekura R.D. [Infect. Immun., 59 (10), págs.
3.754-3.759 (1991)], o mediante una cromatografía de
adsorción utilizando un gel cromatográfico sulfatado mediante
sulfatación directa, tal como un gel de éster de sulfato de
celulosa o un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente
una molécula sulfatada. Sin embargo, de acuerdo con la presente
invención, la forma de realización sumamente preferible es que la
suspensión es purificada mediante cromatografía de adsorción
utilizando un gel cromatográfico sulfatado mediante sulfatación
directa o un gel cromatográfico al cual está unida covalentemente
una molécula sulfatada.
La suspensión de células bacterianas se somete a
una sonicación, un tratamiento enzimático, un prensado, una
repetición de congelación-descongelación, etc., para
homogeneizar las células, y se eliminan los detritus celulares por
centrifugación o filtración por membrana. El extracto bacteriano así
obtenido es sometido directamente, o después de un pretratamiento
adicional para purificación vía el empleo de un agente eliminador de
ácidos nucleicos, una precipitación del electrolito,
ultracentrifugación, etc., a un método de la presente invención. De
acuerdo con el método de la presente invención, no es siempre
necesario el pretratamiento pero, en su lugar, el extracto celular
bacteriano puede ser sometido directamente a cromatografía de
adsorción utilizando un gel de adsorción que tenga una molécula
sulfatada como ligando, o un gel de adsorción sulfatado mediante
sulfatación directa para, de ese modo, hacer el procedimiento
bastante sencillo y adecuado.
Como se utiliza aquí, un gel cromatográfico
sulfatado mediante sulfatación directa, o un gel cromatográfico al
cual está unida covalentemente una molécula sulfatada, son
ejemplificados como sigue:
"Un gel cromatográfico sulfatado mediante
sulfatación directa", como se utiliza aquí, significa un gel
cromatográfico (por ejemplo, celulosa) en donde el gel mismo es
sulfatado directamente por reacción con un agente sulfatante tal
como ácido clorosulfónico, anhídrido sulfúrico en presencia de un
disolvente orgánico tal como piridina, vía, por ejemplo, un enlace
éster, incluyendo típicamente un gel de éster de sulfato de
celulosa en donde el éster de sulfato es introducido dentro de una
celulosa globular compuesta de una celulosa cristalina o una
celulosa con regiones cristalinas y con regiones no cristalinas. El
éster de sulfato de celulosa obtenido conserva la configuración de
la materia de partida, es insoluble en un disolvente acuoso, es
excelente en estabilidad física y, por eso, es adecuado para su uso
como gel cromatográfico. Estas celulosas de partida están ya
disponibles comercialmente, por ejemplo, como Avicel (fabricada por
Asahi Kasei Kogyo K.K.), Cellulofine GC-15,
GH-25, GC-100,
GC-200 (fabricada por Chisso Corporation), y otras.
La celulosa de partida puede ser sulfatada mediante los métodos
mencionados anteriormente, o está disponible comercialmente alguna
celulosa sulfatada como, por ejemplo, "Sulfated Cellulofine"
(fabricada por Chisso Corporation).
"Un gel cromatográfico al cual está unida
covalentemente una molécula sulfatada", como se utiliza aquí,
significa un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural de
alto peso molecular tal como una celulosa reticulada, un dextrano
reticulado o un gel de agarosa reticulado, o un polímero sintético
de alto peso molecular tal como un polímero de vinilo hidrófilo, o
copolímero de estireno-divinilbenceno, al que está
unido covalentemente heparina, un glucosaminoglicano altamente
sulfatado, o grupo sulfopropilo, una clase de alquilo sulfatado,
mediante un procedimiento con CNBr, etc., incluyendo muchos
productos disponibles comercialmente. Un gel cromatográfico al cual
está unida covalentemente heparina incluye "Heparin Sepharose
CL-6B" (Pharmacia), "Affigel Heparin Gel"
(Bio-Rad), "Heparin Cellulofine" (Seikagaku
Kogyo K.K.), y otros. Un gel cromatográfico al cual está unido
covalentemente un colorante azul incluye "Affigel Blue Gel"
(Bio-Rad), "AF-blue Toyopearl"
(Toso K.K.), "Blue Cellulofine" (Seikagaku Kogyo K.K.), y
otros. Un gel cromatográfico al cual está unido covalentemente un
grupo sulfopropilo incluye "SP-Sephadex"
(Pharmacia), "SP-Toyopearl 650M" (Toso K.K.), y
otros.
La purificación y recolección de toxina
dermonecrótica a partir de la solución conteniendo toxina
dermonecrótica, especialmente el extracto celular bacteriano de
Bordetella, utilizando un gel de adsorción que tiene un
grupo sulfato como ligando, o un gel de adsorción sulfatado mediante
sulfatación directa, se lleva a cabo de la manera siguiente. Aunque
la presente invención se ilustra mediante el empleo de un gel de
éster de sulfato de celulosa como forma de realización preferible,
también se puede utilizar cualquier otro gel bajo condicione
similares.
Previamente se equilibra un gel de éster de
sulfato de celulosa con un tampón que tenga en torno a pH neutro
(pH 7 a 9) y una conductividad eléctrica específica apropiada, esto
es, estando estandarizado para lavado y elución en una
cromatografía en gel (normalmente 20 mS/cm o menos, generalmente 3 a
20 mS/cm, más generalmente 5 a 20 mS/cm, aunque puede variar hasta
cierto punto dependiendo de la clase de gel) o menor, por ejemplo,
tampón de fosfato 0'02M complementado con cloruro sódico 0 a 0'2M, y
sometido luego a un procedimiento de adsorción para toxina
dermonecrótica. Se puede conducir una serie de procedimientos de
purificación, tal como la adsorción de la toxina dermonecrótica en
un gel de éster de sulfato de celulosa, lavado del gel, elución de
la toxina dermonecrótica, etc., de una manera industrialmente
habitual tal como un proceso por lotes o un proceso en columna.
Cuando se emplee un proceso por lotes, se pone un éster de sulfato
de celulosa en un extracto celular bacteriano de Bordetella
bronchiseptica y se agita lentamente la mezcla a una temperatura
de 0 a 30ºC, a un intervalo de pH de 7'0 a 9'0, durante unos 10 a
60 minutos, para, de ese modo, hacer que se adsorba la toxina
dermonecrótica sobre el éster de sulfato de celulosa. En este caso,
el éster de sulfato de celulosa es convenientemente concentrado o
diluido antes del procedimiento de adsorción, para que la
conductividad eléctrica específica del extracto celular bacteriano
de Bordetella caiga dentro del intervalo mencionado
anteriormente, generalmente 3 a 20 mS/cm, o menos.
Después de que se complete la adsorción, se
carga la mezcla del extracto y el gel en un filtro, y se conduce la
filtración con succión para separar el gel del filtrado. Al gel
separado se vierte un tampón apropiado que tenga el intervalo
fijado anteriormente de conductividad eléctrica específica
(generalmente alrededor de 3 a 20 mS/cm) o menor, y un pH de
alrededor de 5 a 10, por ejemplo tampón de fosfato 0'02M
complementado con cloruro sódico 0'1M, para lavar el gel con
succión. Después, al gel se vierte un tampón apropiado que tenga un
pH de alrededor de 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica
mayor del anterior intervalo fijado y, generalmente, menor de 130
mS/cm (un intervalo preferible es, por ejemplo, alrededor de 22 a 46
mS/cm), por ejemplo un tampón de fosfato complementado con cloruro
sódico 0'2M a 0'5M, para eluir la toxina dermonecrótica
adsorbida.
Cuando se emplee un proceso en columna, las
condiciones de la materia de partida, el tampón para lavado y el
tampón de elución pueden ser similares a los del proceso por lotes.
Se recomienda que se ajuste la velocidad de paso de los tampones en
torno a 10 ml/cm^{2}/hr hasta 500 ml/cm^{2}/hr.
El método para purificación según la presente
especificación permite la adsorción específica de la toxina
dermonecrótica en una solución conteniendo toxina dermonecrótica,
proporciona un grado de purificación de la toxina dermonecrótica
tan alto como varias decenas hasta 110 veces, y muestra una buena
recuperación de toxina dermonecrótica, el 40% al 100%. La
endotoxina, la cual es responsable de efectos secundarios tales
como fiebre o choque y está contenida en gran cantidad en un
extracto de homogenado celular bacteriano junto con toxina
dermonecrótica, no es adsorbida sobre el gel de éster de sulfato de
celulosa y, de ese modo, reducida a 1/30 hasta 1/800. La toxina
dermonecrótica purificada obtenida muestra tanto como 4 x 10^{5}
hasta 3 x 10^{6} DMN/mg de proteína de actividad específica, y
forma una banda principal en una electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida.
Como se mencionó antes, según el método de la
presente especificación se puede obtener una toxina dermonecrótica
deseada, a partir de una solución de partida conteniendo toxina
dermonecrótica, con buen rendimiento y pureza, los procedimientos
son bastante sencillos, y el adsorbente cromatográfico utilizado
para la purificación puede ser preparado o está disponible a bajo
coste, siendo dicho adsorbente sumamente excelente desde el punto
de vista económico, sin deterioro después de ser utilizado
reiteradamente. Por consiguiente, el método de la presente
invención es un método totalmente excelente para la producción
industrial de toxina dermonecrótica. Además, el método de la
presente especificación puede ser también utilizado en combinación
con la cromatografía de intercambio catiónico convencional, la
cromatografía por filtración en gel, etc., para aumentar
adicionalmente la pureza para, de ese modo, proporcionar resultados
más excelentes que los obtenidos mediante métodos
convencionales.
La toxina dermonecrótica purificada mediante el
método de la presente especificación es transformada en un toxoide
que está privado de la actividad de la toxina, aunque conservando la
inmunogenicidad, por tratamiento con un reactivo químico. La
transformación de la toxina dermonecrótica en un toxoide puede ser
conducida de una manera habitual, por ejemplo, utilizando formalina
[Nakai, T. y col., Infec. Immun., 46, págs. 429-434
(1984)] o utilizando glutaraldehído [Endoh, M. y col., Microbiol.
Immunol., 30, págs. 659-673 (1986)], etc. Para
inducir inmunidad humoral administrando dicho toxoide en el cuerpo
viviente, se administra conjuntamente un adyuvante. Un adyuvante
ejemplar a utilizar incluye gel de aluminio, adyuvante oleoso,
saponina, etc. Dicho toxoide muestra una inmunogenicidad superior
que la de una fracción de toxina dermonecrótica no purificada, y es
también bastante segura, las cuales son confirmadas por los datos en
los Ejemplos como se describe abajo.
La toxina dermonecrótica parcialmente
purificada, obtenida mediante el método descrito aquí, tiene una
alta pureza y está privada de la mayor parte de la endotoxina y, por
eso, es útil para preparar una vacuna para animales. Además, cuando
la pureza de la toxina dermonecrótica parcialmente purificada sea
aumentada adicionalmente empleando el método de la presente
especificación, en combinación con los procedimientos de
purificación convencionales, puede ser utilizada también para
preparar diversos reactivos o medicamentos, o incluso para preparar
vacuna de Bordetella pertussis para humanos.
En la mayoría de los casos de infección natural
con Bb, no aparece un anticuerpo neutralizador de TBb pero aumenta,
en gran proporción, un anticuerpo aglutinador de bacterias, el cual
ha sido utilizado para diagnosis serológica de esta enfermedad.
Según la medición del presente inventor, únicamente dos cerdos
(0'6%) en una granja (2'1%) fueron detectados positivos para
anticuerpo neutralizador de TBb, entre 327 cerdos en 48 granjas en
15 prefecturas donde sucedió RA. Las vacunas muertas de TBb
convencionales aumentan el anticuerpo aglutinador de bacterias,
para interferir la diagnosis. Sin embargo, cuando adicionalmente se
aumenta la pureza del TBb combinando el método de purificación de
la presente invención con los procedimientos de purificación
convencionales, se puede preparar un toxoide que proporcione un
anticuerpo neutralizador pero que no aumente el anticuerpo
aglutinador de bacterias. Una vacuna o toxoide que permita la
distinción serológica entre un anticuerpo inducido por la vacuna y
un anticuerpo inducido por la infección se llama "vacuna
marcadora". Por ejemplo, en granjas libres de patógenos
específicos (LPE), si por alguna casualidad ocurriera una infección
por Bb mientras se utiliza el toxoide de la presente solicitud, para
la prevención de RA, se pueden detectar los cerdos infectados
midiendo el anticuerpo aglutinador de bacterias.
La presente invención tiene que ver con una
mezcla de toxoides constando de toxoide TBb, preparado según el
método de purificación de la presente invención, y un toxoide de
toxina dermonecrótica producido por Pasteurella
multocida.
Para TPm, como se utiliza aquí, un extracto
celular bacteriano Pm de partida incluye un extracto celular
bacteriano de Pm toxigénica o de Pasteurella atípica [Kamp,
E.M.I.E. y col., Vet. Rec., 126, págs. 434-437
(1990)]. Alternativamente, una materia de partida de la presente
invención también incluye un extracto de células donde el TPm está
expresado mediante una técnica de ingeniería genética. Un extracto
preferido utilizado aquí es un extracto celular bacteriano de Pm
toxigénica el cual se cultiva, de una manera habitual, mediante un
cultivo en reposo, un cultivo en agitación, o un cultivo rotatorio
de aireación en un medio líquido tal como medio de infusión
Corazón, caldo de tripticasa-soja, medio
Luria-Betani, medio de infusión Carne [de Jong,
M.F. y Akkermans, J.P.W.M., Vet. Quart., 8, págs.
294-214 (1986)] o mediante un cultivo en agar tal
como medio dextrosa almidón, medio agar sangre, medio YPC [Namioka,
S. y Murata, M., Cornell Vet., 51, págs. 498-507
(1961)], y otros. El cultivo bacteriano en un medio agar es
suspendido en un tampón Tris, etc., utilizando una varilla Conradi,
etc. Después de recuperar células bacterianas por centrifugación, el
cultivo bacteriano en un medio líquido es suspendido en un tampón
adecuado para la siguiente etapa de purificación. La suspensión de
células bacterianas es sometida a sonicación, un tratamiento
enzimático, un prensado, una repetición de
congelación-descongelación, etc., para homogeneizar
las células, y se eliminan los detritus celulares por
centrifugación o filtración por membrana.
Se purifica el extracto celular mediante
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad
preparada con un anticuerpo que identifica TPm, y otras.
Alternativamente, se puede utilizar el sobrenadante obtenido
después del cultivo de Pm toxigénica, en un medio líquido durante 24
a 65 horas, como materia de partida para purificación o sometido
directamente a un proceso para reducir toxicidad.
La fracción de toxina así preparada es sometida
a un proceso de destoxicación por tratamiento con formalina,
glutaraldehído, etc. Después de la terminación de la destoxicación,
el tampón es reemplazado con un salino tamponado con fosfato
mediante diálisis, etc., y a eso se añade un adyuvante. Un ejemplo
de adyuvante que se pueda utilizar incluye gel de aluminio,
adyuvante oleoso, saponina, y otros, Se puede preparar una mezcla
de toxoides mezclando una solución de un antígeno, a una
concentración de dos veces la de la vacuna sencilla complementada
con un adyuvante, con una cantidad equivalente de solución de otro
antígeno a una concentración dos veces la de la vacuna sencilla
complementada con un adyuvante.
La mezcla de toxoides de la presente invención
no es únicamente bastante segura sino que también logra que ambos
anticuerpos neutralizadores de TBb y TPm permitan, de ese modo, la
protección de cerdos de la atrofia de concha o hipoplasia debidas a
ambas toxinas.
El toxoide TBb y la mezcla de toxoides, cuando
son inyectados intramuscularmente a una cerda embarazada, dos veces
en un intervalo de 2 a 6 semanas, al menos una semana antes del
parto, protegen a su progenie de infección vía un anticuerpo
materno proporcionado por el calostro. Para la administración
posterior, para el establecimiento de la inmunidad es suficiente
una única inoculación de toxoide antes del parto. Para el caso de
granjas con infección grave de RA, el toxoide descrito aquí puede
ser también eficazmente inyectado intramuscularmente en lechones de
no menos de 7 días de edad, dos veces en un intervalo de 2 a 6
semanas, para permitir, de ese modo, la protección directa.
La presente invención, definida por las
reivindicaciones adjuntadas, está ilustrada más detalladamente
mediante las Preparaciones y Ejemplos siguientes, pero no se debería
construir para limitarse a ellos.
Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (117
g) a piridina (600 ml), a una temperatura de no más de 0ºC, y se
agita la mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la
mezcla hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Cellulofine
GC-15 (80 g; fabricada por Chisso Corporation) y se
agita la mezcla para reacción a 65 a 70ºC durante 3 horas. Después
de la terminación de la reacción, se enfría la mezcla y se añade una
solución acuosa al 10% de hidróxido sódico para neutralizar
gradualmente la mezcla. Se separa el gel por filtración y se lava
suficientemente con salino tamponado con fosfato 0'01M, para
producir un gel de éster de sulfato de celulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (117
g) a piridina (600 ml), a una temperatura de no más de 0ºC, y se
agita la mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la
mezcla hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Avicel para cromatografía
(80 g; celulosa microcristalina, fabricada por Asahi Kasei Kogyo
K.K.) y se mantiene la mezcla a 65-70ºC durante 4
horas mientras se agita. Después de la terminación de la reacción,
se enfría la mezcla y se añade una solución acuosa al 10% de
hidróxido sódico para neutralizar la mezcla. Se separa el gel por
filtración y se lava suficientemente con salino tamponado con
fosfato 0'01M, para producir un gel de éster de sulfato de celulosa
cristalina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade gota a gota ácido clorosulfónico (82 g)
a piridina (500 ml), a una temperatura de 0 a 5ºC, y se agita la
mezcla. Después de la adición gota a gota, se calienta la mezcla
hasta 65 a 70ºC. A eso se añade Cellulofine GC-25
(80 g; fabricada por Chisso Corporation) y se agita la mezcla para
reacción a 65 a 70ºC durante 4 horas. Después de la terminación de
la reacción, se enfría la mezcla y se añade gradualmente una
solución acuosa al 10% de hidróxido sódico para neutralizar la
mezcla. Se separa el gel por filtración y se lava suficientemente
con salino tamponado con fosfato 0'01M (pH 7'2), para producir un
gel de éster de sulfato de celulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenó una columna (50 mm de d.i. x 200 mm)
con un éster de sulfato de Cellulofine GC-15
preparado como en la Preparación 1, y se equilibró con tampón de
fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor
de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular (200 ml) de
cepa S611 de Bb. Y después, la columna fue lavada con el tampón
anterior para separar mediante lavado los detritus. Luego, se llevó
a cabo una elución por gradiente con tampón de fosfato (pH 8'0;
conductividad eléctrica específica alrededor de 3 a 46 mS/cm)
complementado con cloruro sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción
conteniendo toxina dermonecrótica con 9'1 mg de proteína total. El
índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 39'6%, y el
grado de purificación (actividad específica de la fracción de
toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto
de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 32'1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenó una columna (252 mm de d.i. x 210 mm)
con un éster de sulfato de Cellulofine GC-15
preparado como en la Preparación 1, y se equilibró con tampón de
fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad eléctrica específica alrededor
de 3 mS/cm). A la columna se aplicó un extracto celular de cepa S611
de Bb (29 a 35 g de proteína total). Y después, la columna fue
lavada con tampón de fosfato 0'02M (pH 7'8 a 8'0; conductividad
eléctrica específica alrededor de 3 a 17 mS/cm) complementado con
cloruro sódico 0 a 0'15M, para separar mediante lavado los
detritus. Luego, la toxina dermonecrótica fue eluída con un tampón
de fosfato (pH 7'5 a 7'7; conductividad eléctrica específica
alrededor de 30 a 46 mS/cm) complementado con cloruro sódico 0'3 a
0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina dermonecrótica con
0'2 a 1'1 g de proteína total. Como se muestra en la Tabla 1, el
índice de recuperación de toxina dermonecrótica fue del 76 al 100%,
y el grado de purificación (actividad específica de la fracción de
toxina dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto
de homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 22 a 114, con
la endotoxina siendo reducida al 0'1 a 3%.
Se rellenó una columna (25 mm de d.i. x 140 mm)
con Heparin Sepharose CL-6B (Pharmacia) y se
equilibró con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad
eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó
un extracto celular de cepa S611 de Bb (420 mg de proteína total). Y
después, la columna fue lavada con el anterior tampón para separar
mediante lavado los detritus. Luego, se llevó a cabo una elución por
gradiente con un tampón de fosfato (pH 8'0; conductividad eléctrica
específica alrededor de 3 a 46 mS/cm) complementado con cloruro
sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina
dermonecrótica con 24 mg de proteína total. El índice de
recuperación de toxina dermonecrótica fue del 40'8%, y el grado de
purificación (actividad específica de la fracción de toxina
dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de
homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 7'0. En la Tabla 2
se muestran los resultados analíticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenó una columna (50 mm de d.i. x 140 mm)
con SP-Toyopearl (fabricado por Toso K.K.) y se
equilibró con tampón de fosfato 0'02M (pH 8'0; conductividad
eléctrica específica alrededor de 3 mS/cm). A la columna se aplicó
un extracto celular de cepa S611 de Bb (631 mg de proteína total). Y
después, la columna fue lavada con el anterior tampón para separar
mediante lavado los detritus. Luego, se llevó a cabo una elución por
gradiente con un tampón de fosfato (pH 8'0; conductividad eléctrica
específica alrededor de 3 a 46 mS/cm) complementado con cloruro
sódico 0 a 0'5M, para dar una fracción conteniendo toxina
dermonecrótica con 2 mg de proteína total. El índice de
recuperación de toxina dermonecrótica fue del 11'5%, y el grado de
purificación (actividad específica de la fracción de toxina
dermonecrótica purificada/actividad específica del extracto de
homogenado celular bacteriano) fue tan alto como 35'5. En la Tabla
2 se muestran los resultados analíticos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Una fracción de gel de éster de sulfato de
celulosa para purificación, preparado como en el Ejemplo 1, fue
dializada frente a citrato 33 mM/hidrogenofosfato disódico 66
mM/urea 1M (pH 5'0). El dializado (9'1 mg de proteína total) se
aplicó a sulfopropil SP-Toyopearl 650M (fabricado
por Toso K.K.; 10 mm de d.i. x 80 mm) equilibrado con el mismo
tampón, seguido por lavado con el mismo tampón para separar mediante
lavado los detritus. Después, se llevó a cabo una elución por
gradiente con el anterior tampón, complementado con cloruro sódico
0 a 0'5M, para dar una fracción (fracción SP) conteniendo toxina
dermonecrótica (3'1 mg de proteína total). La fracción SP fue
purificada adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) en una columna G3000 SW (21 mm de d.i. x 600 mm)
con gel TSK, equilibrada con tampón de fosfato 50 mM (pH
7'1)/sulfato sódico 0'3M/urea 1M, para dar una fracción (fracción
HPLC) conteniendo toxina dermonecrótica (1'3 mg de proteína total).
Estos cromatogramas fueron mostrados en las Figs. 1 a 3,
respectivamente. En la Tabla 3 y Fig. 4 se mostraron los resultados
analíticos del extracto de homogenado celular bacteriano y
fracciones de toxina dermonecrótica, y en la Tabla 4 se listaron
las propiedades de la toxina purificada.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \cr \cr \cr}
\newpage
Se añadió formalina a cada fracción de toxina
dermonecrótica, preparada como en los Ejemplos 1 a 5, y se llevó a
cabo la reacción a 37 hasta 40ºC, durante 3 a 14 días, para la
reducción de toxicidad. A la fracción de toxina dermonecrótica se
añadió 3/100 de equivalente de formalina al 10%, seguido por la
misma cantidad al día siguiente, y 2/100 de equivalente en el día
después del siguiente día. Después de completar la reducción de
toxicidad, la fracción fue dializada frente a un salino tamponado
con fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
A la toxina dermonecrótica destoxificada,
preparada como en el Ejemplo 6, se añadió gel de hidróxido de
aluminio y un conservante (timerosal o formalina).
\vskip1.000000\baselineskip
Cada 0'5 ml del toxoide obtenido en el Ejemplo 7
fue inyectado intraperitonealmente a ratones ddY de 5 semanas de
edad, dos veces en un intervalo de 2 semanas. Dos semanas después de
la inmunidad final, los ratones fueron desafiados
intraperitonealmente con aproximadamente 50 (25 a 100) LD_{50} de
toxina dermonecrótica, y se observó la supervivencia durante 7
días. En la Fig. 5 se mostraron los resultados. Hubo una correlación
positiva entre la dosis de toxoide y el índice de supervivencia en
los ratones.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción obtenida como en el Ejemplo 2 fue
sometida a destoxicación como en el Ejemplo 6. Se preparó el
toxoide (2 a 50 \mug/2 ml de dosis), complementado con gel de
hidróxido de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó
intramuscularmente a cerdos LPE de 10 semanas de edad, dos veces en
un intervalo de 3 semanas. No se observó síntomas clínicos o
anormalidad en la temperatura corporal, debidos a la inyección, en
ninguno de los cerdos puestos a prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción HPLC obtenida como en el Ejemplo 5
fue sometida a reducción de toxicidad como en el Ejemplo 6. Se
preparó el toxoide (25 \mug/ml) complementado con gel de hidróxido
de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó intramuscularmente
cada 2 ml a una cerda embarazada, dos veces 6 semanas y 3 semanas
antes del parto. Las cerdas de control fueron inyectadas con una
vacuna placebo. Todas las progenies alimentadas con suficiente
calostro fueron desafiadas intranasalmente con 2 x 10^{8} células
viables de la cepa S6111 de Bb, a los 3 días de edad, y la mitad de
las progenies fueron dos veces desafiadas además,
intramuscularmente, con 2.600 DMN de toxina dermonecrótica, a las 2
y 3 semanas de edad. En la Tabla 5 se mostró el título obtenido del
anticuerpo neutralizador de la toxina dermonecrótica. El título del
anticuerpo neutralizador de TBb fue 32 en sangre y 256 en el
calostro de la cerda al parir, y el título del anticuerpo materno en
la progenie fue 128. El anticuerpo materno continuó siendo positivo
durante más de 6 semanas. Una cerda con inyección placebo, y la
progenie de la misma, fueron seronegativas. En la Tabla 6 se
muestran los resultados de la prueba de desafío. Se detectó atrofia
de concha en nueve de los 12 cerdos de control, con una puntuación
de + a +++, pero no en el grupo inmunizado. No hubo distinción de
la recuperación bacteriana intranasal entre ambos grupos. En cuanto
al peso ganado, hubo diferencia entre ambos grupos cuando se
desafiaron con toxina dermonecrótica además de bacterias Bb vivas,
como se muestra en la Fig. 6. En el primer desafío con toxina
dermonecrótica, a las dos semanas de edad, la proporción de peso
ganado del grupo de control se redujo a aproximadamente 1/3 de la
del grupo inmunizado y, como consecuencia del segundo desafío (a las
3 semanas de edad), murieron todos los cerdos del grupo de
control.
La fracción obtenida como en el Ejemplo 2 fue
sometida a reducción de toxicidad como en el Ejemplo 6. Se preparó
el toxoide (2 a 50 \mug/2 ml de dosis) complementado con gel de
hidróxido de aluminio, como en el Ejemplo 7, y se inyectó dos veces
intramuscularmente a cerdos LPE de 10 semanas de edad, en un
intervalo de 3 semanas. Cuatro semanas después de la inmunidad
total, los cerdos fueron desafiados intranasalmente con 2 x
10^{8} bacterias vivas de Bb, y se comprobó el título del
anticuerpo neutralizador de toxina dermonecrótica hasta 3 semanas
después del desafío. Como se muestra en la Tabla 7, los cerdos de
control permanecieron seronegativos para anticuerpo neutralizador
de toxina dermonecrótica TBb, incluso después del desafío. Por otra
parte, todos los cerdos del grupo inmunizado se transformaron en
seropositivos para anticuerpo neutralizador de TBb. Los cerdos
inmunizados, inyectados con 2 ó 6 \mug/2 ml/dosis de toxoide,
mostraron un aumento radical en anticuerpo neutralizador después
del desafío, mientras que aquellos inyectados con 20 ó 50 \mug/2
ml/dosis no.
Se ha reportado que la toxina dermonecrótica
tiene actividad inhibidora de la producción de anticuerpos [Sekiya,
K., Microbiol. Immunol., 27, págs. 905-915
(1983)]. La razón por la que los cerdos de control no muestren
aumento en anticuerpo neutralizador después del desafío parece ser
debida a la actividad inmunosupresora del TBb producido por las
bacterias desafiadoras. Por consiguiente, puesto que el aumento
radical en anticuerpo neutralizador en el grupo inmunizado es
debido a la protección de la actividad inhibidora de la producción
de anticuerpos de TBb, se sugirió que 2 \mug de toxoide TBb es
eficaz en cerdos de cría.
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\global\parskip0.800000\baselineskip
Se cultivó cepa S611 de Bb en medio peptona, en
un fermentador con aireación a 37ºC durante 24 horas. Las células
bacterianas fueron concentradas por centrifugación y luego rotas
mecánicamente. A una solución (fracción de TBb bruta) obtenida
después de eliminar los detritus mediante centrifugación o
filtración por membrana (tamaño de poro: 0'45 \mum) se añadió
formalina, a una concentración final de 0'8%, y se redujo la
toxicidad entre 37 y 40ºC durante 7 días. El toxoide obtenido fue
dializado frente a un salino tamponado con fosfato. Al producto
dializado se añadió gel de hidróxido de aluminio, a 1 mg (como
cantidad de aluminio)/ml, para dar toxoide TBb 1.
La fracción de TBb bruta obtenida como en la
Preparación 4 fue purificada mediante cromatografía en una columna
de gel de éster de sulfato de celulosa. El TBb bruto fue aplicado a
un gel de éster de sulfato de celulosa equilibrado con tampón de
fosfato 20 mM (pH 8'0), y se lavó el gel con el mismo tampón. Se
elucionó el TBb a partir de una columna de gel de éster de sulfato
de celulosa (7'8 cm de d.i, x 45 cm) con tampón de fosfato 20 mM
(pH 8'0) complementado con ClNa 1'5M y urea 1M. La fracción eluída
(fracción CS1) fue sometida al procedimiento de destoxicación como
en la Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de
hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 2.
La fracción CS1 obtenida como en la Preparación
5 fue purificada adicionalmente mediante una columna de combinación
HW65 (2'64 cm de d.i x 69 cm) y HW75 (2'64 cm de d.i. x 64 cm) con
gel TSK. La fracción CS1 fue pasada a través de la columna
equilibrada con tampón de fosfato 0'05M (pH 7'2) complementado con
sulfato sódico 0'3M y urea 1M, y fraccionada con el mismo tampón, y
luego se combinaron las fracciones conteniendo actividad de toxina
dermonecrótica. La fracción combinada fue sometida al procedimiento
de destoxicación como en la Preparación 4, y, después de diálisis,
se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar toxoide TBb 3.
La fracción de TBb bruta obtenida como en la
Preparación 4 fue purificada mediante cromatografía en una columna
de gel de éster de sulfato de celulosa. El TBb bruto fue aplicado a
un gel de éster de sulfato de celulosa equilibrado con tampón de
fosfato 20 mM (pH 8'0) complementado con ClNa 0'1M, y se lavó el gel
con el mismo tampón. Se eluyó el TBb a partir de una columna de gel
de éster de sulfato de celulosa con tampón de fosfato 20 mM (pH
8'0) complementado con ClNa 0'5M. La fracción eluída (fracción CS2)
fue sometida al procedimiento de destoxicación como en la
Preparación 4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de
aluminio para dar toxoide TBb 4.
La fracción CS2 obtenida como en la Preparación
7 fue purificada adicionalmente mediante una columna de
Affi-gel azul (fabricada por
Bio-Rad; malla 100-200; 5'0 cm de
d.i. x 17 cm). La fracción CS2 dializada frente a tampón Tris 50 mM
(pH 7'5) fue aplicada a una columna de Affi-gel azul
equilibrada con el mismo tampón, y se lavó la columna con tampón
Tris 50 mM (pH 7'5) complementado con hidrogenofosfato disódico 1M.
Después de que la columna fuera lavada además con tampón Tris 50 mM
(pH 7'5), se eluyó el TBb con tampón Tris 50 mM (pH 7'5)
complementado con cloruro magnésico 2M y urea 1M. Esta fracción fue
sometida al procedimiento de destoxicación como en la Preparación
4, y, después de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio
para dar toxoide TBb 5.
Las fracciones de TBb sumamente purificadas,
obtenidas como en los Ejemplos 1 y 5, fueron sometidas al
procedimiento de destoxicación como en la Preparación 4, y, después
de diálisis, se añadió gel de hidróxido de aluminio para dar
toxoide TBb 6. Cada 1 ml de este toxoide fue inoculado, 8 veces
durante 3 meses, a cerdos LPE de 27 semanas de edad, para dar
antitoxina TBb (título de neutralización, 4'096; título del
anticuerpo aglutinador, <20).
Se cultivaron cepas S70 toxigénicas de Pm tipo D
en un caldo infusión Corazón, en un fermentador con aireación a
37ºC durante 24 horas. Las células bacterianas fueron concentradas
por centrifugación y luego rotas mecánicamente. Una solución
(abreviada como "TPm bruta") obtenida después de eliminar los
detritus mediante centrifugación o filtración por membrana (tamaño
de poro: 0'45 \mum) fue purificada mediante cromatografía de
intercambio aniónico. El TPm bruto fue aplicado al intercambiador
aniónico equilibrado con un tampón de fosfato neutro complementado
con ClNa 0 a 0'3M o tampón Tris, y se lavó el intercambiador con el
mismo tampón. Se eluyó el TPm del intercambiador con el mismo
tampón complementado con ClNa 0'4 a 0'5M. Se añadió formalina al
0'4% a esta fracción de TPm parcialmente purificada, y se redujo la
toxicidad a 37ºC durante 14 o más días. El toxoide obtenido fue
dializado frente a un salino tamponado con fosfato. Al dializado se
añadió gel de hidróxido de aluminio, a 1 mg de Al/ml, para dar
toxoide TPm.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cada 0'5 ml de los toxoides TBb con 3.000 DMN/ml
(actividad antes de la destoxicación), obtenidos como en las
Preparaciones 4 a 8, fue inyectado intramuscularmente a cobayas
(Hartely, hembra, 5 semanas de edad) en el muslo. Los animales
fueron desangrados 28 días después de la inyección, y se comprobó el
título del anticuerpo neutralizador de TBb. La medición del
anticuerpo neutralizador se llevó a cabo mediante una dilución
doble seriada de suero inactivado con salino tamponado con fosfato.
Al suero diluido se añadió una cantidad igual de TBb (título: 4
DMN/0'1 ml), y, después de la reacción durante la noche bajo
enfriamiento, cada 0'1 ml de la mezcla fue inyectado
subcutáneamente a cobayas. La medición se hizo un día después de la
inyección, en donde el título de neutralización indicó una máxima
dilución de suero (factor de dilución del suero), la cual inhibió
la reacción dermonecrótica.
Como se muestra en la Tabla 8, los cobayas
inyectados con toxoides TBb 1 y 2, teniendo 1'4 x 10^{4} DMN/mg
de proteína de actividad específica, permanecieron seronegativos
para anticuerpo neutralizador. En el caso de cobayas inyectados con
toxoide TBb 3, teniendo 3'7 x 10^{4} DMN/mg de proteína de
actividad específica, 2 de 3 cobayas fueron seropositivos, y todos
los animales se transformaron en seropositivos con inyección de
toxoide TBb de más de 7'8 x 10^{4} DMN/mg de proteína de actividad
específica.
El TBb es idóneo para ser insolubilizado durante
la purificación, y tiene propiedades para formar fácilmente un
complejo con materias obtenidas bacterianamente tales como lípidos,
proteínas ácidas, etc. [Wordlaw, A.C. y Parton, R., Pharmacol.
Ther., 19, págs. 1-53 (1983)]. Por consiguiente,
parece que la reducción de estas materias obtenidas bacterianamente
permite más bastante destoxicación, o reduce el enmascaramiento del
epítopo(s) inmunogénico en la molécula TBb, a fin de que se
intensifique la eficacia de la exposición de antígenos, para
aumentar de ese modo la inmunogenicidad del toxoide TBb.
Cerdos LPE de dos días de edad fueron
inmunizados pasivamente mediante inyección intraperitoneal de 0'2,
1'0, 2'0 ó 20 ml de antitoxina TBb obtenida en la Preparación 10. A
los tres días de edad, los cerdos fueron desafiados intranasalmente
con 10^{8} UFC de cepa S611 de Bb, y además desafiados
intramuscularmente, a los siete días de edad, con el TBb bruto
(1.940 DMN/cabeza). Como se muestra en la Fig. 7, se observó
protección, con un título de anticuerpo neutralizador de TBb de más
de 1, frente a la actividad letal del TBb, mientras que fue posible
la protección con más de 4 frente a la actividad dermonecrótica.
El toxoide TPm bruto obtenido como en la
Preparación 10 fue emulsionado con una cantidad igual de adyuvante
incompleto de Freund. Ocho cerdas LPE embarazadas fueron divididas
en un grupo de inmunización, constando de 6 cerdas, y un grupo de
control de 2 cerdas. Para el grupo de inmunización, se inyectó
intramuscularmente cada 3 ml de toxoide (840 DMN/ml), 2 a 5 veces,
a cerdos durante el embarazo. Después del parto, la progenie fue
alimentada con suficiente calostro y desafiada intramuscularmente, a
los 2 ó 9 días de edad, con 20 a 160 DMN de TPm bruto. Se
observaron los lechones durante 14 días después del desafío, y se
examinó la lesión en la concha nasal. Como se muestra en la Tabla
9, se observó la protección, frente a la actividad atrófica del TPm
en la concha nasal, en el título del anticuerpo neutralizador de TPm
de más de 2, mientras que fue posible la protección frente a la
actividad letal incluso a menos de 2.
Cerdos LPE de 2 días de edad fueron inmunizados
pasivamente mediante inyección intraperitoneal de 20 ml de
antitoxina TBb obtenida en la Preparación 10. Los cerdos fueron
desafiados intranasalmente, a los 3 y 7 días de edad, con 10^{8}
UFC de cepa S611 de Bb y 10^{8} UFC de cepa S70 de Pm tipo D,
respectivamente, y se realizó la necropsia a las 6 semanas de edad.
Como se muestra en la Tabla 10, se recuperó una gran cantidad de Bb
de la mucosa nasal cuando se inmunizó con antitoxina TBb, mientras
que la recuperación de Pm fue muy inferior en comparación con el
control. La lesión de concha nasal en el grupo de control fue
evaluada como grave (+++) a sumamente grave (++++) mientras que, en
el grupo inmunizado, un cero fue normal (-) y los otros fueron
graves y sumamente graves, demostrando una gran variación de
individuo a individuo.
La toxina dermonecrótica se produce dentro de
las células bacterianas, y se secreta fuera de las células mediante
lisis bacteriana. De acuerdo con esto, la antitoxina TBb no puede
bloquear la colonización por Bb en la mucosa nasal. Para la
colonización por Pm, la Bb debería haber causado previamente la
lesión en la mucosa. Como factores producidos por la Bb, causantes
de la lesión en la mucosa nasal, el TBb [Elias, B. y col., Jpn. J.
Vet. Sci., 52, págs. 677-688 (1990)] y una
citotoxina traqueal [Cookson, B.T. y Goldman, W.E., J. Cell.
Biochem., 11B (Supl.) pág. 124; Dugal, F. y col., Can. J.
Vet. Res., 56, págs. 260-264 (1992)] son los
más importantes. Puesto que la citotoxina traqueal tiene actividad
para interrumpir el movimiento ciliar traqueal, actividad para
destruir células epiteliales ciliares, y actividad para acelerar la
secreción mucosa, todas las actividades siendo importantes para la
colonización por Pm, la inmunización con antitoxina TBb puede
únicamente bloquear parcialmente la colonización por
Pm.
Pm.
Viendo estos hechos, se debería establecer la
inmunización frente, como mínimo, al TBb y la citotoxina traqueal
para bloquear la colonización por Pm en la mucosa nasal. Sin
embargo, el toxoide de citotoxina traqueal dista mucho de uso
práctico, produciendo muchos problemas a resolver tales como el
establecimiento de un procedimiento para purificación,
inmunogenicidad, rendimiento, etc. Por consiguiente, para prevenir
los síntomas primarios de la rinitis atrófica mientras se obvia una
pérdida económica, una vacuna inactivada para RA debería constar,
al menos, de una mezcla de toxoides de toxina dermonecrótica.
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A los TBbs destoxicados obtenidos como en los
Ejemplos 2 y 6 se añadió gel de hidróxido de aluminio, y se agitó
la mezcla. Se preparó una solución madre de toxoide TBb ajustando la
concentración de TBb de 8.700 hasta 220.0000 DMN/ml (equivalente a
2 hasta 50 \mug/ml de proteína de TBb antes de la destoxicación) y
la concentración de aluminio de 0'5 hasta 2'5 mg/ml, y añadiendo un
conservante.
Se preparó una solución madre de TPm preparando
el TPm destoxicado, complementado con gel de hidróxido de aluminio,
obtenido como en la Preparación 11, a 3.400 DMN/ml (cantidad de
toxina antes de la destoxicación) o más, y añadiendo un conservante
a eso. El conservante utilizado fue timerosal al 0'01% o formalina
al 0'1 hasta el 0'4%. Se mezclaron juntas cantidades iguales de la
solución madre de TBb y de la solución madre de toxoide TPm, para
dar una mezcla de toxoides.
Se inoculó intramuscularmente 2 ml de la mezcla
de toxoides, en el cuello de cerdos LPE de 9 semanas de edad, dos
veces en un intervalo de 3 semanas. Se tomó suero con un lapso de
tiempo, y se midieron los títulos de anticuerpo neutralizador de
TBb y de anticuerpo neutralizador de TPm. Se midió el título del
anticuerpo neutralizador de TPm mediante un ensayo de
neutralización utilizando células de pulmón bovinas embrionarias
[Rutter, J.M. y Luther, P.D., Vet. Rec., 114, págs.
393-396 (1984)]. La Tabla 11 muestra los títulos de
anticuerpos neutralizadores en cerdos, mientras que la Tabla 12
muestra los resultados de un ensayo de titulación en ratones. No se
observó distinción en la inmunogenicidad entre cada toxoide simple
de TBb y TPm y la mezcla de toxoides cuando se administraron a
cerdos y ratones, y la mezcla de toxoides exhibió una respuesta de
anticuerpos neutralizadores suficiente para la protección, y fue
bastante segura.
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(Tabla pasa página
siguiente)
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Claims (2)
1. Una vacuna combinada que consta de:
a) un toxoide de toxina dermonecrótica producido
por Bordetella bronchiseptica, teniendo al menos
3'75x10^{5} de dosis mínima necrotizante (DMN)/mg de proteína
antes de la destoxicación, obtenible por tratamiento con un
reactivo químico de una toxina dermonecrótica purificada, a fin de
que la toxina dermonecrótica sea privada de la actividad de dicha
toxina dermonecrótica, aunque conservando la inmunogenicidad, en
donde la toxina dermonecrótica purificada se prepara poniendo en
contacto una solución conteniendo toxina dermonecrótica, producida
por Bordetella bronchiseptica, con un gel
cromatográfico sulfatado mediante sulfatación directa o un gel
cromatográfico al que está unida covalentemente una molécula
sulfatada, o un gel cromatográfico compuesto de un polímero natural
de alto peso molecular o un polímero sintético de alto peso
molecular al que está unido un grupo sulfopropilo, para de ese modo
fabricar la toxina dermonecrótica absorbida sobre el gel, y
eluyendo la toxina dermonecrótica adsorbida a partir del gel; y
b) un toxoide de toxina dermonecrótica producido
por Pasteurella multocida.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La vacuna combinada de la reivindicación 1,
la cual consta del toxoide de la toxina dermonecrótica producida
por Bordetella bronchiseptica como se define en la
reivindicación 1, en donde dicha toxina dermonecrótica purificada
es purificada mediante un método comprendiendo las etapas:
(1) equilibrar el gel cromatográfico sulfatado
mediante sulfatación directa, o el gel cromatográfico al que está
unida covalentemente una molécula sulfatada, tratando previamente el
gel con un tampón teniendo un pH 7 a 9 y una conductividad
eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20 mS/cm;
(2) poner en contacto la solución que contiene
toxina dermonecrótica de Bordetella bronchiseptica con el
gel de adsorción que tiene un grupo sulfato como ligando, o el gel
de adsorción sulfatado mediante sulfatación directa, bajo
condiciones de pH 7 a 9, una temperatura de 0 a 30ºC, y una
conductividad eléctrica específica fija oscilando entre 3 y 20
mS/cm,
(3) lavar el gel de adsorción con un tampón que
tenga pH 5 a 10 y una conductividad eléctrica específica fija
oscilando entre 3 y 20 mS/cm, antes de la elución de la toxina
dermonecrótica del gel; y
(4) eluir la toxina dermonecrótica del gel
utilizando un tampón teniendo pH 5 a 10 y una conductividad
eléctrica específica de más del intervalo fijo de 3 a 20 mS/cm
hasta 130 mS/cm;
y un toxoide de toxina dermonecrótica producido
por Pasteurella multocida.
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