IT201600076743A1 - Nuovo uso del cnf1 - Google Patents
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Description
"NUOVO USO DEL CNF1"
DESCRIZIONE
La presente domanda riguarda l’uso di CNF (Cytotoxic Necrotizing Factor) e/o DNT (dermonecrotic toxin) batterico come principi attivi o principio attivo per la prevenzione e/o il trattamento della malaria causata da plasmodium falciparum, composizioni farmaceutiche comprendenti detto o detti principi attivi per detto uso e un metodo di prevenzione e/o terapia della malaria che comprende la somministrazione di CNF (Cytotoxic Necrotizing Factor) e/o DNT (dermonecrotic toxin) batterico o di una composizione che ne comprende ad un paziente che la necessiti.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
La malaria da Plasmodium falciparum è una delle principali cause di malattia, neuro-invalidità e morte nei paesi tropicali (WHO Malaria Report 2015 doi: ISBN 978 92 4 1564403). In questi paesi ogni anno ci sono oltre 200 milioni di casi clinici di malaria e Γ1 % delle infezioni sintomatiche può degenerare in malaria grave. La malaria grave può manifestarsi sotto forma di anemia, ipoglicemia, acidosi metabolica, convulsioni ripetute, coma o sindrome da disfunzione multiorgano. La più grave manifestazione neurologica della malaria grave è la malaria cerebrale ( cerebral malaria, CM), che ogni anno causa oltre un milione di morti (Snow RW, Guerra CA, Noor AM, Myint HY, Hay SI. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria. Nature. 2005 Mar 10;434(7030):214-7). La caratteristica clinica della CM è la perdita di conoscenza, e nei casi più gravi il coma, causata dall’occlusione dei microvasi cerebrali dovuta all’addensamento dei globuli rossi del sangue infestati dai parassiti (pRBCs) che aderiscono all’endotelio. Le emazie parassitate aderiscono al rivestimento endoteliale (citoaderenza) con le proteine di derivazione del parassita esposte sulla superficie degli eritrociti. L'attivazione del metabolismo del parassita all'interno del globulo rosso comporta una profonda alterazione del metabolismo stesso della cellula ospite e modifiche strutturali specifiche; nel caso di P. falciparum, sulla superficie esterna dell’eritrocita si esprimono molecole che mediano i processi di adesione degli eritrociti infetti alle cellule endoteliali dei microvasi cerebrali. Tale processo, noto come ’sequestramento', costituisce uno dei meccanismi patogenetici fondamentali della CM da P. falciparum (Newbold C, Craig A, Kyes S, Rowe A, Fernandez-Reyes D, Fagan T. Cytoadherence, pathogenesis and thè infected red celi surface in Plasmodium falciparum. Int J Parasitol. 1999 Jun;29(6):927-37). Questa citoaderenza ha un notevole valore adattativo per il parassita, in quanto, bloccando l'eritrocita infetto nella circolazione profonda, ne riduce drasticamente l'eliminazione da parte del sistema reticolo-endoteliale. I meccanismi molecolari alla base del fenomeno del 'sequestramento' coinvolgono recettori endoteliali (CD36, ICAM-1) e proteine del parassita espresse prevalentemente in corrispondenza di estroflessioni citoplasmatiche dell'eritrocita infetto, dette ‘knobs’. In particolare, è ben descritto il ruolo della Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMPI). Questa proteina, codificata da un'ampia famiglia di geni detti var coinvolti nella variabilità antigenica clonale, ha un ruolo centrale nella patogenesi della malaria grave da P. falciparum e può provocare ischemia locale.
Poco si sa circa il signaling cellulare innescato dalla citoaderenza: le molecole di adesione sono note per avere proprietà di trasduzione del segnale che possono innescare cambiamenti nelle cellule endoteliali come un rimodellamento del citoscheletro e delle giunzioni cellulari (Etienne-Manneville S, Manneville JB, Adamson P, Wilbourn B, Greenwood J, Couraud PO. ICAM-1-coupled cytoskeletal rearrangements and transendothelial lymphocyte migration involve intracellular calcium signaling in brain endothelial celi lines. J Immunol. 2000 Sep 15;165(6):3375-83). La famiglia Rho di GTPasi monomeriche (che comprende le sottofamiglie Rho, Rac e Cdc42) svolge un ruolo centrale nella trasmissione dei vari recettori, tra cui ICAM-1, la molecola di adesione delle cellule vascolari (VCAM)-1, e le selectine coinvolte nel signaling di citoaderenza. Le Rho GTPasi agiscono come interruttori molecolari nelle vie di segnalazione intracellulare (attivi quando legati al GTP e inattivi nella forma legata al GDP)e rappresentano i primi intermediari tra i recettori suddetti e gli effettori a valle. In particolare, è stato precedentemente dimostrato che l’adesione degli eritrociti infetti alle cellule endoteliali innesca direttamente l’attivazione delle vie di segnalazione Rho-dipendenti (Taoufiq Z, Gay F, Balvanyos J, Ciceron L, Tefit M, Lechat P, Mazier D. Rho kinase inhibition in severe malaria: thwarting parasite-induced collateral damage to endothelia. J Infect Dis. 2008 Apr 1 ; 197(7): 1062-73).
In questo contesto, il fattore citotossico necrotizzante 1 ( Cytotoxic Necrotizing Factor Type 1 - CNF1) di Escherìchia coli, una tossina proteica che attiva la famiglia delle Rho GTPasi (Flatau G, Lemichez E, Gauthier M, Chardin P, Paris S, Fiorentini C, Boquet P. Toxin-induced activation of thè G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 1997 Jun 12;387(6634):729-33; Schmidt G, Sehr P, Wilm M, Selzer J, Mann M, Aktories K. Gin 63 of Rho is deamidated by Escherìchia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 1997 Jun 12;387(6634):725-9; Lerm M, Selzer J, Hoffmeyer A, Rapp UR, Aktories K, Schmidt G. Deamidation of Cdc42 and Rac by Escherìchia coli cytotoxic necrotizing factor 1: activation of c-Jun N-terminal kinase in HeLa cells. Infect Immun. 1999 Feb;67(2):496-503) e rimodella il citoscheletro delle cellule, può rappresentare una nuova strategia per contrastare la citoaderenza del parassita. Infatti, agendo sul citoscheletro, il CNF1 protegge le cellule epiteliali dall’apoptosi, promuove la macropinocitosi, rafforza l’attività delle cellule naturai killer { NK) e migliora la capacità degli astrociti di sostenere la crescita ed il differenziamento neuronaie. È interessante notare anche che il CNF1 down-regola ICAM-1, sia in cellule NK/Target (Malorni W, Quaranta MG, Straface E, Falzano L, Fabbri A, Viora M, Fiorentini C. The Rac-activating toxin cytotoxic necrotizing factor 1 oversees NK cell-mediated activity by regulating thè actin/microtubule interplay. J Immunol. 2003 Oct 15;171(8):4195-202) che in cellule epiteliali (Fiorentini C, Matarrese P, Straface E, Falzano L, Donelli G, Boquet P, Malorni W. Rho-dependent celi spreading activated by E. coli cytotoxic necrotizing factor 1 hinders apoptosis in epithelial cells. Celi Death Differ. 1998 Nov;5(11):921-9).
Sono note in letteratura proteine altamente omologhe al CNF1 di E. coli, almeno nella parte catalitica; tali proteine sono, ad esempio CNF2 e CNF3 di E. coli, CNFY o CNF1 di Yersinia spp. e la DNT (dermonecrotic toxin) di Bordetella spp.
Queste proteine, come già detto, sono fortemente omologhe al CNF1 (come riportato anche in mediine), soprattutto nella parte catalitica, e quindi farmacologicamente attiva, delle stesse.
Fino ad oggi, i trattamenti 'salva vita’ per la MC hanno riguardato principalmente la somministrazione endovenosa di ACT (artemisinin-based combination therapy), basati su artemisinina ( The World Malaria Report, WHO 2015). Tuttavia, anche se questi farmaci eliminano in modo efficace i parassiti dal sangue, il 15% - 20% dei pazienti muore e gli altri hanno gravi postumi neurologici permanenti (Dondorp A, Nosten F, Stepniewska K, Day N, White N; South East Asian Quinine Artesunate Malaria Trial (SEAQUAMAT) group. Artesunate versus quinine for treatment of severe falciparum malaria: a randomised trial. Lancet. 2005 Aug 27-Sep 2;366(9487):717-25; Idra R, Jenkins NE, Newton CR. Pathogenesis, clinical features, and neurologica! outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 2005 Dec;4(12):827-40). Gli attuali trattamenti per la malaria grave da P. falciparum, che si basano principalmente su una strategia antiplasmodiale diretta, sembrano non essere sufficienti e sono necessari altri approcci complementari per migliorare il quadro clinico della malattia. In questo contesto, la via Rho-chinasi, che è coinvolta nella citoaderenza da P. falciparum (Taoufiq Z, Gay F, Balvanyos J, Ciceron L, Tefit M, Lechat P, Mazier D. Rho kinase inhibition in severe malaria: thwarting parasite-induced collateral damage to endothelia. J Infect Dis. 2008 Apr 1; 197(7): 1062-73), appare un bersaglio farmacologico promettente per un approccio terapeutico efficace contro la malaria. Infatti studi precedenti mostrano che il pre-trattamento di cellule endoteliali con il Fasudil, un noto inibitore della chinasi Rho, ha effetti protettivi sull’endotelio ed è in grado di ridurre l’espressione della molecola di adesione ICAM-1 (Domanda di brevetto CA 2659712 A1-Rho/rock/p13/akt kinase inhibitors for thè treatment of diseases associated with protozoan parasites), mentre il pre-trattamento con Atorvastatina, una statina che promuove sia l’inibizione delle Rhochinasi sia la sopravvivenza delle cellule mediante attivazione Akt , protegge fortemente l'endotelio dall'apoptosi ed è anche in grado di prevenire la citoaderenza da P. falciparum (Taoufiq Z, Pino P, N’dilimabaka N, Arrouss I, Assi S, Soubrier F, Rebollo A, Mazier D. Atorvastatin prevents Plasmodium falciparum cytoadherence and endothelial damage. Malar J. 2011 Feb 28; 10:52; Taoufiq Z, Gay F, Balvanyos J, Ciceron L, Tefit M, Lechat P, Mazier D. Rho kinase inhibition in severe malaria: thwarting parasite-induced collateral damage to endothelia. J Infect Dis. 2008 Apr 1; 197(7): 1062-73; Waknine-Grinberg JH, Hunt N, Bentura-Marciano A, McQuillan JA, Chan HW, Chan WC, Barenholz Y, Haynes RK, Golenser J. Artemisone effective against murine cerebral malaria. Malar J. 2010 Aug 9;9:227). Tuttavia questi farmaci non sono in grado di staccare i parassiti dalle cellule endoteliali e di ridurre significativamente il numero complessivo di parassiti presenti neirorganismo.
Nonostante decenni di ricerca non esiste a tutt’oggi un approccio terapeutico efficace della malaria cerebrale (' severe malaria’), soprattutto a causa della sua natura di sindrome multifattoriale. La causa principale della patologia è dovuta al processo di sequestramento degli eritrociti infettati dal parassita all'interno dei capillari dell’encefalo, mediata dalla capacità di citoaderire all’endotelio vascolare tramite un’interazione ligando-recettore. Tale interazione è inoltre responsabile dell’attivazione di processi infiammatori delle cellule dell’ospite e aumento della permeabilità dell’endotelio vascolare. Allo stato attuale l’OMS suggerisce il trattamento con artesunato intravena, sebbene non riesca a prevenire tutti gli esiti fatali. Studi clinici basati su eritropoietina e/o inalazione di monossido d’azoto sono in corso.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Gli autori della presente invenzione hanno dimostrato la sorprendente ed inattesa efficacia del CNF batterico e/o di proteine ad esso omologhe, nel prevenire la citoaderenza degli eritrociti infettati alle cellule endoteliali, tramite una downregolazione dell’espressione dei principali recettori della cellula ospite utilizzati dal parassita per citoaderire. Totalmente nuova e ancor più significativa si è dimostrata la capacità del CNF1 di favorire il distacco degli eritrociti infetti preventivamente adesi all’endotelio, rendendo il parassita soggetto alla ‘clearence’ della milza.
Quest’ultimo aspetto rappresenta un approccio innovativo e, ad oggi, l’unico con potenzialità di arrestare e/o rallentare i processi innescati dall’adesione dell’eritrocita infetto all’endotelio vascolare. L’azione di inibizione e reversione della capacità dell’eritrocita infetto di aderire da parte del CNF batterico e/o di proteine ad esso omologhe rappresenta, a tutt’oggi, un approccio innovativo nel trattamento della malaria grave con l’ulteriore vantaggio di essere meno soggetto all’insorgenza di fenomeni di farmacoresistenza.
L’invenzione consiste quindi nell’uso della proteina batterica purificata CNF batterica e/o di proteine ad essa omologhe come strumento terapeutico contro l’infezione da Plasmodium falciparum, una delle specie di Plasmodium che causano la malaria nell'uomo. La somministrazione sistemica (orale, intravenosa) di una composizione medicamentosa contenente la proteina batterica purificata CNF e/o di proteine ad essa omologhe, potrà contrastare gli effetti della malaria cerebrale e favorire l’eliminazione del parassita da parte dell’organismo. La somministrazione potrà essere opzionalmente effettuata in combinazione con ulteriori farmaci antimalarici.
È ormai risaputo che un’adeguata aderenza alle terapie antimalariche è di fondamentale importanza per migliorare i risultati del trattamento, riducendo i casi di malaria resistente ai farmaci e aumentando il controllo della malattia. Di fatto, la mancata aderenza alla terapia minaccia l'efficacia stessa dei medicinali, soprattutto nei paesi dove la malaria è endemica: potrebbero aumentare i casi di malaria resistente ai farmaci e di conseguenza la gestione della malattia potrebbe essere ancora più difficoltosa di quanto non lo sia già (Banek K, Lalani M, Staedke SG, Chandramohan D. Adherence to artemisinin-based combination therapy for thè treatment of malaria: a systematic review of thè evidence. Malar J. 2014 Jan 6 ; 13 : 7) . Nello specifico, sono molti gli studi che riferiscono una scarsa aderenza dei pazienti all'intero ciclo di combinazioni terapeutiche a base di artemisina ( Artemisinin-based combination therapy - ACT), a causa dell’elevato numero di compresse, oppure perché il paziente avverte un miglioramento prima che sia terminata la dose prescritta e quindi decide autonomamente di interrompere la terapia (Onyango EO, Ayodo G, Watsierah CA, Were T, Okumu W, Anyona SB, Raballah E, Okoth JM, Gumo S, Orinda GO, Ouma C. Factors associated with non-adherence to Artemisinin-based combination therapy (ACT) to malaria in a rural population from holoendemic region of western Kenya. BMC Infect Dis. 2012 Jun 24; 12:143). Le raccomandazioni dell’OMS sul trattamento con Primachina prevedono l’assunzione del farmaco per 14-21 giorni; non tutti i pazienti purtroppo aderiscono a questo trattamento ( Data control and elimination of plasmodium vivax malaria: a technical brief, WHO 2015), interrompendo prima del dovuto l’assunzione della terapia. Il fatto che il CNF batterico e/o di proteine ad esso omologhe sia efficace dopo una sola somministrazione eliminerebbe quindi il problema dell’aderenza alla terapia risultando in un efficace controllo della malattia con conseguenze sanitarie ed economiche di rilievo.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
Figura 1. Curva dose-risposta per la valutazione dell’effetto del CNF1 sul parassita con tempi di incubazione fino a 48 h, utilizzando il saggio metabolico del LDH.
Figura 2. Effetto del CNF1 sulla citoaderenza endoteliale del P.falciparum. I dati sono espressi come (A) numero medio di parassiti adesi/mm<2>, e (B) come percentuale sul controllo (n = 3).
Figura 3. Il CNF1 contrasta l’aumento di espressione dei recettori endoteliali ICAM-1 and CD36, indotto dal TNF-α. Le cellule sono state trattate con il CNF1 sia “overnight” prima del processo di adesione (CNF1 pre) o successivamente al saggio di adesione dei RBCs, per 2 ore (CNF1 post). Le cellule sono state lisate e processate per l’analisi in Western blot. Le quantità di ICAM-1 and CD36 sono state normalizzate in funzione dei livelli di α-tubulina (istogrammi).
GLOSSARIO
Citoaderenza: avviene quando gli eritrociti infettati da P. falciparum aderiscono all’endotelio dei vasi sanguigni neN’uomo.
Citoscheletro cellulare: è una grande rete di filamenti e tubuli connessi fra di loro che si estendono in tutta la cellula.
Clearance: in questo contesto indica la capacità dell’organismo ospite di eliminare i parassiti presenti nel sangue attraverso l’azione filtrante della milza.
CNF1: è l’acronimo di Cytotoxic Necrotizing Factor Type 1- fattore citotossico necrotizzante di tipo 1, una proteina batterica prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherichia coli. La sequenza del CNF1 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche.
CNF2: è l'acronimo di Cytotoxic Necrotizing Factor Type 2- fattore citotossico necrotizzante di tipo 2, una proteina batterica prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherìchia coli. La sequenza del CNF2 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche.
CNF3: è l'acronimo di Cytotoxic Necrotizing Factor Type 3- fattore citotossico necrotizzante di tipo 3, una proteina batterica prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherìchia coli. La sequenza del CNF3 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche.
CNFY o CNF1: è l'acronimo di Cytotoxic Necrotizing Factor Type Y- fattore citotossico necrotizzante di tipo 3, una proteina batterica prodotta da alcuni ceppi patogeni di Yersinia pseudotuberculosis. La sequenza del CNFY o CNF1 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche.
DNT: è l'acronimo di dermonecrotic toxin- tossina dermonecrotica, una proteina batterica prodotta da alcuni ceppi patogeni di Bordetella spp. in particolare da B. pertussis, B. bronchiseptica, B. avium, B. parapertussis.
La sequenza della DNT è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche.
ICAM-1 e CD36: sono gli acronimi rispettivamente di Intercellular Adhesion Molecule 1 e C luster of Differentiation 36, molecole di adesione cellulare coinvolte nella citoaderenza.
Plasticità sinaptica: è la capacità del sistema nervoso di modificare la quantità di connessioni tra i neuroni (sinapsi).
pRBCs: eritrociti infettati dal P. falciparum.
RHO GTPasi: sono una famiglia di piccole proteine G che agiscono sul citoscheletro actinico delle cellule regolando moltissime funzioni cellulari.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Come precedentemente detto, nel sommario della presente descrizione, gli autori dell'invenzione hanno sorprendentemente scoperto che la proteina batterica scelta tra CNF e/o DNT e/o frammenti della stessa o loro miscele che conservano la porzione catalitica attiva, possono essere utilizzati vantaggiosamente nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum.
Gli autori dell’invenzione hanno infatti dimostrato che le proteine batteriche sopra riportate (CNF e/o DNT) e come definite nella descrizione e nelle rivendicazioni impediscono l'adesione degli eritrociti infettati da Plasmodium falciparum all'endotelio e, soprattutto, che inducono il distacco degli eritrociti infetti. Senza voler essere legati a teorie, gli autori ipotizzano che l’effetto delle proteine suindicate sul legame degli eritrociti infettati da P. falciparum alle cellule endoteliali, dipenda da una modulazione coordinata di processi legati alla motilità e alla plasticità del citoscheletro. Il rimodellamento del citoscheletro degli eritrociti infettati indotto dal trattamento con le proteine sopra definite potrebbe spiegare la perdita della capacità del parassita di citoaderire e potrebbe promuovere il loro distacco dall'endotelio vascolare con la conseguente "eliminazione" dalla circolazione periferica degli eritrociti infettati. Gli autori hanno anche sorprendentemente scoperto e dimostrato l’efficacia proteine batteriche sopra riportate (CNF e/o DNT) e come definite nella descrizione e nelle rivendicazioni non solo nel prevenire la citoaderenza degli eritrociti infettati alle cellule endoteliali, tramite una down-regolazione dell’espressione dei principali recettori della cellula ospite utilizzati dal parassita per citoaderire ma anche nel favorire il distacco degli eritrociti infetti preventivamente adesi all’endotelio, rendendo il parassita soggetto alla ‘clearence’ della milza.
Quest’ultimo aspetto rappresenta un approccio innovativo e, ad oggi, l’unico con potenzialità di arrestare e/o rallentare i processi innescati dall’adesione dell’eritrocita infetto all’endotelio vascolare. L’azione di inibizione e reversione della capacità dell’eritrocita infetto di aderire da parte delle proteine batteriche sopra riportate (CNF e/o DNT) e come definite nella descrizione e nelle rivendicazioni rappresenterebbe, a tutt’oggi, un approccio innovativo nel trattamento della malaria grave con l’ulteriore vantaggio di essere meno soggetto all’insorgenza di fenomeni di farmacoresistenza. E’ pertanto oggetto della presente invenzione una proteina batterica scelta tra CNF e/o DNT e/o frammenti della stessa che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele, per uso nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum.
Per frammenti che conservano la porzione catalitica attiva s’intendono frammenti delle proteine come definite nella presente descrizione e nelle rivendicazioni, purché tali frammenti conservino la porzione catalitica e tale porzione catalitica abbia l’attività della proteina selvatica
Secondo la presente descrizione, la proteina per uso nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum, può essere scelta tra CNF1, CNF2, CNF3 di Eschericha coir, CNFY o CNF1 di Yersinia spp. (ad esempio di Yersinia tubercolosis o pseudotubercoiosis)\ CNF di Erwinia spp. DNT di Bordetella spp. o loro miscele. Ulteriormente, possono essere utilizzati, per lo stesso scopo preventivo e/o terapeutico, uno o più frammenti delle proteine sopra descritte, purché tali frammenti conservino la porzione catalitica e tale porzione catalitica abbia l’attività della proteina selvatica.
Secondo una forma di realizzazione della presente descrizione, detta DNT di Bordetella spp. è scelta tra DNT di B. pertussis e/o DNT di B. bronchiseptica B. e/o DNT di B. avium e/o DNT di B. parapertussis o tra loro miscele.
In particolare, secondo la presente invenzione possono essere utilizzate proteine batteriche omologhe alla proteina CNF1 di E. coli e aventi la stessa funzione.
Secondo la presente invenzione, la proteina CNf1 ( Cytotoxic Necrotizing Factor Type 1- fattore citotossico necrotizzante di tipo 1), corrisponde alla proteina prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherìchia coli. La sequenza del CNF1 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche e non sono necessarie, per il tecnico del settore, ulteriori informazioni per realizzare facilmente l’invenzione.
Secondo la presente invenzione, la proteina CNF2 ( Cytotoxic Necrotizing Factor Type 2- fattore citotossico necrotizzante di tipo 2), corrisponde alla proteina prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherìchia coli. La sequenza del CNF2 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche e non sono necessarie, per il tecnico del settore, ulteriori informazioni per realizzare facilmente l’invenzione.
Secondo la presente invenzione, la proteina CNF3 ( Cytotoxic Necrotizing Factor Type 3-fattore citotossico necrotizzante di tipo 3), corrisponde alla proteina prodotta da alcuni ceppi patogeni di Escherichia coli. La sequenza del CNF3 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche e non sono necessarie, per il tecnico del settore, ulteriori informazioni per realizzare facilmente l’invenzione.
Secondo la presente invenzione, la proteina CNFY o CNF1 ( Cytotoxic Necrotizing Factor Type Y- fattore citotossico necrotizzante di tipo 3), corrisponde alla proteina prodotta da batteri Yersinia pseudotuberculosis. La sequenza del CNFY o CNF1 è nota in letteratura e riportata in banche dati pubbliche e non sono necessarie, per il tecnico del settore, ulteriori informazioni per realizzare facilmente l’invenzione.
Secondo la presente invenzione, la proteina DNT ( dermonecrotic toxin- tossina dermonecrotica) corrisponde alla proteina prodotta da batteri appartenenti Bordetella spp. la cui sequenza è nota in letteratura. Nelle forme di realizzazione preferite della presente invenzione, la proteina potrà essere, ad esempio, una DNT da B. pertussis, B. bronchiseptica, B. avium, B. parapertussis o miscele di esse. Le sequenze delle varie DNT sono note in letteratura e riportate in banche dati pubbliche e non sono necessarie, per il tecnico del settore, ulteriori informazioni per realizzare facilmente l’invenzione.
Un esempio non limitativo di proteine idonee alla realizzazione della presente invenzione è riportato nella tabella 1 sotto dove sono indicati entry name e organismo di proteine CNF o DNT come disponibili al pubblico nella banca dati UNIPROT in data 21/07/2016.
Tabella 1
Entry name Organismo
W6AYD9_9G AM M Moritella viscosa
Q47106_ECOLX Escherichia coli
Q7VTS2_BORPE Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) Q1R2UO_ECOUT Escherichia coli (strain UTI89 / UPEC)
Q2KUX5_B0RA1 Bordetella avium (strain 197N)
Q7W4W3_BORPA Bordetella parapertussis (strain 12822 / ATCC BAA-587 / NCTC 13253) AOAOC6PDA9_BORBO Bordetella bronchiseptica 253
Bordetella bronchiseptica (strain ATCC BAA-588 / NCTC 13252 / RB50) AOAOH3LPZ7_BORBR (Alcaligenes bronchisepticus)
Q47107_ECOLX Escherichia coli
Entry name Organismo
B2VHY9_ERWT9 Erwinia tasmaniensis (strain DSM 17950 / CIP 109463 / Etl/99) Q8KTM3_ECOLX Escherichia coli
E3DDI9_ERWSE Erwinia sp. (strain Ejp617)
Q1M2S9_EC0LX Escherichia coli
Q8KTM4_ECOLX Escherichia coli
Q46962_ECOLX Escherichia coli
AOA125XP14_ECOLX Escherichia coli 2-460-02_Sl_C2
AOA168S6Z2_ECOLX Escherichia coli
Q45336_BORPT Bordetella pertussis
Bordetella pertussis (strain ATCC 9797 / DSM 5571 / NCTC 10739 / A0A0T7 C RY6_BO R P 1 18323)
Q45044_BORBO Bordetella bronchiseptica (Alcaligenes bronchisepticus) C5ZZQ2_ECOLX Escherichia coli Vir68
AOAOK5ZZ47_ECOLX Escherichia coli
AOAOAOXE42_BORPT Bordetella pertussis B1920
Q9EYH7_YERPU Yersinia pseudotuberculosis
QOE668_ECOLX Escherichia coli
A0A0U0VI01_BORPT Bordetella pertussis
A0A0N9JNY6_YERPU Yersinia pseudotuberculosis
A0A0H3B5B9_YERPY Yersinia pseudotuberculosis serotype 0:3 (strain YPIII) DOZ517_PHODD Photobacterium damselae subsp. damselae CIP 102761 A0A063UW49_BORB
0 Bordetella bronchiseptica OSU553
Q9S5D5_BORBO Bordetella bronchiseptica (Alcaligenes bronchisepticus) IOVKY3_ECOLX Escherichia coli W26
AOAOL1C6V4_ECOLX Escherichia coli
AOA026RKM1_ECOLX Escherichia coli 0119:1-14 str. 03-3458
A0A0W3 DO A0_ESC F E Escherichia fergusonii
AOAON2IV24_BORPT Bordetella pertussis H921
Secondo l’invenzione si potrà utilizzare per l’uso terapeutico e/o preventivo della
malaria causata da Plasmodium falciparum una qualsiasi di queste proteine o loro
miscele così come potranno essere anche utilizzati frammenti delle stesse (miscelati
tra loro o con una o più delle proteine sopra descritte) che conservino la porzione
catalitica attiva.
La proteina o i frammenti attivi della proteina come qui descritti potranno essere
prodotti direttamente dai batteri sopra indicati o anche per via ricombinante e potranno
essere purificati mediante metodi standard comunemente utilizzati nel settore,
Come descritto sopra e mostrato nella parte sperimentale, la proteina o la miscela di
proteine o frammenti di esse come definiti nella presente descrizione e nelle rivendicazioni hanno sorprendentemente mostrato, non solo la capacità di prevenire la citoaderenza degli eritrociti infettati da Plasmodium falciparum alle cellule endoteliali ma anche quella di favorire il distacco di eritrociti infettati da plasmodium falciparum preventivamente adesi all’endotelio fornendo pertanto, non solo un effetto preventivo, ma anche un effetto realmente terapeutico che permette una clearance del parassita da parte della milza. L’effetto delle proteine o dei loro frammenti come qui definite e come definite nelle rivendicazioni, permettono pertanto di realizzare nel tempo una reale eradicazione del parassita dal sangue del paziente.
Secondo la presente descrizione, la proteina o miscela di proteine come definita nella descrizione e nelle rivendicazioni, potrà essere utilizzata per un trattamento terapeutico che prevede la somministrazione della stessa in una o più dosi ad un paziente che ne abbia bisogno.
Il paziente potrà quindi essere un individuo che debba potenzialmente esporsi al parassita oppure un individuo già affetto da malaria.
La proteina o la miscela di proteine o loro frammenti per l’uso nella terapia e/o nella prevenzione della malaria causata da Plasmodium falciparum potrà essere somministrata mediante somministrazione sistemica come ad esempio per via orale, intravenosa, transmucosale, percutanea, rettale, sublinguale, per inalazione o per aerosol.
La proteina o la miscela di proteine o loro frammenti potrà essere somministrata in una o più dosi, è pertanto prevista anche una somministrazione realizzata in una singola dose.
E’ anche oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente una proteina batterica scelta tra CNF e/o DNT e/o frammenti della stessa che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele, e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile per uso nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum.
Tutte le definizioni e le descrizioni fornite sopra delle proteine e dei frammenti attivi delle stesse si applicano anche alle forme di realizzazione della composizione dell'invenzione.
E’ quindi oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica per uso nella prevenzione e/o nella terapia della malaria causata da Plasmodium falciparum in cui detta proteina può essere scelta tra CNF1, CNF2, CNF3 di Escherìcha coir, CNFY o CNF1 di Yersinia tubercolosis\ DNT di Bordetella spp., frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele.
Inoltre, cui detta DNT di Bordetella spp. potrà essere scelta tra DNT di B. pertussis e/o DNT di B. bronchiseptica B. e/o DNT di B. avium e/o DNT di B. parapertussis frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele. L’esperto in formulazioni farmaceutiche potrà scegliere senza particolare difficoltà i veicolanti e gli eventuali agenti eccipienti, conservanti, aromi e ulteriori additivi comunemente utilizzati nella pratica delle preparazioni farmaceutiche.
Secondo l’invenzione, la composizione farmaceutica potrà essere quindi realizzata in forma di sospensione iniettabile, per uso orale o per inalazione; di emulsione, di compressa, di capsula, di gelatina dura o morbida, di supposta, di enteroclisma, di sciroppo, di elisir e simili.
La composizione potrà essere inoltre formulata in singole unità di dosaggio, in aliquote dosabili o in formulazioni a dose unica.
La prevenzione e/o trattamento potranno quindi essere realizzati mediante somministrazione della stessa in una o più dosi ad un paziente che ne abbia bisogno. Secondo una forma di realizzazione, la somministrazione della composizione farmaceutica dell’invenzione potrà essere realizzata mediante somministrazione sistemica, come ad esempio per via orale, intravenosa, transmucosale, percutanea, rettale, sublinguale, per inalazione o per aerosol e simili.
La sezione seguente serve a mostrare alcuni dati sperimentali ottenuti dagli autori dell’invenzione così come a esemplificare, in via non limitativa, forme di realizzazione dell’invenzione unitamente
ESEMPI E DATI SPERIMENTALI
Il trattamento con il CNF1 non influenza la vitalità del parassita:
L’ipotetica attività tossica del CNF1 nei riguardi del parassita, è stata preventivamente testata utilizzando il saggio metabolico del LDH, in esperimenti di dose-risposta con tempi di incubazione fino a 48 h. I risultati hanno mostrato che il CNF1 non ha effetto significativo sulla capacità di crescita e/o moltiplicazione del parassita nel range di concentrazioni utilizzate (Figura 1).
Il CNF1 riduce la citoaderenza degli eritrociti infetti alle cellule endoteliali:
Abbiamo studiato l’effetto del CNF1 sull'adesione del parassita clone ITG, in grado di legarsi in modo efficiente attraverso ICAM-1 e CD36 (Ockenhouse CF, Ho M, Tandon NN, Van Seventer GA, Shaw S, White NJ, Jamieson GA, Chulay JD, Webster HK. Molecular basis of sequestration in severe and uncomplicated Plasmodium falciparum malaria: differential adhesion of infected erythrocytes to CD36 and ICAM-1. J Infect Dis. 1991 Jul; 164(1): 163) alla linea di cellule endoteliali HBMEC-60, in presenza o assenza di una fase di attivazione a 12 h con 100 U / mi rTNF-alpha. Cellule HBMEC-60 monostrato sono state: 1) pre-incubate durante la notte con il CNF1 prima di essere esposte a pRBCs; 2) incubate con il CNF1 per 2 h dopo il legame di pRBCs.
I dati hanno mostrato che la citoaderenza del parassita è diminuita del 48% ± 10 rispetto ai controlli non pre-trattati con il CNF1(10<'10>M). È interessante notare che 2 h di incubazione con il CNF1 dopo il legame dei pRBC con l’endotelio, ha portato ad una diminuzione del 40% del pRBCs legati al monostrato endoteliale rispetto al controllo. Questo effetto sulla citoaderenza non è stato osservato utilizzando il ricombinante CNF1 C866S che non ha la capacità di attivare le Rho GTPasi. Pertanto il CNF1 non solo è in grado di prevenire l'adesione dell’eritrocita infettato da P. falciparum alle cellule endoteliali, ma è anche in grado di “staccare” l’eritrocita infettato dal parassita dalle cellule endoteliali. Inoltre, la mancata osservanza di questo effetto utilizzando CNF1 C866S suggerisce fortemente che l’attività delle Rho GTPasi è cruciale in questo processo (Figura 2).
Il CNF1 inibisce l'espressione di ICAM-1 e CD36:
La citoaderenza dei pRBCs agli endoteli del microcircolo sanguigno coinvolge PfEMP-I e recettori quali CD36 e ICAM-1 (Almelli T, Ndam NT, Ezimegnon S, Alao MJ, Ahouansou C, Sagbo G, Amoussou A, Deloron P, Tahar R. Cytoadherence phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is associated with specific pfemp-1 expression in parasites from children with cerebral malaria. Malar J. 2014 Aug 25; 13:333). Quindi, per chiarire il meccanismo con cui il CNF1 è stato capace di “staccare" i globuli rossi infettati dalle cellule endoteliali, abbiamo analizzato l'espressione di questi recettori attraverso tecniche di Western blot in due diverse condizioni sperimentali: (i) sulle cellule pre-trattate con il CNF1 la notte prima del processo di adesione e (ii) su cellule trattate per 2 h con la tossina dopo l'adesione dei iRBCs. I risultati in Fig. 3 mostrano chiaramente la capacità del CNF1 di contrastare l'aumento del TNF-α indotto di una CD36 e ICAM-1 in entrambe le condizioni sperimentali (Figura 3).
Preparazione del CNF1
II CNF1 è stato ottenuto dal ceppo 392 ISS (donato da V. Falbo, Roma, Italia) e purificato come precedentemente descritto (Falzano L, Fiorentini C, Donelli G, Michel E, Kocks C, Cossart P, Cabanié L, Oswald E, Boquet P. Induction of phagocytic behaviour in human epithelial cells by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor type 1. Mol Microbiol. 1993 Sep;9(6): 1247-54). La proteina ricombinante CNF1 C866S (mCNF1), nella quale l’attività enzimatica delle Rho GTPasi è stata bloccata in seguito alla mutazione della cisteina in posizione 866 con una serina (Schmidt G, Selzer J, Lerm M, Aktories K. The Rho-deamidating cytotoxic necrotizing factor 1 from Escherichia coli possesses transglutaminase activity. Cysteine 866 and histidine 881 are essential for enzyme activity. J Biol Chem. 1998 May 29;273(22):13669-74), è stata utilizzata come controllo. Il plasmide codificante per CNF1 C866S, purificato come precedentemente descritto da Falzano et al. (1993), è stato gentilmente donato da E. Lemichez (U627 INSERM, Nizza, Francia).
Colture del parassita
La linea ITG di P. falciparum (Ockenhouse et al . 1991) è stato coltivata in eritrociti umani 0+ al 5 % di ematocrito utizzando un’atmosfera al 5% di C02, 2 % di 02, 93 % N2. Come terreno di coltura è stato utilizzato RPMI 1640 (Gibco) addizionato con 25 mM Hepes, 50 pg / mL ipoxantina, 0,25 mM NaHC03, 50 mg/ml di gentamicina solfato, e 10% di siero umano 0+ inattivato con il calore. Per la sincronizzazione degli stadi desiderati del parassita, colture al 5-8% di parassitemia e al 5% di ematocrito sono state centrifugate a 2000 rpm per 10 minuti, risospese in terreno incompleto (RPMI 1640 addizionato con glucosio 6 mM, pH 7,2) e adagiate sopra un cuscino di Percoli (Sigma) al 60%. Prima del saggio, i campioni sono stati lavati due volte in terreno incompleto e risospesi al 3% di parassitemia e 1% di ematocrito.
Saggio in vitro di suscettibilità ai farmaci
Il CNF1 è stato diluito nel terreno completo dei parassiti e sono state fatte diluizioni seriali in una piastra da 96 pozzetti (Euroclone), in un volume finale di 100 pl/pozzetto. Trofozoiti/schizonti derivanti da una coltura di parassiti asincrona, con una parassitemia del 1-1.5%, sono stati distribuiti nella piastra (100 μΙ/pozzetto, ematocrito finale 1%) e incubati per 48 ore a 37°C. L’epoxomicina (Sigma E3652) è stata utilizzata come controllo per gli asessuati. Gli esperimenti sono stati condotti in duplicato per tre volte. La crescita dei parassiti è stata determinata allo spettrofotometro, misurando l’attività della lattato deidrogenasi del parassita (pLDH), seguendo il protocollo descritto in Makler MT, Ries JM, Williams JA, Bancroft JE, Piper RC, Gibbins BL, Hinrichs DJ. Parasite lactate dehydrogenase as an assay for Plasmodium falciparum drug sensitivity. Am J Trop Med Hyg. 1993 Jun;48(6):739-41. Brevemente, le colture trattate con il CNF1 sono state risospese e 20pl/pozzetto sono stati trasferiti in una piastra contenente 100 μΙ del reagente malstat [0.11% v/v Triton-100; 115.7 mM 123 lithium L-lactate; 30.27 mM Tris; 0.62 mM 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (APAD; Sigma- 124 Aldrich); portato a pH 9 con 1 M HCI] e 25 μΙ di PES/NBT (1.96 mM nitro blue tetrazolium 125 chloride; 0.24 mM phenazine ethosulphate). La piastra è stata letta alla lunghezza d’onda di 650nm usando il lettore di micropiastre Synergy4 (BioTek) e i risultati sono stati espressi come concentrazione inibente (IC50).
Cellule endoteliali
Cellule endoteliali immortalizzate derivate da midollo osseo (HBMEC-60) sono state donate gentilmente dal Dr. E Van der Schoot (CLB, Sanquin Blood Supply Foundation, Paesi Bassi). Le HBMEC-60 sono state coltivate in flask rivestite da uno strato di gelatina 1%, usando un terreno di cultura specifico per le cellule endoteliali (EBM-2 BulletKit, Lonza),
Saggio di adesione statica
Le cellule endoteliali sono state seminate su un vetrino coprioggetto con un diametro di 13mm (Nalgene, Nunc), rivestito con uno strato di gelatina 1%. Raggiunta la confluenza, le cellule sono state incubate tutta la notte a 37°C con 1 ng/ml di rTNF-alpha (Invitrogen UK). Successivamente sono state lavate con DMEM e incubate con 0.5 mi di una sospensione di parassiti (3% parassitemia e 1% ematocrito) per 2 ore a 37°C. Dopo due lavaggi in RPMI 1640, le cellule sono state trattate con CNF1 e mCNF1 per 2 ore. I vetrini coprioggetto sono quindi stati lavati nuovamente con RPMI 1640 due volte per 30 minuti, per rimuovere i parassiti non adesi alle cellule. Infine, le cellule sono state fissate con 1% gluteraldeide e colorate con Giemsa 5% per 30 minuti. Ogni condizione sperimentale è stata ripetuta tre volte e i parassiti sono stati contati ad un ingrandimento di 400<χ>. Il loro numero è stato espresso come numero di globuli rossi infetti per mm2.
Estrazione proteica e western blot
Le cellule sono state lisate in Sample Buffer 1x (50mM Tris-HCI pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 100mM DTT) preriscaladato a 100°C. Trenta pg degli estratti proteici totali sono stati separati su gel di poliacrilammide SDS-PAGE all’8% e successivamente trasferiti elettricamente su filtri PVDF. Dopo aver saturato i siti liberi con TBS-T (20mM Tris-HCI (pH 7.4), 150mM NaCI, 0.02% Tween-20) contenente il 5% di latte scremato (BIORAD), i filtri sono stati incubati per tutta la notte a 4°C con i seguenti anticorpi primari diluiti in TBS-T contenente il 2% di latte: anticorpo monoclonale di topo anti-ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology, diluizione 1:500), anticorpo policlonale di coniglio anti-CD36 (Santa Cruz Biotechnology, diluizione 1:500), anticorpo monoclonale di topo anti-alfa tubulina (Sigma-Aldrich, diluizione 1:10000). Dopo numerosi lavaggi in TBS-T, i complessi immuni sono stati rilevati con un antisiero secondario specie-specifico coniugato con la perossidasi di Rafano (Jackson Laboratory), seguito da una reazione basata sul metodo della chemioluminescenza, ECL (Enhanced Chemioluminescence Detection, Millipore Corporation). Le proteine rilevate mediante immunoblotting sono state quantificate mediante densitometria (ChemiDoc imaging System, BioRad) e normalizzate in funzione dei livelli di espressione della α-tubulina per mezzo del programma Image-Lab (Bio-Rad).
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Proteina batterica scelta tra CNF e/o DNT e/o frammenti della stessa che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele, per uso nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum.
- 2. Proteina per l’uso secondo la rivendicazione 1 in cui detta proteina è scelta tra CNF1, CNF2, CNF3 di Eschericha coli, CNFY o CNF1 di Yersinia tubercolosi, DNT di Bordetella spp., frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele.
- 3. Proteina per l’uso secondo la rivendicazione 2 in cui detta DNT di Bordetella spp. è scelta tra DNT di B. pertussis e/o DNT di B. bronchiseptica e/o DNT di B. avium e/o DNT di B. parapertussis, frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele.
- 4. Proteina o miscela di proteine per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detta prevenzione e/o trattamento è realizzata mediante somministrazione di detta proteina o miscela di proteine in una o più dosi ad un paziente che ne abbia bisogno.
- 5. Proteina o miscela di proteine per l’uso secondo la rivendicazione 4 in cui detta somministrazione è una somministrazione sistemica per via orale, intravenosa, transmucosale, percutanea, rettale, sublinguale, per inalazione o per aerosol.
- 6. Proteina o miscela di proteine per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4 o 5 in cui detta somministrazione è realizzata in una singola dose.
- 7. Composizione farmaceutica comprendente una proteina batterica scelta tra CNF e/o DNT e/o frammenti della stessa che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele e almeno un veicolante farmaceuticamente accettabile per uso nella prevenzione e/o nel trattamento della malaria causata da Plasmodium falciparum.
- 8. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 7 in cui detta proteina è scelta tra CNF1, CNF2, CNF3 di Eschericha coir, CNFY o CNF1 di Yersinia tubercolosis ; DNT di Bordetella spp.. frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele.
- 9. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 8 in cui detta DNT di Bordetella spp. è scelta tra DNT di B. pertussis e/o DNT di B. bronchiseptica B. e/o DNT di B. avium e/o DNT di B. parapertussis, frammenti delle stesse che conservano la porzione catalitica attiva, o loro miscele.
- 10. Composizione farmaceutica per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9 in forma di sospensione iniettabile, per uso orale o per inalazione; di emulsione, di compressa, di capsula, di gelatina dura o morbida, di supposta, di enteroclisma, di sciroppo, di elisir.
- 11. Composizione farmaceutica per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 10 in cui detta prevenzione e/o trattamento è realizzata mediante somministrazione della stessa in una o più dosi ad un paziente che ne abbia bisogno.
- 12. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 11 in cui detta somministrazione è una somministrazione sistemica per via orale, intravenosa, transmucosale, percutanea, rettale, sublinguale, per inalazione o per aerosol.
- 13. Composizione farmaceutica per l’uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11 o 12 in cui detta somministrazione è realizzata in una singola dose.
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