WO1995034322A1

WO1995034322A1 - Procede d'epuration d'une necrotoxine produite par bordetella, et anatoxine d'une telle necrotoxine

Info

Publication number: WO1995034322A1
Application number: PCT/JP1995/001125
Authority: WO
Inventors: Toru Kawai; Toshihiro Ushijima; Kozo Takase; Hideo Fujikawa
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 1995-12-21
Also published as: CN1130225C; EP0773030A4; CN1154655A; CN1279978C; JP4340672B2; DK1297845T3; EP1297845A3; EP1297845A2; ES2326793T3; ATE432712T1; US6124432A; ES2206507T3; EP0773030A1; CN1494922A; DK0773030T3; EP1297845B1; JP2006342175A; CA2192165A1; DE69531690D1; ATE248603T1

Description

明細書

ボルデテラ属菌産生壌死毒素の精製方法およびトキソィド

技術分野

本発明は、豚の伝染性疾患に対する予防薬に関する。さらに詳細には、改良されたボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドおよびそのパスッレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドとの混合トキソィド並びに該トキソィドの調製方法に関する。

発明の背景

萎縮性鼻炎 (以下、 A Rと略称することがある）は豚の慢性呼吸器病で、鼻甲介萎縮、発育遅延、鼻出血、鼻曲がり及び他の呼吸器病の誘発等を主徵とする伝播力の極めて強い疾病である。本病の起因菌としては、毒素原性気管支敗血症菌 (以下、 B bと略称することがある）及び毒素原性パスッレラ ·マルトシーダ (以下、 P mと略称することがある）が認められており、上部気道粘膜に感染する。 B bは定着因子である赤血球凝集素や線毛を保有しているため鼻粘膜に対する定着性が強いが、それを保有しない P mは単独で定着することが困難である。そのため、 P mの感染が成立するためには予め鼻粘膜を障害する因子の存在が必要である。その最も代表的な因子が B bであり、鼻粘膜障害に関与する病原性因子として、気管細胞毒素や壊死毒素が知られている。実験感染では、子ブタに対し B b、続いて数曰後に P mを鼻内感染させることにより野外農場で観察されるような重篤な A Rを再現することができる。

ボルデテラ属菌には、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、ボルデテラ ·アビゥム等があり、これらは種々の生物学的活性物質を産生する B b壌死毒素（以下、 B b Tと略称することがある）はこれらの生物学的活性物質の 1つであり、いずれのボルデテラ属菌も B b Tを産生する。 B b Tは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、血管平滑筋収縮作用、局所の血行障害、脾臓萎縮作用および抗体産生阻害作用などの生物学的活性を有し、ボルデテラ属菌による発症において重要な役割を演じていることが明らかになった。さらに、 BbTは Bbによる子豚の肺炎病巣形成にも重要な役割を演じていることが明らかにされた（Eoop II, E. M. et al. ,：インフエクシヨンアンドィムニティ一 Infect. Imniun. , 5 ,p.217〜222(1987))。

—方、パスッレラ 'マルトシーダの一部あるいは非定型的パスッレラの —部の菌株は、 Pm壊死毒素（以下、 PmTと略称することがある）を産生する。 PmTは出血壊死作用、鼻甲介萎縮作用、発育遅延作用、致死作用、局所の血行障害および脾臓萎縮作用などの生物学的活性を有し、毒素原性 Pmによる発症において重要な役割を演じていることが明らかにされている。また、 PmTは毒素原性 Pmによる豚の肺炎病巣形成において密接に関係していることが明らかになった（Iwamatsu,S. and Sawada, T.；ジャパニーズジャーナルォブヴェテリナリーサイエンス： Jpn. J. Vet. Sci. , 50, p.1200〜 1206(1988))。 B b Tおよび PmTはいずれも培地中に産生されず菌体内に蓄積されるが、長期間培養による溶菌に伴つて菌体内から培養上清に遊離する。生体内においては溶菌に伴って菌体内から遊離した壊死毒素が作用する。

上述の状況下、壊死毒素の生体防御における役割についてはなお不明な点があり、これらを解明していく上での壊死毒素を大量に調製する方法の開発、ならびに疾病予防のための壌死毒素のトキソィドの開発が望まれている。しかし、壌死毒素は熱に対し不安定で精製が進むにつれて自己凝集しゃすくなったり、脂質、酸性蛋白質および疎水性物質等の菌体由来物質と複合体を形成するなどの性質のため精製が困難といつた問題点があつた。また、前記 BbTと PmTは生物学的活性は類似しているものの、免疫学的に交差しないことが明らかにされており、このようなことから、獣医療上、養啄産業上安全かつ有効な B b T♦ PmT混合トキソィドの開発が切望されている。

従来知られている細菌由来の壊死毒素含有液、とりわけ ^'ルデテラ菌菌体抽出液からの壌死毒素の部分精製方法としてはィォン交換クロマトグラフィ一による方法がある（Kume, K.ら，インフヱクシヨンアンドィムニティー： Infect. Immun. , 52(4), p.370〜 377(1986))。しかしながら、この方法は再現性に乏しい欠点がある。また、同様に壊死毒素の部分精製例として、透析、ショ糖密度勾配超遠心分離及びゲルろ過クロマトグラフィ一に基づく方法がある（Endoh, M.ら，マイクロバイオロジーアンドィムノロジー： Microbiol. Immunol. , 30. (7), P.659〜 6 73(1986))が、この方法は再現性に乏しく、さらに、工程が多いにもかかわらず精製度があまり高くな.いという欠点がある。

他の例として、核酸除去剤処理及び陰ィォン交換クロマトグラフィー及びハイドロキシァパタイト吸着クロマトグラフィーによる方法がある（Hor iguchi, Y.ら：マイクロバイアルノ、⁰ソージヱネーシス： Microbiol. Patho gen., ， p.361〜368(1989))。しかしながら、この方法は核酸除去剤のような高価な試薬を必要とし、工程が多い欠点がある。また、核酸除去剤、透析及び陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法もある（H origuchi, Y.ら， FEMS マイクロバイオロジーレターズ： FEMS Microbiol.

Letters, 6_6, p.39〜 44(1990 ))が、この方法は再現性が高く比較的高純度の壊死毒素が得られるものの、前記方法と同様、高価な試薬を必要とする欠点がある。

さらに別の例として、塩析及び色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによる方法がある（Zhang Y. L. and Sekura E. D. ,インフエクションアンドィムニティ一： Infect. Immun.， 59(10), p.3754〜 37

59(1991))が、この方法は再現性は高いものの精製度があまり高くないという欠点がある。

従来報告された A R不活化ワクチンには B b単味、 P m単味並びに B b、 Pm混合不活化ワクチンの 3種類があり研究あるいは実用化されている。

B b不活化ワクチンとしては、ホルマリンゃグルタールアルデヒド等で不活化された死菌にアルミニウムゲルや油性アジュバントを加えたものがある（Goodnow,E.A. ,ヴェテリナリーメディスンスモールアニマルクリニシャン： Vet. Med. Small Anim. Clin..72, p.1210~1212(1 977)、 Nakase, Y.ら，プロシーディングスォブインターナショナルビッグヴェテリナリーソサイエティーコングレス： Proc. Int. Pig Ve t. Soc. Congr. , 8, (1976)、 Giles, C. J. and Smith, I. ,ヴェテリナリープリティン: Vet. Bull. (London), ^_3., p.327〜 338(19 83))。また、 Bbの外膜に存在しアデニールサイクラーゼ活性を有する

68 k Daの蛋白に萎縮性鼻炎の防御効果のあることが明らかにされている（ilontaraz J. A.ら，インフエクシヨンアンドィムニティ一： Infect. Im

755(1985))。さらに、 Bb菌の産生する線維状赤血球凝集素を主成分とするコンポーネントヮクチンが存在する（H ansen, G. E.ら：In Atrophic rhinitis in pigs (Ed. Peterson, K. B. and Nielsen, N. C. ) Communication of the European Communities, Luxembou rg, p.89〜97(1983)および、 Ohgitani, T. ら，ワクチン： Vaccine,

9., p.653〜658(1991))。抗毒素を与える目的で壊死毒素を加えたワクチンは効果を得ていないという報告もある（Soderlind.O. and Be rgstrom, G. , Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr. , p.175(1984)、 Marel, C. M. von der. ら， Pro Int. Pig Vet. Sci. Congr. , p.17 0(1984))。

—方、 Pmの不活化単味ワクチンとしては、 PmTトキソイド（Pederse n, K. B. and Barfod, K.，ノルディッシュヴヱテリナメデイシン： Word. V et. Med. , p.293〜 302(1982)、 Foged, N. T. ら，ヴヱテリナリーレコード: Vet. Eec, 125, p.7〜11 (1989))が研究あるいは実用化されている。

さらに、 B b及び Pmの混合不活化ワクチンとしては、 ① ARの予防のみを目的とするため Bbと PmD型の PmT産生株の死菌を混合したもの、これらに PmT非産生株を加えたもの、あるいは Bbと PmTトキソィドを混合したもの（Barfod, K. and Pedersen, K. B. ,ノルデイツシュヴェテリナメデイシン： Noni. Vet. Med. , 36, r>.337〜 345(1984)、 Baalsrud, K. J., ァクタヴェテリナリアスカンジナビア： Acta Vet. Sc and., 28, p.305〜311 (1987))、 de Jong, H. F.ら，ヴェテリナリークオ一テリー： Vet. Quart.，旦， p.49〜 59(1987)、 Kobisc h, M. and Pennings, A.，ヴヱテリナリーレコード： Vet. Eec, 124, p.57〜61(1989))、 ② ARと肺炎予防を目的とするため、 Bb と PmD型の PmT産生株、 PmA型の死菌を混合したもの（Ostle, A. G. ら、ヴュテリナリーメディスン： Vet Med., p.772〜 775(198 6))、 ③ ARと肺炎に加えて他の疾病の予防も目的とするため Bb、 Pm A型株、豚丹毒菌の死菌に PmTトキソィドを加えたものが実用化されている（Jayappa.H.ら、インタ一ナショナルビッグヴェテリナリーソサイエティ一コングレス： Int. Pig Vet. Soc. Congr. , p .44 ( 1988 ))。

ところで、 Roop II， E. M.らは BbTが Bb感染による豚の鼻甲介萎縮や肺炎病巣形成に重要な役割を演じていることから、 BbTトキソィドの必要性を指摘している（インフヱクシヨンアンドィムニティー： Infect. Immun, , 55, p.217〜 222(1987))。しかし、 BbTと PmTトキソイドとの混合化に関しては全く言及していない。また、 Chanter, N. らは B bT及び PmTの共同作用による豚鼻粘膜障害が B b及び Pmの増殖に好ましい環境を形成することから、 B bの重要な成分を含有する Pm Τトキソィドがより効果的であることを提案している（リサーチインヴェテリナリ一サイエンス： Ees. Vet. Sci. , 47, p.48〜53(1989) しかし、これまでのところ、単に BbT活性を有する画分からなるワクチンでは B b T中和抗体を上昇させることに成功していない（Soderlind, 0. and Bergstrom, G. , Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr. , p.175 (1 984)、 Marel, CM. von der. et al. , Proc. Int. Pig Vet. Sci. Congr. , p.170(1984))。一方で、中井らは高度に精製した BbTトキソィドを用いてブタ及びマウスに中和抗体の上昇することを明らかにした（第 111回日本獣医学会講演要旨集， p.183(1991))。しかし、彼らも当該 BbTトキソィドと PmTトキソィドとの混合化に関しては全く触れていない。

発明の開示 .

本発明者らは、壊死毒素の効率的な精製方法を見い出すベく種々検討を重ねた結果、 ①壞死毒素含有溶液例えばボルデテラ属菌菌体抽出物を、セルロース硫酸エステルゲル、へパリン固定化吸着ゲルもしくは硫酸化アルキル基固定化吸着ゲル等で例示される直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いてクロマトグラフィ一を行なうことにより内毒素含有量の少ない部分精製壊死毒素が簡単にしかも比較的高い回収率で得られること、 ②上記直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壌死毒素をさらに透析、陽ィォン交換クロマトグラフィ一及びゲルろ過クロマトグラフィ一を実施することにより高純度の壌死毒素が簡単に、しかも比較的高回収率で得られること、 ③直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いて部分精製した壌死毒素が未精製のボルデテラ属菌菌体抽出物中壊死毒素に比べ免疫応答が大幅に改善されることの知見を得た。

さらに、本発明者らは、ボルデテラ属菌菌体抽出物を直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壌死毒素を吸着させ、夾雑物質と分離し、ゲルから溶出することにより得られた壌死毒素画分を化学的に減毒したものが膝において.安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し本発明を完成するに至った。

豚に対して P mの感染が成立するためには予め啄鼻粘膜を障害する因子としての B bの前感染が必要である。 B T抗毒素による免疫をブタに行なつた場合、 B b及び P mの攻撃により P mの鼻粘膜定着並びに鼻甲介萎縮を軽減できる。しかし、個体間で効果に大きな差が認められることから、 A R不活化ワクチンの成分として B b Tトキソィドのみでは不十分であることが判明した。

本発明者らは、上述の知見を基に混合トキソィドを開発すべく鋭意検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌菌体抽出物をセルロース硫酸エステルゲル等を用いて比活性 3 7 , 0 0 O MND/mg蛋白以上に精製した毒素に由来するトキソィドと毒素原性 P m産生 P m Tに由来するトキソィドを混合することにより得られる混合トキソィドが、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効であることを確認し、本発明の第二の態様である混合トキソィドを供するに至った。

なお、本発明において使用される最少壊死毒単位（MN D )とは、リポポリサッカライド (大腸菌、血清型 0 111 : B 4由来など）1 /zg/inl存在下でモルモット皮内に注射され 1曰後に直径 5 mm以上の壊死斑を形成する最少毒素量を 1 MN Dと定義される量に基づくものとする。

図面の簡単な説明

図 1は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。図 2は本発明による壊死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。図 3は本発明による壞死毒素精製法の過程のクロマトグラムを示す。図 4は本発明による壊死毒素精製法を用 t、て得られた壌死毒素画分の分析結果を示す。

図 5は本発明によって得られるトキソィドのマウス力価試験の結果を示す。

図 6は本発明によって得られるトキソィドの妊娠ブタでの有効性試験の結果を示す。

図 7は B b T中和抗体による防御ラインの検討結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、壊死毒素含有液をセルロース硫酸エステル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、壊死毒素を吸着させた後、ゲルから溶出することを特徵とする壊死毒素の部分精製方法を提供する。また、前記壞死毒素の部分精製方法によって得られた B b Tに由来する B b Tのトキソィド、並びに該 B b Tトキソィドと毒素)！性 P m産生 PmTに由来するトキソィドを混合することにより得られる、豚において安全かつ萎縮性鼻炎の予防に有効な混合トキソィドを提供するものであ本発明において、出発材料である壊死毒素含有液とは、 Bb、百日咳菌、パラ百日咳菌及びボルデテラアビゥムの菌体抽出液を含む。または、遺伝子組換え技術により B b Tを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。本発明において好ましい抽出液は、 Bbの菌体抽出液であり、 B bをボルデ · ジヤング培地、マッコンキー培地などの寒天培地あるいはペプトン培地 (Horiguchi, Y.ら，マイクロバイアルパソジヱネ一シス： Microb. Pathogen. , 6, p.361〜 368(1989))、コーェン . ウィラー培地、ステナー · ショルテ培地などの液体培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でセルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、セルロース硫酸エステルゲルの開始緩衝液に浮遊する。

この菌体浮遊液について、 Kume, K.らの方法（インフヱクシヨンアンドィムニティー： Infect. Immun. 52 (4), p.370〜 377(1986))、 Endoh, M.らの方法（マイクロバイオロジーアンドィムノロジー： Microb ial. Immunol. , 30 (7), p.659〜 673(1986))、 Horiguchi, Y.らの方法（マイクロバイアルノヽ。ソジエネ一シス： Microbial. Pathogen. , 6_, p.361〜368(1989)あるいは FEMS マイクロバイオロジーレーズ： FEMS Microbiol. Letters, 6_6, p.39〜 44(1990))、 Zhan g Y. L. and Sekura R. D. の方法（ィンフエクシヨンアンドィムニティ一： Infect. Immun. , 59(10), p.3754〜 3759(1991))によって、またはセルロース硫酸エステルゲル等の直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーにより精製を行なうことができるが、本発明においては、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーによる精製を実施することを最適な態様とする。

この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壌し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。この菌体抽出物の形であるいは核酸除去剤、塩析、超遠心分離等の前段部分精製処理後に本発明の方法に供される。本発明の方法によれば、前段部分精製処理をあえて行なう必要はなく、菌体抽出液をそのまま硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いた吸着クロマトグラフィーに付すことができ、工程がきわめて簡便となる。 ' 本発明で用いられる直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルについては以下のものが例示される。

直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルとは、セル口 —スなどのクロマト担体ゲルが、ピリジンなどの有機溶媒の存在下、クロルスルホン酸、無水硫酸などの硫酸化剤の作用により例えばエステル結合を介してクロマト担体ゲルそのものに直接硫酸基が導入されたものを意味し、結晶セルロースまたは結晶領域および非結晶領域セルロースなどからなる球状セルロースに硫酸エステルが導入されたセルロース硫酸エステルのゲルはその代表である。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理的安定性に優れ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適である。これらの原料セルロース類はすでに市販されており、例えばアビセル (旭化成工業社製）、セルロフアイン G C— 1 5、同 G H— 2 5、同 G C— 1 0 0、同 G C— 2 0 0 (チッソ社製）などがある。原料セルロースを前記の方法で硫酸化することもできるし、そのなかのいくつかは硫酸化セルロースとして例えば「硫酸化ーセルロファイン」の販売名（チッソ社製）で市販されている。

硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルとは、架橋セルロース、架橋デキストランもしくは架橋ァガロースゲルなどの天然高分子重合体または親水性ビニルポリマーもしくはスチレンジビニルベンゼン共重合体などの人工高分子重合体からなるクロマト担体ゲルに、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであるへパリン、硫酸化アルキル基の —種であるスルフォプロピル基またはスルフォン基を有するブル一色素などが C N B r法などの方法で共有結合的に結合されているものを意味し、すでに数多くのものが市販されている。へパリン結合クロマト担体ゲルとしては、「へパリンセファロース C L一 6 B」（フアルマシア社)、「ァフィゲルへパリンゲル」（バイオラッド社）、「へパリンセル口ファイン」（生化学工業社)など、ブルー色素結合クロマト担体ゲルとしては「ァフィゲルブル一ゲル」（バイオラッド社）、「A F—ブルートヨパール」（東ソ一社)、「ブルーセル口ファイン」（生化学工業社）など、さらにスルフォプ口ピル基結合クロマト担体ゲルとしては「S P—セフアデックス」（ファルマシア社)、「S P—トヨパール 6 5 0 M」（東ソ一社）などが例示され o

本発明において、硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルを用いて壞死毒素含有液とりわけボルデテラ属菌菌体抽出液中の壌死毒素を精製採取するにあたっては、以下の方法で実施する。ここでは、好適な実施態様であるセルロース硫酸エステルゲルを用、た例について概説するが、他のゲルの場合も同様の条件下で実施することができる。

セルロース硫酸エステルゲルを、予め、例えば 0〜0. 2 M塩化ナトリゥム添加 0. 0 2 Mリン酸緩衝液等の中性付近の p H値（p H 7〜9 )であり、適当な比電導度、すなわちゲルクロマトグラフィーにおける洗浄、溶出の際の一定の基準となる比電導度（その範囲はゲルの種類によっても若干異なるが、通常、 2 0 mS/cm以下、一般的には 3〜 2 0 mS/cm、より一般的には 5〜 2 0 fflS/cmの範囲にある）またはそれ以下の比電導度を有する緩衝液にて平衡化した後に、壊死毒素の吸着操作に供する。セルロース硫酸エステルゲルへの壊死毒素の吸着、ゲルの洗浄、壊死毒素の溶出等一連の精製操作は、バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作方法で行なう。バッチ法で行なう場合は、ボルデテラ属菌菌体抽出液中にセルロース硫酸エステルを投入し、 p H 7 . 0〜9 . 0程度の範囲において 0〜3 0 °C程度の温度にて 1 0〜6 0分程度緩く撹拌して壌死毒素を吸着させる。この際、ボルデテラ属菌菌体抽出液の比電導度が上記所定の範囲、一般的に 3〜2 O mS/cmの範囲、またはそれ以下となるように、適宜濃縮または希釈して吸着操作に付す。

吸着終了後、抽出物 ·ゲル混合液をろ過器上に充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分難する。分離したゲルを、上記所定の範囲の比電導度 (一般的には 3〜2 O mS/cm程度）またはそれ以下で、 p Hが 5〜1 0程度である適当な緩衝液、例えば、 0 . 1 M塩化ナトリゥム添加 0. 0 2 Mリン酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗狰する。この後、 p Hが 5〜1 0程度で、比電導度が上記所定の範囲の比電導度以上で、一般的には 1 3 O mS/cm以下のもの (好ましい範囲は、例えば 2 2〜4 6 mS/cm程度）である適当な緩衝液、 0 . 2〜0. 5 M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している壊死毒素を溶出する。

カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材料、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、 1 0 ml/cm²/hr〜5 0 0 ml/cm ²/hr程度に調整して行なうことが推奨される。本発明の精製方法によれば、壌死毒素含有液中の壊死毒素に対する特異的吸着能に優れ、壌死毒素の精製度は数 1 0倍〜 1 1 0倍に達し、しかも壊死毒素の回収率は 4 0 %〜1 0 0 %と良好である。発熱やショック等副作用の原因物質で壊死毒素とともに菌体破砕抽出液中に大量に含まれる内毒素はセルロース硫酸エステルゲルに吸着しないため、 1 / 3 0〜1 / 8 0 0量に低減される。得られた精製壊死毒素の比活性が 4 x 1 0 ⁵〜3 x 1 0 ⁶MND/mg蛋白と高く、 S D S -ポリアクリルアミド電気泳動分析において主要バンドを形成する。

上述のとおり、本発明の方法によれば、出発材料の壊死毒素含有液から所望の壌死毒素を良好な収率、純度で採取することができ、その操作も極めて簡便で、また、その精製用クロマトグラフィー吸着体は安価に調製あるヽは入手でき、しかも繰り返し使用しても劣化が全くなく経済的にも極めて優れている。従って、本発明の方法は壌死毒素の工業的製造法として極めて優れた方法である。また、本発明の方法は従来の技術である陽ィォン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法等と組み合わせて純度をさらに高めることも可能であり、その際は従来法で得られる結果をはるかに凌ぐ結果を得ることができる。

本発明の方法により精製された壊死毒素は、化学薬品で処理することにより、免疫原性を保持しながら毒素活性を消失させトキソィド化される。トキソィド化に際しては一般的に用いられている方法、例えばホルマリンによる方法（Nakai, T.ら，インフエクシヨンアンドィムニティ一： Infe ct. Ifflmun. , p.429〜434 (1984))ゃグルタールアルデヒドによる方法 (Endoh, M.ら，マイクロバイオロジーアンドィムノロジー： Microbiol. Immunol. , 30, p.659〜 673(1986))などが適用され得る。さらに、当該トキソィドを体内に投与して液性免疫の惹起を期する場合はアジュバントを加える。加えるアジュバントとしては、アルミニゥムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。当該トキソィドは未精製の壌死毒素画分に比べ免疫原性が高く、かつ安全性にも優れており、このことは後述の実施例のデータにより支持される。

本発明の方法によって得られる部分精製壌死毒素は、純度が高く内毒素のほとんどが除去されているため、動物用ワクチンの調製に有用であり、さらに従来の精製方法と組み合わせて純度を高めると各種試薬、医薬品の調製、さらには人体用百日咳ヮクチンの調製への展開も可能である。

ところで、 Bbの自然感染例ではほとんどの場合、 BbT中和抗体の出現を認めないが菌凝集抗体は高率に上昇し本病の血清学的診断法として応用されている。本発明者らの調査においても AR発生農場である 15県 4 8農場 327頭の BbT中和抗体を検査したところ、 1農場（2.1%)の 2頭（0.6%)が陽性であるにすぎなかった。従来の Bb死菌ワクチンは菌凝集抗体を上昇させるため、診断の妨げとなっていた。しかし、本発明の精製法と従来の精製法を組み合わせることによって BbTの精製度を高めると、中和抗体を付与するものの菌凝集抗体を上昇させないトキソィドの調製が可能となる。このように、ワクチン抗体と感染抗体を血清学的に判別可能にならしめるワクチンやトキソィドは「マーカーワクチン」と呼ばれる。例えば、特定病原体フリー（以下、 SPFと略称することがある）農場において、本発明のトキソィドの使用により ARの予防を行ないながら、万一 Bbの感染が認められた場合でも菌凝集抗体を測定することにより感染豚を摘発することができる。

本発明のもう一つの態様は、前記の精製方法に従って調製された BbT トキソィドとパスッレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドを主成分とする混合トキソィドを提供することである。

本発明において用いられる P m Tに関して、出発材料である P m菌体抽出液とは、毒素原性 Pmあるいは非定型的パスッレラ（Ka即， E.M. I.E. et al. , ヴヱテリナリーレコード： Vet. Eec. , 126, p.434〜 437(1 990))の菌体抽出液を包含する。または、遺伝子組換え技術により Pm Tを発現させた細胞抽出液も本発明の出発材料として含まれる。本発明において好ましい抽出液は、毒素原性 Pmの菌体抽出液であり、本菌をデキストロース ·スターチ培地、血液寒天培地、 YP C培地（Namioka, S. and urata, ii. , コ一ネルヴヱテリナリアン： Cornell Vet. , 51, p.498 〜507(1961))などの寒天培地あるいはハートインフュージョン培地、トリプチケース 'ソィ ·ブロス、 Luria-Bertani培地、肉水培地（de J ong, . F. and Akkermans, J. P. W. M. , ヴヱテリナリークオテリー： Vet. Q uart., 8., p.294〜214(1986 ))などの液体培地で、常法により静置培養または振盪培養もしくは通気撹拌培養する。寒天培養菌は、コーンラージ棒等でトリス緩衝液等に浮遊する。液体培養菌は、遠心分離により菌体を回収し、次の精製工程に適した適当な緩衝液に浮遊する。この菌体浮遊液を超音波処理、酵素処理、プレス処理、凍結融解の繰り返し等を行なうことにより菌体を破壊し、遠心分離あるいは膜ろ過により菌体残渣を除去する。

この抽出物をイオン交換クロマトグラフィー、 PmTを認識する抗体で作製した親和性クロマトグラフィーなどにより精製を行なう。あるいは毒素原性 P mを液体培地で 2 4〜 6 5時間培養した上清を精製の出発材料に、あるいはそのまま減毒工程に進むことも可能である。

上述のように調製した毒素画分をホルマリン、グルタールアルデヒドなどによって処理し減毒を実施する。減毒化終了後、透析などによって緩衝液をリン酸緩衝食塩水に置換し、アジュバントを加える。アジュバントとしては、アルミニウムゲル、油性アジュバント、サポニンなどが使用できる。混合トキソィドは、各々抗原濃度を単味の場合の 2倍に調整しアジュバントを加えたものを等量混合することにより製造される。

本発明により得られる混合トキソィドは安全性にも優れており、従来のワクチンとは異なって B b T及び P m Tを中和する抗体を同時に付与することにより、両毒素による鼻甲介萎縮や発育遅延から豚を予防することができ。

本発明により得られる B b Tトキソィド並びに混合トキソィドは、妊娠豚に対し分娩の 1週間以上前までに 2〜 6週間隔で 2回筋肉内注射されることにより、初乳による移行抗体で産子を予防する。次回の分娩からは分娩前に本トキソィドを 1回接種するだけで十分な免疫が成立する。重度の A R感染農場では、 7日齢以上の子膝に対し本トキソィドを 2〜6週間隔で 2回筋肉内注射することにより直接予防することも有効である。

以下、本発明を調製例並びに実施例を挙げより詳細に説明するが、本発明はなんらこれらに限定されるものではない。

実施例

調製例 1

0 °C以下の温度にてピリジン 6 0 O mlにクロルスルホン酸 1 1 7 gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、 6 5〜7 0 °Cに昇温する。この中にセル口ファイン G C- 1 5 (チッソ社製） 8 0 gを加え、撹拌下 6 5〜70°Cにて 3時間反応させる。反応終了後、冷却し、 10%水酸化ナトリウム水溶液を加えて徐々に中和する。ゲルをろ過分離し、 0.01M リン酸緩衝食塩水で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。

調製例 2

0°C以下の温度にてピリジン 600 mlにクロルスルホン酸 117 gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、 65〜70°Cに昇温する。この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用ァビセル (旭化成ェ業社製） 80 gを加え、撹拌下 6 δ~70°Cにて 4時間保持する。反応終了後、冷却し、 10%水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルをろ過分離し、 0.01Mリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄して結晶セルロース硫酸エステルゲルを得る。

調製例 3

0〜5°Cの温度にてピリジン 500mlにクロルスルホン酸 82 gを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加熱し、 65〜70°Cに昇温する。この中にセル口ファイン GC-25 (チッソ社製） 80 gを加え、撹拌下 65 〜70°Cにて 4時間反応させる。反応終了後、冷却し、 10%水酸化ナトリウム水溶液を徐々に加えて中和する。ゲルをろ過分離し、 0.01Mリン酸緩衝食塩水（pH 7.2)で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。

実施例 1

(カラムからのグラジヱント溶離法）

前記調製例 1と同様にして調製したセル口ファイン GC-15の硫酸化エステル化物をカラム（50围（内径） X 200删）に充填し、これに 0.0 2Mリン酸緩衝液（pH8.0, 比電導度約 3ms/cm)を通液して平衛化した _c このカラムに B b菌 S 611株菌体破砕抽出液 200mlを通液した。通液後、上記緩衝液にて洗铮し夾雑物質を洗い出した。ついで、 0〜0.5M 塩化ナトリゥム添加リン酸緩衝液（p H 8.0、比電導度約 3〜 46 ms/cm) でグラジェント溶出し、総蛋白量 9. lmgの壌死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は 39.6%で、精製度 (精製壊死毒素画分の比活性ノ菌体破碎抽出液の比活性）は 32.1倍に達した。

実施例 2

(カラムからのステップワイズ溶離法）

前記調製例 1と同様にして調製したセル口ファイン GC- 15の硫酸化エステル化物をカラム（252rain (内径） X 210删）に充填し、これに 0. 02Mリン酸緩衝液（pH8.0，比電導度約 3 ms/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量 29〜35 g0BbS 611株菌体破砕抽出液を通液した。通液後、 0〜0.15 M塩化ナトリウム添加 0.02Mリン酸緩衝液（pH7.8-8.0,比電導度約 3〜17ms/cm)にて洗净し、夾雑物質を洗い出した。ついで、 0.3〜0.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（pH7.5〜7.7、比電導度約 30〜46ms/cm)で溶出し、総蛋白量 ◦ .2〜1.1 gの壊死毒素を含む画分を得た。表 1に示したとおり壊死毒素の回収率は 76~100%で、精製度 (精製壊死毒素画分の比活性 Z菌体破碎抽出液の比活性）は 23〜114倍に達し、内毒素は 0.1~3%に低減された。 -

バッチェ程総 BbT活性総蛋白量 (a) 総内毒素量 (b) 比活性精製度 No. (HUD) (回収率） (g) (回収率） (mg) (回収率） (fM mg蛋白）

1 菌体出液 5.55X10⁸ (100) 34.3 (100) 59.6 (100) 1.62X10⁴ 1.0 ク Qマトク'ラフィ-精製画分 4.20X10⁸ (75.7). 1.12 (3.3) 1.80 (3.02) 3.75X10⁵ 23.2

2 菌体破碎抽出液 1.01X10⁹ (100) 34.1 (100) 58.1 (100) 2.95X10⁴ 1.0 クロマトク'ラフ精製画分 1.14X10⁹ (113.2) 0.54 (1.6) 1.02 (1.76) 2.11X10⁶ 71.5

3 菌体 5¾¾ 出液 4.30X10⁸ (100) 35.3 (100) 86.7 (100) 1.22X10⁴ 1.0 クロマトク'ラフ精製画分 4.88X10⁸ (113.6) 0.35 (1.0) 0.21 (0.24) 1.40X10⁶ 114.5

4 茴体破出液 7.47X10⁸ (100) 29.3 (100) 42.9 (100) 2.55X10⁴ 1.0 ゥ Πマトゲラフィ-精製画分 5.72X10⁸ (76.6) 0.20 (0.7) 0.05 (0.12) 2.86X10⁶ 112.2

(a) Micro BCA Protein Assay(Piei e社）によって測定

(b) エンドスぺーシ一 (生化学: LHtt)によって測定

実施例 3

(へパリンセファロースカラムからのダラジヱント溶離法）

へパリンセファロース CL- 6 B (フアルマシア社製）をカラム（25mm (内径） X 14 Omm)に充填し、これに 0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0、比電導度約 3 mS/cm)を通液して平衡化した。このカラムに総蛋白量 42 Omg の B b S 611株菌体破碎抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、 0〜0.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（pH8.0、比電導度約 3〜46mS/cm)でグラジュント溶出し、総蛋白量 24 mgの壊死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は 40. 8 %で、精製度 (精製壞死毒素画分の比活性 Z菌体破砕抽出液の比活性）は 7.0倍に達した。分析結果を表 2に記した。

実施例 4

(SP-トヨパール 650Mカラムからのグラジヱント溶離法）

S P-トヨパール 650Mカラム (東ソ一社製）をカラム（5 Omm (内径） X 140雇）に充填し、これに 0.02Mリン酸緩衝液（pH8.0、比電導度約 3mS/cni)を通液して平衡ィヒした。このカラムに総蛋白量 63 ImgOBb S 611株菌体破碎抽出液を通液した。通液後、上記緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで、 0〜0.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（pH8.0、比電導度約 3〜46mS/ciD)でグラジュント溶出し、総蛋白量 2 mgの壌死毒素を含む画分を得た。壊死毒素の回収率は 11.5%で、精製度 (精製壊死毒素画分の比活性/菌体破砕抽出液の比活性）は 35.' 5 倍に達した。分析結果を表 2に記した。

表 2 総 B bT活性総蛋白量 (a) 総内毒素量 (b) 比活性精製度

No. (MND) (回収率） (mg) (回収率） (MQ) (回収率） ( D/mg蛋白）菌体出液 1.12X10⁷ (100) 421.5 (100) 1,820 (100) 2.7 X10⁴ 1.0

Μ\'リ'/ feフ？卩-ス CL-6B 4.57X10⁶ (40.8) 24.0 (5.7) 8.9 (0.49) 1.9 X10⁵ 7.2 精製画分雄例 4 菌体破 ¾4由出液 1.98X10⁷ (100) 631.0 (100) N.T.(c) 3.1 X10⁴ 1.0

SP-トヨ'、 ·_精製画分 2.27X10⁶ (11.5) 2.0 (0.32) N.T. 1.1 10⁶ 35.5

(a) Micro BCA Protein Assay(Pierce社）によって測定

(b) エンドスぺ一シー (生化学纖土)によって測定

(c) 検せず

実施例 5

(高純度精製）

前記実施例 1と同様にして調製したセル口一ス硫酸エステルゲル精製画分を 33mMクェン酸 · 66 mMリン酸 2ナトリウム · 11^尿素（ 115. 0)で透析した。同緩衝液で平衡化した SP-Toyopearl 650M (東ソ一社製： 10画 (内径） X 80mm)に総蛋白量 9.1 mgの透析内容物を通液し、同緩衝液にて洗浄し夾雑物を洗い出した。ついで 0〜0.5 M塩化ナトリゥム添加の上記緩衝液でグラジュント溶出し、総蛋白量 3. lmgの壊死毒素を含む画分（SP画分）を得た。 5 OmMリン酸緩衝液（ρΗ7.1)· 0. 3 M硫酸ナトリウム · 1 M尿素で平衡化した T S K- g e 1 G3000SW (21m m (内径） x 600誦）に SP画分を通液し、上記緩衝液にて高速液体クロマトグラフィ一を行ない総蛋白量 1.3 mgの壌死毒素を含む画分（H P L C画分）を得た。これらのクロマトグラムを図 1〜図 3に示した。また、菌体破砕抽出液〜壊死毒素画分の分析結果を表 3及び図 4に、精製毒素の性状を表 4に記した。

表 3 精製工程総 B b T活性総蛋白量 (a) 比活性精製度

(MND) (回収率） (mg) (回収率） (MND/nig蛋白）菌体破砕抽出液 1.7X10⁷ (100) 731 (100) 1.9X10⁴ 1 セル D-ス硫酸 Iステル 5.6X10⁶ (39.6) 9.1 (1.2) 6.1X10⁵ 32

S P Toyopearl 6.2X10⁶ (44.3) 3.1 (0.4) 2.0X10⁶ 105

TSK G3000SW 5.6X10⁶ (40.0) 1.3 (0.2) 4.3X10⁶ 226

(a)BCA Protein Assay (Pierce社製）による表 4

分子量 1 46kDa

最少壊死量 0 .23ng

最少脾臓萎縮量 0 .07ng

マウス 50%致死量 3 • 8ng 実施例 6

(減毒化） .

前記実施例 1〜5と同様にして得られた壊死毒素画分にホルマリンを加え 37〜40°Cで 3〜14曰間反応させて減毒化を行なつた。壊死毒素画分に 3/100量の 10%ホルマリンを加え、翌日、同量を、翌々日には 2ノ 100量を加えた。減毒化終了後、リン酸緩衝食塩液で透析した。

実施例 7

(アジュバント添加） .

前記実施例 6と同様にして得られた減毒化壊死毒素に水酸化アルミニゥムゲル及び保存剤（チメ口サールあるいはホルマリン）を加えた。

実施例 8

(マウス力価試験）

前記実施例 7と同様にして得られたトキソィドを 5週齢 ddYマウスの腹腔内に 0.5 mlずつ 2週間間隔で 2回注射した。最終免疫の 2週後に約 50(25〜100)LD₅₀の壌死毒素で腹腔内攻撃し生死を 7日間観察した。結果を図 5に示した。トキソィド量とマウス生残率に正の相関関係が認められた。

実施例 9

(育成ブタでの安全性試験）前記実施例 2と同様にして得られた画分を前記実施例 6のとおりに減毒化、前記実施例 7のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソィド 2〜5 0 gZ 2 ml/ドースを調製し、 1 0週齢 S P Fブタに 3週間隔で 2回筋肉内注射した。注射による臨床症状や体温の異常はいずれのブタにも認、められなかった。

実施例 1 0

(妊娠ブタでの有効性試験）

前記実施例 5と同様にして得られた H P L. C画分を、前記実施例 6のとおりに減毒化、前記実施例 7のとおりに水酸化アルミニゥムゲルを加えたトキソィド（2 5 g/ml)を妊娠ブタに分娩 6及び 3週前の 2回、 2 mlずつ筋肉内注射した。対照ブタにはプラセボワクチンを注射した。初乳を十分に摂取させた産子について、 3曰齢時に B b S 6 1 1株 2億個を全頭の鼻内に、さらに半数の子豚について 2及び 3週齢時の 2回、壊死毒素 2600MN Dを筋肉内注射により攻撃した。壊死毒素中和抗体価の成績を表 5に記した。分娩時の母ブタ血中 B b T中和抗体価は 3 2倍、初乳中は 2 5 6倍、産子の移行抗体価は 1 2 8倍であった。この移行抗体は 6週間以上陽性であった。プラセボ注射ブタ及びその産子は抗体陰性であった。攻撃試験の成績を表 6に記した。鼻甲介萎縮は対照群の 1 2頭中 9頭に十〜 +++のスコア一で認められたが、免疫群には認められなかった。鼻内からの菌回収には両群の差は認められなかった。增体重は、図 6に示したとおり B b生菌に加え壊死毒素による攻撃を実施した群間で差が認められた。 2週齢時に実施した 1回目の壊死毒素攻撃では、対照群の増体率は免疫群の約 1 / 3に低下し、 2回目攻撃（3週齢時）により対照群の全頭が死亡した。

表 5

(a)分娩時試験区分母ブタ抗体価 (a) 各週齢における子ブタの移行抗体価血清初乳 0 2 4 6 免疫 32 256 128 128 128 64 64 32 16 32 32 16 16 32

128 128 64 64 32 32 16 16 対照 <1 ぐ 1 <1 <1 <1 <1 〈1 <1 く 1 <1 く 1 〈1 <1 <1 く 1 く 1 く 1 く 1 く 1 <1 <1 <1 <1 く 1 <1 く 1

表 6 整" 法介 a) 備老群 Rb R T 綰 lollJV

Y126 4- - 4—-4-4- γι 27 . 一 -/- 4- γι 8 -/- 4-4-4-4-

~~ _/_

Y1 _/_

1 1 1 4 *τ-* _/_

Y1 -/-

_/_

YI S2 - - .4 . .

Y153 • · 一 4.4. .

Y154 + - ++/ + ++++

Y155 + - 対照 Y156 + - • -/- ++++

Y157 + + +++/++ NT c) 2日目 d)死亡

Y158 + + +++/+++ NT 2日目死亡

Y159 + + +++/++ NT 6曰目死亡

Y160 + + +++/++ NT 5日目死亡

ΥΊ61 + + ++/++ NT 1 日目死亡

Y162 + + +/+ NT 3日目死亡 a)鼻内スヮブを塗抹した平板培地に：出現したコロニ数。 - 0個、

+ ~50個、 + +： ' 100個、 +4 ·+ 200個、 + + + + 200個以上， b) 5段階法 ( ++++) で判定。左鼻甲介骨ノ右 Λ甲介 *スコア c)検査せず，

d) BbT2回目攻¾からの日数，実施例 11

(育成ブタでの有効性試験）

前記実施例 2と同様にして得られた画分を前記実施例 6のとおりに減毒化、前記実施例 7のとおりに水酸化アルミニウムゲルを加えたトキソィド 2〜50 g/2ml/ドースを調製し、 10週齢 S P Fブタに 3週間隔で 2回筋肉内注射した。最終免疫から 4週後に 2億個の B b生菌で鼻内攻撃し、攻撃後 3週目までの壊死毒素中和抗体価及を検査した。表 Ίに示したとおり対照ブタは攻撃後も B b T中和抗体陰性であった。免疫群は全頭が B b T中和抗体が陽転した。攻撃により 2及び 6〃g/2ml/ドースのトキソィド注射ブタは急激な中和抗体の上昇が認められたが、 20及び 50 n 12 ml/ドース以上では上昇しなかった。

壞死毒素には抗体産生抑制作用のあることが報告されている（Sekiya, K. ，マイクロバイオロジーアンドィムノロジー： Microbiol. Immunol., 2 Ί_, p.905〜 915(1983)).。攻撃後、対照ブタに中和抗体が上昇しな、理由は、攻撃菌の産生する B b Tの作用によるものと考えれらえる _c 従って、免疫群における急激な中和抗体の上昇は B b Tの抗体産生抑制作用を防御した結果であることから、育成ブタでは 2/zgの BbTトキソィドでも有効であることが示唆された。

表 7 a) b) 各試験開始後週数での各試験開始後週数での

BbT 豚 No. BbT中和抗体価 Bb凝集抗体価昇內か <o

A π A C " 1

JB f7 I n u n 7 i 1 1 π VJ "リ困 ΙΞ1¾

0 Y135 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <' 0 <10 く 10 40 ++

Y136 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <" 0 <10 く 10 80 ++++

2 丫 137 <1 <1 16 8 8 128 <■ 0 <10 く 10 640 +++

Y138 <1 <1 16 32 16 512 < 0 <10 <10 1280 +++

Y139 <1 <1 8 16 16 1024 < 0 く 10 <10 80 ++++

6 Y140 <1 <1 16 32 16 512 < 0 く 10 <10 640 +++

Y141 <1 <1 16 64 16 128 < 0 く 10 く 10 320

ΥΊ42 <1 <1 64 64 32 64 < 0 く 10 く 10 160 ++++

20 Y143 <1 <1 32 64 64 32 < 0 <10 く 10 640 ++++

Y144 <1 <1 4 8 8 1 < 0 く 10 く 10 40 +

Y145 <1 <1 16 32 8 8 < 0 <10 <10 320 ++

50 Y146 <1 <1 64 64 64 64 < 0 く 10 く 10 1280 +++

Y147 <1 <1 128 128 64 32 < 0 く" 10 く 10 320 +

Y148 <1 <1 64 256 64 64 < 0 く 10 <10 640 ++ a) ^ig/2ml/dose

b) 10週齢 SPFブ夕に対し 0及び 3週目の 2回 BbT卜キソィドを筋肉内注射し， 7週目で Bb生菌で鼻内攻した。

調製例 4

(菌体破碎抽出液： BbTトキソイド 1)

Bb S 611株をぺプトン培地で 37 °C、 24時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破碎処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過（ポア一径 0.45 で除去した溶液 (粗 BbT画分）にホルマリンを終濃度 0. 8%に加えて 37〜40°Cで 7日間減毒した。このトキソィドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化アルミニウムゲルを lmg (アルミニウム量換算) /mlに加えて BbTトキソィド 1とした。

調製例 5

(BbTトキソィド 2)

前記調製例 4と同様にして得られた粗 B bT画分をセルロース硫酸エステルゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。 2 OmMリン酸緩衝液（p H8.0 )で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗 B b Tを通液し、同緩衝液で洗浄した。 BbTは 1.5MNaC 1, 1M尿素添加 2 OmMリン酸緩衝液（pH 8.0)でセルロース硫酸エステルゲルカラム（7. 8 cm (内径） X 45 cm)から溶出した。この溶出画分（C S 1画分）を前記調製例 4と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えて BbTトキソィド 2とした。

調製例 6

(BbTトキソィド 3)

前記調製例 5と同様にして得られた C S 1画分をさらに T S Kゲル HW 65 ( 2.64 cm (内径） X 69 )及び11"^75(2.64 cm (内径） x 64 cm)連結カラムで精製した。 0.3M硫酸ナトリウム、 1M尿素加 0.05Mリン酸緩衝液（pH7.2)で平衡化させたカラムに CS 1画分を逼液し、同緩衝液で分画後、壊死毒活性を有する画分を混合した。この画分を前記調製例 4と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えて BbTトキソィド 3とした。

調製例 7

(BbTトキソィド 4)

' 前記調製例 4と同様にして得られた粗 B b T画分をセルロース硫酸エステルゲルクロマトグラフィーにより精製した。 0. IMNa C 1加 20m Mリン酸緩衝液（pH 8.0)で平衡化したセルロース硫酸エステルゲルに粗 BbTを通液し、同緩衝液で洗浄した。 BbTは0.5MNa C l加2 OmMリン酸緩衝液（pH 8.0)でセルロース硫酸エステルゲルから溶出した。この画分（CS 2画分）を前記調製例 4と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えて BbTトキソィド 4とした。

調製例 8

(BbTトキソィド 5)

前記調製例 Ίと同様にして得られた C S 2画分をさらに Affi-gel blue カラム（B i oRa d社製、 100-200メッシュ、 5.0cm (内径） xl 7cm)で精製した。 50mM トリス緩衝液（pH 7.5)で平衡化させた fi-gel blue カラムに同緩衝液に対して透析した C S 2画分を通液し、 1 M リン酸 2ナトリウム加 50mMトリス緩衝液（pH 7.5)で洗浄した。さらに 50mMトリス緩衝液（pH 7.5)で洗浄後、 2M塩化マグネシゥム、 1M尿素加 50Mmトリス緩衝液（pH 7.5 )で B b Tを溶出した。この画分を前記調製例 4と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニゥムゲルを加えて B bTトキソイド 5とした。

調製例 9

(BbT抗毒素）

前記実施例 1及び 5と同様にして得られた高度精製 B b T画分を前記調製例 4と同様に減毒処理を行ない、透析後、水酸化アルミニウムゲルを加えて BbTトキソイド 6とした。さらに、 27週齢 SPFブタに対して当該トキソイドを 3か月間で 1 mlずつ 8回筋肉内接種して B b T抗毒素（中和価 4, 096倍、菌凝集抗体価 20倍以下)を得た。

調製例 10

(PmTトキソィド）

毒素原性 PmD型 s 70株をハートインフュージョンブロスで 37° (：、 24時間通気撹拌培養した。菌体を遠心濃縮後、菌体破碎処理し菌体残渣を遠心あるいは膜ろ過（ポア一径 0.45 で除去した溶液 (粗 PmTと略）を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。 0〜0.3MNa C 1加中性リン酸緩衝液またはトリス緩衝液で平衡化した陰イオン交換体に粗 PmTを通液し、同緩衝液で洗浄した。 PmTは 0.4〜0.5MNa C 1を含む同緩衝液でイオン交換体から溶出した。この部分精製 PmT画分にホルマリンを 0.4%に加え、 .37 °Cで 14日間以上減毒した。このトキソィドをリン酸緩衝食塩水に対して透析した。透析内容物に水酸化ァルミニゥムゲルを 1 nig Al/mlに加えて PmTトキソィドとした。

実施例 12

(各種精製方法により得られた BbTトキソィドのモルモットでの免疫原性）

前記調製例 4〜8と同様にして得られた 3, 000 MND/ml (減毒前活性）の BbTトキソィドをモルモット（Hartley,雌， 5週齢）の大腿部筋肉内に 0.5mr注射した。注射後 28曰目に採血し、 BbT中和抗体価を検査した。中和抗体測定法は、非働化血清をリン酸緩衝食塩水で 2倍階段希釈した。これに等量の BbT (力価 4廳 D/0. lml)を加え、氷冷下で一夜反応後、モルモットの皮下に 0.1mlずつ注射した。判定は注射後 1曰目に実施し、中和価は壌死反応を阻止した血清の最大希釈倍数 (血清希釈倍率)で示した。

表 8に示したとおり、比活性が 1.4x10⁴ MND/mg蛋白の BbTトキソィド 1及び 2を注射したモルモットではすベて中和抗体が陰性であった c 比活性が 3.7 10⁴ MND/mg蛋白の BbTトキソィド 3を注射したモルモットでは 3頭中 2頭が中和抗体が陽性で、 7.8x 10⁴MND/mg蛋白以上では全頭陽転した。

BbTは精製の過程で不溶化しやすく、脂質、酸性蛋白など菌体由来の物質と複合体を形成しやすい性質を有している（ffordlaw, A.C. and Parto n, E. , Parmacol. Ther. , 19 , p .1〜 53 ( 1983 ))。そのため、これらの菌体由来物質を低減することにより、より十分な減毒化が可能になるか、あるいはまた毒素活性部位のマスキングを減少させ抗原提示効率が向上することにより BbTトキソィドの免疫原性が高まるものと考えられる。

表 8

BbT 比活性壊死毒中和

卜キソイド（MND/mg蛋白）抗体価

1 14000 <2 <2 <2 2 14000 <2 <2 <2 3 37000 <2 2 4 4 76000 32 32 128 5 96000 8 32 32 死菌ワクチン（A社） <2 <2 <2

死菌ワクチン（B社） <2 <2 <2

各トキソィドは水酸ィ匕アルミニウムゲルを 1mg AI/

mlに加え 3，000MND/mlに調整。実施例 13

(B b T中和抗体による防御ライン）

前記調製例 10で得られた BbT抗毒素 0.2， 1.0, 2.0及び 20 mlを 2日齢 S P Fブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。 3曰齢時に BbS 611株 10⁸CFUで鼻内攻撃し、さらに 7日齢時に粗 B b T( 1 , 940MND/頭）で筋肉内攻撃した。図 7に示したとおり、 BbTの致死作用に対しては B b T中和抗体価 1倍以上で防御が認められ、壊死作用に対しては 4倍以上で防御が可能であつた。 .

実施例 14

(PmT中和抗体による防御ライン）

前記調製例 10と同様にして得られた粗 PmTのトキソィドを等量のフ口イント不完全アジュバントで乳化した。 8頭の SPF妊娠ブタのうち 6 頭を免疫群、 2頭を対照群とした。免疫群は妊娠期間中に 3nilのトキソィド（840 JIND/ml)を 2〜5回筋肉内注射した。分娩後、初乳を産子に十分飲ませ 2曰齢または 9日齢時に 20〜160MNDの粗 PmTで筋肉内攻撃した。子ブタは攻撃後 14日間観察し鼻甲介病変を観察した。表 9に示したとおり、 PmTの鼻甲介萎縮作用に対しては P m T中和抗体価 2倍以上で防御が認められ、致死作用に対しては 2倍以下でも防御が可能であつた。

表 9

PmT a) b) 平均 C)

試験中和死亡数ノ S甲介萎縮

区分抗体価供試数スコア一

免疫 128 0/2 0

64 0/2 0

32 0/3 0

16 0/5 0

4 0/1 0

2 0/9 • 0

<2 0/10 2.4 対照 <2 3/14 2.3

a)牛胎仔肺細胞で求めた攻 S時の移行抗体価.

b) 20-160 MNDの PmTで 2ないし 9日齡に大 E8

部筋肉内攻 Sした，

c)鼻甲介 ¾|スコア一の平均 tt. 0:正常， 1:β度，

2:中等度， 3:重度, 4: SSを示す.

実施例 15

(B b T抗毒素受身免疫ブタの B b及び Pm攻撃試験）

前記調製例 10で得られた B b T抗毒素 20 mlを 2日齢 S P Fブタの腹腔内に注射して受身免疫を賦与した。 3曰齢及び 7曰齢時にそれぞれ B b S 611株 10⁸CFU及び PmD型 s70株 10⁸CFUで鼻内攻撃し、 6週齢で剖検した。表 10に示すように、 BbT抗毒素で Bbの鼻粘膜から大量の菌が回収されたが、 Pmの回収は対照に比べると大幅に少なかった。また、対照群の鼻甲介病変は重度 (+++)〜極度 (++++)であったが、免疫群は一頭が正常（一）で残りが重度及び極度と個体間における差が大きかった。

表 1 0 各曰齢における各曰齢における内からの区分子ブ夕 BbT中和抗体価 PmT中和抗体価虽甲介菌回収

No. 生別 3 7 1 5 30 44 3 7 1 5 30 44 萎綰 Bb PmD a) Y89 早 256 NT 64 32 1 6 く 2 NT <2 <2 <2 ++++ ++++ ++ 免疫 Y1 00 早 256 1 28 64 32 64 <2 <2 <Z <2 <2 - ++++ - 丫 1 25 ^ 256 1 28 64 32 32 <2 <2 <2 <2 <2 +++ ++++ -

Y80 <1 NT <1 <1. <1 <2 NT <2 <2 <2 ++++ ++++ ++++ 対照丫 83 早 <1 NT <1 <1 <1 <2 NT <2 <2 <2 +++ +++十 ++++

Y99 早 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 ++++ ++++ ++++ a) 2日齢時にブ夕抗 BbT血清を腹腔内注射した。

* 3日齢時に Bb S61 1株（1 0A8CFU/head)で、 7日齢時に PmD s70株（1 0八 8個/ head)で袅内攻撃。

壊死毒素は菌体内に産生され、溶菌に伴い菌体外に放出される。従って、

B b T抗毒素によって B bの鼻粘膜定着を阻止することはできない。 Pm が定着するためには予め B bが粘膜に障害を与えていなくてはならない。 B bの産生する鼻粘膜障害因子としては、 3bT(Elias, B.ら，ジャパ二ーズジャーナルヴェテリナリ一サイエンス： Jpn. J. Vet. Sci. , 52, p.677〜 688(1990))及び気管細胞毒素（Cookson, B.T. and Gol dman, ジャーナルォブセルラーバイオケミストリ一： J. Cell. B iochem. , 11 B(Suppl.)p.124 ; Dugal, F.らカナディアンジャーナルヴェテリナリーリサーチ： Can. J. Vet. Res,, 56, p.260-264(1 992))が重要である。気管細胞毒素は Pmの定着促進に重要な気管線毛運動停止作用や線毛上皮細胞崩壊作用及び粘液分泌亢進作用を有するため、 B b T抗毒素による免疫では P m定着を部分的にしか阻止することはできない。

これらの事実から Pmの鼻粘膜への定着を阻止するためには、少なくとも B b T及び気管細胞毒に対する免疫を成立させる必要がある。しかし、気管細胞毒ト

キソィドは精製方法の確立、免疫原性、収量など実用化までには多くの問題を抱えている。そのため、萎縮性鼻炎の主症状を予防し経済的損失を抑制するための A R不活化ワクチンとしては少なくとも壌死毒混合トキソィドを含有する必要がある。

実施例 16

ド混合例）

前記実施例 2及び 6と同様にして得られた減毒化 B b Tに水酸化アルミニゥムゲルを加え攪拌した。 BbT濃度を 8, 700~220, 000MND/ ml (減毒前毒素量 BbT蛋白で 2〜 50 zg/mlに相当）に、アルミニウム濃度を 0.5〜2.5mg/mlになるよう調製し、保存剤を加えて B b T原液とした。

前記調製例 11と同様にして得られた水酸化アルミニウムゲル添加減毒化？111丁を3, 40 OMND/ml以上 (減毒前毒素量）に調製し保存剤を加えて PmT原液とした。保存剤としては、 0.01%チメ口サールあるいは 0. 1〜0.4%ホルマリンを使用した。 BbT原液及び PmT原液を等量ずう加えて混合トキソィドを調製した。

この混合トキソイドを 9週齢 S P Fブタの頸部筋肉内に 3週間隔で 2回、 2mlずつ接種した。経時的に血清を採取し、 BbT中和抗体価並びに Pm T中和抗体価を測定した。 PmT中和抗体価は牛胎仔肺細胞 (Rutter, J. M. and Luther, P. D. , ヴヱテリナリーレコード： Vet. Bee. , 114, p.3 93〜396(1984))を用いた中和試験により求めた。ブタでの中和抗体価を表 11に、マウスでの力価試験成績を表 12に示した。 BbT及び PmTの各単味トキソィドと混合トキソィドはブタ及びマウスに注射したとき免疫原性の差が認められず、防御に十分な中和抗体応答が認められ、また安全性も十分であった。

表 11 a) 各試験開始日数における各試験開始日数における試験区分删 ο· BbT中和抗体価 PmT中和抗体価

0 10 21 35 50 64 0 10 21 35 50 64

BbT単味 Y117 <1 <1 <1 3232 8 <2 <2 <2 く 2 <2 <2

Y118 <1 <1 <1 <1 <Ί <1 <ζ < < <Ζ <ά

19 <1 <1 <1 6416 8 <2 っ

Yl く厶くく L 混合丫 120 <Ί <1 <1 6432 16 く 2 <2 <2 256 128 128

Y121 <1 <1 <1 16 8 4 <2 <2 <2 64 32 16

Yl 22 <1 <λ <1 2 2 <1 <2 <2 <2 64 32 32

PmT単味 Y123 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 64 32 16

Y124 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 128 128 64

Υ125 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 く 2 <2 128 128 64 対照 Υ114 <1 <1 <1 <1 <Ί <1 く 2 <2 <2 <2 <2 <2

丫 115 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <Ζ <2 <2 <2 <2 <2

Υ116 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <2 <2 <2 <2 <2 <2 a) 0及び 21日目に各卜キソィドを頸部筋肉内に注射 ·

3κ 12 試験区分 B b T攻撃 PmT攻撃

BbT中和価生存数/供試数 PmT中和価生存数供試数

B b T単味 256 10/10 N. T. N. T.

PmT単味 N. T. N. T. 256 10/10

BbT'PmT混合 512 9/10 1024 10/10 対照 < 1 0/10 <2 0/10 中和価は攻撃時の値を示す

Claims

請求の範囲

1. 細菌が産生する壊死毒素を精製取得するに際し、壌死毒素含有液を直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することを特徵とする壌死毒素の精製方法。

2. 上記吸着ゲルが、セルロースに硫酸エステルが導入されたセルロース硫酸エステルのゲルまたは天然高分子重合体または人工高分子重合体からなるクロマ卜担体ゲルにハペリン、スルフォプロピル基もしくは分子内にスルフォン基を有するブルー色素が単独でもしくは組み合わされて結合されたゲルより選択される請求項 1に記載の壞死毒素の精製方法。

3. 下記の工程：

(1) 直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを、 p H 7〜 9、 3〜2 O mS/cmの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、

(2) 壊死毒素含有液を p H 7〜9、温度 0〜3 0 °C、 3〜2 0 fflS/cniの範囲にある所定の比電導度以下の条件下で硫酸基を有する分子をリガンドとする吸着ゲルあるいは直接硫酸化された吸着ゲルに接触させ、

(3)壌死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルを p H 5〜l 0、 3〜2 O mS/cmの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液で洗浄し、

(4) 壊死毒素のゲルからの溶出を、； p H 5〜1 0、 3〜2 0 mS/cmの範囲にある所定の比電導度以上〜 1 3 O mS/cmの緩衝液を用いて行なうからなることを特徴とする請求項 1に記載の壊死毒素の精製方法。

4. 下記の工程：

(1) セルロース硫酸エステルのゲルを、 pH7〜9、比電導度 20mS/c m以下の緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、

(2) 壌死毒素含有液を pH7〜9、温度 0〜30°C、比電導度 20mS/c m以下の条件下でセルロース硫酸エステルのゲルに接触させ、

(3) 壊死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルを、 pH5〜 10、比電導度 2 OmS/cm以下の緩衝液で洗浄し、

(4) 壞死毒素のゲルからの溶出を、 pH5〜10、比電導度 22〜13 0 mS/cmの緩衝液を用 L、て行なう

からなることを特徵とする請求項 3に記載の壊死毒素の精製方法。

5. 下記の工程：

(1) へパリン結合クロマト担体ゲルを、 pH7〜9、比電導度 3〜5mS /cmの緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、

(2) 壊死毒素含有液を pH7〜9、温度 0〜30°C、比電導度 3〜5raS /cmの条件下でへパリン結合クロマト担体ゲルに接触させ、

(3) 壊死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルを、 pH5〜 10、比電導度 3〜5mS/cm以下の緩衝液で洗狰し、

(4) 壊死毒素のゲルからの溶出を、 pH5〜10、比電導度 3〜130 mS/cmの緩衝液を用いて行なう

からなることを特徵とする請求項 3に記載の壌死毒素の精製方法。

6. 壌死毒素含有液がボルデテラ菌属菌体抽出液である請求項 1もしくは請求項 3に記載の壊死毒素の精製方法。

7. 壌死毒素含有液が遺伝子組み換え技術によりボルデテラ属菌の壌死毒素を発現させた微生物または細胞の培養物あるいは抽出物である請求項 1 もしくは請求項 3に記載の壌死毒素の精製方法。

8. ボルデテラ属菌が産生する壊死毒素の含有液を、直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触せしめ、当該壊死毒素を吸着させた後、吸着した壊死毒素をゲルから溶出することによつて得られる部分精製壊死毒率、あるいは当該部分精製壊死毒素を他の精製方法と組み合わせてさらに高純度に精製したものを、化学的処理により免疫原性を保持しながら活性を消失させた壊死毒素のトキソィド。

9. 該部分精製壊死毒素が、下記の工程：

(1) 直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルを、 pH7~

9. 3〜 20 mS/cmの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち、

(2) 壊死毒素含有液を pH7〜9、温度 0〜30°C、 3〜20mS/cmの範囲にある所定の比電導度以下の条件下で直接的硫酸化により硫酸基が導入されたクロマト担体ゲルもしくは硫酸基を有する分子が共有結合されているクロマト担体ゲルに接触させ、

(3) 壌死毒素のゲルからの溶出処理に先だって、吸着ゲルを pH5〜l 0、 3〜2 OmS/cmの範囲にある所定の比電導度以下の緩衝液で洗浄し、

(4) 壊死毒素のゲルからの溶出を、 pH5〜10、 3〜20mS/cmの範囲にある所定の比電導度以上〜 13 OmS/cmの緩衝液を用いて行なうからなる方法によつて得られる部分精製壊死毒素である請求項 8に記載の壊死毒素のトキソィド。

10. 3.75 X 10⁵最少壊死毒単位 (以下、 MDと略称する）/ mg蛋白以上の比活性を有する請求項 8に記載の壊死毒素のトキソィド。

11. ボルデテラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドおよびパスッレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドを主成分とする混合ワクチン。

1 2. 請求項 8に記載のボルデテラ属菌が産生する壌死毒素のトキソィドおよびパスッレラ属菌が産生する壊死毒素のトキソィドを主成分とする請求項 1 1に記載の混合ワクチン。

1 3. 請求項 9に記載のボルデテラ属菌が産生する壌死毒素のトキソィドおよびパスッレラ属菌が産生する壞死毒素のトキソィドを主成分とする請求項 1 1に記載の混合ワクチン。

1 4. 3 7 , 0 0 O MND/mg蛋白以上の比活性を有するボルデテラ属菌が産生する壌死毒素のトキソィドを含有する請求項 1 1に記載の混合ワクチン。